VILNIAUS UNIVERSITETAS VITA KIRILIAUSKAITĖ ...8739430/8739430.pdf · Dr. Vida Bendikienė...

VILNIAUS UNIVERSITETAS

VITA KIRILIAUSKAITĖ

BIOTECHNOLOGINĖS PASKIRTIES LIPAZIŲ TAIKYMO IŠPLĖSTINIS TYRIMAS

Daktaro disertacija

Fiziniai mokslai, biochemija (04 P)

Vilnius, 2015 metai

2

Disertacija rengta 2010 – 2014 metais Vilniaus universiteto Gamtos mokslų fakulteto

Biochemijos ir molekulinės biologijos katedroje.

Moksliniai vadovai:

Prof. habil. dr. Benediktas Juodka (Vilniaus universitetas, fiziniai mokslai, biochemija –

04 P). Nuo 2010 10 01 iki 2012 12 27;

Dr. Vida Bendikienė (Vilniaus universitetas, fiziniai mokslai, biochemija – 04 P). Nuo

2012 12 28 iki 2014 09 30.

3

TURINYS

Santrumpų sąrašas............................................................................................................................4

Įvadas................................................................................................................................................5

1 Literatūros apžvalga....................................................................................................................8

1.1 Bendra lipazių charakteristika: šaltiniai, struktūra, stabilumas, komercinės lipazės..............8 1.2 Katalizinės lipazių savybės...................................................................................................20 1.3 Lipazių savitumas..................................................................................................................27 1.4 Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos......................................................................32 1.5 Lipazių biotechnologinio pritaikymo galimybės..................................................................37 1.6 Biodyzelinas..........................................................................................................................41 1.7 Lipolizinio aktyvumo nustatymo metodai............................................................................64

2 Medžiagos ir metodai................................................................................................................66

2.1 Medžiagos.............................................................................................................................66 2.2 Baltymų kiekio nustatymas...................................................................................................68 2.3 Lipolizinio aktyvumo nustatymas.........................................................................................68 2.4 Kiekybinis laisvų riebalų rūgščių nustatymas titrimetrija.....................................................69 2.5 Plonasluoksnė chromatografija ir densitometrija..................................................................69 2.6 Biodyzelino sintezė ..............................................................................................................70 2.7 Oleino rūgšties ir trimetilolpropano esterių – biotepalų - sintezė ........................................72 2.8 β-Citronelolio esterių sintezė................................................................................................72 2.9 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas......................73 2.10 Muilo gamybos atliekų utilizavimo tyrimas.......................................................................73

3 Rezultatai ir jų aptarimas...........................................................................................................75

3.1 Biodyzelino sintezė: rapsų aliejaus transesterinimas............................................................77 3.1.1 Lipoprime 50T katalizuojamo rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu optimalių sąlygų nustatymas....................................................................................................................78 3.1.2 Lipolase 100L katalizuojamas rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu bei metil- ir butilacetatais.........................................................................................................................88 3.1.3 Ektoino įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai.........................................91 3.1.4 Naujų organinių tirpiklių - glikolio eterių - įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai.........................................................................................................................97

3.2 Biotepalų sintezė: reakcijos, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas ......................103 3.3 Įvairių biotechnologijai svarbių esterių sintezė...................................................................111

3.3.1 Skirtingų aliejų transesterinimas β-citroneloliu............................................................111 3.3.2 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas.............118

3.4 Lipazių tinkamumo riebalinių atliekų (pamuilių) utilizavimui tyrimas..............................124 3.4.1 Pamuilių cheminės sudėties analizė..............................................................................125 3.4.2 Pamuilių, kaip potencialios biodyzelino žaliavos, transesterinant bei esterinant jas atitinkamais alkoholiais, panaudojimo tyrimas......................................................................126

Išvados..........................................................................................................................................133

Publikacijos disertacijos tema......................................................................................................134

Padėka...........................................................................................................................................136

Literatūra......................................................................................................................................137

4

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

AA – alyvuogių aliejus

BE – butilo esteriai

CALB – Candida antarctica lipazė B

DA – dagių aliejus

DAG – diacilglicerolis (-iai)

DO – dioleilglicerolis (dioleinas)

FSP – fazių sąlyčio paviršius

JA – judrų aliejus

KA – kokosų aliejus

KS – kakavos sviestas

LE – 3,7-dimetil-1,6-oktadien-3-olio

(linalolio) esteris

LSA – linų sėmenų aliejus

MAG – monoacilglicerolis (-iai)

ME – metilo esteriai

MetOH – metilo alkoholis (metanolis)

MO – oleino rūgšties metilo esteris

(metiloleatas)

OA – cis-9-oktadeceno (oleilo) alkoholis

OR – cis-9-oktadeceno (C18:1, oleino)

rūgštis

PAM – paviršiaus aktyvios medžiagos

p-NPB – butano rūgšties p-nitrofenilo

esteris (p-nitrofenilbutiratas)

p-NPP – palmitino rūgšties p-nitrofenilo

esteris (p-nitrofenilpalmitatas)

RA – rapsų aliejus

RiA – ricinų aliejus

RLA – ryžių luobelių aliejus

RR – riebalų rūgštis (-ys)

SA – saulėgrąžų aliejus

TAG – triacilglicerolis (-iai)

TLC – plonasluoksnė chromatografija

(thin-layer chromatography)

TMP – 2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-

1,3-diolis (2-etil-2-hidroksimetil-1,3-

propandiolis, trimetilolpropanas)

TMP-DO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir

2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-1,3-diolio

diesteris (trimetilolpropano dioleinas)

TMP-MO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir


monoesteris (trimetilolpropano

monooleinas)

TMP-TO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir


triesteris (trimetilolpropano trioleinas)

TO – trioleilglicerolis (trioleinas)

UB – universalus buferis

VSA – vynuogių sėklų aliejus

5

ĮVADAS

Įvairių kasdien naudojamų produktų, tokių kaip popierius, tekstilė, maistas,

pašarai, kuras, cheminės ir vaistinės medžiagos, gamybos metu ne tik sunaudojamas

didelis kiekis žaliavų bei energijos, bet ir susidaro daug skirtingos kilmės atliekų,

darančių neigiamą įtaką aplinkai ir gyvenimo kokybei. Pasaulinės žmonių populiacijos

augimas bei ekonomikos vystymasis skatina vartojimo augimą ir tuo pačiu didina

įprastomis cheminėmis technologijomis besinaudojančios pramonės daromą žalą

aplinkai. Todėl įvairioms pramonės šakoms ieškoma alternatyvių technologijų, leisiančių

patenkinti augančius visuomenės poreikius, sunaudojant mažesnį kiekį žaliavų ir kaip

įmanoma labiau sumažinant aplinkos taršos problemas.

Pramoninė biotechnologija yra šiuo metu vienas sparčiausiai augančių, didžiulį

potencialą turinčių pramonės sektorių ne tik Europoje, bet ir visame pasaulyje,

naudojantis skirtingus biotechnologinius metodus, gaminant įvairius produktus.

Pagrindinis tikslas yra laipsniškas naftos pakeitimas atsinaujinančiomis augalinės kilmės

žaliavomis, mat pramoninių biotechnologijų plėtrą skatina ne tik įvairios ekologinės

problemos - didėjanti aplinkos tarša, šiltnamio efektas, - bet ir naftos išteklių ribotumas.

Vienas pagrindinių biotechnologinės gamybos įrankių – fermentai – biologiniai

katalizatoriai, - kurių pritaikymo galimybės, atrodo, bent jau kol kas neturi ribų. Lipazės

(triacilglicerolacilhidrolazės, EC 3.1.1.3.) dėl savo įvairiapusiškumo yra vieni labiausiai

tyrinėjamų ir įvairių junginių sintezei naudojamų hidrolizinių fermentų, jau seniai

neapleidžiančių savo pozicijų biokatalizatorių pasaulio populiarumo aukštumose. Lipazių

fiziologinė funkcija susijusi su lipidų apykaita, tačiau, priklausomai nuo reakcijos sąlygų,

jos gali katalizuoti ir įvairias biotechnologijai svarbias reakcijas: esterių sintezę,

aminolizę, epoksidaciją, laktonizaciją, polimerizaciją ir kt.

Seniai žinoma, kad, palyginus su įprasta tradicine chemine katalize, fermentinei

sintezei būdingi esminiai pranašumai: švelnios vykdomų reakcijų sąlygos, aukšto lygio

substratinis savitumas, šalutinių reakcijų nebuvimas, ekologiškumas, netoksiškumas,

neretai gaunami ir aukštesnės kokybės produktai. Tokių bioprocesų taikymas, gaminant

įvairius kasdieniam naudojimui tinkamus bioproduktus, galėtų užtikrinti tvarų

ekonomikos vystymąsi – dėl didėjančios žmonių populiacijos augančių vartojimo

poreikių patenkinimą, nedarant žalos aplinkai.

6

Kita vertus, siekiant gauti optimalias pageidaujamų produktų išeigas, neretai

reikia naudoti didelius fermentų kiekius, tačiau paprastai po keleto reakcijų ciklų

nustatomas biokatalizatoriaus aktyvumo sumažėjimas. Be to, dažnai susiduriama ir su

fermentų slopinimo reakcijos mišinio komponentais problemomis, patys fermentiniai

procesai trunka santykinai ilgai, o visa tai yra ekonomiškai nepalanku. Todėl, norint

sumažinti tokios gamybos kaštus, būtina ne tik optimalių sąlygų paieška, bet ir tinkamo

fermento parinkimas, kiekvieno biokatalizatoriaus savitumo ir aktyvumo įvertinimas

skirtingų substratų, reakcijų tipo bei sąlygų atžvilgiu individualiai. Todėl disertacinio

darbo metu ir buvo tiriamas pasirinktų iki šiol mažai tyrinėtų lipazių savitumas bei

aktyvumas, katalizuojant skirtingomis sąlygomis vykdomas biotechnologijai svarbias

reakcijas, susidarant produktams, be kurių mūsų kasdienybė šiuo metu neįsivaizduojama

– biodyzelinui, biotepalams, įvairios paskirties esteriams.

Šio darbo tikslas buvo ištirti komercinių lipolizinių fermentų taikymo, sintetinant

įvairius biotechnologijai svarbius esterius, galimybes.

Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai:

1. Įvertinti įvairių reakcijos sąlygų įtaką komercinių lipazių katalizuojamos

biodyzelino sintezės produktyvumui.

2. Ištirti komercinių lipolizinių fermentų gebą katalizuoti sudėtingų esterių –

biotepalų - sintezę, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas.

3. Atrinkti naujus lipazių katalizuojamoms vertingų esterių sintezės reakcijoms

tinkamus substratus bei įvertinti įvairių sąlygų įtaką susidarančių produktų

išeigoms.

4. Ištirti muilo gamybos riebalinių atliekų – pamuilių – utilizavimo galimybes, jas

fermentiškai esterinant/transesterinant.

7

Mokslinis naujumas

Nors fermentinė biodyzelino gamyba nėra nauja tyrimų sritis, tačiau, kadangi,

kaip žinoma, skirtingų fermentų katalizuojamų reakcijų optimalios sąlygos gali drastiškai

skirtis, kiekvienas naujas fermentas turi būti ištirtas atskirai, tad šiame darbe pirmą kartą

taip išsamiai tirta komercinio preparato Lipoprime 50T katalizuojama rapsų aliejaus

transesterinimo metanoliu reakcija. Be to, įvertinta ir neseniai lipazių katalizuojamoms

reakcijoms pradėto naudoti priedo – ektoino – bei naujų perspektyvių tirpiklių – glikolio

eterių - įtaka įvairių šiuo atžvilgiu netirtų komercinių lipazių preparatų aktyvumui.

Biotepalų sintezės reakcijos, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas,

paprastai vykdomos sumažinto slėgio sąlygomis, naudojant ypač didelius fermento

kiekius. Tuo tarpu šiame darbe atlikti tyrimai, siekiant optimizuoti procesą bei pritaikyti

jį pramoninei biotepalų gamybai, nenaudojant jokios sudėtingos įrangos bei sumažinus

reikalingą fermento kiekį.

Iki šiol nebuvo atlikta darbe vykdyta įvairių aliejų atranka, transesterinant juos

terpenoliais - β-citroneloliu bei geranioliu - susidarant vertingiems biotechnologijoje

naudojamiems esteriams. Tyrimų metu fermentiniu būdu gautas glutaro rūgšties ir β-

citronelolio diesteris, kurio detalių sintezės tyrimų literatūroje neaptikta, o visi galimi

sudėtingi cheminiai procesai patentuojami. Be to, įvertinus β-citronelolio ir oleilo

alkoholio įtaką atrinktų organinių rūgščių esterinimo eigai, pirmą kartą nustatyta, kad šių

reakcijų metu gaunamas skirtingas produktų skaičius, kuris kinta ir naudojant skirtingus

komercinius lipolizinius fermentus.

Darbo metu atlikti ir nauji riebalinių atliekų panaudojimo tyrimai: Lietuvos

įmonėje (AB“Naujoji Ringuva“) susidarančių muilo gamybos atliekų – pamuilių -

fermentinio esterinimo/transesterinimo, susidarant įvairiems RR esteriams, kaip

efektyvaus pamuilių utilizavimo būdo, įvertinimas.

8

1 LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Bendra lipazių charakteristika: šaltiniai, struktūra, stabilumas, komercinės lipazės

Aplinkos apsaugos įstatymai, konkurencingumas ir augantis socialinis

atsakingumas skatina įvairias pramonės sritis ieškoti tradiciniams cheminiams metodams

alternatyvių, aplinkai saugesnių, ekonomiškesnių bei tvaresnių procesų. Todėl vis

daugiau dėmesio sulaukia įvairūs, taip vadinami, žalieji cheminiai vyksmai [1], iš kurių

labai svarbi yra biokatalizė [2], pasižyminti ypatingu savitumu, atrankumu bei švelniomis

reakcijų sąlygomis [3].

Fermentai – biologinėse sistemose vykstančių reakcijų katalizatoriai,

sumažinantys tų reakcijų eigai reikalingą aktyvacijos energijos kiekį ir taip didinantys

reakcijų greitį, bet nekeičiantys jų pusiausvyros. Reakcijų metu patys fermentai nei

sunaudojami, nei pagaminami [4]. Atsižvelgiant į katalizuojamos cheminės reakcijos

prigimtį, fermentai skirstomi į šešias klases: oksidoreduktazių, transferazių, hidrolazių,

liazių, izomerazių ir ligazių [5].

Vienai gausiausių klasių – hidrolazėms - priskiriami įvairius junginius

hidrolizuojantys biokatalizatoriai, sudarantys 75 % pasaulinio komercinių fermentų

gamybos kiekio [6]. Esterazių - fermentų, hidrolizuojančių esterines jungtis tarp

alkoholio ir karboksirūgšties, grupei priskiriamos ir lipazės, kurios pagal tarptautinę

klasifikacijos sistemą vadinamos glicerolio esterių hidrolazėmis arba

triacilglicerolacilhidrolazėmis (EC 3.1.1.3.). Lipazės yra vieni labiausiai tyrinėjamų ir

įvairių junginių sintezei naudojamų hidrolizinių fermentų [7, 8], kurių fiziologinė

funkcija susijusi su lipidų apykaita [9], tačiau, priklausomai nuo reakcijos sąlygų, lipazės

gali katalizuoti ne tik lipidų hidrolizės, bet ir įvairių esterių sintezės, aminolizės,

peroksidacijos, epoksidacijos, laktonizacijos, polimerizacijos ir kt. reakcijas [10-13].

Lipazėmis ypatingai domimasi dėl jų pritaikymo galimybės biotechnologijoje,

nes, kontroliuojant įvairius šių fermentų katalizuojamų procesų parametrus, galima gauti

didelę produktų išeigą. Lipoliziniams fermentams būdingas platus substratinis savitumas

[14], didelis enantioatrankumas [15], stabilumas organiniuose tirpikliuose, o jų veikimui

nereikalingi kofaktoriai. Dėl šių savybių lipazės naudojamos įvairių substratų hidrolizei

arba sintezei. Teigiama, kad iš visų žinomų fermentų, būtent lipazėms būdinga didžiausia

9

skirtingų substratų bei katalizuojamų reakcijų įvairovė. Lipoliziniai fermentai yra plačiai

taikomi maisto, farmacijos, odos, kosmetikos, tekstilės, popieriaus ir detergentų

pramonėse, sintetinat medikamentus, vertingas chemines medžiagas, maisto

sudedamąsias dalis [16-18], biotepalus [19], biodyzeliną [20-24] ir kt.

1.1.1 Šaltiniai

Nors lipazės plačiai paplitusios gamtoje ir yra sintetinamos daugelio

mikroorganizmų bei aukštesniųjų eukariotų, bet gausiausiai šie fermentai visgi randami

mikrobiologinėje floroje: bakterijose, grybuose, mielėse [25]. Lipazes sintetinančių

mikroorganizmų galima aptikti įvairioje aliejingoje/riebalingoje aplinkoje: pramoninėse

atliekose, aliejų gaminančiose įmonėse, pieninėse, riebalais užterštoje dirvoje, aliejinių

augalų sėklose, pūvančiame maiste [26, 27], taip pat komposto dėžėse ir net karštosiose

versmėse [28]. Būtent iš mikroorganizmų išskirtos lipazės yra komerciniu atžvilgiu

patraukliausi fermentai, kuriems teikiama pirmenybė biotechnologijoje dėl jų katalizinių

aktyvumų įvairovės, ypatingo stabilumo, esant aukštoms temperatūroms bei organiniams

tirpikliams, atrankumo, plataus substratinio savitumo, greitesnio, saugesnio ir pigesnio

išgavimo būdo, lengvesnių genetinių manipuliacijų [6, 29, 30].

Bakterinės lipazės pirmą kartą aptiktos 1901 m., sintetinamos tokių

mikroorganizmų kaip Bacillus prodigiosus, B. pyocyaneus, ir B. fluorescens. Šiuo metu

jie yra vieni geriausiai ištirtų lipazių producentų, dabar atitinkamai vadinamų Serratia

marcescens, Pseudomonas aeruginosa ir P. fluorescens. Lipazės skiriasi savo

lokalizacija: gali būti viduląstelinės arba sekretuojamos, visgi dažniausiai jos yra

sekretuojami (užląsteliniai) fermentai, išskiriami tiek gramteigiamų (Staphylococcus,

Bacillus, Streptomyces), tiek gramneigiamų (Pseudomonas, Chrommobacterium)

bakterijų. Lipazių sintezei įtakos turi įvairūs mitybiniai ir fiziologiniai veiksniai: terpės

pH (daugeliu atveju lipazės efektyviausiai sintetinamos, kai pH > 7,0), temperatūra bei

ištirpusio deguonies koncentracija, anglies ir azoto šaltiniai, lipidai, neorganinės druskos

ir augimo fazė, tačiau svarbiausias veiksnys yra anglies šaltinis [31]. Lipazės paprastai

yra indukuojami fermentai, sintetinami esant aliejui (triacilgliceroliams (TAG)), riebalų

rūgštims (RR), hidrolizuojamiems esteriams, detergentams, tulžies druskoms ar

gliceroliui. Kita vertus, jų gamybą gali skatinti ir kitokios prigimties anglies šaltiniai:

10

cukrai, polioliai, kazaminorūgštys [32]. Nustatyta, kad nejoninių detergentų naudojimas

taip pat skatina užląstelininių lipazių gamybą dviem mechanizmais: dėl į substratus

panašios savo cheminės prigimties jie gali veikti kaip sintezės induktoriai arba tiesiog

kaip lipazių sekreciją stimuliuojančios paviršiaus aktyvios medžiagos (PAM) [33].

Lipazės į kultūrinę terpę paprastai sekretuojamos, bakterijoms pasiekus

eksponentinio augimo fazės pabaigą. Galimá kiekvienos lipolizinių fermentų sintezės ir

sekrecijos stadijos reguliacija, pradedant lipazės struktūrinių genų transkripcija,

atitinkamų mRNR transliacija ir baigiant baltymo sekrecija per vidinę ir išorinę

membranas [34].

Lipoliziniai fermentai taip pat aptinkami žinduolių (žmogaus, kiaulės, šuns)

kasoje bei aukštesniuosiuose augaluose, tačiau iš augalų išskirtos lipazės komerciškai

nenaudojamos dėl mažo jų aktyvumo, o gyvūninės kilmės lipazės negali būti taikomos

vegetariškų maisto produktų gamyboje, be to, gali turėti likusių gyvūnų hormonų ar

virusų [5]. Pastaruoju metu didesnio dėmesio sulaukia iš žuvų išskirtos lipazės [35].

1.1.2 Struktūra

Pirmoji rentgeno kristalografinės analizės būdu nustatyta struktūra buvo lipazės,

išskirtos iš Rhizomucor miehei [36]. Vėliau nustatytos ir kitų pagrindinių lipazių

struktūros, įskaitant Bacillus thermocatenulatus, Candida antarctica, Pseudomonas

cepacia (struktūra pavaizduota 1.1 paveiksle), Bacillus subtilis [37-41] ir kt.

Trimatę lipazių struktūrą sudaro trys domenai: substrato paviršių atpažįstantis

kontaktinis domenas, vieną substrato molekulę atskiriantis ir užtikrinantis jos sąveiką su

kataliziniu centru hidrofobinis domenas bei katalizinę triadą, sudarytą iš Ser, His ir

Asp/Glu liekanų, turintis funkcinis domenas [42]. Visos lipazės, kurių erdvinė struktūra

yra žinoma, priklauso α/β struktūrinio tipo hidrolazių šeimai. Tokiems fermentams

būdinga iš lygiagrečių β klosčių sudaryta šerdis, kurią supa α spiralės [43-45].

11

A kilpa

stogelis

B

1.1 pav. Burkholderia cepacia (dabar Pseudomonas cepacia) lipazės tretinė (A) ir antrinė (B) struktūros [41]. A: stogelio sritis - 118-159 aminorūgštys (α4-kilpa-α5), katalizinė triada (S87, D264, H286) pavaizduota raudonais apskritimais. B: α spiralės ir β klostės pažymėtos stačiakampiais ir rodyklėmis, atitinkamai.

Lipazių aktyvusis centras yra sudarytas iš serino proteazėms būdingos katalizinės

triados – Ser, His ir Asp/Glu aminorūgščių [36, 46]. Nors lipazių ir proteazių aktyvieji

centrai yra chemiškai panašūs, tačiau dėl skirtingos Ser hidroksigrupės orientacijos jų

struktūra skiriasi, ir todėl lipazių katalizinei triadai būdinga invertuota stereochemija

(reakcijos metu lipazių katalizinė triada atakuojamos jungties atžvilgiu išsidėsto

priešingai negu serino proteazių triada) [36, 46, 47]. Lipazių aktyviojo centro

12

nukleofilinė Ser liekana yra plaukų segtuko struktūros linkyje, tarp β klostės ir α spiralės

ypatingai konservatyviame pentapeptide (Gly-X-Ser-X-Gly); taip suformuojamas

būdingas β-linkis-α motyvas, vadinamas nukleofiline alkūne [44, 45]. Yra ir išimčių,

pavyzdžiui, žinoma, kad Candida antarctica lipazė B (CALB) tokios konservatyvios

pentapeptido sekos neturi [48].

Atsižvelgiant į aktyvaus centro geometriją, lipazės skirstomos į tris pogrupius: i)

lipazės, kurioms būdingas hidrofobinis siauro plyšio formos netoli baltymo paviršiaus

išsidėstęs aktyvusis centras (Rhizomucor ir Rhizopus lipazės); ii) lipazės, kurioms

būdingas piltuvo formos aktyvusis centras (C. antarctica, Pseudomonas ir žinduolių

kasos lipazės) ir iii) lipazės, kurioms būdingas tunelio formos aktyvusis centras (Candida

rugosa lipazė) [49].

1.1.2.1 Stogelis

Daugumos fermentų aktyvusis centras lokalizuotas molekulės paviršiuje, todėl

laisvai prieinamas substratui ir tirpikliui, tačiau lipazių atveju yra kitaip. Daugelio lipazių

ypatybė yra ta, kad jų aktyvusis centras yra uždengtas „stogeliu“ (toliau – stogeliu)

vadinama struktūra, sudaryta iš amfifilinės α spiralės peptidinės sekos [50]. Skirtingoms

lipazėms būdingas įvairus stogelio dydis, pvz., Geobacillus thermocatenulatus lipazės

stogelis yra kompleksinė struktūra, kurią sudaro didelė dalis fermento aminorūgščių,

formuojančių dvigubo stogelio struktūrą [51], tuo tarpu CALB būdingas labai mažas ir

paprastas stogelis, kuris visiškai neizoliuoja fermento aktyvaus centro net ir esant uždarai

jo būsenai [48]. Vienas mažiausių nustatytų stogelių (sudarytas tik iš penkių

aminorūgščių) būdingas iš jūrų kiaulytės išskirtai lipazei [52]. Todėl ir CALB, ir iš jūros

kiaulytės išskirtai lipazei nebūdinga toliau tekste aptarta lipazių aktyvacija fazių sąlyčio

paviršiumi (FSP), susijusi su stogelio poslinkiais bei atitinkamais fermento struktūros

konformaciniais pokyčiais [50, 53]. Kita vertus, yra turinčių stogelį lipazių, kurioms

aktyvacija FSP būdinga tik kai kurių substratų atžvilgiu, pvz., lipazėms, išskirtoms iš

Pseudomonas glumae [54], P. aeruginosa [55], nutrijos kasos [56] ir Staphylococcus

hyicus [57].

Kadangi lipazių katalizuojama reakcija vyksta dviejų fazių (vandens-lipidų)

sąlyčio riboje, buvo pastebėta, kad fermentui adsorbuojantis ant FSP, vyksta su stogelio

13

poslinkiais susiję fermento struktūros konformaciniai pokyčiai (1.2 pav.), nulemiantys

oksianijono plyšio orientaciją bei fermento hidrofobiškumo padidėjimą, - struktūros

ypatybes, reikalingas sąveikaujant su hidrofobiniais substratais [25, 58-60].

1.2 pav. Thermomyces lanuginosus lipazės dviejų konformacinių formų trimatės struktūros [16].

Lipazių struktūra gali būti dviejų konformacinių formų: uždarosios (neaktyvios)

ir atvirosios (aktyvios) (1.2 pav.). Uždaroji forma dominuoja vandeninėje terpėje, todėl,

nesant FSP, lipolizinis aktyvumas yra minimalus. Šios būsenos fermento aktyvusis

centras yra laisvas, nes nuo tirpiklio jį skiria stogelis. Stogelio ir likusios molekulės

dalies sąveika yra komplementari, išskyrus arti Ser liekanos esančią sritį, kur po stogeliu

susidaro ertmė, kurioje yra nedidelis kiekis vandens. Uždaros formos lipazių išorinis

paviršius yra hidrofilinis [61]. Pasislinkus stogeliui, aktyvusis centras tampa prieinamas

substratui, susidaro atviroji fermento forma. Įvykus šiems konformaciniams pokyčiams,

išorėje susiformuoja didelis hidrofobinis paviršius [25]. Hidrofobiškiausias paviršius

susidaro prie aktyvaus centro Ser liekanos, kuri lieka siauro įdubimo, susidarančio

pasislinkus stogeliui, dugne [48, 51, 54, 61].

Įvairių lipazių konformaciniai struktūros pokyčiai skiriasi, pvz., R. miehei lipazės

atveju įvyksta santykinai paprastas, tik vienos spiralės vyrio tipo, poslinkis [58], tačiau

kitoms lipazėms gali būti būdingi gerokai didesni pokyčiai, apimantys keletą kilpų,

drastiškai keičiančių savo antrines struktūras (1.3 pav.) [62-64].

14

1.3 pav. Lipazių uždaroji (mėlyna spalva) ir atviroji (geltona spalva) stogelio konformacijos [65]. Skrandžio lipazės atveju uždaroji ir atviroji stogelio konformacijos gautos, tiriant žmogaus ir šuns skrandžio lipazes, atitinkamai. Homologiškų bakterinių lipazių, išskirtų iš Pseudomonas sp., uždaroji ir atviroji formos gautos, tiriant P. glumae ir P. Cepacia lipazes, atitinkamai. Homologinių grybinių lipazių, išskirtų iš Geotrichum ir Candida sp., uždaroji ir atviroji konformacijos gautos tiriant G. candidum ir C. rugosa lipazes, atitinkamai. Aktyvaus centro Ser liekana pažymėta raudonai.

1.1.3 Stabilumas organiniuose tirpikliuose bei termostabilumas

Ankstyvaisiais biokatalizės tyrimų metais buvo tikima, kad fermentai aktyvūs tik

vandeninėje aplinkoje, tačiau vėliau atskleisti tokių fermentų kaip lipazės veikimo

ypatumai ir organiniuose tirpikliuose [66]. Nustatyta, kad organinių tirpiklių naudojimas

gali išspręsti prasto substratų bei produktų tirpumo reakcijos mišinyje, žemo atrankumo

ir sudėtingo produktų gryninimo problemas, būdingas vandeninėje aplinkoje

vykstančioms reakcijoms [67]. Taip pat nustatyta, kad nepoliniai tirpikliai yra tinkamesni

už polinius. Kitaip nei nepoliniai, poliniai tirpikliai patraukia vandenį iš fermento

aktyvaus centro, taip sumažindami jo katalizinį aktyvumą [68]. Įprastai lipazių

katalizuojamai esterių sintezei naudojami nepoliniai tirpikliai: n-heksanas, heptanas,

cikloheksanas, izooktanas ir toluenas. Naudojamos ir dvifazės sistemos, pavyzdžiui,

vanduo ir organinis tirpiklis ar du skirtingi organiniai tirpikliai [69].

15

Lipazių katalizuojamų riebalų transesterinimo alkoholiais reakcijų atveju prastas

vieno iš substratų - trumpos grandinės alkoholių - tirpumas aliejuose gali sukelti lipazių

inaktyvaciją. Vienas šios problemos sprendimo būdų - organinių tirpiklių pridėjimas į

reakcijos mišinį. Taip padidinamas lipazės stabilumas bei substratų tirpumas,

sumažinama reakcijos mišinio klampa. Kita vertus, ne visos lipazės yra stabilios

organiniuose tirpikliuose, ir todėl jų aktyvumas tokiose sistemose gali būti ribotas [70].

Lipazių paviršiaus savybės, tokios kaip hidrofobiškumas ir krūvio pasiskirstymas,

yra pagrindiniai veiksniai, nulemiantys lipazių stabilumą organiniuose tirpikliuose [71].

Neseniai nustatyta, kad kilpos, esančios Bacillus subtilis lipazės paviršiuje, nulemia

atsparumą tokiems organiniams tirpikliams kaip dimetilsulfoksidas [72]. Siekiant

užtikrinti lipazių stabilumą organiniuose tirpikliuose, neretai naudojami „kieti“ fermentų

preparatai (liofilizuoti arba imobilizuoti – adsorbuoti inertiško nešiklio), suspenduoti

organiniame tirpiklyje. Biologinė lipazės kilmė, reakcijos tipas (hidrolizė ar sintezė),

substratai – visa tai lemia, koks tirpiklis konkrečiu atveju yra tinkamiausias [73, 74].

