Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA...
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WesternWestern--Analyse Analyse ProteinProtein--Elektrophorese Elektrophorese
ELISA ELISA ProteinProtein--ChipChip
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DNADNA--RNARNA--ProteinProtein
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Die Struktur der DNADie Struktur der DNA
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Ebene der Proteinstruktur Ebene der Proteinstruktur
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DieDieGruppenGruppen
derderAminoAmino--ssääurenuren
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Darstellung RDarstellung Rääumliche umliche Proteinstrukturen (RProteinstrukturen (Rööntgenntgen--
Krystallographie)Krystallographie)
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• Lyse der Zellen/Gewebe(Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen)(Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen)•• Aufreinigung Aufreinigung (Zentrifugierung, Chromatographie)(Zentrifugierung, Chromatographie)•• Probevorbereitung Probevorbereitung ••(H(Häängt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativngt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativ--denaturierend; denaturierend; EnzymaktivitEnzymaktivitäät; Proteomik: 2t; Proteomik: 2--DD--Elektrophorese) Elektrophorese)
Proteinisolierung und AufreinigungProteinisolierung und Aufreinigung
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AntigenAntigen--AntikAntiköörperrper
Antigen: Fremdes Material, welches Wirbeltiere erkennen und dagegen die B-Zellen des Immunsystems hochspezifische Antikörper bilden. „Stärke” der Antigene: Proteine> Polysaccharide > Lipide > Nukleinsaure.
Antikörper: Proteine, die aus schwere- und leichte Ketten bestehen. Antikörper bilden spezifische Bindung mit dem Antigen. Nach der Immunisierung kann man sie aus dem gamma-Globulin-Fraktion des Blutserum isolieren.
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Antikörper-Klassen
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Kinetik der AntikKinetik der Antiköörperbildungrperbildung
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Erzeugung monoklonaler Antikörper
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Die auf AntigenDie auf Antigen--AntikAntiköörperrper--Bindung Bindung gegrgegrüündeten Verfahrenndeten Verfahren
Direktes VerfahrenPrimärer Antikörper trägt ein konjugiertes Protein, welches Detektierung ermöglicht
Indirektes VerfahrenDer sekundäre Antikörper erkennt die schwere Kette des primären Antikörpers und trägt konjugierten Teil (Enzym, fluoreszierende Verbindung) für Detektierung
Affinität-Verfahren („sandwich”)Kovalent-Bindung des primaren Antikörpers an Träger Chromatographie der Antigen-Lösung – BindungElution des Antigens/Detektierung mit markierten Antikörper
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Detektierung AntigenDetektierung Antigen--AntikAntiköörper rper BindungBindung
Chromogener Substrat,Farbreaktion
Fluorochrom Markierung,Fluoreszenz-Entstehung
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Die WesternDie Western--Analyse Analyse
Während Western-analyse detektieren wira. Die Grösse des Proteins (kD)b. Die Konzentration des Proteins
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PolyPoly--AkrylamidAkrylamid--GelelektrophoreseGelelektrophorese
Vorbereitung der Probe: Denaturierung und Reduzierung mit SDS und -Merkapto-Ethanol, 3-5 Min, 90 oCPolyakrylamid-Gelelektrophorese (Sammler-Gel, Trennung-Gel)Elektrischer Transfer der Proteine auf Nitrozellulose (bindetProteine mit hocher Affinität)A Kontrolle des Transfers (Färbung, Ponceau-red)
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Polymerisierung von AkrylamidPolymerisierung von Akrylamid
Achtung: Toxisch!!!!
