VLIV PORFYRIN NA MECHANICK VLASTNOSTI BUNN LINIE HELA

Jakub Malohlava, Kateina Tomnkov, Hana Kolov

stav lkask biofyziky, stav molekulrn a translan medicny, Lkask fakulta, Univerzita Palackho v Olomouci, Hnvotnsk 3, 775 15 Olomouc, 585 632 200, jakub.malohlava@upol.cz

Abstrakt Porfyriny jsou vznamnou skupinou fotosenzitizr uplatujcch se pi fotodynamick terapii.

Fotofyzikln vlastnosti porfyrin jsou ovlivnny ptomnost centrlnho iontu. V tto prci jsme se

zamili na vliv novho fotosenzitizru MgTPPS4 na bunnou linii HeLa. Pro vyhodnocen kvalitativnch

a kvantitativnch zmn jsme pouili mikroskopii atomrnch sil a konfokln mikroskopii. Zjistili jsme, e

dochz ke statisticky signifikantnm zmnm v morfologii a mechanickch vlastnostech bunk.

Klov slova: fotodynamick terapie; mechanick vlastnosti; mikroskopie atomrnch sil; F aktin; cytoskelet. vod

Fotodynamick terapie (PDT) je alternativn postup pi lb nkterch ndorovch

onemocnn. Pro navozen fotodynamickho efektu je poteba souinnosti t faktor:

fotosenzitizru, svtla specifick vlnov dlky a kyslku. PDT vyuv fakt, e v ndorov tkni

se akumuluje fotosenzitizr. Po nslednm ozen ndoru se produkuje singletn kyslk a dal

reaktivn formy kyslku (ROS), jako je peroxid vodku, superoxidov anion, hydroxylov radikl,

kter vedou k nevratnm zmnm v ndorov tkni. Krom pmho cytotoxickho pokozen

PDT psob i na cvn zsoben tumoru a vyvolv reakci imunitnho systmu [1].

Mikroskopie atomrnch sil (AFM) [2] se ad k modernm mikroskopickm technikm.

V prbhu sv historie se vyvinula ze zobrazovacho k vysoce univerzlnmu nstroji a umouje

sledovn dalch charakteristik zkoumanho systmu. Princip AFM nen sloit. Na prunm

nosnku je umstn ostr hrot, kter pi piblen k povrchu s nm zane silov interagovat. Mezi

hlavn interakce pat van der Waalsovy, coulombick a kapilrn sly. Na zklad tchto

interakc dojde k prohnut nosnku, co je detekovno prostednictvm optickho systmu.

Nsledn dojde k potaem zen rekonstrukci a vytvoen topografickho obrazu s velmi

vysokm rozlienm. Rozlien dosahuje 0,1 nm vertikln a 1 nm horizontln.

Silov spektroskopie je velkou aplikan oblast AFM. Jedn se o men silovch interakc

mezi vzorkem a ostrm hrotem. Zkladem men je nanoindentace, kdy ve zvolenm mst je

hrot vtlaen do vzorku a je zaznamenno prohnut nosnku. Takto vznikl kivka, F-d kivka, je

dle analyzovna a na jejm zklad jsou ureny hledan parametry, nap. Youngv modul

prunosti, nespecifick adhezn sly nebo disipan energie.

Vztah mezi vnjm prostedm a cytoskeletrnm systmem se odr v mechanickch

vlastnostech bunk. Cytoskeleton se skld z nkolika hlavnch skupin protein: mikrofilament,

intermediln filament a mikrotubul. Podl se na mnoha ivotn dleitch funkcch, jako je

adheze, bunn dlen, migrace i diferenciace. Zmna tchto struktur me slouit jako

patofyziologick marker [3].

Materil a metody V tto prci byla pouita bunn linie HeLa. 10

5 bunk bylo kultivovno v mdiu DMEM

(Dubleccos Eagle Medium) s 10 % FBS (Fetal Bovine Serum), 200 mM L-glutaminem a 0,4 %

antibiotiky (penicilin/streptomycin) v Petriho miskch se sklennm dnem (Will-Co).

