Vliv vnitřních a vnějších faktorů na mikroorganizmy v potraviách

Vliv vnitVliv vnitřřnníích a vnch a vněějjšíších ch faktorfaktorůů na mikroorganizmy v na mikroorganizmy v

potravinpotravinááchch

Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách

Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodníaktivita,antimikrobiální aktivity

Vnější: vlhkost, teplota, atmosféraImplicitní: specifická růstová rychlost,

synergismus, antagonismus, komensalismusTechnologické: krájení, mytí, balení, záření,

pasteurizace

Mikroorganizmus a potravinaMikroorganizmus a potravina

• uchycení mikroorganizmů (fimbrie, pouzdra, slizovávrstva)

• kontaminační dávka• druh mikroorganizmů (růstová fáze, generační

doba)• mikroflóra potraviny (vzájemné vztahy mezi

mikroorganizmy)• vliv vnitřních faktorů• vliv vnějších faktorů

VnitVnitřřnníí faktoryfaktoryPůsobením mikroorganismů se mění vlastnosti potravin (např. textura, konzistence, vůně, chuť, vzhled). K jakým změnám dojde je závislé na chemických a fyzikálních vlastnostech potraviny (intrinsic factors):

• složení potraviny (dostupnost živin)• koncentrace vodíkových iontů (pH)• aktivita vody (aw)• oxido-redukční potenciál (Eh)• textura potraviny• přítomnost antimikrobiálních látek v potravinách

VnVněějjšíší faktoryfaktory

Způsob uchování a skladování potravin má významný vliv na mikroflóru potravin. Jakost a trvanlivost potravin je určována vnějšími faktory (extrinsicfactors).

• teplota prostředí• relativní vlhkost vzduchu (% RV)• složení atmosféry• čas

DalDalšíší faktoryfaktory

Vedle vnitřních a vnějších faktorů má na trvanlivost potravin z pohledu mikrobiologického vliv také počet a druhové zastoupení mikroflóry.

Čím méně je v potravině mikroorganismů a čím ménějsou aktivní, tím delší čas je potřeba k jejich pomnožení a vzniku senzorických změn (dlouhá lagfáze a delší generační čas)

Tlak, záření, působení antimikrobiálních látek, dezinfekčních prostředků

Vztahy mezi mikroorganismyVztahy mezi mikroorganismy

KomenzalizmusKomenzalizmus- volné sdružení MO, kteří si vzájemně neškodí ani

neprospívají (např. mikroflóra úst, kožnímikroflóra, atd.)

SynergizmusSynergizmus ((syntrofizmussyntrofizmus))- umožňuje žít určitým MO v daném prostředí pouze

v přítomnosti MO jiných (např. aeroby odčerpávajíkyslík z prostředí → umožňují růst anaerobů, štěpení makromolekul extracelulárními enzymy, kefírové kultury)


SymbiSymbióózaza- vzájemně prospěšné soužití MO, např. s hmyzem,

rostlinami nebo vyššími živočichy (např. rozklad celulózy v bachoru přežvýkavců, produkce vitaminu K bakteriemi střevního traktu)

AntagonizmusAntagonizmus- nepříznivé působení jedné skupiny mikroorganizmů

na druhou (např. bakterie mléčného kvašení a hnilobné bakterie)


ParazitizmusParazitizmus- jeden MO využívá vnitrobuněčných meziproduktů

metabolismu jiného druhu a tím jej ničí. Jev častější pro soužití mikroorganizmů s živočichy nebo rostlinami (např. bakteriofágy, mykoviry)

MetabiMetabióózaza- produkty metabolismu jedněch mikroorganizmů

jsou postupně využívány mikroorganizmy dalšími (např. zoctovatění alkoholických nápojů)

- metabióza umožňuje rychlou mineralizaci organických látek v přírodě - koloběh prvků

VnitVnitřřnníí faktory faktory -- slosložženeníí potravinypotraviny

Obecně platí, že potraviny obsahující více nízkomolekulárních látek a větší množství vody se kazí rychleji.

