VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚBRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ

ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ

FACULTY OF CHEMISTRY

INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

STANOVENÍ STEVIOLGLYKOSIDŮ V NÁPOJÍCH

DETERMINATION OF STEVIOL GLYCOSIDES IN BEVERAGES

DIPLOMOVÁ PRÁCEMASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE Bc. VLADIMÍRA PORUBČANOVÁAUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE RNDr. MILENA VESPALCOVÁ, Ph.D.SUPERVISOR

BRNO 2015

Vysoké učení technické v Brně

Fakulta chemickáPurkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce

Číslo diplomové práce: FCH-DIP0909/2014 Akademický rok: 2014/2015Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií

Student(ka): Bc. Vladimíra PorubčanováStudijní program: Chemie a technologie potravin (N2901)

Studijní obor: Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010)

Vedoucí práce RNDr. Milena Vespalcová, Ph.D.Konzultanti:

Název diplomové práce:Stanovení steviolglykosidů v nápojích

Zadání diplomové práce:Teoretická část:

1) Botanická charakteristika stévie (Stevia rebaudiana B.)

2) Biologicky účinné látky obsažené ve stévii

3) Využití těchto látek v potravinářství

4) Přehled HPLC postupů stanovení sladkých látek stévie

Experimentální část:

1) Vývoj chromatografického systému pro dělení sladkých látek stévie cukerné

2) Ověření vyvinutého separačního systému na reálných vzorcích nápojů obsahujících sladké látky nebo

extrakty ze stévie

3) Diskuse získaných výsledků

Termín odevzdání diplomové práce: 11.5.2015Diplomová práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v

elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Bc. Vladimíra Porubčanová RNDr. Milena Vespalcová, Ph.D. prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

V Brně, dne 30.1.2015 prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D.

Děkan fakulty

3

ABSTRAKT rastliny a ich stano

-glykozidov ( rebaudiozidu A) pomocou HPLC tak, aby b

V popri steviol-glykozidoch

rebaudiozid A rozmermi 150 x 4,6 mm a

N a (pH 4,2) v pomere 29:71 v/v na 0,28 ml min-1 a teplotu 50 -glykozidov a

ABSTRACT This diploma thesis deals with sweet substances from Stevia rebaudiana and with their

determination in beverages. The ambition was to adjust the separation method for major steviol glycosides (stevioside and rebaudioside A) by HPLC so as to be fast and effective enough, too.

In experimental part was successfully developed the separation method, so it is possible to determine the steviol glycosides and conservation substances, specifically benzoic and sorbic acid (eventually their sodium or potassium salts). At first, for analysis was used monolithic

Other analyses were performed on column Ascentis Express C18 (150 x 4.6 mm; 2.7 . The most suitable separation method was performed by mobile phase made up with 29:71 v/v mixture of acetonitrile and acetate buffer (with pH 4.2). The flow rate was 0.28 ml min-1 and the column temperature was kept constant at 50 . The analysis of steviol glycosides and conservation substances with these conditions was verified on the samples of real beverages.

KEYWORDS Stevia rebaudiana, stevioside, rebaudioside A, HPLC

4

. v 5. 66 s Ph.D..

PR a

a.

....................................

RNDr. Milene

vedenie,

5

OBSAH 1 ............................................................................................................................ 6 2 .................................................................................................... 7

2.1 ................................................................................. 7 2.1.1 ....................................................................................... 7 2.1.2 .............................................................................................. 8 2.1.3 ................................................................................ 9

2.2 ................................................................................................ 10 2.2.1 ....................................................................................................... 13 2.2.2 Rebaudiozid A .............................................................................................. 14 2.2.3 -glykozidy ............................................................................... 15 2.2.4 ................................................................. 16

2.3 ............................................................................................ 16 2.4 - ...................................................... 18 2.5 Stanovenie steviol- HPLC ................................................... 19

3 ...................................................................................... 24 3.1 ................................................................................................................ 24

3.1.1 .......................................................................................... 24 3.1.2 ............................................................................................ 24 3.1.3 ....................................................................................... 24 3.1.4 ........................................................... 25 3.1.5 ................................................................................ 26

3.2 .................................................................................................................. 27 3.2.1 ...................................................................................... 27 3.2.2 ...................................................................... 27 3.2.3 ............................................. 28 3.2.4 ............................................................................... 28

3.3 ................................................................................... 29 4 DISKUSIA ......................................................................................... 31

4.1 rebaudiozidu A ................................................................ 31 4.1.1 ....................................................................... 31 4.1.2 ........................................................ 34 4.1.3 ............................................. 39 4.1.4 ............................................................................... 43

4.2 ................................................................................... 45 4.3 ....................................................................... 49

5 ......................................................................................................................... 51 6 OJOV .......................................................................... 52 7 ATIEK ........................................................................ 56 8 ..................................................................................................... 57 9 ..................................................................................................................... 58

6

1 V trpiacich cukrovkou (latinsky

diabetes mellitus) V

, poc z

o rastlinu s sky Stevia rebaudiana Bertoni).

u -glykozidy.

A a steviolbiozid

listoch, preto sa v priemy listov. Okrem sladkej chuti s takmer

tieto extrakty i

[1].

