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Zielkomponenten- und Profiling-Analysen in der der modernen Weinaromaanalytik: Spielwiesen
für den Einsatz mehrdimensionaler (gas)chromatographischer Techniken?
Dr. Hans-Georg SchmarrAnalytisch-chemisches Kolloquium an der Universität Duisburg-Essen, 16.07.2012
Kompetenzzentrum Weinforschung
Hans-Georg Schmarr
Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum – RheinpfalzAbteilung Weinbau und OenologieBreitenweg 71 D-67435 Neustadt an der Weinstraße, Germany
Überblick 1
• Weinaroma: Zielkomponentenanalyse - Problematik und Bedarf für High-End Analytik
• Beispiele: Methoxypyrazine (MPs), Haloanisole
• HS-SPME-GC(×GC)-MS (SIM)
• SPE // on-line-LC-MDGC-MS (SIM)
• SPE // LV-OC-MDGC-MS (SIM)
• SPE // LV-PTV-OC-MDGC-MSMS
Überblick 2
• Weinaroma: Profiling-Analysen - Erfassung molekularer Veränderungen durch
weinbauliche und oenologische Massnahmen
• Beispiele: Alterung; Micro-Oxygenierung
• HS-SPME-GC(×GC)-MS
• Klassische und pixel-based Verfahren
• Statistische Auswertung; Korrelationen
• Zusammenfassung und Ausblick
Weinaroma für den Analytiker
Matthias Wüst, Chem. in Unserer Zeit 37 (2003) 8-17
Zur Biochemie des sortentypischen Weinaromas
Wein – Qualität entscheidet sichin Nanogramm
• Weinaroma ist sehr komplex zusammengesetzt• Aromastoffe in sub-ng/L bis mg/L Konzentrationen• Organische Chemie in breiter Abdeckung• Matrixzusammensetzung oft problematisch für Extraktion,
Chromatographie und Detektion• Störungen – gerade bei (sub-)ng/L Bestimmungen
3-Isopropyl-2- Methoxypyrazin
Methoxypyrazine im Sauvignon Blanc
Aromastoff Struktur Geruchs- eigenschaft
Geruchs- schwellenwert
[ng/ l] 2-Methoxy-3-isobutyl
N
N O
grüner Paprika, Pfeffer
2
2-Methoxy-3-sec. butyl
N
N O
grüne Erbsen, grüner Paprika
1
2-Methoxy-3-isopropyl
N
N O
grüner Paprika, Pfeffer, erdig
2
2-Methoxy-3-ethyl
N
N O
grüner Paprika, erdig
400
Enger – angenehmer – Konzentrationsbereich von etwa 8-15 ng/L
Wüst, M., Chemie in Unserer Zeit. 37 (2003) 8 - 17
• Dominierendes MP ist IBMP
0
5
10
15
20
25
IBMP IPMP SBMP
[ng/
l] Sauvignon BlancCabernet Sauvignon
Allen, M.S., Lacey, M.J., ACS Symp. Ser. 714 (1998) 31 - 38
MPs in Vitis vinifera var.
MP-Konzentration hoch in unreifen Trauben und geringer werdend mit zunehmender Reife
Methoxypyrazine mal nicht aus Trauben
Klimawandel und das Vordringen des Asiatischen Marienkäfers Harmonia axyridis (nicht nur) in pfälzischen Weinbergen ...
1 Cai, L. et al., J. Chromatogr. A 1147 (2007) 66 - 782 Galvan, T. L. et al., Am. J. Enol. Viticul. 58 (2007) 518 - 5223 Godelmann, R. et al., Eur. Food Res. Technol. 227 (2007) 449 - 461
• Käfer enthalten (in der Hämolymphe) IPMB, IBMP, SBMP und DMMP
• Gehalte [ng/g Käfer] gefunden in (lebenden) Käfern: IPMP (4.2); SBMP (1.9); IBMP (<0.01)1
• Sensorisch bestimmter Schwellenwert für off-flavor durch H. axyridis (in der Lit. auch “ladybug taint; LBT” genannt) liegt bei 0.3 bis 1.9 Käfer/kg Trauben2
Interesse der amtlichen Lebensmittelüberwachung an der Analytik von Methoxypyrazingehalten in Weinen (insbesondere Sauvignon Blanc und Cabernet Sauvignon) ... --> IBMP (173 ng/l südafrikanischer S. Blanc3)
11th Int. Symp. on Hyphenated Techniques in Chromatography (HTC-11), Bruge, Belgium, 26-29 January 2010
Methoxypyrazine
Harmonia axyridis ...
