ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG NGỌC ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN

TRONG DƯỢC PHẨM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG NGỌC ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN

TRONG DƯỢC PHẨM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHOÁ: QHY.2012

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ

Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa

Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.

Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm

thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có

thể thực hiện khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban

Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo

trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học

tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn

bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện

khóa luận này.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2017

Sinh viên

Đặng Ngọc Anh

CHỮ VIẾT TẮT

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid

chromatography)

MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ)

DAD Máy đo quang (Diode Array Detector)

ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược

phẩm sử dụng cho con người (International conference on

Harmonisation of Technical Requirements for Registration of

Pharmaceuticals for Human use)

BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)

EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

LD50 Liều gây chết trung bình (Lethal dose, 50%)

GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

ACN Acetonitril

ATC Phân loại thuốc theo hệ thống Giải phẫu – Điều trị – Hoá học

(Anatomical – Therapeutic – Chemical Code)

NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………..1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN .......................................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen ................................................................ 3

1.1.1. Cấu trúc, tính chất ................................................................................... 3

1.1.2. Tác dụng dược lý ..................................................................................... 4

1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ................................................ 4

1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ ............................ 4

1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử ............ 5

1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......... 6

1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí ........................ 11

1.3. Thẩm định quy trình phân tích ................................................................. 11

1.3.1. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 11

1.3.2. Miền giá trị ............................................................................................ 12

1.3.3. Tính tuyến tính ...................................................................................... 12

1.3.4. Giới hạn phát hiện ................................................................................. 13

1.3.5. Giới hạn định lượng .............................................................................. 14

1.3.6. Độ đúng ................................................................................................. 15

1.3.7. Độ chính xác ......................................................................................... 15

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 17

2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị .................................................................. 17

2.1.1. Dung môi, hoá chất................................................................................ 17

2.1.2. Trang thiết bị ......................................................................................... 17

2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 18

2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký .................................................................. 18

2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 18

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 20

3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký ..................................................................... 20

3.2. Tính đặc hiệu ............................................................................................ 23

3.2.1. Khả năng phân tách ............................................................................... 23

3.2.2. Thời gian lưu ......................................................................................... 25

3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị ................................................................. 27

3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 29

3.5. Độ đúng .................................................................................................... 29

3.6. Độ chính xác............................................................................................. 30

3.6.1. Độ lặp lại ............................................................................................... 30

3.6.2. Độ chính xác trung gian ........................................................................ 30

3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén .................................. 32

3.8. Bàn luận .................................................................................................... 32

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN ........................................................................... 35

4.1. Kết luận .................................................................................................... 35

4.2. Kiến nghị……………………………………………………………….35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Số trang

Bảng 1 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI 10

Bảng 2 Chương trình pha động gradient 11

Bảng 3 Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỉ

lệ pha động khảo sát

21

Bảng 4 Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi

thêm 7,5% AcOH trong pha động

22

Bảng 5 Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu

phân tích và mẫu chuẩn

26

Bảng 6 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan

giữa nồng độ lý thuyết và diện tích pic của

flurbiprofen

27

Bảng 7 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương

pháp

29

Bảng 8 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 30

Bảng 9 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của

phương pháp

31

Bảng 10 So sánh kết quả độ chính xác của các phương

pháp định lượng

32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Số trang

Hình 1 Công thức cấu tạo của flurbiprofen 3

Hình 2 Minh hoạ các thông số sắc ký 6

Hình 3 Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng 20

Hình 4 Hiện tượng kéo đuôi pic trên sắc ký đồ 21

Hình 5 Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá 23

Hình 6 Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid 24

Hình 7 Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời

gian xuất hiện các pic

25

Hình 8 Đổ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ

chất phân tích và diện tích pic

28

1

MỞ ĐẦU

Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống

viêm không steroid (NSAID) với tác dụng giảm đau, hạ sốt. Thuốc nhỏ mắt

flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn

ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ. Flurbiprofen được sử dụng bằng

đường uống để điều trị tấn công trong các bệnh viêm gan cấp tính, viêm

xương khớp cấp tính, đau thắt lưng. Viên nén và gel dùng ngoài chứa

flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp dạng thấp,

viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp [7,11,17,26,29].

Flurbiprofen hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là

các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác nhau như

Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên các thuốc này lại

chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có

chuyên luận về Flurbiprofen.

Phát triển các nghiên cứu về Flurbiprofen là một hướng mới tại Việt

Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị.

Một điểm đáng chú ý là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ

thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là

hướng nghiên cứu được quan tâm trên thế giới [4,12,16,24].

Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn quốc tế

là cơ sở ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm

đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu

tương đương sinh học và dược động học của chúng.

