diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics

2012 • Volume 48 • Number 2 • 187-197

Praca poglądowa • Review Article

187

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

Quality assurance and quality control of microbiology culture media in medical laboratory

Marzena Strzyż, Urszula Wendt

Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o.

StreszczenieMedyczne laboratorium mikrobiologiczne wdrażające system zarządzania jakością zobligowane jest do kontrolowania jakości stosowanego wyposażenia, w tym także, pożywek mikrobiologicznych. Pożywki mikrobiologiczne odgrywają kluczową rolę w badaniach mikrobiologicznych. Jakość pożywek determinuje możliwość wzrostu, prawidłową identyfikację i poprawną oce-nę lekowrażliwości drobnoustrojów. W laboratoriach mikrobiologicznych kontrola pożywek służy sprawdzeniu ich jakości i po-twierdzeniu ich przydatności do stosowania w badaniach mikrobiologicznych. Kontrola ta obejmuje ogólną ocenę właściwości fizycznych i chemicznych oraz ocenę właściwości mikrobiologicznych takich jak jałowość, żyzność, selektywność, specyficz-ność oraz zdolność do oceny lekowrażliwości.

SummaryMedical microbiology laboratory which implement quality management system is obligated to control/ evaluation of quality of equipment, including, microbiology culture media. Microbiology culture media play a key role in microbiology examinations. Quality of culture media determinate possibility of growth, correct identification and accurate antimicrobial susceptibility te-sting. In medical laboratories control of culture media are used for control of their quality and for performance testing of culture media. Quality control include general estimation of physical and chemical characteristics and estimation of microbiological charakteristics like sterility, productivity, selectivity, specificity and ability for antimicrobial susceptibility testing.

Słowa kluczowe: kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych, pożywki mikrobiologiczne, właściwości mikrobiologiczne po-żywek

Key words: quality control of microbiology culture media, microbiology culture media, microbiology characteristics of culture media

WstępWdrożenie systemu zarządzania jakością w medycznym laboratorium mikrobiologicznym wymaga uruchomienia i utrzymywania mechanizmów zapewniających wiarygod-ność uzyskiwanych wyników badań. Zgodnie z ISO/IEC 17025 oraz ISO 15189 [1, 2], jednym z czynników istotnie wpływających na jakość wyników badań jest wyposażenie laboratorium, którym są nie tylko urządzenia badawczo-pomiarowe, ale także odczynniki, wzorce odniesienia, itp. W przypadku badań mikrobiologicznych, dodatkowym ele-mentem wyposażenia o szczególnym znaczeniu dla powta-rzalności i wiarygodności wyników badań są pożywki mikro-biologiczne. Jakość pożywek determinuje bowiem, zarówno możliwość wykrycia drobnoustrojów w badanej próbce, jak też ich poprawnej identyfikacji i prawidłowej oceny lekow-rażliwości. W procesie badawczym, nawet najlepiej dobrane

do określonego kierunku badania pożywki, ale niewłaściwej jakości, mogą spowodować uzyskanie niewiarygodnego wyniku. Jest to powód, dla którego pożywki mikrobiologicz-ne muszą odpowiadać określonym kryteriom jakościowym, a laboratorium powinno zapewniać odpowiednią jakość po-żywek oraz sprawdzać i potwierdzać spełnienie kryteriów jakości pożywek.W zależności od możliwości organizacyjnych, medyczne la-boratoria mikrobiologiczne wykorzystują podłoża komercyj-ne lub przygotowują pożywki we własnym zakresie. Pożywki komercyjne są dostarczane do laboratorium w postaci go-towej do użycia lub jako częściowo przygotowane pożywki w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków, z których należy przygotować pożywkę. Każda seria pożywki dostarczana jest do laboratorium wraz z certyfikatem jakości, w którym wytwórca potwierdza jej jakość. Certyfikat jakości

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

188

pożywki potwierdza wykonanie przez wytwórcę badań kon-trolnych danej serii pożywki i przedstawia ich wyniki. W przy-padku pożywek odwodnionych, certyfikat odnosi się do tej postaci, w jakiej pożywkę dostarczono do laboratorium, gdyż właściwości pożywki w jej ostatecznej postaci będą zależeć od sposobu przygotowania pożywki do użycia przez labora-torium. W przypadku, gdy laboratorium samodzielnie przy-gotowuje pożywki, cała odpowiedzialność za zapewnienie właściwości pożywek, tj. ich odpowiedniej jakości, spoczywa na laboratorium. W tej sytuacji, laboratorium jest zobligowa-ne do zapewnienia jakości pożywek poprzez standaryzację procesu wytwarzania oraz samodzielnego kontrolowania ich jakości poprzez sprawdzanie właściwości pożywek.W celu określenia zakresu i częstotliwości kontroli pożywek mikrobiologicznych należy posłużyć się dokumentami nor-matywnymi opisującymi wymagania odnośnie zapewniania jakości pożywek w procesie wytwarzania oraz ich spraw-dzania, tj. kontroli jakości. Dokumentami takimi są: norma EN 12322 określająca kryteria oceny jakości pożywek do diagnostyki in vitro [3] oraz specyfikacja techniczna ISO/TS 11133 [4, 5]. Specyfikacja ta składa się z dwóch części:

ISO/TS 11133-1 - dokument przedstawiający wytyczne –dotyczące kontrolowania jakości pożywek mikrobiologicz-nych przygotowywanych w laboratorium [4]ISO/TS 11133-2 - dokument zawierający wytyczne przy-–gotowywania i wytwarzania pożywek w laboratorium [5].

Zgodnie z wymaganiami ISO/IEC 17025 (pkt. 4.6.2) oraz ISO 15189 (pkt. 4.6.2.), laboratorium powinno poddawać sprawdzeniom wyposażenie i materiały, które w istotny spo-sób wpływają na wiarygodność wyników badań, przy czym sprawdzeń tych, należy dokonywać przed użyciem dane-go wyposażenia w procesie badawczym [1, 2]. Oznacza to, że ze względu na kluczową rolę pożywek w badaniach mikrobiologicznych, należy sprawdzać także pożywki. O ile kontrolowanie jakości pożywek wykonywanych w labora-torium wydaje się oczywiste, to jednak pojawia się pytanie o konieczność sprawdzania pożywek komercyjnych. Odpo-wiedź na to pytanie można znaleźć w dokumencie EA-04/10 „Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych” [6], w którym w pkt. 7 zapisano wymaganie, iż przed pierwszym użyciem, sprawdzać należy zarówno pożywki przygotowywane w la-boratoriach, jak i pożywki gotowe do użycia. Wyjątkiem są gotowe do użycia lub częściowo przygotowane pożywki (po-żywki suche), których wytwórca posiada potwierdzony odpo-wiednim certyfikatem system jakości jakim jest, np. system zarządzania zgodny z wymaganiami normy ISO 9001 lub ISO 13485 (system zarządzania obowiązujący wytwórców wyposażenia do diagnostyki in vitro - przyp. autorów) [7, 8]. W takim przypadku, wykorzystywana jest bowiem zasada „oczekiwania stałej jakości” dostaw, i laboratorium może zakres sprawdzania jakości pożywek istotnie ograniczyć. Zasada ta nie obowiązuje w przypadku wytwórców, którzy nie posiadają potwierdzonego systemu zarządzania, czego konsekwencją jest konieczność sprawdzania przez labora-torium jakości pożywek, mimo dostarczenia przez wytwórcę

certyfikatu jakości danej serii pożywki. Od jakich czynników zależy jakość pożywek, na jakie etapy i czynności procesu wytwarzania pożywek należy zwrócić szczególną uwagę w celu zapewnienia ich jakości, jaki po-winien być zakres i szczegółowość kontroli, jak przeprowa-dzić kontrolę pożywek mikrobiologicznych w laboratorium? Niniejsze opracowanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na te pytania, szczególnie w odniesieniu do pożywek komercyj-nych gotowych do użycia.

