Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern für die Therapie ... · Clarithromycin und Erythromycin...
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Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern für die Therapie
pulmonaler Infektionen mit Makrolidantibiotika und Rifampicin
bei Fohlen
I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Jette Peters
geboren am 20. November 1982
in Demmin
Greifswald, den 15.08.2011
Dekan: Prof. Dr. K. Fesser
1. Gutachter : Prof. Dr. W. Siegmund
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Fromm
Tag des Promotionskolloquiums: 05.12.2011
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Aufgabenstellung ..................................................... 4
2 Methoden ............................................................................................ 9
3 Ergebnisse........................................................................................ 12
4 Diskussion ........................................................................................ 16
5 Zusammenfassung .......................................................................... 22
6 Literaturverzeichnis ......................................................................... 25
7 Publikationen ................................................................................... 32
7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of
clarithromycin, rifampicin and their main metabolites in horse plasma,
epithelial lining fluid and broncho-alveolar cells (Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011; 55(1):194-201). 33
7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-
alveolar cells is influenced by comedication of rifampicin in foals
(Naunyn Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology
2010;381(2):161-9) 42
7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic
comedication of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition,
accepted for publication June 20th, 2011;
doi:10.1124/dmd.111.039206) 53
7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which
is sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time
drug interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition,
under review) 76
1 Einleitung und Aufgabenstellung
4
1 Einleitung und Aufgabenstellung
Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den
pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneistoffes, sowie von den individuellen
Besonderheiten der Absorption, Verteilung und Elimination des Arzneimittels beeinflusst.
Neben der Arzneistoff-Biotransformation (Metabolismus) waren in den letzten 20 Jahren vor
allem Arzneistofftransporter als Ursache pharmakokinetischer Variabilität Gegenstand
intensiver Forschung. Es konnte überzeugend belegt werden, dass membranale Aufnahme-
und Auswärtstransporter nicht nur von funktioneller Bedeutung für die Pharmakokinetik von
Arzneimitteln sind, sondern dass ihre Funktion auch durch genetische Faktoren,
Arzneimittelwechselwirkungen und krankhafte Prozesse beeinflusst werden kann [1].
Allerdings beschränken sich die bisherigen Forschungen vorwiegend auf die Organe der
Absorption und Elimination (Darm, Leber, Niere) sowie auf einige Gewebe mit
Barrierefunktion (Blut-Hirn-Schranke, Plazenta-Schranke) [2;3].
Weniger umfassend untersucht ist dagegen die Rolle von Transportproteinen bei der
Verteilung an den Ort der Wirkung. Ein Beispiel ist die pulmonale Penetration. Es gibt erste
Hinweise, dass Transportproteine an der Akkumulation von Substanzen (z.B.
Makrolidantibiotika) in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit (ELF) sowie in
bronchoalveolären Lavagezellen (BALC, v. a. pulmonale Makrophagen) beteiligt sein
könnten [4]. Jedoch ist der Erkenntnisgewinn limitiert durch die methodischen
Herausforderungen bei derartigen Untersuchungen. Um Messungen in der ELF oder den
BALC durchführen zu können, eignen sich die üblicherweise genutzten experimentellen
Tiermodelle Maus und Ratte nur bedingt.
Bessere methodische Möglichkeiten bieten dagegen Großtiere wie Schweine oder Pferde.
Aufgrund der vorhandenen regionalen strukturellen Voraussetzungen im Umfeld des
Instituts für Pharmakologie in Greifswald, haben wir uns für Untersuchungen an Fohlen
entschieden. Fohlen sind in der Größe mit erwachsenen Menschen vergleichbar und
erlauben mit vorhandenen diagnostischen Verfahren (z.B. Sonographie, Bronchoskopie,
Biopsie, bronchoalveoläre Lavage (BAL)) die Entnahme ausreichend großer Mengen an
Probenmaterial. Pferde sind auch im Hinblick auf die genetische Homologie von
Arzneimitteltransportern aus der Familie der ABC-Transporter (ATP-binding cassette) und
der Familie der OATPs (organic anion transporting polypeptides) dem Menschen näher als
Nager (Übereinstimmung der Proteinsequenz von Pferd und Mensch: ABCB1, 92%;
ABCC2, 82%; OATP1A2, 85%; OATP2B1 89%, Übereinstimmung der Proteinsequenz
zwischen Mensch und Ratte: Abcb1a, 86%; Abcb1b, 79%; Abcc2, 77%; Oatp1a5, 72%;
Oatp2b1, 76, www.ncbi.nih.gov, www.ebi.ac.uk).
1 Einleitung und Aufgabenstellung
5
Zudem besteht für Fohlen ein klinisch relevanter Bedarf an Informationen zur Expression
und Funktion pulmonaler Arzneistofftransporter. Fohlen erkranken in frühen
Lebensabschnitten häufig an einer lebensbedrohlichen abszedierenden Pneumonie [5].
Diese wird ausgelöst durch Rhodococcus equi (R. equi), einem in bronchoalveolären Zellen
intrazellulär persistierenden Keim, der sich der mütterlichen Immunabwehr entzieht und
medikamentös schwer zugängig ist. Seine Eradikation kann nur dann erfolgreich sein, wenn
sich ein geeignetes antiinfektiv wirksames Arzneimittel mit ausreichend hoher Konzentration
in der Umgebung des Keims in der ELF und in den BALC anreichert, um eine schnelle
extrazelluläre und verzögerte intrazelluläre Wirkungen zu erzielen. Arzneimittel mit solchen
Eigenschaften sind Makrolide, von denen bereits bekannt ist, dass sie in den pulmonalen
Kompartimenten kumulieren können [6-8]. So betragen die Konzentrationen von
Clarithromycin in der ELF etwa das 60-fache und in den BALC etwa das 300-fache der
Konzentrationen im Plasma [6]. Auch wenn derartig hohe Konzentrationsgradienten
zwischen BALC und Plasma durch base trapping erklärbar sind, bleibt die Frage offen,
durch welche Transportmechanismen die makrozyklischen Antibiotika vom Blut über die
Zellmembranen in die ELF und weiter in die BALC, ihren eigentlichen Wirkort gelangen.
Nach gegenwärtigem Erkenntnisstand werden auf der apikalen Seite der Zellen des
Bronchialepithels Auswärtstransporter wie ABCB1 und ABCC2 exprimiert [9], die als aktive
Pumpen fungieren und so zur Kumulation der Substrate in der ELF führen können. In den
BALC führen sie hingegen zur Minderung der intrazellulären Konzentration durch den
Auswärtstransport [10-14].
Die Expression von Aufnahmetransportern ist bisher deutlich weniger erforscht und die
zelluläre Lokalisation weitestgehend unbekannt. Daher können hier noch keine Aussagen
zur etwaigen Transportrichtung getroffen werden. Als Aufnahmetransporter können sie an
der basolateralen Seite der Bronchialepithelzellen (BEC) für die Aufnahme von Substraten
aus dem Blut und in den BALC für die Aufnahme aus der ELF in diese Zellen verantwortlich
sein. Abbildung 1 gibt einen Überblick zum Stand des aktuellen Wissens bezüglich der
Expression von Transportproteinen in der Lunge wieder.
1 Einleitung und Aufgabenstellung
6
BMInterstitium
Basalzelle
ABCG2
ABCC3
ABCC1ABCC2,4,5*
ABCC1 *
ABCB1
ABCC1
OCTN1
AlveolarmakrophageOATP2B1†
BronchialepithelzellePEPT1*
ELF
ABCB1
ABCC2* ABCC7
OCT1,2 *
PEPT2
Abb. 1: Expression und Lokalisation von Transportproteinen in den Lungenzellen - modifiziert nach
van der Deen et al. 2005 und Bosquillon 2010 [4;9]; BM, Basalmembran; ELF,
Epithelialflüssigkeit; ABC, ATP-binding cassette; OATP, organic anion transporting
polypeptide; OCT, organic cation transporter; OCTN, organic cation/carnitine transporter;
PEPT, peptide transporter; *widersprüchliche Datenlage zur zellulären Lokalisation;
†zelluläre Verteilung noch unbekannt
Bislang gibt es nur unzureichende Informationen, ob die o.g. Transporter an der pulmonalen
Penetration von Makroliden beteiligt sind.
Makrolide wie Azithromycin und Clarithromycin sind makrozyklische, lipophile Basen (log P
Werte Clarithromycin 3,16, Azithromycin 4,02; pKA-Werte um 8,8), die hauptsächlich zur
Therapie von Atemwegserkrankungen sowohl beim Menschen als auch bei Fohlen
eingesetzt werden. Sie sind Substrate der Auswärtstransporter ABCB1 und ABCC2 [12-14]
und könnten somit durch diese aus dem Blut in die ELF und aus den BALC in die ELF
gepumpt werden. In Bezug auf die Aufnahmetransporter konnten Seithel et al. in einem in
vitro-Experiment an überexprimierenden Zelllinien die Inhibition des Transportes des
etablierten Substrates Bromsulfophthalein (BSP) für OATB1B1 und OATP1B3 durch
Clarithromycin und Erythromycin nachweisen [15]. Es ist daher möglich, dass die Makrolide
selbst auch Substrate dieser Transporter sein könnten und durch diese in die Zellen der
Lunge aufgenommen werden. Somit könnte die Anreicherung von Makroliden in der ELF
1 Einleitung und Aufgabenstellung
7
und den BALC das Ergebnis des Wechselspiels von Aufnahme- und Auswärtstransportern
sein.
Die pharmakokinetische Bedeutung von Transportern in vivo kann durch Interaktionsstudien
mit Induktoren bzw. Inhibitoren untersucht werden. So sind bestimmte Transporter (ABCB1,
ABCC2, OATP1A2) durch chronische Gabe von pregnane X receptor (PXR)-Liganden (z.B.
Rifampicin, Carbamazepin, Johanniskraut) [16-19] induzierbar. In begrenztem Umfang gibt
es auch die Möglichkeit, Transporter selektiv zu inhibieren (z.B. ABCB1 durch PSC833,
Verapamil , Ritonavir, [20], ABCC2 durch Probenecid [21], OATP1A2 durch Naringin [22],
OATP2B1 sowie OATP1B1 und OATP1B3 durch Statine [23], durch die akute Gabe von
Rifampicin und durch HIV-Proteaseinhibitoren [24;25]. Dennoch besteht aufgrund
überlappender Inhibitorenspektren eine nur schwach ausgeprägte Selektivität und somit
eine zu berücksichtigende Limitation.
Rifampicin, ein PXR-Typ-Induktor bei chronischer Gabe sowie ein kompetitiver Inhibitor bei
akuter Gabe zahlreicher Transporter ist fester Bestandteil von Therapieschemata zur
Behandlung von durch R. equi verursachten abszedierenden Pneumonien bei Fohlen. Aus
einer retrospektiven Analyse ist bekannt, dass die Kombination von Rifampicin und
Clarithromycin den Kombinationen Rifampicin-Erythromycin bzw. Rifampicin-Azithromycin
klinisch überlegen ist [26]. Da Rifampicin nach bisherigen in vitro-Befunden substantiell mit
der Pharmakokinetik von Makroliden sowohl durch Regulation von Transportern als auch
durch Kompetition mit ihrer Funktion interagieren kann, lassen sich Unterschiede in der
Wirkung dieser Kombinationen sehr wohl auch durch Interaktionen auf
Arzneistofftransporterebene erklären.
Kombinationen von Makrolidantibiotika mit Rifampicin stellen bereits etablierte Therapien
von R. equi-Infektionen bei Fohlen dar. Mittels Interaktionsstudien, in denen das duale
Interaktionspotential von Rifampicin als experimentelles Modell verwendet wird, könnten so
tiefere Einblicke in die Mechanismen der pulmonalen Verteilung durch membranale
Transporter erhalten werden. Bei diesen pharmakokinetischen Interaktionsstudien ist
jedoch zu beachten, dass Rifampicin auch andere pharmakokinetisch relevante Funktionen
wie Biotransformation und Transport in anderen, pharmakokinetisch bedeutsamen Organen
(z.B. Darm, Leber) beeinflussen kann. In Bezug auf die Makrolide ist ferner zu
berücksichtigen, dass sie eine unterschiedliche Affinität zu Enzymen der Biotransformation
(z.B. CYP3A4) sowie zu Arzneistofftransportern haben können. Tulathromycin und
Azithromycin werden beispielsweise im Gegensatz zu Clarithromycin und Erythromycin
kaum oder nicht metabolisiert. Dagegen ist bekannt, dass Clarithromycin und Erythromycin
bessere Substrate für ABCB1 sind als Azithromycin [27]. Zur Affinität zu ABCC2 liegen
bislang nur Daten für Azithromycin vor [12].
1 Einleitung und Aufgabenstellung
8
In der vorliegenden Dissertationsarbeit sollten deshalb durch pharmakokinetische
Interaktionsstudien mit den bei Fohlen klinisch indizierten Arzneimitteln Tulathromycin,
Clarithromycin und Rifampicin erste Einblicke in die Mechanismen der pulmonalen
Verteilung von Arzneimitteln gewonnen werden. Dabei sind Tulathromycin und
Clarithromycin als experimentelle Modellsubstrate für Transporter zu verstehen und
Rifampicin als Modellsubstanz zur PXR-Typ-Induktion nach chronischer Gabe sowie als
Hemmstoff nach einmaliger oder kurzzeitiger Gabe, bei der induktive Effekte noch nicht
auftreten oder zu vernachlässigen sind. Zur Beurteilung der pharmakokinetischen Befunde
wurden die in vivo-Untersuchungen durch in vitro-Experimente mit geeigneten Zellmodellen
für Arzneistofftransporter ergänzt.
Im Einzelnen ergaben sich folgende detaillierte Aufgabenstellungen:
1. Entwicklung und Validierung einer sensitiven analytischen Methode zur
Quantifizierung von Clarithromycin, 14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und 25-O-
Desacetylrifampicin im Blut, in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den
bronchoalveolären Zellen von Fohlen (Publikation 1)
2. Untersuchung der Expression von Transportproteinen in der Lunge inklusive der
Regulation durch Rifampicin (Publikation 2 + 3)
3. Bestimmung der Affinität der Makrolide für ausgewählte Auswärts- und
Aufnahmetransporter an geeigneten in vitro-Modellen (Publikation 2 + 4)
4. Charakterisierung der Pharmakokinetik und Verteilung der Makrolide in die Lunge
und deren Kompartimente (Publikation 2 – 4)
5. Bestimmung des dualen Einflusses der Rifampicin-Komedikation auf die globale
Pharmakokinetik und lokale Verteilung der Antibiotika (Publikation 2 – 4)
2 Methoden
9
2 Methoden
Tierexperimentelle Studien
Nach Beantragung und Genehmigung durch die zuständigen Behörden (Landesamt für
Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei) sind die tierexperimentellen Studien
auf dem Gestüt Lewitz, Paul Schockemöhle Pferdehaltung GmbH, Neustadt-Glewe an
gesunden jungen Fohlen (Oldenburger-Rasse) durchgeführt worden. Die Tiere wurden
artgerecht gehalten und von erfahrenen Tierärzten betreut.
An diesen Tieren (18 männlich, 21 weiblich, Körpergewicht 97-167 kg, Alter 6-11 Wochen)
wurden drei pharmakokinetische Arzneimittelinteraktionsstudien mit Makroliden
(Tulathromycin, Clarithromycin) und Rifampicin nach akuter und chronischer Gabe
durchgeführt:
1. Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-alveolar cells is
influenced by comedication of rifampicin in foals (LVL M-V/TSD/7221.3-2.1-021/04;
Publikation 2)
2. Chronic effects of rifampicin on the pulmonary steady-state pharmacokinetics of
clarithromycin in healthy foals (LADDF MV/TSD/7221.3-1.1.-066/08; Publikation 3)
3. Pulmonary pharmacokinetics of rifampicin and clarithromycin and acute drug/drug
interactions between both drugs in healthy foals (LADDF MV/TSD/7221.3-1.1.-
066/08; Publikation 4)
Im Anschluss an die Applikation der Arzneimittel laut Studienprotokoll erfolgten
Blutabnahmen zur pharmakokinetischen Analyse über einen Zeitraum von 48 h
(Clarithromycin-Studien) bzw. 192 h (Tulathromycin-Studie). Das nach Zentrifugation
gewonnene Plasma wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Ferner wurde
in allen drei Studien 12 h nach letzter Arzneimittelgabe eine BAL zur Gewinnung der ELF
und BALC von erfahrenen Tierärzten durchgeführt. Hierzu wurden die Tiere zunächst
mittels Xylazininjektion sediert und anschließend mit einer Kombination aus Ketamin und
Diazepam in Narkose gelegt. Zur Durchführung der BAL und der Biopsie wurde ein flexibles
Endoskop genutzt. Die Lavage erfolgte durch viermaliges Spülen mit jeweils 100 ml warmer
isotoner Salzlösung.