Trên thế giới, một số phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất

chuyển hóa trong huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và trong dịch nước

mắt. Một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được công bố bao gồm

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép đầu dò UV (DAD), đầu dò huỳnh

quang hoặc đầu dò khối phổ (MS). USP 35 và EP 2010 quy định sử dụng

phương pháp HPLC để phân tích flurbiprofen trong nguyên liệu dùng làm

thuốc và trong các dạng thuốc như viên nén, thuốc nhỏ mắt và cao dán

[20,22]

2

Mục tiêu của đề tài này nhằm tiến hành xây dựng và thẩm định quy

trình định lượng flurbiprofen trong dược phẩm bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD theo hướng dẫn của Cơ quan quản

lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency- EMA) [9] và Hội nghị quốc

tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người

(International conference on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human use) [21].

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen

1.1.1. Cấu trúc, tính chất

Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2-(3-flouro-4-

phenylphenyl)propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid

phenylalkanoic, có công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử

244,26 g/mol [27]. Cấu trúc phân tử flurbiprofen được mô tả trong hình 1.

Flurbiprofen có các mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04

[28], mã Pubchem là 3394 [27] và mã Drugbank là DB00712 [29].

Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen

Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học

(+) S và (-) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống

nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [6].

Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như

trắng và nóng chảy ở 110 – 111oC. Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22

oC

là 8 mg/L (22oC) ,các chỉ số LogP và logS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [27,29].

4

1.1.2. Tác dụng dược lý

Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và

cảm nhận đau. Enzym cyclooxygenase (COX) có vai trò xúc tác cho quá

trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit

arachidonic. Flurbiprofen có tác dụng chất ức chế cyclooxygenase (COX)

không chọn lọc và ức chế sự hoạt động của cả hai COX-1 và COX-2. Từ đó,

flurbiprofen ngăn cản việc chuyển hoá axit arachidonic thành PGG2, PGH2 là

nguyên liệu trong quá trình tổng hợp các prostaglandin. Từ đó, làm giảm nồng

độ prostaglandin và cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt. Flurbiprofen

cũng là một trong những NSAIDs mạnh nhất về hoạt động ức chế

prostaglandin.

Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp

của hai đồng phân quang học (+) S và (-) R. Đồng phân S-enantiomer thể hiện

hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt

tính giảm đau.

Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài

đối với bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính

khớp. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như

đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch,

viêm gân, chấn thương mô mềm). Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật

nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ. [7,11,16,26,29]

1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen

1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ

Theo dược điển châu Âu (EP) 2010 [20] và dược điển Hoa Kỳ (USP)

35 [22], phương pháp định lượng dựa vào phản ứng acid - base của gốc acid

trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan

0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1

M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng

bền hơn 30 giây [22]. Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương

pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [20]. 1 ml dung dịch NaOH

0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.

5

Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ

chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và

người phân tích.

1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử

Trong nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã

giới thiệu hai phương pháp định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang

phổ phân tử. Phương pháp được hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH

và EMA [5].

Quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ

quang đã được thẩm định. Trong đó, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV-

Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet

1 cm, tốc độ quét 600 nm/phút, dải quét 190 - 320 nm, độ rộng khe 2 nm.

Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product and Service Solutions

(SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết

lập trong khoảng nồng độ 1-14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn

định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml.

Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng

máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU

RF-5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm,

λex= 248 nm, λem= 308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product and Service

Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính

được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn

3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml.

Các phương pháp này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, độ chính

xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất

nhỏ. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi

các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh

khiết của mẫu.

6

1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của

pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân

tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự

phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền

với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,5,13,18].

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

- Thời gian lưu

tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào

hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.

t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống

sắc ký

tR’(Thời gian lưu thực): tR

’= tR – t0

W: là chiều rộng đáy pic.

W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

Hình 2. Minh hoạ các thông số sắc ký

- Hệ số dung lượng k

7

Trong đó:

Vs : thể tích pha tĩnh

Vm: thể tích pha động

Qs: lượng chất trong pha tĩnh

Qm: lượng chất trong pha động

Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu:

1 < k’< 8.

- Hệ số chọn lọc

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1

Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0

- Hệ số bất đối xứng As

Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.

Trong đó:

W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường

cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2.

Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối.

- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

8

Trong đó

W: Chiều rộng đo ở đáy pic,

W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

- Độ phân giải Rs

Trong đó:

tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).

WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic.

W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn

vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.

Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng

Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [3,5,13,18]

- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong

đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện.

Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc

chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu

thử

- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những

lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều

kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội.Từ những dữ kiện về: diện tích

(hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu

thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong

mẫu thử một cách chính xác.

- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của

các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến

hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu

9

thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng

của diện tích hoặc chiều cao pic.

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất

trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic

của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.

Định lượng bằng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao ghép đầu dò DAD

Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ

thống HPLC - DAD [20]. Trong đó, dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp

acetonitril : nước 45:55. Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung

môi trên để được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silicagel kích thước 5 µm

trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic :

acetonitrile : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là

10 µl. Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu

dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm.