• obsah vody v potravině• zdroj energie a zdroj dusíku (sacharidy, alkoholy,

AMK)• zdroj dusíku (AMK, peptidy, bílkoviny)• vitamíny a růstové faktory (B vitamíny)• minerální látky

pHpH

BakterieBakterie –– slabě kyseléaž slabě alkalické pH

KvasinkyKvasinky –– preferujíkyselé prostředí

PlPlíísnsněě –– tolerují velmi široké rozmezí

pHpH

Hodnota pH ovlivHodnota pH ovlivňňuje:uje:- rozmnožování bakterií, rychlost růstu, vitalitu- intenzitu a charakter metabolizmu- odolnost buněk ke zvýšených teplotám- kyselé pH (<4,0) zabraňuje klíčení spór- změna dostupnosti kovových iontů v alkalickém

prostředí

Vliv má nejen nízká hodnota pH, ale i druh kyselin, které se na snížení hodnoty podílely.

DDěělenleníí potravin dle pHpotravin dle pH

Aktivita vody Aktivita vody -- aaww

Aktivita vodyAktivita vody- je definována jako poměr parciálního tlaku vodní

páry nad potravinou (p) k parciálnímu tlaku vodnípáry nad čistou vodou (p0) při dané teplotě:

paw =

p0- množství vody dostupné pro mikroorganizmy pro

chemické reakce buněk- optimální hodnota pro většinu mikroorganizmů

aw>0,98


BakterieBakterie

halofilní x halotolerantní

xerofilní x xerotolerantní

osmofilní x osmotolerantní


SnSníížženeníí aktivity vody:aktivity vody:• odstranění využitelné vody sušením, uzením,

odpařením, mražením

• zvýšení obsahu tuku

• zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) → zvýšeníosmotického tlaku (hypertonické prostředí) →difuze vody z buňky do prostředí → zastavenímetabolizmu až smrt buňky


PotravinyPotraviny• lehce kazitelné (více než 0,95)• středně kazitelné (0,95-0,92)• málo kazitelné (pod 0,91)

Důležitá je kombinace aw s ostatními faktory ovlivňujícími přežívání MO v potravinách.

Redox potenciRedox potenciáál l -- EEhh

OxidaOxidaččnněě redukredukččnníí potencipotenciáál prostl prostřřededíí- je rozdíl potenciálu mezi platinovou (kovovou)

elektrodou umístěnou do daného prostředí a standardní vodíkovou elektrodou.

oxidaceoxidacelláátka redukovantka redukovanáá lláátka oxidovantka oxidovanáá + + nn elektronelektronůů

redukceredukce

SnSníížženeníí redox potenciredox potenciáálu:lu:- přidání redukujících látek- růst aerobních mikroorganismů- vakuové balení, atd.

Redox potenciRedox potenciáál l -- EEhh

Textura potravinyTextura potraviny

PPřřirozenirozenéé krytkrytíí povrchu potravinpovrchu potravin- skořápka vajec, skořápky ořechů, kůže, vazivová

pouzdra orgánů, povázka masa, kůrka chleba, atd.

PPřříítomnost tomnost antibakteriantibakteriáálnlnííchchlláátek (tek (biocidbiocidůů) v potravin) v potravinááchch

• Některé potraviny obsahují přirozenéantimikrobiální látky (koření, minerální oleje, česnek, hořčice, med)

• Kravské mléko obsahuje laktoferrin, laktoperoxidázový systém, lysozym, kasein

• Vejce lysozym, conalbumin, ovotransferrin, avidin

AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí enzymyenzymy

Jsou hojně rozšířeny v přírodě a hrají důležitou roli při obranných mechanizmech živých mikroorganizmů proti infekcím.

HydrolHydroláázyzy – degradují klíčové struktury buněčných stěn (peptidoglykan)

OxidoreduktOxidoreduktáázyzy – vytváří reaktivní molekuly, kterérozrušují vitální proteiny v buňce.


Bakteriolytické1.1. NN--acetylhexosaminidacetylhexosaminidáázyzy katalyzují štěpení

glukosidických vazeb sacharidů peptidoglykanu2.2. NN--acetylmuramylacetylmuramyl--LL--alaninamidalaninamidáázyzy katalyzují

štěpení mezi sacharidovou a peptidovou částípeptidoglykanu

3.3. EndopeptidEndopeptidáázyzy hydrolyzují peptidové vazby peptidoglykanu

4.4. OstatnOstatníí – chitinázy, ß-glukanázy


Bakteriolytické

LysozymLysozym je aktivní především u G pozitivních bakterií.