Zur Expressionsbestimmung wurden die BALC und BEC für die ersten 24 h bei 4 °C in
RNAlater (RNAlater™ RNA Stabilization Reagent, Qiagen, Hilden, Deutschland) gelagert.
Die weitere Lagerung bis zur Isolation der RNA erfolgte bei -80 °C.
2 Methoden
10
Konzentrationsbestimmung der Markolide in den biologischen Matrices
Zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen sowie der Konzentrationen der
Hauptmetabolite 14-Hydroxyclarithromycin und 25-O-Desacetylrifampicin in den
biologischen Matrices wurden sensitive LC-MS/MS-Methoden etabliert (Publikation 1 und
[28]). Die Abweichungen von Präzision und Richtigkeit dieser Methoden lagen in den von
der FDA geforderten Grenzen von 15% (20% beim lower limit of quantification, LLOQ).
Die Konzentrationen von Cholesterol und dessen Metabolit 4β-Hydroxycholesterol wurden
mittels einer validierten GC-MS-Methode bestimmt und zur Errechnung der Ratio 4β-
Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol als Surrogat für die metabolische Aktivität von
hepatischem Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) genutzt.
Zur Berechnung der intrazellulären Konzentration der Arzneimittel (und Metabolite) in den
BALC wurde nach Jacks et al. ein Zellvolumen von 1,2 µl/106 alveolare Makrophagen
angenommen [29]. Die Konzentration in der ELF wurde unter Nutzung der
Harnstoffverdünnungsmethode nach Rennard et al. errechnet [30].
Genexpressionsuntersuchungen
Die Bestimmung des mRNA-Expressionslevels der Transportproteine ABCB1, ABCC2,
OATP1A2, OATP2B1 und OATP1B4, dem equinen Analogon zu den humanen
Transportern OATP1B1 und OATP1B3, sowie des nukleären Rezeptors PXR wurde
anfänglich semiquantitativ (Publikation 2) und in der späteren Studie quantitativ mittels real
time RT-PCR (Publikation 3) durchgeführt. Für letztere Methode wurden speziell für Pferde
entworfene Primer und Sonden und zur Quantifizierung die ΔΔCt-Methode genutzt [31].
In vitro-Affinität der Makrolide zu Transportproteinen
Zur Bestimmung der in vitro-Affinität der Makrolide zu den Effluxtransportern ABCB1 und
ABCC2 führten wir TRANSWELL Permeabilitäts-Untersuchungen and Madin Darby canine
kidney II (MDCKII)-Zellen durch. Weiterhin verwendeten wir für diese Untersuchungen auch
in der Arbeitsgruppe hergestellte in-side-out Vesikel von ABCC2 überexprimierenden 2008
Zellen (Publikation 2). Stabil transfizierte human embryonic kidney (HEK) 293 Zellen
wurden nach deren Etablierung und Validierung in unserer Arbeitsgruppe [32;33] zur
Analyse der in vitro-Affinität zu Aufnahmetransportern der OATP-Familie (OATP1A2,
OATP2B1, OATP1B1, OATP1B3) genutzt (Publikation 4). Hierzu wurden zum einen
Kompetitionsassays mit bekannten radioaktiv markierten Substraten der
Transporterproteine (OATP1A2 und OATP2B1: Estron-3-sulfat, OATP1B1 und 1B3: BSP)
durchgeführt. Zum anderen wurde die Affinität von Clarithromycin in direkten
Aufnahmeversuchen an den transfizierten Zellen getestet (Publikation 4).
2 Methoden
11
Biometrische Verfahren
Die pharmakokinetischen Daten wurden mit etablierten Standardmethoden analysiert. Für
alle Parameter wurden Mittelwert ± Standardabweichung (M±SD) angegeben. Zur
Auswertung der in vitro-Experimente an Zellen und Vesikeln wurde das Programm Prism
5.01 genutzt (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Intraindividuelle Unterschiede
wurden mit dem nicht parametrischen Wilcoxon-Test beurteilt, zur Evaluierung von
Unterschieden zwischen zwei Gruppen wurde der nicht parametrische Mann-Whitney-Test
genutzt, während Korrelationen nach Spearman berechnet wurden. Das Signifikanzniveau
für alle Tests lag bei p<0,05.
3 Ergebnisse
12
3 Ergebnisse
Die neu entwickelte und validierte analytische Methode zur Quantifizierung von
Clarithromycin, Rifampicin und deren Hauptmetaboliten erwies sich als hinreichend selektiv
und sensitiv zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den zu untersuchenden
biologischen Matrices. Die Methode stellte die experimentelle Grundlage zur
pharmakokinetischen Analyse der klinischen Studien dar (Publikation 1). Zur Bestimmung
der Konzentrationen von Tulathromycin in biologischen Proben konnte auf eine bereits
validierte analytische Methode zurückgegriffen werden [28].
Im Rahmen der durchgeführten klinischen Studien an gesunden Fohlen konnten folgende
neuartige Erkenntnisse gewonnen werden:
1. In den BALC wird die mRNA von PXR, ABCB1, ABCC2 und OATP2B1 exprimiert,
während in den BEC zusätzlich die mRNA von OATP1A2 und OATP1B4, dem equinen
Analogon zum menschlichen OATP1B1 und OATP1B3, exprimiert wird. Die chronische
Therapie mit Rifampicin in Kombination mit Clarithromycin führte nicht zur erwarteten
Induktion von ABCB1 und ABCC2 in BEC und BALC; in BALC kam es sogar zur
Verminderung der Expression von PXR und ABCC2 wobei jedoch die enge Korrelation
zwischen PXR- und ABCC2-Expression erhalten bleibt (Abb. 2). Die OATP1A2-
Expression wird in BEC herunterreguliert während die von OATP2B1 signifikant
induziert wird. Hinweise für eine Induktion von ABCB1 und ABCC2 in BALC aus der
Pilotstudie mit Tulathromycin mit gepooltem Material haben sich bei Vermessung aller
individuellen Proben mittels real-time RT-PCR nicht bestätigt (Publikation 2,3).
2. Tulathromycin zeigte keine Affinität zu ABCB1 und ABCC2 in transfizierten MDCKII-
Zellen (Publikation 2) während sich Clarithromycin in transfizierten HEK-Zellen als
Inhibitor von OATP1B3 > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1 erwies (Publikation 4). Im
Hinblick auf deren Expression im pulmonalen Gewebe (OATP1A2 in BEC und
OATP2B1 in BEC und BALC) könnte dieser Befund pharmakokinetisch für
Clarithromycin im Hinblick auf die Transporter OATP1A2 und OATP2B1 relevant sein.
Clarithromycin wies jedoch keine Substrateigenschaften dieser Aufnahmetransporter in
vitro auf (Publikation 4).
3 Ergebnisse
13
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
AB
CC
2 m
RN
A /
18S
rR
NA
r2 = 0.664
p < 0.001
PXR mRNA / 18S rRNA
Abb. 2: Korrelation der Genexpression von ABCC2 zu PXR in den BALC in acht gesunden Fohlen
sowohl nach Monotherapie (○) mit Clarithromycin (7,5 mg/kg KG, 7 d) als auch nach
Kombinationstherapie () mit Rifampicin (10 mg/kg KG, 11 d).
3. Beide in den tierexperimentellen Studien untersuchten Makrolide kumulierten in
Monotherapie in pulmonalen Kompartimenten: Tulathromycin in der ELF bis zum 33-
fachen sowie in den BALC bis zum 4-fachen und Clarithromycin bis zum 54-fachen in
der ELF sowie in den BALC bis zum 1510-fachen der jeweiligen
Plasmakonzentrationen. Die Konzentrationsgradienten zwischen BALC und ELF lagen
zwischen 0,83 – 14,6 für Tulathromycin und zwischen 4 – 67 für Clarithromycin. In allen
Kompartimenten wurde die minimale Hemmkonzentration (MIC) (Tulathromycin: >64
ng/ml, Clarithromycin: 120 ng/ml [34;35]) um das Mehrfache überschritten (Publikation
2-4).
4. Durch die akute und die chronische Komedikation von Rifampicin sanken die
Clarithromycinspiegel sowohl nach akuter als auch nach chronischer Komedikation im
pulmonalen Kompartiment auf ähnliche Werte, in der ELF zwischen 0,12 und
16,63 µg/ml sowie in den BALC auf Werte von 1,84 bis 74,6 µg/ml. Die Ratios
BALC/Plasma12h von Clarithromycin veränderten sich hingegen kaum weder nach
chronischer (838±449 vs. 757±478) noch nach akuter Komedikation (650±486 vs.
560±298) und unterschieden sich nicht von der jeweiligen Monotherapie. Im Gegensatz
dazu kam es in beiden Studien zur Verdopplung der Ratio ELF/Plasma12h (akute
Komedikation: 65,5±33,3 vs. 32,7±20,3, p<0,05; chronische Komedikation: 62,0±48,6
vs. 36,1±14,8, p<0,05) (Abb. 4) (Publikation 3,4).
Auch für Tulathromycin zeigte sich eine deutliche Verminderung der pulmonalen
3 Ergebnisse
14
Akkumulation mit Abnahme der Konzentration in den BALC um beinahe 50%
(Publikation 2).
5. Die Plasmaspiegel des nicht-metabolisierten Tulathromycin wurden durch Komedikation
von Rifampicin kaum beeinflusst. Auch die single-dose Komedikation von Rifampicin
beeinflusste die Pharmakokinetik von Tulathromycin nicht wesentlich (Publikation 2).
Die chronische Therapie mit Rifampicin führte zur drastischen Abnahme der
Plasmakonzentrationen von Clarithromycin (AUC-Abnahme um >90%) bei gleichzeitig
nur mäßiger, der Abnahme der Muttersubstanz nicht entsprechender Zunahme der
Plasmaspiegel des oxidativen Hauptmetaboliten 14-Hydroxyclarithromycin (Abb. 3).
Gleichzeitig kam es zur Induktion PXR-regulierter Gene im zentralen Kompartiment.
Dies konnte aus dem signifikanten Anstieg des Plasmakonzentrationsverhältnisses
zwischen 4β-Hydroxycholesterol und Gesamtcholesterol, einem Surrogat für die
hepatische CYP3A4-Aktivität, abgeleitet werden (Publikation 3).
In Übereinstimmung dazu war die Verminderung der relativen Bioverfügbarkeit von
Clarithromycin nach kurzzeitiger Komedikation von Rifampicin (2,5 Tage) ähnlich stark
ausgeprägt wie nach chronischer Gabe (Abb. 3), obwohl sich die Plasmaspiegel von 14-
Hydroxyclarithromycin wiederum nur geringfügig erhöhten und die Erhöhung der 4β-
Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratio als Indikator der hepatischen CYP3A4-
Aktivität völlig ausblieb (Publikation 4).
-RIF +RIF0
40
80
120
p = 0.017
ELF / Plasma
Konzentr
ationsverh
ältnis
A B
-RIF +RIF0
40
80
120
160
p = 0.036
ELF / Plasma
-RIF +RIF0
40
80
120
p = 0.017
ELF / Plasma
Konzentr
ationsverh
ältnis
A B
-RIF +RIF0
40
80
120
160
p = 0.036
ELF / Plasma
Abb. 3: Verhältnis der Clarithromycinkonzentration in ELF zu Plasma12h nach Monotherapie (- RIF)
und nach akuter (A) bzw. chronischer (B) Komedikation mit Rifampicin (10 mg/kg KG;
+ RIF) in 18 Fohlen der Oldenburger-Rasse (chronische Studie: Clarithromycin 7,5 mg/kg
KG, 13 d; akute Studie: Clarithromycin 7,5 mg/kg KG, 2,5 d)
3 Ergebnisse
15
chronische Studie akute Studie
0 6 12 18 240
200
400
600
800
1000
RIF
RIF
Cla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
0 6 12 18 240
50
100
150
200
250
14
-Hyd
roxycla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
Zeit (h)
0 6 12 18 240
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 240
50
100
150
200
250
Zeit (h)
chronische Studie akute Studie
0 6 12 18 240
200
400
600
800
1000
RIF
RIF
Cla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
0 6 12 18 240
50
100
150
200
250
14
-Hyd
roxycla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
Zeit (h)
0 6 12 18 240
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 240
50
100
150
200
250
Zeit (h)
Abb. 4: Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven in 18 Fohlen der Oldenburger-Rasse (chronische
Studie: 4 weibliche, 5 männliche Tiere, Alter 41-61 d, Gewicht 115-159 kg, akute Studie: 6
weibliche, 3 männliche Tiere, Alter 42-70 d, Gewicht 102 – 167 kg) für Clarithromycin und
dessen Hauptmetaboliten 14-Hydroxyclarithromycin nach Monotherapie (- RIF) bzw.
Kombinationstherapie mit Rifampicin (+ RIF, 10 mg/kg KG) von Clarithromycin (7,5 mg/kg
KG) nach chronischer Therapie (11 d) bzw. nach Akuttherapie für die Dauer von 2,5 d.
4 Diskussion
16
4 Diskussion
Für eine Reihe von Arzneistoffen ist die Beteiligung von Transportproteinen bei ihrer
Absorption und Elimination bereits gut beschrieben [17;36;37]. Es gibt Hinweise, dass auch
bei der pulmonalen Akkumulation Transportproteine eine Rolle spielen könnten [4;9]. Ein
Beispiel ist die klinisch notwendige Kombinationstherapie von Clarithromycin und
Rifampicin bei Atemwegsinfektionen von Zuchtfohlen. Transportproteine könnten hierbei
sowohl einen Einfluss auf die globale als auch auf die lokale Pharmakokinetik am Wirkort
der Antibiotika haben. Letzteres ist bisher nur unzureichend untersucht.
Um diesen Einfluss näher zu charakterisieren, führten wir zunächst Genexpressions-
untersuchungen an jungen Fohlen durch. Dabei konnten wir in Übereinstimmung mit van
der Deen et al. die mRNA von ABCB1 in den BEC und BALC nachweisen [9]. Entgegen der
widersprüchlichen Datenlage in Bezug auf die Expression von ABCC2 wiesen wir dessen
mRNA in beiden Zellarten nach. Gleichzeitig konnten wir erstmalig die mRNA-Expression
von OATP1A2, OATP2B1 und OATP1B4, dem equinen Analogon zum menschlichen
OATP1B1 und OATP1B3, in den unterschiedlichen Zellen der Lunge nachweisen. Somit
konnten wir das Wissen über die Transporterexpression in der Lunge deutlich erweitern.
Abbildung 5 zeigt die Transporterexpression in den BEC und BALC unter Berücksichtigung
unserer Forschungsbefunde.
Noch ist die genaue Lokalisation der Aufnahmetransporter in den BEC nicht bekannt,
dennoch ist es sehr wahrscheinlich, dass die pulmonalen Arzneistoffkonzentrationen durch
ein komplexes Zusammenspiel von Aufnahme- und Auswärtstransport erreicht werden. So
könnten die Aufnahmetransporter bei basolateraler Lokalisation Substanzen aus dem Blut
in die BEC aufnehmen, von wo aus diese durch die Vertreter der ABC-Familie in die ELF
gepumpt würden. Aus der ELF würden die Stoffe über Aufnahmetransporter in ihren
eigentlichen Wirkort, die BALC, aufgenommen werden, um gleichzeitig durch die ebenfalls
exprimierten Auswärtstransporter wieder hinaus in die ELF gepumpt zu werden.
4 Diskussion
17
BMInterstitium
Basalzelle
ABCG2
ABCC3
ABCC1ABCC2,4,5*
ABCC1 *
ABCB1
ABCC1
OCTN1
Alveolarmakrophage
BronchialepithelzellePEPT1*
ABCB1
ABCC2* ABCC7ELF
OCT1,2 *
PEPT2
OATP2B1‡
ABCC2‡
OATP2B1‡
OATP1A2‡
Abb. 5: Expression und Lokalisation von Transportproteinen in den Lungenzellen - modifiziert nach
van der Deen et al. 2005 und Bosquillon 2010 [4;9]; BM, Basalmembran; ELF,
Epithelialflüssigkeit; ABC, ATP-binding cassette; OATP, organic anion transporting
polypeptide; OCT, organic cation transporter; OCTN, organic cation/carnitine transporter;
PEPT, peptide transporter; *widersprüchliche Datenlage zur Expression und subzellulären
Lokalisation; ††
subzelluläre Lokalisation noch unbekannt
Neben der Expression dieser Transportproteine in der equinen Lunge sollte auch deren
funktionelle Relevanz beurteilt werden. Hierzu führten wir Untersuchungen mit den
Arzneistoffen Tulathromycin und Clarithromycin und dem etablierten Modulator Rifampicin
durch und analysierten die Verteilung der Makrolidantibiotika in die Lunge. Rifampicin wirkte
dabei nach chronischer Gabe als Induktor und nach akuter Gabe als Inhibitor auf die
Transportproteine (Publikation 2-4).