Termostabilumo dėka įvairūs bioprocesai gali būti vykdomi, esant aukštesnėms

temperatūroms, taip pasiekiami didesni difuzijos greičiai, geresnis hidrofobinių substratų

tirpumas vandenyje, mažesnė substratų klampa, padidėjęs reagentų tirpumas

(transesterinimo reakcijų atveju padidėja alkoholių tirpumas aliejuose), todėl reakcijos

vyksta greičiau ir gaunamos didesnės produktų išeigos [6]. Kadangi, pakėlus temperatūrą

10oC, reakcijos greitis apytiksliai padvigubėja, daugelis pramoninių fermentų

katalizuojamų procesų įprastai vykdomi esant aukštesnei nei 50oC temperatūrai, tad

temperatūrinis stabilumas yra viena labiausiai pageidaujamų lipazių (kaip ir kitų

fermentų) savybių [75, 76]. Tokiomis savybėmis pasižymi ne tik iš termofilinių ir

hipertermofilinių mikroorganizmų išskirtos lipazės, bet ir iš daugelio kitų šaltinių,

įskaitant P. fluorescens [77], Bacillus sp. [78], B. coagulans ir B. cereus [79].

Lipazių termostabilumas yra neabejotinai susijęs su jų struktūra, ir pagrindiniai jį

nulemiantys veiksniai yra aminorūgščių sudėtis, didesnis druskų tiltelių ir hidrofobinių

sąveikų skaičius, mažesnis baltymo vidinių ertmių dydis, paviršiaus pokyčiai [80]. Labai

didelę įtaką gali turėti ir mutacijos fermento molekulės stogelio srityje [81, 82]. Be to,

termostabilumas priklauso ir nuo įvairių aplinkos veiksnių: pH, metalų jonų ir kt., tačiau

gali būti padidintas imobilizuojant fermentą ir taip pakeičiant jo terminės inaktyvacijos

16

mechanizmą [83] arba keičiant vykdomos reakcijos sąlygas, pvz., parenkant tam tikrus

tirpiklius (joninius skysčius) ir pan.

1.1.3.1 Lipazių imobilizacija – stabilumo didinimo būdas

Viena pagrindinių lipazių naudojimo pramonėje problemų yra santykinai aukšta

fermentų kaina [6]. Ši problema buvo dalinai išspręsta, kai fermentai pradėti imobilizuoti

ant įvairių nešiklių - taip atsirado galimybė juos naudoti keletą kartų, veiksmingiau

kontroliuoti katalizės eigą, produktų kokybę bei išeigą, lengviau atskirti ir gryninti

reakcijų produktus, padidinti fermentų termo- ir cheminį stabilumą [5, 22, 83-86].

Imobilizacijos sėkmė priklauso nuo trijų parametrų: fermento, nešiklio bei

imobilizacijos metodo. Prijungimas prie netirpaus nešiklio stabilizuoja fermento

konformaciją, dažnai padidina termostabilumą ir aktyvumą bevandenėje aplinkoje,

pakeičia temperatūrinį ir pH optimumus bei kitas savybes. Literatūroje aprašyta daug

lipazių imobilizacijos metodų [87], įskaitant adsorbciją ar nusodinimą ant hidrofobinių

medžiagų [88, 89], joninį ir kovalentinį prijungimą prie funkcinių grupių [90, 91],

sulaikymą polimeriniuose geliuose [92], mikroinkapsuliaciją lipidinėse pūslelėse [9],

hidrofobines sąveikas [93] ir kt. Dažniausiai naudojamas adsorbcijos metodas, nes tai yra

paprasta, lengva, santykinai pigi, švelniomis sąlygomis vykdoma procedūra [94, 95].

Plačiai tiriami įvairūs nešikliai - neorganiniai ir organiniai, monomeriniai ir

polimeriniai, natūralūs ir sintetiniai, hidrofobiniai ir hidrofiliniai, pavyzdžiui, nailonas

[96], Amberlite MB-1, diatomitas [97], baltasis asbestas [98] ir daugybė kitų. Nešiklio

pasirinkimas priklauso nuo keleto veiksnių: atsparumo, cheminio patvarumo ir

mechaninio tvirtumo (ilgaamžiškumo), lipazės ir reakcijos sistemos tipo, regeneracijos

lengvumo, kainos ir kt. [22]. Pvz., neorganiniams nešikliams būdingas didesnis cheminis

atsparumas nei organiniams, tačiau pastarieji yra gerokai pigesni, jų taikymas yra

įvairesnis, o savybės yra lengvai modifikuojamos [5].

Literatūroje aprašyta daug lipazių imobilizavimo ant hidrofobinių nešiklių atvejų,

kai siekiama padidinti jų aktyvumą, stabilumą, pagerinti katalizines savybes

(imobilizuojant atviros konformacijos fermentą) [99-104]. Pvz., po adsorbcijos ant

hidrofobinio nešiklio nustatyta Alcaligenes sp. lipazės hiperaktyvacija: imobilizuotai

lipazei buvo būdingas 135 % aktyvumas, palyginus su tirpiu fermentu [104]. Tai susiję

17

su lipazių aktyvacijos FSP fenomenu: fermento aktyvųjį centrą supančios hidrofobinės

aminorūgščių liekanos sąveikauja su hidrofobiniu nešikliu, ir stogelis, dengiantis

fermento aktyvųjį centrą, pasislenka. Tokiu būdu hidrofobinės sąveikos dėka lipazė

tvirtai adsorbuojasi atviroje aktyvioje konformacijoje, ir taip padidinamas jos katalizinis

aktyvumas [105]. Nustatyta, kad tokio pobūdžio aktyvacijos fenomenas gali būti

sukeliamas ne tik hidrofobinių nešiklių, bet ir hidrofobinių baltymų (hidrofobinų) [106]

ar net kitų atviros formos lipazių molekulių [107, 108].

Pastaruoju metu vis daugiau dėmesio sulaukia imobilizacijos ant įvairių

nanomedžiagų metodai, nes tokioms medžiagoms būdingas ypatingai didelis paviršiaus

ploto ir tūrio santykis, o patys metodai nėra sudėtingi. Šiuo metu naudojami nešikliai:

nanodalelės [109], anglies nanovamzdeliai [110], nanoskaidulos, iš kurių gali būti

lengvai nupinamos membranos [111, 112] ir kt.

1.1.4 Komercinės lipazės

1.1.4.1 Thermomyces lanuginosus lipazė

Pirmoji komercinė lipazė pradėta gaminti dar 1988 m. Novo Nordisk (dabar

Novozymes) pristatė genetiškai modifikuoto (su perkelta T. lanuginosus lipazės seka)

Aspergillus oryzae mikroorganizmo sintetinamą, detergentų pramonei skirtą lipazę

komerciniu pavadinimu Lipolase [16, 18]. Optimalios šios lipazės veikimo sąlygos: pH

10 - 11,5, 40oC temperatūra. Fermentas pasižymi stabilumu proteolizininių fermentų

turinčiuose plovimo tirpaluose, atsparumu įvairioms paviršiaus aktyvioms medžiagoms

bei plačiu substratiniu savitumu. Vėliau Novozymes pradėjo gaminti ir kitus šio

fermento komercinius preparatus: skystos formos LipolaseUltra, Lipex, LipoPrime,

Lipozyme TL 100L ir imobilizuotus Lipozyme TL IM, Lipolase 100T ir Lipex

100T. Nors iš pradžių komerciniai preparatai daugiausia buvo skirti detergentų

priedams bei maisto pramonei, vėliau pradėti taikyti ir daugelyje kitų pramonės sričių,

pradedant biodyzelino gamyba bei baigiant vertingų junginių sinteze (paprastai enantio-

ar regioatrankių procesų metu) [16].

Thermomyces lanuginosus (anksčiau vadinta Humicola lanuginosus) lipazė yra

grybinės kilmės bazofilinis, pakankamai termostabilus (išlaiko aktyvumą, esant 55 -

60oC), 1,3-savitas fermentas, sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės, susidedančios

18

iš 269 aminorūgščių, jo molekulinė masė – 31,7 kDa, o izoelektrinis taškas 4,4 [113].

Nustačius lipazės tretinę struktūrą, paaiškėjo, kad tai yra 35Å x 45Å x 50Å dydžio sferos

formos baltymas, sudarytas iš aštuonių centrinių lygiagrečių β klosčių, kurias jungia

penkios α spiralės. 1.2 paveiksle pavaizduotos uždaroji ir atviroji trimatės fermento

formos. Lipazės aktyvųjį centrą dengiantis stogelis yra mobili α spiralė, kurią sudaro

aminorūgštys – 86 - 93 [114]. Aktyvusis fermento centras sudarytas iš įprastos Ser-His-

Asp katalizinės triados. Nustatyta, kas viena iš keturių lipazės Trp liekanų - Trp89 -

lokalizuota fermento stogelio srityje, taip pat turi įtakos efektyviai substratų hidrolizei

[115].

Yra nustatyta, kad lipazės savo atviros formos aktyvių centrų sritimis paprastai

yra linkusios sudaryti bimolekulinius agregatus [116]. T. lanuginosus lipazei ši savybė

būdinga netgi labiau nei kitoms, todėl kitos imobilizuotos lipazės gali būti naudojamos

jos gryninimui ar netgi imobilizacijai [107, 108]. Tiriant lipazę, į šią jos savybę būtina

atsižvelgti, nes monomerinės ir dimerinės formos gali pasižymėti skirtingu aktyvumu,

stabilumu bei atrankumu [116].

Kaip minėta, T. lanuginosus lipazė naudojama daugelyje pramonės sričių, ir nors

nėra tokia populiari kaip iš mielių Candida genties išskirtos lipazės, bet kai kuriais

atvejais pasižymi netgi geresnėmis savybėmis, ir, be abejo, ypatingo dėmesio susilaukia

dėl didelio stabilumo [16].

1.1.4.2 Kitos lipazės

Rhizomucor miehei lipazė - komercinis imobilizuoto preparato pavadinimas -

Lipozyme RM IM, skysto – Palatase 20000L. Kaip minėta anksčiau, pirmoji nustatyta

trimatė lipazių struktūra buvo būtent šio fermento [36]. Šiai lipazei būdingas hidrofobinis

siauro plyšio formos netoli baltymo paviršiaus išsidėstęs aktyvusis centras [49]. Stogelio

struktūros konformaciniai pokyčiai, esant atvirai ir uždarai fermento formai, pateikti 1.3

pav. Tai - 1,3-savita lipazė. Nors dauguma lipazių savitos nuo vidutinės (C4) iki ilgos

(C16) grandinės sočių RR esteriams, R. miehei lipazė gali efektyviai hidrolizuoti iki 22

anglies atomų turinčių RR esterius [117]. Šios lipazės transesterinimo reakcijų substratais

gali būti ne tik alifatiniai, bet ir turintys įvairias kitas funkcines grupes alkoholiai, pvz.,

cikloheksilmetanolis, metoksipropandiolis [118].

19

Candida rugosa lipazė - mielių sintetinama lipazė (komercinis pavadinimas

Resinase), sudaryta iš 534 aminorūgščių [119], būdingas tunelio formos aktyvusis

centras [49], kurį dengia α spiralinė struktūra – stogelis (aminorūgštys 65 - 94) [119].

Stogelio struktūros konformaciniai pokyčiai, esant atvirai ir uždarai fermento formai,

pateikti 1.3 pav. C. rugosa lipazėms būdingas savitumas trumpos grandinės RR [120,

121]. Kai kurios šių fermentinių preparatų katalizinės savybės pateiktos 1.1 lentelėje.

1.1 lentelė. Gamintojo pateikiamos trilaurino hidrolizės metu nustatytos Resinase preparatų savybės

Preparato pavadinimas Aktyvumas, KLU/g

Savybės

Resinase A2X 100 Stabili, esant 40 - 75oC temperatūrai Optimali veikimo temperatūra 50 - 75oC Stabili, esant pH 4,5 - 8,5 Optimalus pH 6,0 - 6,5

Resinase HT 50 Stabili, esant 45 - 90°C temperatūrai Optimali veikimo temperatūra 70 - 85°C Stabili, esant pH 4,5 - 8,5 Optimalus pH 6,0 - 6,5

Candida antarctica B lipazė - komercinis imobilizuoto preparato pavadinimas -

Novozym 435. Tai - viena populiariausių, daugiausiai tyrinėjamų ir plačiausiai

organinėje sintezėje [122] bei biodyzelino gamyboje [123, 124] naudojamų lipazių. Dėl

ypatingo susidomėjimo šiuo fermentu buvo optimizuota jo gamyba: gauti, charakterizuoti

ir išgryninti du izofermentai (vadinami atitinkamai A ir B lipazėmis), o, siekiant gauti

praktiniam taikymui pakankamus biokatalizatorių kiekius, jie buvo klonuoti į Aspergillus

oryzae mikroorganizmą, kur buvo padidinta jų raiška [125].

Tai – globulinis baltymas, sudarytas iš 317 aminorūgščių, o jo molekulinė masė

yra 33,273 kDa [48]. Nors daugumos lipazių aktyviojo centro nukleofilinė Ser liekana

yra plaukų segtuko struktūros linkyje, tarp β klostės ir α spiralės ypatingai

konservatyviame pentapeptide (Gly-X-Ser-X-Gly), tačiau CALB yra išimtis ir, kaip

žinoma, tokios konservatyvios pentapeptido sekos neturi [48]. Šiam fermentui būdingas

piltuvo formos aktyvusis centras [49] bei labai mažas ir paprastas stogelis, kuris visiškai

neizoliuoja aktyvaus centro net ir esant uždarai jo būsenai [48], todėl šiuo atveju

daugeliui lipazių būdinga su stogelio poslinkiais susijusi aktyvacija fazių sąlyčio

paviršiumi nėra galima [50, 53].

20

CALB yra termostabili, 1,3-savita lipazė, katalizuojanti reakcijas tik ties

pirminėmis glicerolio hidroksigrupėmis [50], nors kai kuriuose kituose šaltiniuose

nurodoma, kad šis lipolizinis fermentas yra nesavitas arba savitas tik esant tam tikroms

sąlygoms [126-129]. Nors išskirtinės imobilizuotos Novozym 435 lipazės savybės leidžia

ją naudoti įvairiose pramonės srityse [68, 130], yra duomenų, kad šis preparatas tinka ne

visada: esant tam tikromis sąlygomis, iš jo gali atsiplauti paties fermento molekulės bei

kiti sudėtyje esantys junginiai, kurie gali dalyvauti šalutinėse reakcijose kaip lipazės

substratai, susidarant nepageidaujamiems produktams [68, 131, 132].

1.2 Katalizinės lipazių savybės

1.2.1 Lipazių katalizuojamos reakcijos

Lipazės apibūdinamos kaip fermentai, gebantys hidrolizuoti TAG esterinę jungtį,

susidarant laisvoms RR ir gliceroliui. Bevandenėje ar turinčioje mažai vandens aplinkoje

lipazės gali vykdyti ir priešingą hidrolizei reakciją - esterių sintezę, kurios metu tarp

alkoholio ir karboksirūgšties molekulių suformuojama esterinė jungtis [7, 25]. Šie du

procesai sudaro transesterinimo reakcijų pagrindą.

Transesterinimo reakcijos skirstomos į interesterinimą (dvi TAG/esterių

molekulės pasikeičia acilinėmis liekanomis), acidolizę (jų metu pasikeičiama acilinėmis

liekanomis tarp TAG/esterio bei RR) ir alkoholizę (pasikeičiama acilo liekanomis tarp

TAG/esterio ir alkoholio) [7, 133]. Tarp šių reakcijų vis dažniau minima aminolizė, kai

nukleofilo vaidmenį atlieka ne alkoholis, o aminas (1.4 pav.). Be to, lipazės gali

katalizuoti ir kitas reakcijas: peroksidaciją, epoksidaciją, laktonizaciją, polimerizaciją,

angliavandenių acilinimą ir kt. [134]. Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos

aptartos 1.4 skyriuje. Kadangi klasikinė alkoholizė daugelyje literatūros šaltinių yra

vadinama tiesiog transesterinimo reakcija, taip ji bus vadinama ir šiame darbe.

21

(i) Hidrolizė (vandeninė aplinka)

R1COOR2 + H2O ↔↔↔↔ R1COOH + R2OH

(ii) Sintezė (organinė aplinka)

(A) Esterinimas:

R1COOH + R2OH ↔↔↔↔ R1COOR2 + H2O

(B) Transesterinimas:

(1) Acidolizė

R1COOR2 + R3COOH ↔↔↔↔ R3COOR2 + R1COOH

(2) Alkoholizė

R1COOR2 + R3OH ↔↔↔↔ R1COOR3 + R2OH

(3) Interesterinimas

R1COOR2 + R3COOR4 ↔↔↔↔ R1COOR4 + R3COOR2

(4) Aminolizė

R1COOR2 + R3NH2 ↔↔↔↔ R1CONHR3 + R2OH

1.4 pav. Pagrindinės lipazių katalizuojamos reakcijos.

Esterių hidrolizės bei sintezės reakcijos yra grįžtamos ir joms būdinga tam tikra

pusiausvyra, kurios poslinkis į vieną ar kitą pusę paprastai priklauso nuo vandens kiekio

reakcijos mišinyje. Todėl, pvz., vykdant esterių sintezę, sistemoje turi būti užtikrinamas

minimalus vandens kiekis. Tai realizuojama naudojant liofilizuotus arba imobilizuotus

fermentų preparatus ir/arba reakciją vykdant molekuliniais sietais išdžiovintuose

organiniuose tirpikliuose. Keičiant vandens kiekį, keičiasi ir fermento substratinis

savitumas, stabilumas bei kitos savybės [135].

Nustatyta, kad minimalus vandens kiekis yra būtinas fermento aktyvumui, nes

palaiko reikiamą baltymo molekulės judrumą, todėl labai svarbu įvertinti naudojamo

organinio tirpiklio hidrofobiškumą bei kitas savybes, nuo kurių priklauso vandens kiekis

ne tik visame reakcijos mišinio tūryje, bet ir fermento mikroaplinkoje [135]. Bendrą

vandens kiekį sudaro vanduo, ištirpęs organiniame tirpiklyje, sudarantis lipazės ir kitų

22

sistemos komponentų hidratacinį sluoksnį bei vandens kiekis, esantis išorinėje aplinkoje

(ne reakcijos sistemoje) [136].

1.2.2 Lipolizė: mechanizmas ir pagrindiniai kinetikos principai

Kaip minėta, lipazės yra hidrolazės, skaldančios acilgliceroliuose esančius

esterinius ryšius, atpalaiduodamos laisvas RR bei glicerolį. Pagrindiniai tokių reakcijų

substratai - vandenyje netirpūs bekrūviai lipidai (ilgagrandžiai TAG). Įsotinimo taškas,

kuriame TAG vandeninėje terpėje pradeda formuoti emulsijas, vadinamas maksimalia

monomerų koncentracija. Viršijus šią koncentraciją taške, vadinamame kritine micelių

koncentracija, formuojasi micelės. Tarp įvairių substratų fizikocheminių formų

egzistuoja tam tikra dinaminė pusiausvyra, tačiau, kadangi daugelis substratų pasižymi

ribotu tirpumu arba apskritai netirpsta vandenyje, paprastai dominuoja nemonomerinės

formos [11, 137].

Kadangi fermentas yra hidrofilinis, o substratai – hidrofobiniai, lipolizės reakcija

vyksta lipidų ir vandens fazių sąlyčio paviršiuje (FSP). Substrato molekulių

koncentracija FSP tiesiogiai apsprendžia lipolizės greitį, todėl labai svarbu palaikyti šio

paviršiaus kokybę. Kad ir kaip bebūtų keista, žinios apie šio paviršiaus sudėties įtaką

lipolizės reakcijai iki šiol yra gana skurdžios, ir vienintelis plačiai naudojamas terminas

yra FSP kokybė. Atlikti sisteminiai biofizikiniai tyrimai atskleidė tam tikrus FSP

mikroaplinkos poveikio lipazių veiklai ypatumus. Nustatyta, kad lipazių aktyvumas, kaip

FSP sudėties funkcija, labiau susijęs su substrato pasiekiamumu nei paties fermento

denatūracija ar inaktyvacija, kaip buvo dažnai spėjama. Aiškiai įrodyta, kad TAG

lipolizės greitis labai priklauso nuo specifinės emulsijos lašelio srities, kurioje ji vyksta

[138, 139].

Lipazių katalizuojamos hidrolizės mechanizmas paprastai analizuojamas arba

koncentruojantis į substrato, arba į fermento modelį. Substrato modelis akcentuoja

pagerėjusį substratų pasiekiamumą ir tinkamą orientaciją FSP. Kita vertus, fermento

modelis analizuoja konformacinius lipazės pokyčius adsorbuojantis ant FSP [11].

23

1.2.2.1 Lipolizės mechanizmas

Lipazių pagrindinė katalizinė reakcija, t.y., TAG skaldymas, vyksta aktyviajame

centre, kurį, kaip minėta, sudaro aminorūgščių triada Ser-Asp(Glu)-His, atsakinga už SN2

tipo reakcijos mechanizmą. Lipazių katalizuojamos reakcijos mechanizmas priskiriamas

Ping-Pong Bi-Bi tipui, t.y., vyksta bisubstratinė reakcija, dalyvaujant TAG ir vandens

molekulei. Susidaro du produktai, kai antrojo substrato prijungimas vyksta atsipalaidavus

pirmajam produktui. Be to, reakcija prasideda po lipazės adsorbcijos FSP, taigi visas

katalizės procesas vyksta dviem etapais [140].

Katalizės mechanizmas bendras visoms lipazėms. Reakcijos metu susidaro

tetraedrinis tarpinis junginys, kuris vėliau virsta acilintu fermento kompleksu, o

paskutinėje stadijoje lipazė regeneruojama hidrolizės metu. 1.5 paveiksle pateikta

lipolizės reakcijos stadijų schema.

1.5 pav. Lipolizės reakcijos stadijos [25]. Susidaro tetraedrinis tarpinis junginys, kuris vėliau virsta acilintu fermento kompleksu, o paskutinės stadijos metu lipazė regeneruojama hidrolizės metu.

Katalizinę triadą sudarančių aminorūgščių funkcija: pirmiausia nukleofilinis Ser

deguonies atomas atakuoja substrato sudėtyje esantį karbonilinį esterinio ryšio anglies

atomą, susidarant tetraedriniam tarpininkui, kuris yra šios reakcijos pereinamoji būsena.

Būtent Ser liekana tiesiogiai dalyvauja kataliziniame procese. His sudaro vandenilinį ryšį

su Ser hidroksigrupe, taip padidindamas Ser nukleofiliškumą. His imidazolo žiedas

protonizuojasi, susidaręs teigiamas krūvis stabilizuojamas Asp arba Glu neigiamos

24

karboksigrupės [25]. Pereinamoji būsena stabilizuojama, susidarant vandeniliniams

ryšiams tarp aktyviojo centro aminorūgščių liekanų ir substrato oksianijono. Tetraedrinis

tarpininkas suyra, atsipalaiduojant alkoholio molekulei bei susidarant tarpiniam

acilfermento kompleksui. Laisva RR atpalaiduojama ir lipazė regeneruojama hidrolizės

metu, veikiant nukleofilui (vandens molekulei arba monoacilgliceroliui (MAG)) [11].

1.2.2 Pagrindiniai kinetikos principai

Viena unikalių lipazių savybių yra aktyvacijos FSP fenomenas. Dar ankstyvųjų

tyrimų metu buvo parodyta, kad, kol substratas vandeniniame tirpale yra monomerinės

formos, lipazė pasižymi minimaliu aktyvumu, tačiau, kai substrato koncentracija yra

pakankamai didelė, kad viršytų tirpumo ribą ir suformuotų emulsijas bei miceles,

stebimas staigus hidrolizinio lipazės aktyvumo išaugimas (1.6 pav.) [141, 142]. Šie

eksperimentai įrodo, kad lipazės aktyvumas priklauso ne nuo substrato molinės

koncentracijos, bet nuo FSP egzistavimo, ir jis yra kontroliuojamas FSP esančios

substratų koncentracijos [50, 143].

Esterazės, priešingai, - aktyvios tik vandenyje tirpių substratų atžvilgiu. Jų

aktyvumas yra substrato koncentracijos funkcija, aprašoma Michaelio-Menten kinetiniu

modeliu, kai maksimalus reakcijos greitis pasiekiamas gerokai greičiau nei tirpalas

įsotinamas substratu, todėl fizikocheminės būsenos pasikeitimas (substrato emulsijos

susidarymas) reakcijos greičio nebekeičia [144]. 1.6 paveiksle parodyti lipazėms ir

esterazėms būdingų kinetinių kreivių skirtumai.

Substrato koncentracija Substrato koncentracija

Esterazė Lipazė

Akty

vu

mas

Akty

vu

mas

Tirpus

substratas

Agreguotas

substratas

1.6 pav. Lipazių ir esterazių kinetinės kreivės [17]. Substrato koncentracija išreikšta santykiniais vienetais, kur 1 (C*) atitinka kritinę micelių koncentraciją. Aktyvumas – savitas fermento aktyvumas, išreikštas santykiniais vienetais.

25

Šis FSP sukelto lipolizinio aktyvumo išaugimo fenomenas daugelį metų ne tik

žavėjo, bet ir glumino enzimologus, nes lipolizė negalėjo būti tiriama įprastais metodais

ar apibrėžta klasikiniu Michaelio-Menten modeliu, galiojančiu tik homogeninėje fazėje

vykstančiai biokatalizei. Lipolizė vyksta iš bent dviejų skirtingų fazių sudarytoje

aplinkoje. Substratai, produktai ir fermentai pasiskirsto tarp tūrio ir paviršiaus fazių. Be

to, šis pasiskirstymas nėra fiksuotas ir kinta lipolizės reakcijos metu [145].

Dėl to buvo pasiūlyti įvairūs kinetiniai modeliai, aprašantys fermentinės lipolizės

mechanizmą FSP. Vienas paprasčiausių yra Verger-de Haas sukurtas modelis, aprašantis

lipolizinių fermentų katalizės kinetiką [146, 147]. Tai - paprasčiausias Michaelis-

Menten-Henri kinetinio modelio pritaikymas trumpos ir vidutinės grandinės ilgio lipidų

hidrolizei FSP, susidarant tirpiems produktams (1.7 pav.). Jis sudarytas iš dviejų stadijų:

grįžtamos fizinės vandenyje tirpaus fermento (E) adsorbcijos ant FSP, fermentui

pereinant į energetiškai palankesnę būseną (E*), po to sekančios jo aktyvacijos (atsidaro

stogelis, dengiantis aktyvųjį centrą) [61, 148] bei substrato (S) surišimo, t.y., fermento ir

substrato (E*S) komplekso susidarymo. Antroji stadija gali būti apibūdinta sąlyčio

paviršiniu Michaelio-Menten modeliu, substrato koncentracijas išreiškiant ne mol/tūrio

vienetui, bet mol/paviršiaus ploto vienetui. Susidarius E*S kompleksui, vyksta

tolimesnės dvimatės katalizės stadijos, susidarę produktai (P*) atsipalaiduoja ir ištirpsta

vandeninėje fazėje, regeneruojamas E* formos fermentas, kuris lieka adsorbuotas ant

FSP ir atsipalaiduoja tik po keleto katalizinių ciklų [147].

Vanduo

Fazių sąlyčio paviršius

1.7 pav. Kinetinis lipolizinių fermentų katalizės modelis [149].

Remiantis šiuo modeliu, buvo atlikta daug kinetinių vidutinio grandinės ilgio

sintetinių lipidų hidrolizės, susidarant vandenyje tirpiems produktams, tyrimų. Nustatyta,

26

kad išvestos lygtys visiškai atitinka eksperimentinius rezultatus Tačiau natūralūs

lipolizinių fermentų substratai yra ilgos grandinės lipidai, kurių hidrolizės metu susidaro

vandenyje netirpūs produktai. Apskritai, kinetiniai modeliai turi atsižvelgti į susidariusių

vandenyje netirpių produktų susikaupimą ant FSP, kas keičia, taip vadinamą, FSP

kokybę. 1.8 paveiksle pavaizduotas kinetinis lipazės veikimo modelis, atsižvelgiantis į

galimą vieno iš produktų įtaką fermento, substrato ir kito produkto pasiekiamumui fazių

sąlyčio paviršiuje. Siekiant pašalinti ant FSP susikaupusius lipolizės produktus,

naudojami įvairūs vandenyje tirpūs akceptoriai (β-ciklodekstrinas ir kt.) [150].

1.8 pav. Kinetinis lipazės veikimo modelis, kai susidaręs produktas P1 veikia fermento (E), substrato (S) ir kito produkto (P2) pasiekiamumą/prieinamumą fazių sąlyčio paviršiuje [151].

Taigi lipazės gali būti apibrėžtos kaip karboksiesterazės, veikiančios emulsintus

substratus. Ši savybė lengvai paaiškinama lipazių erdvinės struktūros ypatybėmis. Kaip

minėta, fermento aktyvųjį centrą dengia į stogelį panaši polipeptidinė grandinė, kuri

neleidžia substrato molekulėms patekti į vidų. Aktyvacija sąlyčio paviršiuje struktūriniu

požiūriu susijusi su stogelio poslinkio sąlygojamomis dviejomis konformacinėmis lipazių

formomis. Esant vienai iš jų (atvirajai), stogelis savo hidrofobiniu paviršiumi sąveikauja

su substratu (lipidine faze), ši sąveika yra labai svarbi lipolizės eigai, nes sustiprina

hidrofobinę sąveiką tarp fermento bei substrato lipidinio paviršiaus. Nesant substrato,

stogelis uždengia aktyvų centrą, įvyksta savotiška fermento struktūrinė inaktyvacija

(uždaroji forma) [58, 148].

27

1.3 Lipazių savitumas

Skiriami trys lipazių savitumo substratų atžvilgiu tipai: regiosavitumas (pozicinis

savitumas), stereosavitumas bei savitumas konkretiems substratams [134].

1.3.1 Regiosavitumas (pozicinis savitumas)

Atsižvelgiant į lipazių gebą hidrolizuoti TAG, jos gali būti suskirstytos į tris

pagrindines grupes [32, 117, 152]:

1. Nesavitos lipazės katalizuoja TAG hidrolizę, atskeldamos RR ties bet kuriuo

glicerolio molekulės C atomu [117, 152-154]. Jos katalizuoja visišką TAG hidrolizę

iki glicerolio ir laisvų RR (1.9 pav.). DAG ir MAG reakcijos metu susidaro kaip

tarpiniai junginiai [152, 154], kurie hidrolizuojami greičiau nei TAG, tad reakcijos

mišinyje jie nesikaupia [154]. Nesavitos lipazės sintetinamos tokių mikroorganizmų

kaip Burkholderia glumae (Pseudomonas glumae), B. cepacia (P. cepacia),

Chromobacterium viscosum ir Pseudomonas fluorescens [134].

TAG Glicerolis

Nesavita

lipazė

1.9 pav. Bendra nesavitų lipazių katalizuojamų reakcijų schema [134].

2. 1,3-Savitos lipazės katalizuoja reakcijas tik ties pirminėmis glicerolio

hidroksigrupėmis [117, 152-154]. Taigi jos vykdo savitą TAG hidrolizę, pasirinktinai

atskeldamos RR ties glicerolio molekulės C1 ir C3 atomais (sn-1,3 savita lipazė),

susidarant laisvoms RR, DAG ir/ar MAG (1.10 pav.). 1,3-Savitos lipazės

sintetinamos tokių mikroorganizmų kaip Bacillus thermocatenulatus, Aspergillus

niger, CALB, Mucor javanicus, Rhizomucor miehei (Mucor miehei), Rhizopus

delemar, R. oryzae, R. niveus, T. lanuginosus, Yarrowia lipolytica. 1,3-Savitumas

būdingas ir iš rapsų (Brassica napus) bei kiaulės ir žmogaus kasos išskirtoms

lipazėms [134].