V Japonsku sa e a

i a ako doplnok stravy od roku 2008.

sladidla v novembri roku 2011 [2]

pre stanovenie steviol-glykozidov

7

2

2.1

2.1.1 a latinsky Stevia rebaudiana), je ako

I -, -he- . V

Moise Santiago Bertoni ako Eupatorium rebaudianum. po profesorovi Ovidiovi Rebaudiovi z

Kew rodu Stevia Eupatorium a

rastlina v roku 190 Stevia rebaudiana [3]. z oblasti . Rastie v -600 , na

brehoch riek alebo na [4]. Z v Hokkaido a Okinawa. j firma Maruzen Kasei Cs Japonsko.

000 ton sladidla.

Vietnam. V v USA i v [5].

1 [6]

8

2.1.2 Botanick Rod via rebaudiana a

phlebophylla -glykozidy [7]. Patria astrov latinsky Asteraceae.

. Stonka je bohato -1,8 m. Stonky a

. , 3-8 cm a 2-3,5 cm ( 1). V

- . V korune

dvojklann , kto [5]. s . Plodom

.

40-70 %. 000 semien 0,4 g [8].

pomocou semien , ako

a kosti.

jednej materskej rastliny [9].

2 stliny, 2 list, 3 kvet, 5 plod) [5]

9

2.1.3 Pestovanie s

s hodnotou pH v rozme --

y -0,5 m [8].

obnovia.

pokles tvorby okolitej teploty pod 9

V v

[10]. samotnej

%, v piesku 90 %

a v perlite 100 v miestnosti s ,

piliny [11]. Dni s rast listov a

v korene pod zemou sa rastlina .

z jednej rastliny sa pohybuje v vy 000-1 200 tov, z

-70 kg st viozidu. repa cukro vyprodukuje viac cukru 70 kg st viozidu,

000 kg cukru z jeden u cukrovej repy alebo trstiny [12].

alebo

.

( 3).

v -14 cm a -14 listov [13].

10

3: Pestovanie [14]

2.2

rastliny, k klad

glukozidy, fru . [15]v sladkej -glykozidy, a to rebaudiozid A, B, C, D, E, F a dulkozid A. , ale

. steviol-podmienkach pestovania rastliny [16]. Rozdiely v obsahu i medzi

.

ka 1 -glykozidov v 100 z [17]

Krajina Rebaudiozid A Rebaudiozid C 5,8 1,2 0,5

Ukrajina (Krym) 4,8 1,3 0,3 5,5 2,5 1,4

6,6 3,7 2,1 Paraguaj 4,6 1,9 0,9 Japonsko 7,7 1,9 0,9 Kanada 2,0 0,3 0,1

11

-V

poskytol d rastliny

a , nerozpustn alkohole.

Ani jedna z Lavieille

alko

Eupatorium rebaudianum na Stevia rebaudiana [3].

kolegami na huniverzite v charakterizovali i v i,

E. viol-13C-NMR. listoch

ich extrakcie [16].

( 4) ent-kaur-16- -19- roku 1960.

J ho steviol-glykozidov [16]. Prekurzorom ent- kyselina [8].

Steviol-glykozidy sa type a polohe mono je

v 2.

v [18].

4 [18]

12

2 -glykozidov [18] [19]

R1 R2 vzorec

Steviol H H C20H30O3 Steviolbiozid H -Glu- -Glu C38H60O18 100 125

-Glu -Glu- -Glu C32H50O13 250 300

Rebaudiozid A -Glu -Glu- -Glu

-

C44H70O23 350 450

Rebaudiozid B H -Glu- -Glu

-

C38H60O18 300 350

Rebaudiozid C -Glu -Glu- -

-

C44H70O2 50 120

Rebaudiozid D -Glu- - -Glu- -Glu

-

C50H80O28 200 300

Rebaudiozid E -Glu- - -Glu- - C44H70O23 250 300

Rebaudiozid F -Glu -Glu- -

-

C43H68O22

Dulkozid A -Glu -Glu- - C38H60O17 100 125 Obsah steviol-glykozidov je v ich

rastliny. V ani -g

v y rastu. P [20].

13

Graf 1 steviol-glykozidov [20]

2.2.1 eupatorin, rebuadin, stevin alebo steviosin, je

najpre m steviol-glykozidom v [16, 17]. Vyskytuje sa v nich v -13 %. Zpestovania i liny [20]. - s 10% .

13-O-(2- -glukosyl- -glukosyl)-19-O- -glukosylsteviol alebo 13-O- -soforosyl-19-O- -glukosylsteviol 804,87 g mol-1

[8]. rozsahu 196-198 24

D = 20,8 Vo vode je (0,13 %), [16].

katalyzovanou [16].

do 120 rozkladu a

[21].

14

Graf 2 [21]

10 i

dvoj teplota o 20 %.

a V

ie v z grafu 3 [21].

Graf 3 [21]

2.2.2 Rebaudiozid A -glykozid v

v . id

%) . tejto je -O- -glukosyl-13-O- --soforosyl-19-O- -glukosylsteviol [8]. Teplota topenia rebaudiozidu A je 242-244 jeho molekulov g mol-1 [16].

rovinu 24

D = 20,8 [8].