In den steady-state Studien mit Tulathromycin und Clarithromycin wiesen beide Makrolide
nach Monotherapie eine starke Akkumulation in den pulmonalen Kompartimenten ELF und
BALC auf (Publikation 2,3). Die beobachtete Akkumulation von Clarithromycin stimmt dabei
mit früheren Untersuchungen überein [6;8]. Die präsentierten Ergebnisse für Tulathromycin
sind neuartig, da hier bisher nur Konzentrationen in Lungengeweben von Schweinen und
Kühen bekannt waren. Die gefundene Anreicherung lag jedoch in ähnlichen
Größenordnungen [38;39].
4 Diskussion
18
Nach chronischer Komedikation mit Rifampicin sanken die Konzentrationen in den
pulmonalen Kompartimenten für Tulathromycin um circa 50% und für Clarithromycin um
beinahe 90%. Die MIC90-Werte für R. equi wurden dennoch nicht unterschritten, so dass
der Therapieerfolg nicht direkt gefährdet war (Publikation 2,3). Die Ergebnisse der
gleichzeitig durchgeführten Analysen zur Regulation der Genexpression im pulmonalen
Kompartiment waren überraschend, da sich die erwartete Induktion von ABCB1 und
ABCC2 in den BEC und BALC durch Komedikation mit Rifampicin nicht einstellte [40;41].
Eine zu geringe Rifampicinkonzentration in der ELF und den BALC können wir als Ursache
ausschließen. Die gefundenen Konzentrationen lagen zwischen 6 – 10 µM und somit in
dem Bereich der zur transkriptionalen Regulation über PXR ausreichend ist [40;42]. Auch
das Fehlen von PXR kann nicht ursächlich an der ausbleibenden Genexpressionsänderung
sein, denn sowohl in den BEC als auch in den BALC konnten wir die mRNA von PXR
nachweisen (Publikation 3). Eine weitere mögliche Ursache ist die Beteiligung anderer
nukleärer Rezeptoren [43;44]. Auch können gewebespezifische Regulationsmechanismen
durch beispielsweise epigenetische Einflüsse als Ursache der ausbleibenden Regulation
nicht ausgeschlossen werden [45].
Bei der weiteren Betrachtung der pulmonalen Kinetik fällt auf, dass die Akkumulation in den
BALC in direkter Abhängigkeit von der Plasmapharmakokinetik des Makrolids steht. Die
Ratios BALC/Plasma12h vor und nach Rifampicin-Komedikation unterscheiden sich in
beiden Studien nicht signifikant voneinander. Die deutliche Abnahme der Akkumulation
innerhalb der BALC ist somit auf die Reduktion der oralen Absorption und somit der
Bioverfügbarkeit von Clarithromycin um über 90% (AUC0-12h 0,35±0,31 vs.
5,54±4,42 µg×h/ml; p<0,05) durch die Behandlung mit Rifampicin über zwei Wochen
zurückzuführen. Die Plasmaspiegel des ABCB1- und CYP3A4-Substrates sanken dabei
deutlich auf Werte unterhalb der MIC90 für R. equi. Dies lässt sich nicht allein mit
gesteigertem ABCB1-Effluxtransport erklären. Der Anteil des ABCB1-bedingten Verlustes
an der Bioverfügbarkeit nach oraler Absorption für etablierte ABCB1-Substrate liegt im
Bereich von 20-25% und damit deutlich unterhalb des hier beobachteten Verlustes [46-49].
Im Gegensatz zu den ABCB1-Substraten Digoxin und Fexofenadin wird Clarithromycin
jedoch intensiv metabolisiert. Die nach chronischer Rifampicin-Komedikation gleichzeitig
beobachteten gesteigerten 4β-Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratios zeigten einen
gesteigerten hepatischen CYP3A4-Metabolismus an. Diesen Schluss lässt auch der
gestiegene Anteil des Metaboliten an der Gesamtexposition zu. An der drastisch
gesunkenen Gesamtexposition (1,08 ± 0,75 vs. 7,12 ± 5,44 µg×h/ml, p<0,05) wird jedoch
deutlich, dass der gesteigerte Metabolismus nicht allein für die geringere Bioverfügbarkeit
von Clarithromycin verantwortlich sein kann. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe,
4 Diskussion
19
dass die verminderte orale Bioverfügbarkeit Resultat eines durch Rifampicin gehemmten
Aufnahmemechanismus sein könnte.
Zur genaueren Klärung einer Beteiligung intestinaler Aufnahmemechanismen führten wir
eine zweite klinische Studie mit Clarithromycin an Fohlen durch. Rifampicin wurde hierbei
nur kurzzeitig gegeben und wirkte so als Inhibitor von zahlreichen Transportproteinen.
Während die Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven nach alleiniger Kurzzeitgabe von
Clarithromycin denen nach chronischer Gabe ähnelten, nahm auch die AUC von
Clarithromycin nach akuter Komedikation mit Rifampicin ähnlich stark ab. Im Unterschied
zur chronischen Studie lag der Verlust der Bioverfügbarkeit jedoch bei „nur“ circa 70%.
Während bei der chronischen Komedikation nachweislich auch die Induktion des
hepatischen Metabolismus eine Rolle spielte (Anstieg des 4β-
Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratio von 0,68±0,34 auf 1,05±0,4; p=0,004), sollte
dies bei kurzzeitiger Rifampicingabe umgangen werden. Die unveränderten 4β-
Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratios bestätigen dies. Dennoch muss
einschränkend hinzugefügt werden, dass dieser Surrogatparameter nur die Veränderung
des hepatischen, nicht aber die des intestinalen CYP3A4-Metabolismus beschreibt. Eine
Induktion auf Ebene der Enterozyten erscheint unter Berücksichtigung der oralen Gabe von
Rifampicin aber durchaus als wahrscheinlich. Denn auch nach kurzzeitiger Rifampicin-
Komedikation stieg der Anteil des Metaboliten von 21 auf 52% und lag damit in der gleichen
Größenordnung wie auch nach chronischer Komedikation. Den Bioverfügbarkeitsverlust der
Muttersubstanz kann dies dennoch nicht erklären.
Eine mögliche Ursache für die Minderung der oralen Absorption nach akuter und
chronischer Gabe von Rifampicin ist die Beteiligung von Aufnahmetransportern an der
globalen Kinetik von Clarithromycin. Ein weiteres plausibles Argument hierfür stellt die
Tatsache dar, dass die akute Interaktion zwischen Clarithromycin und Rifampicin nicht zu
beobachten ist, wenn beide Substanzen zeitlich versetzt appliziert werden [50]. So wurde
zum Beispiel für Fexofenadin, einem ABCB1- und OATP1A2-Substrat, ein Verlust an
Bioverfügbarkeit von circa 45% nachgewiesen [51;52]. Eine Erklärung dafür ist die
Hemmung des genannten Aufnahmetransporters. Eine derartige Interaktion auf Ebene
intestinaler Aufnahmetransporter der OATP-Familie wäre auch für die Makrolide denkbar,
da Rifampicin einen potenten Hemmstoff dieser Carrier darstellt. Aufgrund der bereits
beschriebenen Inhibition von OATPs durch Makrolide lag die Vermutung nahe, dass
Clarithromycin ebenfalls über diese intestinalen Aufnahmetransporter aufgenommen wird
(Publikation 3 und [15]). OATP1A2 und OATP2B1 werden im Darm exprimiert und kämen
somit als mögliche Aufnahmetransporter für Clarithromycin in Frage [53].
4 Diskussion
20
Zur Eingrenzung der am Makrolidtransport beteiligten Membranproteine führten wir in vitro-
Untersuchungen an geeigneten Zellmodellen bzw. Vesikeln und Membranfraktionen durch.
Hierbei stellte sich Tulathromycin nicht als Substrat der in den BEC und BALC exprimierten
Transporter ABCB1 und ABCC2 dar. Die beiden Auswärtstransporter sind somit nicht an
der Akkumulation Tulathromycins in der ELF beteiligt. Frühere Untersuchungen haben
einen Einfluss von ABCC7 auf die Akkumulation von Azithromycin und Roxithromycin in
fetale Trachealzelllinien gezeigt [11]. Die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den
Makroliden legen die Vermutung nahe, dass auch bei der Akkumulation von Tulathromycin
dieser Transporter eine Rolle spielen könnte.
Für Clarithromycin wurde die Affinität zu Vertretern der OATP-Familie an
überexprimierenden Zelllinien analysiert. Clarithromycin zeigte in den Kompetitionsassays
eine Affinität zu den untersuchten OATPs mit IC50-Werten zwischen 9,5 und 384 µM. Diese
Konzentrationen werden in vivo sowohl intestinal (Dosis/250ml) als auch im Lungengewebe
erreicht [6]. Gleichzeitig lagen diese Werte in den Konzentrationsbereichen, in denen auch
Seithel et al. bereits eine Inhibition der Transporter beobachtet haben [15]. Eine
pharmakokinetisch relevante Interaktion ist also durchaus denkbar. Dennoch trugen weder
OATP1A2, OATP2B1 noch OATP1B1 oder 1B3 zur Akkumulation von Clarithromycin in den
transfizierten Zellen bei. Ein derartiges Verhalten eines inhibitorisch wirksamen
Arzneistoffes, der selbst nicht transportiert wird, ist nicht häufig. Gleichwohl konnten Kindla
et al. vor kurzem einen allosterischen Inhibitionsmechanismus für nichtsteroidale
Antiphlogistika zeigen [54]. Während sowohl Diclofenac, Ibuprofen als auch Lumaricoxib die
Aufnahme von BSP über OATP1B1 und OATP1B3 hemmten, konnte nur für Diclofenac ein
Transport über OATP1B3 nachgewiesen werden. Für Clarithromycin wäre ebenso eine
allosterische Inhibition möglich. Somit kommen die OATPs nicht als intestinale
Aufnahmetransporter für Clarithromycin in Frage. Des Weiteren wären diese Carrier auch
keine Erklärung für den Übertritt der Substanz aus dem Blut in die ELF und die BALC.
Eine andere Erklärung für die in beiden Clarithromycin-Studien beobachteten starken
Verluste an Bioverfügbarkeit könnten im Darm basolateral exprimierte Effluxtransporter der
ABCC-Familie (MRPs) sein, die sowohl den Metaboliten als auch Clarithromycin als
Muttersubstanz transportieren. Es finden sich Hinweise in der Literatur, dass Vertreter der
ABCC-Familie am intestinalen Transport von Xenobiotika beteiligt sind [55]. Da diese
Transportproteine durch Rifampicin modulierbar sind, ist ihre Beteiligung an der Absorption
und den Veränderungen durch Rifampicin Komedikation gut denkbar [56].
Die bereits gut etablierte und auch in dieser Arbeit nachweislich replizierte Akkumulation
von Clarithromycin innerhalb der BALC kann durch so genanntes base trapping erfolgen, in
dem die schwach basischen Makrolide (pKA-Wert um 8,8) in den Lysosomen (pH-Wert um 3
[57]) der BALC protoniert vorliegen und somit für eine Rückdiffusion aus den BALC in die
4 Diskussion
21
ELF ungeeignet sind. Auch bei physiologischem pH-Wert von 7,4 im Blut liegt
Clarithromycin bereits zu mehr als 97% protoniert vor und ist als kationische
makrozyklische Verbindung schwer membrangängig. Die passive Diffusion dieses
makrozyklischen, geladenen Moleküls durch Membranen der Blutkapillaren in die ELF ist
daher aus physikochemischer Sicht unwahrscheinlich und suggeriert die Beteiligung von
Transportproteinen. Die These wird weiter durch den Befund gestärkt, dass die
Konzentration in den BALC in direkter Abhängigkeit zur Plasmakonzentration stand, die in
der ELF gefundenen Konzentrationen sich relativ zum Plasma gesehen jedoch
verdoppelten.
Weitere mögliche Kandidaten für den Transport von Makroliden sind Vertreter der organic
anion transporter (OAT-), organic cation transporter (OCT-) oder organic cation/carnitine
transporter (OCTN-) Familie. Bisher existieren keine publizierten in vitro-Untersuchungen,
die auf eine Beteiligung dieser Transporter schließen lassen. Es finden sich jedoch
Hinweise in der Literatur, dass neben der möglichen Beteiligung von OATPs auch die
Vertreter der OCTs als Transportproteine für Clarithromycin in Frage kommen [58], ebenso
sind OCTNs denkbar. Eine Beteiligung ist möglich, da Vertreter dieser Transporter sowohl
im Darm [59] als auch in der Lunge [4] exprimiert sind. Für eine Beteiligung von OCTs oder
OCTNs spricht weiterhin, dass Makrolide als schwach basische Verbindungen in
physiologischem pH-Wert Eigenschaften klassischer Substrate dieser Transporter [60]
aufweisen, da sie hauptsächlich als protonierte organische Verbindungen vorliegen. Dies
muss jedoch in weiteren Untersuchungen bestätigt werden.
Die Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des pathogenen
R. equi ist ein gutes Beispiel einer klinisch indizierten, aber aus pharmakokinetischen
Gesichtspunkten fragwürdigen Arzneimittelkombination. Trotz einer enormen
Absorptionsminderung von Clarithromycin durch die Komedikation mit Rifampicin kumuliert
Clarithromycin in der ELF und den BALC in therapeutisch ausreichend hohen
Konzentrationen. Die vorliegende Arbeit konnte unter Berücksichtigung der globalen und
lokalen Pharmakokinetik am Wirkort nachweisen, dass es bei der untersuchten
Kombination zu Interaktionen auf Ebene intestinaler Transportmechanismen kommt.
Die detaillierte Aufklärung der beteiligten Transportproteine konnte allerdings nicht erbracht
werden und bietet Ansatzpunkte für zukünftige Forschungsarbeiten.
5 Zusammenfassung
22
5 Zusammenfassung
Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den
pharmakokinetischen Eigenschaften eines Arzneistoffes bestimmt. Dabei spielt neben der
Absorption, dem Metabolismus und der Elimination auch der Transport und somit die
Verteilung des Arzneistoffes in die Zielkompartimente eine entscheidende Rolle. Dass
intestinal exprimierte Transportproteine einen entscheidenden Einfluss auf die Absorption
eines Arzneistoffes nach oraler Gabe ausüben, ist bereits gut dokumentiert. Die Beteiligung
dieser membranalen Proteine bei der Verteilung von Xenobiotika in die jeweiligen
Wirkkompartimente ist jedoch weniger umfassend untersucht. Ein Beispiel hierfür ist die
pulmonale Penetration eines oral verabreichten Arzneistoffes. Hier gibt es erste Hinweise,
die auf eine Beteiligung von Transportproteinen an der Akkumulation von beispielsweise
Makrolidantibiotika in der Lunge schließen lassen.
Daher war das Ziel der vorliegenden Dissertation, die Expression von für den
Arzneimitteltransport wichtigen Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten der Lunge
und gleichzeitig den Einfluss dieser auf die Verteilung von Arzneistoffen in die pulmonale
Epithelialflüssigkeit und die bronchoalveolären Lavagezellen zu untersuchen. Die klinisch
indizierte Kombinationstherapie eines Makrolides mit Rifampicin zur Eradikation von
Rhodococcus equi in Fohlen bietet eine geeignete Grundlage dafür.
Zur Auswertung pharmakokinetischer Untersuchungen von Clarithromycin und Rifampicin
entwickelten und validierten wir eine Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie
(LC-MS/MS)-Methode. Diese Methode ermöglichte die Quantifizierung von Clarithromycin,
14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und dessen Hauptmetaboliten 25-O-
Desacetylrifampicin sowohl in den Plasma-, Lavage- und Zellproben der tierexperimentellen
Studien nach Gabe therapeutischer Dosen als auch in den Zelllysaten der in vitro-
Untersuchungen (Publikation 1).
