Veobecn vybavenie molekulrneho laboratria Chemick sklo (skmavky, odmern valce, kadiky, Erlenmeyerove banky, reagenn fae a in) pouvaj sa pri prprave roztokov, glov, kultivanch mdi, ako aj na ich uskladnenie- v rmci experimentov v molekulrnom laboratriu sa sklen ndoby vyuvaj v ovea menej miere ako v chemickom laboratriu, pretoe s nahraden kvalitnmi sterilnmi plastovmi ndobami vo vine prpadov na jednorzov pouitie

Plastov ndoby a pomckyExperimenty v molekulrnej biolgii si vyaduj prcu v sterilnch podmienkach so sterilnmi pomckami. Na zabrnenie kontamincie jednorzov materil vyroben z kvalitnho plastu (napr. polypropyln), vysok odolnos voi chemiklim a vysokm teplotm, vinu z nich je mon sterilizova alebo autoklvova

Skmavky so rbovacm uzveromMikroskmavky (tzv. eppendorfky)rzne objemy 2,0 ml; 1,5ml; 0,5 ml; 0,2 ml (pri metde PCR)uzatvraten rznymi typmi uzverovprispsoben pre centrifugciu v rznych typoch centrifg

PCR Strip TubesPCR plate (PCR plt)PCR Tubes

piky na mikropipetyrzny objem poda pouitej mikropipety (objem 1000, 200, 10 l)poda objemu s piky aj farebne odlin (modr 1000l, lt 200l, biele-bezfarebn 10l)vzhadom na odlinos mikropipiet od rznych vrobcov, je potrebn poui piky uren pre konkrtny typ mikropipetyVyroben z kvalitnho plastu, s odoln voi chemiklim a je mon ich sterilizova a autoklvova

MikropipetyMechanick pipety s fixnm a variabilnm objemomJednokanlov, Viackanlov fixn pipety s objemom od 10 l a do 1 000 l, pipety s variabilnm objemom 0,1 l - 2,5 l a po1 - 10 ml 8-kanlov a 12-kanlov pipety o objemoch 0,5 - 10 l, 10 - 100 l a 30 - 300 l Autoklvovaten, bu cel pipeta alebo len jej spodn as pipety s variabilnm objemom - nastaviten pomocou otonej skrutkysepartny vyhadzova

1-kanlov, 8-kanlov nebo 12 kanlov zobrazovac displej pracovn reimy: pipetovanie, opakovan dvkovanie nasaje pln objem piky a dvkuje uvateom nastaven objem, monos premieania vzorky po vypusten do skmavky, nastaviten rchlos nasvnia i vypania monos pripojenia k PC a vytvorenia vlastnch pracovnch reimov pomocou ovldacieho softwru

Elektronick pipety

Zsady pipetovaniaNenastavi objem pod 0l alebo nad maximlny objem mikropipety, inak dochdza k jej pokodeniu a chybe meraniaKvapalina sa pri pipetovan prena v plastovej pike (Nikdy nezabudn ju nasadi!!!, inak skontaminujeme alebo pokodme piest pipety)Nasvanie a vypanie realizujeme stlanm a uvonenm piestu pipety piest stlame do prvej polohy a piku ponorme do kvapaliny, uvonenm uvedieme piest do pokojovej polohy za sasnho naberania kvapaliny do piky (ubezpeme sa, e v kvapaline v pike nie s vzduchov bubliny), pipetu so pikou vyberieme a vlome do novej skmavky, kde vypustme cel obsah piky stlaenm piestuPozor! Kapilrne javy v pike spsobia, e sa cel objem kvapaliny nevytla, preto stlame piest a na doraz (do druhej polohy)piku z pipety odstrnime pouitm vyhadzovaapiku vdy menme!!! je jednorzov

CentrifugciaSeparan metda zaloen na rozdielnom pohybe astc v tekutom prostred vplyvom odstredivej silyOdstrediv pole vznik otanm rotora centrifgy, pohyb astc je podmienen hmotnosou a prostredmVyuva sa napr. pri izolcii, purifikcii (preisovan) DNA, RNA a protenovRchlos centrifugcie zvis od vekosti astc, ktor separujeme a od metdy, vyjadruje sa pomocou jednotky otky za mintu (ot/min., rpm)2 typy centrifugcie :Diferencilna (frakn) je mon oddeli zmes astc, ktor sa vrazne lia vekosou, hmotnosou alebo hustotou. Prebieha v homognnom roztoku. Zlokyzmesi sedimentuj rznou rchlosou. astice s najvou hmotnosou alebo vekosou po centrifugcii vytvoria znu na dne skmavky, alie astice tvoria alie zny smerom k stiu skmavky poda klesajcej hmotnosti. Vyuitie na separciu a izolciu zloiek lyztov z buniek.