15

forma steviol-glykozidov s prevahou rebaudiozidu A . % rebaudiozidu A [22]. Vo forme bieleho po dobu 24 mesiacov v vrecku len 1-2 % rebaudiozidu A

- do 200

[23].

2.2.3 -glykozidy Rebaudiozid B sa od rebaudiozidu A 19

ktorej rovnako ako steviolbiozid. V listoch rastliny sa nevyskytuje, ale 193-195

hmotno ,87 g mol-1. %. K rebaudiozidu B 24

D = 45,4 [16]. Rebaudiozid C,

A -. Teplotu t -217 metanolu

24D = 29,9 . Jeh rebaudiozidom A aj B,

[16]. Rebaudiozid D obsahuje vo svojej

polohe 2 19 [8]. Teplotu to -286 jeho 24

D = 22,7 [16]. Rebaudiozid E v o

13 v polohe 2 [8]. Teplotu top -207 Jeho k 24

D = 34,2 . Tento steviol-glykozid nich n % [16].

Rebaudiozid F xyl . 24

D = 25,5 [24]. Dulkozid A

[8]. T -195 rovinu

24D = 50,2

rebaudiozidom A aj [16]. Steviolbiozid

19 [8]. Teplotu top -192 K rovinu 24

D = 34,5 (iba 0,03 %) [16]. rastline

jej extrakcie.

16

2.2.4 Mi glykozidy Z

(1) 6-O- -D-xylopyranosyl- -D-glukopyranosyl ester kyseliny 13-[(2-O- -D-

glukopyranosyl- -Dglukopyranosyl)oxy]-kaur-16- n-18-ovej

(2) -D-glukopyranosyl ester kyseliny 13-[(2-O- -D-glukopyranosyl- -D-glukopyranosyl) oxy]-17-hydroxy-kaur-15- n-18-ovej

(3) -D-glukopyranosyl ester kyseliny 13-[(2-O- -D-glukopyranosyl- -D-glukopyranosyl) oxy]-17-oxo-kaur-15- n-18-ovej

(4) -D-glukopyranosyl ester kyseliny 13-[(2-O- -D-glukopyranosyl- -D-glukopyranosyl) oxy]-kaur-15- n-18-ovej.

- konzistencie. Ich a vzorce ( 3) boli stanoven pomocou ESI-MS a NMR spektier [25].

k 5 -glykozidov [25]

ka 3 -glykozidov [25]

R1 R2 R3 (1) xyl-glc glc- CH2 C43H68O22

(2) glc glc- CH2OH C38H60O19 (3) glc glc- CHO C38H58O19 (4) glc glc- CH3 C38H60O18

Vysvetlivky: -D-xylopyranosyl, -D-glykopyranosyl

2.3 V rastline sa

17

V roku 2010

4

aminokyselina [26].

ka 4 [26]

g na 100 g g na 100 g 1,45 1,08 1,13 0,56 1,13 0,46 0,98 0,43

0,77 0,40 0,70 0,37 0,64 0,25 0,42 0,17 0,42

Lipidy V oleji z

a s ou tomto oleji g v 100 g oleja z

g v 100 g oleja z listov [27].

V

fosfor [26]. V

[28]. Obs sa v 8].

Polyf

chorob listoch je pyrogallol v mg na 100

v listoch i -kyselina p- - v [28].

18

katechiny, anthokyanidy, izoflavony, dihydroflavonoly a 6

[28]. V -O-glukozid, kaempferol 3-O-ramnozid, luteolin 7-O-glukozid, quercetin 3-O-arabinozid, quercetin 3-O-glukozid a quercetin 3-O-ramnozid (kvercetin) [16].

ok 6 flavanu [28]

-

roku 1986. V -H. Z 6-O-acetylaustroinulin a 7-O-acetylaustroinulin [16].

Triterpenoidy a steroidy Z - a lupeol

3- -sitosterol, stigmasterol a campesterol [16].

2.4 - je

v -

k deti. listov a na

-glykozidy ( E960). -

11. novembra 2011. -1 telesnej hmotnosti sa steviol-glykozidy na sladenie

in -sirup alebo od a s , v

19

Birell Limetka & Malina

Green tea peach (Coca

Nativa gingko green tea (Rauch Praha spol. s.r.o.) Nativa green tea lemon (Rauch Praha spol. s.r.o.) Nestea Marhu (Coca-

e se i (Coca- Rio H2O s poma

en a.s.) Staropramen Cool Grep (Pivovar Staropramen a.s.)

Potraviny

Ov dezert p vanilky (KALMA K.S) Ketchup Stevia (SPAK foods, s.r.o.) sladidly z

atko s (BIOFERM SK, s.r.o.)

(BIOFERM SK, s.r.o.)

2.5 Stanovenie steviol-glykozidov ou HPLC v roku 2001 steviol-glykozidy v

i v s g boli e 2 x 50 ml ej vody 2 gramy

100 ml Extrakty po cez 5 er (SPE). a 1 kvapalinovou chromatografiou.

SiC18 s rozmermi 250 x 4 mm a bola

20

na 25 acetonitrilu v pomere 75:15 v/v. Po

30 mi acetonitril v pomere 50:50 v/v -1. detektor s od firmy Waters z USA, nm.

li

[29].

