2005 Katedra molekulárnej biológie

Základné metódy práceZákladné metódy práce s ľudskou DNA s ľudskou DNA

Izolácia DNA

DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami

Postup:1. lýza bunkových membrán (SDS)2. štiepenie proteínov (proteináza K)3. odstránenie proteínov

(fenol/chloroform)4. vyzrážanie DNA (etanol)

Postup:Postup:

1.1. lýza bunkových membrán a lýza bunkových membrán a štiepenie proteínovštiepenie proteínov

2.2. naviazanie DNA na kolónunaviazanie DNA na kolónu

3.3. premytie kolónypremytie kolóny

4.4. elúcia DNAelúcia DNA

5.5. precipitácia DNAprecipitácia DNA

Izolácia DNA kitom

Určovanie kvantity a kvality DNA

Spektrofotometricky 1. kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml)2. kvalita – pomer OD pri 260/28nm (ideálne ~ 1,8)Elektroforézou1. kvantita – porovnaním so štandardom2. kvalita – určenie degradácie DNA

Elektroforéza DNA

Separačné média pre analýzu DNA

Agaróza separácia dvojvláknovej DNArozdiel vo veľkosti fragmentov od 10nt

Koncentrácia agarózy

[%]

Oblasťť efektívneho rozdelenia

molekúl DNA [kb]

0,3 60 - 5

0,6 20 - 1

0,7 10 - 0,8

0,9 7 - 0,5

1,2 6 - 0,4

2,0 3 - 0,1

Koncentrácia polyakrylamid

u [%]

Veľkosť DNA fragmentov v

nt

3,5 1000 - 2000

5 80 – 500

8 60 – 400

12 40 – 200

15 25 – 150

20 6 - 100

Polyakrylamid Separácia jednovláknovej a dvojvláknovej DNArozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt

Vizualizácia DNA v géli

EtBr, SYBR Green (agarózový gél, polyakrylamnidový gél)

– interkalačné činidlo– dsDNA– UV lampa

AgNO3 (polyakrlylamidový gél)

– ssDNA a dsDNA– denné svetlo

Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor)

– kovalentná väzba farbičky na primer– ssDNA– laser a CCD kamera

Štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami

enzýmy súčasťou RM systému baktériínázvy podľa pôvodu5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce

Elektroforéza DNA po štiepení RE

Príprava rekombinantných DNA

Hybridizácia DNA

komplementarita bázTm (GC content)

Southernov blottinggenomická DNAštiepenie REelektroforézaoligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii

FISH technológiadetekcia numerických a štrukturálnych chromozómových aberáciífluorescenčne značené oligonukleotidové sondyfluorescenčný mikroskop

Microarray/ DNA chip

Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA s DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku

DNA microarray a DNA chip

možnosti aplikácie možnosti aplikácie technológiítechnológií DNA microarray a DNA microarray a DNA chipDNA chip

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena

Princíp PCR

Verifikácia PCR amplifikácie

PCR odporúčané nastavenie

DNA – 50 – 500 ng

primery– 16 – 24 nt dlhé– Tm 48 – 65 ºC– GC content 40 – 60 %– 1 – 10 pmol/na

reakciu

dNTP– 50 - 500 μM

MgCl2– 1 – 5 mM

DNA polymeráza

– 0,5 – 2,5 U

úvodná denaturácia DNA

94 – 95 ºC 2 – 5 min

cyklické opakovanie – 25 - 35 x

denaturácia 94 – 95 ºC 30 – 40s

hybridizácia T = Tm – 3 ºC polymerizácia 72ºC 45s (do 1

kb)

záverečná polymerizácia

72 ºC 7 min

Chladenie/inaktivácia reakcie

4 – 10 ºC

Sekvenovanie (Sanger) 1

Sekvenovanie (Cycle sequencing)

Pyrosequencing