Vybrané imunologické metody -...
Transcript of Vybrané imunologické metody -...
Vybrané imunologické metody
Ing. Petra Šandová
Klinická imunologie a alergologie – laboratořÚKBLD a 1. LF UK VFN
Laboratorní imunologická vyšet ření
� Humorální imunita� proteiny krevního séra (Ig, C, CRP), IK� paraproteiny, kryoglobuliny� specifické IgE, ECP� autoprotilátky
� Buněčná imunita� subpopulace lymfocytů - imunofenotypizace� intracelulární cytokiny� fagocytóza� HLA B27
Laboratorní imunologická vyšet ření
� Periferní krev� Humorální imunita - sérum, plazma
� Buněčná imunita - plná krev s antikoagulačním
činidlem
� Tělní tekutiny - likvor, BAL, punktáty, výpotky
Indikace laboratorních vyšet řenív klinické imunologii
� Určení diagnózy
� Diferenciální diagnostika
� Potvrzení diagnózy
� Monitorování terapie
� Screening rodin
Imunologické laboratornímetody 1. volby
� Hladiny imunoglobulinů - IgG, IgA, IgM event. IgE
� Cirkulující imunokomplexy metodou PEG
� C3, C4 složka komplementu
� Antinukleární protilátky (ANAb) metodou NIF ENA screening
� Stanovení povrchových znaků lymfocytů (CD3, CD4, CD8), B lymfocytů (CD19, CD20), NK buněk (CD3-CD16+56+)
� U dětí vyšetření fagocytózy
Imunologické laboratornímetody 1. volby
� Součástí kompletního imunologického vyšetření je vždy:
� kompletní krevní obraz t.j. včetnědiferenciálního rozpočtu leukocytů
� FW (ev. CRP zejména u dětí)
Imunologické laboratornímetody 2. volby� Autoprotilátky orgánově nespecifické (dsDNA, ENA
typizace, ANCA, APLA, SMAb, AMAb a další)
� Orgánově specifické protilátky (anti-tTG, ASCA, anti-TG, anti-TPO, LKM a další)
� Další ukazatele buněčné imunity např. znaky aktivaceT lymfocytů, adhezívní molekuly
� Funkční testy T a B lymfocytů (blastická transformace)
� Vyšetření fagocytárních funkcí včetně oxidativníhovzplanutí granulocytů
Imunologické laboratornímetody 2. volby
� Stanovení specifických IgE
� ECP
� C1 inhibitor, C1inh funkční test
� Stanovení sekrečního IgA
� Stanovení podtříd IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
Principy laboratorních imunochemických metod
� Antigen + protilátka imunitní komplex
� detekce protilátky pomocí antigenu� detekce antigenu pomocí protilátky
� Principy detekce
� přímá detekce � nepřímá detekce� detekce založená na značení antigenu nebo
protilátky
Přímá detekce Ag nebo Ab
� Imunonefelometrie� Imunoturbidimetrie� Radiální imunodifúze� Imunoelektroforéza� Protisměrná imunoelektroforéza� Imunofixační elektroforéza
Imunonefelometrie
� Ig, složky komplementu, CRP, CIK-C1q� Měření světla rozptýleného na komlexech Ag-Ab
Imunonefelometrie
� Dade Behring – BN II
Radiální imunodifúze
� C1q� Kruhová difúze roztoku Ag z kruhové jamky do
vrstvy gelu s obsahem protilátky
CH100
� Funkční test stanovení celkové hemolytickéaktivity komplementu
� V gelu ovčí ery s navázanou Ab proti ovčím ery. � Séra se pipetují do aplikačních jamek� Komplement se aktivuje při 37 0C (klasická cesta)� Lýza ery - projasnění
Protism ěrná imunoelektroforéza
� ENA screen� Migrace antigenu a protilátky při elektroforéze
proti sobě
Imunofixa ční elektroforéza� Gamapatie� Elektroforetická separace proteinů na gelu� Imunoprecipitace s monospecifickými antiséry
Nepřímá detekce Ag nebo Ab