Inkubovny byly ve standartnch podmnkch s 5% CO2 pi 37C.

Pro navozen fotodynamickho jevu byly buky po dobu 24 h kultivovny s nov

syntetizovanm fotosenzitizrem MgTPPS4 o koncentraci 10 M a 0 M jako kontrola. Pot byly

ozeny zdrojem svtla s maximem emise pi vlnov dlce 414 nm po dobu nezbytnou k dosaen

celkov dvky ozen 5 J/cm2. Nsledn byly buky kultivovny dalch 20 h v erstvm mdiu.

Kontroln buky a buky po PDT byly zobrazovny prostednictvm mikroskopu atomrnch

sil Bioscope Catalyst (Bruker) za pouit zobrazovacho mdu PeakForce QNM se skenovac

rychlost 0,2 Hz. Byl pouit hrot DNP 10 s rezonann frekvenc 16 28 kHz a nominln

konstantou tuhosti 0,12 N/m. Pro zjistn Youngova modulu prunosti byly vyhodnocovny Fd kivky (Force vs distance curves) namen ve Force Volume mdu s rychlost 5,58 Hz. K

fitovn Fd kivek byl pouit Sneddonv model:

( ) 222

tan1

EF

=

kde je polovin vrcholov hel hrotu, E je Youngv modul, je Poissonv pomr a je

deformace buky. Pro buky je Poissonv pomr volen 0,5. AFM obrazy byly zpracovny

programem Gwyddion 2.34 a silov kivky byly analyzovny prostednictvm SPIP 6.0.10.

Pro fluorescenn znaen byly buky fixovny 4% paraformaldehydem a nsledn

permeabilizovny 0,1% Tritonem X-100. Znaen F-aktinu bylo provedeno pomoc fluorecenn

barvy Alexa Fluor 532 Phalloidin. Zobrazen probhalo na systmu Axio Observer Z1 (Zeiss),

vybavenm spinning diskem Yokogawa CSU X1, a objektivem 63x/1.4 N.A.

Vsledky a diskuse V tto prci jsme zkoumali vliv novho porfyrinovho senzitizru MgTPPS4. K evaluaci

zmn vyvolanch fotodynamickou terapi jsme pouili fluorescenn konfokln mikroskopii

a mikroskopii atomrnch sil. Metaloporfyriny s centrlnm iontem Mg jsou charakterizovny

vymi kvantovmi vtky singletnho kyslku a del dobou excitovanho tripletnho stavu [4].

Lokalizace fotosenzitizru uvnit buky je dleitm faktorem, nebo ivotnost singletnho

kyslku je krtk a difze tohoto radiklu nepesahuje vzdlenost 20 nm [5].

Morfologick parametry meme pout ke zhodnocen stavu bunk, podobn jako Jin

a kol. [6], kdy posuzovali zmny tvaru erytrocyt zpsoben nemoc a stm. Obrzek 1

pedstavuje 2D (A) a 3D (B) reprezentaci vkovho kanlu AFM pi men bunn linie

HeLa. Prostednictvm AFM meme vyhodnocovat topografick parametry a jejich zmny.

Vka bunk po fotodynamick terapii je statisticky signifikantn vy oproti kontrolnm

bukm.

Mechanick vlastnosti pat mezi hlavn charakteristiky stavu bunk a tkn. Jsou primrn

ureny systmem cytoskeletrnch protein a interakc s vnjm prostedm. PDT krom

jednotlivch organel tak psob na cytoskelet. Na obrzku 3 meme sledovat reorganizaci

jednoho z hlavnch cytoskeletrnch protein F-aktinu. Aktinov filamenta se pevn nalzaj

v perifrich pod bunnou membrnou a G-aktin je rozprosten v cytoplazm a v okol jdra. Po

PDT se rapidn sniuje zastoupen cytoplazmatickho G-aktinu, piem F-aktin je zasaen

z potku nepatrn [7]. Zmny mechanickch vlastnost souvis se zmnou cytoskeletrnch

protein, zejmna s aktinovmi mikrofilamenty. Rotsch a Radmacher [8] vystavili buky ltkm

ovlivujc polymerizaci mikrofilament a mikrotubul, a zjistili, e rozruen aktinovch vlken

m vliv na pokles Youngova modulu, kdeto mikrotubuly nevykazuj vraznj efekt na zmnu

elasticity. Ndorov HeLa buky podroben PDT vykazuj statisticky signifikantn vy

Youngv modul prunosti oproti bukm, kter PDT vystaveny nebyly.