In den ersten beiden tierexperimentellen Interaktionsstudien an gesunden Fohlen sollte der
Einfluss einer chronischen Komedikation von Rifampicin, einem Induktor der
Genexpression der Transporter ABCB1 und ABCC2, auf die Verteilung der Makrolide
Tulathromycin bzw. Clarithromycin in die pulmonale Epithelialflüssigkeit und die
bronchoalveolären Lavagezellen untersucht werden. Hierbei stellten wir nach
Rifampicingabe eine deutliche Abnahme der Akkumulation beider Makrolide in den
pulmonalen Kompartimenten fest. Die mittels sensitiver TaqMan®-Methoden durchgeführten
Genexpressionsuntersuchungen ergaben den unerwarteten Befund einer fehlenden
Induktion der mRNA von ABCB1 und ABCC2 durch Rifampicin. Für Clarithromycin ist
bekannt, dass es ein Substrat von ABCB1 und ABCC2 ist. Gleichzeitig konnten in vitro-
5 Zusammenfassung
23
Transportstudien an ABCB1- und ABCC2-überexprimierenden Zellmodellen sowie Vesikeln
von ABCC2-transfizierten Zellen zeigen, dass Tulathromycin keine Affinität zu den
genannten Transportproteinen besitzt (Publikation 2). Somit konnten die pulmonalen
Auswärtstransporter nicht ursächlich sein für den Verlust an Makrolidkonzentration an ihrem
Wirkort. Gleichzeitig beobachteten wir eine signifikante Reduktion der oralen
Bioverfügbarkeit von Clarithromycin um mehr als 90% wohingegen die Bioverfügbarkeit von
Tulathromycin nur um 25% sank. Dieser drastische Verlust an Bioverfügbarkeit von
Clarithromycin konnte weder allein mit einem gesteigerten intestinalen Efflux noch durch
den gesteigerten hepatischen Metabolismus des CYP3A4-Substrates erklärt werden.
Vielmehr wiesen die Ergebnisse auf eine Beteiligung anderer intestinaler
Aufnahmemechanismen hin (Publikation 3).
Die daraufhin durchgeführte tierexperimentelle Studie zur Untersuchung der Interaktion von
Clarithromycin und Rifampicin nach kurzzeitiger Kombination erbrachte eine ähnliche
Reduktion der Akkumulation des Makrolids in der Epithelialflüssigkeit und den
bronchoalveolären Lavagezellen. Die orale Absorption war ebenfalls drastisch vermindert,
jedoch um „nur“ 70% reduziert. Der Bioverfügbarkeitsverlust war somit deutlich geringer
ausgeprägt als bei der chronischen Interaktionsstudie beider Arzneistoffe. Den Unterschied
von etwa 20% in der Veränderung der oralen Absorption von Clarithromycin konnten wir mit
der nach akuter Komedikation ausbleibenden Induktion von ABCB1, ABCC2 und dem
Biotransformationsenzym CYP3A4 begründen (Publikation 4).
Auffallend, und die These der Beteiligung von Transportproteinen an der oralen Absorption
sowie der pulmonalen Distribution stützend, waren die gestiegenen Verhältnisse der
Konzentration von Clarithromycin in der Epithelialflüssigkeit verglichen zum Plasma. Sowohl
nach chronischer als auch nach akuter Komedikation beobachteten wir eine Verdopplung
dieses Verhältnisses.
Die zur weiteren Aufklärung der möglicherweise beteiligten Aufnahmetransporter
durchgeführten Transportuntersuchungen zeigten einen inhibitorischen Einfluss von
Clarithromycin auf Vertreter der organic anion transporting polypeptide (OATP-) Familie
(OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1). In den folgenden direkten
Akkumulationsversuchen stellte sich Clarithromycin jedoch nicht als Substrat der genannten
Transportproteine dar (Publikation 4).
Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation verdeutlichen, dass die klinisch
indizierte Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des
pathogenen R. equi mit einer drastischen Absorptionsminderung von Clarithromycin
verbunden ist und dass auch die Akkumulation im Wirkkompartiment, den
bronchoalveolären Lavagezellen, deutlich beeinträchtigt ist. Dennoch werden in der
5 Zusammenfassung
24
pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den bronchoalveolären Lavagezellen therapeutisch
ausreichend hohe Konzentrationen erreicht. Wir konnten im Vergleich der akuten und der
chronischen Interaktion der Antibiotika die Beteiligung von intestinalen
Transportmechanismen, die durch Rifampicin modulierbar sind, nachweisen. Die detaillierte
Aufklärung der beteiligten Transportproteine bietet Ansatzpunkte für zukünftige
Forschungsarbeiten.
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7 Publikationen
32
7 Publikationen
7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of clarithromycin,
rifampicin and their main metabolites in horse plasma, epithelial lining fluid and
broncho-alveolar cells (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
2011; 55(1):194-201).
7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-alveolar
cells is influenced by comedication of rifampicin in foals (Naunyn
Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 2010;381(2):161-9)
7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic comedication
of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition, accepted for
publication June 20th, 2011; doi:10.1124/dmd.111.039206)
7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is
sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time drug
interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition, under review)
J Pharm Biomed Anal. 2011;55(1):194-201 7.1 Publikationen
33
7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of clarithromycin,
rifampicin and their main metabolites in horse plasma, epithelial lining
fluid and broncho-alveolar cells (Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis 2011; 55(1):194-201).
Eigene Leistung:
Material und Methoden
o Planung und Entwicklung der analytischen Methode zur quantitativen
Bestimmung der Analyten in den biologischen Matrices bei Fohlen
o Validierung der analytischen Methode und fortlaufende Qualitätssicherung
o Vermessung der in der klinischen Studie gewonnenen Proben mit der neu
entwickelten Methode
Ergebnisse
o biometrische Auswertung dieser Ergebnisse (inkl. Qualitätsdaten)
o Interpretation der Validierungsdaten
Abfassung des Manuskriptes
Stefan Oswald:
Anleitung bei der Planung, Durchführung, Auswertung und Validierung der
analytischen Messungen
Anleitung zur Interpretation der Validierungsdaten
Mitarbeit bei der Planung und Korrektur des Manuskriptes
Monica Venner:
Mitarbeit bei der Abfassung und Korrektur des Manuskriptes
Werner Siegmund:
Planung und Überwachung aller Experimente sowie inhaltliche Begleitung und
Korrektur bei der Erstellung des Manuskriptes
Unterschrift des Betreuers
7.2 Publikationen Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 2010; 381:161-169
42
7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-
alveolar cells is influenced by comedication of rifampicin in foals
(Naunyn Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 2010;381(2):161-9)
Eigene Leistung:
Material und Methoden
o Transportuntersuchungen an isolierten Membranvesikeln
o Mitarbeit bei der Probenverarbeitung in der klinischen Studie
Ergebnisse
o Auswertung der Experimente zu den Transportuntersuchungen an isolierten
Membranvesikeln
o Auswertung der Genexpressionsanalysen
o alle pharmakokinetischen und biometrischen Auswertungen aus der
klinischen Studie
o Interpretation sämtlicher Ergebnisse sowohl aus den
Transportuntersuchungen an Zellen und Membranvesikeln wie auch der
Genexpressionsanalysen und pharmakokinetischen Daten sowie den
statistischen Auswertungen
Abfassung des Manuskriptes
Monica Venner:
Mitarbeit bei der Planung und Durchführung der tierexperimentellen Studie
Mitarbeit bei der Abfassung und Korrektur des Manuskriptes
Nina Höhensteiger:
Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel, Narkose,
Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage
Birthe Schock:
Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel, Narkose,
Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage
Alexa Bornhorst:
Durchführung der Genexpressionsanalysen
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 2010; 381:161-169 7.2 Publikationen
43
Markus Grube:
Mitarbeit bei der Gestaltung und Abfassung des Manuskriptes
Ulrike Adam:
Durchführung und Auswertung der Transportversuche an ABCB1 bzw. ABCC2
überexprimierenden MDCKII-Zellen
Eberhard Scheuch:
Durchführung aller analytischen Arbeiten
Werner Weitschies:
Mitarbeit bei der Planung und Korrektur des Manuskriptes
Dieter Rosskopf:
Mitarbeit bei der Planung und Korrektur des Manuskriptes
Heyo K. Kroemer:
Mitarbeit bei der Korrektur des Manuskriptes
Werner Siegmund:
Planung und Überwachung der Experimente, Anleitung zur Interpretation der
Ergebnisse und Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes
Unterschrift des Betreuers
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
53
7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic
comedication of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition,
accepted for publication June 20th, 2011; doi:10.1124/dmd.111.039206)
Eigene Leistung:
Material und Methoden
o tierexperimentelle Studie: Planung und Durchführung aller Arbeiten in der
klinischen Studie, die keine tierärztliche Approbation erfordern. Im
Speziellen: Erstellung der Studiendokumente, Verarbeitung der Blutproben
zur Bestimmung der Pharmakokinetik, Verarbeitung der in der Studie
gewonnenen pulmonalen Proben, inkl. der bei der bronchoalveolären Lavage
gewonnenen Spülflüssigkeit, Aufteilung in Lavageflüssigkeit und
bronchoalveoläre Zellen sowie die Zellzahlbestimmung.
o Arzneimittelanalytik: Durchführung aller Arzneimittelanalysen zu den
Antibiotika in den biologischen Matrices aus den tierexperimentellen
Untersuchungen, inkl. Probenaufbereitung
o Genexpressionsuntersuchungen in den Alveolarmakrophagen und
Bronchialepithelzellen mittels TaqMan®-Technologie
o alle biometrischen Analysen
Ergebnisse
o Auswertung der pharmakokinetischen Daten der klinischen Studie
o Auswertung der Konzentrationsbestimmung der Sterole
o Auswertung der Genexpressionsanalysen
o Auswertung sämtlicher biometrischer Analysen
o Interpretation sämtlicher Ergebnisse der Genexpressionsanalysen,
Arzneimittelanalysen und den resultierenden pharmakokinetischen Daten,
der Sterolmessungen sowie der statistischen Auswertungen
Abfassung des Manuskriptes
Wiebke Block:
Durchführung tierärztlicher Arbeiten bei den Fohlen: Applikation der Arzneimittel,
Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage und
Bronchialbiopsie
Stefan Oswald:
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
54
Anleitung und Überwachung der Durchführung und Auswertung analytischer
Arbeiten zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den biologischen Proben
aus der tierexperimentellen Studie
Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes
Johanna Freyer:
Mithilfe bei der Durchführung der Genexpressionsanalysen
Markus Grube:
Mitarbeit bei der Planung der Experimente sowie bei der Abfassung des
Manuskriptes
Heyo K. Kroemer:
Mitarbeit bei der Abfassung und Korrektur des Manuskriptes
Marc Lämmer:
Mithilfe bei der Durchführung der tierärztlichen Arbeiten bei Fohlen
Dieter Lütjohann:
Durchführung der Konzentrationsbestimmung der Sterole
Monica Venner:
Mitarbeit bei der Planung und Überwachung der tierärztlichen Arbeiten sowie bei der
Planung und Korrektur des Manuskriptes
Werner Siegmund:
Planung der Experimente, Anleitung zur Interpretation der Daten sowie Mitarbeit bei
der Abfassung des Manuskriptes
Unterschrift des Betreuers
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
55
Reprinted with permission of the American Society for Pharmacology and Experimental
Therapeutics. All rights reserved.
ORAL ABSORPTION OF CLARITHROMYCIN IS NEARLY ABOLISHED BY CHRONIC
COMEDICATION OF RIFAMPICIN IN FOALS
Jette Peters, Wiebke Block, Stefan Oswald, Johanna Freyer, Markus Grube, Heyo K.
Kroemer, Marc Lämmer, Dieter Lütjohann, Monica Venner, Werner Siegmund
Form the Department of Clinical Pharmacology (JP, SO, JF, WS) and Department of
General Pharmacology (MG, HKK), University of Greifswald; the Department of Clinical
Chemistry and Clinical Pharmacology, University of Bonn, (DL); the Veterinary Clinic (MV),
Trift 4, 38162 Destedt, and the Lewitz Stud, Lewitzhof 1, 19306 Neustadt-Glewe, Germany
(WB, ML)
Abstract
The delivery of clarithromycin (CRL) to its site of action in bronchial/alveolar epithelial cells
(EC), bronchial epithelial lining fluid (ELF) and bronchoalveolar lavage cells (BALC) may be
influenced by CYP3A4 and the drug transporters ABCB1, ABCC2 and OATPs which can be
modulated and/or upregulated via the nuclear pregnane X receptor (PXR) by rifampicin
(RIF). Therefore, we evaluated disposition and pulmonary distribution of CLR (7.5 mg/kg
b.i.d., 21 days) and expression of ABCB1, ABCC2, OATP1A2 and OATP2B1 in EC and
BALC before and after comedication of RIF (10 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy foals (41-
61 days, 115-159 kg) in which the genetic homology of drug transporters is close to their
human analogs. After RIF comedication, relative bioavailability of CLR decreased by more
than 90%. Concentrations in plasma (29.8±26.3 ng/ml vs. 462±368 ng/ml), ELF (0.69±0.66
µg/ml vs. 9.49±6.12 µg/ml) and BALC (10.2±10.2 µg/ml vs. 264±375 µg/ml, all p<0.05) were
lowered drastically whereas levels of the metabolite 14-hydroxyclarithromycin (14OH-CLR)
were not elevated despite higher 4β-OH-cholesterol/cholesterol plasma concentration ratio,
a surrogate for CYP3A4 induction. In presence of CLR, ABCC2 and PXR mRNA content
were significantly and coordinately (r2=0.664, p<0.001) reduced in BALC after RIF. In EC,
mRNA expression of OATP1A2 increased but of OATP2B1 decreased (both p<0.05).
RIF interrupts oral absorption and decreases CRL plasma levels below the minimal
inhibitory concentration for eradication of Rhodococcus equi. Evidence exists for RIF to
influence the cellular uptake of CLR in bronchial cells and the PXR expression in BALC in
presence of high CLR concentrations.
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
56
Introduction
Efficacy of drugs is dependent on the availability of active concentrations at the site(s) of the
desired pharmacodynamic effect. In the case of infectious lung diseases, for instance, the
minimum inhibition concentrations (MIC) for antimicrobial agents must be exceeded in the
environment of the respective bacteria; i.e. in the bronchial and alveolar epithelial cells
(EC), in the bronchial epithelial lining fluid (ELF) and in bronchoalveolar lavage cells (BALC)
of which about 80% are alveolar macrophages. Thus, the frequently prescribed macrolide
antibiotics penetrate into these pulmonary spaces to reach drug levels many times above
the concurrent plasma concentrations at steady-state (BALCELFplasma) (Conte, Jr. et
al., 1995). The mechanisms by which macrolides accumulate in pulmonary cells are poorly
understood. So far, trapping of the basic compounds in acidic compartment of alveolar
macrophages (i.e. lysosomes, endosomes) is the only plausible rationale. However,
BALC/plasma gradients of 50-100 : 1 and steeper and accumulation in the
alveolar/bronchial ELF are not solely explainable by base trapping. There is ample evidence
that unidirectional penetration of drugs from the blood throughout the vascular and the
alveolar/bronchial epithelium into the alveolar/bronchial ELF and from there into the BALC is
achieved by the coordinate interplay of multidrug transporters. To the current knowledge,
the cell membranes along the pulmonary penetration route are equipped with uptake
carriers of the organic anion transporting polypeptide (OATP), organic cation transporter
(OCT) and peptide transporter (PEPT) families and with efflux carriers of the ATP-binding
cassette (ABC) family which are also expressed along the intestinal/hepatic absorption
route of the drugs (Bosquillon, 2010; Chan et al., 2004).
To evaluate whether and how multidrug transport proteins influence absorption and
pulmonary distribution of macrolides, we initiated a multiple-dose drug interaction study with
clarithromycin (CLR) and rifampicin (RIF) in healthy foals. CLR is a substrate of cytochrome
P450 (CYP) 3A4, ABCB1 (P-glycoprotein) and probably of ABCC2 (multidrug resistance
associated protein 2) and of OATPs (Garver et al., 2008; Seithel et al., 2007; Suzuki et al.,
2003; Lan et al., 2009; Munic et al., 2010). The efflux carriers ABCB1 and ABCC2 and
several OATPs are modulated in the presence of RIF (Geick et al., 2001; Vavricka et al.,
2002) After chronic treatment, however, RIF can up-regulate gene expression of intestinal
and hepatic CYP3A4, ABCB1, ABCC2 and OAP1A2 via the nuclear pregnane X receptor
(PXR) pathway (Lau et al., 2006; Tirona, 2011; Vavricka et al., 2002; Zong and Pollack,
2003). We have recently shown, that RIF may also regulate pulmonary ABCB1 and ABCC2
of healthy foals (Venner et al., 2010). Therefore, the overall changes in absorption and
pulmonary distribution of CRL may be caused by competitive effects in presence of RIF and
by the chronic effects as caused by PXR-type transporter induction.
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
57
We have chosen foals for our mechanistic drug interaction study because of the clinical
challenge in horse-breeding to eradicate Rhodococcus equi which resists innate
macrophage defense in adult horses but causes severe caseous, necrotisizing lung
infection in the foals with high mortality rate of up to 80% (Hillidge, 1987). Combined
antimicrobial therapy with macrolides and RIF has become the most effective treatment
protocol to increase the survival rate from 20% to nearly 90% (Hillidge, 1987). In a
retrospective study it was shown that the combination of RIF with CLR is superior to
combinations with erythromycin or azithromycin (Giguère et al., 2004). Secondly, we have
chosen the animal model because bronchoscopy and bronchoalveolar lavage are accepted
diagnostic techniques in foals for sampling of biomaterial. Finally, the sequence homology
of the equine drug transporters is distinctly closer to the human analogs (ABCB1, 92%;
ABCC2, 82%; OATP1A2, 85%; OATP2B1 89% on protein basis) than, for instance, the
homology of the transporter of rats which are often used to predict the situations in human
beings (Abcb1a, 86%; Abcb1b, 79%; Abcc2, 77%; Oatp1a5, 72%; Oatp2b1, 76% on protein
basis, www.ncbi.nih.gov, www.ebi.ac.uk) (Hagenbuch and Meier, 2004).
