Pflanzenphysiologisches Institut der Universitat Wien

Zur Bestimmung von Blei in Mikroproben von biologischem Material mittels flammenloser Atomabsorptions­Spektrophotometrie

Determination of Lead in Micro Samples of Biological Materials by Flameless Atomic Absorption Spectrophotometry

R. ALBERT, E. BEIGL, H. KINZEL und G. M. STEINER

Mit 2 Abbildungen

Eingegangen am 12. April 1976 . Angenommen am 4. Mai 1976

Summary

A method is described for micro determination of lead in biological samples. Following wet digestion a micro solvent extraction of ammonium pyrrolidine dithiocarbamate - Pb chelate into methyl isobutyl ketone was carried out prior to flameless atomic absorption determination. Traces of lead in small biological samples (few milligrams of dry weight) down to the limit of 10 ppb/ dry weight can be determined with an accuracy of about ± 5 0/0 without using standard addition methods.

Key words: heavy metals; quantitative determination of lead; atomic absorption spectro­photometry; trace analysis.

Einleitung

Ais Abfallprodukt der Kraftstoffverbrennung ist Blei in den letzten Jahren zu einem zentralen Problem des Umweltschutzes geworden. Am Pflanzenphysiologi­schen Institut der Universitat Wien werden zur Zeit im Rahmen des MAB-Projek­tes Untersuchungen zur Blei-Toxizitat durchgefuhrt. Dazu gehoren auch Gehaltsbe­stimmungen von Blei in Teilen von Pflanzen, die mit BleilOsungen verschiedener Konzentration behandelt worden waren, sowie der entsprechenden unbehandelten Kontrollen.

Die Methode der Wahl ist die Atomabsorptions-Spektrophotometrie (AAS); als Gerat stand uns die Type AA 6 mit Carbon Rod Atomizer 63 der Firma Varian­Techtron zur Verfiigung. In Vorversuchen erwiesen sich die Bleigehalte der Pflan­zen, insbesondere der Kontrollen, vielfach als zu gering fur die direkte Vermessung

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in der Acetylen-Luftflamme nach nasser Veraschung. Es muBte also die flammenlo­se AAS mittels Graphitkuvette ins Auge gefaBt werden, eine Methode, die aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit fur die Bestimmung von Blei und anderen Schwerme­tallen in biologischen und abiologischen Proben immer mehr herangezogen wird (MATOUSEK and STEVENS, 1971; HAUCK, 1973; MACHATA und BINDER, 1973; SCHRAMEL, 1973; WELZ und WIEDEKING, 1973; POSMA et a!., 1975 ; YAMASAKI ct a!., 1975; HORAK, 1976).

1ndessen waren die Ergebnisse, die wir mit den in der Literatur mitgeteilten Me­thoden erhielten, fur unsere Zweckc nicht befriedigend, einerseits deshalb, wei I die zur Analyse kommenden Proben oft extrem klein waren (kleine Bodemiere, Einzel­btitter, Wurzelchen, Flechtenanfluge von wenigen mg Gewicht), andererseits, weil die Proben groBe und von Fall zu Fall stark schwankende Mengen an Ca, K, Mg, P, S, etc. enthielten, deren Konzentrationen im AufschluB um mehrere Zehnerpo­tenzen groBer sind als die Bleikonzentration. Diese Beimengungen sind nicht nur fur starke unspezifische Absorptionen verantwortlich, sondern auch fur depressive Wirkungen auf die Hohe des Bleisignals (Matrix-Effekt). Der Hauptgrund hierfur liegt darin, daB die Matrixbestandteile durch die thermische Vorbehandlung in der Graphitkuvette nur sehr unvollstandig abgetrennt bzw. zerstort werden, da wegen der relativ leichten Fluchtigkeit des Bleis die Temperatur wahrend der Veraschung eher niedrig gehalten werden muB. Viele dieser Fremdatome werden dann wahrend der Atomisierungsphase zusammen mit Blei freigesetzt und storen Atomisierung und Lichtabsorption der Blei-Atome. Die im Gegensatz zu anderen Schwermetallen be­sonders groBe Anfalligkeit des Bleis fur die vcrschiedenartigsten Matrixeffekte ist wiederholt gefunden worden (MATOUSEK and STEVENS, 1971; SCHRAMEL, 1973; BRIESE and GIESY, 1975; YAMASAKI et a!., 1975 etc.). Zur Eliminierung dieser Stor­effekte gibt es zwei Moglichkeiten: a) die Anwendung der Deuterium-Unter­grund-Kompensation, die in diesem Faile zumeist nur bei gleichzeitiger Durchfuh­rung des Standard-Additionsverfahrens erfolgversprechend ist (BUTTGEREIT, 1973; HAUCK, 1973; WELZ und WIEDEKING, 1973; HORAK, 1976); b) die Bindung des Bleis an organische Komplexbildner und Extraktion des Komplexes in eine organi­sche Phase, wodurch eine Abtrennung von den meisten Stor-Elementen gelingt. Wir wahlten das letztere Verfahren mit dem System Ammonium-Pyrrolidin-Dithiocar­bam at (APDC)/Methyl-1sobutylketon (MIBK) (MULFORD, 1966; KOIRTYOHANN and WEN, 1973) und bauten es zu einer Mikromethode aus. Da die dabei anfallen­den Mengen an organischer Phase sehr gering waren, kam ein Verspruhen in die Flamme nicht in Frage. Wir adaptierten daher die Methode an die flammenlose AAS; diese Moglichkeit wurde bereits von DUDA (1974) fur die Bestimmung geringer Mengen von Cd, aber unseres Wissens noch nicht fur die Bestimmung von Blei her­angezogen.