Obrzek 1. 2D (A) a 3D (B) reprezentace vkovho kanlu AFM Bioscope Catalyst, snmno skenovac rychlost 0,2 Hz, velikost skenu 85 85 m, rozlien 256256, hrot DPN s nominln

konstantou tuhosti k = 0.12 N/m.

Obrzek 2. Zmna distribuce aktinu ped (A) a po (B) PDT, znaeno fluorescenn barvou Alexa Fluor 532 Phalloidin.

Zvr Cytoskelet hraje dleitou roli pi mnoha funkcch, jako je pohyb, adheze, bunn dlen

nebo strukturln integrita. Zmny v cytoskeletrnm systmu vedou ke zmnm mechanickch

vlastnost, kter mohou slouit jako indiktor zmn zpsobench rakovinou. Nae prce se

B A

A B

zamila na zmny zpsoben novm porfyrinovm senzitizrem MgTPPS4, a byla potvrzena

jeho innost.

Podkovn

Prce vznikla za podpory projektu LF_2015_008 a NPU I LO1304.

Literatura [1.] AGOSTINIS, P., BERG, K., CENGEL, K. A., FOSTER, T. H., GIROTTI, A. W.,

GOLLNICK, S. O., HAHN, S. M., HAMBLIN, M. R., JUZENIENE, A., KESSEL, D.,

KORBELIK, M., MOAN, J., MROZ, P., NOWIS, D., PIETTE, J., WILSON, B. C., GOLAB, J.

Photodynamic therapy of cancer: An update. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2011, ro. 61, s. 250-281.

[2.] BINNIG, G., QUATE, C. F. Atomic force microscope. Physical Review Letters, 1986, ro. 56, s. 930-933.

[3.] BERQUAND, A., HOLLOSCHI, A., TRENDELENBURG, M., KIOSCHIS, P. Analysis of cytoskeleton-destabilizing agents by optimized optical navigation and AFM froce measurements. Microscopy Today, 2010, ro. 18, s. 34-37.

[4.] KUBAT, P., MOSINGER, J. Photophysical properties of metal complexes of meso-tetrakis(4-sulphonatophenyl) porphyrin. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 1996, vol. 96, s. 93-97.

[5.] TSAI J. C., WU C. L., CHIEN H. F., CHEN C. T. Reorganization of cytoskeleton induced by 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic therapy and its correlation with mitochondrial dysfunction. Lasers in Surgery and Medicine, 2005, ro. 36, s. 398-408. [6.] JIN, H., XING, X., ZHAO, H., CHEN, Y., HUANG, X. et al. Detection of erythrocytes influenced by aging and type 2 diabetes using atomic force microscope. Bichemical and Biophysical Research Communications, 2010, ro. 391, s. 1698-1702.

[7.] LIU, T., WU, L. Y., BERKMAN, C. E. Prostate-specific membrane antigen-targeted photodynamic therapy induces rapid cytoskeletal disruption. Cancer Letters, 2010, ro. 296, s. 106-112.

[8.] ROTSCH, C., RADMACHER, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: An atomic force microscopy study. Biophysical Journal, 2000, ro. 78, s. 520-535.

Abstract

Porphyrins are important group in photodynamic therapy (PDT). Its photophysical properties are

significantly affected by a central ion. In this work, we focused on an impact of newly synthetised

photosensitizer MgTPPS4 on HeLa cell line. Atomic force microscopy and confocal microscopy were

used to quantify and qualify structural characteristic before and after PDT. We observed statistically

significant changes in morphology and mechanical properties of HeLa cells.