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Denaturierung von Proteine mit SDSDenaturierung von Proteine mit SDS
SDS kezelés előtt
SDS kezelés után
Töltéssel rendelkezőrészek
Hidrofób részek
Betain-Struktur,Zwitterion
Einheitlich negativ-geladenes Protein
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Vertikale GelelektrophoreseVertikale Gelelektrophorese
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FFäärbung getrennter Proteinerbung getrennter Proteine
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Farbstoff fFarbstoff füür Fr Fäärbungrbung
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WesternWestern--AnalyseAnalyse
MembranMembran--Blockierung Blockierung
GesGesäättigung unspezifischer Proteinttigung unspezifischer Protein--Bindungsstellen mit Kasein oder BSABindungsstellen mit Kasein oder BSA
Inkubierung mit dem primInkubierung mit dem primäären Antikren Antiköörper rper Erkennung spezifischer Bindungsstellen Erkennung spezifischer Bindungsstellen 3x Waschen3x Waschen
Inkubierung mit dem sekundInkubierung mit dem sekundäären Antikren Antiköörperrperz.B. horsez.B. horse--raddish (Meerretich)raddish (Meerretich)--PeroxidasePeroxidase--Konjugat (HRP)Konjugat (HRP)3x Waschen 3x Waschen
DetektierungDetektierungAlkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz) Alkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz)
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ElektroElektro--TransferTransfer
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ElektroElektro--TransferTransfer
Kontrolle des Protein-Transfers: Ponceau-Färbung
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Ergebnis der WesternErgebnis der Western--AnalyseAnalyse
Ponceau: Färbt alle Proteine; Antikörper
markiert das
Zielprotein
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ECLECL--DetektierungDetektierung
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Substrat fSubstrat füür Alkalische Phosphataser Alkalische Phosphatase
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Bestimmung LymeBestimmung Lyme--Erkrankung mithilfe Erkrankung mithilfe WesternAnalyseWesternAnalyse
Zecke - Borrelia burgdorferi - bakterielle Proteine aus Blutserum
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Beispiel für Lyme-Erkrankung
Proben:1: Molekulargewicht-Marker 2-3: Lyme-positiv-Sera 4-7: Diskriminierungsantikörper8: Positive Kontrolle
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Bestimmung DystrophinBestimmung Dystrophin--ProteinProtein
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ProteinProtein--ChipChip
LigandLigand--ChipChip: Mit spezifischer Antigen: Mit spezifischer Antigen--AntikAntiköörperrper--Bindung; ExpressionsmusterBindung; Expressionsmuster--Bestimmung auf ProteinBestimmung auf Protein--Ebene Ebene
(DNA(DNA--Chip: Hybridisierung)Chip: Hybridisierung) AntikAntiköörperrper--Bindungen auf GlassBindungen auf Glass--OberflOberfläächeche Anwendung: Forschung, DiagnoseAnwendung: Forschung, Diagnose
![Page 31: Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chipweb.med.u-szeged.hu/mdbio/ger/material/2012-2013/II.semester/seminar/... · Antigen-Antikörper Antigen:Fremdes Material,](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022081419/5d4dd92f88c99324658b4855/html5/thumbnails/31.jpg)
ProteinProtein--Chip:Detektierung AntigenChip:Detektierung Antigen--AntikAntiköörper Wechselwirkungenrper Wechselwirkungen
![Page 32: Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chipweb.med.u-szeged.hu/mdbio/ger/material/2012-2013/II.semester/seminar/... · Antigen-Antikörper Antigen:Fremdes Material,](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022081419/5d4dd92f88c99324658b4855/html5/thumbnails/32.jpg)
Muster von HefeproteineMuster von Hefeproteine
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ChipChip--Automatisierung Automatisierung
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ELISAELISA--VerfahrenVerfahren
ELISAELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, EnzymEnzym--gekoppeltesgekoppeltes--ImmunosorbenzImmunosorbenz--Verfahren)Verfahren)
Antigen wird auf festen TrAntigen wird auf festen Trääger (Mikrotiterger (Mikrotiter--Platte) Platte) gebunden gebunden
Reaktion mit Serum der Patienten nach Reaktion mit Serum der Patienten nach VerdVerdüünnungennnungen
Anwendung: Klinische Labordiagnose Anwendung: Klinische Labordiagnose Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw. Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw.
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Die in ELISA angewandten Enzyme Die in ELISA angewandten Enzyme und Substrateund Substrate
Enzyme
Meerettichperoxidase (HRP)Alkalische Phosphatase (AP)
(Konjugiert mit dem AK)
Substratmoleküle
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (HRP)3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (HRP)
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate, BCIP (AP)Indoxyl phosphate (AP)
AP-BCIP-Farbreaktion
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ELISAELISA--ReaktionReaktion
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Quantitative Ergebnisse von ELISA
Positive Kontrolle
Negatíve Kontrolle Patient A
PatientB
Patient C
Test-Kontrolle
1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123
ELISA-Platte
(Mikrotiterplatte)
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Semiquantitative BildanalyseNach der Gelseparation von Proteine und Nukleinsären kann aus der Densität des Bandes (summierung der grauheitsstufen der Bildpunkte) auf dem grauen Gelbild eine quantitative Information gewonnen werden.
Densität auf einem Pixel: Grauheitswert auf einem Pixel.
32 stufiger Durchgang
8 bit (256 Farben) Durchgang
255 Wert = schwarz 0 Wert= weiss
16 bit Graumatrix
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Analyse der farbigen Aufnahmen geschieht aufgrund der Aufteilung auf
RGB Farben
RotRot
GrGrüünn
BlauBlau
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Densitometrische Analyse des Gelbildesa) Profila) Profil b) Flb) Fläächenanalysechenanalyse
Ablauf: Wir stellen das Querschnittprofil des Bandes her, mit der Subtraktion der Grunddensität des Gels kann aus der Flächengrösse unter der Kurve eine quantitative Schlussfolgerung gezogen werden. (Intensität/Pixel)
Wir markieren ein, von dem Band etwas grösseren Gebiet. Wir bestimmen die Densitätsumme der Pixeln mit Grundintensität, welche aus der Summe der Pixeldensitätwerte des aktuellen Bandes subtraktiert wird