28

1,3-savita

lipazė

TAG

1,2-DAG

2,3-DAG

2-MAG

1.10 pav. Bendra 1,3-savitų lipazių katalizuojamų reakcijų schema [134].

3. Savitos tam tikroms RR lipazės efektyviausiai katalizuoja reakciją, esant tam tikro

ilgio ir nesotumo laipsnio RR [7, 117, 133, 155]. Pavyzdžiui, Geotrichum candidum

lipazė yra savita RR su dvigubu ryšiu tarp C9 ir C10 [156-158].

1.3.1.1 Acilgrupės migracija acilgliceroliuose - tai savaiminis acilgrupės judėjimas nuo

vienos hidroksigrupės prie gretimos [159-161]. 1,3-Savitos lipazės katalizuojamos TAG

hidrolizės reakcijos metu susidaro 2-MAG ir 1,2- ar 2,3-DAG. Šių junginių viduje vyksta

lėta acilgrupės migracija, susidarant 1,3-DAG ar 1-MAG, kurie tuomet yra

hidrolizuojami 1,3-savitos lipazės iki laisvų RR ir glicerolio (1.11 pav.). Dėl to ilgesnės

reakcijos trukmės dėka galima gauti visišką TAG hidrolizę iki laisvų RR ir glicerolio

[155, 157]. Pavyzdžiui, Holmberg ir Osterberg tyrė 1,3-savitos lipazės katalizuojamą

TAG hidrolizės reakciją iki 2-MAG, gauta išeiga siekė ne 100 %, kaip buvo galima

tikėtis, o 80 %. Didesnės išeigos nebuvo galima gauti dėl acilgrupės migracijos

fenomeno, dėl kurio galiausiai įvyksta visiška hidrolizė iki glicerolio ir laisvų RR [162].

Literatūroje aprašomi atvejai, kai, naudojant 1,3-savitas lipazes, gauta biodyzelino išeiga

siekė daugiau nei 90 % (teoriškai biodyzelino išeiga, naudojant tokias lipazes, turėtų būti

tik 66 %), ir tai yra taip pat paaiškinama acilgrupės migracijos fenomenu [163-166].

29

TAG

2,3-DAG

1,2-DAG

1,3-DAG1-MAG

2-MAG

Glicerolis

Acilmigracija

Acilmigracija

1.11 pav. Visi galimi produktai, įskaitant tuos, kurie susidaro dėka acilgrupės migracijos, susidarę 1,3-savitų lipazių katalizuojamų triacilglicerolių hidrolizės reakcijų metu [134].

1.3.1.2 Veiksniai, turintys įtakos acilo migracijai

Nustatyta, kad medžiaga, ant kurios imobilizuotas fermentas, gali turėti įtakos

acilgrupės migracijai, jeigu jai būdingas rūgštinis ar bazinis paviršius [160]. Pvz., 1,3-

savitos T. lanuginosus lipazės katalizuojamo sojų aliejaus transesterinimo metu, kai į

reakcijos mišinį buvo pridėta silikagelio, biodyzelino išeiga išaugo ir siekė daugiau nei

90 % [167]; trietilamino (silpnos organinės bazės) pridėjimas į reakcijos mišinį taip pat

padidino biodyzelino išeigą kukurūzų aliejaus transesterinimo metu [166].

Teigiama, kad tirpiklio poliškumas taip pat turi įtakos acilgrupės migracijai.

Pavyzdžiui, 1,2-DAG greičiau izomerizuojasi nepoliniuose nei poliniuose tirpikliuose

[168], monooleinas stabilus dipoliniuose hidrofobiniuose tirpikliuose (cikloheksanone), o

tuo tarpu nepoliniuose hidrofobiniuose (n-heksane) ir poliniuose hidrofiliniuose

(etanolyje, metanolyje) aplinka palankesnė acilgrupės migracijai [160]. Ištyrus įvairių

tirpiklių ir jų savybių įtaką acilgrupės migracijos kinetikai 1,2-DAG ir 2-MAG, nustatyta,

kad bendru atveju mažėjant tirpiklio poliškumui, didėja acilgrupės migracijos greičio

konstantos [164]. Vandens kiekis reakcijos sistemoje taip pat veikia acilgrupės

migracijos greitį. Nustatyta, kad jis mažėja, didėjant vandens aktyvumui reakcijos

mišinyje [160, 165, 168].

30

Acilgrupės migracijai įtakos turi ir reakcijos temperatūra bei pH. Nustatyta

tiesioginė reakcijos temperatūros ir acilgrupės migracijos greičio priklausomybė,

nepriklausomai nuo reakcijoms vykdyti naudojamo tirpiklio [160, 161, 165, 169].

Imobilizuotų CALB ir R. miehei lipazių katalizuojamos triacetino hidrolizės reakcijos

metu, kai pH 7, vyksta savaiminė acilgrupės migracija, susidarant 1,2- ir 1,3- diacetino

mišiniui, tuo tarpu, kai pH yra 5,5, acilgrupės migracija slopinama, ir gaunamas tik

vienas produktas - 1,2-diacetinas [170].

1.3.2 Stereosavitumas

Stereosavitumas (kitaip dar vadinamas stereoatrankumu) yra apibrėžiamas kaip

lipazės geba vieną nuo kitos atskirti TAG molekulėse esančias sn-1 ir sn-3 padėtis.

Lipazėms gali būti būdingas nedidelis stereoatrankumas arba jos gali būti labai

stereoatrankios. To paties fermento stereoatrankumas gali skirtis priklausomai nuo

substrato struktūros [171]. Kasos, Rhizopus arrhizus ir Pseudomonas fluorescens

lipazėms nebūdingas stereosavitumas kuriai nors pirminių pozicijų TAG ar

alkildiacilglicerolio molekulėse [172]. Žinduolių (žmogaus) skrandžio lipazei būdingas

ribotas atrankumas sn-3 pozicijai sintetinių TAG molekulėse [173]. Pseudomonas sp. ir

P. aeruginosa lipazėms būdingas sn-1 savitumas, kai substratas trioktanoinas, tuo tarpu

CALB būdingas labai didelio laipsnio sn-3 atrankumas. Visoms kitoms bakterinėms

lipazėms būdingas vidutinis ar žemas sn-1(3) stereosavitumas trioktanoino atžvilgiu.

Nustatyta, kad lipazių stereoatrankumas kinta kintant substratui, pvz., G. candidum M ir

A bei CALB lipazėms būdingas sn-3 savitumas trioktanoino atžvilgiu ir sn-1 savitumas,

kai substratas yra trioleinas [174].

1.3.3 Savitumas konkretiems substratams

Lipazėms būdingas labai skirtingo laipsnio savitumas skirtingų substratų

atžvilgiu. Jos gali katalizuoti reakcijas, dalyvaujant įvairiems substratams, bet,

priklausomai nuo jų molekulių struktūros, reakcijų greičiai labai skiriasi. Beveik visoms

lipazėms būdingas tam tikro laipsnio savitumas karboksirūgštims [157, 158]. Lipazės

pasižymi savitumu ne tik RR (tipas ir grandinės ilgis) bet ir alkoholio atžvilgiu [157].

31

Lipazių savitumą tam tikroms RR ar alkoholiams nulemia du pagrindiniai veiksniai:

steriniai efektai ir hidrofobinės sąveikos [175, 176].

Kai kurios lipazės teikia pirmenybę tam tikroms RR ar jų grupėms, pavyzdžiui,

Aspergillus flavus lipazė pasižymi didesniu savitumu trikaprinui nei trioleinui [177];

lipazės, išskirtos iš C. rugosa ir R. miehei, pasižymi didesniu savitumu oleino rūgščiai,

palyginus su elaidino rūgštimi (oleino rūgšties trans izomeras), o C. antarctica lipazė

priešingai - pirmenybę teikia elaidino, o ne oileino rūgščiai [178]. Lipazėms būdingas ir

savitumas RR grandinės ilgio atžvilgiu. Dauguma lipazių savitos nuo vidutinės (C4) iki

ilgos (C16) grandinės sočių RR esteriams, tačiau ir čia yra keletas išimčių, pavyzdžiui,

Penicillium roquefortii lipazė (pagerina sūrių skonį) gali hidrolizuoti trumpos grandinės,

bet ne vidutinės ar ilgos grandinės RR esterius [121], tuo tarpu R .miehei lipazė gali

efektyviai hidrolizuoti iki 22 anglies atomų turinčių RR esterius [117]. Kiaulių kasos ir

C. rugosa lipazėms būdingas savitumas trumpos grandinės RR [120, 121].

Lipazių aktyvumas skirtingų alkoholių klasių atžvilgiu yra išsidėstęs tokia tvarka:

pirminiai > antriniai > tretiniai alkoholiai [179]. Tretiniai alkoholiai ir jų esteriai yra

prasti lipazių susbtratai [180, 181], tačiau ir čia esama išimčių, pavyzdžiui, Burkholderia

sp. YY62 lipazė efektyviai hidrolizuoja tret-butilo esterius ir pasižymi didesniu savitumu

tret-butiloktanoatui, palyginus su tret-butilpalmitatu ar stearatu [182], kai kurios kitos

lipazės (C. rugosa [181], C. antarctica lipazė A [117]) taip pat pasižymi tam tikru, tačiau

pakankamai ribotu aktyvumu tokių substratų atžvilgiu.

Lipazių substratais gali būti ne tik alifatiniai, bet ir alicikliniai, bicikliniai ir

aromatiniai esteriai [50, 183, 184], tioesteriai bei aktyvuoti aminai [185]. Pvz., R. miehei

lipazės substratais gali būti įvairiausi alkoholiai, turintys įvairias kitas funkcines grupes,

pvz., cikloheksilmetanolis, metoksipropandiolis [118].

Toks platus lipazių substratinis savitumas gali būti paaiškintas substratų surišimo

vietos anatominiais (aktyvaus centro geometriniais) skirtumais. Nustatyta, kad lipazės,

turinčios į tunelį panašias substrato prijungimo vietas, yra savitos ilgos grandinės RR,

palyginus su stambiais/griozdiškais substratais, tuo tarpu lipazėms, kurių substrato

prijungimo vieta yra piltuvo formos, būdingas priešingas savitumas [49].

32

1.4 Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos

1.4.1 Fermentų neišrankumas (enzyme promiscuity)

Neišrankumas - fermentų gebėjimas katalizuoti alternatyvias reakcijas, kurios

skiriasi nuo jų natūralių fiziologinių funkcijų [186-188]. Nors enzimologijoje šis

terminas yra santykinai naujas, tačiau dėl plataus šio reiškinio paplitimo šiuo metu jis jau

yra tapęs gana įprastu [187, 189]. Fermentų aktyvumas, katalizuojant netradicines

reakcijas, paprastai yra gerokai mažesnis už tą, kuris būdingas, katalizuojant natūralias

reakcijas (atliekant pirmines funkcijas), bet yra duomenų, kad antro laipsnio greičio

konstantos (kcat/KM) visgi pasiekia 105 M-1s-1, o greitis padidėja ((kcat/KM)/k2) iki 1018,

kas būdinga ir tradicinėms fermentų katalizuojamoms reakcijoms [190].

Fermentų neišrankumas gali būti suskirstytas į tris pagrindines klases [186]:

1) Neišrankumas reakcijų sąlygoms – fermento geba katalizuoti reakcijas, esant

nenatūralioms sąlygoms: bevandenei aplinkai, aukštai temperatūrai ar

ekstremaliam pH.

2) Neišrankumas substratui – būdingas fermentams, pasižymintiems plačiu

substratiniu savitumu. Tai - fermento geba katalizuoti panašias chemines

reakcijas, naudojant skirtingus substratus.

3) Katalizinis neišrankumas – tai fermento aktyvaus centro geba katalizuoti

chemiškai skirtingus cheminius virsmus. Tokie cheminiai virsmai gali skirtis

susidarančio ar suardomo ryšio tipu ir/ar kataliziniu mechanizmu [191, 192]. Hult

ir Berglund (2007) šią fermentų savybę suskirstė į du tipus: atsitiktinis (būdingas

laukinio tipo fermentams) ir indukuotas (naujas fermentinis aktyvumas, sukeltas

mutacijų) fermento katalizinis neišrankumas [186]. Manoma, kad konformacinė

fermentų įvairovė ir lankstumas yra vieni svarbiausių veiksnių, užtikrinančių

katalizinį neišrankumą [193]. Nustatyta, kad ypatingai svarbus yra aktyvaus

centro kilpų mobilumas, pavyzdžiui, fermento izopropilmalato izomerazės (EC

4.2.1.33) aktyvaus centro kilpos lankstumas leidžia atpažinti dviejų skirtingų

substratų (izopropilmalato ir homocitrato) skirtingus fragmentus (hidrofobinius ir

hidrofilinius) [194].

33

1.4.2 Netradicinių lipazių katalizuojamų reakcijų pavyzdžiai

Dėl savo potencialo katalizuoti daugybę netradicinių reakcijų lipazės katalizinio

neišrankumo klausimu tyrinėjamos labiausiai [195, 196]. Yra žinoma daug lipazių

katalizuojamų netradicinių reakcijų: anglis-anglis, heteroatomas-anglis, heteroatomas-

heteroatomas ryšių susidarymas bei įvairūs oksidaciniai procesai [186, 188, 195].

1.4.2.1 Anglis-anglis (C-C) ryšio susidarymo reakcijos - vienos svarbiausių reakcijų

organinėje sintezėje, svarbios medikamentų, vertingų cheminių junginių bei natūralių

produktų sintezei. Aldolazių katalizuojamos C-C ryšio susidarymo reakcijos žinomos jau

seniai, neseniai nustatyta, kad ir lipazės gali katalizuoti šias reakcijas [186, 197, 198].

Pvz., CALB katalizuoja aldolinio prijungimo C-C ryšio susidarymo reakciją, dalyvaujant

heksanoliui ir propanoliui [197]. Reakcija nėra enantioatranki, bet distereoatrankiai

skiriasi nuo savaiminės reakcijos. Buvo pasiūlytas ir šios reakcijos mechanizmas,

teigiantis, kad aktyviajame centre esantis His, patraukdamas protonus nuo aldehido,

veikia kaip bazė, tuo tarpu nukleofilinis Ser iš viso nevaidina jokio vaidmens. Ser

pakeitus Ala, mutantas pasižymėjo keturis kartus didesniu specifiniu aktyvumu nei

laukinio tipo fermentas.

2008 m. paskelbta pirmoji lipazės katalizuojama asimetrinio aldolinio prijungimo

reakcija: kiaulės kasos lipazės katalizuojama reakcija tarp acetono ir skirtingų aromatinių

aldehidų [199]. Nustatyta ir CALB geba katalizuoti aldolinę prijungimo reakciją tarp

triciklinio ketono ir in situ gauto acetaldehido (susidariusio reakcijos mišinyje dėl

vinilacetato hidrolizės). Produkto išeiga po 4 val. siekė 94 %, o nesant fermento ta pati

produkto išeiga pasiekta per keturias dienas [200].

Literatūroje aprašytas CALB gebos katalizuoti Michaelio prijungimo reakciją tarp

1,3-dikarbonilinio junginio ir α/β nesotaus aldehido ar ketono atvejis [198]. Lipazės gali

katalizuoti ne tik Michaelio tipo prijungimo, bet ir Markovnikovo ir anti-Markovnikovo

prijungimo reakcijas, susidarant anglis-heteroatomas ir heteroatomas-heteroatomas

ryšiams [201].

34

1.4.2.2 Oksidaciniai procesai

Perhidrolizė. Lipazės katalizuoja vidutinės grandinės ilgio karboksirūgščių

perhidrolizę, naudojant skystą vandenilio peroksidą kaip perhidrolizinį agentą, susidarant

peroksikarboksirūgštims [202]. Perhidrolizės reakcijos metu susidariusios peroksirūgštys

buvo panaudotos kaip in situ susidaręs oksidantas alkenų epoksidacijai, tad lipazių

katalizuojama perhidrolizės reakcija yra chemofermentinio būdo gauti epoksidus iš

alkenų pagrindas (1.12 pav.).

R, R1 = Alkil, R2, R3, R4 = H, Alkil

Lipazė

1.12 pav. Lipazių katalizuojama karboksirūgščių perhidrolizės reakcija, naudojant skystą vandenilio peroksidą kaip perhidrolizinį agentą, susidarant peroksikarboksirūgštims, kurios po to panaudojamos kaip in situ susidaręs oksidantas alkenų epoksidacijai [202].

Tiesioginė alkenų epoksidacija. Nustatyta, kad CALB Ser105Ala mutantas

(paprastai katalizėje dalyvaujanti Ser liekana pakeista Ala) geba katalizuoti tiesioginę

α/β nesočių junginių (but-2-enalio ir 3-fenilprop-2-enalio) epoksidaciją vandenilio

peroksidu ir vandeninėje, ir organinėje terpėje. Autoriai šiai reakcijai pasiūlė dviejų

stadijų mechanizmą (1.13 pav.).

1.13 pav. Candida antarctica lipazės B Ser105Ala mutanto katalizuojamos tiesioginės α,β-nesotaus aldehido epoksidacijos vandenilio peroksidu reakcijos mechanizmas [203].

Pirmoji stadija: aktyvaus centro His liekana prisijungia vieną vandenilio atomą iš

vandenilio peroksido, susidarant naujam ryšiui tarp aldehido β-anglies ir peroksido

35

deguonies atomo. Antros stadijos metu susidaro C-O ryšys tarp aldehido α-anglies ir

peroksido deguonies, susidarant epoksidui ir vienai vandens molekulei [203].

1.4.2.3 Heterociklų sintezė

Literatūroje aprašoma 2-alkilbenzimidazolų sintezė fermentinio

acilinimo/ciklizacijos domino reakcijų metu tarp 1,2-arilendiamino ir RR esterių [204].

Neseniai nustatyta, kad lipazės gali katalizuoti ir dihidrofurano darinių susidarymo

reakcijas (1.14 pav.) [205].

b

a

c d

1.14 pav. Lipazių katalizuojama dihidrofurano darinių susidarymo reakcija [205]. Reaguojant nitrostirenui (a) ir acetilacetonui (b), susidaro ne tik įprastas Michaelio tipo prijungimo reakcijos produktas 3-(2-nitro-1-feniletil)pentan-2,4-dionas (c), bet ir 1-(5-(hidroksiimino)-2-metil-4-fenil-4,5-dihidrofuran-3-il)etanonas (d).

1.4.2.4 Hantzsch tipo reakcijos

Lipazės geba katalizuoti Hantzsch tipo reakciją, dalyvaujant aldehidui, 1,3-

dikarboniliniams junginiams bei acetamidui, susidarant 1,4-dihidropiridinams. Nustatyta,

kad CALB katalizuoja 4-nitrobenzaldehido (1.15 (a) pav.), acetilacetono (1.15 (b) pav.)

ir acetamido (1.15 (c) pav.) reakciją, susidarant produktui - 1,4-dihidropiridinui (1.15 (d)

pav.), kurio išeiga po 72 val. siekia 90 % [206].

a b c

d 1.15 pav. C. antarctica lipazės B katalizuojama Hantzsch tipo reakcija, dalyvaujant 4-nitrobenzaldehidui (a), acetilacetonui (b) ir acetamidui (c), susidarant 1,4-dihidropiridinui (d) [206].

36

1.4.3 Neišrankumas reakcijų sąlygoms

Lipazės pasižymi dideliu stabilumu organiniuose tirpikliuose. Kaip minėta, esant

nedideliam vandens kiekiui aplinkoje (organiniame tirpiklyje), lipazės gali katalizuoti

priešingą hidrolizei reakciją – sintezę [12, 13, 17, 53, 184, 207]. Kitos sąlygos, kurioms

esant vyksta sintezės reakcijos: aukšta temperatūra (termofilų fermentai) [208],

ekstremalus pH (acidofilų ir alkalofilų fermentai) [209, 210], didelės druskų

koncentracijos (halofilų fermentai), dujinė fazė [211], sistemos be tirpiklių [212, 213],

joniniai skysčiai [214, 215], kieta fazė [216].

Įvairių reakcijos terpių, naudotų lipazių katalizuojamoms reakcijoms, privalumai

ir trūkumai gana plačiai aprašyti literatūroje. Dvifazė sistema, sudaryta iš hidrofobinių

tirpiklių ir vandeninių buferių, turi tam tikros svarbos lipazėms, mat dauguma šių

fermentų aktyvuojasi fazių sąlyčio paviršiuje [217-219]. Tweddell su kolegomis (1998)

tyrė Rhizopus nivea ir Mucor miehei lipazių esterinimo ir interesterinimo aktyvumus trijų

skirtingų tipų organinėse sistemose ir nustatė, kad dvifazės sistemos buvo tinkamesnės

esterinimo nei interesterinimo reakcijoms [220]. Vandens-organinio tirpiklio dvifazės

sistemos buvo sėkmingai pritaikytos labai didelio lipofiliškumo substratų, tokių kaip

steroidai [217], taukai [221] ir alkenai [222], transformacijoms vykdyti.

Nustatyta, kad organiniai tirpikliai daro įtaką lipazių katalizuojamų reakcijų

atrankumui [223-225]. Pvz., P. cepacia lipazės katalizuojamo 1,4-dibutiriloksi-2-

oktilbenzeno transesterinimo butanoliu metu hidrofobiniuose tirpikliuose susidaro 4-

butiriloksi-2-oktilfenolis, o hidrofiliniuose – 4-butiriloksi-3-oktilfenolis [224]. Tirpikliai

gali turėti įtakos ir lipazių prochiraliniam atrankumui (pagrindinio ir minorinio/šalutinio

enantiomero susikaupimo greičio santykiui). Ištyrus Pseudomonas lipazės katalizuojamą

prochiralinio diesterio 2-(1-naftoilamino)trimetilendibutirato hidrolizę iki jo monoesterių

įvairiuose hidratuotuose tirpikliuose, nustatyta, kad pro-S atrankumas varijavo nuo 3 kai

kuriuose tirpikliuose iki daugiau nei 30 – kituose [225]. Tirpikliai gali nulemti ir

enantioatrankumo inversiją: AH lipazės (Pseudomonas sp.) katalizuojamos kai kurių

prochiralinių 1,4-dihidropiridino darinių hidrolizės metu izopropilo eteryje susidaro

ee~90 % (S)-enantiomero, o cikloheksane susidaro apie ee~90 % (R)-enantiomero [223].

37

1.5 Lipazių biotechnologinio pritaikymo galimybės

Kaip minėta, lipazės yra labai svarbi biotechnologijai fermentų grupė, turinti

didžiules pritaikymo galimybes maisto, detergentų, farmacijos, tekstilės, kosmetikos ir

kitose pramonės srityse. Lipoliziniai fermentai veikia esant švelnioms reakcijų sąlygoms

(tai sumažina vykdomų procesų ekonomines sąnaudas bei reagentų ar produktų

degradacijos galimybę), yra labai stabilūs organiniuose tirpikliuose, katalizuoja daug

biotechnologijai svarbių reakcijų, pasižymi ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei

regio- ir / ar stereoatrankumu, todėl nesusidaro nepageidaujami šalutiniai produktai,

nereikia papildomų priemonių reakcijos metu susidariusiems junginiams atskirti [226].

1.5.1 Įvairių vertingų esterių sintezė

Didžiąją lipazių taikymo biotechnologijoje dalį sudaro įvairių vertingų esterių

sintezė. Kvapiųjų esterių sintezė yra viena plačiausių lipazių katalizuojamų esterinimo ir

transesterinimo reakcijų taikymo sričių [1, 2, 7, 8]. Skonį ir kvapą suteikiančios

sudedamosios dalys yra specialūs priedai, naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir

asmens higienos (priežiūros) pramonės srityse.

Dauguma skonio ir kvapo junginių gali būti gauti iš natūralių šaltinių, tačiau jų

išskyrimas yra gana sudėtingas procesas. Tokių junginių ekstrakcijos kaina yra tokia, kad

procesas tampa komerciškai per brangus. Esteriai gali būti gaminami ir naudojant

cheminius katalizatorius, bet tokių reakcijų metu neretai susidaro šalutiniai

nepageidaujami produktai, o lipazių katalizuojamų reakcijų pagalba gauti produktai gali

būti traktuojami kaip natūralūs, kas yra ypatingai svarbu sintetinant maisto priedus [227].

Tipiniai šios grupės esteriai: butillauratas (abrikosų ir persikų kvapas), etilbutiratas

(ananasų kvapas), izoamilacetatas (bananų kvapas), izoamilizovaleratas (obuolių kvapas)

ir kt. (daugiau esterių pavyzdžių pateikta 1.16 pav.) [228-230].

38

Izoamilacetatas Izoamilbutiratas Izoamilizovaleratas

Izoamilpropionatas Butilizobutiratas Izoamiloktanoatas

3-Tioheksilacetatas Butilkapratas (-) Mentilacetatas

Terpinilacetatas Cinamilacetatas (R)-1-Fenetilacetatas

Etilvaleratas Geranilacetatas Butiltiglatas

Eugenolbenzoatas Geraniltiglatas 1.16 pav. Fermentinės sintezės būdu gautų vertingų esterių pavyzdžiai [69].

Ilgos grandinės RR ir ilgos grandinės alkoholių esteriai vadinami vaškais.

Fermentinė katalizė ypatingai dažnai naudojama asmens higienos/priežiūros produktų

sudedamųjų dalių gamybai. Odą minkštinantys esteriai yra iš įvairios kilmės aliejų ir

riebalų gautos cheminės medžiagos, plačiai naudojamos kosmetikos produktuose dėl

savo minkštinančių ir drėkinančių savybių [231].

39

Acetatai yra vieni populiariausių esterių, plačiai naudojamų maisto ir kvapų

pramonėse [232]. Literatūroje plačiai aprašytos iš įvairių mikrobinių šaltinių išskirtų

laisvų ir imobilziuotų lipazių katalizuojamos įvairių acetatų sintezės reakcijos [230, 233-

235]. Kita svarbi esterių klasė - terpenų esteriai - RR junginiai, pasižymintys įvairiomis

skonio ir kvapo savybėmis, labai plačiai naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir

kosmetikos pramonėse. Kai kurie tokių esterių pasižymi antibakterinėmis ir

antioksidacinėmis savybėmis bei geba slopinti nepageidaujamą kūno kvapą. Literatūroje

aprašoma tokių terpenolių kaip β-citronelolio, geraniolio ir terpenilo esterių, naudojant

įvairias lipazes, sintezė [236-239].

1.5.2 Maisto pramonė

Lipazės naudojamos įvairių maisto produktų kokybės ir skonio gerinimui.

Pavyzdžiui, krakmolas yra viena pagrindinių duonos sudedamųjų dalių. Ilgainiui duonoje

esantis krakmolas kristalizuojasi, taip suteikdamas nemalonų skonį bei kietumą.

Amilazės ir lipazės pridėjimas duonos gamybos metu slopina krakmolo kristalizacijos

procesus ir taip ilgina duonos galiojimo laiką [240].

Riebalai ir aliejai yra svarbi maisto sudedamoji dalis. Maistinė TAG vertė

priklauso nuo RR ilgio, nesotumo laipsnio bei padėties glicerolio molekulėje. Lipazių

katalizuojamų transesterinimo reakcijų pagalba iš struktūriniu atžvilgiu mažiau vertingų

riebalų galima gauti gerokai vertingesnius produktus. Šiuo metu toks riebalų ir aliejų

modifikavimas yra viena pagrindinių lipazių taikymo maisto apdorojimo pramonėje

sričių. Įvairūs prastos sudėties pigūs aliejai gali būti modifikuojami iki maistingų ir

pramonėje svarbių TAG: kakavos sviesto pakaitalo, žmogaus pieno riebalų pakaitalų,

mažai kaloringų TAG, polinesočiosiomis RR ir oleino rūgštimi prisotintų aliejų [241].

1.5.3 Farmacijos pramonė

Biokatalizė įgauna vis daugiau svarbos ir farmacijos pramonėje. Būtent čia,

gaminant įvairius vaistus, realizuojama lipazių geba sintetinti ne raceminius mišinius, o

grynus enantiomerus. Chirališkumas yra pagrindinis daugelio vaistų veiksmingumo

veiksnys, dėl to vaistams naudojama optiškai gryna medžiaga, o ne raceminis mišinys,

40

mat daugeliu atvejų pageidaujamu terapiniu poveikiu pasižymi tik viena konkrečios

medžiagos enantiomerinė forma, o kita gali būti netgi toksiška [242]. Lipazės katalizuoja

reakcijas, kurių metu gaminami tokie vaistai kaip nikkomycin-B, naproxen, ibuprofen,

suprofen ir ketoprofen [243].

Lipazės gali būti naudojamos ir tiesiogiai - virškinimo sutrikimams bei su jais

susijusioms odos alerginėms reakcijoms gydyti. Šiuo atveju naudojamos ypatingu

stabilumu bei aktyvumu, esant įvairiam pH, pasižyminčios lipazės [7, 25, 133].

1.5.4 Biojutikliai

Lipazės kaip biojutikliai naudojamos maisto technologijoje, klinikinėje

diagnostikoje, farmacijoje, pesticidų kiekio įvertinimo technologijose. Vienas lipazių

kaip biojutiklių panaudojimo būdų klinikinėje diagnostikoje – TAG kiekio kraujo serume

nustatymas (paprastai siekiant kontroliuoti lipidų kiekį kraujyje tais atvejais, kai

pacientams būdingi širdies ir kraujagyslių sutrikimai) [244, 245]. Nors biojutikliai gali

būti cheminės, biologinės ar elektroninės kilmės, tačiau biologiniai neretai yra ir pigesni,

ir greitesni [5].

1.5.5 Detergentai

Detergentų gamyba - komerciniu atžvilgiu svarbiausia hidrolizinių lipazių

savybių taikymo sritis. Dažniausiai lipazės naudojamos kaip sudėtinė buitinės ir

pramoninės paskirties plovikliuose naudojamų detergentų dalis. 1988 m. NovoNordisk

pristatė pirmąją detergentų pramonei skirtą komercinę lipazę - Lipolase [18].

Fermentų naudojimas mažina energijos sąnaudas (procesai vykdomi esant

žemesnėms temperatūroms) bei kenksmingų PAM, įeinančių į detergentų sudėtį, kiekį

[246]. Lipazės yra bioskalios, todėl neturi neigiamos įtakos nuotekų vandenims ir

vandens telkinių gyvajam pasauliui.

Detergentams naudojamoms lipazėms keliami reikalavimai: mažas substratinis

savitumas (galimybė hidrolizuoti įvairios sudėties ir kilmės riebalus), ypatingas

stabilumas (pH 10 - 11, 30 - 60ºC temperatūra) bei atsparumas cheminei denatūracijai ir

proteolizinei degradacijai (dėl PAM ir proteazių priedų) [18].

41

1.5.6 Tekstilės, odos, kailių ir popieriaus pramonės

Lipazės tekstilės pramonėje naudojamos, siekiant pagerinti audinių dažymo

kokybę, suteikti tvirtumo, atsparumo bei minkštumo. Fermentais modifikuoti įvairūs

sintetiniai pluoštai naudojami siūlų, audinių, tekstilės, kilimėlių ir kt. gamyboje [247].