Z W lwer-Rieck s om, ktorej predmetom bola rebaudiozidu A v 24, 48 a

teplote 80 s - tieto vzorky k rebaudiozidu A

ek ProStar 410, DAD detektor 335 s na 210 y .

a s rozmermi 250 x 4,6 mm a s rozmermi 4 x 3,0 mm od firmy

Phenomenex, USA. zmesou acetonitrilu a vody v pomere 80:20 v/v, -1. Objem

u bol 20 . gram ukazuje -

je medzi 10. a [30].

Liu, Jin-wei Li a Jian Tang vypracovali v roku 2010

listov 5 Listy boli 000 sile ultrazvuku.

i Agilent 1100 od firmy Agilent Ltd., USA so Zorbax Eclipse XDB- vody v pomere 70:30 v/v, s -1 Detekcia steviol- nm na detektore Ingelligent UV/VIS od firmy filter a objeme 10

V min. a pre rebaudiozid A 6,97 min. V 1,32 % a obsah rebaudiozidu A na 12,1 1,12 [31].

21

Congmin Yu a rebaudiozidu A v HPLC a NIR.

deionizovanej vode 100, 50 a 50

kvapalinovou chromatografiou

Luna NH2 100 250 x 4,6 mm a obsahovala acetonitril a vodu v pomere 78:22 v/v a -1. DAD

Z rebaudiozidu A bol 11,250 [32].

D. Bergs s -glykozidov z ou listov rastliny s 30 g vody pri teplote 30 PTR30 od firmy Grand Bio, UK 5 krokoch

Extrakty boli pre cez 0,2 a .

kvapalinovou chromatografiou Smartline Manager 5000,

Smartline PDA 2800 UV/VIS/NIR 210 nm od firmy Knauer, Nemecko,

. v STAR RP-18 s rozmermi 250 x 4,6 mm a 3 od firmy ej s HCl na pH 2,75 a acetonitrilu v pomere 65:35 v/v. J -1.

6,05 min. a rebaudiozidu A na 5,72 min.

V i -glykozidov a [33].

vydali v pre stanovenie steviol-glykozidov v

a -glykozidov. 7 steviol-glykozidov. aj 2

od firmy Waters, USA s UV-VIS detektorom SPD-10AV od firmy Shimadzu Corporation, Japonsko.

z roku 2008 -NH2 s rozmermi

22

250 x 4,6 mm a 5 od firmy Sigma-Aldrich, USA vyhrievanej na teplotu 40 vody s pH

v pomere 80:20 v/v s toku 1 -1 nm.

ODS ch rozmermi 250 x 4,6 mm aj 5 : Capcell Pak C18 MGII od firmy Shiseido Co., Ltd., Japonsko, Shim-pack CLC-ODS od firmy Shimadzu Corporation, Japonsko a Luna C18 od firmy Phenomenex Co., Ltd., USA. Teplota a

, teda 40 nma , 10 -1 s pH 2,6 v pomere 32:68 v/v -1. 1,4 -1 5 -1 3,0; 5 -1 roztok a 5 -1 roztok octanpH pufor: 10 -1 roztok u sodn s pH 2,6. acetonitrilom a

Tieto pomery boli 35:65, 32:68 a 30:70 objem acetonitrilu a pufru. V v

acetonitrilu a pufru, a preto bol i , z

pre rebaudiozid A je to 18 Tieto dva steviol-so rebaudiozid D sa eluuje z

-glykozidy. Novou met -glykozidy boli od seba

v bol medzi 7- tou a rebaudiozidu A medzi 6-7.

V rebaudiozid A 3 ml-1 [34]. steviol-glykozidov. z roku 2014

om steviol-glykozidov a od firmy Palo Alto, USA.

-HG s rozmermi 250 x 4,6 mm a 5 a Luna HILIC s rozmermi 150 x 4,6 mm a 5 od firmy Phenomenex,

. vodou, pri izokratickej v/v

% acetonitrilu v -10 min, pokles obsahu acetonitrilu z 80 na 50 % v -12 50 na 0 % v -

23

14 % v -16 min a 80 % acetonitrilu v -18 mi -1.

Autori vo svojom Z

rebaudiozid A rebaudiozidu A je

6,15 rebaudiozidu A mg l-1 [35].

T. Bililign s sa zaoberali v roku 2014 sep - extraktoch

od firmy Wilmington, Nemecko a Waters Alliance 2965 od firmy Milford, USA,

-AQ s rozmermi 250 x 4,6 mm a 5 od firmy YMC America, USA, Shiseido Capcell Pak C18 MGII s rozmermi 250 x 4,6 mm a 5 od firmy Shiseido, Japonsko a Scherzo SM-C18 s rozmermi 250 x 4,6 mm a

3 od firmy Imtakt, USA. acetonitril a 5 u draseln s pH 3.