Phương pháp có những ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy tốt tách

được các thành phần riêng biệt ra khỏi mẫu và có thể áp dụng được cho

những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Nhược điểm của phương pháp là

phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc

hiện đại.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ

Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen

và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng

hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC - MS/MS).

[8,14,15,18]

Ví dụ như nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng

phương pháp LC-MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin,

Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng

Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [8]. Trong đó hệ thống sắc ký lỏng

Shimadzu UFLC LC-30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối

phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ

10

thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy

nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 1.

Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

Thông số Giá trị

Áp suất khí phun 30 psi

Thế phun điện tử -4,5 kV

Nhiệt độ mao quản 400 oC

Nguồn ion 40 psi

Detector với các thông số năng lượng va chạm (CE) = - 12 V, thế phân

nhóm (DP) = - 26 V, Thế đầu vào (EP) = - 8 V, Năng lượng (CXP) = - 8 V.

Ion có dạng 242,9 → 198,7.

Pha tĩnh: cột silicagel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với

một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex.

Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 2.

Bảng 2. Chương trình pha động gradient

Thời gian (phút) Tốc độ dòng

(ml/phút)

Kênh A

(Acid formic :

Nước 99,9 : 0,1)

Kênh B

(Acetonitril :

Acid formic

99,9 : 0,1)

0,1 0,4 60 40

0,6 0,4 15 85

1 0,4 5 95

2 0,4 5 95

2,5 0,4 60 40

Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl.

Phương pháp đã xác định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml.

Độ chính xác đạt 2,2 - 3,4%.

Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do tính

phân mảnh riêng biệt của các ion, thời phân tích nhanh, có thể định lượng các

chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao. Nhược điểm của

11

phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi,

phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền.

1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí

Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal, and Emrah Alkan (2015), các tác

giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký

khí ghép đầu dò khối phổ [25]. Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ

thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống

tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation

(Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Cột HP-5 MS có độ dày 0,25 μm (30

m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách. Tiêm mẫu không chia dòng, khí

mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút. Nhiệt độ đầu phun và máy dò là

250°C. Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ

dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV. Miền giá trị được xây dựng

trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml. Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt

99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml.

Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,

độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích

tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao tính phân mảnh

riêng biệt của các ion. Phương pháp có nhược điểm là giá thành cao, không áp

dụng được cho những chất không bền nhiệt và chất dễ khó hơi.

1.3. Thẩm định quy trình phân tích

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương

pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của

ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11

năm 2005 [21], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần

thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và

miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc

phải có trong quy trình thẩm định.

1.3.1. Tính đặc hiệu

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:

12

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có

ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng

thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn. [1,2,9,21]

Phương pháp xác định

Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng

chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp

chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai

thành phần trở lên.

Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo

ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm

phân huỷ.

1.3.2. Miền giá trị

Khái niệm

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và

nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ

nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính

chất tuyến tính của phương pháp [1,2,9,21].

Phương pháp xác định

- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.

- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến

tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.

Yêu cầu

Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của

miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,9,21].

1.3.3. Tính tuyến tính

Khái niệm

Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả

13

của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của

đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với

hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,9,21].

Phương pháp xác định

- Khảo sát ở ít nhất 5 [21] hoặc 6 [9] mức nồng độ khác nhau.

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của

phương pháp.

- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.

- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc

nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra

tính thích hợp của phương trình.

Yêu cầu

Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2

≤ 1 [1, 2].

1.3.4. Giới hạn phát hiện

Khái niệm

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của

chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác

định chính xác hàm lượng [1,2,9,21].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng

cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ

nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện.

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương

pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu

thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng

độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3.

14

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.

SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc

dựa vào đường chuẩn định lượng.

1.3.5. Giới hạn định lượng

Khái niệm

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ

chính xác phù hợp [1,2,9,21].

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính

xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng

biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy

trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp

nhận.

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương

pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu

thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là

nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.

SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc

15

dựa vào đường cong chuẩn độ

1.3.6. Độ đúng

Khái niệm

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá

trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với

một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định

[1,2,8,20].

Phương pháp xác định

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần

mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3

lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo

công thức sau:

ỷ ệ ụ ồ

Trong đó: là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.

Yêu cầu

Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý

mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi

thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần

giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.

1.3.7. Độ chính xác

Khái niệm

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử

riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất

cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,9,21].

16

Phương pháp xác định

Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá

trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định

lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.

Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân

tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống

máy thay đổi.

Yêu cầu

Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu

phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên

dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở

giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD

càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2].

17

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị

2.1.1. Dung môi, hoá chất

Flurbiprofen, natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid

từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn

HPLC.

Nước được tinh chế bằng máy Thermo Scientific GenPure UV-TOC

đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m.

Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Anadys 100mg

Theramex, Pháp số lô 2M653 05 2015.

2.1.2. Trang thiết bị

Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo

Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự

động.

Đầu dò DAD Diode Array Detector Model: DAD - 3000 Dionex sử

dụng đèn Deuterium (D2) cho khoảng UV và tungsten (W) cho khoảng VIS,

khoảng bước sóng đo được 190 - 800 nm.

Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150

mm và cột C18 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150 mm.

Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang

bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân

phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo

Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày,..

18

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để nghiên cứu định lượng

flurbiprofen trong mẫu thử, thực hiện khảo sát các điều kiện phân tích như

sau.

- Cột sắc ký: tiến hành khảo sát trên các cột C18 và C8.

- Pha động: tiến hành sắc ký ở chế độ gradient và isocratic với các tỷ lệ

ACN, nước và acid acetic băng để lựa chọn pha động thích hợp.

- Detector: sử dụng đầu dò DAD quét phổ trong dải sóng 190 - 800 nm để

tìm bước sóng hấp thụ cực đại.

- Thể tích tiêm mẫu: khảo sát các thể thích tiêm là 5, 10, 15, 20 µl để lựa

chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.

2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích

Tính đặc hiệu

Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý

với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm

làm phân huỷ mẫu và xác định xem flurbiprofen có tách hoàn toàn ra khỏi sản

phẩm phân huỷ hay không.

Tính tuyến tính và miền giá trị

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 6 nồng độ là 20, 16, 12, 8, 4, 2

µg/ml.

Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy giữa

nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác định giá trị R2

Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định bằng phương pháp pha loãng

mẫu. LOD là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 2 - 3 lần đường nền ở tất cả 3

lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.

19

Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) được xác định bằng phương pháp pha

loãng mẫu. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền đường

nền ở tất cả 3 lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.

Độ đúng

Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ

trong khoảng tuyến tính đã phân tích.

Độ chính xác

Độ lặp lại: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần

trong cùng một ngày.

Độ chính xác trung gian: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml,

mỗi mẫu 3 lần. Thực hiện phân tích trong ba ngày khác nhau.

Xác định giá trị RSD của các lần đo.

Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.

2.2.3. Ứng dụng

Áp dụng phương pháp đã thẩm định trên để định lượng flurbiprofen

trong viên nén viên nén Anadys 100 mg Theramex, Pháp.

Chuẩn bị mẫu dược phẩm để định lượng lấy viên nén flurbiprofen trong

vỉ, cạo lớp bao film và nghiền mịn trong cối sứ. Cân lượng bột thuốc tương

ứng với 5 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 5 ml, thêm acetonitril đến

vạch, siêu âm khoảng 15 phút và lọc qua giấy lọc giấy lọc Whatman 40. Pha

loãng dung dịch trên 100 lần trong pha động sắc ký, thu được dung dịch có

nồng độ khoảng 10 μg/ml, lọc qua màng lọc màng lọc ptfe 0,2 μm. Tiến hành

sắc ký như điều kiện đã chọn.

20

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký được thực hiện với dung dịch

flurbiprofen có nồng độ 20 μg/ml. Tốc độ dòng là 1 ml/phút. Sử dụng đầu dò

DAD để quét phổ trong dải bước sóng 190 - 800 nm, kết quả cho thấy mẫu có

độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 247 nm.

Hình 3. Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng

Tiến hành sắc ký với cột silicagel C18 ở chế độ gradient với pha động

nước : acetonitril thay đổi từ 90 : 10 đến 10 : 90, trên sắc ký đồ xuất hiện pic

chính ở thời gian lưu tương ứng với tỷ lệ nước : acetonitril là 20 : 80; 25 : 75;

30 : 70, 35 : 65; 40 : 60.

247nm

21

Tiếp tục sắc ký ở chế độ isocratic với pha động nước : acetonitril lần

lượt là các tỷ lệ 20 : 80; 25 : 75; 30 : 70, 35 : 65; 40 : 60. Thời gian lưu và hệ

số bất đối As của mỗi tỉ lệ nước : acetonitril được ghi trong bảng 3.

Bảng 3. Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỷ lệ pha động khảo sát.

Tỷ lệ nước : acetonitril Thời gian lưu (phút) As

20 : 80 2,65 2,02

25 : 75 2,97 0,85

30 : 70 3,45 0,81

35 : 65 4,03 0,80

40 : 60 5,13 0,69

Các pic hình thành có hiện tương kéo đuôi. Trong các trường hợp đã

khảo sát, ở tỷ lệ nước : acetonitril 35 : 65 cho pic có chiều cao và diện tích lớn

nhất.