OxidoreduktOxidoreduktáázyzy

GlukozooxidGlukozooxidáázyzy jsou produkovány některými plísněmi, podstata cytotoxicity spočívá v tvorbě peroxidu vodíku (oxidace glukózy na kys. glukonovou a H2O2)

LaktoperoxidLaktoperoxidáázyzy se vyskytují např. ve slinách, mléce(oxidace thiokyanátu na hyperthiokyanát)

LaktoferrinLaktoferrin je glykoprotein tvořící komplexy s iontyželeza

VnVněějjšíší faktoryfaktory

• Teplota• Složení atmosféry• Relativní vlhkost vzduchu• Čas

TeplotaTeplota

• Je jedním z hlavních faktorů vnějšího prostředí, který ovlivňuje rychlost rozmnožování (přežívání) bakterií

• Rozeznáváme 3 základní body teplotyminimminimáálnlníí teplotuteplotuoptimoptimáálnlníí teplotuteplotumaximmaximáálnlníí teplotuteplotu

RozdRozděělenleníí bakteribakteriíí podle podle vztahu k teplotvztahu k teplotěě

Mikroorganizmy dělíme do skupin podle nároků na teplotu při které se rozmnožují a metabolizují

PsychrofilnPsychrofilníí bakterie (12bakterie (12--15 15 °°C)C)PsychrotrofnPsychrotrofníí bakterie (25bakterie (25--30 30 °°C)C)MezofilnMezofilníí bakterie (30bakterie (30--40 40 °°C)C)TermofilnTermofilníí bakterie (50bakterie (50--70 70 °°C)C)

Vliv vysokých teplotVliv vysokých teplot

Smrtící účinek vysokých teplot (letální teplota)

• je nejnižší teplota, při které dochází za určitý čas k usmrcení (70 °C/10 minut) • denaturace bílkovin, inaktivace enzymů, narušení DNA a cytoplazmatické membrány

• je závislá na: druhu mikroorganismujeho fyziologickém stavukoncentraci buněk v prostředícharakteru prostředí

TermorezistenceTermorezistence

Stupeň odolnosti mikroorganizmů je závislý na:

• fyziologickém stavu bakterií• jejich genetické výbavě• množství bakterií• obsahu vody v substrátu

• množství ochranných látek (lipidy, proteiny, sacharidy)

SterilizaceSterilizace

• jednorázové použití teploty nad 100 °C

• sterilizace je definována jako kombinace teploty a času

• sterilizaci potravin přežívají některé spóry (rody Bacillus a Clostridium)

• praktická (obchodní) sterilita x absolutní sterilita

STERILIZOVANÉ POTRAVINY MOHOU OBSAHOVAT SPÓRY!

PasteracePasterace

Správně provedená pasterace zaručí:

• devitalizaci patogenních mikroorganismů(M. tuberculosis)

• devitalizaci podstatné části saprofytické mikroflóry (vegetativních buněk)

• zachování původních fyzikálních, chemických, výživových a senzorických vlastností

PASTEROVANÉ POTRAVINY OBSAHUJÍMIKROORGANISMY!

Vliv nVliv níízkých teplotzkých teplotNižší než optimální teploty přežívá většina mikroorganizmůdlouhou dobu. Přenesou-li se však z optimálních teplot do teploty kolem 0 °C dochází k chladovchladovéému mu ššokuoku.

Při pomalpomaléém zmrazovm zmrazováánníí bunbuněěkk na teploty pod 0 °C ze z vnitro i mimobuněčné vody tvoří velké krystaly ledu, kterébuňku nevratně poškozují.

Při rychlrychléém zmrazovm zmrazováánníí bunbuněěkk na teploty -30 °C – 180 °C se tvoří mikrokrystalky ledu, které buňky poškozují jen minimálně.

Po rozmrazení se potraviny rychleji kazí (poškozeníživočišných i rostlinných pletiv krystaly vody)

SloSložženeníí atmosfatmosfééryry

Skladování potravin v řízené atmosféře plynů máochranný účinek

• VakuovVakuověě balenbalenéé potravinypotraviny (v obalech nepropustných pro kyslík)• COCO22 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silnéoxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků

RelativnRelativníí vlhkost prostvlhkost prostřřededíí

Vysoká relativní vlhkost ovlivňuje aw potraviny (význam balení)

Čím vyšší je teplota, tím nižšímusí být relativní vlhkost prostředí a naopak

ČČasas

Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek

VnitVnitřřnníí faktoryfaktory VnVněějjšíší faktoryfaktory

Technologie pTechnologie přřekekáážžekek

Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, kterémusí mikroorganizmy překonat.I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesíleníúčinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musímikroorganizmy vyvinout.