� Latex fixační test
� Nepřímá (pasivní) hemaglutinace
� Aglutinační inhibiční test
� Komplement fixační reakce
Latex fixa ční test
� RF� Latexová částice – Ab + Ag aglutinace
Nepřímá hemaglutinace
� Protilátky proti zona pellucida� Antigen je adsorbován na erytrocytech� Protilátka je přítomna ve vzorku� V případě nepřítomnosti hledané protilátky nedojde
k hemaglutinaci
Detekce založená na zna čeníantigenu nebo protilátky
� Enzymy – EIA
� Flurochromy – FIA
� Chemiluminiscenční látky – CLIA
� Radionuklidy - RIA
Enzymová imunoanalýza
� Stanovení autoprotilátek� ELISA – enzymová imunoanalýza na pevné fázi
Enzymová imunoanalýza
� Imunoblotting� WB� Dot blot
� ENA typizace� Anti-gangliosidy� AMAb II� Jaterní blot
Protilátky proti extrahovatelnémunukleárnímu antigenu
� Anti-SSA/Ro SLE, Sjögrenův syndrom� Anti-SSB/La SLE, Sjögrenův syndrom� Anti-Sm (B´B) SLE� Anti-Sm (D) SLE� Anti-Scl 70 systémová sklerodermie� Anti-RNP smíšená choroba pojiva SLE� Anti-Pm-Scl polymyositida, dermatomyositida� Anti-NuMA Sjögrenův syndrom, SLE, RA� Anti-Ku sklerodermie� Anti-Jo dermatomyositida, polymyositida� Anti-histon léky indukovaný SLE, SLE, RA� ACA CREST syndrom, sklerodermie
Fluorescen ční imunoanalýza
� Stanoveníautoprotilátek
� Nepřímáimunofluorescence
Fluorescen ční imunoanalýza
� Typy substrát ů
� Tkáňové řezy krysí - LKS� Tkáňové řezy opičí - ovaria, ledviny,
mozeček, nadledvinky, endomýzium� Suspenze - prvok Crithidia luciliae
- lidské granulocyty� Tkáňové kultury - HEp-2, HUVEC
AMAb GPCAb SMAb
Tkáňové řezy krysí
Protilátky proti bazální membráně glomerulů(GBM)
Tkáňové řezy opičí
cANCA pANCA
Suspenze: lidské granulocyty
Protilátky proti dsDNA
Suspenze: prvok Crithidia lucilae
Antinukleární protilátky (ANAb)
Tkáňové kultury: HEp-2 buňky
Jaderné autoantigenypolynukleotidyhistonyribonukleoproteinyantigeny jadérekcentroméradalší antigeny
Orgánov ě nespecifické antigeny cytoplazmy
buněčné organelyantigeny cytoskeletudalší antigeny
Antigeny asociované s d ělením buňky
centrioladělící vřeténkoseparační zóna buňky
Antigenní cíle v bu ňce
Jaderná membrána s póry
Antigenní cíle v bu ňce
Průtoková cytometrie
� Technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množstvíčástic (např. buněk) v suspenzi
� Buňky lze rozlišit dle jejich velikosti (FSC), granularity (SSC), obsahu DNA, značením monoklonálními Ab,…
Průtoková cytometrie
SSC
FSC
020
040
060
010
00
0 200 400 600 800 1000
800
Lymfocyty a
Bazofily
Monocyty
Neutrofily
Eosinofily
Trombocyty,erytrocyty adebris
Průtoková cytometrie
CD19 PE
CD3 FITC
Průtoková cytometrie
� Průtokový cytometr BD FACS Canto
Chemiluminiscen ční imunoanalýza
� Stanovení specifických IgE, ECP� Immulite 2000
Alkalická fosfatáza - detekce tímto enzymem vyvolaného
luminiscenčního záření
Chemiluminiscen ční imunoanalýza
� Stanovení specifických IgE� Advia Centaur
Acridium ester – emitacesvětla při oxidaci H2O2
v alkalickém prostředí
Kryoglobuliny
� Imunoglobuliny precipitující v chladu� Speciální odběr� 3 typy:� Typ I. – monoklonální kryoglobuliny,
paraproteiny IgG, IgM, IgA
� Typ II. – smíšené kryoglobuliny, kombinace paraproteinus polyklonálním Ig
� Typ III. – polyklonální imunoglobuliny
Děkuji za pozornost!