Hình 4. Hiện tượng kéo đuôi của pic trên sắc ký đồ

Hiện tượng kéo đuôi của pic có thể là do flurbiprofen trong mẫu tồn tại

cả dạng ion hoá flurbiprofen. Sử dụng hệ dung môi nước : acetonitril 35 : 65,

thêm acid acetic băng vào pha nước để đạt nồng độ 7,5% nhằm chuyển hoàn

22

toàn lượng flurbiprofen ion hoá về dạng không ion hoá. Kết quả cho thấy hiện

tượng kéo đuôi được cải thiện nhưng không hoàn toàn biến mất, cả chiều cao,

diện tích pic đều tăng, thời gian lưu giảm từ 3,92 phút xuống còn 3,68 phút.

Kết quả được thể hiện trong bảng 4.

Bảng 4. Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi thêm 7,5% AcOH trong

pha động

%CAcOH

Thời gian

lưu (phút)

Diện tích pic

(mAU.min)

Chiều cao pic

(mAU) As

0 3,92 13,26 161,944 1,16

7,5 3,683 14,667 188,982 1,13

Hiện tượng kéo đuôi vẫn còn có thể là do thể tích tiêm mẫu quá lớn nên

chưa phù hợp. Giảm thể tích tiêm mẫu từ 20, 15, 10 và 5 µl. Kết quả cho thấy,

ở thể tích tiêm mẫu 10 µl, pic cân xứng hơn và tỉ lệ diện tích pic/nồng độ

cũng như tỷ lệ chiều cao/nồng độ cao nhất.

Hiện tượng kéo đuôi chưa mất hẳn có thể là do pha tĩnh chưa phù hợp.

Tiến hành sắc ký với cột C8 thay cột C18 ở các điều kiện đã khảo sát được:

pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm

mẫu 10 µl, pic flurbiprofen gần như không còn hiện tượng kéo đuôi

(As=1,08), mẫu có thời gian lưu 3,73 phút. Thời gian sắc ký được điều chỉnh

thành 8 phút (bằng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen).

Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu là pha tĩnh cột silicagel

C8, pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích

tiêm mẫu 10 µl, thời gian tiêm 8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, dectector ghi tại

bước sóng 247 nm. Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 5.

23

Hình 5. Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá

3.2 . Tính đặc hiệu

3.2.1. Khả năng phân tách

Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý

với các yếu tố khác nhau acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm

phân huỷ mẫu. Điều kiện cụ thể như sau:

Acid và base

Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml

dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml NaOH 5 M vào ống, đun nóng ở nhiệt độ

khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi trung hoà hỗn

hợp bằng lượng acid hoặc base tương ứng.

Oxi hoá

Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml

dung dịch H2O2 6% và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.

Nhiệt độ

Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml

dung dịch pha động và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.

24

Ánh sáng

Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm, cho tiếp xúc với

ánh nắng mặt trời trong 5 giờ.

Sau khi xử lý, các mẫu trên được pha loãng đến nồng độ khoảng 20

µg/ml trong pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Tiến hành sắc ký rồi xác định

xem trong điều kiện phân tích flurbiprofen có tác được hoàn toàn khỏi các sản

phẩm phân huỷ hay không.

Kết quả cho thấy flurbiprofen chỉ bị phân huỷ khi xử lý với hydrogen

peroxide. Trên sắc ký đồ xuất hiện pic mới có thời gian lưu 1,68 phút, tách ra

hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen.

Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic (peak purity) cho thấy

pic flurbiprofen tinh khiết với độ tương xứng đạt hơn 999.

Hình 6. Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid

25

t = 1,68 phút

t = 3,69 phút

Hình 7. Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời gian lưu của các pic

3.2.2. Thời gian lưu

Phân tích thống kê thời gian lưu của pic flurbiprofen trong các mẫu

phân huỷ và thời gian lưu của flurbiprofen trong mẫu chuẩn. Thời gian lưu

26

của flurbiprofen trong 3,73 phút. Các giá trị thời gian lưu của pic trong sắc

ký đồ mẫu phân tích và mẫu chuẩn được liệt kê trong bảng 5.

Bảng 5. Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu phân tích và

mẫu chuẩn

Yếu tố tác động Thời gian lưu trong

mẫu thử (phút)

Thời gian lưu trong

mẫu chuẩn (phút)

Acid

3,59 3,71

3,60 3,65

3,68 3,66

Base

3,61 3,67

3,62 3,67

3,69 3,67

Oxy hoá

3,63 3,68

3,63 3,69

3,69 3,69

Nhiệt độ

3,64 3,70

3,64 3,69

4,00 3,66

Ánh sáng

3,65 3,66

3,65 3,67

3,70 3,67

27

Qua trắc nghiệm thống kê cho thấy có thời gian lưu của pic ở các mẫu

thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc

ký đồ mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048).

Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao.

3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị

Chuẩn bị 6 mẫu có nồng độ lần lượt là 20, 16, 12, 8, 4, 2 µg/ml bằng

cách pha loãng từ dung dịch mẹ có nồng độ 1000 µg/ml.

Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần với điều kiện đã chọn. Kết quả được

trình bày trong bảng 6 và hình 8.

Bảng 6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ lý thuyết và

diện tích pic của flurbiprofen

STT Nồng độ lý thuyết (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min)

1 20 13,76

2 16 10,68

3 12 8,24

4 8 5,53

5 4 2,73

6 2 1,38

Khoảng định lượng 2-20 µg/ml

Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,08853

R2 0,9993

28

Hình 8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ chất phân tích

và diện tích pic

Từ phân tích thống kê thu được phương trình y = 0,68x + 0,022

Trong đó, y (mAU.min) là diện tích pic, x (µg/ml) là nồng độ mẫu phân

tích.

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là có tính

tương thích (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13).

Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 76,86

> t0,05 = 2,132), hệ số b không có ý nghĩa về mặt thống kê nên bị loại (t = 0,85

< t0,05 = 2,132).

Hệ số R2 > 0,99 đạt yêu cầu.

Vậy phương trình hồi quy có dạng y = 0,68x.

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát

2 - 20 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ flurbiprofen và diện

tích pic. Hệ số tương quan là R2

= 0,999. Mức độ tương quan tốt, độ tuyến

tính chặt chẽ. Độ lệch của các giá trị thực nghiêm với giá trị hồi quy rất gần

với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.

y = 0.6804x + 0.0221 R² = 0.9993

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.min

)

Nồng độ mẫu phân tích (µg/ml)

29

3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen đến

khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt khoảng

2-3. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện

(LOD) của phương pháp ứng với từng chất.

Giới hạn định lượng: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen

đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt

khoảng 10. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát

hiện (LOQ) của phương pháp ứng với từng chất.

Kết quả phân tích cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp

LOD = 0,05 µg/ml và giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0,15

µg/ml.

3.5. Độ đúng

Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ

trong khoảng tuyến tính đã phân tích.

Bảng 7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp.

STT Nồng độ lý thuyết

(µg/ml)

Nồng độ thực

nghiệm (µg/ml)

Tỷ lệ phục hồi

(%)

1 20,00 20,22 101,12

2 16,00 15,70 98,10

3 12,00 12,11 100,92

4 8,00 8,13 101,59

5 4,00 4,01 100,31

6 2,00 2,03 101,41

30

Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng với các giá trị của độ phục hồi

đều nằm trong khoảng 100±2%.

3.6. Độ chính xác

3.6.1. Độ lặp lại

- Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong

pha động.

- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.

Bảng 8. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp

Nồng độ lý

thuyết

(µg/ml)

Diện tích pic

(mAU.min)

Diện tích pic

trung bình

(mAU.min)

SD RSD

(%)

20,00

13,78

14,00

0,22 1,57 14,22

13,99

8,00

5,55

5,53

0,03

0,46 5,53

5,50

2,00

1,34

1,38

3,93 2,34 1,40

1,39

Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ

lặp lại đều nhỏ hơn 2,34%.

3.6.2. Độ chính xác trung gian

- Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong

dung dịch pha động.

31

- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.

- Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau.

Bảng 9. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp

Nồng độ lý

thuyết

(µg/ml)

Ngày

Diện tích

pic

(mAU.min)

Diện tích

pic trung

bình

(mAU.min)

SD RSD

(%)

20,00

1 14,00

13,89 0,15 1,06 2 13,72

3 13,94

8,00

1 5,53

5,55 0,10 1,73 2 5,46

3 5,65

2,00

1 1,38

1,35 0,02 1,71 2 1,34

3 1,34

Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ chính xác

trung gian đều nhỏ hơn 1,73%.

Nhận xét: So sánh giá trị RSD của phương pháp được xây dựng với

một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được báo cáo.

32

Bảng 10. So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp định lượng

Tên phương pháp RSD (%) của độ lặp lại RSD (%) của độ chính

xác trung gian

Đo độ hấp thu quang [5] ≤ 3,10 ≤ 3,20

Đo độ phát xạ huỷnh

quang [5] ≤ 2,05 ≤ 3,80

LC-MS/MS [8] ≤ 2,20 ≤ 3,40

GC-MS [25] ≤ 2,65 ≤ 3,64

Phương pháp xây dựng ≤ 2,34 ≤ 1,73

RSD của độ lặp có giá trị trong khoảng trung gian so với phương pháp

trên. RSD độ lặp lại của phương pháp xây dựng nhỏ hơn kết quả trong nghiên

cứu sử dụng phương pháp đo độ hấp thu quang và GC-MS. RSD độ chính xác

trung gian của phương pháp xây dựng đạt được thấp hơn giá trị trong cả bốn

nghiên cứu đã được giới thiệu. Từ đó khẳng định phương pháp có độ chính

xác cao.