1. Parametry jakości pożywek mikrobiologicznychW zależności od kryterium [9], pożywki mikrobiologiczne można klasyfikować ze względu na:

skład: podłoża syntetyczne o ściśle określonym składzie –chemicznym i podłoża o nie w pełni zdefiniowanym skła-dzie chemicznym ze względu na obecność składników po-chodzenia naturalnego,konsystencję: pożywki stałe, półpłynne i płynne,–zastosowanie: podłoża namnażające, różnicujące, wybiór-–cze, wybiórczo-różnicujące, transportowe, itd.postać pożywki: pożywki gotowe do użycia, pożywki su-–che i niekompletne.

(Pochodzące z dokumentów normatywnych podstawowe definicje dotyczące pożywek przedstawia Tabela I). Jednak bez względu na postać, skład, stan czy przezna-czenie, pożywki mikrobiologiczne powinny posiadać odpo-wiednią jakość [3, 10, 11, 12]. Podstawowymi parametra-mi jakości pożywek są odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne, a także właściwości mikrobiologiczne takie jak jałowość oraz, zależne od składu chemicznego - żyzność, selektywność, specyficzność i zdolność do badania wrażli-wości drobnoustrojów na leki [3]. Wśród właściwości fizycznych jakimi powinna charaktery-zować się pożywka o odpowiedniej jakości, można wymie-nić takie jak np. właściwa grubość warstwy i jednorodność podłoża, prawidłowa wartość pH, itd. Każda z tych cech jest na tyle istotna, że może warunkować użycie pożywki w pro-cesie wykonania badania. Inną, ważną właściwością jest jałowość pożywki, która zapewnia ograniczenie możliwości uzyskania wyniku fałszywie dodatniego hodowli drobno-ustrojów, będącego wynikiem zanieczyszczenia mikrobiolo-gicznego pożywki przed jej użyciem do badań. Żyzność to taka cecha, która świadczy o właściwościach odżywczych pożywki wpływających na możliwość wzrostu drobnoustro-jów. Pożywka charakteryzująca się odpowiednią żyznością to pożywka umożliwiająca szybki i intensywny wzrost drob-noustrojów. Żyzność wskazuje czy pożywka posiada pra-widłowy skład, tj. zawiera wszystkie niezbędne do wzrostu drobnoustrojów składniki oraz czy stężenie tych składników jest prawidłowe. Inną cechą użytkową pożywki jest selek-tywność (wybiórczość), świadcząca o zdolności pożywki do wybiórczego hamowania wzrostu określonych grup drobno-ustrojów. Cecha ta związana jest z obecnością w pożywce takich składników (suplementów), które wybiórczo hamują wzrost jednych drobnoustrojów, ale nie wpływają na możli-

189

wość jednoczesnego wzrostu innych drobnoustrojów. Dzię-ki tej właściwości pożywki, możemy hodować określone, wybrane grupy drobnoustrojów. Specyficzność pożywki to cecha zapewniająca właściwe różnicowanie drobnoustro-jów wyhodowanych na danym podłożu. Rozróżnienie drob-noustrojów poprzez makroskopową ocenę stopnia nasilenia reakcji biochemicznych i/lub fizjologicznych (np. wielkość i kolor kolonii, obecność hemolizy, itp.) możliwe jest dzięki obecności w pożywce odpowiednich składników różnicują-cych. Kolejną właściwością pożywek jest zdolność do oceny wrażliwości drobnoustrojów na leki. Badanie lekowrażliwo-ści wykonywane jest przy użyciu specjalnych pożywek, któ-re mają umożliwić nie tylko wzrost drobnoustroju, ale także właściwą dyfuzję leku w pożywce, dzięki czemu warunkują prawidłowy wynik badania. 2. Czynniki wpływające na jakość pożywek mikrobiolo-gicznychW procesie wytwarzania pożywek, co dotyczy zarówno la-boratorium jak i wytwórców pożywek komercyjnych, należy zapewnić nadzorowanie wszystkich tych czynników i etapów postępowania, które mogą mieć wpływ na jakość pożywek mikrobiologicznych, tj. na ich właściwości fizyczne, chemicz-ne oraz właściwości mikrobiologiczne. Wśród czynników o największym znaczeniu dla jakości pożywek można wy-mienić [3, 4, 5]:

jakość poszczególnych składników, w tym wody i suple-–mentów, z których sporządzane są pożywki,skład ilościowy pożywek warunkujący właściwości od-–żywcze,sposób przeprowadzenia procedury przygotowania poży-–wek,proces sterylizacji warunkujący jałowość pożywek,–sposób pakowania zabezpieczający przed wtórnym za-–

nieczyszczeniem mikrobiologicznym, odwodnieniem, de-strukcyjnym działaniem światła,sposób i warunki przechowywania pożywek warunkujące –stabilność właściwości pożywek,warunki transportu mające wpływ na stabilność pożywek.–

Nadzorowanie wymienionych czynników poprzez standa-ryzację procesu wytwarzania i przechowywania pożywek oraz wdrożenie odpowiednich mechanizmów kontrolnych obejmujących, zarówno poszczególne etapy wytwarzania pożywek, jak i sprawdzanie właściwości pożywki w jej koń-cowej postaci, są działaniami zapewniającymi, że do badań mikrobiologicznych zostaną użyte pożywki o właściwej ja-kości.

2.1. Pożywki wykonywane w laboratoriumW przypadku laboratoriów samodzielnie wykonujących po-żywki, istotne jest ustalenie zasad i mechanizmów nadzo-rowania wszystkich, oprócz transportu, etapów wytwarzania pożywek wpływających na ich jakość [4, 5, 10, 12, 13]. Jakość podłoża bezpośrednio zależy od jakości surowców stosowanych do jej wytworzenia, dlatego też zaleca się, aby laboratorium dokonywało zakupu komponentów i suplemen-tów pożywek u renomowanych dostawców. W przypadku składników do sporządzania pożywek, ale także dla pożywek częściowo przygotowanych dostarczanych do laboratorium w postaci granulatu lub odwodnionego proszku, niezwykle istotne jest kierowanie się zasadą first in - first out (pierwsze przyszło – pierwsze wyszło) [4, 13]. Wykorzystywanie tego typu składników i pożywek wiąże się z koniecznością spraw-dzania szczelności opakowania, notowaniem daty pierw-szego otwarcia oraz każdorazowym dokonywaniem oceny wizualnej zawartości otwieranego pojemnika. W przypadku stwierdzenia zmiany sypkości, zbrylenia, zmiany zabarwie-nia lub innych zmian fizyko-chemicznych, dane opakowanie

Pożywka mikrobiologiczna to zestaw substancji w płynnej, półpłynnej lub stałej postaci, zawierający naturalne i/lub syntetyczne składniki służące do namnożenia lub utrzymania przy życiu drobnoustrojów [PN-EN 1659:2004]

Partia pożywki mikrobiologicznej (seria pożywki) to w pełni możliwa do zidentyfikowania jednostka pochodząca z określonej masy półproduktu lub gotowego produktu, jednolitego typu i jakości, która spełnia wymagania produkcyjne (kontrola w trakcie produkcji) i kryteria zapewnienia jakości, wytworzona w tym samym zdefiniowanym okresie produkcyjnym i oznakowana tym samym numerem serii [PN-EN 12322:2005]