Naudojant lipazes, galimas gerokai ekologiškesnis odos ar kailio nuriebalinimo

procesas [7, 25, 245, 248]. Šiuo atveju naudojamos įvairios ir rūgštinėje, ir šarminėje

terpėje stabilios lipazės. Lipazių pagalba gaunami kokybiškesni produktai (švaresni,

pasižymintys tolygesne spalva, geresne bendra išvaizda). Lipazės taip pat pagerina

vandeniui atsparios odos produktų kokybę [247]. Šalinant plaukus nuo odos įprastais

tradiciniais metodais, naudojami kalkių ir natrio sulfidų mišiniai – agresyvios ir aplinką

teršiančios medžiagos. Šio proceso metu cheminius reagentus galima pakeisti fermentais

- lipazėmis bei proteazėmis, kurios veiksmingai atpalaiduoja plaukus, kurie vėliau

pašalinami tiesiog juos nufiltruojant. Taip gaunami geresnės kokybės gaminiai.

Popieriaus pramonėje lipazės naudojamos popieriaus valymui, masės

minkštinimo proceso pagreitinimui, baltumo padidinimui, taip sumažinamas naudojamų

agresyvių cheminių medžiagų bei teršalų kiekis, taupomos energijos ir laiko sąnaudos

[249].

1.5.7 Atliekų apdorojimas

Lipazės naudojamos ir valant užterštą, nuotekų vandenį, perdirbant poliesterių

atliekas į naudingus produktus, kaip prevencinė priemonė nuo įrenginių užsikimšimo

riebalinėmis atliekomis bei naikinant įvairias kitas atliekas. Išsiliejusiai naftai ir ja

užterštiems paplūdimiams valyti taip pat naudojamos lipazės [245, 250].

1.6 Biodyzelinas

Nesustojamas populiacijos bei energijos suvartojimo augimas, senkantys

iškastinio kuro ištekliai, vis didesnę grėsmę keliantys dėl vidaus degimo variklių

išmetamųjų dujų emisijų spartėjantys pasaulinio atšilimo reiškiniai yra pagrindinės

priežastys, skatinančios ieškoti alternatyvaus energijos šaltinio, kuris užtikrintų tvarų

42

žmonijos vystymąsi, energetinį saugumą bei pasaulinės ekonomikos augimą [135, 251-

253]. Nuo 1971 iki 2001 m. pasaulinis energijos suvartojimas padvigubėjo, ir manoma,

kad iki 2030 m. energijos poreikis išaugs dar 53 %. Pavyzdžiui, spėjama, kad iki

minėtųjų 2030 m. JAV naftos sunaudojimas išaugs nuo 84,4 iki 116 mln. barelių per

dieną [254]. Remiantis dabartiniu vartojimo greičiu, apskaičiuota, kad iškastinio kuro

turėtų užtekti ne ilgiau nei ateinantiems 50 metų [255].

Viena alternatyvų - iš biomasės gaunamas biokuras: bioetanolis, biometanolis,

biodyzelinas ir biovandenilis [256]. Kadangi biodyzelinui (RR alkilo esterių mišiniui)

būdingos fizikinės ir kitos savybės yra artimos iš naftos gautam dyzelinui, kas leidžia jam

efektyviai veikti tradiciniuose varikliuose be jokių didesnių papildomų modifikacijų,

būtent jis iš visų biokuro rūšių šiuo metu sulaukia didžiausio dėmesio [256-259].

Biokuro naudojimo dyzeliniuose varikliuose idėja pirmą kartą pristatyta

pasaulinėjė parodoje Paryžiuje 1900 m., kai dyzelinio variklio išradėjas Rudolf Christian

Karl Diesel (1858 - 1913) kaip kurą panaudojo žemės riešutų aliejų. Biokuras ar

augaliniai aliejai buvo naudojami vidaus degimo varikliuose 1920 - 1930 m. bei antrojo

pasaulinio karo metu visame pasaulyje. Vokietija, Argentina, Japonija, Belgija, Italija,

Prancūzija, Jungtinė Karalystė, Portugalija ir Kinija bandė ir naudojo įvarių rūšių

biokurą, tačiau dėl tuo metu ypatingai gausių naftos išteklių bei gerokai mažesnės

iškastinio kuro kainos alternatyvaus kuro idėja didesnio dėmesio nesulaukė, tad degalų

augalinių aliejų pagrindu kūrimas bei tolimesni tyrimai nebuvo vykdomi.

Atsinaujinantys energijos šaltiniai bei tokio tipo kuras didesnio dėmesio sulaukė

palyginti neseniai (augalinių aliejų, kaip kuro, tyrimai JAV prasidėjo 1978 m., o Pietų

Afrikoje – 1981 m.), kai buvo suvokta, kad būtina sumažinti šiltnamio efektą sukeliančių

dujų emisiją, o iškastinio kuro ištekliai labai greitai senka, ir todėl turi būti rasti

ekologiški atsinaujinantys pakaitalai [257, 260, 261]. 1982 m. Vokietijoje ir Austrijoje iš

rapsų aliejaus gauti metilo esteriai, o 1985 m. Austrijoje pastatytas pirmasis mažas

bandomasis fabrikas. Komercinė metilo esterių gamyba pirmiausia prasidėjo Europoje

1990 m. Nuo tada biodyzelinas lėtai plito Europos, ypač Vokietijos ir Prancūzijos,

rinkose, dažniausiai naudojamas ne grynas, bet maišomas su tradiciniu dyzelinu.

Komerciškai šie mišiniai vadinami BXX, kur XX yra skaičius, nurodantis procentinę

biodyzelino tūrio dalį dyzelino ir biodyzelino mišinyje. Šiuo metu rinkoje yra keturios

43

pagrindinės biodyzelino koncentracijos: grynas (B100), mišinys (B20 - B30), priedas

(B5) ir tepalingumo priedas (B2). 2003 m. Europoje pagaminta daugiau nei 2,7 mln. tonų

biodyzelino, o tikslas – iki 2020 m. pasiekti 20 % visos dyzelinio kuro rinkos [259, 262].

1.6.1 Biodyzelino privalumai

Šiuo metu biodyzelinas yra laikomas vienu idealiausių atsinaujinančių energijos

šaltinių. Lyginant su įprastu kuru, gaunamu iš naftos, biodyzelinas pasižymi keletu

reikšmingų privalumų: gaunamas iš įvairių atsinaujinančių biologinių šaltinių (augaliniai,

dumblių aliejai, gyvūninės kilmės riebalai, riebalinės atliekos ar šių žaliavų mišiniai),

mažiau toksiškas, greitai suyra gamtoje, jo struktūroje esantis deguonies kiekis (11 - 15

%) užtikrina spartesnį sudegimo vidaus degimo varikliuose procesą ir mažesnį į aplinką

išskiriamų teršalų kiekį: jį naudojant į aplinką išskiriama mažiau sieros oksido (100 %),

anglies monoksido (44 %), smulkiųjų dalelių (particulars) (40 %), nesudegusių

angliavandenilių (68 %) ir policiklinių aromatinių angliavandenilių (80 - 90 %) [263-

268]. Biodyzelinas vadinamas CO2 neutraliu kuru, mat jam degant išsiskyręs anglies

dioksidas yra sunaudojamas jo žaliavos augimo metu, ir taip nedidinamas šiltnamio

efektas [257, 263]. Kadangi augaliniuose aliejuose sieros koncentracija artima nuliui,

naudojant biodyzeliną sumažinama sieros rūgšties daroma žala aplinkai [269, 270]. Be

to, biodyzelino sudėtyje nėra ir sunkiųjų metalų (švino, vanadžio ir kadmio).

Ypatingai svarbi biodyzelino savybė – bioskalumas (skyla keturis kartus greičiau

nei įprastas kuras, gaunamas iš naftos), tad atsitiktinio išsiliejimo metu aplinkai

padaroma gerokai mažesnė žala palyginus su atitinkamais naftos išsiliejimo avarijų

padariniais [259, 262]. Kaip jau minėta, RR metilo esteriai (biodyzelinas) yra netoksiški

ir lengvai biodegraduojantys vandeninėje aplinkoje. Nustatyta, kad per 21 d. laikotarpį

biologiškai suskaidoma 98 % iš rapsų aliejaus gautų metilo esterių, o gryno iš naftos

gauto dyzelino suskaidymo efektyvumas per tą patį laikotarpį siekia tik 60 %. Tad iš

rapsų aliejaus gauti metilo esteriai visiškai atitinka pagrindinius tarptautinius

biodegradacijos standartus (biokuro skaidymo efektyvumas turi siekti daugiau nei 90 %

per 21 d. laikotarpį) [271].

Biodyzelinui būdinga santykinai aukšta pliūpsnio temperatūra (150oC), (iš naftos

gauto tradicinio dyzelino atveju temperatūra nesiekia nė 64oC), tad jis yra nedegus,

44

nesprogus, mažiau lakus (neprodukuoja sprogių garų), o tai garantuoja didesnį jo

pervežimo bei laikymo saugumą [135]. Šis kuras pasižymi ir geromis tepalinėmis

savybėmis, kurių dėka sumažinamas variklio susidėvėjimo greitis [272].

1.6.2 Biodyzelino gamyba

Grynas augalinis aliejus pasižymi žemu oksidaciniu stabilumu ir po to

vykstančiomis polimerizacijos reakcijomis, mažu lakumu, dėl ko degimo metu susidaro

santykinai didelis pelenų kiekis, bei gana didele klampa (11 - 17 kartų didesnė už

dyzelinio kuro), dėl ko yra netinkamas klasikiniams vidaus degimo varikliams [3], ir dėl

to turi būti chemiškai modifikuojamas į monoalkilo esterius.

Pagrindiniai šiuo metu egzistuojantys metodai, siekiant gauti biodyzeliną, yra

mikroemulsinimas [273], maišymas su naftos produktais [274, 275], terminis

krekingas/pirolizė [276, 277] bei transesterinimas [278, 279]. Klampos mažinimas ir

cetano skaičiaus didinimas mikroemulsinimo ir terminio krekingo metodais pasirodė

nepakankamai veiksmingas, o aliejų maišymas su naftos produktais (dyzelinu), nors ir

dažnai taikomas, visgi nepakankamai sumažina iškastinio kuro sąnaudas, be to, nėra iki

galo ištirtas tokio kuro ilgalaikis poveikis varikliui [269].

TAG transesterinimo ir laisvų RR esterinimo reakcijos pasirodė esąs

reikšmingiausias ir palankiausias būdas, gaminant aukštesnės kokybės biodyzeliną [263,

280, 281]. Šių reakcijų metu bet kokios kilmės žaliava, turinti laisvų RR ir/ar TAG, tokia

kaip augaliniai aliejai, riebalinės atliekos, gyvūninės kilmės riebalai ir kt. paverčiama

biodyzelinu. Reakcijos metu vienas molis TAG reaguoja su trimis moliais alkoholio,

susidarant trims moliams alkilo esterių bei vienam moliui glicerolio (1.17 pav.) [282,

283]. Tai yra trijų grįžtamų reakcijų seka, kurių metu TAG paverčiamas DAG, DAG –

MAG, ir tada MAG – gliceroliu [284].

Katalizatorius

Triacilglicerolis Alkoholis Esteriai Glicerolis

1.17 pav. Triacilglicerolių transesterinimo alkoholiais reakcijos schema [282].

45

Transesterinimo reakcijos efektyvumą bei galutinių produktų išeigos dydį

nulemia keletas veiksnių: reakcijos temperatūra, laisvų RR ir vandens kiekis žaliavoje,

katalizatoriaus tipas bei kiekis, reakcijos trukmė, substratų molinis santykis, alkoholio

tipas bei tiekimo į reakcijos mišinį pobūdis, ko-tirpiklių naudojimas bei maišymo

intensyvumas [254]. Transesterinimo reakcija yra grįžtama, ir alkoholio

(acilakceptoriaus) perteklius pastumia pusiausvyrą į produkto susidarymo pusę.

Egzistuoja du transesterinimo metodai: su katalizatoriumi ir be jo

(superkritinėmis sąlygomis) [285, 286]. Katalizatorius gali būti cheminės (rūgštinis,

bazinis) arba fermentinės kilmės. Šiuolaikiniai tyrimai koncentruojasi į šarminę ir

fermentinę katalizę, nes, veikiant rūgštiniams katalizatoriams, procesas yra ilgas, reikia

didesnio alkoholio kiekio, aukštesnės temperatūros, didesnio slėgio, o tai ekonomiškai

nepalanku [287, 288].

Nors šiuo metu vis dar vyrauja cheminiai metodai, jie turi keletą akivaizdžių

trūkumų: didelės energijos sąnaudos, brangi įranga, sudėtingi procesai, aplinkos tarša

[289]. Daugumos šių trūkumų galima išvengti taikant biotechnologinę (fermentinę)

gamybą. Fermentinio proceso metu riebalų transesterinimo reakcijas katalizuoja lipazės

[282, 290-292]. Nors šio proceso ekonominės sąnaudos pramoniniu mastu yra gana

didelės, o biologiniams katalizatoriams būdinga palyginti lengva inaktyvacija, tačiau

įvairių acilakceptorių, tirpiklių ir pigiausių daugkartiniam naudojimui tinkamų fermentų

paieška, fermentų modifikacijų bei imobilizacijos taikymas teikia vilčių sukurti

konkurencingą rinkai patrauklų biodyzelino gamybos metodą [24, 254, 287, 293].

Kaip minėta anksčiau, transesterinimo reakcijas galima vykdyti ir be įprasto

katalizatoriaus. Tokių reakcijų metu naudojamas superkritinis metanolis, kuris, esant

superkritinėms sąlygoms (pvz., 350oC, 43 Mpa), pats veikia kaip rūgštinis katalizatorius

[294]. Tokia reakcija trunka nepalyginamai trumpiau (mažiau nei 4 minutes) [258, 295,

296], gali būti naudojama cheminei katalizei netinkama žaliava (turinti didesnį laisvų RR

ir vandens kiekį), tačiau procesas labai brangus ir sunkiai įgyvendinamas didelio masto

gamybos pramonėje dėl būtinų ekstremalių reakcijos sąlygų, o didelio metanolio kiekio

naudojimas (metanolio ir aliejaus molinis santykis gali siekti 42:1) yra pavojingas

aplinkai. Visa tai trukdo proceso komercializavimui [297]. Siekiant sušvelninti proceso

46

sąlygas, naudojami įvairūs ko-tirpikliai, pridedamas nedidelis kiekis katalizatoriaus

[293].

1.6.3 Biodyzelino kokybę nulemiantys veiksniai

Biodyzelino kokybę gana smarkiai nulemia RR sudėtis bei transesterinimo

reakcijoms naudojamo alkoholio tipas. Kuo ilgesnė RR grandinė, tuo geresnės bus tokios

biodyzelino savybės kaip šiluminė talpa [298] ir cetano skaičius, kuris nusako gebą

detonuoti (t.y., užsiliepsnoti nuo suspaudimo) [299]. Žiemos metu aliejai, turintys didelį

kiekį sočių RR, gali užkišti kuro tiekimo linijas dėl sukietėjimo [259, 262, 300, 301].

Biodyzelinas, gaminamas iš aliejų, turinčių didelį oleino rūgšties kiekį, pasižymi

savybėmis, artimiausiomis įprastam dyzeliniam kurui [3, 302]. Visais metodais gauti

galutiniai biodyzelino sintezės produktai turi atitikti visuotinai apibrėžtus griežtus

reikalavimus (Europinis standartas EN 14214, JAV – ASTM D 6751-02) [303].

1.6.4 Žaliava

1.6.4.1 Aliejus

Kaip žinoma, svarbiausia priežastis, stabdanti biodyzelino komercializacijos

procesą, yra dideli gamybos kaštai, kurių 70 - 80 % sudaro žaliavos (maistinių aliejų)

kaina [252, 304]. Nors biodyzelino gamybai maistinis aliejus yra labai plačiai

naudojamas, ir tai šiuo metu vis dar yra pagrindinė žaliava, vis dėlto maisto stygius

besivystančiose šalyse bei natūralios bioįvairovės sutrikdymo grėsmė dėl didelių

maistinės aliejingos žaliavos plantacijų skatina ieškoti alternatyvių nemaistinės kilmės

riebalų šaltinių (dumbliai, nemaistiniai aliejai, riebalinės atliekos ir kt.) [305-309]. Būtent

fermentinė katalizė suteikia galimybę panaudoti tokią alternatyvią žaliavą, nes jai nėra

būdingi saviti chemine katalize pagrįsti technologijos trūkumai: būtinas ypatingai mažas

laisvų RR bei vandens kiekis žaliavoje, norint išvengi potencialaus muilų susidarymo

proceso metu [254, 293].

Žaliavos pasirinkimas paprastai priklauso nuo geografinės vietovės padėties ir

klimato sąlygų [302] bei ekonomikos [310], pvz., JAV – sojų, Europoje – rapsų ir

saulėgrąžų, o tropinio klimato šalyse – palmių bei kokosų aliejai yra įprasta biodyzelino

gamybos žaliava [311, 312]. Pasaulyje augalinių aliejų gamyba nuolat auga [313].

47

Pirmaujantis pagal išgavimo mastus maistinis aliejus gaunamas iš palmių - jo gamyba

išaugo nuo 17,1 mln. tonų 1997 m. iki 38,2 mln. tonų 2006 m. [314]. Šiam aliejui

būdingas didžiausias iš 1 ha išgaunamas produkto kiekis (apie 5000 kg), palyginus su

kitais aliejais, kurių didžiausias išgaunamas iš 1 ha žaliavos kiekis siekia 2250 kg

(kokosų aliejaus atveju), tad ekonominiu atžvilgiu naudingiausia naudoti palmių aliejų

[251]. Pagrindinė palmių aliejaus gamintoja yra Malaizija (Indonezija yra antroji šalis

pagal palmių aliejaus eksporto mastą pasaulyje) [314, 315].

Kadangi, kaip minėta anksčiau, didžiąją biodyzelino kainos dalį sudaro tradicinių

augalinės kilmės žaliavų kaina, didelių kaštų problemą bandoma spręsti, ieškant

tinkamiausių nemaistinės žaliavos šaltinių, mat įvairių aliejų naudojimui biodyzelino

gamyboje nėra jokių techninių apribojimų. Vieni tokių aliejų - ricinų ir braivėlių

(Jatropha curcas) [251]. Biodyzelino gamyba iš šių aliejų yra konkurencinga gamybai iš

maistinių aliejų tiek proceso, tiek ir kokybės atžvilgiu [316]. Palyginus su kita aliejinga

žaliava, Jatropha curcas kultūroms būdingas papildomas privalumas – atsparumas

sausrai (gali augti apleistose, nederlingose kitiems augalams netinkamose žemėse) [317].

Šiuo metu ypatingai didelis susidomėjimas biodyzelino gamyba iš dumblių aliejų

[318, 319]. Demirbas (2010) teigia, kad tai yra vienintelė žaliava, galinti visiškai

patenkinti transporto sektoriaus kuro poreikį pasauliniu mastu. Teigiama, kad artimiausiu

metu būtent šis aliejus taps pagrindine ir svarbiausia biodyzelino gamybos žaliava [320].

Dumbliai yra mikroskopiniai autotrofiniai ir heterotrofiniai organizmai [321,

322], sparčiai besidauginantys ir augantys tiek sintetinėse (druskų tirpalai), tiek ir

natūraliose (vandenvalos ir gyvulininkystės bei paukštininkystės fermų nuotekos) terpėse

[323]. Palyginus su augalais, dumblių augimas yra labai spartus procesas [324, 325],

pavyzdžiui, Chlorella per 24 val. suformuoja dvi naujas generacijas, t.y., iš vienos

ląstelės susidaro keturios. Kai kurios dumblių rūšys sukaupia ypatingai daug lipidų [326],

kurie savo sudėtimi yra analogiški iš įprastų augalinių kultūrų (rapsų, saulėgrąžų, palmių

ir kt.) gaunamiems aliejams [327, 328]. Be to, dumblių aliejaus kiekis hektarui žemės yra

gerokai didesnis palyginus su tradicinėmis aliejingomis kultūromis (l.2 lentelė).

Plačiausiai lipidų išskyrimui iš dumblių yra naudojami spaudimo, ekstrakcijos

tirpikliais, ardymo ultragarsu ir kt. metodai, o išskirtų lipidų išeigos gerokai viršija iš

tradicinių aliejingų augalų išskirtų aliejų išeigas [327-329]. Po lipidų išskyrimo likusi

48

dumblių biomasė gali būti paversta kitomis biodegalų rūšimis – biometanu, bioetanoliu ir

biovandeniliu. Visgi, siekiant komercializuoti šį procesą, susidurta su dumblių ląstelių

ardymo bei aliejų ir kitų bioproduktų išskyrimo iš jų problema. Literatūroje iki šiol nėra

aprašyta nė vieno visapusiškai efektyvaus metodo.

1.2 lentelė. Iš kai kurių šaltinių išgaunamo aliejaus bei kai kurių mikrodumblių sukaupiamų lipidų kiekio palyginimas [285]

Šaltinis Išgaunamo aliejaus kiekis (L/ha)

Lipidų kiekis (% sausos biomasės)

Kukurūzai 172

Soja 446

Rapsai 1190

Braivėlis 1892

Riešutinė kokospalmė 2689

Palmė 5950

Mikrodumbliaia 136900

Mikrodumbliaib 58700

-Botryococcus braunii 25 - 75

-Chlorella sp. 28 - 32

-Crypthecodinium cohnii 20

-Cylindrotheca sp. 16 - 37

-Dunaliella primolecta 23

-Isochrysis sp. 25 - 33

-Monallanthus salina > 20

-Nannochloris sp. 20 - 35

-Nannochloropsis sp. 31 - 68

-Neochloris oleoabundans 35 - 54

-Nitzschia sp. 45 - 47

-Phaeodactylum tricornutum 20 - 30

-Schizochytrium sp. 50 - 77

-Tetraselmis sueica

15 - 23 a kai lipidai sudaro 70 % sausos biomasės b kai lipidai sudaro 30 % sausos biomasės

Riebalinių atliekų naudojimas vietoj grynų aliejų galėtų veiksmingai (60 - 90 %)

sumažinti biodyzelino kainą bei dirbamos žemės plotus, skirtus biodyzelino gamybai

reikalingoms kultūroms auginti, tačiau prieš tokių atliekų taikymą gamyboje, būtina

49

atlikti gryninimo procedūras, kas vėlgi nėra ekonomiškai palanku [254], tuo labiau, kad

nustatyta, jog tokios žaliavos naudojimo metu išsiskiria dioksinai [330]. Be to, būtina

sukurti efektyvią tokių atliekų surinkimo infrastruktūrą.

Atliekų aliejus savo sudėtimi gana skiriasi nuo įprastai naudojamų šviežių aliejų.

Esant aukštesnei temperatūrai ir didesniam vandens kiekiui, vyksta TAG hidrolizė, todėl

vandens kiekis riebalinėse atliekose siekia apie 2000 ppm, o laisvų RR gali būti iki 15 %

ar daugiau [331]. Tad šiuo atveju šarminė katalizė negali būti taikoma dėl galimo muilų

susidarymo [332, 333]. Kita vertus, lipazės gali esterinti visas atliekų aliejuose esančias

laisvas RR [334]. Pavyzdžiui, palyginus Novozym 435 katalizuojamas reakcijas, kai kaip

žaliava naudotas atliekų bei grynas aliejus, nustatyta, kad reakcijos abiem atvejais vyksta

panašiai, produktyvumas beveik toks pat. Nors didesnis vandens kiekis atliekose ir

sumažino metanolizės greitį, tačiau reakcijos pusiausvyrai įtakos neturėjo [335]. Tai

patvirtina lipazių pritaikymo galimybę, perdirbant riebalines atliekas [334].

Biodyzelino gamybai gali būti naudojami ir gyvulinės kilmės riebalai [336] bei

aliejai, gauti iš genetiškai modifikuotų augalų, produkuojančių daugiau aliejų,

pasižyminčių papildomomis teigiamomis savybėmis (atsparumu sausrai ar ligoms) ir pan.

[20, 337, 338]. Tačiau šiuo atveju turi būti ypatingai atsižvelgta į atsargumo priemones,

siekiant užtikrinti tokių genetiškai modifikuotų kultūrų biosaugumą [337].

1.6.4.2 Acilakceptoriai

Įvairių riebalų transesterinimo reakcijų metu kaip acilakceptoriai dažniausiai

naudojami trumpagrandžiai alkoholiai, ypač metanolis (daugelyje šalių tai pigiausias

alkoholis) ir kiek rečiau etanolis. Dažniau pasirenkamas metanolis, nes jis yra pigesnis,

reaktingesnis, o RR metilo esteriai yra lakesni bei mažiau klampūs, palyginus su

atitinkamais etilo esteriais. Kita vertus, etanolis yra mažiau toksiškas, be to, gali būti

lengvai gaunamas fermentacijos būdu iš atsinaujinančių šaltinių (biomasės), o didžioji

metanolio dalis yra gaunama iš iškastinio kuro [339]. Naudojami ir kiti alkoholiai, tačiau

jie yra brangesni, todėl bendros ekonominės proceso sąnaudos būna didesnės [286].

50

1.6.5 Cheminė katalizė

Pramoninis biodyzelino gamybos procesas paprastai vyksta kaitinant augalinį

aliejų, esant alkoholio (dažniausiai metanolio) pertekliui bei neorganiniam katalizatoriui.

Kaip katalizatoriai dažniausiai naudojami šarmai (metalų alkoksidai ir hidroksidai), nes

tai yra santykinai pigūs ir lengvai gaunami katalizatoriai, be to, šarminė katalizė vyksta

apie 4000 kartų greičiau nei rūgštinė [313, 340]. Hidroksidai naudojami dažniau nei

alkoksidai, nes jie yra pigesni, tačiau ne tokie aktyvūs kaip atitinkami alkoksidai.

Šarminis katalizatorius, pvz., kalio hidroksidas, reaguoja su metanoliu, susidarant kalio

metoksidui, kuris ir reaguoja su TAG. Reakcijos produktai – esterių mišinys bei keletas

šalutinių produktų, kurių pagrindinis yra glicerolis. Tokio proceso pagrindinis trūkumas

yra tas, kad katalizatorius atsiskiria kartu su glicerolio sluoksniu ir nebegali būti toliau

naudojamas [341]. Dalinės TAG alkoholizės metu susidaro DAG ir/ar MAG, kurie turi

būti atskirti ir grąžinti į reaktorių. Reakcijos mišinyje taip pat randamos laisvos RR,

vanduo bei nesureagavęs katalizatorius.

Nors šarminės katalizės metu per gana trumpą laiką gaunamos didelės produkto

išeigos, šis procesas turi keletą reikšmingų trūkumų: žaliava turi būti pakankamai gryna

(laisvų RR turi būti mažiau nei 1 %, o vandens < 0,5 %) [342]. Kai biodyzelino gamybai

naudojamas aliejus savo sudėtyje turi daug laisvų RR ir vandens, tradiciniai šarminiai

katalizatoriai netinka, nes proceso metu laisvos RR reaguoja su šarminiu katalizatoriumi,

ir susidaro muilai. Taip sunaudojamas katalizatorius, sumažėja pageidaujamo galutinio

produkto – alkilo esterių – išeiga, sudėtingėja glicerolio atskyrimas nuo alkilo esterių,

padidėja klampa, susidaro geliai, emulsija, - visa tai sudaro daug problemų vėliau

gryninant ir išgaunant alkilo esterius [283, 343, 344]. Po reakcijos junginių atskyrimo

stadijos metu dėl poliškumo muilai ištirpsta glicerolio fazėje, taip pagerindami metilo

esterių tirpumą glicerolyje, ir sumažindami galutinę esterių išeigą [272].

Be to, po reakcijos, siekiant pašalinti muilus ir glicerolį, galutinis produktas 2 - 3

kartus plaunamas dideliu kiekiu vandens, taip susidaro apie 0,2 t. šarminių nuotekų

vienai tonai biodyzelino, kurios po to turi būti atitinkamai neutralizuojamos,

apdorojamos. Be to, susidaręs glicerolis paprastai būna užterštas katalizatoriaus

51

priemaišomis, ir tai sumažina jo komercinę vertę. [289, 342]. Tradicinės šarminės

biodyzelino gamybos schema pateikta 1.18 paveiksle.

Kaip alternatyva naudojami rūgštiniai homogeniniai katalizatoriai (pvz., sieros

rūgštis), kurie tinkami žemos kokybės žaliavai (turinčiai didelį laisvų RR bei vandens

kiekį) [346]. Šiuo atveju nesusidaro muilai, tuo pačiu metu vyksta ir laisvų RR

esterinimas, ir TAG transesterinimas, tačiau esterinimo reakcija trunka ilgai, reikia

aukštesnės temperatūros ir didelės rūgšties koncentracijos, kas daro neigiamą įtaką

aliejui, be to išlieka ir gryninimo problemos [135, 347, 348], o rūgštinis katalizatorius

gali sukelti dar ir įrangos koroziją [346].

Transesterinimo

reakcija

Neapdorotų

biodyzelino gamybos

produktų atskyrimas

Neapdororas glicerolis, priemaišos, nešvarumai

Glicerolio

gryninimasMineralinė rūgštis (H2SO4)

Laisvos riebalų rūgštys

Neutralizacija/

plovimas

vandeniu

Neapdorotas biodyzelinas

Mineralinė rūgštis (H3PO4)

Nuotekos

Aliejus/riebalai

Alkoholis

Šarmas

Distiliacija/

garinimas

Alkoholis perdirbimui

Džiovinimas

Galutinis

produktas

(biodyzelinas)

Grynas glicerolis

1.18 pav. Tradicinė šarminė biodyzelino gamyba [345].

Kaip minėta, didžiausios cheminės katalizės problemos yra ilga reakcijos trukmė

(rūgštinių katalizatorių atveju) ir metilo esterių nuo glicerolio atskyrimas (muilo

susidarymas šarminių katalizatorių atveju). Šias problemas bandoma spręsti naudojant

rūgštinę ir šarminę katalizę apjungiantį dviejų stadijų procesą. Pirmos stadijos metu

vyksta rūgštinė katalizė - esterinamos laisvos RR iki mažesnio nei 1 % kiekio. Antros

stadijos metu vyksta šarminė katalizė – riebalų transesterinimo reakcija [349, 350].

Literatūroje aprašomi atvejai, kai dviejų stadijų procesas reakcijos produktų išeigas

padidino 30 %, palyginus su vienos stadijos procesais, ir biodyzelino išeiga siekė 98 %

[351, 352]. Daugeliu tyrimų nustatyta, kad dviejų stadijų procesas yra veiksmingesnis,

tačiau ir šiuo atveju susiduriama su tam tikromis problemomis, kurių didžiausia – po

kiekvienos stadijos būtinas katalizatoriaus pašalinimas iš reakcijos mišinio. Ši problema

gali būti sprendžiama neutralizuojant pirmos stadijos rūgštinį katalizatorių, tačiau tuomet

antros stadijos metu turi būti naudojamas gerokai didesnis šarminio katalizatoriaus

52

kiekis, kas padidina proceso kaštus, be to katalizatorių likučiai vėliau gali būti

kenksmingi varikliams [254].

Įranga, kurioje vykdomi cheminės katalizės procesai, turi būti atspari šiems

agresyviems agentams, be to, reikia aukštų saugumo standartų. Tai daro šį procesą

ekonomiškai nepalankų ir per daug sudėtingą [135].

1.6.6 Fermentinė katalizė

Nors finansiniu požiūriu cheminis būdas pranašesnis už fermentinį, tačiau

ypatingai daug energijos, vandens išteklių ir laiko sąnaudų reikalaujantis produkto

gryninimas, pašalinant iš mišinio glicerolį, vandenį ir netinkamus produktus, skatina

ieškoti optimalių katalizės sąlygų, užtikrinančių ekologiškesnį ir ekonomiškesnį proceso

vyksmą. Tiesioginis RR esterinimas ar TAG transesterinimas alkoholiais lipazių pagalba

yra kur kas patrauklesnis būdas nei klasikinė pramoninė cheminė konversija, nes taip

galima išvengti daugelio anksčiau minėtų problemų [300, 353, 354].