3-Isopropyl-2- methoxypyrazin
Analyse mit einer oft beschriebenen Methode:
HS-SPME-GC-MS
• pH Einstellung auf 6.6
• SIDA für Quantifizierung der MPs (d3 -MPs)
• HS-SPME-GC-MS (SIM); Divinylbenzene/Carboxen/PDMS Faser, HP-5MS column, SIM-MS1
• In unserer Situation ergaben dotierte Proben (Most) nicht die erwarteten Resultate !?
• Spektren bzw. “Quantifier/Qualifier” Ionenverhältnisse auffällig
• GC×GC-qMS für Fehlersuche (Trace GC×GC-DSQ)
1 Kotseridis, Y.S. et al., J. Chromatogr. A, 1190 (2008) 294-301
m/z 137(extracted ion plot)
base peak von IPMP
IPMPKritische
Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung
GC×GC contour plot
m/z 140base peak von d3 -IPMP
d3 -IPMPKritische
Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung
m/z 138base peak von SBMPSBMP
Kritische Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung
m/z 141base peak von d3 -SBMPd3 -SBMP
Kritische Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung
m/z 124base peak von IBMP
IBMPunkritische
Quantifizierung:kaum Co-Elution
bei 1D Trennung
m/z 127base peak von d3 -IBMP
d3 -IBMP
ABER !Nicht erklärbares Peaktailing
sichtbar nicht typisch für d3 -IBMP
unkritische Quantifizierung:Keine Co-Elution
bei 1D Trennung
Alternative Analysenideen ...
• GC×GC-ToF-MS eventuell mit anderen Ionen und/oder Spektrendekonvolution
evtl. mit hochauflösendem ToF-MS (beide) nicht verfügbar (in unserer Gruppe)
• GC×GC-NPD - evtl. aber dann SIDA Quantifizierung problematisch mit d3 -MPs
• Probenvorbereitung SPE mit LiChrolut® EN als Sorbenz1
• Anderer chromatographischer Ansatz - andere stationäre Phase(n), Säulendimension, Gasfluss, ...
on-line LC-(MD)GC statt GC×GC
1 Culleré, L. et al., J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 4040-4045
on-line LC-(MD)GC
Schmarr, H.-G. et al. J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 6769-6777
MCSS – Moving Capillary Stream Switching;H. Sulzbach, C.E. Instruments patent
transfer volume: 500 µl
Probenvorbereitung: SPE (LiChrolut EN, Merck); 100 ml Most, 1 ml Extrakt
HPLC: Phoenix20 (Thermo) + TM 486 (Waters); UV (277 nm)
Trennsäule: 12 cm x 2 mm i.d. HyperSil Si (3µm); 20 µl Inj.vol.