Pożywka gotowa do użycia to pożywka mikrobiologiczna, która jest dostarczona w pojemnikach, w formie gotowej do użycia (np. w płytkach Petriego, w probówkach lub innych pojemnikach) [PN-EN 1659:2004]

Pożywka niekompletna to pożywka mikrobiologiczna, która wymaga co najmniej jeszcze jednego dodatkowego etapu pracy przed jej zamierzonym użyciem (np. rozpuszczenia, wylania do płytek, rozporcjowania, dodania suplementu/suplementów) [PN-EN 1659:2004]

Pożywka sucha to pożywka mikrobiologiczna w postaci suchej, która nie jest gotowa do bezpośredniego użycia (np. proszki, granu-laty, produkty liofilizowane) [PN-EN 1659:2004]

Szczep referencyjny to drobnoustrój oznaczony przynajmniej do poziomu rodzaju i gatunku, skatalogowany i opisany zgodnie z jego właściwościami [PN-EN 12322:2005]

Szczep macierzysty to partia fiolek/pojemników z hodowlą uzyskaną w laboratorium z pojedynczego przesiewu szczepu referencyj-nego lub wiele fiolek/pojemników z tej samej serii szczepu referencyjnego od dostawcy[PN-EN 12322:2005]

Szczep kontrolny to drobnoustrój używany do mikrobiologicznej oceny działania pożywek mikrobiologicznych [PN-EN 12322:2005]

Tabela IWybrane definicje dotyczące pożywek mikrobiologicznych, szczepów referencyjnych oraz kontroli właściwości pożywek.

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

190

składnika lub pożywki należy odrzucić, a do przygotowania pożywki użyć innego opakowania.Jednym z głównych składników pożywek jest woda. W przy-padku tego komponentu, parametry, które należy kontrolo-wać to pH i przewodnictwo [13]. Prawidłowo, wartość pH wody powinna mieścić się w zakresie od 5,5 do 7,5 [4, 13]. Wskaźnikiem stopnia czystości wody jest przewodność wła-ściwa, która zależy od zawartości jonów soli organicznych i nieorganicznych, w tym także jonów miedzi, których obec-ność w pożywce wpływa hamująco na wzrost drobnoustro-jów. Prawidłowo, przewodność właściwa wody mierzona w temperaturze 250C nie powinna przekraczać 25 µS cm-1 [4, 13]. Wyższa przewodność świadczy o zwiększonej zawar-tości jonów, a więc niskiej czystości wody. Jeśli pomiar jest przeprowadzany w innej temperaturze, to w celu uzyskania prawidłowego wyniku przewodności, należy zastosować od-powiedni współczynnik przeliczeniowy dla rzeczywistej tem-peratury, w której dokonano pomiaru.W laboratorium, które samodzielnie przygotowuje pożyw-ki, cały tok postępowania podczas przygotowywania i wy-twarzania pożywek powinien być przeprowadzany zgodnie z recepturą danej pożywki, ustaloną procedurą i szczegó-łowo dokumentowany. Dokumentacja ta powinna umożliwić odtworzenie przebiegu całego procesu wytwarzania każdej partii pożywek w celu oceny poprawności przygotowania po-żywki do użycia.Jałowość pożywki uzależniona jest od właściwego przepro-wadzenia procesu sterylizacji. Sterylizację najczęściej wy-konuje się za pomocą przegrzanej pary wodnej lub metodą filtracji [14]. Sterylizację za pomocą pary wodnej przeprowa-dza się w autoklawie, a liczba pożywek jakie jednorazowo można poddać procesowi sterylizacji i czas trwania powinny być ściśle określone, bowiem podczas obróbki cieplej może dojść do niepożądanych reakcji między poszczególnymi składnikami pożywki lub do ich zniszczenia. Z tego powo-du, cały proces sterylizacji powinien być stale monitorowany poprzez sprawdzanie temperatury i ciśnienia. Dodatkowym mechanizmem pozwalającym na ocenę poprawności proce-su sterylizacji jest także monitorowanie skuteczności proce-su sterylizacji za pomocą wskaźników fizycznych, chemicz-nych i biologicznych.Jakość pożywki w dużej mierze zależy także od warunków jej przechowywania [3, 4]. Pożywkom wytworzonym w la-boratorium należy zapewnić takie warunki, aby uchronić je przed zmianą składu i wtórnym zanieczyszczeniem mikro-biologicznym. Zgodnie ze specyfikacja techniczną ISO/TS 11133-1 zaleca się, aby pożywki chronić przed dostępem światła, odwodnieniem i przechowywać je w temperaturze 5±30C [4]. W przypadku dłuższej ekspozycji na światło sło-neczne lub sztuczne może dojść do zmian składu chemicz-nego pożywki, zaś odwodnienie może skutkować zmianą stężenia poszczególnych jej składników. W konsekwencji, w każdym z tych przypadków, dochodzi do zmian właściwo-ści pożywki, a więc obniżenia jej jakości.Specyfikacja ISO/TS 11133-1 zaleca także, aby pożywek

rozlanych na płytki nie przechowywać dłużej niż 2-4 tygodni, zaś pożywek rozlanych do butelek i probówek – nie dłużej niż 3-6 miesięcy [4]. Okres przechowywania danego typu podłoża można modyfikować na podstawie wyników badań wykonywanych podczas walidacji trwałości podłoża. Okres przydatności pożywek można wydłużać jeśli będą one przechowywane w szczelnych plastikowych opakowaniach zbiorczych. W celu wyeliminowania nadmiernego skraplania wody podczas przechowywania, płytki przed zamknięciem należy schodzić. Dla zapewnienia pełnej identyfikowalności stosowanych podłoży, każda płytka powinna być dokładnie opisana, po-przez umieszczenie na spodzie lub z boku płytki, daty przy-gotowania i/lub daty ważności, a także kodu wskazującego na rodzaj podłoża. Wszystkie te oznakowania umożliwiają pełną identyfikację serii danej pożywki.

2.2. Pożywki gotowe do użyciaW przypadku podłóż gotowych do użycia odpowiednia ja-kość komponentów, prawidłowy skład pożywki, sposób wytwarzania i sterylizacji, jej właściwości fizyko-chemiczne i mikrobiologiczne gwarantowane są przez wytwórcę [7, 15]. Potwierdzeniem jakości danej serii pożywki jest stosowny certyfikat jakości, który wytwórca zobowiązany jest dostar-czyć do laboratorium. W przypadku pożywek gotowych do użycia, jakość pożywki dostarczanej do laboratorium, zależy głównie od warunków transportu do laboratorium i sposobu przechowywania w laboratorium. Podczas transportu do laboratorium, najczęściej zapewnia-nego i organizowanego przez wytwórcę lub dystrybutora, pożywki powinny być zapakowane w sposób zabezpiecza-jący je przed ewentualnymi uszkodzeniami mechanicznymi, a warunki w jakich są transportowane powinny chronić je przed przegrzaniem lub zamrożeniem oraz odwodnieniem. Transportowanie i przechowywanie pożywek w temperatu-rze znacznie wyższej od zalecanej przez wytwórcę, może doprowadzić do zmiany składu chemicznego pożywki (de-gradacja, niepożądane reakcje pomiędzy komponentami) oraz zmiany stężenia składników pożywki, co w konsekwen-cji może spowodować pogorszenie właściwości pożywki takich jak żyzność, selektywność i specyficzność. Następu-jące po sobie skrajne zmiany temperatury mogą natomiast doprowadzić do pojawienia się na wieczku płytki z pożywką wilgoci, spowodowanej nadmierną kondensacją wody [4]. Zamrożenie może spowodować, że pożywki agarowe zupeł-nie nie będą nadawać się do użycia w procesie diagnostycz-nym, zaś w pożywkach płynnych może dojść do wytrącenia niektórych składników pożywki, co także uniemożliwia ich stosowanie.W przypadku komercyjnych podłóż gotowych do użycia, laboratorium bezwzględnie powinno przestrzegać instrukcji wytwórcy w zakresie warunków przechowywania oraz okre-su przydatności pożywek do użycia. Informacje odnośnie warunków przechowywania danej pożywki zawarte są w fir-mowej instrukcji technicznej pożywki (opisie pożywki).