10 na 35 % 35 na 75

% acetonitrilu a 90 -1 a

roztoku 15 nm.

e okrem 9 steviol-glykozidov aj steviol, izosteviol a izo- rebaudiozidu A

[36].

podmienok HP

24

3 EX

3.1

3.1.1 mikrof i mikropipety vialky

3.1.2 (HA 202 M, Japonsko)

- , USA) - , USA) - vzoriek (Waters 717 plus, USA) - detektor (Waters 2487 Dual , USA) - termostat TM, USA) - monoliti -18e (100 x 3 mm, Phenomenex) - Express C18 (150 x 4,6 mm; 2,7 , Sigma-Aldrich) - MetaGuard 4,6 mm Polaris 5 u C18-A (Agilent)

c magne pH meter (ProfiLine 3210 WTW, Nemecko) (PS 03000A 2,5 l, Notus-powersonic, Slovensko)

3.1.3 acetonitril (Sigma-Aldrich, Nemecko) (FCH VUT ) (Analytika spol. s.r.o., ) -Ner, ) -Ner, ) Scharlan Chemie S.A, EU) ) rebaudiozid A (Sigma aldrich, Nemecko) rebaudiozidu A (Stevia SILVER 250, stevioside.cz)

25

3.1.4 Z udiozidu A > 96 %) s g l-1

bolo do odmernej banky s objemom 100 ml

bola po rysku destilovanou vodou. , ale s

) namiesto destilovanej vody.

rebaudiozidu A (Stevia SILVER 250) g

objemom 100 banka bola po rysku destilovanou vodou.

ml do odmernej banky s objemom 50 Tento roztok

rebaudiozidu A. , ale s

29:71, acetonitril a ) namiesto destilovanej vody.

rebaudiozidu A v

pufor) s g l-1 bolo do odmernej banky s objemom 25 po rysku.

Z tohto roztoku s 1 g l-1 5 a 7,5 objemom 10 ml.

0,01; 0,025; 0,05; 0,075 a 0,1 g l-1.

kyseliny benzoovej s 0,5 g l-1

0500 g kyseliny benzoovej objemom 100

bola vodou.

s 1 g l-1 do odmernej banky s objemom 10 vodou.

i tieto roztoky pripraven znovu, ale s

kyseliny sorbovej s 0,5 g l-1

0500 g kyseliny sorbovej objemom 100

bola

26

s 1 g l-1 2 odmernej banky s objemom 10 vodou.

i tieto roztoky pripraven znovu, ale s

Kalibr

(29:71, acetonitril a pufor) s g l-1 0,02; 0,1; 0,2; 0,5; 0,8 a 1 ml do

objemom 10

s koncent g l-1.

(29:71, acetonitril a

pufor) s g l-1 ,5; 0,8 a 1 ml do objemom 10

0,001; 0,005; 0,01; 0,025; 0,04 a 0,05 g l-1.

vzoriek

v . cez mikrofiltrer s u. Ka

3.1.5 V boli V

ril a na pH 2,75. pomere (35:65, 30:70, 25:75, 27:73, 31:69 a 29:71 v/v) bola takto

ultrazvukom. V bola pre oddelenie kyseliny benzoovej a sorbovej

0,30 ho v 900 ml demineralizovanej vody. adovou kyselinou octovou bolo pH pufru [37]. Takto s acetonitrilom v pomere 71:29 v/v a ultrazvukom .

27

3.2 rebaudiozidu A

v v a .

nastavenie detektoru a to nm.

3.2.1 -

Od klasic sa

-v ktorom by bola

[33] acetonitrilu a okyslenej demineralizovanej vody v pomere 35:65 v/v.

0,3 ml min-1

30

ej y v/v

i teplota v

ej y v/v 0,6 ml min-1. Teplota

3.2.2 Express C18 C-18.

150

y v/v

oku 3 ml min-1. Teplota .

28

pomere

27:73 v/v zostala 0,3 ml min-1

v/v

ml min-1. Teplota vyhrievania

-A. ostal rovnak , teda 31:69 v/v

ostala 0,3 ml min-1 i teplota 40

pomere

29:71 v/v ml min-1

3.2.3 a Spolu so steviol-

e znehodnotenia mikroorganizmami. Jedn

.

pomere

29:71 v/v ml min-1. Teplota vyhrievania 50

Pomer acetonitrilu a v/v0,28 ml min-1 50

3.2.4

V Po

29

v/v (acetonitril a bola 0,28 ml min-1 50

3.3 zvolenej analytickej m

V bola

rebaudiozidu A

pomocou Empower Software.

R

Empower Software.

B s mg l-1 a

i 50 mg l-1. Linearita Linearita

Tento parameter bol pomocou A 5 roztokov s

a 100 mg l-1.

Hoci bol v tejto

tento s

100 mg l-1 10 l.

. a

. o dobu 30

30

Selektivita Je to s

.

31

4 V DISKUSIA

-glykozidov, idu a rebaudiozidu A.

mm) a

- spolu s nimi v a V s pojov.

4.1 rebaudiozidu A ozidu

od rebaudiozidu A v zmesi. teda , Stevia SILVER 250

. bol rebaudiozidu A.

4.1.1 , pre zistenie vhodnosti tejto

rebaudiozidu A [33] v

.

kapitole 3.2. ok 7

32

ok 7: Chromatogram rebaudiozidu A

Zmenou z 35:65 v/v na 30:70 v/v, teda

acetonitrilu v , sa 1 ( 8). afinita .

rebaudiozid A jeden

33

8 : 1 rebaudiozidu A

u od rebaudiozidu A, v V

k bol 25:75 v/v. Z chromatogramu ( 9) je podielu acetonitrilu v

a rebaudiozid A

34

9 1 rebaudiozidu A

- itrilom a okyslenou demineralizovanou vodou (pH 2,75). Preto v

4.1.2

Ascentis Express C18. o 50 a

oli (sep acetonitrilu a okyslenej demineralizovanej vody v pomere 30:70 v/v. ( 10), rebaudiozid A zo zmesi sa rozdelili. Pre

35

10

V to

z 30:70 v/v na 27:73 v/v. Analyzova ozidu A a ( 11). V

h acetonitrilu v

36

11 .