Imobilizuotų lipazių taikymas yra perspektyviausias išvardintų problemų

sprendimo būdas: reakcijos gali vykti be tirpiklio - terpėse, sudarytose tik iš reaguojančių

medžiagų mišinio, susidarant išimtinai tik RR esteriams bei gliceroliui, o galimybė

pakartotinai naudoti imobilizuotą fermentą sumažina proceso kaštus [347, 353, 355,

356]. Susidarę produktai lengvai atskiriami ir yra ypatingai aukštos kokybės (fementinės

biodyzelino gamybos schema pateikta 1.19 paveiksle). Be to, lipazių katalizuojamų

procesų veiksmingumui užtikrinti pakanka švelnių reakcijų sąlygų: santykinai žemos

temperatūros, atmosferos slėgio, nereikia naudoti agresyvių reagentų. Tačiau ir čia

susiduriama su tam tikromis problemomis, kurių viena pagrindinių – lipazių slopinimas

reakcijos mišinio komponentais [357]. Be to, neapdorotame aliejuje paprastai aptinkamas

sąlyginai didelis fosfolipidų kiekis. Žaliavoje esantys fosfolipidai padengia lipazių

paviršių, taip slopindami jų aktyvumą, todėl prieš biodyzelino gamybos procesą būtinas

fosfolipidų pašalinimas. Šiam tikslui įgyvendinti taikomi patys įvairiausi metodai:

hidratacija, filtracija membranomis, superkritinė ekstrakcija ir kt. [358, 359].

53

Transesterinimo

reakcija

Produktų

atskyrimas/gryninimas

Apatinis sluoksnis

Glicerolio

gryninimas

Viršutinis sluoksnis

Aliejus/riebalai

Alkoholis

Fermentai

Galutinis

produktas

(biodyzelinas)

Grynas glicerolis 1.19 pav. Fermentinė biodyzelino gamyba [345].

Lipazių katalizuojamos transesterinimo reakcijos plačiai vykdomos įvairiuose

organiniuose tirpikliuose bei sistemose be tirpiklių. Nors katalizinis transesterinimo

mechanizmas (ping-pong bi-bi) yra gerai išaiškintas [360] ir reakcijos sistema paprastai

sudaryta tik iš penkių skirtingų junginių (fermento, dviejų substratų: alkoholio ir esterio,

likutinio vandens ir organinio tirpiklio), reakcijos kinetika, esant skirtingoms sąlygoms,

vis dar gali nustebinti. Kinetikos sudėtingumas kyla iš to, kad visi junginiai sąveikauja, ir

todėl dažnai sunku įžiūrėti atskirus efektus/poveikius, identifikuoti jų molekulinius

mechanizmus ir prognozuoti sistemos elgesį [361].

1.6.6.1 Lipazėms keliami reikalavimai

Pagrindiniai reikalavimai, keliami lipazėms, norint jas panaudoti biodyzelino

gamyboje:

• didelė galutinio produkto išeiga (pageidaujamas nestereosavitumas, kad visi tri-,

di- ir monoacilgliceroliai galėtų būti paversti RR esteriais);

• nedidelis fermento slopinimas reakcijos mišinio komponentais (alkoholiu bei

reakcijos metu susidarančiu gliceroliu);

• greitas procesas;

• galimybė pakartotinai naudoti fermentą (imobilizacija);

• atsparumas temperatūros ir naudojamo organinio tirpiklio poveikiui;

• lengvas ir pigus lipolizinio fermento gavimas.

Burkholderia cepacia (Pseudomonas cepacia) yra viena dažniausiai naudojamų

bakterinių lipazių transesterinimo reakcijoms katalizuoti. Imobilizuota lipazė pakankamai

efektyviai katalizuoja biodyzelino sintezę tiek organiniuose tirpikliuose, tiek sistemose

be tirpiklio [362, 363]. Dažnai naudojama ir iš Pseudomonas fluorescens išskirta lipazė

54

[364, 365]. CALB yra plačiausiai taikoma iš mielių išskiriama lipazė [366]. Plačiai

naudojamos ir iš Candida sp. 99-125 [86] bei C. rugosa [367] išskirtos lipazės.

Dažniausiai transesterinimo reakcijoms naudojamų grybinės kilmės lipolizinių fermentų

pavyzdžiai: T. lanuginosus [368], R. oryzae [369], Penicillium expansum [215],

Geotrichum sp. [370] ir kitos lipazės. Literatūroje aprašyti ir iš kiaulės kasos išskirtos II

tipo lipazės gebos katalizuoti transesterinimo reakcijas tyrimai, tačiau didžiausia gauta

esterių išeiga nesiekia nė 19 % [371].

Šiuo metu egzistuoja pačios įvairiausios lipazių efektyvumo didinimo bei savybių

gerinimo strategijos, pradedant baltymų inžinerijos metodais ir baigiant imobilizacija bei

chemine modifikacija. [252]. Literatūroje aprašytas sėkmingas netgi visos R. oryzae

ląstelės kaip biokatalizatoriaus panaudojimas, ir ištirta ląstelės membranos sudėtyje

esančių RR įtaka biodyzelino gamybai [372]. Palyginus imobilizuotus fermentus su visos

ląstelės katalizatoriais, pastarieji pasižymi unikalia savybe – jie veikia kaip nedirbtinai

imobilizuoti fermentai. Tokiu būdu ši technologija tampa ekonomiškene bei paprastesne

alternatyva tradiciniams dirbtinio imobilizavimo metodams [252].

1.6.6.2 Fermento slopinimo reakcijos komponentais problemos sprendimo būdai

Gaminant biodyzeliną fermentinės katalizės būdu, viena aktualiausių problemų –

fermento slopinimas vienu iš reakcijos substratų - trumpos grandinės alkoholiu

(metanoliu) - ir reakcijos metu susidarančiu gliceroliu. Kadangi metanolis yra

augaliniuose aliejuose netirpus junginys, sistemoje susidaro nauja skysta fazė, nulemianti

fermento inaktyvaciją ir dėl to sumažėjusią galutinio produkto išeigą [23, 373]. Nors

molekulinis slopinimo metanoliu mechanizmas nėra iki galo išaiškintas, manoma, kad,

aliejuose susidarantys metanolio lašeliai, esant didelėms jo koncentracijoms, inaktyvuoja

lipazes, jas denatūruodami [354, 373].

Slopinantis metanolio poveikis yra didelis reakcijos pradžioje, bet proceso eigoje

poveikis mažėja, nes mažėja metanolio koncentracija, o jo tirpumas produktuose (RR

esteriuose) yra geresnis nei substratuose (TAG) [373]. Kita vertus, reakcijos metu

susidarantis hidrofilinis šalutinis produktas glicerolis taip pat netirpus aliejuose, tad jis

lengvai adsorbuojasi ant imobilizuotų lipazių paviršiaus, taip neigiamai veikdamas jų

55

aktyvumą bei stabilumą [335, 374, 375]. Tad slopinimo dėl katalizatoriaus pasidengimo

glicerolio molekulėmis reakcijos pradžioje nėra, bet proceso eigos metu jis auga [375].

Literatūroje siūlomi keli būdai šiai problemai spręsti: nuolatinis mažų metanolio

porcijų tiekimas į reakcijos mišinį, kitų acilakceptorių ir/ar įvairių tirpiklių parinkimas,

fermento apdorojimas prieš reakciją ir kt. [373, 376]. Skirtingų lipazių jautrumas

metanoliui skiriasi, tad taip pat svarbu parinkti ir tinkamą lipazę. Pavyzdžiui, nustatyta,

kad viena populiariausių daugeliui organinių tirpiklių atspari CALB (Novozym 435) yra

slopinama didelių metanolio koncentracijų [354, 373, 377], o labiausiai metanoliui

atsparus fermentas – lipazė, išskirta iš Pseudomonas cepacia.

Tokių hidrofobinių tirpiklių kaip n-heksanas ar petrolio eteris naudojimas

reakcijų mišiniuose [378] problemos neišsprendžia dėl prasto metanolio bei glicerolio

tirpumo juose [379]. Literatūroje aprašomas gana veiksmingos trioleino metanolizės

metodas, kai 1,4-dioksanas naudojamas kaip metanolį tirpinantis ko-tirpiklis, tačiau, kad

jo naudojimas pasiteisintų, reikia labai didelės šio tirpiklio dalies (90 %) [364]. Nors

tirpiklių naudojimas fermentinėje biodyzelino gamyboje yra vertinamas gana nepalankiai

dėl atsirandančios papildomos proceso stadijos (tirpiklio šalinimo iš reakcijos mišinio),

tačiau tirpiklio šalinimas yra įprasta praktika cheminėje biodyzelino gamyboje, todėl,

pramoniniu mastu, po fermentinės reakcijos tirpikliai gali būti regeneruojami kartu su

nesureagavusiu metanoliu [375].

Nustatyta, kad daugeliu atvejų hidrofilinio tret-butanolio naudojimas vietoj

tradicinių tirpiklių gali padidinti produkto išeigą [375, 380, 381]. Manoma, kad tai susiję

su tuo, jog tiek metanolis, tiek glicerolis yra tirpūs šiame tirpiklyje, dėl ko ir sumažėja jų

slopinantis poveikis [354, 375, 379-381]. tret-Butanolis yra tretinis alkoholis, tad jis

daugeliu atvejų nėra lipazių substratas [382], be to, tai - santykinai pigus, netoksiškas

tirpiklis [375]. Tokioje sistemoje dėl neigiamo metanolio ir glicerolio poveikio

neutralizavimo išauga lipazės veikimo stabilumas: aktyvumas nekinta net po 200-kartinio

jos panaudojimo [383]. Nors patvirtinta, kad tret-butanolis padidina metanolio tirpumą,

taip panaikindamas jo slopinantį poveikį lipazėms, molekulinis veikimo modelis liko

neišspręstas. Türkan ir Kalay (2008) nustatė, kad tret-butanolis keičia lipazių

katalizuojamų reakcijų mechanizmą, kaip tikėtina, sukeldamas konformacinius fermento

struktūros pokyčius, kas taip pat pašalina ir metanolio slopinantį poveikį [384]. Lipazės

56

turi panašią molekulės architektūrą, tačiau jų aktyvaus centro struktūros gali būti gana

skirtingos, kas nulemia kitokį substratinį savitumą ir netgi reakcijos mechanizmą [61,

385]. Nustatyta, kad organiniai tirpikliai gali keisti fermento aktyvumą, greitį

nulemiančią stadiją ir savitumą paprasčiausiai keisdami fizikochemines reakcijos terpės

savybes, tokias kaip poliškumas ir hidrofobiškumas [386, 387].

tret-Butanolio naudojimo privalumai: dideli reakcijų greičiai, didelės išeigos,

nereikia tokių didelių fermento kiekių kaip kitose sistemose, aukštas darbinis fermento

stabilumas net ir esant 50oC temperatūrai. Proceso pabaigoje žema tret-butanolio virimo

temperatūra leidžia jį kartu su metanoliu lengvai pašalinti iš reakcijos mišinio [375].

Siekiant padidinti lipazių stabilumą, aktyvumą ir atsparumą slopinančiam

metanolio poveikiui, fermentas prieš reakciją gali būti veikiamas įvairiais reagentais,

tokiais kaip substratai ar jų analogai, organiniai tirpikliai, druskos ar kraun eteriai.

Nustatyta, kad fermento veikimas 1 mM CaCl2 ir MgCl2 padidina jo aktyvumą,

toleranciją metanoliui bei veikimo stabilumą [388]. Literatūroje aprašomi ir atvejai, kai

metanolizė vyko greičiau, kai prieš reakciją C. antarctica lipazė buvo 30 min. inkubuota

metilo oleate ir po to 12 val. sojų aliejuje [389].

Nustatyta, kad biodyzelino žaliavoje esančios laisvos RR mažina neigiamą

metanolio poveikį lipazei [390]. Tai susiję su reagentų hidrofobiškumu (logPreagentai): kuo

mažesnė │logPreagentai - logPsąlyčio paviršius│vertė, tuo didesnė lipazės tolerancija metanolio

atžvilgiu (P - medžiagos pasiskirstymo tarp 1-oktanolio ir vandens koeficientas) [383,

391].

Dažnai be tret-butanolio biodyzelino sintezė apskritai nevyksta dėl galimo lipazės

slopinimo metanoliu, todėl vietoj metanolio naudojamas etanolis [335, 354, 356, 375,

378, 392]. Kita vertus, vietoj įprastų alkoholių kaip acilakceptoriai buvo pasiūlyti

atitinkami jų acetatai [393]. Nustatyta, kad metilacetatas neturi jokio neigiamo poveikio

fermento aktyvumui, ir beveik jokio aktyvumo netekimo nepastebėta lipazę pakartotinai

naudojant 100 kartų. Be to, taip išvengiama ir neigiamo glicerolio poveikio, nes vietoj jo

susidaro lipazėms jokio šalutinio poveikio neturintis triacetinas (1.20 pav.), ir negana to,

jo pritaikymas/panaudojimas įvairiapusiškesnis, platesnė rinka nei glicerolio [393, 394].

Tačiau tokie acilakceptoriai yra brangesni už įprastus alkoholius, reakcijos vyksta lėčiau,

o produktų išeigos yra gerokai mažesnės [86].

57

Lipazė

Triacilglicerolis Metilacetatas Esteriai Triacetinas

1.20 pav. Lipazių katalizuojamos triacilglicerolių transesterinimo metilacetatu reakcijos schema [393].

Literatūroje aprašomi ir kitokie fermento slopinimo metanoliu problemos

sprendimo būdai. Vienas įdomesnių - vietoj grynų aliejų naudojami tų aliejų ir ricinų

aliejaus mišiniai [395]. Ricinų aliejus gaunamas iš paprastųjų ricinmedžių (Ricinus

communis) sėklų, savo sudėtyje sukaupiančių iki 40 - 60 % aliejaus [396]. Pagrindinė

ricinų aliejaus riebalų rūgštis yra ricinolio (12-hidroksioleino) (1.21 pav.), turinti dvigubą

ryšį ties C9 ir hidroksigrupę ties C12, pastarosios buvimas ir nulemia ricinų aliejaus

tirpumą metanolyje bei transesterinimo reakcijos produkte - metilo esteriuose [395].

Kadangi būtent metanolio netirpumas augaliniuose aliejuose nulemia fermento

inaktyvaciją, manoma, kad ricinų aliejaus pridėjimas į reakcijos mišinį turėtų padidinti

fermentinės aliejų metanolizės efektyvumą. Be to, ricinų aliejus reakcijos metu veikia ne

tik kaip reakcijos efektyvumo didintojas, bet ir kaip substratas [397].

1.21 pav. Ricinolio rūgšties struktūrinė formulė [395].

Iš gryno ricinų aliejaus gautas biodyzelinas netinkamas dėl didelės jo klampos

[398], kita vertus, palyginus su biodyzelinu, gautu iš kitų augalinių aliejų, biodyzelinui iš

ricinų aliejaus būdingas didelis cetano skaičius bei žema ribinė šalto filtravimo

temperatūra (cold filter plugging point). Tad šios abi biodyzelino, gauto iš kitų augalinių

aliejų, savybės gali būti pagerintos, pridedant maždaug 20 % iš ricinų aliejaus gauto

biodyzelino [399, 400].

58

1.6.6.3 Vandens kiekio įtaka transesterinimo reakcijai

Viena vertus, vandens perteklius reakcijos mišinyje gali pastumti reakcijos

pusiausvyrą į riebalų hidrolizės pusę, susidarant laisvoms RR, kita vertus, įvairių

lipolizinių fermentų tyrimais nustatyta, kad nesant vandens, fermentai pasižymi mažu

aktyvumu, ir tai patvirtina, kad minimalus vandens kiekis reikalingas fermentui įgauti ir

palaikyti kataliziškai aktyvią konformaciją, nes lipazės aktyvumas bendru atveju

priklauso nuo fazių sąlyčio ribos, kuri susidaro tarp aliejaus ir vandens [135, 252, 373,

390, 401, 402]. Minimalus vandens kiekis, būtinas aktyviai fermento konformacijai

palaikyti, skirtingiems fermentams skiriasi ir priklauso nuo konkrečios lipazės prigimties,

todėl optimalus vandens kiekis reakcijos mišinyje turi būti nustatomas kiekvienai lipazei

bei reakcijai individualiai.

Nors vanduo organiniuose tirpikliuose yra reikalingas fermentui, jis taip pat

dalyvauja ir daugelyje fermento inaktyvavimo procesų [403]. Per didelis vandens kiekis

sukelia fermento molekulių agregaciją, o tai lemia fermento aktyvumo sumažėjimą. Be

to, imobilizuotų fermentų atveju vanduo gali užpildyti matricos, kurioje imobilizuota

lipazė, poras ir taip neleisti hidrofobiniams substratams pasiekti fermentą. [362-364, 404,

405]. Atlikus tyrimus su skirtingais tirpiklais, besiskiriančiais logP verte, nustatyta, jog

skirtinguose tirpikliuose lipazei palaikyti maksimalų aktyvumą reikia skirtingo kiekio

vandens. Bendru atveju, kuo hidrofobiškesnis tirpiklis, tuo daugiau vandens reikia.

Stebima koreliacija tarp didžiausio vandens kiekio ir tirpiklio logP vertės [135].

Žaliavoje esančių laisvų RR esterinimo reakcijos metu susidarančio vandens

šalinimui iš reakcijos mišinio taikomi įvairūs metodai, tokie kaip dehidratuojančių

agentų, molekulinių sietų, specializuotų membranų ir ceolitų naudojimas [406, 407].

1.6.6.4 Fermento kiekio įtaka reakcijos eigai

Didinant fermento koncentraciją reakcijos mišinyje, proceso efektyvumas auga

iki tam tikros ribos, kurią pasiekus, tolimesnis fermento kiekio didinimas nebeturi jokios

įtakos proceso eigai [378, 382, 408]. Taip gali būti dėl to, kad, esant dideliam lipazės

kiekiui, aktyvusis centras substratams neprieinamas dėl fermento molekulių tarpusavio

agregacijos, susidarant imobilizuotų lipazių aglomeratams [409, 410].

59

1.6.6.5 Skirtingu savitumu pasižyminčių lipazių mišinių naudojimas

Šiuo metu žinoma nemažai imobilizuotų komercinių lipazių, gebančių efektyviai

katalizuoti biodyzelino sintezę [362, 363], tačiau vienų lipazių atveju reikia gana didelio

jų kiekio, kitais atvejais - ilgesnės reakcijos trukmės, kas nulemia didesnius gamybos

kaštus. Novozym 435 yra gana dažnai biodyzelino sintezei naudojama nesavita

komercinė lipazė (gali atskelti visas acilgrupes, esančias TAG molekulėje ties sn-1, 2 ir 3

padėtimis), tačiau dėl didelės šio fermento kainos (2270 $/kg), pramoninis pritaikymas

yra gana ribotas. Kita vertus, kita komercinė lipazė Lipozyme TL IM yra 1,3-savita, t.y.,

gali skelti acilgrupes tik ties sn-1 ir 3 pozicijomis, be to, pasižymi mažesniu

transesterinimo aktyvumu nei Novozym 435. Tačiau tai gerokai pigesnis fermentas - jo

kaina sudaro 1/16 Novozym 435 kainos. Tyrimų metu parodyta, kad kartu naudojant

Lipozyme TL IM ir Novozym 435 fermentus, stebimas teigiamas sinergetinis efektas. Ši

kombinacija sėkmingai pritaikyta biodyzelino sintezei [411]. Tokia strategija gali labai

sumažinti bendrą katalizatoriaus kainą ir padidinti produktų išeigą [261].

Kaip minėta anksčiau, transesterinimo reakcija gali būti suskirstyta į tris stadijas:

TAG pavertimas DAG, DAG – MAG, ir galiausiai MAG – gliceroliu. Greičiausia

Novozym 435 fermento katalizuojamos transesterinimo reakcijos stadija yra MAG

pavertimas gliceroliu, o lėčiausia – DAG pavertimas MAG, tai ir yra bendrą proceso

greitį nulemianti stadija. Kita vertus, Lipozyme TL IM atveju greitį nulemianti stadija yra

TAG pavertimas DAG. Tokiu būdu Novozym 435 ir Lipozyme TL IM kombinacija gali

pašalinti iš proceso greitį nulemiančią stadiją, taip pagreitinant reakciją ir atitinkamai

padidinant produkto išeigą.

1.6.6.6 Temperatūros įtaka

Temperatūra yra dar vienas svarbus fermentų katalizuojamų procesų parametras.

Optimali proceso temperatūra priklauso nuo lipazės šaltinio ir imobilizacijos būdo [412].

Pvz., optimali įvairių lipazių katalizuojamos biodyzelino sintezės transesterinant aliejų

skirtingais alkoholiais reakcijos n-heksane temperatūra svyruoja tarp 30 ir 55oC. Taigi

transesterinimo reakcijos efektyvumas didėja augant reakcijos temperatūrai gana

siaurame temperatūriniame intervale. Tolimesnis temperatūros augimas paprastai neturi

jokio arba pasižymi neigiamu efektu, mat, esant auktesnėms temperatūroms, fermentas

60

destabilizuojamas. Todėl optimali transeterinimo reakcijos temperatūra yra

biokatalizatoriaus veikimo stabilumo bei reakcijos greičio sąveikos rezultatas [163, 364].

1.6.6.7 Priedų įtaka

Siekiant padidinti biodyzelino išeigą fermentinio transesterinimo metu, neretai

naudojami įvairūs priedai. Pvz., nustatyta, kad ciklinės aminorūgšties, ektoino (1,4,5,6-

tetrahidro-2-metil-4-pirimidino karboksirūgšties, 1.22 pav.), naudojimas gali padidinti

biodyzelino išeigą 20,9 %, palyginus su išeiga, gauta be priedo [413].

1.22 pav. Cheminė ektoino (1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidino karboksirūgšties) struktūra [413].

Ektoinas yra priskiriamas osmoprotektoriams (osmolitams) – nedidelėms

molekulėms, pasižyminčioms osmolitiniu poveikiu (padeda ląstelėms išgyventi

ekstremalaus osmosinio streso sąlygomis). Šis junginys paprastai kaupiasi halofilinėse

bei halotolerantinėse bakterijose, esant labai didelei druskų koncentracijai aplinkoje, ir jo

funkcija yra susijusi su osmosinių slėgių pusiausvyros tarp ląstelės vidaus bei išorės

užtikrinimu bei palaikymu. Jis stabilizuoja baltymus, nukleorūgštis, membranas bei

ląsteles, nedarydamas jokio neigiamo poveikio įprastai vykstančioms fermentinėms

reakcijoms ar molekulių sąveikai, todėl gali būti plačiai naudojamas biologinių

makromolekulių bei ląstelių apsaugai bei stabilizacijai.

Nustatyta, kad teigiamas ektoino poveikis fermentinės biodyzelino sintezės metu

yra susijęs su lipazės giminingumo metanoliui sumažinimu, ir atitinkamai,

triacilgliceroliams – padidinimu. Tai yra vienas iš potencialių lipazių slopinimo

metanoliu TAG transesterinimo reakcijų metu problemos sprendimo būdų [413].

1.6.6.8 Tirpiklių įtaka

Jau pirmųjų fermentų katalizinio aktyvumo organiniuose tirpikliuose sisteminių

tyrimų metu buvo pastebėta, kad fermentų katalizinis aktyvumas ir substratinis savitumas

priklauso ne tik nuo substratų struktūros ir koncentracijos, bet ir nuo pasirinkto organinio

61

tirpiklio bei vandens kiekio reakcijos mišinyje [414, 415]. Tad tinkamo tirpiklio ar jų

derinio parinkimas yra puiki strategija, siekiant pagerinti biokatalizatorių veikimą.

Šiuo metu žinomi keturi būdai, kuriais organiniai tirpikliai gali veikti fermentų

katalizuojamą reakciją: (i) fermento aktyvaus centro struktūros bei dinamikos keitimas,

(ii) organinio tirpiklio molekulių konkurencingas jungimasis prie fermento aktyvaus

centro, (iii) prie fermento prisijungusių/esančių vandens molekulių pašalinimas bei (iv)

hidrofobinių substratų tirpumo pagerinimas [361].

Tirpiklio poveikis fermentų struktūrai bei dinamikai ištirtas gana išsamiai. Buvo

pasiūlyta, kad organinių tirpiklių poveikis fermentui pirmiausia susijęs su sąveika tarp

organinio tirpiklio bei fermento surištų vandens molekulių, ir kad mažas vandens kiekis

yra reikalingas efektyviam fermento konformaciniam lankstumui [416]. Nustatyta

koreliacija tarp fermento vidinio mobilumo ir enantioatrankumo [417], o organiniai

tirpikliai gali keisti fermentų lankstumą, taigi tai gali būti antras mechanizmas, kuriuo

tirpikliai keičia fermentų katalizinį aktyvumą ir enantioatrankumą. Trečias mechanizmas

siūlo, kad tirpiklio molekulės gali blokuoti substrato surišimo sritį, t.y., gali vykti

konkurencinis slopinimas organinio tirpiklio molekulėmis. Siekiant padidinti lipazių

katalizuojamos transesterinimo reakcijos efektyvumą, naudojami įvairūs organiniai

tirpikliai, mat jie gali padidinti bendrą tiek hidrofilinių (alkoholių), tiek hidrofobinių

(TAG) substratų tirpumą sistemoje, ir taip užtikrinti reakcijos mišinio homogeniškumą

[418]. Be to, kaip minėta anksčiau, organiniai tirpikliai gali prisidėti prie fermento

apsaugos nuo alkoholio pertekliaus reakcijos mišinyje sukeltos inaktyvacijos. Tirpiklių

naudojimas sumažina reakcijos mišinio klampą, taip sumažindamas masių pernašos

apribojimus ir padidindamas reakcijos greitį. Be to, nepoliniai tirpikliai neleidžia vandens

molekulėms pasitraukti nuo fermento, taip palaikydami fermentą stabilizuojantį vietinį

vandens aktyvumą [419].

Zaks ir Klibanov (1988) buvo pirmieji paskelbę, kad fermentai hidrofobiniuose

tirpikliuose išlaiko savo aktyvumą. Jie nustatė, kad poliškumas ir maišymasis su

vandeniu nėra kritiniai veiksniai/ būtini parametrai [416]. Vėliau Laane su kolegomis

(2009) paskelbė, kad tirpiklio logP yra pagrindinis organinių tirpiklų hidrofobiškumo

parametras, darantis įtaką fermentų katalizuojamoms reakcijoms [420]. Fermento

aktyvumas, stabilumas ir net enantioatrankumas neretai koreliuoja su tirpiklio

62

hidrofobiškumu. Didesni fermentų aktyvumai buvo pastebėti, kai logP vertė yra didesnė

už 2 [421]. Be to, didesnis fermentų stabilumas stebimas labiau hidrofobiniuose

tirpikliuose. Kita vertus, jokios produktų išeigos koreliacijos su tirpiklių poliškumu,

tirpumo savybėmis ar dielektrinėmis konstantomis nerasta [21], tačiau vandens

pridėjimas į polinius tirpiklius sumažina reakcijos efektyvumą, o į nepolinius –

priešingai, - padidina [422].

1.6.6.9 Superkritinių ir joninių skysčių naudojimas

Superkritinių skysčių (medžiagos būsena, pasiekiama slegiant dujas, esant aukštai

temperatūrai) naudojimas padidina difuzijos greičius, kas nulemia didesnius reakcijų

greičius. Vienas tokių skysčių naudojimo privalumų – lengvas tirpiklio savybių keitimas

(tiesiog keičiant reakcijos slėgį ir/ar temperatūrą) [423]. Daugelio dujų, tokių kaip CO2,

etanas, propanas ir butanas kritinė temperatūra yra temperatūrų intervale, kuriame

fermentai išlaiko savo didžiausią stabilumą ir aktyvumą [423, 424]. Tarp skirtingų

superkritinių skysčių superkritinis CO2 yra tinkamiausias dėl netoksiškumo, nedegumo,

pigumo, lengvo gavimo, pasižymėjimo švelniomis kritinėmis savybėmis (31,1oC ir 7,38

MPa) [425]. Be to, pasižymi unikaliomis transportavimo savybėmis, kurios gali

pagreitinti ribotą masių pernašą fermentų katalizuojamose reakcijose [423, 424].

Kitas naujų tirpiklių tipas - joniniai skysčiai, sukuriantys aukštam fermento

kataliziniam aktyvumui palankią aplinką [426]. Joniniai skysčiai – tai organinės tik iš

jonų sudarytos druskų tipo medžiagos, pasižyminčios įspūdingomis savybėmis: žema

lydimosi temperatūra, nedideliu garų slėgiu, nedegumu, puikiu cheminiu ir terminiu

stabilumu, netoksiškumu bei geromis tirpinimo savybėmis. Fizikinės ir cheminės joninių

skysčių savybės gali būti keičiamos, keičiant juos sudarančius katijonus ir anijonus, ir

tokiu būdu joniniai skysčiai gali būti pritaikyti atitinkamiems kataliziniams procesams.

Fermentai tokioje aplinkoje pasižymi išaugusiu atrankumu ir stabilumu, palyginus su

klasikiniais organiniais tirpikliais, ir tai gali būti alternatyvi aplinka procesams, sunkiai

vykstantiems įprastuose organiniuose tirpikliuose ar vandenyje [427].

Sunkiausia dalis, naudojant joninius skysčius, yra produktų atskyrimas nuo

reakcijos mišinio. Vandens kiekis vaidina labai svarbią rolę, nesvarbu ar reakcijai

naudojamas organinis tirpiklis ar joninis skystis [428]. Galimi trys naudojimo variantai:

63

kaip ko-tirpiklis vandeninėje fazėje, kaip grynas tirpiklis, kaip dvifazė sistema kartu su

kitais tirpikliais. Gali būti naudojami ir mažesni nei įprasti joninių skysčių ar organinių

tirpiklių kiekiai, kurie tik padengia lipazės paviršių, taip padidindami fermento aktyvumą

ir stabilumą [429]. Pramonėje netaikoma dėl aukštos tokių junginių kainos. Tinkami tik

ypatingai vertingiems junginiams sintetinti. Vienas pirmųjų sintezės joniniuose

skysčiuose pavyzdžių – CALB katalizuojama oktanamido sintezė (1.23 pav).

Karboksirūgščių fermentinė aminolizė yra sudėtingesnė nei esterių, kadangi reaguojantys

junginiai yra linkę sudaryti nereaktyvias druskas, tačiau joniniuose skysčiuose procesas

vyksta, susidarant didelėms produkto išeigoms [430].

1.23 pav. CALB katalizuojama oktanamido sintezės joniniuose skysčiuose reakcija [430].

1.6.6.10 Ultragarso ir mikrobangų įtaka

Įprastu būdu maišomos transesterinimo reakcijos vyksta santykinai lėtai, o

glicerolio fazės šalinimas yra gana ilgai trunkantis procesas. Ultragarso ir mikrobangų

naudojimas transesterinimo metu ne tik padidina reakcijos greitį, bet ir išsprendžia

anksčiau minėtas problemas [431-434]. Didesnis reakcijų greitis aiškinamas masių

pernašos pagerinimu bei papildomo energijos kiekio įvedimu į sistemą [432].