191

3. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznychKontrola jakości pożywek mikrobiologicznych służy do sprawdzania i/lub potwierdzania jakości, a tym samym, przydatności pożywek do wykonywania rutynowych badań mikrobiologicznych. Jak już wspomniano na wstępie, kontro-li należy poddać pożywki wykonywane w laboratorium oraz pożywki pochodzenia komercyjnego [6]. Kontrolę tę wykonu-je się dla każdej serii pożywki stopniowo, etapami o różnym poziomie szczegółowości [3, 4, 13, 15]. Pierwszym etapem kontroli jest ocena ogólna, obejmująca określenie właści-wości fizyko-chemicznych pożywki. Drugi etap, to ocena szczegółowa obejmująca mikrobiologiczne kryteria jakości pożywek charakteryzujące właściwości użytkowe pożywek, tj. jałowość, żyzność, selektywność i specyficzność. Zgodnie z EN 12322, daną partię pożywki można zaakceptować jako przydatną do stosowania w procesie diagnostycznym, tzn. uznać jej jakość za właściwą, jeśli jednocześnie spełnione są ogólne i mikrobiologiczne kryteria jakości [3].O zakresie kontroli jakości pożywek mikrobiologicznych decyduje laboratorium. Zakres kontroli jest uzależniony od tego, czy laboratorium wykorzystuje pożywki przygotowywa-ne samodzielnie czy pożywki komercyjne. W przypadku po-żywek wytwarzanych w laboratorium, należy przeprowadzać pełną kontrolę jakości pożywek [6] - ogólną i szczegółową, zgodnie z zaleceniami obowiązujących norm [3, 4, 5, 10]. W tym miejscu, trzeba zauważyć, że właściwie tylko norma europejska EN 12322 bardzo ogólnie odnosi się do kontro-lowania pożywek mikrobiologicznych wykorzystywanych do diagnostyki in vitro. Pozostałe dokumenty normatywne, szczegółowo opisujące metody kontrolowania pożywek mi-krobiologicznych, np. specyfikacja techniczna ISO/TS 11133 [4, 5], przeznaczone są do stosowania w laboratoriach mi-krobiologii żywności i pasz. Specyfikacja ta podaje ogólne zasady kontrolowania pożywek mikrobiologicznych (metody kontroli i kryteria oceny), które ze względu na uniwersalność są stosowane do kontrolowania pożywek wykorzystywa-nych w laboratoriach o innych profilach badań mikrobiolo-gicznych, w tym także w mikrobiologicznych laboratoriach medycznych [10].W przypadku pożywek komercyjnych wykorzystywanych do diagnostyki in vitro, zakres kontroli uzależniony jest, jak już wspomniano, od posiadania przez wytwórcę potwierdzonego systemu zarządzania jakością [6]. Ze względu na brak szcze-gółowych wytycznych dotyczących pożywek do diagnostyki in vitro, w celu ustalenia sposobu wykonania kontroli tych pożywek, laboratorium może również oprzeć się na firmowej instrukcji technicznej pożywki. Instrukcja taka, oprócz opisu pożywki, powinna przedstawiać sposób przeprowadzenia kontroli danej pożywki, a także kryteria oceny poszczegól-nych parametrów jakości pożywki wraz z oczekiwanymi wy-nikami. Zgodnie z dyrektywą IVD [7] oraz obowiązującymi normami europejskimi [3, 4, 13], wytwórca zobowiązany jest do przekazania takich informacji do laboratorium.W przypadku pożywek komercyjnych, dodatkowym, wstęp-nym etapem kontrolnym, poprzedzającym właściwą kontrolę

jakości pożywek, jest każdorazowe sprawdzenie dokumen-tacji dostawy oraz ocena opakowania transportowego [4, 13, 15].

3.1. Kontrola wstępna dostawy pożywek komercyjnychWstępna kontrola dostawy komercyjnych pożywek mikro-biologicznych obejmuje sprawdzenie dokumentacji potwier-dzającej jakość pożywki dostarczanej przez wytwórcę – do-kumenty dostawy wskazujące na warunki transportu oraz certyfikat jakości [4, 13, 15]. Certyfikat ten dla każdej serii pożywek, powinien zawierać następujące dane:

nazwę wytwórcy,–nazwę produktu, numer serii i datę ważności,–ogólną charakterystykę właściwości fizyko-chemicznych –pożywki: kolor, pH, itp.,charakterystykę mikrobiologiczną tj. wykaz szczepów kon-–trolnych użytych do przeprowadzenia kontroli danej serii pożywki wraz z opisem prawidłowej morfologii kolonii wy-rosłych na pożywce.

Podczas odbioru każdej dostawy pożywek, laboratorium zobowiązane jest do odnotowywania daty otrzymania do-stawy oraz wizualnej oceny opakowania transportowego, tj. sprawdzenia jego oznakowania (dane identyfikujące po-żywkę), szczelności i integralności [4, 13, 15]. Stwierdzenie uszkodzenia opakowania transportowego pożywek wskazu-je na potencjalne obniżenie jakości pożywek i jest podstawą do złożenia reklamacji u wytwórcy lub dystrybutora.

3.2. Kontrola ogólna właściwości fizycznych i chemicz-nych pożywkiWłaściwości fizyczne i chemiczne oceniane są głównie po-przez wizualną, makroskopową ocenę wyglądu pożywki. Kontrola ta jest łatwa do przeprowadzenia i bardzo przy-datna, gdyż przed rozpoczęciem szczegółowych badań kontrolnych, może wskazywać na zmiany jakości pożywki. Przykładowo, inne niż oczekiwane zabarwienie pożywki może świadczyć o nieprawidłowym jej składzie chemicz-nym. Właściwości fizyczne i chemiczne należy kontrolować dla każdej partii pożywek, zarówno tych przygotowanych w laboratorium, jak i komercyjnych [3, 4, 13]. Kontrola poży-wek do diagnostyki in vitro obejmuje ocenę [3, 15]:

ilości produktu w opakowaniu (w przypadku pożywek syp-–kich),grubości warstwy agaru i formy wypełnienia dla podłoży –stałych oraz objętości pożywki płynnej,wyglądu zewnętrznego, tj. zabarwienia, klarowności, –obecności artefaktów, jednorodności,stabilności i konsystencji żelu,–wyglądu zewnętrznego specyficznych pożywek, np. agaru –z krwią,zawartości wilgoci lub homogenność suchych pożywek tj. –czy pożywka nie uległa zbryleniu,wartości pH.–

Jedną z ważniejszych cech fizycznych jest pH, które powin-no być sprawdzane szczególnie podczas przygotowywania

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

192

podłóż w laboratorium, tj. przed i po autoklawowaniu przy użyciu wzorcowanego pehametru. Zasadniczo, przyjmuje się, że schłodzona do temperatury 25°C, pożywka powinna mieć wymaganą wartość pH ± 0,2 jednostki pH [4], np. agar XLD powinien mieć pH 7,4± 0,2.W przypadku gotowych do użycia pożywek komercyjnych, najczęściej spotykane nieprawidłowości dotyczące właści-wości fizycznych i chemicznych obejmują [13]:

niewystarczającą ilość agaru w płytce tj. < 3 mm lub po-–żywki w butelce/probówce,pęknięcie lub uszkodzenie płytki,–oderwanie agaru od płytki,–zamrożenie lub roztopienie agaru,–hemolizę krwi w pożywce,–chropowatość powierzchni agaru,–nadmiar pęcherzyków na powierzchni agaru,–nadmiar wilgoci lub odwodnienie,–nietypowe zabarwienie pożywki, –obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych widocznych –gołym okiem.