PrediktivnPrediktivníí mikrobiologiemikrobiologie

Vychází ze znalostí vnitřních a vnějších faktorů

• Predikce růstu• Pravděpodobnostní modely• Kinetické modelování

PoPoččááteteččnníí popoččet LM et LM 101044 CFU CFU Teplota Teplota 20/1020/10°°CCpH 7pH 7 aaw w 0,9970,997

Predikce rPredikce růůstu stu –– modelovmodelováánníítyp ztyp záákusekkusek

•• Vliv dalVliv dalšíších faktorch faktorůů na na mikroorganizmy v potravinmikroorganizmy v potravinááchch

PovrchovPovrchovéé napnapěěttíí

• Některé mikroorganizmy se špatnou smáčitelnostíbuněk rostou v tekutinách ve formě blanky (křísu)

• Povrchové napětí prostředí snižujeme přídavkem povrchově aktivních látek (tenzidů)

ZZáářřeneníí

Elektromagnetické vlnění různých délek se značně liší svými účinky na mikroorganizmy

•• InfraInfraččervenervenéé – nemá přímé letální účinky (teplo!)•• ViditelnViditelnéé svsvěětlotlo – ovlivňuje pozitivně i negativně

některé aktivity buněk•• UltrafialovUltrafialovéé – má silně mutagenní a letální účinky (malá pronikavost)

•• IonizaIonizaččnníí zzáářřeneníí-- má silně mutagenní a letálníúčinky (vysoká pronikavost)

Hydrostatický tlakHydrostatický tlak

Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku.

Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a 30-40 MPa zcela zastavuje.

Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa – barofilnbarofilníí x x barotolerantnbarotolerantníí (v hlubinách moří)

UltrazvukUltrazvuk

UltrazvukUltrazvukjsou zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, na bakterie působí letálně pouze při vysoké intenzitě.

KavitaKavitaččnníí ultrazvukultrazvukv důsledku kmitání vzniká prudká pulzace buněčných membrán a cytoplazmy (letální účinek)

Citlivé k ultrazvuku jsou především tyčinky a vlákna, koky jsou odolnější

MechanickMechanickéé vlivyvlivy

Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou buněčnou stěnou a malými rozměry

K destrukci buněk dochází:• opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním (odolnost enzymů)

• ošetření vysokým tlakem• třepání s abrazivním materiálem

PPůůsobensobeníí antimikrobiantimikrobiáálnlníích lch láátektek

Některé látky přítomné v prostředí mají na mikroorganizmy nepříznivý vliv v důsledku svého specifického složení (antimikrobiální).

MikrobistatickMikrobistatickéé- látky zastavující rozmnožování mikroorganizmů

MikrobicidnMikrobicidníí– látky usmrcující mikroorganizmy

Vliv koncentrace (účinek stimulační)

Podle mechanizmu Podle mechanizmu úúččinku dinku děěllííme me antimikrobiantimikrobiáálnlníí lláátkytky

Látky poškozující strukturu bustrukturu buňňkyky nebo její funkci (např. buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, ribozomy)

Látky působící na mikrobimikrobiáálnlníí enzymyenzymy (oxidační činidla, chelatační látky, těžké kovy, antimetabolity)

Látky reagujreagujííccíí s DNAs DNA (např. chemické mutageny –alkylační nebo dezaminační činidla, cytostatika)

CCíílovlováá mmíísta psta půůsobensobeníí AML na AML na bakteribakteriáálnlníí bubuňňkuku

DezinfekDezinfekččnníí lláátkytky

Sanitace = čištění a dezinfekce

Čištění – odstranění nečistot a zbytků organického materiálu

Dezinfekce – odstranění mikroorganismů.

Teplota a doba působení čistících a dezinfekčních prostředků!