Eluent: n-Hexan/MTBE (70/30; v/v) @ 200 µl/min
Transfervolumen: 0.5 ml
Abdampfrate: 172 µl/min @ 72 °C, 100 kPa He
GC Vorsäulen: 10 m x 0.53 mm i.d. unbelegt, desaktiviert (Phesil) + 2 m x 0.32 mm i.d., 1.5 µm PS-255 Y-Stück, early solvent vapor exit
1D Säule: 20 m x 0.25 mm i.d. ZB-Wax, 0.5 µm 72 °C (8 min), 8°/min to 250 °C (10 min)
Säulenschaltung: MCSS (Domdruck @ 25 kPa)2D Säule: 15 m x 0.25 µm i.d. ZB-35, 0.5 µm
55 °C (3 min), 10°/min to 250 °C (10 min)
Detektion: Quadrupol MS (MD800, Thermo); EI+, SIM
Quantifizierung: SIDA mit d3 -IPMP, d3 -SBMP, d3 -IBMP
SPE // on–line LC–MDGC–MS (SIM)
RT: 7.60 - 10.20
7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
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1000
20
40
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80
1000
20
40
60
80
100
8.50
9.868.06 8.11 9.50 9.698.19 9.248.36 10.189.427.71 9.11 10.137.78 7.95
8.50
9.868.05 9.508.20 9.68
8.36 9.249.11 9.427.70 10.1810.027.79 7.97
8.19 9.50 9.688.50
9.86
8.06
9.238.25 8.357.71 9.11 9.41 10.1810.067.78 7.95
9.688.20 9.50
8.50
9.868.068.05
8.35 9.249.12 9.417.71 10.197.79 10.037.96
NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_b
NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_5ngl
NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_25ngl
NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_100ngl
Erste Ergebnisse
V. vinifera Riesling Traubensaft
extracted ion Chromatogramme nach SPE // on-line-LC-MDGC-MS (SIM)
IPMP
SBMP
IBMP
Standard- Addition:nD MPs [ng/l]
0
5
25
100
MPs in Riesling
MPs in Vitis Vinifera c.v. Riesling (Traubensaft); Neustadt, Pfalz
Quantifizierungsmethode: Standard Addition
spike level [ng/L] [ng/L]5 25 100 av. std.dev. cov [%]
IPMP 2.5 2.6 2.5 2.5 0.1 3.9SBMP 5.8 5.3 5.6 5.6 0.3 4.6IBMP 4.3 4.3 4.0 4.2 0.2 4.2
Bisher waren kaum Daten für Riesling publiziert: <0.2-6 ng IPMP oder 0.3- 55 IBMP in ng/L Saft oder ng/kg in unreifen Beeren.
Hashizume und Samuta, Am. J. Enol. Vitic. 50 (1999) 194-198
Kalibrierung (SIDA)ar
eara
tio IP
MP
/d3-
IPM
P
concentration IPMP/d3 -IPMP
IPMPY = 0.0932835+0.299805*X R^2 = 0.9991 W: Equal
0 1 2 3 4 5 6 7 8ng/L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Area
Rat
io
Kalibrierungsbereich: 0.4 – 8 ng/l IBMPY = 0.0962654+0.0388926*X R^2 = 0.9986 W: 1/X
0 10 20 30 40 50 60 70 80ng/L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Area
Rat
io
IBMPY = 0.0962654+0.0388926*X R^2 = 0.9986 W: 1/X
0 10 20 30 40 50 60 70 80ng/L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
eaat
o
Kalibrierungsbereich: 0.2 – 8 ng/l
area
ratio
SB
MP
/d3-
SB
MP
area
ratio
IBM
P/d
3-IB
MP
concentration IBMP/d3 -IBMP
concentration SBMP/d3 -SBMP
Kalibrierungsbereich: 1 – 80 ng/l
Mosta Weinb
[ng L-1] [ng L-1]
Lesetermin IPMP SBMP IBMP IPMP SBMP IBMP
Serie A c 08.08.07 <0.4 nd 9.6 - - - 14.08.07 <0.4 nd 6.9 - - - 23.08.07 <0.4 nd 4.6 1.0 nd 5.3 28.08.07 <0.4 nd 1.2 0.5 nd 4.0 09.09.07 <0.4 nd <1.1 <0.4 nd 3.1 10.09.07 d 0.6 nd 3.6 0.5 nd 2.9
Serie B c 14.08.07 <0.4 nd 5.3 - - - 23.08.07 <0.4 nd 3.5 0.7 nd 5.5 28.08.07 <0.4 nd 3.4 0.5 nd 3.6 05.09.07 <0.4 nd 2.4 <0.4 nd 4.6 11.09.07 <0.4 5.7 1.4 0.7 nd 2.9 17.09.07 <0.4 5.0 1.8 0.6 nd 3.3
a Most nach SPE mit LiChrolut® EN b c Serie A von Weisenheim (Sand/Lehm; warm), Serie B von Hochstadt
(Löß/Lehm; kalt ), 2 unterschiedliche Standorte (Boden, Mikroklima) d Lese zuvor für Reifemessungen , hier komplette Lese
MP-Gehalte in Sauvignon Blanc Most
cMPsReife
MPs in Sauvignon Blanc Wein
MPs in Sauvignon Blanc (Wein); aus Neuseeland, Marlborough Region (2007)
Probe[ng/L]
IPMP SBMP IBMPSB_NZ ? ? ?