Stwierdzenie jakiejkolwiek z wymienionych nieprawidłowości w makroskopowej ocenie właściwości pożywki, upoważnia do reklamacji danej partii pożywki u wytwórcy/ dostawcy.

3.3. Kontrola szczegółowa właściwości mikrobiologicz-nych pożywekMetody kontroli poszczególnych parametrów wskazujących na właściwości mikrobiologiczne pożywek oraz kryteria ich oceny zostały opisane w ISO/TR 11133-2 [4, 5, 10]. Wyjąt-kiem jest badanie przydatności pożywek do oceny lekowraż-liwości, które, jak podano w EN 12322, należy wykonywać zgodnie z odpowiednimi metodami referencyjnymi [3]. Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek ma na celu sprawdzenie obecności zanieczyszczeń mikrobiolo-gicznych w pożywce, intensywności wzrostu drobnoustrojów na danej pożywce, zahamowania wzrostu mikroflory towa-rzyszącej, potwierdzenie, że wyhodowane drobnoustroje (szczep kontrolny) wykazują charakterystyczne dla swojego gatunku cechy biochemiczne i fizjologiczne oraz sprawdze-nie przydatności do badania lekowrażliwości. Dlatego też, kontrola ta obejmuje tzw. mikrobiologiczne kryteria jakości [3]:

zanieczyszczenia mikrobiologiczne - badany parametr to •jałowość,cechy pożywki wpływające na wzrost drobnoustrojów:•właściwości odżywcze - badany parametr to żyzność,–właściwości selektywne - badany parametr to selektyw-–ność,cechy pożywki wpływające na ocenę właściwości bioche-•micznych i fizjologicznych drobnoustrojów - badany para-metr to specyficzność,przydatność do badania wrażliwości drobnoustrojów na •leki.

Kontrolę właściwości mikrobiologicznych, określanych też jako właściwości użytkowe pożywek [13], należy wykonywać

zawsze wtedy, gdy laboratorium rozpoczyna pracę z nową serią składników pożywek, dla nowej partii pożywek sporzą-dzonych w laboratorium, przy zmianie dostawcy pożywek, a także w przypadku zaistnienia wątpliwości dotyczących jakości danej serii pożywek, o czym można wnioskować na podstawie wyników ogólnej kontroli pożywek mikrobiologicz-nych [5]. Do oceny właściwości mikrobiologicznych pożywek wpływa-jących na wzrost, tj. żyzności i selektywności drobnoustro-jów, należy wykorzystywać metody ilościowe i półilościowe [3], zaś do oceny specyficzności - metody jakościowe. Nie-zbędnym warunkiem przeprowadzenia tej kontroli jest zasto-sowanie odpowiednich szczepów kontrolnych.

3.3.1. Kontrola jałowości pożywekZgodnie z normą EN 12322, pożywki mikrobiologiczne moż-na podzielić na te, które są sterylizowane w końcowym opa-kowaniu oraz na pożywki gotowe do użycia wyprodukowane w sposób eliminujący lub ograniczający zanieczyszczenia do akceptowalnego minimum [3]. Norma EN 12322 zaleca, aby odpowiednia liczba pożywek z każdej partii była badana pod kątem zanieczyszczeń mikrobiologicznych [3]. Ocenę jało-wości przeprowadza się inkubując pożywki w temperaturze odpowiedniej dla stosowanej metody badania przez co naj-mniej 3 dni (≥72 godziny) [3]. Norma EN 12322 nie precyzuje jednak ile pożywek należy poddać kontroli jałowości i w jakiej dokładnie temperaturze je inkubować. Dlatego też, w celu prawidłowego przeprowadzenia badania jałowości możemy oprzeć się na postanowieniach innego dokumentu dotyczące-go wytwarzania i kontroli jakości pożywek tj. ISO/TS 11133-2 lub skorzystać z wytycznych wytwórców pożywek. W specyfi-kacji tej podano, iż pod względem jałowości należy badać, np. jedną płytkę/butelkę lub 1% płytek/butelek z początku i końca partii produkcyjnej, inkubując pożywki co najmniej 18 godzin w temperaturze 37°C lub temperaturze w jakiej pożywka jest stosowana w procedurze badawczej [13].W przypadku pożywek sterylizowanych w końcowym opa-kowaniu, jałowość powinna być zagwarantowana poprzez zastosowanie przez wytwórcę zwalidowanego procesu sterylizacji całkowicie eliminującego zanieczyszczenia mi-krobiologiczne [3, 7], co oznacza, że w żadnym z końco-wych opakowań, pożywki nie powinny wykazywać wzrostu drobnoustrojów. W przypadku pożywek przygotowywanych w warunkach aseptycznych, dopuszcza się zanieczyszcze-nie mikrobiologiczne w mniej niż 5% całej partii pożywek [3]. Jeżeli poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych przekra-cza 5% danej partii pożywki, to powinna ona być odrzucona [3]. Kontrolę jałowości należy przeprowadzać zarówno dla po-żywek przygotowywanych w laboratorium, jak i dla pożywek komercyjnych.

3.3.2. Zasady doboru szczepów kontrolnychPrawidłowe przeprowadzenie kontroli żyzności, selektywno-ści i specyficzności, wymaga aby dla każdej kontrolowanej

193

pożywki skomponować odpowiednio dobrany zestaw szcze-pów kontrolnych przygotowanych na bazie szczepów refe-rencyjnych [3]. W tym celu, laboratorium powinno dyspono-wać odpowiednimi szczepami referencyjnymi pochodzącymi z uznanych kolekcji stowarzyszonych w European Culture Collection’s Organization (ECCO) lub World Federation for Culture Collection (WFCC) [3]. Przykładem takiej kolekcji jest ATCC (American Type Culture Collection). Prawidłowo skomponowany zestaw szczepów kontrolnych, określanych też jako organizmy testowe [4], powinien zawierać [3]:

szczep stanowiący kontrolę dodatnią (tzw. szczep docelo-–wy, target) – posiadający typowe cechy, silnie rosnący na danej pożywce, wykazujący dodatni wynik testu,szczep stanowiący kontrolę słabo dodatnią – słabo rosną-–cy na badanej pożywce, wykazujący z opóźnieniem wynik testu,szczep stanowiący kontrolę ujemną (non-target) - wyka-–zujący częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu na badanej pożywce, wykazujący ujemny wynik testu.