DezinfekDezinfekččnníí lláátkytky

• buněčná stěna - poškození• cytoplazmatická membrána – indukce difuze látek

z buňky, inhibice enzymů CM, oslabeníelektrochemického potenciálu CM

• cytoplazma – koagulace enzymů, ribozomů, NK

DezinfekDezinfekččnníí mechanizmusmechanizmus- oxidace, hydrolýza, tvorba solí s bílkovinami,

koagulace bílkovin, změny permeability, poškozeníenzymatického systému, mechanická disrupce.

AnorganickAnorganickéé slouslouččeninyeniny

SilnSilnéé kyseliny a silnkyseliny a silnéé zzáásadysady- poškozují BS a CM x poškozují povrchy zařízení

HaHaššenenéé vváápnopno- dezinfekce stěn, kvasných kádí, atd.

UhliUhliččitan sodný, fosforeitan sodný, fosforeččnan sodný, nan sodný, polyfosfpolyfosfáátyty- odstranění zbytků tuků a bílkovin x polyfosfáty

ekologicky nežádoucí (eutrofizace vod)

Oxid siOxid siřřiiččitýitý- síření ovocných a vinných polotovarů, síření sudů,

sklepů, atd.


Oxid uhliOxid uhliččitýitý- uchovávání ovocných šťáv

OrganocOrganocííniniččititéé slouslouččeniny eniny -- LastanoxyLastanoxy- antifugální účinek, nátěry stěn, omítek, atd.

SlouSlouččeniny chleniny chlóóruru- plynný chlór – dezinfekce vody- chlorové vápno – desinfekce podlah, skladovacích

ploch- chloramin – směsné čistící prostředky, velmi časté

použití v lékařství i potravinářství


JodovJodovéé preparpreparáátyty- Jodonal M – desinfekce mléčné žlázy

Peroxid vodPeroxid vodííkuku- sterilizace korunkových uzávěrů, obalů z plastu

(kelímky, tetrapakové obaly,atd.), sýrařství

OrganickOrganickéé slouslouččeninyeniny

OrganickOrganickéé kyseliny kyseliny –– konzervace potravinkonzervace potravin- kyselina benzoová- kyselina sorbová (plísně)- kyselina mravenčí (kvasinky, plísně)

Kyselina Kyselina peroctovperoctováá -- PersterilPersteril

PovrchovPovrchověě aktivnaktivníí lláátkytky- mýdla (sodné soli vyšších MK)- kvartérní amoniové báze (Ajatin, Septonex)

AntibiotikaAntibiotika- nisin (konzervace potravin)

LaboratornLaboratorníí mmetodyetodynepřímépřímé

1. kultivační2. mikroskopické3. imunologické4. molekulárně

biologické

1. impedanční2. konduktometrické3. metabolická

aktivita4. redukce barviv

KultivaKultivaččnníí metodymetodyMetoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo

stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebodruhu bakterií

VýhodyVýhody•• vysokvysokáá citlivostcitlivost -- REFERENREFERENČČNNÍÍ METODAMETODA (ISO, EN)(ISO, EN)

NevýhodyNevýhody•• dlouhdlouháá dobadoba do do dosadosažženeníí výsledkvýsledkůů•• kvantitakvantita je je vyjvyjááddřřenaena jakojako CFU (KTJ) ne CFU (KTJ) ne popoččtemtem

bakteribakteriíí

KultivaKultivaččnníí metodymetody

Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu(kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou

•• SpirSpiráálovlováá plotnovplotnováá metodametoda•• PetrifilmyPetrifilmy•• HygikultyHygikulty

KultivaKultivaččnníí metodymetody-- spirspiráálovlováá plotnovplotnováá metodametoda

Malé množství vzorku (35 µl) je nanášeno na rotujícíPetriho misku tryskou spirálovitě ve směru od středumisky k její periferii. Pomocí šablony (manuálně) nebolaseru (automaticky) je odečítán počet CFU (KTJ) namisce a ten je přepočten na výchozí objem inokula.

VýhodyVýhody• automatizace, eliminace chyb způsobenýchlidským faktorem

NevýhodyNevýhody• vysoké pořizovací náklady

KultivaKultivaččnníí metodymetody-- PetrifilmyPetrifilmy

Petrifilmy jsou destičky potažené kultivačnímimédii ve formě gelu. Destičky se inokulují 1 ml naředěného vzorku a inkubují v termostatu.