3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén

Áp dụng phương pháp được xây dựng thẩm định để định lượng

flurbiprofen có trong viên nén Anadys 100mg Theramex, Pháp. Theo USP 35,

hàm lượng flurbiprofen phải đạt từ 90 - 110%. [22]

Kết quả thu được diện tích pic trung bình là 5,96 mAU.min. Nồng độ

dung dịch định lượng là 9,31 µg/ml. Như vậy, hàm lương flurbiprofen trong

viên nén là

bằng 93,10% hàm lượng lí thuyết, đạt

tiêu chuẩn của USP 35.

3.8. Bàn luận

Hiện nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đang được ứng dụng

dụng rộng rãi trong các quy trình định tính, thử độ tinh khiết và định lượng

các chất. HPLC có các ưu điểm là độ chính xác cao, ổn định, dễ thực hiện,

nhạy với các nồng độ nhỏ. Phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ

thống HPLC - DAD có những ưu điểm nổi bật của cả phương pháp HPLC và

33

phương pháp đo độ hấp thụ UV-Vis đem lại: có khả năng tách các chất ra

hoàn toàn nên tính đặc hiệu cao, có khả năng kiểm tra độ tinh khiết của mẫu,

độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ. Bên cạnh đó, phương pháp

cũng có một số nhược điểm như hệ dung môi đắt tiền, cần một hệ thống máy

móc hiện đại.

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thì một số đại lượng sau cần lưu ý.

Thời gian lưu tR là thời gian tính từ khi chất được tiêm vào hệ thống sắc ký

đến khi phát hiện ở nồng độ cực đại. Thông thường thời gian sắc ký thường

gấp đôi thời gian lưu. Hệ số dung lượng k’ cần nằm trong khoảng tối ưu

1< k’ < 8 căn cứ vào pha tĩnh, pha động,…Hệ số As cho biết mức độ cân đối

của pic và thường nằm trong khoảng 0,9 - 2,5 pic càng cân đối thì hiệu lực

tách của cột càng tốt.

Phương pháp sử dụng cột sắc ký pha đảo. Pha động sử dụng dung môi

có độ phân cực cao là hỗn hợp acetonitril, acid acetic và nước. Flurbiprofen

tan trong acetonirtil tốt hơn với nước nên khi tăng tỷ lệ acetonitril thì thời

gian lưu của flurbiprofen cũng giảm dần. Khi tỷ lệ nước : acetonitril là

35 : 65, diện tích pic và chiều cao pic được tối ưu hoá. Acid acetic được thêm

có tác dụng chuyển flurbiprofen dạng ion hoá về dạng không bị ion hoá nhằm

giảm hiện tượng kéo đuôi ở pic. Về thành phần cấu tạo, silicagel C8 có độ

phân cực cao hơn silicagel C18. Khi độ phân cực pha tĩnh tăng thì tương tác

với chất phân tích sẽ lớn hơn. Vì vậy, khi thay cột C18 bằng cột C8, thời gian

lưu của flurbiprofen tăng từ 3,14 – 3,73 phút.

Các thể tích tiêm mẫu đã khảo sát là 20, 15, 10 và 5 μl. Kết quả cho

thấy ở nhưng thể tích như 15 và 20 μl, pic có hiện tượng kéo đuôi có thể là do

thể tích tiêm quá lớn nên lượng flurbiprofen đi qua đầu dò không ổn định theo

thời gian. Ở thể tích tiêm 5 μl, chiều cao và diện tích pic nhỏ nên sai số ở

những nồng độ thấp sẽ cao và LOD, LOQ của phương pháp sẽ thấp. Kết quả

cho thấy, tại thể tích tiêm mẫu 10 μl, hệ số bất đối, diện tích pic và chiều cao

pic là tối ưu nhất.

Lựa chọn cài đặt đầu dò DAD tại bước sóng có độ hấp thụ cực đại

247 nm. Tại bước sóng đó, độ hấp thụ có giá trị lớn nhất, đường chuẩn định

lượng có độ dốc a cao sẽ làm cho phương pháp độ chính xác cao hơn.

34

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy trong điều kiện khảo sát,

flurbiprofen khá bền trong acid, base, nhiệt độ và ánh sáng nhưng dễ bị phân

huỷ bởi tác nhân oxi hoá. Vì vậy trong bảo quản cần tránh để flurbiprofen tiếp

xúc với các tác nhân oxi hoá làm giảm chất lượng thuốc.

35

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN

4.1. Kết luận

Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH và

EMA, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định

lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC - DAD với các thông số: pha tĩnh là

silicagel C8 trong cột 5 μm, 4,6×150 mm, pha động acetonitril : nước : acid

acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm mẫu là 10 µl, thời gian sắc ký là

8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò DAD tại bước sóng 247 nm.