Do oceny selektywności koniecznym wydaje się także za-stosowanie szczepu dającego inne od szczepu docelowego reakcje biochemiczne.Zestawy szczepów kontrolnych dla poszczególnych rodza-jów pożywek, laboratorium ustala samodzielnie kierując się przedstawionymi powyżej zasadami. Przykładowe zestawy szczepów kontrolnych, jakie można zastosować do kontroli

pożywek wykorzystywanych do diagnostyki in vitro przedsta-wia Tabela II.Dodatkowym warunkiem uzyskiwania wiarygodnych wy-ników badań kontrolnych jest właściwe postępowanie ze szczepami referencyjnymi. Bardzo dobrym źródłem infor-macji i wytycznych dotyczących prawidłowego postępowa-nia ze szczepami referencyjnymi jest raport techniczny ISO 11133 [4].

3.3.3. Ilościowa i półilościowa kontrola żyzności pożywekOcenę żyzności pożywek stałych należy wykonywać metodą ilościową [3], która opiera się na określeniu tzw. współczyn-nika żyzności (Productivity Ratio, PR), wyrażającego sto-sunek całkowitej liczby kolonii wyrosłych na kontrolowanej pożywce do całkowitej liczby kolonii wyrosłych na pożywce referencyjnej [5, 10, 13]. Sposób obliczania tego współczyn-nika przedstawia następujący wzór:

PR = Ns / NogdziePR – współczynnik żyzności (Productivity Ratio)Ns – całkowita liczba kolonii na pożywce badanejNo – całkowita liczba kolonii na pożywce referencyjnej

Tak więc, dla poprawnego wykonania tego badania kontrol-nego należy zastosować tzw. pożywkę referencyjną, pełnią-

Tabela IIPrzykładowe zestawy szczepów kontrolnych do oceny żyzności, selektywności oraz specyficzności pożywek (opracowanie własne na podsta-wie certyfikatów kontroli jakości wytwórców, ISO/TS 11133-2, M22-A3).

Nazwa pożywki Cecha Szczepy testowe Kryterium oceny- inten-

sywność wzrostuKryterium oceny-reakcje

charakterystyczne

XLD

żyznośćSalmonella enterica

ATCC 13076 Dobry wzrost Czerwone koloniez czarnym środkiem

selektywność Enterococcus faecalisATCC 29212

Całkowite zaha-mowanie wzrostu -

specyficznośćEscherichia coli

ATCC 8739

Częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu Żółte kolonie

MCK

żyznośćE. coli

ATCC 25922 Dobry wzrost Kolonie laktozo dodatnie

selektywność Enterococcus faecalisATCC 29212

Całkowite zaha-mowanie wzrostu -

specyficznośćProteus vulgaris

ATCC 6380 Dobry wzrost Kolonie laktozo ujemne

HEKT

żyznośćSalmonella enterica

ATCC 13076 Dobry wzrost Zielone kolonie z czarnym środkiem

selektywnośćEnterococcus faecalis

ATCC 29212 Zahamowanie wzrostu -

specyficznośćE. coli

ATCC 25922 Częściowe lub całkowi-te zahamowanie wzrostu Łososiowo -żółte kolonie

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

194

cą rolę pożywki odniesienia, do której porównujemy pożyw-kę badaną. Najczęściej, pożywką referencyjną jest pożywka nieselektywna, zapewniająca optymalny wzrost wszystkich szczepów kontrolnych, dodatnich i ujemnych. Jako pożyw-kę referencyjną można także stosować ten sam rodzaj po-żywki innej partii, która została już skontrolowana [5, 13]. W metodzie tej, na pożywkę badaną oraz referencyjną nale-ży posiać po 0,1 ml zawiesiny szczepu kontrolnego o tak do-branym stężeniu drobnoustrojów, aby po inkubacji uzyskać policzalną liczbę kolonii. Zawiesinę bakteryjną dokładnie rozprowadzić na pożywkach za pomocą głaszczki. Po za-kończeniu inkubacji, policzyć kolonie wyrosłe na pożywkach i obliczyć współczynnik żyzności (PR). Dodatkowo, ocenić wygląd i wielkość wyrosłych kolonii. Prawidłowo, żyzność pożywki jest właściwa jeśli dla pożywek selektywnych war-tość współczynnika żyzności wynosi co najmniej 0,1, zaś dla pożywek nieselektywnych co najmniej 0,7 [5, 10, 13]. W przypadku niektórych pożywek dopuszcza się jednak bardziej liberalne kryteria [13]. Przyjmuje się, że w metodzie tej wzrost szczepu dodatniego na kontrolowanej pożywce powinien wynosić co najmniej 70% wzrostu uzyskanego na pożywce referencyjnej [16]. Inną metodą oceny żyzności pożywek stałych jest półilo-ściowa ekonometryczna metoda posiewu rysowego [5, 13]. W metodzie tej, oceny żyzności dokonuje się poprzez wy-znaczenie indeksu wzrostu (Growth Index, GI). Ezą o po-jemności 1 µl nachyloną pod kątem 20o-30o w stosunku do podłoża, należy wykonać posiew rysowy dokładnie według poniższego schematu (Ryc.1)

całej długości 0,5 punktu - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost –na połowie długości 0 punktów – uzyskuje linia, na której nie stwierdzono wzro-–stu lub wzrost jest mniejszy niż połowa długości posianej linii.

Prawidłowo, indeks wzrostu dla szczepu dodatniego powinien wynosić co najmniej 6 punktów [5, 10, 13], zaś wzrost szcze-pu ujemnego powinien być całkowicie lub częściowo zaha-mowany. Wykonanie badania kontrolnego tą metodą wymaga sporego doświadczenia w jej stosowaniu (Rycina 2).

Rycina 1Schemat posiewu rysowego w metodzie ekonometrycznej wg ISO 11133-2.

Rycina 2Ocena żyzności pożywek agarowych półilościową metodą ekono-metryczną. Przykład wzrostu Salmonella enterica ATCC 13076 na pożywce XLD.

Odstępy między kolejnymi liniami posiewu powinny wyno-sić dokładnie 0,5 cm. Do badania należy użyć zawiesiny dodatniego szczepu kontrolnego (target), zawierającej 103

do 104 jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1µl oraz ujem-nego szczepu kontrolnego o stężeniu zawiesiny 104 do 106 jtk w 1µl. Indeks wzrostu wylicza się poprzez zsumowanie punktów przyznawanych każdej posianej linii według na-stępującej skali:

1 punkt - uzyskuje linia, na której stwierdzamy wzrost na –

3.3.4. Ilościowa kontrola selektywności pożywekKontrola wybiórczości pożywek selektywnych ma na celu wy-kazanie prawidłowego działania składników warunkujących selektywność danej pożywki. Kontrolę selektywności pożyw-ki można przeprowadzić metodą ilościową poprzez oblicze-nie tzw. współczynnika selektywności (Selectivity Factor, SF), który jest różnicą najwyższego rozcieńczenia dające-go wzrost co najmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej, a najwyższym rozcieńczeniem dającym porównywalny wzrost na pożywce kontrolowanej [5, 10, 13]. Współczynnik selektywności obliczamy według następującego wzoru:

SF = Do – Dsgdzie:SF – współczynnik selektywności (Selectivity Factor) wyra-żony w log10

Do – najwyższe rozcieńczenie dające wzrost co najmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnejDs – najwyższe rozcieńczenie dające porównywalny wzrost na pożywce badanej

W celu wykonania badania należy przygotować szereg roz-cieńczeń szczepu kontrolnego będącego kontrolą ujemną (non-target). Następnie, na pożywkę badaną i referencyjną wysiać po 0,1 ml każdego przygotowanego rozcieńczenia, rozprowadzić jałową głaszczką na powierzchni agaru i inku-bować w cieplarce przez 48 godzin w temperaturze i atmos-

195

ferze w jakiej wykorzystywana jest pożywka w procedurze badawczej. Po inkubacji ocenić wygląd i wielkość kolonii, a do obliczenia współczynnika selektywności (SF) wybrać taką pożywkę kontrolowaną i taką pożywkę referencyjną, na których uzyskano porównywalny wzrost. Wartość współczyn-nika selektywności wyrażana jest jako logarytm dziesiętny, i prawidłowo dla pożywek selektywnych powinna wynosić co najmniej 2. Na pożywce selektywnej wzrost szczepów badanych powi-nien być częściowo lub całkowicie zahamowany. Stopień zahamowania wzrostu zależy od rodzaju szczepu kontrolne-go i użytej pożywki, zwykle jednak przyjmuje się, że wzrost ulega zredukowaniu o współczynnik wynoszący 103 do 104

lub więcej, w porównaniu ze wzrostem na nieselektywnej pożywce referencyjnej [16].