Material and methods
Study protocol
Animals: The drug interaction study was performed after approval by the State Authority of
Mecklenburg/Vorpommern (reference code: LALLF M-V/TSD/7221.3-1.1-066/08). Nine
foals (4 females, 5 males, age 41-61 days, body weight 115-159 kg) of warm-blooded
horses of the Oldenburger trait were included after confirmation of good health by physical
examinations including sonography of the lung and routine clinical-chemical and
hematological screenings. The animals were kept at natural light rhythm on paddocks
together with their mares and had free access to equine milk, hay, oats and tap water. All
clinical examinations were done in individual stables which were covered with straw. Prior to
the study, the foals did not receive any other medication.
Study design: The drug interaction study was performed under steady-state condition within
a study period of 21 days. Initially, the foals were treated orally with 7.5 mg/kg CLR (Abbott,
Wiesbaden, Germany) twice daily for 6 days. A last dose was given in the morning of the 7th
study day. On treatment days 9-19, the animals received 7.5 mg/kg CLR and 10 mg/kg RIF
(Gruenenthal GmbH, Aachen, Germany) twice daily. Administration of CLR was continued
until the morning of the 21st day while RIF was not given on the 20th day or in the morning of
the 21st day to avoid competitive interferences with the pharmacokinetics of CLR after last
administration. RIF tablets suspended in 30 ml water and the commercial CLR suspension
were sprinkled in the mouth using a syringe to be completely swallowed by the foals.
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
58
To evaluate pharmacokinetics of CLR on treatment days 7 and 21, venous blood was
collected via an indwelling jugular vein cannula (Vygon, Aachen, Germany) before and 0.33,
0.66, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 36 and 48 h after administration. Plasma was
separated by centrifugation at 2.000 x g for 10 min and stored at least at -80°C until further
analysis.
To measure drug distribution in the ELF and BALC, a bronchoalveolar lavage (BAL) was
performed 12 h after the last administrations of CLR of each study period as described
recently (Venner et al., 2010). In brief, after anesthesia with ketamine (Serumwerke,
Bernburg, Germany) and diazepam (ct-Arzneimittel, Berlin, Germany), a flexible fiberscope
(Karl Storz, Tuttlingen, Germany) was advanced through the nose into the trachea to take
two biopsy specimen from the bronchial epithelium behind the carina. Then, the endoscope
was advanced and wedged in a second-generation bronchus. The lavage was performed by
repeated instillation of 100 ml phosphate buffered saline (pH 7.4, temperature about 37 °C).
The first aspirate was discarded to remove the excess of epithelial cells. Three additional
aliquots were combined, filtered through a layer of gauze (Lohmann and Rauscher,
Neuwied, Germany) and centrifuged at 400 g for 10 min. The BALC pellet consisted of 77-
84.5% alveolar macrophages, 11.5-18.5% lymphocytes and 2.5-8.5% mast cells as
confirmed by May-Gruenwald staining. For mRNA analysis of ABCB1, ABCC2 and PXR,
the biopsy specimens and aliquots of 5 106 BALC were incubated overnight with RNAlater
buffer (4 °C) (Qiagen, Hilden, Germany) before freezing. For drug analysis, aliquots of
BALC and of the supernatant were shock frozen using dry ice and stored at -80°C until
further use.
Quantitative assays for clarithromycin and 4-β-hydroxycholesterol
CLR and 14-hydroxyclarithromycin (14OH-CLR) were quantified in plasma, lavage fluid and
BALC using a validated LC-MS/MS method as recently described (Oswald et al., 2011a).
The limit of quantification for all matrices was 2.5 ng/ml. The within-day accuracy of the
assay ranged from -11.8 to 9.3% of the nominal concentrations and precision was 1.6 to
11.2% of means (coefficient of variation). Between-day accuracy was -11.7 to 8.6% of the
nominal concentrations and precision was 3.7 to 10.0% of the respective mean control
values. CLR and 14OH-CLR concentrations in ELF were assessed by normalizing to the
concentration ratio of urea in plasma over bronchoalveolar fluid and in BALC to a mean
macrophage cell volume of 1.2 µl/106 cells in foals (Jacks et al., 2001; Rennard et al.,
1986). Urea was quantified using the kit LT-UR 0010 (Labortechnick Eberhard Lehmann,
Berlin, Germany).
Plasma concentrations of 4-β-hydroxycholesterol (4β-OH-C) were assayed using GC-MS
for a isotope dilution method with [26.26.26.27.27.27-2H6] 4β-OH-C as an internal standard
as described previously (Tomalik-Scharte et al., 2009). The lower limit of quantification was
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
59
3.0 ng/ml for plasma. Between-day and within-day precision was 2.1 and 2.7%,
respectively, of the mean values and between-day and within-day accuracy was between
2.9 and 3.3% of the nominal values.
Quantitative mRNA expression of drug transporters and PXR
The bronchial biopsy specimens and BALC were homogenized using a dismembrator
(Braun, Melsungen, Germany), total RNA was prepared applying the NucleoSpin® RNAII Kit
(Macherey-Nagel, Dueren, Germany) and reverse transcription of 100 ng RNA was
performed using the SuperScript®VILO™ cDNA Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)
according to the protocols of the manufacturers. The quantitative real-time RT-PCR analysis
for ABCB1, ABCC2 and PCR was conducted using primers assembled for equine mRNA
(PrimerDesign, Southampton, United Kingdom). The sequences were as follows,
ABCB1_SE 5`-AGGATGTTCTGTTGGTATTCTCA-3`; ABCB1_AS 5`-
GACACTTTGGCTTTGGCATAG-3`; ABCC2_SE 5`-ACTTCAATG-CCACCAACTATCC-3`;
ABCC2_AS 5`-CACCTTGTGCTAATCCCAGAG-3`; PXR_SE 5`-
CGATTGTCCAAAGTTGATAATTTACG-3` and PXR_AS 5`-CGGAGCCATTAG-
GAATAGTAGAAT-3`. Sequences for the probes for ABCB1, ABCC2 and PXR were 5`-
(FAM)-CAAATGAACTGACCTGCCCCACTGCC, 5`-(FAM)-
CCATAGACGCCAACTCTCAAGTCCCTCT and 5`-(FAM)-
CTCTCTGCCAACCATCTCCATAGCCT, respectively. For mRNA quantification of
OATP1A2 and OATP2B1, we used equine primers according to the instruction of the
manufacturer (Applied Biosystems, Foster City, USA). The RT-PCR was performed using
the TaqMan® method with human 18s rRNA (Applied Biosystems, Foster City, USA) as
reference due to the high homology between the equine and human gene. Each experiment
was conducted in duplicates. Gene expression was quantified using the ΔΔct method.
Biometrical evaluation
Maximum (Cmax) and minimum (Cmin) plasma concentrations and the time of Cmax (tmax) at
steady-state were taken from the plasma concentration-time curves. The area under the
plasma concentration-time curve (AUC0-12h) was calculated using the trapezoidal rule and
the average plasma concentration (Cav) was derived (AUC/dosing interval). Terminal
elimination half-life (t1/2) was estimated by log-linear regression analysis. For group result,
arithmetic means±standard deviations (mean±SD) are given. Differences between two
groups were evaluated using the nonparametric Wilcoxon test and correlations were
assessed using Spearman´s rank test, both with p<0.05 as level of significance.
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
60
Results
CLR was slowly absorbed during the chronic oral treatment to generate average plasma
concentrations between 133 ng/ml and 1300 ng/ml at steady-state (Figure and Table 1).
The plasma exposure (AUC0-12h) of the metabolite 14OH-CLR amounted to 33±9% of the
CLR exposure (metabolic ratio). CLR accumulated along the pulmonary distribution route to
reach more than 30-fold higher levels in the ELF and 700-fold higher concentrations in
BALC than in plasma at trough 12 hours after administration. 14OH-CLR underwent similar
accumulation even though to a lower extent (ELF, about 5-fold; BALC, about 44-fold; Table
2). Please note in Table 1, that the concentrations for CLR and 14OH-CLR in plasma are
given in ng/ml and in ELF and BALC in µg/ml. CLR was eliminated in foals at steady-state
with terminal half-lives between 4.7 and 7.3 hours.
After comedication of RIF for 11 days, relative bioavailability of CLR decreased by more
than 90%; accordingly, the average plasma concentrations (Cav) were significantly reduced
and fell even below the minimum inhibition concentration (MIC) for Rodoccocus equi (Jacks
et al., 2003). The elimination rate was not significantly influenced. The drastic decrease of
CLR bioavailability did not result in a proportional increase of metabolite exposure, although
relative 14OH-CLR exposure increased more than 7-fold compared to the situation before
RIF comedication (metabolic ratio: 2.56±0.97 versus 0.33±0.09, p<0.05). Lower
bioavailability of CLR after RIF was also associated with parallel lowering of CLR and
14OH-CLR in ELF and BALC by more than 90% and 60%, respectively, as compared to the
levels reached by CLR mono-therapy. Remarkably, CLR penetrated significantly better into
the ELF after RIF comedication as confirmed by the increase of the ELF/plasma
concentration ratio (Figure 2). RIF treatment was also associated with induction of systemic
metabolic activity. The 4β-OH-C/cholesterol plasma concentration ratio significantly
increased from 0.68±0.34 to 1.05±0.40 (p=0.004) (Figure 3). However, the pulmonary
mRNA expression of the efflux transporters ABCB1 and ABCC2 and of the nuclear PXR
receptor was not significantly up-regulated by RIF; the bronchoalveolar mRNA content of
ABCC2 and PXR was even significantly reduced (Figure 4). Nevertheless, we found a
significant correlation between the decrease in PXRmRNA and the decrease in
ABCC2mRNA expression in BALC (Figure 5). OATP1A2mRNA and OATP2B1mRNA were
expressed in EC. In BALC, only OATP2B1 was markedly expressed. RIF comedication
significantly decreased the mRNA content of OATP1A2 in EC but increased that of
OATP2B1 (Figure 6). Content of both OATPmRNAs was not significantly correlated to the
content of PXRmRNA
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
61
Discussion
By this drug interaction study it was clearly shown, that chronic comedication of RIF leads to
a dramatic lowering of the average steady-state plasma concentrations of CLR by more
than 90% and in turn to a similarly limited distribution into the bronchial ELF and BALC. RIF
comedication was not associated with up-regulation of the pulmonary efflux transporters
ABCB1 and ABCC2. Nevertheless, the distribution of CLR into the ELF in absolute
measures was decreased while it was nearly twofold increased relative to the (lowered)
plasma levels after RIF. Interestingly, RIF comedication was associated with decreased
OATP1A2mRNA but increased OATP2B1mRNA expression levels in EC.
The dramatic decrease of the steady-state levels is doubtlessly the consequence of nearly
complete abolition of CLR bioavailability because the plasma half-lives remained
unchanged after comedication of RIF. In healthy foals, bioavailability of CLR after oral
administration is incomplete (60%) as caused at least in part by presystemic “first pass”
metabolism by which the active 14OH-CLR is generated (Womble et al., 2006). The results
of in-vitro studies using human liver microsomes and recombinant CYPs suggested that
CYP3A4 plays a major role in the overall metabolic clearance of CLR (Suzuki et al., 2003).
Another reason for deficit bioavailability could be intestinal efflux transport. Macrolides are
substrates of ABCB1 as confirmed by competitions assays using Caco2, MDCK and
ABCB1-overexpressing MES-SA/Dx5 (ATCC, CRL-1976) human uterine sarcoma cells.
From these in-vitro studies, the overall impression can be derived, that CLR has moderate
affinity to ABCB1 (Munic et al., 2010; Pachot et al., 2003; Hughes and Crowe, 2010). There
is also evidence for macrolides to be substrates of ABCC2 as shown for azithromycin by
pharmacokinetic studies in Abcc2-deficient rats and in a drug interaction study with
probenecid, an inhibitor of ABCC2 (Sugie et al., 2004). Therefore, the drastic lowering of the
average CLR plasma concentrations by more than 90% may have resulted from induction of
hepatic and intestinal CYP3A4 and intestinal ABCB1, and probably ABCC2.
RIF is a prototype ligand for the nuclear PXR receptor that regulates many drug
metabolizing enzymes and multidrug transport proteins in the small intestine and the liver
(Handschin and Meyer, 2003; Glaeser, 2011; Oswald et al., 2011b; Tirona, 2011). Induction
of hepatic CYP3A4 in our study was confirmed by significant increase of the 4ß-
hydroxycholesterol/cholesterol plasma concentration ratio, an accepted endogenous
metrics for hepatic CYP3A4 activity in-vivo (Yang and Rodrigues, 2010). Nevertheless, the
plasma levels of 14OH-CLR increased only to a limited extent and did not agree with the
large loss in CLR bioavailability. Therefore, induction of intestinal efflux transport seems to
be the major reason for lower bioavailability which is also supported by the results of clinical
studies in man. According to the summary of product characteristics (SMPC) of the
manufacturers for CLR, strong enzyme inducers of the CYP450 system may accelerate the
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
62
metabolism of CLR and, by this, decrease the plasma levels of the parent drug in human
patients by about 30-40% and increase the concentrations of the microbiologically active
14OH-CLR by the same extent (e.g. Klacid®, Abbott, Wiesbaden, Germany). In contrary to
the product information, the results of two clinical studies in patients with pulmonary
Mycobacterium avium complex infections showed a somewhat different feature. In all
patients, the trough plasma concentrations of CLR were markedly lower when administered
together with RIF (<20% of the levels after monotherapy); the 14OH-CLR levels, however,
were not different (Wallace, Jr. et al., 1995; Taki et al., 2007). Interestingly, the decrease of
CLR exposure could be avoided if RIF and CLR were administered at different times, i.e.,
CLR seems to be absorbed by a mechanism which is susceptible to direct competition with
RIF (Taki et al., 2007) but this mechanism has not been identified yet.
Therefore, we are encouraged to provide an alternative hypothesis to which inhibition of a
so far unknown intestinal uptake transporter in the presence of RIF may have caused lower
bioavailability of CLR; instead of or additionally to the absorption deficit as caused by RIF-
type induction of ABCB1. Candidates might by members of the OATP-family which are
known to be modulated by RIF in-vitro (Vavricka et al., 2002). Firstly, CLR is a potent
inhibitor of the taurocholate uptake in rat Oatp1a5-transfected MDCK cells, the nearest
analog to human OATP1A2. Both rat Oatp2b1 and human OATP2B1 were not inhibited by
clarithromycin (Garver et al., 2008; Lan et al., 2009). Secondly, oral bioavailability of CLR in
rats was reduced by 45% in the presence of RIF. Thirdly, RIF had no effect on body
clearance of CLR and did most likely not cause induction of metabolic enzymes and/or
transporters after the short-time comedication in this study (120-180 min) (Garver et al.,
2008). Therefore, a member of the OATP-family might be involved in intestinal absorption of
CLR although there is little evidence that rat Oatp1a5/human OATP1A2 or
rat Oatp2b1/human OATP2B1 really are the candidates (Lan et al., 2009). Hence,
alternative intestinal absorption pathways must exist which are susceptible to inhibition by
RIF. Anyway, in assuming competition of RIF with an intestinal uptake transporter for CLR,
it must be considered that RIF also modulates ABCB1 and ABCC2 (Zong and Pollack,
2003; Lau et al., 2006) which are also expressed in the horse intestine (Tyden et al., 2009).
Thus, the net effect resulting from modulation of intestinal OATP(s) and/or induction of
ABCB1/ABCC2 must have overshadowed in extent the modulating effects of RIF on the
ABCB1/ABCC2-mediated efflux of CLR.
Whatsoever mechanism has influenced the “first-pass” route of CLR, the average steady-
state plasma concentrations in our foals dropped down to levels below the MIC (90%) of
0.12 µg/ml for Rhodoccocus equi (Jacks et al., 2003). Although manifold decreased, the
concentrations in the ELF and BALC were still above the desired MIC. Nevertheless, there
are many doubts from a pharmacokinetic point of view that combination therapy of CLR with
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
63
RIF might really be superior to other eradication protocols as suggested by the results of a
retrospective clinical study in foals (Giguère et al., 2004). Absence of major drug
interactions as shown in our recent pharmacokinetic study with tulathromycin and RIF
should be confirmed before launching a combination treatment in clinical practice (Venner
et al., 2010).