Reakcijos mišinio kaitinimas mikrobangomis – vis labiau populiarėjanti strategija

tiek cheminėje, tiek fermentinėje katalizėje [435]. Tokiu būdu dažnai įmanoma ne tik

sumažinti reakcijos trukmę, bet ir padidinti produktų išeigas. Kintantis elektrinis laukas,

sąveikaudamas su molekulių dipoliais bei krūvį turinčiais jonais, greitina tų molekulių ar

jonų sukimąsi, ir taip molekulinės trinties dėka generuojama šiluma [436]. Nustatyta, kad

biodyzelino gamybos procesas yra gerokai greitesnis veikiant mikrobangomis nei šildant

reakcijos mišinį įprastais metodais [437]. Atrodytų, kad mikrobangomis veikiama

transesterinimo reakcija yra gana perspektyvi biodyzelino gamybos technologija, visgi

didžiausias apribojimas yra mikrobangų skvarba, kuri tesiekia kelis cm, priklausomai nuo

absorbuojančių medžiagų dieletrinių savybių, be to, norint šią technologiją pritaikyti

didelio masto gamybai, kyla ir įvairūs saugumo klausimai [436].

64

1.7 Lipolizinio aktyvumo nustatymo metodai

Lipolizinis aktyvumas nustatomas naudojant gryną fermento preparatą arba

kultūrinę terpę. Nėra vieno universalaus lipolizinio aktyvumo nustatymo metodo, taikomi

įvairūs metodai [438], iš kurių laboratoriniams tyrimams dažniausiai naudojami trys:

titrimetrinis, spektrofotometrinis bei fluorimetrinis. Lipazių katalizuojamų reakcijų

greitis gali būti išmatuojamas, nustatant substrato sunaudojimo, laisvų RR susidarymo

arba emulsijos skaidrėjimo greičius [439].

Titrimetriniu metodu nustatomas TAG ar kito lipazės substrato hidrolizės metu

atsipalaidavusių laisvų RR kiekis. Kokybiniam reakcijos produkto aptikimui naudojami

spalvoti indikatoriai (fenolftaleinas, timolftaleinas ir kt.). Kiekybiniam laisvų RR

įvertinimui taikomas gana pigus ir patogus pH-statinis metodas, kurio esmė – pastovaus

pH palaikymas reakcijos metu, naudojant žinomos koncentracijos NaOH ar kito šarmo

tirpalą. Kadangi, kaip minėta anksčiau, lipolizės reakcijos greitis priklauso nuo FSP

kokybės, lipolizinis aktyvumas nustatomas naudojant intensyviai maišomus emulsintus

natūralius arba sintetinius substratus. Substratų koncentracija išreiškiama tūrio ar svorio

procentais arba moliais paviršiaus ploto vienetui [133].

Spektrofotometrinė analizė paprastai atliekama po reakcijos sustabdymo

organiniais tirpikliais ar jų mišiniais arba reakcijos metu, matuojant optinio tankio, esant

tam tikram bangos ilgiui (pastarasis parenkamas, atsižvelgiant į reakcijos metu

susidarančius produktus), pokytį per laiko vienetą. Prastas lipazių substratų tirpumas

vandenyje bei emulsijų ir micelių formavimasis turi įtakos šviesos absorbcijai. Ši

problema sprendžiama, naudojant labai praskiestus substratų tirpalus, pridedant įvairių

organinių tirpiklių, paviršiaus aktyvių medžiagų ir pan. Taikomi spektrofotometrinės

analizės variantai: tiesioginis (reakcijos metu susidaro spalvotas junginys, pvz., p-

nitrofenolis) ir netiesioginis (reakcijos metu susidarę produktai sąveikauja su kitais

junginiais, susidarant optiškai aktyviems dariniams, arba tokiais junginiais paverčiami

kitų fermentinių reakcijų metu) [440].

Fluorimetrinės analizės metodu lipolizinis aktyvumas nustatomas matuojant

fluorescencijos pokyčius, sąlygojamus RR fluoresceino esterių hidrolizės metu

susidarančio fluoresceino ar įvairių kitų fluorescuojančių medžiagų, susidarančių jomis

65

pažymėtų įvairių lipidų arba jų analogų (pirenas, dansilas, kumarinas ir kt.) hidrolizės

metu. Šiuo atveju fluorescuojančią žymę turi lipazių substratai. Be to, galima sekti žymę

turinčios RR, prijungtos prie savito surišančio baltymo, pakeitimą RR, atsipalaiduojančia

lipolizės reakcijos metu. Panašiai kaip ir spektrofotometriniu, šiuo metodu galima

nustatyti jau susidariusį produktą arba sekti jo susidarymą reakcijos metu.

Kiti metodai:

• Kontroliuojamo įtempimo sąlyčio paviršiaus sudarymo metodas. Lipazių

katalizuojamos reakcijos vyksta vandens ir lipidų FSP, todėl šio paviršiaus

įtempimas yra ne mažiau svarbus parametras negu pH ar temperatūra. Į vandeninę

fazę įnešta lipazė adsorbuojasi ant substrato plėvelės ir jį hidrolizuoja. Substrato

monosluoksnio hidrolizės metu, mažėja pastarojo tankis bei paviršiaus įtempimas,

kuris tam tikrais laiko intervalais atnaujinamas, naudojant mobilų paviršiaus

barjerą. Vykstant reakcijai, galima kontroliuoti įvairius substrato monosluoksnio

parametrus: paviršiaus įtempimą, potencialą ar radioaktyvumą [25].

• Radiometrinis ir chemiliuminescensinis metodai, nepaisant jų jautrumo, dėl

didelių ekonominių sąnaudų ir sunkumų sintetinant žymėtus substratus nėra

plačiai paplitę [438].

• Turbidimetrinės analizės metu matuojamas reakcijos mišinio drumstumo

mažėjimas, esant 340 nm ilgio bangai.

• Chromatografiniai metodai. Plonasluoksnės (TLC), dujų (GC), dujų-skysčių

(GLC), aukšto slėgio skysčių tiesioginės arba atvirkštinės fazės (HPLC)

chromatografiniai metodai naudojami lipolizės reakcijos produktų

frakcionavimui, kurie po to gali būti analizuojami masių spektrometrijos būdu.

• Konduktometrinės analizės metu, naudojant gryną fermentą ar kultūrinę terpę,

matuojamas elektros laidumas.

• Branduolio magnetinio rezonanso spektroskopiniais (BMR) metodais tiriamas

lipazių aktyvumas difuzinėse makroemulsijose arba analizuojami reakcijos

produktai (poziciniai izomerai).

• Infraraudonųjų spindulių (IR) spektroskopiniu metodu tiriama TAG hidrolizė

atvirkštinėse micelėse bei analizuojami reakcijos produktai [25].

66

2 MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Medžiagos

2.1.1 Fermentai

Komerciniai „NovoNordisk“ (Lipoprime 50T) bei „Novozymes“ lipolizinių

fermentų preparatai gauti iš UAB „Biopolis“, Vilnius, dovana (2.1 lentelė).

2.1 lentelė. Pagal standartinį metodą (2.3.1 skyrelis) laboratorijoje išmatuoti tyrimams naudotų lipolizinių fermentų hidroliziniai aktyvumai p-nitrofenilbutirato atžvilgiu

Kieti U/gpreparato Skysti U/mlpreparato Lipex 100T 130 Lecitase Ultra 15 Lipoclean 2000T 2938 Lipex 100L 77 Lipolase 100T 568 Lipolase 100L 51 Lipopan 50BG 968 Lipozyme TL100L 17 Lipopan FBG 4670 Palatase 20000L 10 Lipoprime 50T 27841 Resinase A2X 86 Lipozyme RMIM 28 Resinase HT 43 Lipozyme TLIM 11008 Novozym 435 144 Novozym 435FG 238

2.1.2 Aliejai

Dauguma tyrimams naudotų aliejų yra komerciniai maisto produktai. Judrų

aliejus buvo gautas iš Aleksandro Stulginskio Universiteto (ASU), ricinų aliejus įsigytas

medicininiais preparatais prekiaujančioje vietoje, o kokosų aliejus pirktas „Sigma“.

2.2 lentelė. Tyrimams naudoti aliejai Aliejus Paskirtis Gamintojas Šalis Alyvuogių (AA) Maisto produktas „Corporation Oliveira“ Ispanija Dagių (DA) Maisto produktas „Gloria“ Vokietija Judrų (JA) Reagentas ASU Lietuva Kakavos sviestas (KS) Maisto produktas AB „Pergalė“ Gana Kokosų (KA) Reagentas „Sigma“ Vokietija Linų sėmenų (LSA) Maisto produktas „Anira“ Vokietija Rapsų (RA) Maisto produktas „Obelių“ Lietuva Ricinų (RiA) Farmacijos produktas AB „Bakteriniai preparatai“ Lietuva Ryžių luobelių (RLA) Maisto produktas „Rizi“ Tailandas Saulėgrąžų (SA) Maisto produktas „Obelių“ Ukraina Vynuogių sėklų (VSA) Maisto produktas „Anira“ Ispanija

2.1.3. Alkoholiai

„Lachema“ (Čekija): metanolis, etanolis, 2-propanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis,

1-heksanolis. „Roth“ (Vokietija): tret-butanolis, tret-amilo alkoholis, terpenoliai -

geraniolis ir linalolis. „Merck“ (Vokietija): β-citronelolis. „Sigma-Aldrich“ (Vokietija):

67

trimetilolpropanas (TMP) bei aromatiniai alkoholiai – hidrochinonas, katecholis,

pirogalolis bei rezorcinolis. „Fluka“(Vokietija): 2-butanolis ir oleilo alkoholis (OA).

„Reachim“ (Rusija): izoamilo alkoholis.

2.1.4 Kiti reagentai

„Fluka“ (Vokietija): ektoinas, oleino rūgštis (OR). „Sigma“: trimetilolpropano

trioleatas (TMP-TO), oleino rūgšties metilo esteris (MO), trioleinas (TO), dioleinas (DO,

1,3–dioleino (85 %) ir 1,2–dioleino (15 %) mišinys), 1-monooleinas), p-nitrofenilo

esteriai - p-nitrofenilbutiratas (p-NPB) ir p-nitrofenilpalmitatas (p-NPP), Bredfordo

reagentas, jaučio serumo albuminas, metalinis jodas ir natrio dezoksicholatas. „Acros

Organics“ (Belgija): glutaro ir sieros rūgštys. „Reachem Slovakia“ (Slovakija): oksalo

rūgštis. „Roth“ (Vokietija): acto rūgštis, benzenas, diizopropilo eteris, izooktanas, n-

heptanas, n-oktanas, tret-butilmetilo eteris, tetrahidrofuranas, ftalo ir galo rūgštys,

etilacetatas, linalilesteris, agaras, geležies ir aliuminio sulfatai, mangano chloridas, natrio

molibdatas, natrio nitratas, mėlynasis silikagelis su indikatoriumi (2 - 4 mm.) ir

molekuliniai sietai (3 ir 4Å). „Sigma-Aldrich“ (Vokietija): acetonas, acetonitrilas, 2-

butanonas, chloroformas, cikloheksanas, dietilo eteris, dimetilformamidas,

dimetilsulfoksidas, dioksanas, n-heksanas, petrolio eteris, piridinas, n-pentanas,

skruzdžių rūgštis, toluenas, butilacetatas, citrinų rūgštis. „Chempol“ (Lenkija):

gumarabik. „Lachema“ (Čekija): natrio hidroksidas ir ortofosforo rūgštis. „Reachim“

(Rusija): boro rūgštis, fenolftaleinas, cinko sulfatas ir monokalio fosfatas. „Chempur“

(Lenkija): kalcio ir natrio chloridas, kalio fosfatas, magnio sulfatas bei etilendiamino

tetraacto rūgštis (EDTA). „Alfa Aesar“ (A Johnson Matthey Company, Vokietija):

glikolio eteriai - dietilenglikolio dietilo eteris, dietilenglikolio dibutilo eteris,

etilenglikolio dietilo eteris ir tetraetilenglikolio dimetilo eteris.

Silikageliu dengtos chromatografinės stiklo plokštelės (G-25, sluoksnio storis

0,25 mm.) pirktos „Merck“ (Vokietija).

Universalus buferis (UB) – Britono-Robinsono (Britton-Robinson) buferis -

ruošiamas iš acto, boro ir ortofosforo rūgščių santykiu 1:1:1, skiedžiant iki reikiamos

koncentracijos bei pH privedant iki 8,0.

68

2.1.5 Mikrodumbliai

Dumblių padermės gautos iš Čekijos Trebono miesto Botanikos instituto

(www.butbn.cas.cz). Chlorella vulgaris CCALA 896, ALGEUS 1942/SAG 211-11p,

išskirta Švedijoje iš Lundo miesto municipaliniame parke esančio tvenkinio, o

Scenedesmus dimorphus CCALA 443, KOMAREK 1962/36, išskirta Čekijoje iš Stary

Hospodar žuvų tvenkinio, esančio netoli Trebono miesto.

2.2 Baltymų kiekio nustatymas

Baltymų kiekis buvo nustatomas klasikiniu Bredfordo metodu [441] pagal

standartinę kalibracinę kreivę, gautą, naudojant jaučio serumo albuminą.

2.3 Lipolizinio aktyvumo nustatymas

2.3.1 Tirpios lipazės hidrolizinio aktyvumo p-NPB atžvilgiu nustatymas

Hidrolizinis aktyvumas buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu

termostatuojamoje kiuvetėje, palaikant 30oC temperatūrą, 0,1 M UB, pH 8,0 buferyje

kaip substratą naudojant 10 mM p-NPB tirpalą 2-propanolyje, matuojant optinio tankio

pokytį, esant 410 nm bangos ilgiui. Galutinė substrato koncentracija matavimo kiuvetėje

esančiame reakcijos mišinyje buvo 0,1 mM. Savaiminė substrato hidrolizė buvo tiriama

analogiškomis sąlygomis, tik be fermento [75]. Lipazės hidrolizinio aktyvumo vienetas

(U) atitinka tokį fermento kiekį, kuris katalizuoja 1 µmol produkto – riebalų rūgščių -

susidarymą per 1 minutę. Reakcijos schema pateikta 2.1 paveiksle.

Lipazė

2.1 pav. Lipazės katalizuojama p-nitrofenilbutirato hidrolizės reakcija, susidarant butano rūgščiai ir spalvotam junginiui - p-nitrofenoliui [442].

2.3.2 Imobilizuotų lipazių hidrolizinio aktyvumo p-NPB atžvilgiu nustatymas

Hidrolizinis aktyvumas buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu

termostatuojamoje kiuvetėje, palaikant 30oC temperatūrą, kaip substratą naudojant 10

mM p-NPB tirpalą 2-propanolyje. Reakcijos mišinys, kurį sudarė 20 mg sauso

69

imobilizuoto fermento preparato, 2,5 - 7,5 ml UB, pH 8,0 bei 25 - 75 µl substrato, buvo

inkubuojamas, esant 30oC temperatūrai, 1 - 3 min. (priklausomai nuo fermento

aktyvumo). Po to reakcijos tirpalas buvo nufiltruojamas nuo imobilizuoto fermento ir

matuojamas jo optinis tankis, esant 410 nm bangos ilgiui.

2.3.3 Tirpios lipazės hidrolizinio aktyvumo p-NPP atžvilgiu nustatymas

Substrato tirpalas buvo ruošiamas dviem etapais. Pirmiausia 20 mg p-NPP buvo

ištirpinta 6 ml 2-propanolio, tuomet 100 mg gumarabiko ir 207 mg natrio dezoksicholato

ištirpinta 90 ml buferio. Į 19 ml buferio su ištirpintais reagentais intensyviai maišant

buvo sulašintas 1 ml paruošto p-NPP tirpalo (substrato tirpalo tūris priklauso nuo

mėginių skaičiaus, tačiau išlaikomas tirpalų santykis 19:1). Taip paruošta substrato

emulsija tinkama naudoti 2 val. Reakcijos mišinį sudarė 1,8 ml substrato emulsijos ir 0,2

ml fermento (kontrolės atveju – buferio). Galutinė substrato koncentracija – 0,4 mM.

Reakcijos sąlygos: pH 8,0, 40oC temperatūra, A400nm, reakcijos trukmė - 3 - 5 min.

2.4 Kiekybinis laisvų riebalų rūgščių nustatymas titrimetrija

Liekamasis (esterinimo reakcijos metu) arba išsiskyrusių (transesterinimo

reakcijų metu) laisvų RR kiekis buvo nustatomas reakcijos mišinį titruojant 50 ± 5 mM

NaOH tirpalu metanolyje, esant 22°C temperatūrai. Tiksli NaOH koncentracija tirpale

buvo nustatyta, titruojant iš fiksanalo paruoštu 0,1 N HCl tirpalu. Kaip indikatorius

naudotas fenolftaleino tirpalas etanolyje. Kiekvienas matavimas kartotas 3 - 4 kartus.

2.5 Plonasluoksnė chromatografija ir densitometrija

Tam tikrais laiko tarpais iš kiekvieno reakcijos mišinio buvo imami mėginiai (po

50 µl), reakcija sustabdoma, pripilant po 50 µl (jei buvo tiriama reakcijos sistema

nenaudojant tirpiklių – 350 µl) dietilo eterio ir užšaldant. Lipazių katalizuojamų reakcijų

metu susidariusių produktų bei nesureagavusių pradinių medžiagų analizė buvo

atliekama klasikiniu plonasluoksnės chromatografijos metodu ant skirtingo dydžio (5x10

cm ir 10x10 cm) silikageliu dengtų (sluoksnio storis - 0,25 mm) chromatografinių

plokštelių.

70

Chromatografinėje plokštelėje 1,0 cm nuotoliu nuo krašto buvo pažymima starto

linija, ant kurios, priklausomai nuo tiriamų mėginių skaičiaus ir naudojamos plokštelės

dydžio, 0,8 – 1,0 cm nuotoliu vienas nuo kito 5 µl Hamiltono mikrošvirkštu užnešami

tiriamų medžiagų mėginiai (po 2 - 8 µl). Po kiekvieno mėginio užnešimo mikrošvirkštas

praplautas 2-propanoliu bei n-heksanu. Išdžiovinta plokštelė buvo merkiama į

chromatografijos indą su atitinkama eliucijos (organinių tirpiklių) sistema taip, kad inde

esantis tirpiklių mišinys neapsemtų pažymėtos starto linijos. Eliucijos sistemai pasiekus

numatytą aukštį, plokštelė buvo išimama ir, pažymėjus fronto liniją, 10 - 15 min.

džiovinama traukos spintoje.

Siekiant nustatyti nesočiuosius junginius, išdžiuvusios plokštelės buvo

ryškinamos jodo garų kameroje, o sočiųjų junginių atveju - apanglinamos sieros rūgštimi

(plokštelės nupurškiamos metanolio, sieros rūgšties ir acto rūgšties anhidrido mišiniu

(tūrių santykis 20:2:2) ir kaitinamos 15- 20 min., esant 120oC temperatūrai).

Kiekybinė TLC metodu atskirtų reakcijų mišinius sudarančių produktų analizė

buvo atliekama densitometrijos principais, naudojant UVItec Cambridge Fire-reader

TLC duomenų dokumentavimo sistemą bei UVItec Fire-reader 15.10 vaizdo apdorojimo

programą. Kiekvienos dėmės sugertis buvo apskaičiuota pagal jos plotą bei intensyvumą

kiekviename chromatogramos elemente, atmetus foninę sugertį. Pagal gautus duomenis

(3 - 4 matavimų vidurkis) apskaičiuota kiekvieno susidariusio produkto bei likusio

nesureagavusio substrato procentinė dalis visame reakcijos mišinyje.

TLC analizei tinkamų eliucijos sistemų – tirpiklių mišinių atranka buvo

atlikta, naudojant tiriamų aliejų (RA, JA, SA, AA, RiA, KS, LSA bei RLA) kontrolinius

mišinius, sudarytus iš 0,4 g aliejaus n-heksane (bendras tūris 4,5 ml) ir eterio (tūrio

santykiu 1:1). TLC analizė buvo atliekama kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.6 Biodyzelino sintezė

2.6.1 Rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu

Reakcijos mišinys, kurį sudarė aliejus ir alkoholis (molinis reagentų santykis 1:2

– 1:16) n-heksane, tret-butanolyje arba įvairių santykinių tūrio dalių n-heksano ir tret-

butanolio mišinyje (vandens dalis reakcijos mišinyje - 0 – 40 %) bei lipazės preparatas

71

(galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 11 – 110 mg/ml; naudojant keletą lipazių

preparatų, koncentracija buvo perskaičiuota į aktyvumo vienetus), 1 - 168 val. inkubuotas

30o – 50oC, maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos

koncentracijos aliejaus, alkoholio, distiliuoto vandens bei tirpiklio mišiniai, inkubuoti

tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta,

taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje. Laisvų RR kiekis reakcijų mišiniuose

nustatytas titrimetriniu metodu, kaip aprašyta 2.4 skyriuje.

2.6.2 Rapsų aliejaus transesterinimas skirtingais acilakceptoriais

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis, metil- ar butilacetatas

(molinis substratų santykis 1:4) n-heksane, tret-butanolyje arba reakcijos sistemoje be

tirpiklio bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 30

min. - 24 val. maišomas magnetine maišykle kambario temperatūros sąlygomis (25oC).

Maišymo poveikio įvertinimui analogiškos reakcijos vykdytos ir be maišymo. Kaip

kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus, alkoholio bei tirpiklio mišiniai,

laikyti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė reakcija. Mėginių analizė

atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.6.3 Ektoino įtaka biodyzelino sintezės reakcijai

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis (molinis reagentų

santykis 1:6) n-heksane, tret-butanolyje arba reakcijos sistemoje be tirpiklio, lipazės

preparatas (galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 44 mg/ml) bei reakcijos priedas –

ektoinas (galutinė koncentracija mišinyje – 1,1 mM), 1 - 24 val. inkubuotas 40oC,

maišant magnetine maišykle. Palyginimui kaip kontrolės analogiškos reakcijos vykdytos

ir be priedo. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus, alkoholio bei

tirpiklio mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė

reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

72

2.6.4 Tirpiklių įtaka biodyzelino sintezės reakcijai

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis (molinis reagentų

santykis 1:6) skirtinguose tirpikliuose (tret-butanolyje, n-heksane, dietilenglikolio

dibutilo eteryje, etilenglikolio dietilo eteryje, dietilenglikolio dietilo eteryje bei

tetraetilenglikolio dimetilo eteryje) bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija

reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 3 - 24 val. inkubuotas 40oC, maišant magnetine maišykle.

Reakcijos mišinys buvo džiovinamas molekuliniais sietais (3 – 4 Å) bei mėlynuoju

silikageliu su drėgmės indikatoriumi. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos

reagentų mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė


2.7 Oleino rūgšties ir trimetilolpropano esterių – biotepalų - sintezė

Lipazių katalizuojamos metiloleato transesterinimo ir oleino rūgšties esterinimo

trimetilolpropanu reakcijos buvo tiriamos trimis metodais. Pirmasis buvo pasirinktas,

atsižvelgus į E. Uosukainen’o ir bendraautorių metodiką [19]: reakcijos mišinys,

sudarytas iš MO arba OR ir TMP (molinis reagentų santykis 3,5:1 ir 4,5:1) vandenyje (15

% w/w) bei lipazės preparatas (40 % w/w), 1 - 120 val. inkubuotas, esant 37 ir 47oC

temperatūroms, maišant magnetine maišykle. Antrasis metodas – šiek tiek modifikuotas

pirmojo variantas: vietoj vandens buvo naudotas tret-butanolis, o reakcijos mišinys

inkubuotas, esant 60oC temperatūrai. Trečiojo metodo esmė – bet kokių papildomų

tirpiklių atsisakymas, naudojamo fermento kiekio sumažinimas iki 15 % (w/w) bei

fermentinių preparatų mišinių taikymas. Kaip kontrolės naudoti atitinkamų koncentracijų

reagentų mišiniai be fermento, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta

fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1

skyrelyje.

2.8 β-Citronelolio esterių sintezė

Reakcijos mišinys, kurį sudarė aliejus ir alkoholis (molinis reagentų santykis 1:4)

įvairiuose organiniuose tirpikliuose bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija

reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 3 - 24 val. inkubuotas, esant 30oC temperatūrai, maišant

magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus,

73

alkoholio bei tirpiklio mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta

fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1

skyrelyje. Laisvų RR kiekis reakcijų mišiniuose nustatytas titrimetriniu metodu, kaip

aprašyta 2.4 skyriuje.

2.9 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas

Reakcijos mišinys, sudarytas iš karboksirūgšties ir alkoholio (molinis reagentų

santykis - 1:1; jei naudojama dikarboksirūgštis, tuomet rūgšties ir alkoholio molinis

santykis - 1:2, atitinkamai) n-heksane bei lipazės preparato (galutinė koncentracija

reakcijos mišinyje 21 mg/ml), inkubuotas 1 – 144 val., esant 40o – 60oC temperatūrai

maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos grynos

karboksirūgšties, alkoholio bei n-heksano mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis,

kokiomis vykdyta ir fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą,

kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.10 Muilo gamybos atliekų utilizavimo tyrimas

2.10.1 Muilo gamybos atliekų transesterinimo ir esterinimo reakcijos

I dalis. Pamuilių mišinys ekstrahuotas skirtingais tirpikliais – potencialiais lipazių

substratais (metilacetatas, butilacetatas, izopropanolis, izobutanolis, izoamilo alkoholis,

metanolis, etanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis, 1-heksanolis) – tūrio santykiu 1:1.

Reakcijos mišinys, sudarytas iš 0,87 ml pamuilių, 1,65 ml tirpiklio (vanduo, tret-

butanolis arba n-heksanas) bei 100 mg fermento, buvo inkubuotas 30 min. – 5 val., esant

30oC temperatūrai, maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos

koncentracijos pamuilių bei tirpiklių mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis,

kokiomis vykdyta ir fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą,

kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

II dalis. Pamuilės ekstrahuotos įprastais lipazių katalizuojamoms reakcijoms

naudojamais tirpikliais: vandeniu, tret-butanoliu, toluenu, n-heksanu bei n-heptanu.

Reakcijos mišinys, kurį sudarė 0,87 ml pamuilių, 1,65 ml atitinkamo tirpiklio (vanduo,

tret-butanolis, toluenas, n-heksanas, heptanas), 65 - 195 µl metanolio bei 100 mg

74

fermento, buvo inkubuotas 30 min. – 48 val., esant 30oC temperatūrai, maišant

magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos pamuilių bei

tirpiklių mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta ir fermentinė


2.10.2 Chlorella vulgaris ir Scenedesmus dimorphus dumblių padermių auginimas

Dumblių padermės augintos ir palaikytos standartiniais mikrobiologiniais

metodais [443] mėgintuvėliuose ant agarizuotos sintetinės Bristol terpės kambario

temperatūroje pastovaus apšviestumo vietoje. Padermių augimo eiga buvo tikrinta

kasdien, o persėjmas vykdytas sterilioje aplinkoje kas mėnesį. Biomasės priauginimui

pirmiausia buvo atgaivinamos skystoje terpėje esančios padermės. Sėjimo lazdele

padermės buvo užsėjamos į mėgintuvėlius su 50 ml autoklavuotos (120°C, 1 MPa, 30

min.) modifikuotos sintetinės Bristol terpės. Auginama 30 dienų, po to 15 ml (10 %

sėjamos terpės tūrio) atsigavusios padermės buvo persėjama į 250 ml tūrio kolbą su 150

ml minėtos terpės. Toks tūris pasirinktas dėl to, kad mėginiai nebuvo aeruojami. Steriliai

užsėjus, kolbos buvo užkemšamos vatos ir marlės kamščiais. Padermės skystoje terpėje

persėjamos kas 10 - 20 dienų. Auginama termostate, esant 25°C temperatūrai, 12:12 (12

val. šviesos ir 12 val. tamsos) šviesos periodo sąlygomis.

Pamuilių įtaka dumblių padermių augimui tirta pasirinktų padermių dumblius

auginant įvairiai skiestose „Ringuvos“ muilo gamybos atliekose (toliau – pamuilėse) bei

palyginimui - skirtingos sudėties sintetinėse terpėse (TAMIA, M8, Bristol ir Basal terpių

sudėtys pateiktos 2.3 lentelėje). Kiekviena padermė auginta dviejose 250 ml tūrio

kolbose, kuriose buvo 150 ml neautoklavuotos terpės. Kolbos laikytos termostate,

palaikant 25°C temperatūrą, 12:12 (12 val. šviesos ir 12 val. tamsos) šviesos periodo

sąlygomis 14 dienų.

2.3 lentelė. Cheminių elementų koncentracija sintetinėse terpėse, mg/l. Cheminiai elementai

Terpė Na K Mg Ca Fe Mn Cu Zn

Tamia 1280 2900 1900 - - - - - Bristol be peptono 78 81,3 19,5 9,5 - - - -

M8 700 337 102 14 8,6 0,2 0,04 0,052 Basal 20 8,75 8,2 0,72 - - - -

75

3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Darbo metu buvo tirtos įvairios lipazių katalizuojamos esterinimo bei

transesterinimo reakcijos. Kadangi reakcijų sąlygų įtaka procesų eigai daugiausia buvo

tiriama pigiu ir patogiu klasikinės plonasluoksnės chromatografijos metodu,

eksperimentų pradžioje jis ir buvo pritaikytas tiriamų reakcijų metu susidarančių

konkrečių produktų analizei. Tinkamos eliucijos sistemos (mobilios fazės, organinių

tirpiklių mišinio) parinkimas ne tik užtikrina efektyvų ir patikimą kokybinį reakcijos

mišinį sudarančių junginių atskyrimą bei nustatymą, bet ir leidžia įvertinti reakcijos metu

susidarančių produktų bei sunaudojamų pradinių medžiagų kiekybinius pokyčius, taikant

densitometrijos principus, naudojant atitinkamą įrangą bei kompiuterines programas

(mūsų atveju - UVItec Cambridge Fire-reader TLC duomenų dokumentavimo sistemą ir

UVItec Fire-reader 15.10 vaizdo apdorojimo programą).

TLC analizei tinkamiausių eliucijos sistemų atranka (3.1 pav.) atlikta kaip

kontroles naudojant įvairius aliejus - RA, JA, SA, AA, RiA, KS, LSA ir RLA, - kurių

cheminės sudėties kiekybiniai skirtumai pateikti 3.1 lentelėje, bei kitus grynus cheminius

junginius, kaip galimus fermentų katalizuojamų reakcijų produktus (oleino rūgšties

metilo esterį, trimetilolpropano trioleatą, trioleiną, oleino rūgštį, dioleiną, monooleiną);

pastarųjų išsidėstymas chromatogramose pateiktas 3.2 paveiksle.