RT: 8.07 - 11.11
8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
Relative Abu
ndan
ce
0
20
40
60
80
100 9.96
9.61
10.4210.34 10.58 10.71 10.8310.21 10.919.758.59 9.018.928.68 9.118.318.21 8.458.59
9.01
8.68
9.11 9.15
8.558.31 8.768.22
10.369.96
10.56 10.7110.2110.089.61 10.82 10.849.83
9.96
10.3710.17 10.56 10.829.618.96 10.919.749.118.848.688.31 8.548.21 8.40
NL:4.79E8TIC F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ
NL:9.04E5m/z= 136.50-137.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ
NL:2.93E6m/z= 137.50-138.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ
NL:6.83E7m/z= 123.50-124.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ
IPMP m/z=137
SBMP m/z=138
IBMP m/z=124
TIC
SPE mit Kationenaustauscher
Plexa PCX™-Säulen (200mg):• Wein (75 ml) + MPs-D3, einstellen auf pH=2
• Konditionierung: Dichlormethan (DCM)Methanolmilli-Q Wasser
• 1. Waschschritt: milli-Q H2 O/Methanol(30%) pH=2
• Trocknung: Argon
• 2. Waschschritt: DCM
• Elution: Triethylamin in DCM (10g/L)• 3.Waschschritt: milli-Q-H2 O (pH=3 mit Weinsäure einstellen)
R. Lopez et al. J. Chromatogr. A 1218 (2011) 842
MPs in Sauvignon blanc
MPs in Vitis Vinifera c.v. Sauvignon blanc (Wein); Herkunft Neuseeland, Marlborough Region
Quantifizierung: SIDA
sample[ng/L]
IPMP SBMP IBMPsv_nz 2.3 0.4 17.1
Problem gelöst !SPE mit Mischbett Material (Bond Elut Plexa PCX™, Varian) welches auch starke Kationenaustausch-Funktionalität enthält1
Ermöglicht wesentlich selektivere Extraktion der MPs, durch die Ausnutzung der N-Protonierung bei saurem pH.Zur Analyse von MPs in vergorenem Most (Weinen) ist dies unbedingt angeraten!
Peter Schoenmakers: Thank God for the matrix!
... asking for expert(s) hyphenated techniques ...