A second major finding in our study was the more intensive distribution of CLR into the
bronchial ELF despite markedly lower plasma concentrations after RIF comedication. We
have hypothesized that finding in advance because, as discussed above, CLR is a
substrate of ABCB1 (and probably of ABCC2) and RIF is a strong inducer of both. Both
ABCB1 and ABCC2 are expressed in the apical membrane of the EC and in the cell
membrane of BALC and both may mediate active efflux of their substrates into the ELF and
the environment of macrophages, respectively (Bosquillon, 2010; Seral et al., 2003a; Seral
et al., 2003b). According to our recent preliminary data, mRNA expression of ABCB1 and
ABCC2 (semi-quantitative RT-PCR in pooled samples) can be up-regulated by RIF in foals
(Venner et al., 2010). We also found, that the trough BALC concentrations of RIF after
administration of 10 mg/kg given twice daily (6.0±1.3 µmol/l, N=9, Oldenburger trait,
unpublished own result) are in the same order of magnitude as the in-vitro concentrations
necessary to activate the nuclear PXR and to increase CYP3A4, ABCB1 and ABCC2
activity (2-10 µM) (Geick et al., 2001; Kast et al., 2002). In fact, our results did not suit our
working hypothesis; ABCB1 expression remained unchanged and ABCC2 was even
significantly down-regulated by RIF comedication. However, we must consider some
methodological limitations because quantitative PCR was performed 48 h after RIF last
administration. We cannot exclude that mRNA levels returned to their pre-treatment levels
while expression of the transporter protein in the cell membrane was still high, causing an
increase in CLR accumulation in the ELF.
Pulmonary penetration of drugs is extremely complex, not well understood and not only
mediated by efflux transporters. In man, the uptake carriers PEPT2 and OCTN2 are
expressed in the apical membrane of the EC. In alveolar macrophages, OCTN1 and
OATP2B1 are expressed. In the lung, mRNA transcripts were also identified for OCT3,
OCTN1, OATP1A2 and OATP2B1 (Bosquillon, 2010; Endter et al., 2009; Moreau et al.,
2011). OATP1A2 and 2B1 are highly conserved in Equus caballus (mRNA homology
compared to human genes: OATB1A2 88%, OATP2B1 84%, ww.ncbi.nih.gov,
www.ebi.ac.uk). To our data in foals, OATP1A2 is expressed in EC and OATP2B1 in EC
and BALC; the exact cellular localization is unknown so far.
It is rather speculative to find a conclusive rationale for higher ELF/plasma ratios of CLR
after RIF comedication because of the complexity of parallel processes. In our study, equine
OATP2B1 in EC was regulated by RIF. Others also found OATP1A2 to be induced by RIF
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
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via a PXR response element (Meyer zu Schwabedissen et al., 2008). On the other hand,
OATPs are inhibited in the presence of RIF (Vavricka et al., 2002). If the pulmonary OATPs
are localized to the basolateral site of EC, higher ELF/plasma ratios are explained by
upregulation of OATP2B1 by chronic RIF comedication. In case of apical localization of the
uptake carriers, the pharmacokinetic phenomenon in presence of RIF (downregulation and
or inhibition) is in line with delayed CLA reuptake from the bronchial ELF back to EC during
systemic elimination of the drug. Therefore, information on the pulmonary localization of
OATPs and quantitative data on affinity of CLA and RIF to the uptake transporters and their
regulatory elements is needed before the results of the drug interaction study can be
rationally discussed.
A third interesting and, to our knowledge, new finding in our study was the coordinate down-
regulation of ABCC2mRNA expression in significant correlation to the PXRmRNA content
(r=0.815) in the BALC after comedication of RIF; a tendency for lower PXRmRNA levels
was also observed in EC. Please notice, that the down-regulation of PXR occurred in the
presence of high cellular CLR concentrations (about 350 mM !). PXR-activating
concentrations of RIF in presence of high CLR concentrations obviously inhibit mRNA
expression of PXR whereas the interaction between PXR with other nuclear receptors and
transcriptional factors that regulate the ABCC2 target gene seemed not to be disrupted by
RIF/CLR as shown for ketoconazole and CYP3A4 (Lim et al., 2009). Future research is
required to elucidate the mechanism behind our finding in BALC of foals.
Conclusions: Chronic comedication of RIF in foals leads to an unexpectedly strong
decrease of the bioavailability of CLR. By this undesired drug interaction, the plasma levels
fall below the MIC for eradication of Rhodococcus equi. Evidence exists for RIF to influence
the cellular uptake of CLR in bronchial cells and the PXR expression in BALC in presence
of high CLR concentrations.
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Acknowledgements
The authors thank Gitta Schumacher, Sabine Bade and Danilo Wegner for excellent
technical assistance.
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Authorship Contributions
Participated in research design: Peters, Grube, Kroemer, Venner and Siegmund.
Conducted experiments: Peters, Block, Freyer, Lämmer and Venner.
Contributed new reagents or analytic tools: Oswald and Lütjohann.
Performed data analysis: Peters, Block and Oswald.
Wrote or contributed to the writing of the manuscript: Peters, Oswald, Grube, Kroemer,
Venner and Siegmund.
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Legends for Figures
Figure 1: Plasma-concentration time curves of clarithromycin (above) and 14-
hydroxyclarithromycin (below) after chronic treatment with 7.5 mg/kg twice
daily before (-RIF) and after (+RIF) comedication of rifampicin (10 mg/kg b.i.d.,
11 days) in 9 healthy foals.
Figure 2: Accumulation of clarithromycin in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and
bronchoalveolar lavage cells (BALC) after chronic treatment with 7.5 mg/kg
twice daily before (-RIF) and after (+RIF) comedication of rifampicin
(10.0 mg/kg b.i.d., 11 days). The cell/plasma ratios are given for 8 healthy foals
(the plasma level was in one animal <LOQ).
Figure 3: 4β-OH-cholesterol/cholesterol plasma concentration ratios before (-RIF) and
after (+RIF) treatment with rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy
foals.
Figure 4: Expression of ABCB1mRNA, ABCC2mRNA and PXRmRNA (relative to
18SrRNA) in bronchoepithelial cells (upper figures) and bronchoalveolar
lavage cells (lower figures) before (-RIF) and after (+RIF) treatment with
rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy foals.
Figure 5: Correlation between the mRNA content of PXR and ABCC2 bronchoepithelial
cells (left) and brochoalveolar lavage cells (right) in 9 healthy foals.
Figure 6: Expression of OATP1A2mRNA and OATP2B1mRNA (relative to 18SrRNA) in
bronchoepithelial cells (EC) and bronchoalveolar lavage cells (BALC) before (-
RIF) and after (+RIF) treatment with rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9
healthy foals.
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Figure 1
0 6 12 18 240
200
400
600
800
1000
RIF
RIF
cla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
0 6 12 18 240
50
100
150
200
250
14
OH
-cla
rith
rom
ycin
(n
g/m
l)
time (h)
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72
Figure 2
-RIF +RIF0
40
80
120
160
p = 0.036
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-RIF +RIF0
400
800
1200
1600
2000
p = 1.000
BALC / plasma
-RIF +RIF0
20
40
60
80
p = 0.110
BALC / ELF
Figure 3
-RIF +RIF
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
p = 0.004
4O
H-c
hole
ste
rol / chole
ste
rol
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
73
Figure 4
-RIF +RIF0
2
4
6
8
p = 0.260
ABCB1
18S
rR
NA
ratio
-RIF +RIF0
1
2
3
4
5
p = 0.889
18S
rR
NA
ratio
-RIF +RIF0
1
2
3
4
5
p = 0.441
ABCC2
-RIF +RIF0
1
2
3
4
p = 0.025
-RIF +RIF
0
10
20
30
p = 0.086
PXR
-RIF +RIF0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
p = 0.025
Figure 5
0 5 10 15 20 250
1
2
3
4
5
AB
CC
2 m
RN
A /
18S
rR
NA
r2 = 0.194
p = 0.067
PXR mRNA / 18S rRNA
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
r2 = 0.664
p < 0.001
PXR mRNA / 18S rRNA
7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011
74
Ta
ble
1:
Ph
arm
acokin
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ch
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ristics
of
cla
rith
rom
ycin
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1
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roxycla
rith
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rom
ycin
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10
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/kg
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rith
rom
ycin
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roxycla
rith
rom
ycin
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a
AU
C0-1
2h
(µ
g×
h/m
l)
Cm
ax
(n
g/m
l)
Cm
in
(n
g/m
l)
Cav
(n
g/m
l)
t max
(h
)
t ½
(h)
pla
sm
a12h
(n
g/m
l)
EL
F12h
(µ
g/m
l)
BA
LC
12
h
(µ
g/m
l)
with
ou
t
RIF
5
.54
± 4
.42
6
14
± 3
65
262
± 2
54
462
± 3
68
3.7
3 ±
1.7
9
6.1
1 ±
0.8
3
301
± 2
70
9.4
9 ±
6.1
2
264
± 3
75
cla
ri-
th
rom
ycin
RIF
0
.35
± 0
.31*
65.0
± 5
1.5
* 9
.26
± 9
.63*
29.8
± 2
6.3
* 2
.84
± 1
.79
6
.88
± 3
.44
1
3.9
± 1
5.8
0
.69
± 0
.66*
10.2
± 1
0.2
*
with
ou
t
RIF
1
.58
± 1
.03
1
61
± 6
9.9
8
4.7
± 6
8.1
1
32
± 8
6.0
3
.56
± 2
.59
8
.11
± 1
.61
9
2.0
± 6
4.3
0
.41
± 0
.20
4
.73
± 5
.49
14-h
yd
roxy-
cla
ri-
th
rom
ycin
R
IF
0.7
2 ±
0.4
4*
109
± 5
4.3
* 2
1.0
± 2
1.3
* 6
0.4
± 3
6.8
* 2
.89
± 1
.76
5
.10
± 0
.88*
29.6
± 2
6.7
0
.13
± 0
.08*
1.7
1 ±
1.2
2*
*p<
0.0
5 (
Wilc
oxo
n te
st)
DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen
75
Ta
ble
2:
Ra
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rom
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and
14
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roxycla
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12
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rith
rom
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EL
F/p
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LC
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BA
LC
/EL
F
with
ou
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IF
36.1
± 1
4.8
7
57
± 4
78
25.8
± 2
3.0
cla
rith
rom
ycin
RIF
6
2.0
± 4
8.6
* 8
38
± 4
49
14.3
± 6
.79
with
ou
t R
IF
4.8
2 ±
1.8
6
44.2
± 1
7.1
1
1.2
± 9
.14
14
-hyd
roxycla
rith
rom
ycin
RIF
4
.88
± 2
.02
6
3.0
± 2
0.0
1
4.2
± 4
.90
*p<
0.0
5 (
Wilc
oxo
n te
st)
7.4 Publikationen DMD, under review
76
7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is
sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time drug
interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition, under
review)
Eigene Leistung:
Material und Methoden
o tierexperimentelle Studie: Planung und Durchführung aller Arbeiten in der
klinischen Studie, die keine tierärztliche Approbation erfordern. Im
Speziellen: Erstellung der Studiendokumente, Verarbeitung der Blutproben
zur Bestimmung der Pharmakokinetik, Verarbeitung der in der Studie
gewonnenen pulmonalen Proben, inkl. der bei der bronchoalveolären Lavage
gewonnenen Spülflüssigkeit, Aufteilung in Lavageflüssigkeit und
bronchoalveoläre Zellen sowie die Zellzahlbestimmung.
o Arzneimittelanalytik: Durchführung aller Arzneimittelanalysen in den
biologischen Matrices aus den tierexperimentellen Untersuchungen, inkl.
Probenaufbereitung, ebenso Probenaufbereitung und Vermessung aller
Proben aus den in vitro Transportuntersuchungen im Zellmodell
o Planung und Durchführung sämtlicher Transportuntersuchungen zu
Clarithromycin mittels Kompetitionsassays und Direkttransportversuchen an
transfizierten HEK-Zellen
o alle biometrischen Analysen
Ergebnisse:
o Auswertung aller pharmakokinetischer Daten der klinischen Studie
o Auswertung der Konzentrationsbestimmung der Sterole
o Auswertung der Transportexperimente an transfizierten Zellen
o Auswertung sämtlicher biometrischer Analysen
o Interpretation sämtlicher Ergebnisse der Transportversuche an transfizierten
HEK-Zellen, der Arzneimittelanalysen und den resultierenden
pharmakokinetischen Daten, Interpretation der Sterolmessungen sowie der
statistischen Auswertungen
Abfassung des Manuskriptes
Karen Eggers:
Mitarbeit bei der Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel,
Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage
DMD, under review 7.4 Publikationen
77
Stefan Oswald:
Anleitung und Überwachung der Durchführung und Auswertung analytischer
Arbeiten zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den biologischen Proben
aus der tierexperimentellen Studie
Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes
Wiebke Block:
Mitarbeit bei der Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel,
Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage
Dieter Lütjohann:
Durchführung der Konzentrationsbestimmung der Sterole
Marc Lämmer:
Mitarbeit bei der Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel,
Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage
Monica Venner:
Mitarbeit bei der Planung und Überwachung der tierärztlichen Arbeiten sowie bei der
Planung und Korrektur des Manuskriptes
Werner Siegmund:
Planung der Experimente, Anleitung bei der Interpretation der Daten und Mitarbeit
bei der Abfassung des Manuskriptes
Unterschrift des Betreuers
7.4 Publikationen DMD, under review
78
Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is
sensitive to major inhibition by rifampicin – results of a short-time drug
interaction study in foals
Jette Peters, Karen Eggers, Stefan Oswald, Wiebke Block, Dieter Lütjohann, Marc Lämmer,
Monica Venner, Werner Siegmund
From the Department of Clinical Pharmacology, University of Greifswald (JP, SO, WS), the
Lewitz Stud, Lewitzhof 1, 19306 Neustadt-Glewe, Germany (KE, WB, ML, MV) and the
Department of Clinical Chemistry and Clinical Pharmacology, University of Bonn, Germany
(DL)
Abstract
Pulmonary penetration of clarithromycin (CLR) in epithelial lining fluid (ELF) and broncho-
alveolar lavage cells (BALC) can be influenced by CYP3A4, ABCB1 and to our hypothesis
by a member of the OATP-family for which rifampicin (RIF) is inhibiting in single doses but
inducing after long-term co-medication. To assess the partial inhibitory effect, we measured
absorption and pulmonary distribution of CLR after short-term (2.5 days) co-medication of
RIF after which up-regulation is still not expected. The drug interaction study was performed
with five doses (12h interval) of CLR (7.5 mg/kg) and RIF (10 mg/kg) in nine healthy foals;
horse transporters are very similar in protein sequence and transcriptional regulation to the
human analogues. RIF equally distributed into ELF but reached half the plasma levels in
BALC. The de-acetylated metabolite accumulated 1.4-6-fold in ELF and 8-60-fold in BALC.
CLR did not significantly influence distribution of RIF. CLR and 14-hydroxy-clarithromycin
(14OH-CLR), accumulated approximately 20-40-fold and 1.5-4.5-fold in ELF as well as 300-
1,800-fold and 25-90-fold in BALC, respectively. By RIF, plasma levels of CLR dropped
down by more than 70% without changing 14OH-CLR formation, half-lives of CLR and
14OH-CLR and the 4-ß-hydroxycholesterol/cholesterol ratio, a surrogate for CYP3A4
induction. CLR was an inhibitor of OATP1B3 (IC50=9.50±3.50µM), OATP1B1
(IC50=46.0±2.27µM), OATP1A2 (IC50=92.6±1.49µM) and OATP2B1 (IC50=384±5.30µM) but
not a substrate for these transporters in transfected HEK cells. In conclusion, despite no
significant inducing effects, RIF lowers plasma levels of CLR below the MIC90 of pathogenic
bacteria most likely by inhibition of an unknown intestinal uptake transporter.
DMD, under review 7.4 Publikationen
79
Introduction
The invasion of orally administered drugs to the sites of pharmacodynamic action, e.g. in
the lung, can be influenced by the activity of drug metabolizing enzymes and transport
proteins in the intestinal wall, the liver and in pulmonary compartments such as the
broncho-epithelial cells (BEC), the epithelial lining fluid (ELF) and luminal cells that can be
sampled by broncho-alveolar lavage (broncho-alveolar-lavage cells, BALC) (Giacomini et
al., 2010; van der Deen et al., 2005). Major factors known to change the function of these
enzymes and transporters are genetic polymorphisms, drug interactions and diseases.
Thus, we have recently evaluated oral absorption and pulmonary distribution of
clarithromycin (CLR) at steady-state before and after long-term co-medication of rifampicin
(RIF) in foals because CLR is a substrate for cytochrome P450 (CYP) 3A4 and for the efflux
transporters ABCB1 (and likely for ABCC2) which are expressed in enterocytes,
hepatocytes, BEC and BALC and which can be induced by chronic treatment with the
pregnane-X receptor (PXR) ligand RIF (Peters et al., 2011; Urquhart et al., 2007).