1m folgenden ist diese Modifikation beschrieben, die die quantitative Bestimmung von Blei bis zu einer Konzentration von 10 ppb im AufschluB erlaubt, wobei Pro­benmengen bis herumer zu wenigen mg ausreichend sind.

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Methodik

1. Aufschlug: Getrocknete Tier- bzw. Pflanzenproben wurden in 100 ml Kjel­dahlkolben mit 5 ml eines Gemisches aus 5 Teilen HNOs und 1 Teil HCl04 (p. A. Merck) an einem Btichi Infrarot-Aufschluggerat verascht. Erfahrungsgemag lagen die Blindwerte sehr niedrig, so dag auf die Verwendung von Suprapur-Chemikalien verzichtet werden konnte. Der zur Trockne gebrachte Rtickstand wurde in 5,0 ml 0,5 M HNOa aufgenommen und in kleine, vorher ausgedampfte PVC-Flaschchen abgefullt. Bei Vorliegen von Mikroproben kann der Aufschlug auch gleich in den nachstehend genannten kleinen Reagensrohrchen in einem Heizblock erfolgen. Dies­beztigliche Versuche sind noch im Gange.

2. Messung: Je nach dem Bleigehalt der Probe wurden 5 bis 500,u1 AufschlugJo­sung in ein 2 ml fassendes Reagenzrohrchen mit Schliffstopfen pipettiert. Bei klei­neren Mengen als 500,u1 wurde mit 0,5 M HNOa auf 500,u1 Gesamtvolumen er­ganzt. Dazu kamen 50,u1 einer 3 0/oigen APDC-Losung und 500,u1 MIBK. Hierauf wurde der Ansatz 30 sec am Eprouvettenschtittler durchmischt und in ein auf 100 thermostatiertes Wasserbad gestellt. Nach ca. 2 min wurde die Probe vermessen. Die Haltbarkeit des Pb-Komplexes betragt bei dieser Temperatur etwa 30 min, so dag gentigend Zeit ftir Parallelbestimmungen bleibt. Bei Zimmertemperatur hingegen ist der Pb-Komplex nur wenige Minuten haltbar.

Zur Messung wurden aus der organischen Phase (tiber der wagrigen Phase) mii­tels 5-,uI-Spritze mit PVC-Spitze 5,u1 entnommen und in den Carbon Rod einge­spritzt. Dabei wurde immer nur eine, vorher mit Saure grtindlich gereinigte Spitze verwendet. Urn ein Zurtickrinnen der Probe (aufgrund geringer Oberflachenspan­nung) zu vermeiden, hat es sich als gunstig erwiesen, in den leicht vorgeheizten Carbon Rod einzuspritzen (<<dry», 40 sec bei Einstellung 4,5). Nun wurde weitere 20 sec bei Einstellung 4,5-5,5 getrocknet, 30 sec bei Einstellung 5,8-6,7 verascht (schwache Rotglut) und 2,5 sec bei Einstellung 4 atomisiert. Wie bei allen Verfah­ren im Mikrodosisbereich muB die Durchfuhrung mit besonderer Sorgfalt erfolgen. Ein heikler Punkt ist die verlustfreie Einspritzung der organischen Phase in den Carbon Rod.