VýhodyVýhody• destička je opatřena mřížkou pro snazší počítání

kolonií• speciální indikátory zbarvují narostlékolonie a tím je zvýrazňují

KultivaKultivaččnníí metodymetody-- HygikultyHygikulty

Hygikult je plastová destička oboustranně pokrytákultivačním médiem, umístěná ve sterilní nádobce.

Je určen k rychlému monitorování úrovně mikrobiálníkontaminace v potravinářských provozech.

VýhodyVýhody• snadnost použití mimo laboratoř

NevýhodyNevýhody• sortiment destiček je omezen pouze na indikátorové

mikroorganizmy

MembrMembráánovnováá filtracefiltrace

Metoda slouží k zakoncentrování bakterií

• kultivační metoda• mikroskopiefiltry z nylonu, PVC, polykarbonátu, polyesteru, kovu

VýhodyVýhody• filtrací většího objemu lze zvýšit citlivost metody• teplý agar nepoškozuje bakterie

MikroskopickMikroskopickéé metodymetodyKlasickKlasickéé metodymetody -- stanovení počtu bakterií po obarvení

preparátuModernModerníí metodymetody - epifluorescencepifluorescencespojuje metodu filtrace a fluorescenční mikroskopie

PrincipPrincip spočívá ve vazbě fluorochromového barviva naDNA (RNA) mikrobů (DEFT, BACTOSCAN)

VýhodyVýhody• rychlost provedeníNevýhodyNevýhody• metoda detekuje i mrtvé buňky

ImunologickImunologickéé metodymetody

Princip metody ELISA ELISA Enzymaticky značená specifická protilátka je

vázána na vhodný povrch (mikrotitračnídestička).

Za přítomnosti antigenu (specifické bakterie) vzniká komplex AgAbAgAb. .

Ten je možné detekovat buď přímo spektrofotometricky nebo vizualizovatkonjugátem.

ImunologickImunologickéé metodymetody

VýhodyVýhody - automatizace- rychlost- vyšetření velkých sérií

vzorků

NevýhodyNevýhody – vyšší náklady na vyšetření- skríningová metoda

VyuVyužžititíí – detekce bakteriálních patogenů- detekce bakteriálních toxinů

ImunomagnetickImunomagnetickááseparaceseparace

PrincipPrincipjsou-li v substrátu přítomny sledované bakterie, vážíse na super-para-magnetické částice obalenéspecifickou protilátkou. Komplexantigen - protilátka se odseparujepomocí magnetu a dále zpracuje.

VýhodyVýhodyzkracuje dobu kultivacezachycuje i subletálně poškozené buňky

ImunomagnetickImunomagnetickáá separaceseparace

PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakcereakcePrincipPrincipPrincip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro

opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy(primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA.

PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci jedinébuňky.

Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním třízákladních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken

PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce reakce Vysvětlení základních pojmů

•• templtempláátt – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používágenomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml.

• DNA polymeráza – termostabilní enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´-3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používápro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut.

• dNTP - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)

PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce reakce Vysvětlení základních pojmů

• primery – jsou oligonukleotidy (obvykle 20-25 bazí) , které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a kterévymezují úsek templátu, který bude amplifikován

• master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dNTP, polymerázy, specifických primerů a vody.

• termocykler ((teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce.

• marker – velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu

TurbidimetrieTurbidimetrie

Podstata Podstata Bakterie v průběhu množení tvoří v tekutém vzorku

zákal. Metoda využívá měření změn intenzity zákalu média v závislosti na čase.

Intenzita zákalu je závislá na počáteční koncentraci mikroorganizmů.

Využití – k měření celkového počtu mikroorganizmů(aerobních i anaerobních)

PrPrůůtokovtokováá cytometriecytometrie

Podstata Podstata Metoda vyjadřuje kvantitativní fotometrické stanovení

fluorochromu navázaného na specifické bakterie.Buněčná suspenze po obarvení prochází kapilárou přes

trysku, kde je laserem ozářena. Intenzita excitovaného světla vyjadřuje kvantitu specifických bakterií.

VyuVyužžititíí – rychlá detekce technologicky významných a patogenních bakterií. Výsledky nejsou porovnatelnése standardními metodami (CFU)

ImpedanImpedanččnníí metodametoda

Metabolická činnost bakterií mění složení kultivačního média, což vede ke změnám vodivosti.