Pharmacokinetic studies in foals are suitable to predict transporter variability in human
beings because of their body size enabling non-invasive experimental procedures (e.g.
broncho-alveolar lavage, BAL) and because protein sequence of drug transporters in
horses exhibits high homology to the respective human proteins (www.ncbi.nih.gov,
www.ebi.ac.uk). CLR and RIF are components of treatment protocols for eradication of
Rhodococcus equi which causes severe necrotisizing pneumonia with high mortality rate in
foals (Giguère et al., 2004). While information about CLR pharmakokinetics and pulmonary
distribution exists to a certain extend only little is known about RIF pharmakokinetics and its
distribution into pulmonary compartments.
Astonishingly for a well established clinical drug combination, we recognized in our long-
term study, that the plasma levels of CLR fall by more than 90 % even below the minimum
inhibitory concentration required to inhibit the growth of 90% (MIC90%) of Rhodococcus equi
(Jacks et al., 2003). The distribution of CLR into the ELF in absolute measures was
decreased while, interestingly, it was nearly two-fold increased relative to the (lowered)
plasma levels after RIF. A further interesting finding was, that RIF comedication resulted in
decreased OATP1A2 mRNA but increased OATP2B1 mRNA expression levels in BEC,
whereas the expected up-regulation of the pulmonary efflux transporters ABCB1 and
ABCC2 in BEC and BALC did not occur. However, it was unknown whether CLR is a
substrate for OATPs and whether RIF reaches pulmonary compartments in concentrations
known to induce PXR-regulated transporter gene expression in-vitro (Meyer zu
Schwabedissen et al., 2008; Kast et al., 2002; Geick et al., 2001). Furthermore, we could
not clarify whether the nearly abolished CLR absorption resulted entirely from induction of
intestinal efflux via ABCB1/ABCC2 or whether a so far unknown intestinal uptake
7.4 Publikationen DMD, under review
80
transporter susceptible to inhibition by RIF was involved, most likely a member of the
OATP-family for which RIF is a strong inhibitor (Vavricka et al., 2002).
To get deeper insights into the mechanisms behind our major findings with CLR after long-
term treatment with RIF, further research was needed, i.e. to measure the exposure of RIF
in lung compartments, to evaluate affinity of CLR to OATPs and to quantify that portion of
the absorption deficit that is most likely caused by inhibition of an intestinal uptake
transporter for CLR. Therefore, we initiated a cross-over drug interaction study with CLR
and RIF at steady-state following short-term repeated dosing by which expression of drug
metabolizing enzymes and drug transporters is not expected to be up-regulated in a
significant manner. Furthermore, we evaluated in vitro whether CLR is a substrate and/or an
inhibitor of OATP1A2, 2B1, 1B1 and 1B3 which are expressed along the oro-hepatic uptake
route of CLR into lung compartments.
Material and methods
Animal experimental study
Animals: The pharmacokinetic CLR-RIF interaction study was performed in healthy warm-
blooded foals (N=9, 6 females, 3 males, age 6-10 weeks, body weight 102-167 kg) of the
Oldenburger trait after approval of the State Authority of Mecklenburg-Vorpommern,
Germany. Good health of the animals was confirmed by physical examination including
sonography of the lung and routine clinical-chemical and hematological screenings. The
animals were housed at natural light rhythm and free access to equine milk, standard
pellets, hay, oats and tap water. All clinical examinations were performed in individual
stables covered with straw. The foals did not receive any other medication for at least 4
weeks prior to the study.
Study protocol: The drug interaction study was performed controlled, three-period, cross-
over with wash-out phases of 11 days between the study periods. In the study periods, the
foals received 5 times either 10 mg/kg RIF (Rifampicin, Gruenenthal GmbH, Aachen,
Germany), 7.5 mg/kg CLR (Klacid, Abbott, Wiesbaden, Germany) or 10 mg/kg RIF in
combination with 7.5 mg/kg CLR in intervals of 12 hours according to the randomization list.
For administration, RIF tablets suspended in 30 ml of water and the commercially available
CLR suspension were sprinkled in the mouth using a syringe to ensure complete
swallowing by the foals. Pharmacokinetics was measured after last administration of the
respective study medication in the morning of the 3rd treatment day. Venous blood was
collected via an indwelling jugular vein catheter before and 0.33, 0.66, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6,
8 and 12 hours after administration; and after 16, 24, 36 and 48 hours to calculated
elimination half-lives correctly. Plasma was separated by centrifugation at 2.000 x g for
10 min and stored at least at -80°C until further analysis. 12 h after administration, a BAL
DMD, under review 7.4 Publikationen
81
was performed as described recently to measure drug distribution in the ELF and BALC
(Peters et al., 2011). The BALC pellet consisted of 42-82.5% alveolar macrophages, 16.5-
57.0% lymphocytes, 0-1.5% mast cells and 0-2.5% neutrophil granulocytes as confirmed by
May-Gruenwald staining.
Assays for drugs, major metabolites and 4β-hydroxycholesterol
CLR, 14-hydroxy-clarithromycin (14OH-CLR), RIF and 25-O-desacetylrifampicin (DAc-RIF)
in plasma, lavage fluid and BALC were quantified by LC-MS/MS as recently described
(Oswald et al., 2011). The lower limit of quantification (LLOQ) for all matrices was 2.5 ng/ml.
Within-day accuracy ranged for all analytes between -6.1 and 13.7% of the nominal
concentrations and within-day precision was 1.6 to 12.6% of means (coefficient of
variation). Between-day accuracy was -3.6 to 9.1 % of the nominal concentrations and
precision was 3.4 to 13.3% of mean controls. Drug concentrations in ELF were assessed by
normalizing to the concentration of urea in lavage fluid over the concentrations in plasma
and in BALC to a mean macrophage cell volume of 1.2 µl/106 cells in foals (Jacks et al.,
2001; Rennard et al., 1986). Plasma concentrations of 4-β-hydroxycholesterol (4βOH-C)
were assayed using GC-MS for an isotope dilution method with [26.26.26.27.27.27-2H6]
4βOH-C as an internal standard as described previously (Tomalik-Scharte et al., 2009).
The LLOQ was 3.0 ng/ml for plasma. Between-day and within-day precision was 2.1 and
2.7%, respectively, of the mean values and between-day and within-day accuracy was
between 2.9 and 3.3% of the nominal values.
Biometrical evaluation
Maximum (Cmax) and minimum (Cmin) plasma concentrations and the time of Cmax (tmax) at
steady-state were taken from the plasma concentration-time curves. The area under the
plasma concentration-time curve (AUC0-12h) was calculated using the trapezoidal rule and
the average plasma concentration (Cav) was derived (AUC/dosing interval). Terminal
elimination half-life (t1/2) was estimated by log-linear regression analysis of the terminal
slope. Arithmetic means ± standard deviations (mean±SD) are given. Differences between
two groups were evaluated using the nonparametric Wilcoxon and Mann-Withney test as
appropriate.
Cellular uptake by HEK-OATPs
Chemicals: CLR, estrone-3-sulphate (E3S) and bromosulfophthalein (BSP) were obtained
from Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany). [3H]-BSP (14 Ci/mmol) was purchased from
Hartmann Analytic (Braunschweig, Germany) and [3H]-E3S (50 Ci/mmol) was acquired from
Biotrend (Cologne, Germany).
Competitions assays with CLR: HEK-OATP1A2, 1B1, 1B3, 2B1 and the respective vector-
transfected control cells (HEK-VC) were established as previously described (Leonhardt et
al., 2010; Mandery et al., 2010). For competition assays, the cells were seeded in 24-well
7.4 Publikationen DMD, under review
82
plates (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) in full growth medium (minimal essential
medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 2 mM
nonessential amino acids; PAA, Coelbe, Germany) for three days at an initial density of
200,000 cells per well. Before starting the experiments, the cells were washed with
phosphate buffered saline (PBS, temperature 37°C). [3H]-BSP and [3H]-E3S were dissolved
in incubation buffer and unlabeled substrates were added to reach final concentrations of
0.05 µM and 1.0 µM BSP for OATP1B1 and OATP1B3, respectively, and of 1.0 µM E3S for
OATP1A2 and OATP2B1. After incubation at 37°C for 5 min in the presence or absence of
CLR, the cells were washed three times with ice-cold PBS and lysed with 0.5% Triton-X-100
and 0.5% sodium deoxycholate. Aliquots were mixed with 2 ml of scintillation cocktail
(Rotiszint eco plus, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) and the intracellular accumulation of
radioactivity was measured using a scintillation beta counter (type 1409; LKB-Wallac,
Turku, Finland). During the incubation time of 5 min, the cellular influx of BSP and E3S was
still in the linear range (data are not shown).
Uptake assays with CLR: To measure time-dependence of CLR-uptake, HEK-OATP1A2
and 2B1 were incubated with 0.1 mM CLR and HEK-OATP1B1 and 1B3 with 0.01 mM CLR
for 60 min. Afterwards, the cellular uptake of CLR in OATP1A2 and 2B1 (3.9-500 µM) and in
OATP1B1 and 1B3 (1.9-250 µM) was measured after incubation for 1 min. Within 1 min, the
uptake was still in the linear range. After adding 0.2% sodium dodecyl sulfate, CLR was
quantified in cell lysates using LC-MS/MS as described before (Oswald et al., 2011). Protein
concentrations were determined using the BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific
Inc. Rockford, USA) according to the manufacturer’s instructions. All experiments were
performed in triplicates.
In all experiments, the substrate uptake in OATP-transfected cells was corrected by the
vector control uptake. In competition assays, 50% inhibitory concentration (IC50) was
calculated by fitting the data to a sigmoidal dose-response regression curve using Prism 5
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Means±SD are given.
Results
Pharmacokinetic interaction between CLR and RIF
RIF was slowly absorbed from the gastrointestinal tract and reached maximum plasma
concentrations between 7.93 and 19.5 µg/ml after administration of the last maintenance
dose (Figure 1). The parent drug was eliminated with half-lives between 9.48 and
19.8 hours. Formation of the de-acetylated metabolite DAc-RIF accounted to <1 % of the
plasma exposure of total RIF. RIF equally distributed into the ELF but reached only half the
plasma levels in BALC. In contrast, the more polar metabolite achieved concentration
gradients of 1.3-6 in ELF and approximately 8-60 in BALC relative to plasma (Table 1,
DMD, under review 7.4 Publikationen
83
Figure 2). Co-medication of CLR did not significantly influence any pharmacokinetic
characteristics and pulmonary distribution of RIF except formation of the de-acetylated
metabolite which was numerically decreased in presence of CLR.
CLR after short-term administration was faster absorbed than RIF; tmax occurred
approximately one hour earlier. Plasma exposure, accumulation in pulmonary
compartments, formation of 14OH-CLR and elimination rates for CLR and the metabolite
were quite similar to the data obtained in our recent long-time study which was performed
with the same staff and in identical experimental environment (Peters et al., 2011). By co-
medication of RIF, the plasma concentrations dropped down by more than 70 % without
change of 14OH-CLR formation and without influencing half-lives of CLR and 14OH-CLR
(Table 2, Figure 3). Relative to the lowered plasma levels, the accumulation of CLR in ELF
was significantly increased and, consequently, the BALC/ELF-ratio decreased (Figure 4).
The 4βOH-C/cholesterol ratio was not significantly different in the treatment groups (CLR,
1.7±1.0; RIF, 1.8±0.8; CLR with RIF, 1.6±0.6).
Affinity of CLR to HEK-OATP1A2, 2B1, 1B1, 1B3
In competition assays with the model substrates BSP and E3S, respectively, CLR was a
strong inhibitor of the liver specific uptake transporters OATP1B3 (IC50=9.50±3.50 µM) and
OATP1B1 (IC50=46.0±2.27 µM). OATP1A2 (IC50=92.6±1.49 µM) and OATP2B1
(IC50=384±5.30 µM) were inhibited with markedly lower potency (Figure 5). The uptake of
CLR in all OATP-transfected cells was not significantly different from the uptake in vector
control cells (data not shown).
Discussion
As a primary objective of our drug-interaction study, we provide for the first time data on
penetration of RIF and of its major de-acetylated metabolite into pulmonary compartments
of foals under steady-state condition; the half-life of RIF was approximately 15 hours and
distribution was evaluated 60 hours after first administration of the all in all 5 RIF doses (10
mg/kg, 12 h dosage interval), i.e. after about 4-times the half-life. At distribution equilibrium,
RIF permeated unrestricted into ELF but reached approximately 40-80% lower levels in
BALC. Interestingly, the de-acetylated, more polar metabolite accumulated 1.4-6-fold in ELF
and 8-60-fold in BALC (Figure 4) thus accounting for approximately 2% of total drug
exposure in ELF but 25% in BALC. Therefore, a significant part of the antimicrobial effect of
RIF in BALC must be attributed to DAc-RIF which is as active as the parent compound
(Acocella, 1978). However, the concentrations of RIF in plasma (considering 20% unbound
fraction), (Kohn et al., 1993) and in all pulmonary compartments at steady state were in
excess of the MIC90 for equine pathogens as ß-hemolytic streptococci (<0.5 µg/ml),
7.4 Publikationen DMD, under review
84
Staphylococcus spp. (1 µg/ml), Pasteurella spp. (1 µg/ml) and Rhodococcus equi (<0.5
µg/ml) (Jacks et al., 2003). Furthermore, the concentrations of RIF in plasma (13.1±4.45
µM) and in the lung compartments (ELF 10.3±4.98 µM; BALC 5.97±1.26 µM) were also in
the magnitude for which transcriptional regulation via the nuclear PXR-receptor pathway
was shown in-vitro for CYP3A4 (2-20 µM, (Luo et al., 2002)) and for the multidrug
transporters ABCB1 (5-10 µM, (Geick et al., 2001)), ABCC2 (>1 µM, (Kast et al., 2002)) and
OATP1A2 (1 µM, (Meyer zu Schwabedissen et al., 2008)) which are expressed in BEC and
BALC of foals (Peters et al., 2011). Our steady-state data are more reliable to predict
pharmacodynamic effects of RIF in the therapeutic in-vivo situation than the data of Ziglam
et al. from a single dose study with arbitrary sampling at times points of non-equilibrium.
They found in ELF of patients approximately one third but in BALC 16-fold the
concentrations in plasma ~2-5 hours after a single 600 mg dose (microbiological assay)
(Ziglam et al., 2002).
Contrary to our expectation, pharmacokinetics of RIF was not influenced by co-medication
of CLR although RIF is a substrate of the liver specific uptake transporters OATP1B1 and
1B3 (Vavricka et al., 2002) which can be inhibited by CLR at concentrations that most likely
occur in portal venous blood after oral administration of therapeutic doses (our study data
and (Seithel et al., 2007)).
A second finding of our short-time study was the extreme loss of CLR bioavailability by
more than 70% in the presence of RIF and, in parallel, the lower penetration in ELF and
BALC by approximately 65% and 80%, respectively (Table 2). The average plasma
concentrations of CLR which were in absence of RIF (~0.40 µg/ml) already quite near to the
MIC90 for ß-hemolytic streptococci (<0.06 µg/ml), Staphylococcus spp. (0.25 µg/ml),
Pasteurella spp. (1 µg/ml) and Rhodococcus equi (0.12 µg/ml), dropped down to inactive
levels in presence of RIF (~0.10 µg/ml) (Jacks et al., 2003). In contrast to our hypothesis,
these results were rather similar to the data of our long-term CLR-RIF interaction study
(initial loading with 7.5 mg/kg CLR b.i.d. for 7 days followed by 7.5 mg/kg CLR plus 10
mg/kg RIF b.i.d. for 11 days) (Peters et al., 2011). It must be mentioned, that there were
some important aspects in our short-term study relevant for discussing the rationale behind
the major RIF-CLR drug interaction. Firstly, the 4ßOH-C/cholesterol ratio, an endogenous
marker for CYP3A4 induction, was not elevated after short-term co-medication of RIF (5
doses). Secondly, we found a lower magnitude of the absorption deficit (~70 % vs. >90 %).
Thirdly, the plasma exposure (AUC0-12h) of 14OH-CLR in absence and presence of RIF
were not markedly different in both studies (short-term: without RIF 1.09±0.64 µg×h/ml vs.
with RIF 0.99±0.66 µg×h/ml, n.s.; long-term: without RIF 1.58±1.03 µg×h/ml vs. with RIF
0.72±0.44 µg×h/ml, p<0.05). Please consider that the half-life for 14OH-CLR was
DMD, under review 7.4 Publikationen
85
unchanged after short-term co-medication of RIF (7.28±1.35 h 6.60±1.76 h, n.s.) but
significantly lowered after long-term treatment (8.11±1.61 h 5.10 ± 0.88 h, p<0.05).