Bằng các quá trình thực nghiệm đã chứng tỏ được quy trình định lượng

flurbiprofen đạt các yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ

chính xác theo hướng dẫn chung của ICH và EMA. Kết quả cho thấy phương

pháp có đặc hiệu với flubiprofen. Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa

đáp ứng phân tích và nồng độ flurbiprofen trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml

với hệ số tương quan R2

= 0,999. Phương pháp có độ đúng tốt (100±2%), độ

lặp lại đảm bảo (RSD ≤ 2,34%). Phương pháp đã được ứng dụng để định

lượng một dược phẩm chứa flurbiprofen dạng viên nén.

4.2. Kiến nghị

Ứng dụng phương pháp để định lượng flurbiprofen trong các dạng bào

chế khác như thuốc nhỏ mắt, viên nang, cao dán. Phương pháp cũng là cơ sở

cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm đau, chống viêm

chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu tương đương sinh

học và dược động học của chúng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

[1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học),

Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184.

[2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương

pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ

thuật,pp.10-59.

[3] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB

Y học, pp.68-84.

Tiếng anh

[4] Bhaskar, Kesavan, et al (2009), “Lipid nanoparticles for transdermal

delivery of flurbiprofen: formulation, in vitro, ex vivo and in vivo

studies”, Lipids in health and disease, 8(1), 6.

[5] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and

Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the

Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal

of Pharmaceutical Analysis, 4(4).

[6] Brittain, H. G. (Ed.) (2013), Profiles of drug substances, excipients and

related methodology (Vol. 38), Academic Press, pp.115-154.

[7] Calapai, G., et al (2013), "Fatal hypersensitivity reaction to an oral spray

of flurbiprofen: a case report" Journal of clinical pharmacy and

therapeutics, 38(4), 337-338.

[8] Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem

mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma

and its application in a study of bioequivalence", Journal of

Chromatography B, 993-994, pp.69-74.

[9] European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method

validation, pp.9-10.

[10] FDA (2013), “Guidance for industry: bioanalytical method validation”

,US Food and Drug Administration, pp.4-9.

[11] Geerts H: Drug evaluation (2007), “(R)-flurbiprofen-an enantiomer of

flurbiprofen for the treatment of Alzheimer's disease”, Idrugs,10(2),

pp.121-33.

[12] Gonzalez-Mira, E., et al (2010), “Optimizing flurbiprofen-loaded NLC

by central composite factorial design for ocular

delivery”, Nanotechnology, 22(4), 045101.

[13] Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of

topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9),pp. 654-663.

[14] Lee, Hye-In, et al (2014), "Simultaneous determination of flurbiprofen

and its hydroxy metabolite in human plasma by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry for clinical application", Journal of

chromatography B, 971, pp. 58-63.

[15] Mano N, Narui T, Nikaido A, Goto J (2002), “Separation and

determination of diastereomeric flurbiprofen acyl glucuronides in human

urine by LC/ESI-MS with a simple column-switching technique”, Drug

Metabol Pharmacokin, 17, pp.142-149.

[16] Meister, Sabrina, et al (2013), “Nanoparticulate flurbiprofen reduces

amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain barrier model”,

Alzheimer's research & therapy, 5(6), 51.

[17] Mironov, Gleb G., et al (2012), “Comparative study of three methods for

affinity measurements: capillary electrophoresis coupled with UV

detection and mass spectrometry, and direct infusion mass spectrometry”,

J Am Soc Mass Spectrom, 23(7), pp.1232-40.

[18] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass

spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied

Chemistry, 85(7),1515-1609.

[19] Pradhan PK, Rajput PN (2014), “Simultaneous Estimation of

Flurbiprofen and Gatifloxacin by Dual Wavelength UV Spectroscopy

Method in an Eye Drops”, International Journal of Pharmaceutical

Sciences Review and Research, 27(2),pp.96-99.

[20] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia

Europaea 7th Edition vol 2, pp.2056-2057.

[21] The International Council for Harmonisation of Technical Requirements

for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical

procedures: text and methodology Q2(R1), pp.6-13.

[22] United States Pharmacopoeial Convention (2010), United States

Pharmacopoeia 35th Edition, pp.3258.

[23] Vega, E.., et al (2006), “Flurbiprofen loaded biodegradable nanoparticles

for ophtalmic administration”, Journal of pharmaceutical

sciences, 95(11), 2393-2405.

[24] Wang, G. J., et al. (2003), "European journal of drug metabolism and

pharmacokinetics", Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 28(4), pp.265-272.

[25] Yilmaz, Bilal, Emrah Alkan (2015), "Determination of flurbiprofen in

pharmaceutical preparations by GC–MS", Arabian Journal of

Chemistry.

[26] Zhou, S-F., et al (2009),”Substrates, inducers, inhibitors and

structure-activity relationships of human Cytochrome P4502C9 and

implications in drug development”, Curr Med Chem, 16(27), pp.3480-

675.

Trang web

[27] Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

[28] WHO http://www.whocc.no

[29] Drugbank http://www.drugbank.ca