Der wah rend der Veraschung erscheinende peak entspricht dem Oberschug an Komplexierungsmittel. Beim Stehenlassen des Extraktionsrohrchens bei 100 kann ein kontinuierliches Abnehmen dieses peaks verfolgt werden. Nach ca. 25 min ist der peak dann nahezu verschwunden. Offensichtlich gehen am Komplexbildner chemische Veranderungen vor sich, die seine Hydrophilie erhohen, so dag er in die untere HNOa-Phase wandert. Diese Vedinderungen sind wohl auch der Grund fur die kurze Haltbarkeit des Pb-Komplexes (ca. 30 min).

Abb. 1 zeigt den typischen Verlauf einer Messung. A gibt die kontinuierliche Re­gistrierung der Extinktion bei der Gerateeinstellung «Absorbance» wieder, im Faile B wurde nach Erscheinen des Veraschungspeaks auf die Gerateeinstellung «Peak» um­geschaltet. Bei dieser Einstellung wird der hochste wahrend der Atomisierung erreichte

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Extinktionswert vom Geriit gespeichert und anschlieBend auf den Schreiber ubertra­gen. Diese Art der Registrierung wurde bevorzugt, da dabei nicht die Gefahr bestand, daB die sehr rasch erscheinenden Bleisignale durch zu geringe Zeitauflosung des Schrei­bers abgeschnitten werden. UnregelmaBigkeiten des Bleipeaks, die gelegentlich auf­treten und fur AusreiBer verantwortlich sind, konnen trotzdem am Zeigerausschlag des «Peaking Meter» erkannt werden. Kontrollen mit der H 2-Lampe ergaben, daB in keinem Fall unspezifische Absorptionen wahrend der Atomisierung auftraten.

dry dry

B A

Pb

Pb

ash ash

:-- peak--:

Fig. 1: Recorder tracings for 50 ppb lead at 217.0 nm. A.: Continuous registration of absorbance. B.: .Peak» mode of indication was selected following ash stage.

Abb. 2 zeigt eine typische Pb-Eichgerade, deren Verlauf mit Hilfe des Verfah­rens der Regressionsanalysc (mittels Taschencomputer Hewlett-Packard 65) auf der Grundlage von mindestens 25 Parallelbestimmungen pro Eichpunkt fixiert wurde. Die statistische Behandlung der Eichpunkte (KAISER und GOTTSCHALK, 1972) ergab einen Vertrauensbereich von ca. ± 5 % fUr 95 % Voraussagewahrscheinlichkeit. Ausgangslosung war eine 50 ppb Pb-Losung in 0,5 M HNOs (verdunnt aus einer Pb(NOskStandardlosung von Merck), von welcher 200, 500 bzw. 1000 ,111 in das Reagensrohrchen pipettiert und der ohen beschriebenen Komplexierungsmethode unterzogen wurden. Dies ergab die drei Eichpunkte 20, 50 bzw. 100 ppb in der or­ganischen Phase. Dem hochsten Eichwert entsprach die Extinktion von ca. 0,4. Aufgrund des geringen Blindwertes, der dem Bleigehalt in der HNOs entspricht, geht die Eichgerade nicht durch den O-Punkt. Da Proben und Standardlosungen mit der identischen HNOs verdUnnt bzw. in ihr aufgenommen wurden, ist dies be­langlos. Vor «AusreiBern» ist man allerdings nicht sieher, es muB also ein Ansatz mehrmals vermessen werden. ErfahrungsgemaB genUgten 3 Parallelmessungen; nach

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Berechnung des arithmetischen Mittelwertes kann der Bleigehalt der Probe dann an Hand der Eichgeraden ermittelt werden.

0.4

0.3

0.1

20 50 1Xl ppb Pb

Fig. 2: Typical calibration curve obtained by linear regression analysis. Arithmetical mean values and 95 % confidence intervals are indicated.

Zur Oberpriifung der Methode wurden die Bleigehalte einiger natiirlicher Proben auf die eben beschriebene Art und parallel dazu nach dem Standard-Additionsver­fahren ermittelt. Hierbei wurden Probe und bekannte Blei-Zusatze gemeinsam der Mikro-Extraktionsmethode unterzogen. Der wahre Bleigehalt der Probe kann dann graphisch ermittelt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gegeniibergestellt. Die bei Direktmessung an Hand der Eichgeraden gefundenen Werte sind gleich 100 % gesetzt.