In our long-term study, absorption of CLR was nearly abolished most likely by the net effect
resulting from PXR-type induction of ABCB1 and ABCC2 and inhibition of a so far unknown
transporter which is susceptible for strong inhibition by RIF (Peters et al., 2011). In this
context must be mentioned for horses, that ABCB1 and ABCC2 (and ABCC1 and BCRP)
are highly expressed along the intestine in similar pattern as in man and rodents, that there
is a high transporter protein homology between these species and that the protein
expression is regulated at a transcriptional level (Tyden et al., 2009; Tyden et al., 2010).
The short-term study was initiated to achieve steady-state condition for RIF and CLR
without significant up-regulation of CYP3A4, ABCB1 and ABCC2 which are involved in
disposition of CLR (Munic et al., 2010; Suzuki et al., 2003). We concluded from the pattern
of changes in our two studies, that administration of 5 RIF doses in our short-term study did
not or only marginally induce gene transcription. In man, induction of CYP3A4 by RIF leads
to a significant increase of the 4ßOH-C/cholesterol ratio after one week; the maximum (4-
fold) elevation is reached after 14 days (Diczfalusy et al., 2009; Kanebratt et al., 2008). The
same pattern of induction was observed in our previous study in foals after chronic
administration of RIF for 11 days (Peters et al., 2011). The induction dissipates within 2
weeks following termination of RIF treatment (Niemi et al., 2003). A two-day treatment is
unlikely to produce any significant response in CYP3A4 expression even there is a
considerable induction (>10-fold) (Yang and Rodrigues, 2010). Therefore, it is very unlikely
that the increased proportion of 14OH-CLR exposure (AUC0-12h) relative to the AUC of total
CLR (0.52±0.13 vs. 0.21±0.06, p<0.01) is caused by induction of CYP3A4 hydroxylation of
CLR (Suzuki et al., 2003) and, in turn, that induction of presystemic “first-pass” metabolism
of CLR is the major reason for >70 % lowering of bioavailability (please notice the
discussion below on alternative reasons). Because the concentrations necessary to
regulate CYP3A4, ABCB1 and ABCC2 in-vitro were quite similar and in the range of the
systemic levels achieved at steady-state (see discussion above), but duration of RIF
concentration was not long enough, intestinal efflux via ABCB1 and ABCC2 was most likely
also not significantly up-regulated in our short-time study. Therefore, the loss of
bioavailability must have been entirely or in its major portion resulted from inhibition of
intestinal uptake mechanisms for CLR.
To quantify the absorption deficit following inhibition of the intestinal uptake transport in our
long-time drug interaction study, the overall net effect must be detracted by the deficit that
can be maximally achieved with strong inducers (e.g. RIF, St. John’s wort) on absorption of
probe drugs for ABCB1 (e.g. digoxin, talinolol) which are not a substrate of a RIF-sensitive
uptake transporter. Effectively, the maximum decrease did not exceed 20-25% from
7.4 Publikationen DMD, under review
86
baseline after therapeutic standard doses of RIF and St. John’s wort in man (Glaeser et al.,
2007; Johne et al., 1999). Only in case of fexofenadine, the absorption deficit (~45%) was
markedly stronger considering that fexofenadine is also a substrate of intestinal OATP2B1
and OATP1A2 which are modulated by RIF (Glaeser et al., 2007; Imanaga et al., 2011). For
fexofenadine, the absorption deficit as caused by OATP-uptake inhibition must account for
at least 20% assuming that not more than 20-25% can be explained by strong efflux
induction. Translating this conception to the results of our two RIF-CLR interaction studies,
we conclude that up to approximately 70 % of the CLR absorption deficit is caused by
inhibition of intestinal uptake which is in case of chronic dosing additionally minimized by 20
to 25 % following induction of intestinal efflux.
Potential intestinal uptake carriers for CLR might be members of the OATP-family because
CLR inhibits the uptake of taurocholate in OATP-transfected MDCK cells and because its
oral absorption in rats can be markedly reduced by co-medication of RIF (Garver et al.,
2008; Lan et al., 2009). In our in-vitro studies using transfected HEK-cells, CLR was also an
inhibitor with potency for OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1 similar to previous
results of Seithel et al. (Seithel et al., 2007). However, CLR was not a substrate for
OATP1A2, 1B1, 1B3 and 2B1 as clearly shown in our in-vitro study.
Interestingly, we and others found that plasma exposure with 14OH-CLR (AUC, trough
levels) is nearly not influenced by RIF, neither after short-time nor after long-term co-
medication although CLR absorption was dramatically reduced (Peters et al., 2011; Taki et
al., 2007; Wallace, Jr. et al., 1995); the lower AUC0-12h in our chronic study is explained by
shortening the half-life of 14OH-CLR following induction of its terminal metabolism (Ferrero
et al., 1990). It might be, that the proximal intestine is the major site of CLR hydroxylation in
horses, where CYP3A-metabolic activity is highly expressed (Tyden et al., 2004). If
intestinal metabolism is not influenced or even induced by RIF, than the uptake carrier for
CLR must be located along the “first-pass” route beyond the place of intestinal
biotransformation, i.e. in the basolateral membrane of enterocytes. Possible candidates
might be ABCC1 and ABCC3 as these transporters are expressed within the basolateral
membrane of the enterocytes, acting there as efflux transporters that are also inhibited by
rifampicin (Giacomini et al., 2010; Oswald et al., 2006). In addition there exists evidence
that basolateral transporters have an impact on the absorption of orally administered drugs
(Torii et al., 2002). In conclusion, to discover intestinal uptake carriers for macrolides,
further research directed to efflux transporters in the basolateral membrane of enterocytes
is needed.
DMD, under review 7.4 Publikationen
87
Acknowledgements
The authors thank Gitta Schumacher, Sabine Bade and Danilo Wegner for excellent
technical assistance.
7.4 Publikationen DMD, under review
88
Authorship Contributions
Participated in research design: Peters, Venner and Siegmund.
Conducted experiments: Peters, Eggers, Block, Lämmer
Contributed new reagents or analytic tools: Oswald and Lütjohann
Performed data analysis: Peters, Eggers and Oswald.
Wrote or contributed to the writing of the manuscript: Peters, Oswald, Venner and
Siegmund.
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89
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7.4 Publikationen DMD, under review
92
Footnotes
Financial support: The clinical part of the study was generously supported by the
Paul-Schockmoehle Lewitz Stud, Neustadt-Glewe, Germany. The analytical part
and the molecular and cell biological part were supported by grant of the German
Federal Ministry for Education and Research [03IP612, InnoProfile].
Conflict of interest: The authors declare that they have no conflict of interest.
DMD, under review 7.4 Publikationen
93
Legends for Figures
Figure 1: Plasma-concentration time curves of rifampicin and 25-O-desacetylrifampicin
after last administration of 10 mg/kg rifampicin alone and after co-medication
with 7.5 mg/kg clarithromycin in nine healthy foals.
Figure 2: Penetration of rifampicin (upper figures) and 25-O-desacetylrifampicin (lower
figures) in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and broncho-alveolar lavage
cells (BALC) after last administration of 10 mg/kg rifampicin alone (-CLR) and
after comedication of 7.5 mg/kg clarithromycin (+CLR).
Figure 3: Plasma-concentration time curves of clarithromycin and 14-hydroxy-
clarithromycin (14OH-clarithromycin) after last administration of 7.5 mg/kg
clarithromycin alone and after co-medication with 10 mg/kg rifampicin in nine
healthy foals.
Figure 4: Accumulation of clarithromycin (upper figures) and 14-hydroxy-clarithromycin
(lower figures) in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and broncho-alveolar
lavage cells (BALC) after last administration of 7.5 mg/kg clarithromycin alone
(-RIF) and after comedication of 10 mg/kg rifampicin (+RIF).
Figure 5: Competition of clarithromycin with the uptake of estrone-3-sulphate (E3S,
1.0 µM) in HEK cells transfected with OATP1A2 and OATP2B1 (upper figures)
and with bromosulfophthalein (BSP) in cells transfected with OATP1B1
(0.05 µM) and OATP1B3 (0.1 µM), respectively (lower figures). Means±S.D.
are given for three experiments each performed in triplicate.
7.4 Publikationen DMD, under review
94
Figure 1
0 6 12 18 24 30 36 42 480.00
0.05
0.10
0.15
25-O
-desa
ce
tylrifa
mp
icin
(µ
g/m
l)
time (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
5
10
15
20
25
CLR
CLR
rifa
mpic
in (
µg/m
l)
DMD, under review 7.4 Publikationen
95
Figure 2
-CLR +CLR0
2
4
6
8
p = 0.953
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-CLR +CLR0
20
40
60
80
p = 0.594
BALC / plasma
-CLR +CLR0
5
10
15
20
25
p = 0.678
BALC / ELF
-CLR +CLR0.0
0.5
1.0
1.5
p = 0.767
ELF / plasmaconcentr
ation r
atio
-CLR +CLR0.0
0.5
1.0
1.5
p = 0.214
BALC / plasma
-CLR +CLR0.0
0.5
1.0
1.5
p = 0.038
BALC / ELF
7.4 Publikationen DMD, under review
96
Figure 3
0 6 12 18 240.00
0.25
0.50
0.75
1.00
RIF
RIF
cla
rith
rom
ycin
(µ
g/m
l)
0 6 12 18 240.00
0.05
0.10
0.15
0.20
14
OH
-cla
rith
rom
ycin
(µ
g/m
l)
time (h)
DMD, under review 7.4 Publikationen
97
Figure 4
-RIF +RIF0
1
2
3
4
5
p = 0.069
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-RIF +RIF0
40
80
120
p = 0.017
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-RIF +RIF0
1
2
3
4
5
p = 0.069
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-RIF +RIF0
40
80
120
p = 0.017
ELF / plasma
concentr
ation r
atio
-RIF +RIF0
25
50
75
100
p = 0.093
BALC / plasma
-RIF +RIF0
400
800
1200
1600
2000
p = 0.889
BALC / plasma
-RIF +RIF0
25
50
75
100
p = 0.093
BALC / plasma
-RIF +RIF0
400
800
1200
1600
2000
p = 0.889
BALC / plasma
-RIF +RIF0
20
40
60
p = 0.401
BALC / ELF
-RIF +RIF0
20
40
60
p = 0.012
BALC / ELF
-RIF +RIF0
20
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60
p = 0.401
BALC / ELF
-RIF +RIF0
20
40
60
p = 0.012
BALC / ELF
7.4 Publikationen DMD, under review
98
Figure 5
0
25
50
75
100
125
1 10 100 1000
clarithromycin (µM)
BS
P u
pta
ke
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)
0
25
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125
1 10 100 1000
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)
0
25
50
75
100
125
1 10 100 1000
0
25
50
75
100
125
1 10 100 1000
clarithromycin (µM)
IC50= 9.5 ± 3.5 µM
IC50= 92.58 ± 1.49 µM IC50= 384 ± 5.3 µM
IC50= 46.0 ± 2.27 µM
0
25
50
75
100
125
1 10 100 1000
clarithromycin (µM)
BS
P u
pta
ke
(%
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0
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1 10 100 1000
E3S
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0
25
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1 10 100 1000
0
25
50
75
100
125
1 10 100 1000
clarithromycin (µM)
IC50= 9.5 ± 3.5 µM
IC50= 92.58 ± 1.49 µM IC50= 384 ± 5.3 µM
IC50= 46.0 ± 2.27 µM
DMD, under review 7.4 Publikationen
99
Ta
ble
1:
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±4
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8.1
±5.5
9
10.8
±3.6
6
3.6
6±2.5
2
14.7
±3.1
8
8.4
9±4.1
0
4.9
1±1.0
4††
with
CLR
1
68
±6
5.0
1
7.7
±6.7
5
11.0
±5.0
1
3.4
2±2.5
8
14.5
±5.0
1
8.1
2±5.8
6
6.6
5±3.6
6†
25-O
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with
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0
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5
0.0
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5
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7
12.1
±4.0
5
0.1
9±0.1
0††
1.4
4±0.6
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with
CLR
0
.75
±0.2
2
0.0
8±0.0
2
0.0
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2
5.3
4±3.4
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10.1
±1.8
5
0.1
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1.7
3±1.4
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7.4 Publikationen DMD, under review
100
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2:
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6
101
Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer
anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten
ohne Kennzeichnung übernommen habe.
Datum Unterschrift
102
Lebenslauf
Jette Peters
geboren am 20.11.1982 in Demmin
wohnhaft im Max-Hagen-Weg 13A, 17491 Greifswald
08/1993 – 07/1999 Besuch des Christophorus Gymnasium Rostock
09/1999 – 06/2000 Besuch des Vankleek Hill Collegiate High Institute, Vankleek
Hill, Canada
08/2000 – 06/2002 Besuch des Christophorus Gymnasium Rostock, Abitur
10/2002 – 10/2006 Studium der Pharmazie an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
08/2004 1. Staatsexamen
10/2006 2. Staatsexamen
11/2006 – 04/2007 1. Praktisches Halbjahr bei der Bayer Schering Pharma AG,
Berlin, Bereich: Regulatory affairs
05/2007 – 10/2007 2. Praktisches Halbjahr in der Witzleben Apotheke, Berlin
11/2007 Approbation als Apothekerin
seit 12/2007 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Pharmakologie
der Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald, Abteilung
Klinische Pharmakologie und Anfertigung der vorliegenden
Arbeit unter Betreuung von Prof. Dr. Werner Siegmund
103
Danksagung
Die vorliegende Dissertationsarbeit wurde in der Abteilung für Klinische Pharmakologie der
Universität Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. Werner Siegmund angefertigt. An
dieser Stelle möchte ich mich sehr herzlich für die immer gewährte Unterstützung, die
stetige Motivation und die vielen konstruktiven Diskussionen bedanken, die maßgeblich
zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
• Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Werner Siegmund für die Überlassung
dieses äußerst interessanten und fruchtbaren Themas, die Bereitstellung der exzellenten
technischen und materiellen Rahmenbedingungen, die unermüdlichen Diskussionen und
Anregungen sowie die zielführenden Hilfestellungen bei Erstellung der Publikationen.
• Frau Dr. Karen Saljé und Herrn Dr. Stefan Oswald möchte ich im Speziellen danken. Ihre
allgegenwärtige Unterstützung, Hilfe bei der Planung und Auswertung von Experimenten,
Durchführung von Analysen, die konstruktiven Diskussionen und ihre Freundschaft haben
mich wesentlich bei der Erstellung dieser Arbeit unterstützt.
• Herrn Dr. Markus Keiser danke ich für die gründliche Einarbeitung in das Arbeiten in der
Zellkultur und die immer - auch zu frühesten Morgenstunden - bereit gestellte Hilfe bei der
Durchführung meiner Versuche.
• Herrn Danilo Wegner danke ich für die Ruhe und Ausdauer mit der er mir auch zum
wiederholten Male die Funktionen bestimmter Programme erklärte, Berechnungen
durchführte und für die beinahe philosophischen Kurzdiskussionen am Arbeitsplatz.
• Frau Gitta Schumacher danke ich für die unzähligen vorbereiteten Proben für die
analytischen Messungen und allen Mitarbeitern des GLP-Labors für die offenen Ohren für
alle kleinen und größeren Problemchen während der vergangenen Jahre.
• Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Klinische Pharmakologie möchte ich mich für die
produktive Arbeitsatmosphäre, aber auch die fröhlichen sportlich-musikalischen
„Abteilungs-Events“ bedanken.
• Frau Anja Moll danke ich für die in den zurückliegenden Jahren gewährte Unterstützung
und Ihre freundschaftliche Verbundenheit.
• Den Mitarbeitern des Gestüts Lewitz, allen voran Frau Dr. Venner, Herrn Dr. Lämmer
sowie Frau Dr. Wiebke Block und Frau Karen Eggers danke ich für die gemeinsame
Durchführung der tierexperimentellen Studien zu allen Tages- und Nachtzeiten, den
unermüdlichen Einsatz und den Spaß den wir dabei zusammen hatten.
104
• Herrn Dr. Markus Grube aus der Abteilung für Allgemeine Pharmakologie danke ich für
die vielen ausdauernd beantworteten Fragen und ideenreichen Diskussionen, die wir
geführt haben.
• Herrn Dr. Dieter Lütjohann von der Abteilung für Klinische Pharmakologie der Universität
Bonn gilt mein Dank für die Bestimmung der Serum-Sterole der tierexperimentellen
Studien.
• Darüber hinaus möchte ich mich bei meinem Verlobten und meinen Eltern bedanken,
dass sie immer für mich da waren. Sie haben mich stets unterstützt und unermüdlich
aufgemuntert, bei allen Schwierigkeiten das Ziel nicht aus den Augen zu verlieren.