Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně...
Transcript of Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně...
![Page 1: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/1.jpg)
Vyšetřovací metody v
bakteriologii
Jana Juránková
OKM
FN Brno
![Page 2: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/2.jpg)
Vyšetřovací metody v mikrobiologii
• Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií
nebo virů– bakteriologie, virologie
• Nepřímý průkaz – průkaz reakce
makroorganizmu na přítomnost bakterií
nebo virů - sérologie
![Page 3: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/3.jpg)
Vyšetřovací metody v bakteriologii
• Mikroskopie
• Kultivace
• Průkaz antigenů
• Průkaz metabolitů
• Průkaz nukleových kyselin
![Page 4: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/4.jpg)
Mikroskopie
• Preparát nativní
• Preparát barvený
– Monochromatické barvení
– Barvení podle Grama
– Barvení podle Giemsy
– Barvení podle Ziehl – Nielsena
– Barvení spor
– Barvení pouzder
– Fluorescenční barvení
![Page 5: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/5.jpg)
Nativní preparát
• Suspenze materiálu nebo kultury ve
fyziologickém roztoku
• Pro pozorování živých mikroorganizmů,
posouzení jejich pohyblivosti
• 100 – 400násobné zvětšení
![Page 6: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/6.jpg)
Nativní preparát - využití
• Bakteriologie – sledování typického
pohybu bakterií (listerie)
• Parazitologie – průkaz střevních parazitů
ve stolici
• Mykologie – sledování růstu a množení
kvasinek
![Page 7: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/7.jpg)
Nativní preparát
![Page 8: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/8.jpg)
Barvení podle Grama
• Hans Christian Joachim Gram, 1884
• Dělí bakterie do dvou základních skupin
– Grampozitivní G +, modrofialové
– Gramnegativní G -, růžovočervené
![Page 9: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/9.jpg)
Barvení podle Grama
• Barvitelnost podle složení buněčné stěny
• Fixace plamenem
• Postup barvení:
– Krystalová violeť – 20 s
– Lugolův roztok – 20 s
– Oplach vodou
– Odbarvení acetonalkoholem – 10 s
– Safranin – 1 min
![Page 10: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/10.jpg)
Barvení podle Grama
• Mikroskopie při 1000násobném
zvětšení
• Pozorování pomocí imerzního oleje
mezi preparátem a objektivem
![Page 12: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/12.jpg)
Barvení podle Grama
Gramnegativní
![Page 13: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/13.jpg)
Barvení podle Grama
Význam
• Diagnostické barvení – základ
klasifikace a taxonomie bakterií
• Možnost okamžité a racionální
antibiotické terapie
![Page 14: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/14.jpg)
Barvení podle Giemsy
• Původně podle Giemsy – Romanovského
• Slouží k diferenciaci buněčných struktur
• Použití hlavně v parazitologii
– Mikrobiální obraz poševní – průkaz
Trichomonas vaginalis
• Barvení obtížně barvitelných
mikroorganizmů
• Fixace metanolem
![Page 15: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/15.jpg)
Barvení podle Giemsy
• Azur a eosin rozpuštěný ve směsi
glycerinu a metanolu
• Ředěn neutrální destilovanou vodou
• Roztok není stabilní, používá se vždy
čerstvý
![Page 17: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/17.jpg)
Barvení podle Ziehl - Nielsena
• Barvení acidorezistentních tyčinek
– Špatně barvitelné
– Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně
• Nejčastěji Mycobacterium sp.