1 R. Lopez et al.: J. Chromatogr. A 1218 (2011) 842
On-line LC-MDGC-MS
HPLC2. GC
Massenspektrometer 1. GC
Verbesserte SPE und LV-OC-MDGC-MS
(HPLC)2. GCMassenspektrometer
1. GC
Maskottchen
Modernes Equipment: Triplus RSH & MDGC-QqQ-MS
Methodenvergleich
DPC: uncoated, deactivated pre-column (3 m x 0.53 mm i.d. phenylmethyl silylated) 1D AC: analytical column Rtx-200MS (15 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm)2D AC: analytical column TG-5SilMS (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm) RC: restrictor column (~0.75 m x 0.10 mm i.d. phenylmethyl silylated) FID: flame ionisation detector, EPC: electronic pressure controller
MDGC-QqQ-MS: Schematics
Variable Injektionstools
Ansteuerung der Deans-Schaltung
3-Wege Ventil für Deans-Switch Ansteuerung
On-line LC-MDGC-MS
RT: 0.00 - 25.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
10000000
11000000
12000000
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15000000
16000000
17000000
18000000
19000000
20000000
21000000
22000000
23000000
24000000
25000000
26000000
27000000
28000000
Cou
nts
20.33
19.88
19.61
12.47 19.28 20.5411.03 13.8320.7418.86
16.2815.09
18.30
17.41
13.1011.72
10.63
14.40 21.5823.36 23.49
0.04 2.15
NL:1.41E8FID Analog 120425_MP_PTV_OC_20ng_d
59˚C (8 min iso); He @ 2ml/min const. flow 20µl @ 2µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)
bad chromatography, severe flooting
Question:too much liquidortoo fast injection speed
MPs und Alkanreihe in DCM (Sdp. 40°C)
20µl DCM
RT: 0.00 - 24.29
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
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10000000
11000000
12000000
13000000
14000000
15000000
16000000
17000000
18000000
19000000
20000000
21000000
22000000
23000000
24000000
25000000
Cou
nts
18.5818.16 18.91
17.59
19.8515.4914.20 20.0612.74
11.016.6916.67
8.91
11.829.95
20.905.78 21.13 22.708.73 13.517.010.09 2.13
NL:1.41E8FID Analog 120425_MP_PTV_OC_10ng_g
59˚C (8 min iso); He @ 2ml/min const. flow 10µl @ 2µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)
good chromatography, no flooting
IPMP
SBMP, IBMP
RT: 0.00 - 23.90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
10000000
11000000
12000000
13000000
14000000
15000000
16000000
17000000
18000000
Cou
nts
17.5716.88
18.8119.3714.45
15.7313.01 19.62
11.37
7.08
9.39
9.808.18
20.8421.246.54 22.907.29 8.88 12.20 13.271.20
NL:1.40E8FID Analog 120427_MP_PTV_OC_20ul_a
70˚C (8 min iso); 270kPa He constant pressure 20µl @ 0.5µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)
RT: 7.85 - 13.54
8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5Time (min)
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
Cou
nts
0
2
4
6
8
10
12
14
Rel
ativ
e A
bund
ance
NL:1.07E9TIC MS 120427_MP_PTV_OC_20ul_ad
NL:1.29E7FID Analog 120427_MP_PTV_OC_20ul_ad
1D column (FID)(RTX-200MS)
2D column (MS)(TG5-SilMS)
IPMP
SBMP
IBMP
cut-signals
Definition der Schnittfenster
Full scan und product scan Spektren der MPs. Qualifier und Quantifier ions für MS-MS mit entsprechenden Farben unterlegt. Strukturvorschläge für die relevanten parent ions.
MPs: MS-MS Fragmentierung
Single reaction monitoring (SRM)
Mit dem Quantum Ultra geht auch Ultra Selective SRM (U-SRM).
Die hyperbolischen Stäbe erlauben eine Auflösung bis zu 0.1 Da.