3.1 lentelė. Pagrindinių riebalų rūgščių kiekis (%) tirtuose aliejuose [302, 304, 310-313]

Riebalų rūgštys

Miristo C14:0

Palmitino C16:0

Stearino C18:0

Oleino C18:1

Linolo C18:2

Linoleno C18:3

Ricinolio 12-hidroksioleino

C18:1 Aliejai Rapsų 0,1 5,1 4,5 57,9 24,7 7,9 - Judrų 3 - 8 2 - 6 11 - 25 15 - 24 30 - 40 - Saulėgrąžų 6,5 4,5 21 68 - - Alyvuogių 9 - 10 2 - 3 73 - 84 10 - 12 pėdsakai - Ricinų 6 - 2 5 - 1 1 - 0,5 85 - 95 Kakavos sviestas

4 57 36 1 2 -

Linų sėmenų 4 - 7 2 - 4 25 - 40 35 - 40 25 - 60 - Ryžių luobelių

15,0 1,9 42,5 39,1 1,1 -

Iš visų tyrimams pasirinktų aliejų įdomiausias - RiA, nes jo sudėtyje yra net 85 -

95 % ricinolio rūgšties, turinčios hidroksigrupę ties C12 (pastarosios buvimas nulemia

įprastiems aliejams nebūdingą RiA tirpumą įvairiuose hidrofiliniuose junginiuose) [395].

76

Visų tirtų aliejų, išskyrus KS, sudėtyje vyrauja nesočiosios 18 anglies atomų turinčios

RR. Oleino rūgšties (C18:1) daugiausiai aptinkama AA, kiek mažiau – RA, o RLA bei

LSA atveju - ir OR (C18:1), ir linolo rūgšties (C18:2) kiekiai praktiškai vienodi.

Pastarosios rūgšties didžiausias kiekis randamas SA (apie 68 %). Polinesočiosios

linoleno rūgšties (C18:3) daugelyje aliejų neaptinkama arba nustatomi tik pėdsakai,

išskyrus JA bei LSA, kuriame ši RR gali sudaryti net iki 60 % bendro visų RR kiekio.

Nesočioji 18 anglies atomų turinti stearino RR vyrauja kakavos svieste, o palmitino

rūgšties (C16:0) daugiausiai aptinkama RLA bei AA sudėtyje.

Chloroformas : acetonas : acto r.: Chloroformas : acetonas: Heksanas: eteris: 96:4:1 96:4 90:10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Petrolio eteris:eteris:acto r.:

90:10:1 75:25:1 85:15:2 80:20:2 70:30:2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

3.1 pav. TLC analizei tinkamų eliucijos sistemų atranka. 1 – RA; 2 – JA; 3 – SA; 4 – AA; 5 – RiA; 6 – KS; 7 – LSA; 8 – RLA; 9 – kontrolių mišinys (monooleinas, DO, TO).

1 2 3 4 5 6 3.2 pav. Grynų cheminių junginių, kaip galimų lipazių katalizuojamų reakcijų substratų bei produktų, chromatografinis vaizdas. 1- MO; 2 – TMP-TO; 3 – TO; 4 - OR; 5 – 1,3- ir 1,2-DO mišinys; 6 – monooleinas. Eliucijos sistema: petrolio eteris : eteris : acto rūgštis = 85:15:2.

Įvairių organinių tirpiklių mišinių atrankos metu nustatyta, kad mūsų tiriamų

reakcijų metu susidarančių produktų bei nesureagavusių pradinių medžiagų atskyrimui

TLC analizės metodu tinkamiausios eliucijos sistemos, sudarytos iš petrolio eterio, eterio

77

bei acto rūgšties (3.1 pav.), lyginant su kitais mokslinėje literatūroje plačiai aprašytais bei

įvairių tyrimų metu dažnai naudojamais organinių tirpiklių mišiniais [444-446]. Keičiant

šio mišinio sudedamųjų dalių santykinį kiekį, eksperimentams parinkta efektyviausia

kokybinio ir kiekybinio produktų bei nesureagavusių pradinių junginių atskyrimo

atžvilgiu eliucijos sistema - kai petrolio eterio, eterio ir acto rūgšties santykis mišinyje

yra 85:15:2 (3.1 pav.).

3.1 Biodyzelino sintezė: rapsų aliejaus transesterinimas

Žmonių populiacijos bei vartojimo augimas, senkantys iškastinio kuro ištekliai,

dėl vidaus degimo variklių išmetamųjų dujų emisijų spartėjantys pasaulinio atšilimo

reiškiniai skatina ieškoti alternatyvaus energijos šaltinio [135, 251-253]. Šiuo metu

biodyzelinas yra laikomas vienu idealiausių atsinaujinančių energijos šaltinių, nes jis yra

bioskali bei aplinkai saugesnė alternatyva tradiciniam dyzeliniam kurui. Be to, kadangi

biodyzelino fizikinės ir kitos savybės yra artimos iš naftos gautam dyzelinui, tai leidžia

jam efektyviai veikti tradiciniuose varikliuose be papildomų modifikacijų [256, 257].

Kaip minėta, biodyzelinas gali būti gaunamas cheminiais arba fermentiniais

būdais - TAG transesterinimo ir/ar laisvų RR esterinimo trumpagrandžiais alkoholiais

reakcijų metu. Šiuo metu vis dar vyraujantiems cheminiams metodams būdingi tam tikri

trūkumai: didelės energijos sąnaudos, brangi įranga, sudėtingi procesai bei aplinkos tarša

[289]. Daugumos šių trūkumų galima išvengti taikant biotechnologinę gamybą, kai

riebalų transesterinimo reakcijas katalizuoja lipazės [282, 290-292]. Nors tokių procesų

ekonominės sąnaudos kol kas dar yra gana didelės, o biologiniams katalizatoriams

būdinga palyginti lengva inaktyvacija, tačiau įvairių tirpiklių, žaliavos, acilakceptorių,

pigiausių daugkartiniam naudojimui tinkamų fermentų paieška bei fermentų modifikacijų

ir imobilizacijos taikymas teikia vilčių sukurti konkurencingus biodyzelino gamybos

metodus [24, 254, 287, 293]. Tad darbo metu buvo tiriama lipazių katalizuojama

biodyzelino sintezės reakcija – įvertinta rapsų aliejaus transesterinimo skirtingais

acilakceptoriais efektyvumo priklausomybė nuo įvairių reakcijos eigą nulemiančių

veiksnių: vandens bei fermento kiekio, molinio substratų santykio, tirpiklio, temperatūros

ir acilakceptoriaus bei fermento prigimties.

78

3.1.1 Lipoprime 50T katalizuojamo rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu optimalių sąlygų nustatymas

Kaip žinoma, vykdant lipazių katalizuojamas aliejų transesterinimo metanoliu

reakcijas, viena aktualiausių problemų – fermento slopinimas vienu iš reakcijos substratų

- metanoliu. Nors molekulinis šio slopinimo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas,

manoma, kad dėl trumpagrandžio alkoholio netirpumo augaliniuose aliejuose sistemoje

susidaro nauja skysta fazė - metanolio lašeliai, kurie, esant didelėms jo koncentracijoms,

inaktyvuoja lipazes, jas denatūruodami [23, 354, 373]. Be to, reakcijos metu susidarantis

hidrofilinis šalutinis produktas – glicerolis - taip pat netirpus aliejuose, tad lengvai

adsorbuojasi ant imobilizuotų lipazių paviršiaus, taip neigiamai veikdamas jų aktyvumą

bei stabilumą [335, 375]. Teigiama, kad tokių hidrofobinių tirpiklių kaip n-heksanas

naudojimas reakcijų mišiniuose [378] problemos neišsprendžia dėl prasto metanolio bei

glicerolio tirpumo juose [379]. Todėl mūsų tyrimų metu reakcijos vykdytos ne tik n-

heksane, kuris buvo pasirinktas kaip klasikinis lipazių katalizuojamoms reakcijoms tirti

naudojamas hidrofobinis tirpiklis, bet ir hidrofiliniame tret-butanolyje (tretiniai

alkoholiai paprastai nėra lipazių substratai), kuriame tirpūs visi reakcijos mišinį

sudarantys junginiai. Dėl to manoma, kad jo naudojimas vietoj tradicinių tirpiklių gali

gerokai padidinti produktų išeigas [129, 375, 381, 383, 384].

Darbų pradžioje buvo siekiama įvertinti tirpiklio prigimties įtaką komercinės

Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo transesterinimo efektyvumui. Lipoprime 50T buvo

pasirinktas kaip komercinis lipoliziniu aktyvumu pasižymintis preparatas, kurio įvairios

katalizuojamos reakcijos iki šiol nebuvo detaliai ištirtos. RA ir metanolio molinis

santykis pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis (daugeliu atvejų riebalų

transesterinimo alkoholiais reakcijoms optimaliausias RA ir metanolio molinis santykis

yra 1:4) [129, 313, 383], o temperatūra parinkta, remiantis ankstesnių eksperimentų metu

gautais rezultatais (nepublikuoti duomenys). RA transesterinimo metanoliu tret-

butanolyje bei n-heksane eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės tyrimų duomenys

pateikti 3.3 paveiksle.

79

0

20

40

60

80

100

120

K 1 3 5 24 48 120 1 3 5 24 48 120

Reakcijos trukmė, val.

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.3 pav. Lipoprime 50T katalizuojamų RA transesterinimo metanoliu tret-butanolyje ir n-heksane, esant 30oC temperatūrai, reakcijų metu susidariusių produktų kiekio priklausomybė nuo reakcijos trukmės. Kontrolė: K – RA.

Nustatyta, kad Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo RA transesterinimo

metanoliu tret-butanolyje metu lygiagrečiai su esterių sinteze vyksta ir ypatingai efektyvi

RA hidrolizė: aliejus suskaldomas per netirtą reakcijos laiką tarp 5 ir 24 val., ir

akivaizdu, kad tolimesnis laisvų RR kiekybinis augimas reakcijos mišinyje vyksta tik dėl

MAG ir DAG hidrolizės, kurių kiekiai 24 - 120 val. laikotarpiu sumažėja apie 50 %. Šios

reakcijos metu po 24 val. susidaro apie 32 % metilo esterių, ir ilginant reakcijos trukmę,

šis kiekis nebekinta. Tuo tarpu n-heksane ir po 120 val. reakcijos mišinyje dar lieka apie

19 % nesuskaldyto RA, tačiau čia esterių išeiga yra didesnė ir siekia apie 45 % (3.3 pav.).

Taigi galima daryti preliminarias išvadas, kad hidrofilinis tret-butanolis galėtų

būti puikus tirpiklis įvairioms hidrolizės reakcijoms vykdyti, o jo naudojimo sintezei

(esterinimui ar transesterinimui) galimybė turėtų būti detaliau ištirta, mat tret-butanolyje

gautos esterių išeigos neprilygo n-heksane vykdytų reakcijų metu susidarančių produktų

kiekiams.

Lipazių katalizuojamo aliejų transesterinimo įvairiais alkoholiais metu

acilakceptoriaus (alkoholio) kiekis reakcijos mišinyje vaidina labai svarbų vaidmenį.

Pradinių tyrimų metu RA ir metanolio molinis santykis (1:4) buvo pasirinktas,

atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis, tačiau lipazės yra itin įvairialypiai fermentai,

kuriems būdingos optimalios katalizuojamų reakcijų sąlygos gali labai skirtis,

priklausomai nuo fermento prigimties ir įvairių aplinkos parametrų (tirpiklio, substratų,

temperatūros ir kt.). Todėl, siekiant optimizuoti Lipoprime 50T katalizuojamą reakciją

tret-butanolyje, pirmiausia buvo ištirta pradinio metanolio kiekio įtaka reakcijos eigai,

tret-Butanolis n-Heksanas

80

keičiant RA ir metanolio molinį santykį (1:2; 1:4; 1:6; 1:8) bei reakcijos temperatūrą

(30oC, 40oC ir 50oC). Tyrimų rezultatai pateikti 3.4 paveiksle.

A

0

20

40

60

80

100

120

K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4


Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reak

cij

os

miš

iny

je,

%

ME

RA

RR

DAG

MAG

C

0

20

40

60

80

100

120

K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

D

0

20

40

60

80

100

120

K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.4 pav. Lipoprime 50T katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu (molinis RA ir metanolio santykis A – 1:2, B – 1:4, C – 1:6, D - 1:8) eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės chromatografinis vaizdas bei kiekybinis TLC duomenų įvertinimas, esant atitinkamoms temperatūroms. K – RA (kontrolė).

Nustatyta, kad tirtos reakcijos metu visas RA suskaldomas per apytikriai 1,5 val.,

kai temperatūra yra 40oC, o RA ir metanolio molinis santykis yra nuo 1: 6 iki 1 : 8. Esant

šioms reakcijos sąlygoms po 4 val. susidaro ir didžiausias esterių kiekis, siekiantis 40 %

(3.4 (C, D) pav.).

30oC 40oC 50oC

81

Kaip žinoma, hidrofiliniai tirpikliai yra linkę iš aktyvaus centro patraukti jame

esančias vandens molekules, reikalingas fermento aktyvumui palaikyti ir efektyviai

katalizei vykti, todėl fermentiniams procesams palankesni hidrofobiniai tirpikliai. Kita

vertus, didelis hidrofobiškumas gali sąlygoti baltymo konformacijos nepaslankumą, todėl

neretai naudojamas ne vienas tirpiklis, o dviejų skirtingos prigimties tirpiklių mišinys

[68]. Kaip minėta anksčiau, nors tret-butanolyje RA hidrolizė yra ypatingai greitas ir

efektyvus procesas, tačiau pageidaujamų produktų (metilo esterių) susidaro gerokai

mažiau, palyginus su n-heksane vykstančiomis reakcijomis. Tad, siekiant gauti didesnes

esterių išeigas, analogiškos reakcijos vykdytos ir n-heksane bei n-heksano ir tret-

butanolio mišinyje tūrio santykiu 1:1, esant skirtingai reakcijų temperatūrai bei moliniam

substratų santykiui. Kadangi n-heksane vykdomos reakcijos yra ilgiau trunkantys

procesai, jos buvo tiriamos pasirinkus atitinkamą reakcijos trukmę – 48 val. Gauti

rezultatai pateikti 3.5 paveiksle.

A

0

20

40

60

80

100

120

K 1(30) 2(30) 3(30) 4(30) 1(40) 2(40) 3(40) 4(40) 1(50) 2(50) 3(50) 4(50)

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

K 1(30) 2(30) 3(30) 4(30) 1(40) 2(40) 3(40) 4(40) 1(50) 2(50) 3(50) 4(50)

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.5 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane (A) ir n-heksano bei tret-butanolio mišinyje (1:1) (B), esant skirtingiems RA ir MetOH moliniams santykiams, reakcijos metu po 48 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose. K – RA (kontrolė); 1 – RA:MetOH (1:2); 2 – RA:MetOH (1:4); 3 – RA:MetOH (1:6); 4 – RA:MetOH (1:8).(30), (40), (50) - reakcijos temperatūra, oC.

Reakcijos eiga n-heksane ir n-heksano bei tret-butanolio (1:1) mišinyje skyrėsi

gana smarkiai (3.5 pav.). Tirpiklių mišinyje, kaip ir tret-butanolyje, labai efektyviai

82

katalizuojama RA hidrolizės reakcija, tačiau esterių išeiga išlieka mažesnė (didžiausia

siekia 27 %), palyginus su išeiga, gauta, kai naudotas grynas n-heksanas (38 %).

Nustatyta, kad optimalus molinis substratų santykis praktiškai visais tirtais atvejais yra

toks pats – 1:6, tačiau optimali temperatūra skiriasi: kaip ir gryname tret-butanolyje, taip

ir n-heksane ji yra 40oC, o šių tirpiklių mišinyje – 30oC. Palyginus santykinį kitų

reakcijos mišinį sudarančių produktų bei substratų kiekį, akivaizdu, kad optimaliomis

sąlygomis daugiau nesuskaldyto RA lieka n-heksane - apie 36 %, kai tuo tarpu tirpiklių

mišinyje RA kiekis nesiekia nė 15 %. Visų kitų medžiagų nustatyta daugiau, kai

reakcijos tirpikliu naudojamas n-heksano ir tret-butanolio mišinys: MAG - mišinyje - 9

%, o n-heksane – 1 %; DAG - mišinyje - 16 %, o n-heksane – 13 % bei laisvų RR -

mišinyje - 33 - %, o n-heksane – 12 %.

Taigi esterių sintezės atžvilgiu reakcija produktyvesnė n-heksane, o aliejų

hidrolizė efektyvesnė tirpiklių mišinyje, tačiau pastaroji reakcija neprilygsta

atitinkamiems procesams, vykstantiems gryname tret-butanolyje, todėl tokio tirpiklių

mišinio naudojimas nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo būdas.

Kadangi reakcijos n-heksane ir tirpiklių mišinyje taip smarkiai skiriasi, buvo

atlikti analogiški eksperimentai, reakcijas vykdant tirpiklių mišiniuose, labiau

besiskiriančiuose sudėties tūrio dalimis. Bandyta įžvelgti reakcijos pusiausvyros

pasislinkimo į hidrolizės ar sintezės pusę tendencijas, esant optimaliai 40oC temperatūrai.

Įvairių tirpiklių mišinių sudėties įtakos proceso produktyvumui tyrimų rezultatai pateikti

3.6 paveiksle.

A

0

20

40

60

80

100

120

K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

83

B

0

20

40

60

80

100

120

K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

C

0

20

40

60

80

100

120

K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.6 pav. Lipoprime 50T katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose metu susidariusių produktų po 24 (A), 48 (B) ir 168 val. (C) santykinis kiekis reakcijų mišiniuose. K – RA (kontrolė). Tirpikliai: 1 – n-heksanas; 9 – tret-butanolis; n-heksano ir tret-butanolio mišiniai tūrio santykiu atitinkamai: 2 – 4:1; 3 – 3:1; 4 2:1; 5 - 1:1; 6 - 1:2; 7 - 1:3; 8 - 1:4. Reakcijos sąlygos: 40oC temperatūra, RA ir MetOH molinis santykis 1:6.

Kaip ir buvo galima tikėtis, nustatyta tiesioginė reakcijos metu išsiskiriančių

laisvų RR kiekio priklausomybė nuo tret-butanolio tūrio dalies tirpiklių mišinyje. n-

Heksane procesai gerokai lėtesni, ir reakcijos pradžioje RR metilo esterių išeigos

neprilygsta gautoms reakcijų, vykstančių tirpikliuose, kur tret-butanolio kiekiai

mišiniuose yra didesni, metu, tačiau po 168 val. esterių išeigos tampa beveik vienodos.

tret-Butanolyje ir mišinyje, kuriame vyrauja didesnė šio tirpiklio dalis, jau po 24 val.

nebelieka RA (3.6 (A) pav. 8 ir 9 stulpeliai). Nors yra sulėtėjęs metilo esterių sintezės

procesas, bet stebimas laisvų RR kiekio didėjimas akivaizdžiai dėl MAG ir DAG

hidrolizės: jau po 48 val. kai kuriais atvejais DAG apskritai nelieka (3.6 (B) pav. 8 ir 9

stulpeliai). Tuo tarpu n-heksane ir mišiniuose, kur vyrauja šis tirpiklis arba tūrio santykis

84

yra 1:1, net ir po 168 val. aptinkami visi reakcijos mišinio komponentai: ir nesuskaldytas

RA, ir laisvos RR bei MAG ir DAG (3.6 (C) pav. 1 - 5 stulpeliai).

RA hidrolizė. Nors tret-butanolis dažniausiai naudojamas aliejų transesterinimo

metanoliu reakcijų metu, siekiant sumažinti neigiamą metanolio poveikį lipazių

aktyvumui, tačiau buvo pabandyta išsiaiškinti, ar jo privalumai išlieka ir vykdant

hidrolizės reakcijas. Mat yra žinoma, kad reakcijų metu susidaręs glicerolis pasižymi

panašiomis slopinančiomis savybėmis kaip ir metanolis, o šį poveikį, kaip nurodoma

literatūriniuose šaltiniuose [135, 375, 381], dėl anksčiau minėtų savybių galėtų pašalinti

būtent tret-butanolio naudojimas, tad, siekiant patvirtinti šias hipotezes, RA hidrolizės

reakcijos n-heksane palygintos su analogiškais procesais tret-butanolyje (3.7 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

K 1 3 24 48 1 3 24 48


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

RA

RR

DAG

MAG

3.7 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA hidrolizės n-heksane ir tret-butanolyje eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės. Reakcijos sąlygos: 40oC temperatūra, RA ir MetOH molinis santykis 1:6. K – RA (kontrolė).

Lipoprime 50T katalizuojama RA hidrolizė visu tirtu laikotarpiu (1 - 48 val.)

efektyvesnė tret-butanolyje, nes tomis pačiomis sąlygomis n-heksane vykstančios

reakcijos metu po 48 val. lieka apie 62 % nesuskaldyto RA, o tret-butanolio aplinkoje jau

po 3 val. ir RA kiekis sumažėja iki 40 %, o po 24 val. nebelieka visai (3.7 pav.). Be to,

kadangi tret-butanolis yra netoksiškas ir santykinai pigus, palyginus su n-heksanu, jis

gali tapti puikia alternatyva tradiciniams hidrofobiniams organiniams tirpikliams. tret-

Butanolis keičia lipazių katalizuojamų reakcijų mechanizmą, kaip tikėtina, sukeldamas

konformacinius fermento struktūros pokyčius [384], tačiau, nors bendrai lipazėms

būdinga panaši molekulės architektūra, jų aktyvaus centro struktūros gali būti gana

skirtingos, kas nulemia ir skirtingą jų substratinį savitumą ir netgi katalizuojamos

reakcijos mechanizmą [61, 385]. Todėl ir tret-butanolio poveikis skirtingiems

n-Heksanas tret-Butanolis

85

fermentams gali būti kitoks. Be to, yra lipazių, kurių substratais gali būti ir tretiniai

alkoholiai (bei jų esteriai) [181, 182], todėl prieš naudojant tret-butanolį kaip tirpiklį,

būtina įvertinti ir konkrečios lipazės savitumą bei aktyvumą tokių alkoholių atžvilgiu.

Nors vandens perteklius gali pastumti organiniuose tirpikliuose vykstančios

reakcijos pusiausvyrą į hidrolizės pusę arba sukelti fermento molekulių agregaciją, kas

lemia fermento aktyvumo sumažėjimą, tačiau įvairių lipolizinių fermentų tyrimais

nustatyta, kad pašalinus vandenį, fermentams būdingas mažas aktyvumas. Minimalus

vandens kiekis yra būtinas fermentui įgauti ir palaikyti kataliziškai aktyvią konformaciją,

nes lipazės aktyvumas bendru atveju priklauso nuo tarp aliejaus ir vandens susidarančios

fazių sąlyčio ribos [135, 252, 373, 390, 401, 402]. Minimalus vandens kiekis, reikalingas

aktyviai lipazės konformacijai palaikyti, skirtingiems fermentams skiriasi ir priklauso

nuo konkretaus lipolizinio fermento prigimties bei vykdomų reakcijų sąlygų, todėl

optimalus vandens kiekis reakcijos mišinyje turi būti nustatomas kiekvienai lipazei bei

reakcijai individualiai [373, 390, 401, 402]. Kadangi ankstesnių tyrimų metu buvo

naudota pagal standartinę metodiką parinkta vandens koncentracija (9 tūrio %, toliau

tekste - %), siekiant nustatyti optimalias tiriamos reakcijos sąlygas, buvo įvertinta

vandens kiekio įtaka anksčiau tirtuose tirpikliuose vykdytų reakcijų eigai (3.8 pav.).

A

0

20

40

60

80

100

120

K 0 4 9 13 18

Vandens kiekis reakcijos mišinyje, %

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

K 0 4 9 13 18 22 26 30 36 40


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

86

C

0

20

40

60

80

100

120

K 0 4 9 13 18 22 26 30 35 40


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.8 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu reakcijos po 24 val., esant 40oC temperatūrai, kai RA:MetOH molinis santykis 1:6, eigos priklausomybė nuo vandens koncentracijos reakcijos mišinyje: tret-butanolyje (A), n-heksane (B) bei tret-butanolio ir n-heksano mišinyje (1:1) (C). K - RA (kontrolė).

Nustatyta, kad skirtinguose tirpikliuose bei jų mišinyje kiekybiniai vandens

pokyčiai daro skirtingą įtaką procesų eigai. Tirtomis sąlygomis tret-butanolyje optimali

yra anksčiau naudota vandens koncentracija (9 %) (3.8 (A) pav.: suskaldomas visas RA,

ME kiekis siekia 39 %), o n-heksane ji yra gerokai didesnė – 26 %: nors ir

nesuskaldomas visas RA, tačiau ME kiekis sudaro 68 % (3.8 (B) pav.). Tai patvirtina

literatūroje nurodomą fermento optimalaus aktyvumo palaikymui reikalingą vandens

kiekio priklausomybę nuo tirpiklio hidrofobiškumo - skirtinguose tirpikliuose lipazei

palaikyti maksimalų aktyvumą reikia skirtingo kiekio vandens: kuo tirpiklis

hidrofobiškesnis, tuo didesnė vandens dalis reikalinga reakcijos mišinyje [135, 447].

Įdomiausias iš tirtų yra reakcijų, vykdytų tirpiklių mišiniuose, atvejis: čia

optimalios vandens koncentracijos yra trys: 4, 35 ir 40 % (3.8 (C) pav.: susidariusio ME

kiekis yra panašus - 40, 44 ir 43 %, atitinkamai). Nors visas RA suskaldomas, kai

vandens koncentracija reakcijos mišinyje siekia ir 4, ir 35 bei 40 %, visgi įdomiausi

pastarieji du atvejai, nes reakcijos mišinį praktiškai sudaro tik laisvos RR ir jų metilo

esteriai: suskaldomas visas RA, MAG bei DAG ir nusistovi pusiausvyra, kuri, ilginant

reakcijos trukmę, nekinta.

Kadangi, esant optimaliam vandens kiekiui, n-heksane gauta santykinai didelė

RR metilo esterių išeiga (68 %), buvo nutarta dar kartą įvertinti molinio substratų

santykio įtaką proceso produktyvumui, didinant metanolio kiekį reakcijos mišinyje (3.9

pav.).

87

0

20

40

60

80

100

120

K 2 4 6 8 10 12 14 16

Metanolio molinė dalis rapsų aliejaus atžvilgiu

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.9 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane, esant 40oC temperatūrai bei 26 % vandens, reakcijos po 24 val. efektyvumo priklausomybė nuo molinio substratų santykio. K – RA (kontrolė).

Paaiškėjo, kad šiuo atveju optimaliausias RA ir metanolio molinis santykis yra

1:12 – 1:16 reikšmių intervale: per 24 val. suskaldomas visas RA bei MAG, o ME išeiga

siekia apie 75 %. Literatūroje aptinkama duomenų, kad kitų Lietuvoje vykdomų tyrimų

metu lipazių katalizuojamoms riebalų transesterinimo reakcijoms tirti naudojamas,

niekur kitur publikacijose neaptiktas, aliejaus ir metanolio molinis santykis, siekiantis

1:400 [448], o butanolio atveju ir – 1:500 [449], tačiau, kaip žinoma, net ir 1:42 santykis,

kuris neretai būna naudojamas, kai reakcija vykdoma be katalizatoriaus superkritinėmis

sąlygomis, yra ne tik ekonomiškai nepalankus, bet ir pavojingas aplinkai [297].

Taigi nustačius optimalias temperatūros, tirpiklio, vandens koncentracijos ir

molinio substratų santykio reikšmes, galiausiai atlikti ir fermento kiekio įtakos reakcijos

produktyvumui tyrimai. Rezultatai pateikti 3.10 paveiksle.

0

20

40

60

80

100

120

K 11 22 44 66 88 110

Fermento koncentracija reakcijos mišinyje, mg/ml

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.10 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane, esant 40oC temperatūrai, RA:MetOH moliniam santykiui 1:16 bei 26 % vandens, reakcijos eigos priklausomybė nuo fermento kiekio. K – RA (kontrolė).

88

Paaiškėjo, kad, esant 66 mg/ml fermento koncentracijai, reakcijos mišinį sudaro

mažiausias laisvų RR kiekis, o ME išeiga siekia beveik 85 %, ir tai yra didžiausias šių

tyrimų metu gautas ME kiekis (3.10 pav.).

3.1.2 Lipolase 100L katalizuojamas rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu bei metil- ir butilacetatais

Kadangi Lipoprime 50T preparato komercinė gamyba buvo nutraukta, ir mes

negalėjome tęsti darbų, tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas kitas iš Thermomyces

lanuginosus išskirtos lipazės komercinis preparatas - Lipolase. Pirmiausia palyginimui

buvo pakartotos RA transesterinimo metanoliu reakcijos tret-butanolyje, naudojant

skystą (Lipolase 100L) ir imobilizuotą (Lipolase 100T) lipazių preparatus (3.11 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.11 pav. Lipolase 100L (skysto) ir Lipolase 100T (imobilizuoto) preparatų katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu tret-butanolyje esant 30oC eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės. K - RA (kontrolė).

Akivaizdu, kad imobilizuotas preparatas savo aktyvumu neprilygo skystam, kurio

katalizuojamos reakcijos metu per 15 minučių suskaldomas beveik visas RA (3.11 pav.).

Be to, taip Lipolase 100L savo hidroliziniu aktyvumu pranoko anksčiau tirtą Lipoprime

50T, kurio katalizuojamos reakcijos metu visas RA suskaldomas tarp 5 ir 24 val. (3.3

pav.). Todėl tolimesniems tyrimams pasirinktas tik Lipolase 100L lipazės preparatas.

Yra žinoma, kad, norint padidinti gaunamų esterių išeigą bei išvengti slopinamo

metanolio poveikio, vietoj alkoholių kaip acilakceptoriai biodyzelino gamybos procese

gali būti naudojami atitinkami jų ir acto rūgšties esteriai - acetatai [393]. Įrodyta, kad

metilacetatas neturi jokio neigiamo poveikio fermento aktyvumui. Be to, taip išvengiama

ir neigiamo glicerolio poveikio, nes vietoj jo susidaro lipazėms jokio efekto neturintis

Skystas Imobilizuotas

89

triacetinas, ir negana to, jo, kaip šalutinio reakcijos produkto, vėlesnis panaudojimas yra

įvairiapusiškesnis nei glicerolio, susidarančio, kai reakcijoms kaip acilakceptoriai

naudojami alkoholiai [393, 394].

Tad tyrimų metu buvo palygintos Lipolase 100L katalizuojamos RA

transesterinimo reakcijos, kai kaip acilakceptoriai naudoti ir metanolis, ir metil- bei

butilacetatai. Šis eksperimentas išsiskyrė tuo, kad, siekiant įvertinti maksimalų proceso

ekonomiškumo potencialą, reakcijos buvo vykdytos, nepalaikant įprastai efektyviam jų

vyksmui reikalingos aukštesnės temperatūros. Tad reakcijų sąlygos buvo: 25oC

temperatūra, palyginti du anksčiau tirti tirpikliai (n-heksanas ir tret-butanolis) bei

reakcijos sistemos be tirpiklio, RA ir acilakceptoriaus (metanolio (A), metil- (B) ir

butilacetato (C)) molinis santykis 1:4, reakcijos trukmė – nuo 30 min. iki 24 val. (3.12

pav.).

A

0

20

40

60

80

100

120

0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24


Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

rea

kcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24


Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

rea

kc

ijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

Be tirpiklio tret-Butanolis n-Heksanas


90

C

0

20

40

60

80

100

120

0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24


Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

rea

kc

ijo

s m

išin

yje

, %

BE

RA

RR

DAG

MAG

3.12 pav. Lipolase 100L katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu (A), metilacetatu (B) ir butilacetatu (C) metu susidarančių produktų kiekio priklausomybė nuo reakcijos trukmės bei tirpiklio prigimties.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis RA transesterinimas įprastu alkoholiu –

metanoliu - vyksta nepalyginamai efektyviau nei atitinkamos reakcijos su acetatais. Šiuo

atveju reakcija efektyviausiai vyko be tirpiklio: per 24 val. suskaldomas visas RA, esterių

išeiga siekia 56 % (tret-butanolyje – 30 %, o n-heksane – 42 %), o MAG sudaro apie 2

%, DAG – apie 11 %, laisvos RR – apie 31 % (3.12 (A) pav.).