3.3.5. Jakościowa kontrola właściwości mikrobiologicz-nych pożywek stałychInnym sposobem oceny właściwości użytkowych pożywek jest jakościowa metoda posiewu rysowego [5,13]. W meto-dzie tej ezą o pojemności oczka 1µl dokonuje się posiewu rysowego jednego lub kilku szczepów kontrolnych na po-żywkę. W przypadku posiewu kilku szczepów, linie posiewu poszczególnych szczepów nie powinny się krzyżować (Ry-cina 3). Zestaw szczepów kontrolnych można dobrać w taki sposób, aby jednocześnie ocenić żyzności, selektywności i specyficzności pożywki Do oceny żyzności, inokulum szczepu kontrolnego powinno zawierać 103 do 104 jtk w 1µl, do oceny selektywności inokulum szczepu kontrolnego po-winno zawierać powyżej 104 jtk w 1 µl [5, 13]. W celu porów-nywalności wyników kontroli, zaleca się, aby oceny selek-tywności i specyficzności nie dokonywać wcześniej niż po 48 godzinach inkubacji pożywki. Po zakończeniu inkubacji, każdej posianej linii przyznawana jest odpowiednia liczba punktów w skali od 0 do 2. Liczba przyznawanych punktów odpowiada intensywności wzrostu szczepu kontrolnego na pożywce według następujących zasad:

0 punktów – brak wzrostu na całej długości linii–1 punkt – słaby wzrost na danej linii–2 punkty – dobry wzrost na danej linii–

Dobry wzrost na całej długości linii posianego szczepu do-datniego (docelowego) pozwala na uzyskanie 2 punktów i oznacza, że kontrolowana pożywka posiada odpowiednią żyzność. Brak wzrostu szczepu docelowego może suge-rować nieodpowiednią jakość pożywki, tj. nieprawidłowość składu pożywki. W przypadku pożywek selektywnych, brak wzrostu kontrolnego szczepu ujemnego (non-target) umoż-liwia ocenę właściwości selektywnych pożywki. Jednocze-sna, makroskopowa ocena cech biochemicznych i fizjo-logicznych wyrosłych drobnoustrojów (morfologia kolonii, hemoliza, itp.), umożliwia dodatkową ocenę specyficzności kontrolowanej pożywki. Przykłady jakościowej oceny wła-ściwości pożywek przy użyciu metody posiewu rysowego przedstawia Rycina 4.

Wyniki uzyskane podczas kontroli metodą posiewu rysowe-go, należy porównywać z wynikami badań kontrolnych tych samych szczepów kontrolnych przedstawionymi przez wy-twórcę w certyfikacie kontroli jakości danej serii pożywki (np. opisem wzrostu). Łatwość stosowania metody jakościowej do kontrolowa-nia pożywek wynika z prostoty wykonania oraz możliwości jednoczesnej oceny żyzności, selektywności i specyficz-ności, i jest szczególnie polecana do kontrolowania poży-wek gotowych do użycia. Doświadczenia własne pozwoliły wnioskować, że jakościowa metoda posiewu rysowego jest optymalną metodą do oceny pożywek chromogennych. W przypadku tych pożywek, oceniana jest żyzność, a reak-cje barwne, dzięki obecności substratów chromogennych w podłożu umożliwiają ocenę specyficzności. W Tabeli II przedstawiono przykłady gotowych do użycia pożywek ko-mercyjnych wraz z zestawem szczepów kontrolnych oraz kryteriami oceny wyników kontroli.

3.3.6. Badanie wrażliwości na antybiotykiJedną z informacji o zasadniczym znaczeniu dla podjęcia właściwej antybiotykoterapii, jest informacja o wrażliwości wyhodowanego drobnoustroju na leki. Dlatego też, bardzo ważne jest zapewnienie wiarygodności wyników oceny le-kowrażliwości drobnoustrojów, które najczęściej wykony-

Rycina 3Technika posiewu rysowego w jakościowej metodzie oceny właściwości użytkowych pożywek. a) Schemat posiewu rysowego jednego szcze-pu kontrolnego b) Schemat posiewu rysowego trzech różnych szczepów kontrolnych.

Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym

196

wane jest metodą dyfuzyjno-krążkową. Na uwagę zasługu-je fakt, że wynik tego badania zależy nie tylko od jakości stosowanych pożywek, ale także od jakości krążków z an-tybiotykami oraz techniki wykonania badania. Dlatego też, kontrola jakości metody dyfuzyjno-krążkowej ma charakter kompleksowy i pełni funkcję kontrolną nie tylko dla spraw-dzania jakości stosowanych pożywek, ale także jakości krążków antybiotykowych oraz poprawności techniki wyko-nania badania. W celu prawidłowego przeprowadzania kon-troli jakości pożywek do określania lekowrażliwości, norma EN 12322 zaleca stosowanie referencyjnych metod kontroli [3]. Metody takie zostały opracowane przez organizacje fa-chowe jakimi są np. CLSI i EUCAST (tłumaczenie). Organi-zacje te opracowały i opublikowały zasady i procedury wy-konywania kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej przy użyciu szczepów referencyjnych oraz sposób interpretowa-nia i kryteria oceny wyników badań kontrolnych [17, 18, 19, 20]. Wykonanie kontroli jakości metody dyfuzyjno-krążkowej nie powinno przedstawiać większych trudności, gdyż dzięki KORLD, niezbędne procedury i dokumenty są powszechnie dostępne w języku polskim.

PodsumowanieNiniejsze opracowanie oparto głównie na dokumentach nor-matywnych zawierających wymagania akredytacyjne dla la-boratoriów mikrobiologicznych – ISO/IEC 17025, ISO 15189 i EA-04/10 [1, 2, 6] oraz normach dotyczących nadzorowa-nia pożywek mikrobiologicznych [3, 4, 5]. Zapewnienie jako-ści oraz kontrolowanie jakości pożywek mikrobiologicznych są jednym z zasadniczych elementów systemu zarządzania jakością w laboratorium mikrobiologicznym. Nadzorowanie procesu wytwarzania pożywek i kontrolowanie ich jakości wydają się oczywiste w przypadku pożywek wytwarzanych przez laboratorium na własne potrzeby, jednak konieczność kontrolowania pożywek gotowych do użycia jest stale dys-kutowana. Uważa się bowiem, że pożywki komercyjne nie wymagają kontrolowania przez laboratorium, a certyfikat ja-kości pożywki dostarczony przez wytwórcę, jest wystarcza-jącym dowodem ich właściwej jakości. Faktycznie, w ame-