120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC 5/7/2012 8:27:46 PM
RT: 11.52 - 11.93
11.55 11.60 11.65 11.70 11.75 11.80 11.85 11.90Time (min)
0
50
1000
50
100
0
50
10011.75 11.7511.7511.7211.71
11.7611.7111.7711.70
11.7811.69 11.7911.68 11.81 11.82 11.84
11.75
11.84
11.72
11.83
NL: 7.10E4TIC MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC
NL: 7.10E4TIC F: + c EI SRM ms2 152.090 [109.059-109.061, 124.099-124.101, 137.069-137.071] MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC
NL: 6.83E4TIC F: + c EI SRM ms2 155.090 [112.059-112.061, 127.099-127.101, 140.069-140.071] MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC
100 105 110 115 120 125 130 135 140m/z
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
109124
137
112 127
140
NL: 5.28E4120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC#9874 RT: 11.75 AV: 1 SB: 2 10.43 , 10.67 F: + c EI SRM ms2 152.090 [109.059-109.061, 124.099-124.101, 137.069-137.071]
NL: 4.49E4120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC#9816 RT: 11.71 AV: 1 SB: 1 10.39 , 10.68 F: + c EI SRM ms2 155.090 [112.059-112.061, 127.099-127.101, 140.069-140.071]
IPMP: Quan: 152 137Qual: 152 109,124
IPMP
D3 -IPMP
Probe: IPMP
Probe: SBMP
Probe: IBMP
1D GC Trennung (FID) mit heart-cuts eines Weinextraktes, spiked mit 4 ng/L (IPMP, SBMP) und 40 ng/L (IBMP) sowie den Deuterierten MPs (unten). Im Bild oben sind die Ionenspuren dargestellt (m/z; Quantifier und Qualifier) für MPs: a) 140, 127, 112; b) 137, 124, 109; c) 126, 119, 98; d) 123, 119, 95
MDGC-QqQ-MS: MPs-Analysenbeispiel
MDGC-SIM-MS versus MDGC-QqQ-MS
In der Regel ergaben beide Verfahren vergleichbare Ergebnisse für die in einer weinbaulichen und oenologischen Studie untersuchten Proben !(Ergebnisse z.T. in das deutsche weinmagazin, Juni 2012, S. 30-34)
Allerdings wurden mit SIM-MS einige Proben mit auffälligen und unplausiblen SBMP-Gehalten gemessen. Hier ergab die MS-MS Messung, dass es sich um falsch-positive Werte handelte !
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD / QqQ-MS
• 2,4,6-Trichloranisol (TCA) als Leitsubstanz für muffige Korktöne; daneben auch Tetrachloranisol und 2,4,6- Tribromanisol (TeCA und TBA)
• Routineanalytik mit HS-SPME-1D-GC-ECD, jüngst wegen Matrixproblemen in Wein umgestellt auf HS-SPME-MDGC-ECD (Poster ISCC 2012, Riva del Garda)
• Quantifizierung über D5 -Isotopenstandards (SIDA)
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD
Stable Isotope Dilution Analysis of Corky Off-Flavour Compounds at Ultra Trace Level with Multidimensional Gas Chromatography–Electron Capture Detection
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD
Geruchsschwellenwerte z.T. bei 1-3 ng/L Wein; Qualitätskontrolle bis < 1 ng/L
Standard-Chromatogramm
Kalibration
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD
Kork-Extrakt (10% vol. Ethanol)
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD
Wein (ca. 12% vol. Ethanol)
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD
RT: 11.00 - 16.00
11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 6.50E3TIC F: + c EI SRM ms2 209.870 [195.100-195.500] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756
NL: 7.53E3TIC F: + c EI SRM ms2 216.930 [198.920-199.320] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756
NL: 7.89E3TIC F: + c EI SRM ms2 245.860 [230.630-231.030] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756
NL: 9.66E2TIC F: + c EI SRM ms2 343.810 [328.980-329.380] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756
NL: 1.79E2TIC F: + c EI SRM ms2 348.850 [331.010-331.410] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756
TCA (210 195)
TCA-d5 (217 199)
TeCA (246 231)
TBA (344 329)
TBA-d5 (349 331)
60˚C (2 min)10˚/min / 210˚C / 50˚/min / 270˚C (5min)
SPME: PDMS (100µm)2 min incubation20 min extraction @ 50˚C2 min desorption (splitless)
2 ng/L in 10%Vol EtOH
collision energy 15V
Vorteil: U-SRMQ1 0.3 DaQ3 0.7 Da