Na k 12)

analyzov (R = 1,6). V 27:73 v/v na 31:69 v/v obsahu acetonitrilu v

v .

37

k 12

V MetaGuard C 18.

, teda 31:69 v/v (acetonitril a . -glykozidy sa z

chromatograme ( 13 preto

38

13 rebaudioz

Pre stanovenie steviol-glykozidov v

so v/v (acetonitril a v rebaudiozidu A na chromatograme ( k 14) (R = 1,4) ( k 12

Je teda znehodnotia

rebaudiozidu A v

-glykozidmi i

39

k 14

4.1.3 Okrem steviol-glykozidov sa v

a rebaudiozidu A tak, aby bolo v

V enzoovej od kyseliny sorbovej pri

podmienkach chromatogrkyseliny benzoovej a sorbovej ( k 15) tieto kyseliny,

k 16) ko neoddelili.

preto

40

k 15 es kyseliny benzoovej a sorbovej.

k 16

41

V

obsahovala rebaudiozidu A s sorbovej. k 17)

vzorke. ( ok 18, 20 a 20)

v

k 17

42

ok 18

19

43

20 .

4.1.4 vplyvu

Z 5 rebaudiozidu A. Z na

chromatogramy z a 50 ok 21, ok 22 a ok 23).

ka 5

Teplota

rebaudiozid A

40 8,99 10,64 16,86 17,63 1,18 45 8,76 10,38 16,82 17,63 1,26 50 8,53 10,13 16,77 17,59 1,38

a

44

ok 21: 1, teplota 40

ok 22: 5

45

ok 23: 50

4.2 vyvinutej , pomocou ktorej boli

-glykozidy i acetonitrilu a

ml min-1 teplotu 50

V je

roztok rebaudiozidu A

rebaudiozid A 12 300

12 627

aj

46

rebaudiozidu A a 4.

R > 1,5. Ta oddelenie . bolo v acetonitril a , inak by

lebo rebaudiozidom A i

= m HPLC softwarom.

mg l-1, a potom s l-1 6.

6:

c = 10 mg l-1

R

[min.] P

[mV s] c = 50 mg l-1

R

[min.] P

[mV s] 1. 16,73 66,9 1. 16,77 364,8 2. 16,74 66,0 2. 16,75 363,8 3. 16,79 65,2 3. 16,78 361,7 4. 16,72 66,3 4. 16,72 368,8 5. 16,70 65,3 5. 16,72 368,1

S

0,03 0,6 S

0,02 2,7

Priemer 16,74 65,9 Priemer 16,75 365,4 O [%] 0,17 0,9 O 0,15 0,7

pri oboch pre %. Z

Linearita

s 5, 10, 25, 50, 75 a 100 mg l-1. v bola

tejto

47

7: Linearita zvolenej met dy l-1] s]

0,005 31,8 0,010 65,3 0,025 174,5 0,050 367,8 0,075 580,0 0,100 701,5

Graf 4

Rovnica regresnej priamky: 889,27071xy

Nas 10 s g l-1 8 a

5. P priamky a

y = 7071x - 2,889

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

c [g/l]

48

ka 8 streku P [mV s] 4 334,4 5 389,8 7 524,0 9 642,3 10 701,5

Graf 5

Rovnica regresnej priamky: 935,85781,61 xy

k ak koeficient je

0,999. teda potvrdzuje linearitu objemu .

1,6 10-4.

LOD: 4,8 10-4 g l-1 LOQ: 1,6 10-3 g l-1 Limit detekcie ukazuje

s 10-4 g l-1. 10-3 g l-1.

y = 61,78x + 85,93

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 2 4 6 8 10 12

p

o

Linearita n streku vzorky

49

Selektivita Selektivita zvolenej nich

-glykozidy v

4.3 10. Bolo v nich

nedos Na 5

k 24

Obsah rebaudiozidu A v kapitole

4.1.5. a v 3) a obsah kyseliny benzoovej a z krivky uvedenej v 4. 9. Chromatogramy

ka 9

creb A [mg l-1] u c[mg l-1]

c[mg l-1]

Grena 42,68 nie 91,80 0 K 29,44 nie 91,77 0

Malina 29,14 nie 79,30 0 Z orka 45,76 nie 101,43 0

J 45,32 0 0 Obsah rebaudiozidu A i kyseliny benzoovej sa v Kyselina

Pivovaru -glykozidov

50

a ich vyskytuje i

i (Funny fruit) je paster a sorbo - a i rebaudiozidu A. yseliny benzoovej pre

mg l-1 sladenie steviol-glykozidmi je mg l-1 analyzo-

51

5 V e bol

a nej i -

i obezite ani k

-

i kapitole 2.3.

obsahom tohto sladidla [38]. V v

i v i steviol-glykozidov

kvapalinovou chromatografiou. Z

podmienky

V 100 rebaudiozid A

mm a

a rebaudiozidu A pH 4,2. bol 29:71 v/v. 0,28 ml min-1 a teplota steviol-glykozidov nepresiahla 19

l kyseliny benzoovej bol 8,5 kyseliny sorbovej bol 10,1

takto jednoducho

a preto aj praxi.

vybran nealkoholick ov. Jednalo sa o

jednom nebolo presiahnut.