Die Abweichungen der an verschiedenen Tagen durchgefiihrten Parallelmessun­gen (1, 2) bleiben in den Fallen ohne Addition innerhalb des Konfidenzbereiches.

Tab. 1: Gegentiberstellung von Direktmessung (ohne Addition) und Additionsverfahren fUr einige nattirliche Proben. Die bei Direktmessung gefundenen Werte sind gleich 100 Ofo gesetzt. Die angegebenen ppb beziehen sich auf die Aufschlu/Wisung.

ohne mit Addition Addition %

Tradescantia fluminensis Wurzel 36,3 31,7 87 Blatt 19,5 20,7 106

Hypogymnia physodes (Blattflechte) 1 30,5 29,5 97

2 33,4 36,7 110

Porcellio scaber (Kellerassel) 1 26,0 25,0 96

2 26,7 29,2 109

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Die etwas sdirkeren Schwankungen bei Anwendung des Additionsverfahrens beru­hen sicher z. T. auf der Summierung geringerer Fehler durch die Art der graphi­schen Auswertung. Jedenfalls scheint ein signalvedindernder Einflug anderer mitex­trahierter Schwermetalle kaum vorzuliegen, da in den beiden Fallen mit Parallel be­stimmungen (Flechte und Assel) die Abweichungen yom Wert ohne Addition gegen­laufig sind. Die erreichte Genauigkeit erscheint uns flir die Bearbeitung biologischer Proben, wo Bleigehalte von Versuch und Kontrolle um Zehnerpotenzen schwan ken konnen, als ausreichend. Ein groger Vorteil unserer Methode ist, dag Blei auch in Proben von nur wenigen mg ohne Anwendung des umstandlichen Additionsverfah­rens noch hinlanglich genau quantitativ erfagt werden kann.

Die Verfasser danken dem «Fonds zur Forderung der wissenschaftlichen Forschung» flir die Bereitstellung des Gerates.

Literatur

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BUTTGEREIT, G.: Modifizierte atomabsorptionsspektroskopische Methoden zur Metallspuren­Analytik. Z. Anal. Chern. 267, 81-88 (1973).

DUDAS, M. J.: The quantitative determination of cadmium in soils by solvent extraction and nameless atomic absorption spectroscopy. At. Absorption Newslett. 13, 109-112 (1974).

HAUCK, G.: Erfahrungen mit der flammenlosen Atomabsorption bei der Untersuchung bio­logischen Materials auf Spuren von Schwermetallen. Z. Anal. Chern. 267, 337-341 (1973).

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KAISER, R., und G. GOTTSCHALK: Elementare Tests zur Beurteilung von Me~daten. B.I. Hochschultaschenblicher, Bd. 774 (1972).

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MACHATA, G., und R. BINDER: Bestimmung von Blei-, Thallium-, Zink- und Cadmiumspu­ren in biologischem Material mittels flammenloser Atomabsorption. Zeitschrift f. Rechts­medizin 73, 29-34 (1973).

MATOUSEK, J. B., and B. J. STEVENS: Biological applications of the carbon rod atomizer in atomic absorption spectroscopy. Clin. Chern. 17, 363-368 (1971).

MULFORD, C. E.: Solvent extraction techniques for atomic absorption spectroscopy. At. Ab­sorption Newslett. 5, 88-90 (1966).

POSMA, F. D., ]. BALKE, R. F. M. HERBER and E. ]. STUIK: Microdetermination of cadmium and lead in whole blood by flameless atomic absorption spectrometry using carbon­tube and carbon-cup as sample cell and comparison with flame studies. Anal. Chern. 47, 834-838 (1975).

SCHRAMEL, P.: Determination of eight metals in the international biological standard by nameless atomic-absorption spectrometry. Anal. Chim. Acta 67, 69-77 (1973).

WELZ, B., und E. WIEDEKING: Einsatz der flammenlosen Atom-Absorption zur Bestimmung von Spurenelementen in Wasser und Abwasser. Z. Anal. Chern. 264, 110-118 (1973).

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YAMASAKI, S., A. YOSHINO and A. KISHITA: The determination of sub-microgram amounts of elements in soil solution by flameless atomic absorption spectrophotometry with a heated graphite atomizer. Soil Sci. Plant Nutr. 21, 63-72 (1975).

Dr. R. ALBERT, E. BEIGL, Prof. Dr. H. KINZEL, G. M. STEINER, Pflanzenphysiologisches Institut der Universirat, Dr.-Karl-Lueger-Ring 1, A-I0I0 Wien, Osterreich (Austria).

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