Zonlna (gradientov) pouva sa, ak zmes na separciu pozostva z astc, ktorch rchlos sedimentcie je vemi podobn (rzne typy nukleovch kyseln). Pouva sa gradientov roztok (sacharza, CsCl), ktorho koncentrcia od povrchu ku dnu skmavky stpa. istota prepartov je vysok.

Zsady centrifugcie :skmavky v rotore musia by vyven vdy umiestujeme skmavky s rovnakouhmotnosou oproti sebeManipulciu so skmavkami v centrifge uskutoujeme len vtedy, ak nie jecentrifga v innostiCentrifugciu spustme a vtedy, ke je veko centrifgy bezpene zatvoren; veko otvorme a po zastaven rotoraPouvame len skmavky odporan vrobcom centrifgy

Rzne typy centrifg s rznymi rotormi

Typ rotora centrifgy

Sterilizcia pomcok a priestorovPri prci s NK je riziko kontamincie vemi vysok, me djs ku kontamincii vzoriek cudzorodou DNA (napr. pri prci s udskou DNA je mon kontamincia s DNA experimenttora) alebo sa kontaminuj vzorky navzjom. Zvl vysok riziko nastva poas metdy PCR.Opatrenia: jednorzov materil, sterilizcia priestorov a materilu, ochrann odevpouitie UV svetla degraduje molekuly NK a eliminuje prtomn baktrie (pecilne boxy s UV lampou a laminrnym prdenm vzduchu pri otvoren boxu zabrauje vmene vzduchu medzi boxom a okolm)pomocou autoklvu sterilizcia sa dosahuje psobenm nastenej vodnej pary pri vysokej teplote a tlaku (najastejie pri 120C, pri tlaku 0,1-0,3 MPa, 20 min.) (plasty, sklo), je mon autoklvova aj roztoky (zsady- mnostvo roztoku nesmie presiahnu 2/3 objemu ndoby, vrchnk ndoby necha nasaden len vonepomocou steriliztora psobenm vysokej teploty, menej inn ako sterilizcia v autoklve

Tlmiv roztoky (pufre, angl. buffers)Udruj pH roztoku kontantn aj po pridan malho mnostva kyseln alebo zsadPh tlmivho roztoku sa nemen ani zriedenm roztokuVyuvaj sa pri prci s enzmami, pri elektroforze, izolcii a purifikcii biologicky aktvnych ltoktlmiv roztoky pre prcu s enzmami maj rzne zloenie, s komerne dodvan s konkrtnym enzmom

Izolcia DNACie: zska ist, vysokomolekulrnu DNA bez protenov a polysacharidovvzhadom na vekos DNA v jednotlivch chromozmoch eukaryotickch organizmov (desiatky milinov bz), je technicky vemi nron izolova neporuen molekuly DNA v plnej dke a manipulova s nimi v in vitro podmienkach. Pre vinu experimentov to vak ani nie je potrebn a plne postaujca je fragmentovan DNA s dkou fragmentov 70-150 kb.

V sasnosti existuje mnostvo metodk izolcie nukleovch kyseln z rznych zdrojov. Mnoh vrobcovia dodvaj cel spravy chemikli (tzv. kity) uren pre izolciu DNA z konkrtneho zdroja s vysokou innosou. DNA sa izoluje z krvi, z chlpovej cibuky, buniek sliznice stnej dutiny, prpadne zo svalu alebo inch tkanv. DNA z rastlinnch pletv sa izoluje aie v porovnan so ivonymi tkanivami vaka pevnej bunkovej stene. Na jej rozruenie sa pouvaj rzne zmesi enzmov (izolovan napr. z Trichoderma reesei) alebo sa bunkov stena rozru pomocou tekutho duska

Vetky metdy izolcie genmovej DNA z tkanv ivochov a pletv rastln s zaloen na zkladnch krokoch:

1. homogenizcia (rozruenie tkanv, pletv a iastone i buniek)2. lza buniek a bunkovch membrn 3. uvonenie vzby medzi DNA a bielkovinou (rozpad nukleoprotenovho komplexu)4. odstrnenie protenov a ostatnch vysokomolekulrnych zloiek bunky okrem DNA, preistenie DNA od neiaducich prmes (tzv. istenie - purifikcia DNA)5. vyzranie DNA (precipitcia)

1. rozruenie tkanv v homogeniztore v prostred zvolenho extraknho mdia, v niektorch prpadoch pri tkanivch s vysokou aktivitou nuklez alebo pri pevnejch tkanivch (kostn tkanivo) je vhodn tkanivo zmrazi v kvapalnom dusku, rozdrvi na prok 2. rozruenie buniek (bunkovch membrn)pomocou lyzanho roztoku (Tris- HCl pH=7.5, EDTA, aninov detergenty laurylsran sodn, ltny alebo SDS (so dodecylsulftu))Aktivita nuklez enzmov, ktor sa prirodzene vyskytuj v bunkch a degraduj DNA sa inhibuje : roztokom EDTA - viae iny (naprklad Mg2+), ktor nuklezy vyaduj ku svojej aktivite teplotou a 60C v prtomnosti detergentov (SDS)

3. uvonenie vzby medzi DNA a bielkovinouDNA tvor pevn komplexy s histnmi a almi protenmi, preto sa do lyzanho roztoku pridva enzm proteinza K a detergenty (SDS alebo N-lauryl sarkozn), ktor pomhaj deproteinizcii

(proteinza K - izolovan z baktrie Tritirachium album - tiepi peptidov vzby po karboxylovej skupine N-substituovanch aminokyseln, m hydrolyzuje proteny)

4. deproteinizcia prepartov DNA (odstrnenie protenov z roztoku)preistenie prepartov DNA od bielkovinovch prmes sa d uskutoni viacermi postupmi, v ktorch pouit inidl denaturuj prtomn bielkoviny a DNA ostane rozpusten vo vodnej fze bez toho, aby sa poruila ich truktra

A) fenol alebo zmes fenol:chloroform - najefektvnejie denaturan inidl. Nevhodou fenolu je jeho vysok toxicita.B) vysoovanie pomocou NaCl

A) Nukleov kyseliny s hydrofiln molekuly, ktor sa dobre rozpaj vo vodnej fze. Bielkoviny vaka prtomnosti hydrofbnych skupn s lepie rozpustn v organickej vrstve (spodn). Po intenzvnom pretrepan sa vzorka centrifuguje a vytvoria sa dve fzy. Vrchn vodn fza obsahuje rozpusten nukleov kyseliny, medzifza je tvoren denaturovanmi protenmi a zbytkami buniek, v hornej vodnej fze je rozpusten DNA. Na odstrnenie zvykov fenolu sa vyuva zmes chloroformu s izoamylalkoholom v pomere 24 : 1. Chloroform tie denaturuje bielkoviny, izoamylalkohol zniuje penenie zmesi, uahuje oddelenie vrstiev pri centrifugcii a udruje ich stabilitu.B) po centrifugcii zskame v spodnej fze tvorenej NaCl denaturovan proteny a v hornej vodnej fze rozpusten DNA5. vyzranie DNA- najastejie 96% etanolom alebo izopropanolom- innmu vyzraniu DNA sa pomha znenm teploty a pridanm soli

IZOLCIA DNA POMOCOU KOLNPrincp metdy je zaloen na zachyten DNA na kolnkach, ktor obsahuj silikagly alebo anin iontomeniov ivice. Na izolciu sta 0,2 ml nezrazenej krvi.1. Rozbitie buniek: proteinza K naruuje bunkov steny a napomha rozruenie buniek. Lyzan roztok, obsahujci chaotropn soli a detergent rozbja otvoren bunky. Intenzvne premieanie a teplota 65 C napomhaj lze membrn a natrveniu bielkovn.2. Zachytenie DNA na membrne kolnky: DNA sa viae na kremiit membrnu kolnky, neiadci bunkov materil, denaturovan proteny a RNA sa odstrnia preteenm kolnkou.3. Premvanie a odstrnenie kontaminujcich zloiek: Tlmiv roztok s etanolom odstrni neiadce bunkov zvyky, son prmesi a zrove vyist naviazan DNA na kolnke.4. Elcia DNA z kolnky: poda typu ivice dosiahne sa alkalickm tlmivm roztokom alebo roztokom s vysokou koncentrciou soli. Vaok bva cca 10 mg DNA/0,2 ml krvi.