Systém je složen ze dvou elektrod ponořených do živného média. Ty jsou připojeny na zdroj střídavého proudu a měříme jimi impedanci. Stoupající vodivost vede k poklesu impedance.

VýhodyVýhody - automatizaceNevýhody Nevýhody – vyšší cena přístroje

- při smíšených kulturách nestandardnívýsledky

VyuVyužžititíí – indikátorové skupiny mikroorganizmů

MetabolickMetabolickáá aktivitaaktivita

BioluminiscencBioluminiscenceeATP je zdrojem energie všech živých buněk. Podstata

metody spočívá v reakci ATP s enzymem luciferluciferáázouzou vázanou na luciferinluciferin.

Tři tvorbě luciferin-adenylátového komplexu se z ATP uvolňuje pyrofosfát.

Za přítomnosti kyslíku dochází k uvolnění světla, jehožintenzita je závislá na výchozím množství ATP.

PouPoužžititíí – rychlá detekce mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech (HACCP)

EnzymatickEnzymatickáá aaktivitaktivita

RedukceRedukce barvivbarvivResazurinový test je založen na průkazu

bakteriálních reduktáz. Ty redukujíresazurin rezorufin hydrorezorufinmet. modř leukoforma

Rychlost barevné změny je závislá na množstvímikroorganizmů.

VyuVyužžititíí – rychlá detekce CPM v mléce nebo mase

IDENTIFIKACEIDENTIFIKACE - zařazení neznámých kmenů (druh, poddruh)

TYPIZACETYPIZACE - zařazení neznámých kmenů pod úroveň druhu

FINGERPRINTINGFINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho druhu poddruhu nebo variety

Metody typizaceMetody typizace

Kategorie typizaKategorie typizaččnníích metod ch metod -- fenotypovfenotypováá charakteristikacharakteristika

BIOTYPIZACEBIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základěbiochemických vlastností (API, Enterotest, Stafytest atd.)

REZISTENCE k antibiotikREZISTENCE k antibiotikůůmm - zkoumání citlivosti kultur k antimikrobiálním látkám (disková difuznímetoda, MIC)

SSÉÉROTYPIZACE ROTYPIZACE - nejstarší typizační technika, sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H:K

Kategorie typizaKategorie typizaččnníích metod ch metod -- genotypovgenotypováá charakteristikacharakteristika

1. GeneraceGenerace - analýza plazmidové DNA- restrikční analýza plazmidové DNA

2. GeneraceGenerace - restrikční analýza chromozomální DNA- hybridizací s próbami- ribotypizace

3. GeneraceGenerace - PFGE- typizační metody na bázi PCR (RAPD, REP PCR)

4. GeneraceGenerace - DNA sekvenování

RestrikRestrikččnníí analýza analýza plazmidovplazmidovéé DNADNA

RE RE - sekvenčně specifická nukleáza, která štěpídsDNA ve specifických sekvencích vytvářením dvouřetězcových zlomů

PulznPulzníí gelovgelováá elektroforelektroforééza (PFGE)za (PFGE)

Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu, technika určená pro separaci molekul DNA o velikosti až 12Mb, při níž dochází ke změně směru elektrického pole.

Molekuly DNA putujípohybem cik-cak v závislosti na pulzním čase a napětí

PulznPulzníí gelovgelováá elektroforelektroforééza za (PFGE)(PFGE)

Rare cutting endonukleázy-RE vzácně štěpící –rozpoznávají a štěpí sekvence, kterése v genomové DNA vyskytujízřídka a vytváří dlouhé restrikčnífragmenty (XbaI, SpeI,SmaI,NotI)

Metoda PCR detekující polymorfizmus DNA za použitíjediného krátkého oligonukleotidového primeru, který se na cílovou DNA váže v náhodných místech. Výsledkem je soubor amplikonů charakteristický pro daný mikroorganizmus

Podle délky primerů rozlišujeme metody: AP-PCR (Arbitrary primed PCR) 18-24 merRAPD 10 merDAF (DNA amplification fingerprinting) 5-8 mer

RandomlyRandomly amplifiedamplified polymorficpolymorfic DNADNA((polymerpolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce nreakce nááhodnhodnáá -- RAPD)RAPD)

Vliv vnitřních a vnějších faktorů na mikroorganizmy v potraviách

Education

Transcript of Vliv vnitřních a vnějších faktorů na mikroorganizmy v potraviách