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-QqQ-MS
RT: 11.00 - 16.00
11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100 NL: 2.58E3TIC F: + c EI SRM ms2 209.870 [195.100-195.500] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g
NL: 9.49E3TIC F: + c EI SRM ms2 216.930 [198.920-199.320] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g
NL: 6.90E3TIC F: + c EI SRM ms2 245.860 [230.630-231.030] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g
NL: 2.04E3TIC F: + c EI SRM ms2 343.810 [328.980-329.380] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g
NL: 1.28E3TIC F: + c EI SRM ms2 348.850 [331.010-331.410] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g
Liquid-Injection: 1µl splitless (0.5pg/µl)
TBA-d5 (349 331)
TBA (344 329)
TeCA (246 231)
TCA-d5 (217 199)
TCA (210 195)
60˚C (2 min)10˚/min / 210˚C / 50˚/min / 270˚C (5min) collision energy 15V
U-SRMQ1 0.3 DaQ3 0.7 Da
Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-QqQ-MS
• Oenologie ... die Wissenschaft vom Weinmachen (ausser weinbaulichen Aspekten)
• Wein-Aroma Flüchtige Stoffe, die unseren Sinnen (Nase) und den analytischen Methoden (GC) zugänglich sind
• (Multivariate) Statistische Analysen Principal Component Analysis (PCA): Linear Discriminant Analysis (LDA) Partial Least Squares Regression (PLSR) Analysis of Variance (ANOVA)
• Applikationen Alterung, Mikro-Oxygenierung (MOX)
Profiling-Analysen
38 samples10 origins4 vintages
analysis viaGC×GC-qMSorGC×GC-TOF-MS
quantification via internal standards
HS-SPMEinternal standards
Analysis: HS-SPME-GC×GC-MS
ToF-MS in co-operation with
subset of a larger number of samples from the Palatinate Terroir project
esters
alcoholsacids
Analysis: Reversed column set-up
polyethylene glycol
5% p
heny
lmet
hyl s
ilico
ne separation space
• Nach Ende der Gärung, umfasst die einsetzende Reife (Alterung) viele komplexe substanzielle Veränderungen
• Farbe, Mundgefühl, Aroma und Geschmack unterliegen z.T. drastischen Veränderungen
• Sauerstoff und konzentrations- abhängige molekulare Veränderungen (MWG), aber auch Zersetzungs- und andere Reaktionen
• Neben individueller Präfe- renzen für alte Weine ist die Kenntnis des Alterungspoten- tiales wichtig für die Industrie
Alterung von (Riesling) Wein
-6
-4
-2
0
2
4
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6
• 1200 peaks detected
• 300 peaks identified according to their mass spectra and retention indices
• random selection of a chromatogram as reference
• 130 analytes present in all samples
• quantification relative to a reference standard (2,6-dimethylhept-6-en-2-ol, [2H5 ]-ethyl cyclohexanoate)
• statistics with individual peak areas — the classical workflow, based on integrated peaks
Aging of Riesling Wine
Non-Targeted Multi-Component Profiling
… biased …
-10
-5
0
5
-10 -5 0 5 10
F 1 (78.48 %)
F 2
(16.
18 %
)
2005200620072008
Riesling Aging (ChromaToF), LDA, F1 F2, 15 most relevant signals
confidence intervals @ 95%
2005 2006 2007 2008
2005 95 % 0 % 5 % 0 %
2006 0 % 84 % 16 % 0 %
2007 6 % 6 % 89 % 0 %
2008 0 % 8 % 21 % 71 %
Confusion matrix
Validation: ~15 % Test data set85 % Model data set20x Repetition
~ 84 % correct correlation (differing sample number in individual groups, due to randomization of vintages)
Riesling Aging (ChromaToF), LDA, 15 most relevant signals
Riesling Aging (ChromaToF), LDA, F1 F2, 15 most relevant signals, loadings
Styrol
Anhydrolinalooloxide
Decanol
Ethyl 3-phenyl-pentanoateTerpinolene
p-Cymol
Linalool
Octan-3-olEthyl heptanoate
5-Methylfurfural
Phenyl acetateTDN Hexyl acetate
Furfural
-1
-0.75
-0.5
-0.25
0
0.25
0.5
0.75
1
-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1
F1 (78.48 %)
F2 (1
6.18
%)
1,1-Diethoxyethan
CH2
CH3 CH3
CH3 OH
CH3 CH3
OH
CH3
CH3 CH3
CH3 OH
OH
O CH3
CH2CH3
OH CH3CH2
CH3 CH3
CH3 OH
OH
CH2
CH3 CH3
CH3 OH
OH
CH2
CH3 CH2
CH3 OH
α-Terpineol
Linalool
1,8-Terpin
Hydroxylinalool Linalooloxide (f.)