.

52

6 [1] CHATSUDTHIPONG, V., MUANPRASAT, CH.: Stevioside and related

compounds: Therapeutic benefits beyond sweetness. Pharmacology & Therapeutics [online]. 2009, . 121, 1, s. 41-45, [cit. 17. 3. 2015]. z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163725808001927

[2] MOTARJEMI, Y., MOY, G., TODD, E.: Encyclopedia of food safety. 1 vyd. Oxford: Elsevier, 2014, s. 2304. ISBN 978-0-12-378613-5

[3] WOOD, H. B., a kol.: Stevioside. I. The structure of the glucose moieties. The Journal of Organic Chemistry -883 [cit. 8. 10. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jo01125a012

[4] , P., V , T., N M, A.: Diabetes mellitus a rostliny, Remedia, -3. s. 150-151.

[5] V , L.: 1 vyd. : START, 2001. ISBN 80-862-3114-3.

[6] [cit: 20. 11. 2014] http://www.natusweet.de/_lccms_/_00118/Suessstoff-Stevia-pflanzliches-suessungs.htm?VER=120904173526&MID=121&LANG=ger.

[7] BRANDLE, J. E., TELMER, P. G.: Steviol glycoside biosynthesis. Phytochemistry -

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942207000933

[8] Praha, 1998. 11 s. Dizerta na

Praze.

[9] NAKAMURA, S., TAMURA, Y.: Variation in the main glycosides of Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). Japanese Journal of Tropical Agriculture , s. 109-115 [cit. 9. 10. 2014].

[10] SINGH, S. D., RAO, G. P.: Stevia: The herbal sugar of 21st century. Sugar Tech -

http://link.springer.com/article/10.1007%2FBF02942413

[11] ZUBENKO, V.F. a kol.: Storage of the rhizomes of Stevia propagated by green cuttings. Soviet agricultural sciences. -21 [cit. 2. 11. 2015].

[12] SERIO, L.: La Stevia rebaudiana, une alternative au sucre. [online], -

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10298-010-0526-4

[13] - Metabolizmus.sk. [online]. 3. 2. 2013 [cit. 2. 11. 2014]. http://metabolizmus.sk/zdrave-potraviny/stevia-sladky-liek-z-prirody/

53

[14] Best of 2011 Services Provider: International Stevia Council. Nutritional OUTLOOK

http://www.nutritionaloutlook.com/article/best-2011-ingredient-supplier-international-stevia-council-4-8430

[15] BERNAL, J. a kol.: Advanced analysis of nutraceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis -774 [cit. 24. 6. 2014].

icle/pii/S073170851000676X

[16] KINGHORN, A. D.: Stevia: The Genus Stevia. 1 vyd. : Taylor & Francis, 2002. s. 224. ISBN 0-415-26830-3

[17] KOVYLYAEVA, G. I. a kol.: Glycosides from Stevia rebaudiana. Chemistry of Natural Compaunds 1, s. 81-85 [cit. 24. 6. 2014].

-007-0037-x

[18] GEUNS, J. M. C.: Stevioside. Phytochemistry -

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942203004266

[19] [online]. 1. 3. 2013, -steviozid-

rebaudiozid

[20] BONDAREV, N. I. a kol.: Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana and its dynamics during ontogeny. Biologia Plantarum [online], 2003,

-http://link.springer.com/article/10.1023/B%3ABIOP.0000022261.35259.4f

[21] KROYER, G.: Stevioside and Stevia-sweetener in food: application, stability and interaction with food ingredients. Journal of Consumer Protection and Food Safety

-http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00003-010-0557-3

[22] PRAKASH, I. a kol.: Development of rebiana, a natura, non-caloric sweetener. Food and Chemical Toxicology 7, s. 75-z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18554769

[23] CARAKOSTAS, M. C. a kol.: Overview: The history, technical function and safety of rebaudioside A, a naturally occurring steviol glycoside, for use in food and beverages. Food and Chemical Toxicology -10 [cit. 17. 1. 2015]http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691508002342

[24] STARRATT, A. N, a kol.: Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana. Phytochemistry [online].2002, . 59, 4, s. 367-370 [cit. 17. 1. 2015].

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942201004162

54

[25] CHATURVEDULA, V. S. P., a kol.: Minor diterpenoid glycosides from the leaves of Stevia rebaudiana. Phytochemistry Letters [online], 2011, . 4, 3, s. 209-212, [cit. 7. 3. 2015http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874390011000036

[26] ABOU-ARAB, A a kol.: Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant. African Journal of Food Science 4, s. 269-281, [cit. 10. 3. 2015].

[27] TADHANI, M., SUBHASH, R.: Preliminary studies on Stevia rebaudiana leaves: Proximal composition, mineral analysis and phytochemical screening. Journal of Medical Science -326, [cit. 10. 3. 2015].