![Page 18: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/18.jpg)
Barvení podle Ziehl - Nielsena
• Fixace teplem
• Barvení karbolfuchsinem
• Zahřátí
• Odbarvení kyselým alkoholem
• Oplach
• Dobarvení malachitovou zelení
![Page 20: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/20.jpg)
Barvení pouzder
• Pouzdra pevně lnou k buněčné stěně
• Faktor virulence
• Nepřijímají běžná barviva
• Negativní barvení tuší
• Na tmavém pozadí světlé dvorce pouzder
• Význam pro posouzení virulence bakterií
(pneumokoky)
![Page 21: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/21.jpg)
Negativní barvení
![Page 22: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/22.jpg)
Fluorescenční barvení
Pomocí fluoreskujícího barviva
• Imunofluorescence
– Na hledaný antigen se naváže protilátka
označená fluoreskujícím barvivem
• Pozorování pomocí fluorescenčního
mikroskopu
![Page 24: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/24.jpg)
Kultivační průkaz
• Základní mikrobiologický postup
• Cílem je získat mikroba z klinického
materiálu v čisté kultuře
• Identifikovat ho
• Určit citlivost k antimikrobním
přípravkům
![Page 25: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/25.jpg)
Kultivační půdy
• Dělení podle konzistence
– Tekuté – k pomnožení bakterií
– Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií
– Tuhé, pevné
![Page 26: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/26.jpg)
Kultivační půdy
• Dělení podle funkce
– Základní – masopeptonový bujon, krevní agar
– Diagnostické – obsahují látky, které se mění
vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení
laktózy)
– Selektivní – k výběrovému růstu bakterií,
obsahují látky, které potlačují některé bakterie
– Selektivně diagnostické
![Page 27: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/27.jpg)
Kultivační půdy
• Dělení podle funkce (pokračování)
– Transportní - k transportu bez množení –
umožňují přežití bakterií při transportu
– Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií
ve vzorku, mohou být i selektivní
![Page 28: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/28.jpg)
Podmínky kultivace
• Dostatečná vlhkost prostředí
• Optimální teplota - 37
C (4
C, 40
C)
• Optimální pH půdy – 7,2 – 7,4
• Vhodná izotonie média – 0,5 – 1% NaCl
• Dostatek vhodných živin
• Vhodné plynné prostředí
![Page 29: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/29.jpg)
Dělení bakterií podle vztahu ke
kyslíku
• Striktně aerobní
• Fakultativně anaerobní
• Striktně ananerobní
• Anaerobní aerotolerantní
• Mikroaerofilní
• Kapnofilní
![Page 30: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/30.jpg)
Anaerostat
![Page 31: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/31.jpg)
Nádoba pro anaerobní kultivaci
![Page 32: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/32.jpg)
Termostat se zvýšenou tenzí CO2
![Page 33: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/33.jpg)
Kultivační půdy
• Masopeptonový bujon
• Krevní agar
• Čokoládový krevní agar
• Levinthalův agar
• Endova půda
• Sabouraudův agar
• Desoxycholát – citrátový agar
• Chromagary
![Page 34: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/34.jpg)
Pomnožovací bujóny
![Page 35: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/35.jpg)
Krevní agar
![Page 36: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/36.jpg)
Krevní agar a Endova půda
![Page 40: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/40.jpg)
Identifikace bakterií
• Podle morfologie
• Podle růstových vlastností
• Podle biochemických vlastností
– Selektivní půdy
– Komerční diagnostické soupravy
• Podle antigenní struktury
– Latexová aglutinace
![Page 41: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/41.jpg)
Biochemické určení bakterií
![Page 42: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/42.jpg)
Biochemické určení bakterií
![Page 43: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/43.jpg)
Stanovení citlivosti na antibiotika
• Disková difúzní metoda
– Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana
růstu bakterií
• Diluční testy
– Stanovení koncentrace antibiotika, která je
ještě na mikroba účinná
![Page 44: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/44.jpg)
Disková difúzní metoda
![Page 45: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/45.jpg)
Diluční metoda
![Page 46: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/46.jpg)
Průkaz antigenů z materiálu
• Latexová aglutinace
• Rychlá vyšetřovací metoda např.
mozkomíšního moku
![Page 47: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/47.jpg)
Latexová aglutinace
![Page 48: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/48.jpg)
Průkaz metabolitů
• Těžko kultivovatelné bakterie
• Rychlý průkaz
– Např.infekce Helicobacter pylorii –
průkaz produkce ureázy
![Page 49: Vyšetřovací metody v bakteriologii - is.muni.cz · Trichomonas vaginalis •Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů •Fixace metanolem . Barvení podle Giemsy •Azur](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040216/5d222b7b88c993f2168cca0b/html5/thumbnails/49.jpg)
Průkaz nukleových kyselin
• Průkaz přítomnosti mikroorganizmu v
klinickém vzorku
• Druhové identifikace izolovaného
mikrobiálního kmene