Terpendiol I Hotrienol
Aging – Chemical Issues
O O
H
O
OH+
pH 3-3.5; time
1,1-Diethoxyethane,Acetaldehyde diethyl acetal
Riesling Aging: Petrol or Kerosine note
OH
OOH
O
OH
OH
1,1,6-Trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN)
Proposed pathway of TDN formation (from Winterhalter, JAFC 39 (1991) 1825)
- H2O
- 2 H2O
Profiling – via Fingerprint Analysis
Clearly non-targeted: Visual comparison
only for limited sample numbers
Advanced Image Processing
Image warping compensates for fluctuations in signal position
H.-G. Schmarr, J. Bernhardt, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 565
... image/pixel-based analysis ...
Advanced Image Processing
Rolling ball model applied for background substraction
H.-G. Schmarr, J. Bernhardt, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 565
Volatile (aroma) - Profilingfingerprint analysis;approach is based on image processing techniques
Delta2D software,well established in 2D gel electrophoresisDecodon, Greifswald, Germany
-10
-5
0
5
10
-10 -5 0 5 10 15
F 1 (54.04 %)
F 2
(29.
42 %
)
2005
2006
2007
2008
Riesling Aging (Delta2D), LDA F1 F2, 15 most relevant signals
confidence intervals @ 95%
2005 2006 2007 2008
2005 100 % 0 % 0 % 0 %
2006 0 % 100 % 0 % 0 %
2007 0 % 0 % 100 % 0 %
2008 0 % 0 % 0 % 100 %
Confusion matrix
Validation: ~15 % Test data set85 % Model data set10x Repetition
Riesling Aging (Delta2D), LDA F1 F2, 15 most relevant signals
Potential explanation for better validation of the model: ANOVA yielded 15 most relevant signals - but considering all signal information (unbiased)
MOXtreatment of
red wines
Enology,Winemaking
MOX: Changes in composition
"Fermentation-Metabolom" dependend on - oxygen dosage and timing- grape variety (polyphenol structure)
loadings on PC1-PC3 were multiplied by their per- centage of explained vari- ance, summed, and arran- ged according to size
Image Analysis and Signal Labeling
cut-out (amplified)Delta2D Analyzing 2D-Gels
Drawback: Off-line Signal Identification
Zusammenfassung
Komplexe Matrices (z.B. Wein) erfordern mitunter besondere Behandlung für Zielkomponentenanalytik! Ansonsten drohen falsche Resultate!
• Möglichkeiten für verbesserte Analytik seitens: - Probenvorbereitung - Separation (Chromatographie) - Detektion
• MDGC (Deans-Switch oder MCSS)
• TriPlus RSH - Variable Injektionsmöglichkeiten
• Quantum Ultra - QqQ-MS und evtl. U-SRM
Ausblick und Erwartungen
• Profiling – Analysen und Statistische Auswerteverfahren zur Erfassung komplexer Veränderungen im Weinaroma (Oenologie)
• Advanved Image Processing für GC x GC-Daten sehr vielversprechend (stoffliche Zuordnung derzeit off-line)
• Korrelation oenologischer/sensorischer Daten mit chromatographischer und spektroskopischer (UV/Vis, IR, NMR) Information
• Oenometabolomics
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Dr. Hans-Georg Schmarr
Competence Center of Wine Research
Dank an das MULEWF, Rheinland-Pfalz, für finanzielle Unterstützung
Dank an:Stefan Koschinski,Petra Slabizki,Theodoros Potouridis,Johannes Langen,Elisa Garcia-Morenou.a.für Ihre Mitarbeit
Analytisch-chemisches Kolloquium an der Universität Duisburg-Essen, 16.07.2012
MDGC: A comprehensive review ...
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MDGC: MCSS
TrAC Trends in Analytical Chemistry 34 (2012) 1 - 21
MDGC: SilFlow Deans Switch
TrAC Trends in Analytical Chemistry 34 (2012) 1 - 21