[28] KIM, I. a kol.: The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia rebaudiana water extracts. LWT Food Science and Technology -1332, [cit. 10. 3. 2015].

[29] .: Determination of Stevioside in Plant Material and Fruit Teas. Journal of food composition and analysis [online]. 2001,

. 14, 4, s. 383-388 [cit. 7. 3. 2015http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0889157500909748

[30] WOLWER-RIECK, U., TOMBERG, W., WAWRZUN, A.: Investigations on the Stability of Stevioside and Rebaudioside A in Soft Drinks. Journal of Agricultural and Food Chemistry [online], 2010, . 58, 23, s. 12216-12220, [cit. 7. 3. 2015].

http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=S2qzTa4ENsdblvDd8Ze&page=1&doc=1

[31] LIU, J., LI, J-W, TANG, J.: Ultrasonically assisted extraction of total carbohydrates from Stevia rebaudiana Bertoni and identifiaction of extracts. Food and Bioproducts Processing [online], 2010, . 88, 2-3, s. 215-221, [cit. 7. 3. 2015http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308510000040

[32] YU, C., XU, K., SHI, Y.: The spectrum model established for measuring the contents of Rebaudioside A and Stevioside quickly in the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni. Energy Procedia [online], 2011, . 5, s. 855-861, [cit. 7. 3. 2015http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1876610211010873

[33] BERGS, D., a kol.: Fast and isocratic HPLC-method for steviol glycosides analysis from Stevia rebaudiana leaves. Journal of Consumer Protection and Food Safety

-154, [cit. 7. 3. http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00003-012-0760-5

[34] TADA, A. a kol.: Improvement of the Assay Method for Steviol Glycosides in the JECFA Specifications. American Journal of Analytical Chemistry [online], 2013,

- http://file.scirp.org/Html/4-2200537_30452.htm

55

[35] LORENZO, C. a kol.: Fast methodology of analysing major steviol glycosides from Stevia rebaudiana leaves. Food Chemistry -523 [cit. 8. 3. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814614002738

[36] BILILIGN, T. a kol.: Development and Validation of a Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography Method for Routine Identification and Purity Assessment of High-Purity Steviol Glycoside Sweeteners. Journal of Agricultural and Food Chemistry -1389 [cit. 8. 3. 2015].

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf4047557?journalCode=jafcau

[37] G REN, A. C. a kol.: HPLC and LC-MS/MS methods for determination of sodium benzoate and potassium sorbate in food and beverages: Performances of local accredites laboratories via proficiency test in Turkey. Food Chemistry [online], 2015,

-http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814614018238

[38] .:

Ph.D.

56

7 SKRATIEK Glu HILIC HPLC

chromatografia JECFA (The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) Spo

NIR NMR Ram reb A rebaudiozid A SPE (solid shase sxtraction) extrakcia na pevnej matrici Xyl

57

8

. 1:

rebaudiozidu A (Stevia Silver 250)

3: rebaudiozidu A

4: kyseliny benzoovej a sorbovej

58

9

.1:

Prietok

-1] Teplota

Odkaz

SiC18, RP (250x4

acetonitril, voda gradient 1 25 [29]

Luna HILIC (250 x 4,6 mm)

acetonitril, voda

(80:20 v/v) 1 36 [30]

Zorbax Eclipse XDB-C18

acetonitril, voda

(70:30 v/v) 1 25 [31]

Luna NH2 (250 x 4,6 mm )

acetonitril, voda

(78:22 v/v) 1 - [32]

Purospher Star RP-18 (250 x 4,6 mm )

acetonitril, voda (pH 2,75)

(35:65 v/v)

1 50 [33]

Capcell Pak C18 MGII Shim-pack CLC-ODS

Luna C18 (250 x 4,6 mm )

acetonitril, pufor (10 -1

Na3PO4, pH 2,6)

(32:68 v/v)

1 40 [34]

Develosil ODS-HG (250 x 4,6 mm )

Luna HILIC (150 x 4,6 mm )

acetonitril, voda gradient

1 30 [35]

Capcell Pak C18 MGII (250 x 4,6 mm )

YMC ODS-AQ (250 x 4,6 mm )

Sherzo SM-C18 (250 x 4,6 mm )

acetonitril, pufor (5 mM KH2PO4,

pH 3) gradient 0,5 32 [36]

59

rebaudiozidu A (Stevia Silver 250)

25

60

3

ka 10 s]

0,005 31,752 0,010 65,280 0,025 174,456 0,05 367,757 0,075 579,971 0,100 701,460

Graf 6: Graf rebaudiozidu A

y = 7071x - 2,889

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

c [g/l]

krivka rebaudiozidu A

61

4: sorbovej

11

[g/l] s]

Kyselina 0,001 103,43 57,968 0,005 446,236 294,149 0,010 929,449 591,015 0,025 2231,266 1542,427 0,040 3521,592 2447,980 0,050 4331,585 3089,047

Graf 7 kyseliny benzoovej a sorbovej

y = 86588x + 36,75

y = 61889x - 14,15

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

c [g/l]

62

5

26

63

6: Chromatogram vzorky

27

64

7

28

65

8

ok 29

66

9

30