rykańskich wytycznych dotyczących kontrolowania pożywek komercyjnych (NCCLS, dokument M22-A3), nie wprowa-dzono obowiązku kontrolowania wszystkich pożywek ko-mercyjnych [15]. Trzeba jednak zwrócić uwagę, że wytyczne te, w zależności od przeznaczenia pożywek do określonych kierunków badań w celu wykrycia określonych grup drobno-ustrojów, dzielą pożywki na dwie kategorie: pożywki zwolnio-ne z kontroli (exempt media category), dla których certyfikat jakości wytwórcy może być wystarczającym potwierdzeniem jakości oraz pożywki określane jako „nonexempt media ca-tegory”, których jakość obowiązkowo należy potwierdzać w laboratorium. Do pierwszej grupy pożywek zaliczono między innymi agar krwawy, Hektoen (HEK) agar, Colum-bia (CNA) agar. Do drugiej kategorii zaliczono, np. agar MacConkey z sorbitolem, agar czekoladowy z bacytracyną, bulion odżywczy. W przypadku laboratoriów mikrobiologicz-nych ubiegających się o akredytację Polskiego Centrum Akredytacji, wymagania dokumentów odniesienia, tj. ISO/IEC 17025, ISO 15189 oraz EA-04/10 stanowiących kryte-rium oceny w procesie akredytacji, są jednak jednoznaczne i wskazują na obligatoryjny charakter kontroli jakości poży-wek bez względu na źródło ich pochodzenia.Wspólnym elementem wymagań, zarówno norm europej-skich [3, 4], jak i wytycznych amerykańskich (dokument M22-A3) [15], jest zobowiązanie laboratoriów medycznych do kontrolowania dokumentacji oraz cech fizyko-chemicznych każdej dostawy i/lub serii pożywek komercyjnych dostarcza-nych do laboratorium. Zgodnie z wymaganiami europejski-mi [3], kontrola jakości pożywek powinna także obejmować właściwości mikrobiologiczne pożywek – jałowość, żyzność, selektywność, specyficzność oraz zdolność do oceny le-kowrażliwości. O ile metody kontroli zdolności pożywek do oceny wrażliwości na leki zostały dobrze opisane w piśmien-nictwie fachowym [17, 18, 19, 20], to prawidłowe przepro-wadzenie kontroli pozostałych parametrów jakości pożywek do diagnostyki in vitro jest dość trudne ze względu niedo-stateczną ilość odpowiednich dokumentów normatywnych oraz piśmiennictwa fachowego dotyczącego tego zagadnie-nia. Dlatego też, wydaje się wskazane korzystanie z innych,

Rycina 4Jakościowa ocena właściwości mikrobiologicznych (żyzność, selektywność, specyficzność) pożywek agarowych techniką posiewu rysowego, na przykładzie pożywek a) MCK - E. coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Proteus vulgaris ATCC 6380; b) HEKT – Salmonella enterica ATCC 13076, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922.

197

uniwersalnych dokumentów normatywnych przeznaczonych dla laboratoriów mikrobiologicznych o innym profilu badaw-czym [10] oraz firmowych instrukcji pożywek komercyjnych, zawierających informacje o sposobie wykonania kontroli i kryteriach oceny wyników kontroli, czego przykładem mogą być pożywki wykorzystywane w automatycznych systemach hodowli krwi i płynów ustrojowych.Laboratoria mikrobiologiczne starające się o akredytację, kontrolę jakości pożywek komercyjnych przeprowadzają nie tylko dla potwierdzenia ich jakości, ale także w celu kwa-lifikacji dostawców pożywek, gdyż kwalifikacja dostawców wyposażenia jest jednym z podstawowych wymagań akre-dytacyjnych [1, 2].Niniejsze opracowanie nie wyczerpuje bardzo rozległego te-matu jakim jest zapewnienie i kontrola jakości pożywek mi-krobiologicznych do diagnostyki in vitro. Jednak, nawet jeśli laboratorium nie wdraża systemu zarządzania jakością, to w celu zapewnienia wiarygodności wyników badań mikrobio-logicznych, w zakresie swoich możliwości organizacyjnych i technicznych, powinno opracować i stosować mechanizmy kontrolowania pożywek mikrobiologicznych i, jeśli samo wy-twarza pożywki, zapewniania ich jakości podczas procesu wytwarzania.

PiśmiennictwoPN-EN ISO/IEC 17025:2005/Ap1:2007. Ogólne wymagania do-1. tyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących, PKN, Warszawa 2005.PN-EN ISO 15189:2008. Laboratoria medyczne. Szczególne 2. wymagania dotyczące jakości i kompetencji, PKN, Warszawa 2008.PN-EN 12322: 2005. Wyroby medyczne do diagnostyki in vitro. 3. Pożywki mikrobiologiczne – Kryteria oceny działania pożywek mikrobiologicznych, PKN, Warszawa 2005.PKN-CEN ISO/TS 11133-1: 2009. Mikrobiologia żywności i pasz. 4. Wytyczne dotyczące przygotowania i wytwarzania pożywek. Część 1: Ogólne wytyczne dotyczące kontroli jakości pożywek przygotowywanych w laboratorium, PKN, Warszawa 2009.Kwiatek K. Kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych według 5. projektu normy prEN ISO 11133-2:2000. Aktualności bioMerieux 2002; 20:13-18.EA-04/10. Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych, PCA. 6. Warszawa 2002.Dyrektywa nr 98/79/WE Parlamentu Europejskiego i Rady 7. z dnia 27 października 1998 r. w sprawie wyrobów medycznych używanych do diagnozy in vitro.PN-EN ISO 13485:2005. Wyroby medyczne. Systemy zarzą-8. dzania jakością, wymagania dla celów przepisów prawnych. PKN, Warszawa 2005.PN-EN 1659: 2004. Systemy diagnostyczne in vitro. Pożywki 9. mikrobiologiczne. Terminy i definicje. PKN, Warszawa 2004.Stefaniuk E. Laboratoryjna kontrola jakości podłoży mikrobiolo-10. gicznych. Aktualności bioMerieux 2008; 44: 23-26. Zaręba T. Pożywki mikrobiologiczne. Laboratorium 2007; 6: 18-11. 19.Basu S, Pal A, Desai PK. Quality control of culture media in 12. a microbiology laboratory. Indian J Med Microbiol 2005; 23:159-63.Materiały szkoleniowe Gdańskiej Fundacji Wody.13. PN-EN ISO 7218:2008/Ap1:2010. Mikrobiologia żywności 14. i pasz. Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych, PKN, Warszawa 2008.

NCCLS, Quality Control for Commercially Prepared Microbio-15. logical Culture Media; Approved Standard-Third Edition, NC-CLS document M22-A3, 2004.Ogólna instrukcja dotycząca stosowania. Pożywki gotowe do 16. użycia i częściowo przygotowane, instrukcja firmowa Becton Dickinson, July 2009.Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion meth-17. od, EUCAST ver. 1.0, Dec. 2009EUCAST recommended strains for internal quality control, EU-18. CAST ver.1.3, Dec.2010 CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility 19. Testing; Twentieth International Supplement, CLSI document M100-S18, 2008Stefaniuk E., Standaryzacja testów lekowrażliwości i kontrola 20. jakości. Aktualności BioMerieux 2006; 39: 12-16.

Zaakceptowano do publikacji: 07.05.2012

Adres do korespondencji:Dr n. med. Urszula WendtLaboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o.81-519 Gdynia, ul. Powstania Styczniowego 9Btel. (58) 699 88 66, fax (58) 699 88 63e-mail: urszula.wendt@lmbruss.pl