Įdomu tai, kad esterių sintezė apskritai nevyko (stebimas tik lėtas hidrolizės

procesas) n-heksane, kai kaip acilakceptorius buvo naudotas metilacetatas (3.12 (B)

pav.), ir sistemoje be tirpiklio, kai naudotas butilacetatas (3.12 (C) pav.). Abiejų acetatų

atveju tret-butanolyje nedidelis esterių susidarymas (apie 5 %) stebimas tik po 24 val.,

tačiau šiame tirpiklyje, kaip ir ankstesnių tyrimų metu, stebima efektyvi hidrolizė:

metilacetato atveju suskaldomas visas RA, butilacetato atveju lieka apie 2 %, o laisvų RR

kiekiai sudaro 54 ir 52 %, atitinkamai. Nors transesterinimas metilacetatu reakcijų

sistemose be tirpiklio vyko neefektyviai, tačiau, palyginus su butilacetatu, čia stebima

gana efektyvi hidrolizė: po 24 val. lieka apie 52 % RA, tačiau santykinai daug ir DAG –

23 % (daugiau nei laisvų RR, kurios sudaro 18 %) (3.12 (B) pav.).

Kadangi Lipolase 100L katalizuojamas RA transesterinimas metanoliu vyko

efektyviausiai, įvertinta ir reakcijos mišinio maišymo įtaka bendram proceso

efektyvumui: analogiškos reakcijos buvo vykdytos su ir be maišymo (3.13 pav.).


91

0

20

40

60

80

100

120

0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.13 pav. Lipolase 100L katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu be maišymo metu susidarančių produktų kiekio priklausomybė nuo reakcijos trukmės bei tirpiklio prigimties.

Gauti rezultatai nustebino: paaiškėjo, kad maišymas neturi didesnės įtakos

tiriamos reakcjos efektyvumui. Dėl mišinio nehomogeniškumo ir skirtingų fazių

susidarymo didžiausias neigiamas nemaišymo poveikis pasireiškė reakcijoms,

vykdytoms n-heksane - šiuo atveju esterių išeiga po 24 val. sumažėjo nuo 42 % (reakcija

su maišymu) iki 32 % (reakcija be maišymo). Tuo tarpu reakcijų, vykdytų tret-

butanolyje, atveju praktiškai nepastebėta jokio efektyvumo skirtumo. Tai gali būti

paaiškinta tuo, kad šiame tirpiklyje puikiai tirpsta visi reakcijos mišinį sudarantys

komponentai, todėl reakcijos sistemos homogeniškumas yra užtikrinamas ir be maišymo.

Sistemose be tirpiklio didžiausia gauta esterių išeiga sumažėjo nuo 56 % (maišant) iki 52

% (nemaišant). Toks nedidelis pokytis, palyginus su n-heksane vykusiais procesais, gali

būti paaiškintas substratų koncentracijos reakcijų mišiniuose skirtumais.

Nors šių reakcijų tyrimo metu negautos optimalios esterių išeigos, visgi rezultatai

leidžia daryti tam tikras išvadas: metil- bei butilacetatų naudojimas vietoj metanolio

tirtomis sąlygomis nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo sprendimo būdas; ir,

nors literatūroje neaptikta duomenų, kur būtų abejojama reakcijų maišymo svarba lipazių

katalizuojamų vyksmų metu, visgi paaiškėjo, kad kai kuriais atvejais maišymo būtinybę

gali nulemti tik naudojamo tirpiklio prigimtis.

3.1.3 Ektoino įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai

Vis dažniau literatūroje pasirodo duomenų, kad, siekiant padidinti fermentinės

transesterinimo reakcijos produktyvumą, naudojami įvairūs priedai. Pavyzdžiui,


92

nustatyta, kad tam tikras ciklinės aminorūgšties - ektoino (1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-

pirimidino karboksirūgšties, 1.22 pav.) - kiekis reakcijos mišinyje gali padidinti

biodyzelino išeigą 20,9 %, palyginus su išeiga, gauta be šio priedo. Šis junginys plačiai

naudojamas biologinių makromolekulių bei ląstelių apsaugai bei stabilizacijai, o

teigiamas jo poveikis fermentinės biodyzelino sintezės metu, kaip manoma, yra susijęs su

lipazės giminingumo metanoliui sumažinimu, ir atitinkamai - triacilgliceroliams –

padidinimu. Tad tai galėtų būti vienas iš potencialių lipazių slopinimo metanoliu TAG

transesterinimo reakcijų metu problemos sprendimo būdų [413].

Ektoino įtakos RA transesterinimo metanoliu reakcijos tyrimams buvo pasirinkti

šeši skysti (Lipolase 100L, Lipex 100L, Lipozyme TL100L, Resinase A2X, Palatase

20000L, Lecitase Ultra) bei septyni imobilizuoti (Lipoprime 50T, Lipolase 100T, Lipex

100T, Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM, Novozym 435, Lipoclean 2000T)

komerciniai lipoliziniu aktyvumu pasižyminčių fermentų preparatai. Reakcijos

temperatūra (40oC) bei molinis substratų santykis (RA:MetOH = 1:6) buvo pasirinkti,

atsižvelgus į ankstesnių tyrimų metu gautus rezultatus. Nors ankstesnių mūsų tyrimų

metu nustatytas optimalus RA ir metanolio molinis santykis reakcijoms, vykdytoms n-

heksane siekė 1:12 - 1:16 (3.9 pav.), tačiau šiuo atveju pasirinkome santykį, artimesnį

plačiai literatūroje aprašytoms standartinėms sąlygoms (1:4) - 1:6 (optimalų tret-

butanolyje vykstantiems procesams) dėl to, kad, kaip žinoma, didesnis metanolio kiekis

reakcijos mišinyje slopina daugelio lipazių aktyvumą. Tuo tarpu šių tyrimų tikslas buvo

palyginti ektoino įtaką įvairių komercinių lipazių preparatų katalizuojamų reakcijų

produktyvumui, kai vykdomų procesų sąlygos nėra ekstremalios ar kritinės naudojamų

fermentų optimalaus veikimo atžvilgiu.

Pirmiausia buvo ištirta skystų komercinių lipolizinių fermentų katalizuojama RA

transesterinimo reakcija n-heksane: palygintas fermentų katalizinis aktyvumas sistemose

su ektoinu ir be jo, esant skirtingai reakcijos trukmei (3.14 pav.).

93

A

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/L

ipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/L

ipoz

yme

TL100

L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

re

ak

cijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/L

ipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/L

ipoz

yme

TL100

L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.14 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu n- heksane po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

Tyrimų metu nustatytas slopinantis ektoino poveikis, kuris didžiausias Lecitase

Ultra katalizuojamos reakcijos atveju: po 3 val. reakcijos be ektoino metu susidariusių

esterių kiekis siekia 12 %, su priedu – tik 3 % (3.14 (A) pav.), o po 24 val. gautos esterių

išeigos siekia 23 ir 6 %, atitinkamai (3.14 (B) pav.). Visų kitų tirtų fermentų atveju,

naudojant priedą, po 3 val. gautų esterių išeigos sumažėja 2 - 6 % (3.14 (B) pav.).

Didžiausias nustatytas neigiamas ektoino poveikis reakcijų produktyvumui stebimas po

24 val.: Lipolase 100L - ME išeiga sumažėja nuo 72 iki 49 %, Lipozyme TL100L - nuo

70 iki 48 % ir Resinase A2X - nuo 57 iki 40 %. Palatase 20000L ir Lipex 100L pasirodė

esantys atspariausi potencialiam neigiamam ektoino poveikiui fermentai: jų

94

katalizuojamų reakcijų metu net ir po 24 val. naudojamo priedo poveikis buvo nedidelis -

produktų išeigos sumažėjo 1 - 4 % (3.14 (B) pav.).

Siekiant detaliau įvertinti ektoino poveikį lipazių kataliziniam aktyvumui,

analogiškos reakcijos vykdytos ir kitame tirpiklyje – tret-butanolyje. Tyrimų rezultatai

pateikti 3.15 paveiksle.

A

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/L

ipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/L

ipoz

yme TL1

00L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

B

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/L

ipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/L

ipoz

yme

TL100

L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

re

ak

cijo

s

miš

iny

je, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.15 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu tret-butanolyje po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

tret-Butanolyje po 3 val. nedidelis neigiamas ektoino poveikis nustatytas tik

Lipex 100L lipazės atveju: esterių išeiga sumažėja 3 %, palyginus su reakcija, kai priedas

nebuvo naudotas, o nesuskaldyto RA lieka 6 % daugiau (3.15 (A) pav.). Po 24 val.

reakcijų su priedu ir be jo produktyvumas tampa vienodas visais atvejais, išskyrus

95

Lecitase Ultra, kurios katalizuojama reakcija, priešingai nei anksčiau tirtų vyksmų n-

heksane metu, su ektoinu vyksta produktyviau: nors esterių išeiga padidėja tik 3 %,

tačiau suskaldomas visas RA, kai tuo tarpu reakcijos be priedo atveju po 24 val. vis dar

lieka apie 12 % RA (3.15 (B) pav.).

Nors, kaip minėta, po 24 val. akivaizdesnės ektoino įtakos lipazių (išskyrus

Lecitase Ultra) katalizuojamiems procesams, nepastebėta, tačiau reakcijų pradžioje (po 3

val.) šioks toks teigiamas ektoino poveikis nustatytas ir kai kurių kitų lipolizinių

fermentų atveju: esterių išeiga padidėja apie 2 %, kai reakcijas katalizuoja Lipolase

100L, Resinase A2X bei Lipozyme TL100L, pastarosios lipazės atveju per 3 val.

suskaldomas visas RA, kai buvo naudotas ektoinas, ir lieka apie 5 % RA, kai priedo

reakcijos mišinyje nebuvo (3.15 (A) pav.).

Pakartojus eksperimentus reakcijas vykdant sistemose be tirpiklio, vėl, kaip ir n-

heksane, daugeliu atveju nustatytas neigiamas ektoino poveikis (3.16 pav.), tik čia jis

pastebimas jau reakcijos pradžioje, o Lecitase Ultra lipazės katalizuojamo proceso metu

nustatyta, nors ir nedidelė, bet visgi teigiama ektoino įtaka bendram proceso

produktyvumui.

A

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/L

ipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/L

ipoz

yme

TL100

L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

Sa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

re

ak

cijo

s

miš

iny

je, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

96

B

0

20

40

60

80

100

120

Lipo

lase

100

L

E/Lipol

ase

100L

Lipe

x 10

0L

E/L

ipex

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

E/Lipoz

yme

TL100

L

Res

inas

e A2X

E/R

esinas

e A2X

Palat

ase

2000

0L

E/P

alat

ase

2000

0L

Lecita

se U

ltra

E/L

ecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.16 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu reakcijos sistemoje be tirpiklio po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

Reakcijų sistemose be tirpiklio, didžiausias neigiamas priedo poveikis stebimas

Lipolase 100L ir Lipex 100L atvejais. Po 24 val. mažiausia neigiama ektoino įtaka

nustatyta Resinase A2X ir Palatase 20000L lipazių katalizuojamų reakcijų metu (3.16 (B)

pav.).

Analogiški eksperimentai buvo atlikti ir su anksčiau minėtais septyniais

imobilizuotais komerciniais lipolizinių fermentų preparatais, tačiau šiuo atveju reakcijų

su ektoinu ir be jo eiga nesiskyrė, todėl pateiktas tik reakcijų be tirpiklio po 24 val.

mišinius sudarančių medžiagų santykinių kiekių palyginimas (3.17 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

Lipop

rime

50T

E/Lipop

rime

50T

Lipo

lase

100

T

E/Lipol

ase

100T

Lipex

100

T

E/Lipex

100

T

Lipo

zym

e TL

IM

E/Lipozy

me

TL IM

Lipo

zym

e RM

IM

E/Lipoz

yme R

M IM

Nov

ozym

435

E/Nov

ozym

435

Lipoc

lean

200

0T

E/Lipoc

lean

200

0TSa

nty

kin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

re

ak

cijo

s

miš

iny

je, %

ME

RA

RR

DAG

MAG

3.17 pav. Ektoino įtaka įvairių imobilizuotų lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu reakcijos sistemoje be tirpiklio po 24 val. efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

97

Įdomu tai, kad visas RA suskaldomas tik Lipozyme TL IM (čia gaunama ir

didžiausia esterių išeiga, siekianti 65 %) ir labai mažai tyrinėto Lipoclean 2000T

preparato atveju. Daugiausia nesuskaldyto RA (apie 25 %) lieka Lipoprime 50T, Lipex

100T ir Novozym 435 katalizuojamų reakcijų metu.

Taigi ektoino, kaip priedo, padidinančio lipazių katalizuojamos transesterinimo

reakcijos produktyvumą, naudojimas tirtomis sąlygomis nepasiteisino. Kadangi ektoino

kiekis (1,1 mM) tyrimams buvo pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis,

tikėtina, kad mūsų atveju tai nebuvo optimali šio priedo koncentracija, mat yra nustatyta,

kad per didelė ektoino koncentracija gali slopinti fermentų aktyvumą [413]. Be to, galima

daryti preliminarias išvadas, kad hidrofilinėje aplinkoje (tret-butanolyje) ektoinui labiau

būdingas teigiamas poveikis, o hidrofobinėje (n-heksane, mišiniuose be tirpiklio) –

neigiamas.

3.1.4 Naujų organinių tirpiklių - glikolio eterių - įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai

Glikolio eteriai (GLYMES) – jokių kitų funkcinių grupių neturintys sotūs

polieteriai. Kitaip nei glikoliai (pavyzdžiui, polietilenglikolis), glikolio eteriai neturi

laisvų hidroksigrupių, todėl yra chemiškai inertiški. Daugelis šių junginių puikiai maišosi

ir su kitais organiniais tirpikliais, ir su vandeniu, todėl juose puikiai tirpsta įvairūs

reakcijų substratai (tiek hidrofobiniai, tiek hidrofiliniai), susidarant homogeniniams

reakcijų mišiniams. Be to, jiems būdingas mažas klampumas, didelis cheminis ir terminis

stabilumas, nedidelis toksiškumas bei bioskalumas. Teigiama, kad glikolio eterių

naudojimas gali padidinti lipazės stabilumą, mat sumažėja neigiamas reakcijos substratų

poveikis: manoma, kad, naudojant šiuos tirpiklius, lipazių stabilumas, esant didelėms

metanolio koncentracijoms, smarkiai išauga dėl tarp metanolio ir glikolio dieterių

deguonies atomų susidarančių vandenilinių ryšių [450].

Atsižvelgus į literatūrinius duomenis, tyrimams buvo pasirinkti keturi lipazių

katalizuojamoms aliejų transesterinimo reakcijoms tinkamiausi glikolio eteriai (3.2

lentelė: 2, 4 – 6 eilutės) [450].

98

3.2 lentelė. Tyrimams naudoti organiniai tirpikliai

Tirpiklis logP 1 n-Heksanas +3,50 2 Dietilenglikolio dibutilo eteris +2,24 3 tret-Butanolis +0,83 4 Etilenglikolio dietilo eteris +0,75 5 Dietilenglikolio dietilo eteris +0,27 6 Tetraetilenglikolio dimetilo eteris -1,26

Kadangi, kaip minėta, šių tyrimų metu Lipoprime 50T lipazės komercinė gamyba

jau buvo nutraukta, pasirinkti kiti komerciniai preparatai: šeši skysti (Lipolase 100L,

Lipozyme TL100L, Lipex 100L, Resinase A2X, Palatase 20000L, Lecitase Ultra) bei du

imobilizuoti (Novozym 435 ir Lipoclean 2000T). Reakcijos temperatūra (40oC) bei

molinis substratų santykis (RA:MetOH = 1:6) buvo pasirinkti, atsižvelgus į ankstesnių

tyrimų metu gautus rezultatus. Skirtingų tirpiklių įtakos šių fermentų katalizuojamų RA

transesterinimo metanoliu reakcijų efektyvumui tyrimų rezultatai pateikti 3.18 paveiksle.

A

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Lipolase

100L

Lipozyme

TL100L

Lipex

100L

Resinase

A2X

Palatase

20000L

Lecitase

Ultra

Novozym

435

Lipoclean

2000T

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

tret-Butanolis

n-Heksanas

Dietilenglikolio dietilo eteris

Tetraetilenglikolio dimetilo eteris

Etilenglikolio dietilo eteris

Dietilenglikolio dibutilo eteris

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Lipolase

100L

Lipozyme

TL100L

Lipex

100L

Resinase

A2X

Palatase

20000L

Lecitase

Ultra

Novozym

435

Lipoclean

2000T

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

tret-Butanolis

n-Heksanas

Dietilenglikolio dietilo eteris

Tetraetilenglikolio dimetilo eteris

Etilenglikolio dietilo eteris

Dietilenglikolio dibutilo eteris

3.18 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamų RA transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose reakcijų efektyvumo po 3 (A) ir 24 val. (B) palyginimas.

2 4 5 6

99

Iš gautų duomenų nustatyta, kad po 3 val. reakcijos efektyviausiai vyksta tret-

butanolyje visų tirtų lipazių atveju, išskyrus Lipex 100L, kurios katalizuojamas

transesterinimas produktyviausiai vyksta n-heksane. Didžiausios esterių išeigos,

siekiančios beveik 45 %, gautos Lipolase 100L ir Resinase A2X lipazių katalizuojamų

reakcijų metu (3.18 (A) pav.), bet po 24 val. situacija gana smarkiai pasikeitė - didžiausi

esterių kiekiai (apie 80 %) gauti n-heksane Lipozyme TL100L, Lipex 100L, Resinase

A2X ir Lipoclean 2000T katalizuojamo transesterinimo metu. Lipolase 100L atveju

gauta esterių išeiga mažesnė, palyginus su anksčiau minėtais fermentais, tačiau šios

lipazės katalizuojama reakcija taip pat efektyviausiai vyksta n-heksane. Palatase 20000L,

Lecitase Ultra, ir Novozym 435 katalizuojamas RA transesterinimas ir po 24 val.

efektyviausiai vyksta tret-butanolyje (3.18 (B) pav.).

Produktų išeigos, gautos reakcijas vykdant glikolio eteriuose, daugeliu atveju

neprilygo tradiciniams dažniausiai naudotiems tirpikliams – n-heksanui bei tret-

butanoliui. Po 3 val. didžiausios esterių išeigos (22 - 24 %) gautos dietilenglikolio dietilo

eteryje Lipolase 100L, Lipozyme TL100L ir Resinase A2X atveju. Įdomu tai, kad šių

fermentų katalizuojamos reakcijos apskritai nevyko etilenglikolio dietilo eteryje: esterių

nesusidarė nei po 3, nei po 24 val., tuo tarpu Lipoclean 2000T atveju esteriai nesusidarė

po 3 val, tačiau po 24 val. gauta išeiga siekė apie 10 %, ir šis kiekis netgi lenkia Lecitase

Ultra bei Novozym 435 katalizuojamų reakcijų metu susidariusių esterių išeigas,

nepaisant to, kad pastarųjų atveju, esterių aptinkama jau po 3 val. Dietilenglikolio

dibutilo eteryje nevyksta tik Novozym 435 katalizuojama reakcija, Lipoclean 2000T

atveju vėl stebima ta pati tendencija: po 3 val. esterių nesusidaro, tačiau po 24 val. jų

susidaro apie 30 %, ir tai yra viena didžiausių gautų išeigų šiame tirpiklyje (3.18 pav.).

Visais atvejais fermentai mažiausiu kataliziniu aktyvumu pasižymėjo

etilenglikolio dietilo eteryje, išskyrus Palatase 20000L, kurios katalizuojamos reakcijos

vyko labai neefektyviai, tačiau panašiai visuose glikolio eteriuose. Reakcijos

produktyviausiai vyko dietilenglikolio dietilo eteryje bei tertaetilenglikolio dimetilo

eteryje, išskyrus Lipex 100L lipazę, kurios katalizuojamas transesterinimas

dietilenglikolio dibutilo eteryje vyko panašiu efektyvumu.

Kadangi buvo palyginti aštuoni skirtingi komerciniai lipazių preparatai, iš kurių

šeši buvo skysti ir du imobilizuoti, siekiant sukurti identiškas reakcijų sąlygas,

100

imobilizuotų fermentų atveju į reakcijos mišinį atitinkamai buvo pridedamas papildomas

kiekis vandens. Žinant, kad vanduo turi didelės reikšmės reakcijų eigai, ir atsižvelgus į

literatūrinius duomenis, kad Novozym 435 lipazė puikiai veikia ir bevandenėje aplinkoje,

eksperimentai tęsti tik su imobilizuotais fermentais, nepridedant papildomo kiekio

vandens. Tyrimų rezultatai palyginti su anksčiau gautais duomenimis (3.19 pav.).

A

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

tret-Butanolis n-Heksanas Dietilenglikolio

dietilo eteris

Tetraetilenglikolio

dimetilo eteris

Etilenglikolio

dietilo eteris

Dietilenglikolio

dibutilo eteris

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Novozym 435

Novozym 435 be vandens

Lipoclean 2000T

Lipoclean 2000T be vandens

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


dietilo eteris

Tetraetilenglikolio

dimetilo eteris

Etilenglikolio dietilo

eteris

Dietilenglikolio

dibutilo eterisSan

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Novozym 435

Novozym 435 be vandens

Lipoclean 2000T

Lipoclean 2000T be vandens

3.19 pav. Bevandenės aplinkos įtaka Novozym 435 ir Lipoclean 2000T lipazių katalizuojamų RA transesterinimo metanoliu reakcijų skirtinguose tirpikliuose efektyvumui po 3 (A) ir 24 val. (B).

Nustatyta, kad bevandenėje aplinkoje vyksta Novozym 435 katalizuojama

reakcija dietilenglikolio dibutilo eteryje (susidaro kiek daugiau nei 20 % esterių), kuri

apskritai nevyksta, kai reakcijos mišinyje yra papildomas kiekis vandens. Be to, visais

atvejais stebimas smarkus esterių išeigų augimas. Po 3 val. didžiausia esterių išeiga (45

%), gauta, kai reakcijos tirpikliu naudojamas tret-butanolis bei tetraetilenglikolio

dimetilo eteris, po 24 val. kiek daugiau nei 50 % esterių išeiga nustatyta, kai tirpikliu

naudotas tret-butanolis, nors reakcijos ir kituose tirpikliuose, išskyrus dietilenglikolio

dibutilo eterį, vyko gana panašiu produktyvumu - išeigos viršija 40 %.

Tuo tarpu Lipoclean 2000T situacija daugeliu atvejų priešinga - vandens

pašalinimas iš reakcijos mišinio labai smarkiai sumažino fermento katalizinį aktyvumą

visuose tirpikliuose, išskyrus etilenglikolio dietilo eterį, kuriame jau po 3 val. susidaro

nedidelis esterių kiekis, apskritai nesusidaręs reakcijų mišiniuose su vandeniu net ir po

101

24 val. Įdomu, kad po 24 val. n-heksane esterių išeiga siekia beveik 80 %, kai reakcijos

mišinyje yra vandens, tuo tarpu bevandenėje aplinkoje šis kiekis nesiekia nė 5 %.

Kadangi bevandenė aplinka pradiniame reakcijos mišinyje pasižymėjo teigiamu

efektu Novozym 435 katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu metu, siekiant

optimizuoti reakcijos sąlygas, buvo bandoma papildomai pašalinti vandenį ir iš reakcijos

mišinio molekulinių sietų bei mėlynojo silikagelio su drėgmės indikatoriumi pagalba.

Tyrimų duomenys pateikti 3.20 paveiksle.

A

0

10

20

30

40

50

60


dietilo eteris

Tetraetilenglikolio

dimetilo eteris

Etilenglikolio

dietilo eteris

Dietilenglikolio

dibutilo eteris

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Vanduo

Be vandens

Be vandens + molekuliniai sietai

Be vandens + silikagelis

B

0

10

20

30

40

50

60

70


dietilo eteris

Tetraetilenglikolio

dimetilo eteris

Etilenglikolio

dietilo eteris

Dietilenglikolio

dibutilo eteris

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Vanduo

Be vandens

Be vandens + molekuliniai sietai

Be vandens + silikagelis

3.20 pav. Vandens ir jo šalinimo iš reakcijos mišinio būdo įtaka Novozym 435 lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui.

Nustatyta, kad molekulinių sietų pridėjimas į reakcijos mišinį, padidina reakcijos

efektyvumą visais atvejais, išskyrus reakciją po 24 val. n-heksane. Ypatingai didelis

poveikis matomas dietilenglikolio dibutilo eteryje (didžiausias esterių išeigų skirtumas).

Mėlynojo silikagelio poveikis reakcijai priešingas – katalizinis fermento aktyvumas

sumažėjo visais atvejais. Tai gali būti susiję su mechaniniu imobilizuoto fermento

molekulių pažeidimu silikagelio grūdeliais reakcijos mišinių maišymo magnetine

maišykle metu. Taigi molekulinių sietų naudojimas gali būti efektyvus vandens šalinimo

iš reakcijos mišinio būdas, siekiant gauti didžiausias pageidaujamo produkto išeigas.

102

Glikolio eteriuose molekulinių sietų pagalba po 24 val. didžiausią metilo esterių išeigą

pavyko padidinti iki 60 %.

Skyriaus apibendrinimas:

Ištyrus dviejų skirtingų organinių tirpiklių – n-heksano ir tret-butanolio – įtaką

Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu eigai, nustatyta, kad

tret-butanolis yra tinkamesnis aliejų hidrolizei, o n-heksanas – transesterinimui vykdyti.

Reakcijoms naudojant įvairius n-heksano ir tret-butanolio mišinius, pastebima tiesioginė

išsiskiriančių laisvų RR kiekio priklausomybė nuo tret-butanolio tūrio dalies tirpiklių

mišinyje, tačiau tokių mišinių naudojimas nėra efektyvus produktų išeigos didinimo

būdas - neprilygsta atitinkamiems procesams, vykstantiems grynuose tirpikliuose. Be to,

vandens kiekio pokyčiai daro skirtingą įtaką reakcijų efektyvumui – kuo tirpiklis

hidrofobiškesnis, tuo daugiau vandens reikia maksimaliam proceso efektyvumui pasiekti:

optimali vandens koncentracija tret-butanolyje yra 9 %, o n-heksane - 26 %.

Ištyrus optimalias abiejuose tirpikliuose vykdomų procesų sąlygas, nustatyta, kad

jiems būdinga ta pati optimali temperatūra - 40oC. tret-Butanolyje visas aliejus

suskaldomas per 1,5 val., o didžiausia esterių išeiga (40 %) gaunama per 4 val., kai

molinis RA ir metanolio santykis yra 1:6 – 1:8, vanduo sudaro 9 %, o fermentinio

preparato kiekis – 44 mg/ml. Tyrimų metu didžiausia gauta esterių išeiga siekia 85 %, kai

reakcija vykdyta 24 val. n-heksane, esant 26 % vandens, 66 mg/ml fermentinio preparato

bei RA ir metanolio moliniam santykiui 1:12 – 1:16.

Palyginus Lipolase 100L lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu bei

metil- ir butilacetatais, efektyvumą, paaiškėjo, kad acetatų naudojimas vietoj metanolio

tirtomis sąlygomis nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo būdas. Ektoino, kaip

priedo, padidinančio aliejų transesterinimo metanoliu produktyvumą, naudojimas

tirtomis sąlygomis taip pat nepasiteisino. Kadangi ektoino kiekis (1,1 mM) tyrimams

buvo pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis, tikėtina, kad mūsų atveju tai

nebuvo optimali šio priedo koncentracija. Reakcijos naujuose organiniuose tirpikliuose -

glikolio eteriuose - daugeliu atveju neprilygo procesams, vykstantiems tradiciniuose

tirpikliuose – n-heksane bei tret-butanolyje, tačiau reakcijos produktyvumas gali būti

gerokai padidintas, naudojant džiovinimo agentus - molekulinius sietus.

103

3.2 Biotepalų sintezė: reakcijos, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas

Šiuo metu didžiąją tepalų dalį (85 - 90 %) sudaro iškastinio kuro produktai,

mažiau nei 15 % - sintetinė alyva, kuriai būdinga aukšta kokybė, geresnės tepamosios

savybės, didesnis termo- ir labai geras oksidacinis stabilumas bei mažesnis lakumas.

Nors augaliniai riebalai (aliejai) gali būti įvardijami kaip iš atsinaujinančių šaltinių

išgaunami bioskalūs esterių tipo tepalai, visgi prieš naudojimą turi būti pakeistos tam

tikros jų savybės: neatitinkantis reikalavimų oksidacinis stabilumas, blogos tepamosios

savybės, esant žemai temperatūrai ir kt. Dėl to tiesioginis aliejų, kaip biotepalų,

naudojimas pramonėje yra ribotas ir sudaro apie 1 % visų pasaulinės rinkos tepalų [451].

Tačiau tokios sandaros junginiai kaip 2-etil-2-hidroksimetil-1,3-propandiolis

(trimetilolpropanas, TMP) – triolis, kitaip nei įprastai TAG sudėtyje esantis glicerolis,

ties β–anglimi neturi vandenilio atomo, o tai, kaip manoma, nulemia TMP esterių

ypatingai aukšto lygio oksidacinį bei termostabilumą. Taip pat žinoma, kad tokie esteriai

pasižymi ir geromis tepamosiomis (lubrikantinėmis) savybėmis bei kitomis

technologiškai patraukliomis charakteristikomis [19].

Cheminiu būdu TMP esteriai gali būti gaunami šiuo trioliu transesterinant,

pavyzdžiui, iš palmių aliejaus gautus metilo esterius [451], tačiau galimi ne tik

cheminiai, bet ir alternatyvūs – fermentiniai - metodai, panaudojant riebalų virsmų

reakcijas katalizuojančius fermentus – lipazes [19]. Reakcijos schema pateikta 3.21

paveiksle.

Lipazė

Trimetilolpropanas Riebalų rūgštis Trimetilolpropano triesteris Vanduo 3.21 pav. Trimetilolpropano esterinimo riebalų rūgštimis reakcijos schema [19].

Žinant minėtas TMP junginio cheminės sandaros lemiamas ypatybes, buvo tirtos

komercinių lipazių katalizuojamos MO transesterinimo ir OR esterinimo TMP reakcijos.

Tyrimų pradžioje, pasirinkus vieną komercinį Lipoprime 50T lipazės preparatą,

vykdomų reakcijų sąlygos buvo parinktos, atsižvelgus į E. Uosukainen ir bendraautorių

104

metodiką (Uosukainen et al., 1998): molinis MO arba OR ir TMP santykis buvo 3,5:1 ir

4,5:1, temperatūra – 37oC bei 47oC, vandens kiekis reakcijos mišinyje sudarė 15 %

(w/w), o lipazės preparatas - 40 % (w/w). Nors minėtoje metodikoje slėgio sumažinimas

(2 – 16 kPa) buvo apibūdintas kaip vienas esminių veiksnių, nulemiančių dideles

reakcijos metu susidarančių produktų išeigas, mes siekėme įvertini proceso efektyvumą,

esant normaliam atmosferos slėgiui, taip išvengiant sudėtingos įrangos naudojimo vėliau

taikant sukurtus metodus didesnio masto gamybai. Tyrimų rezultatai pateikti 3.22 – 3.24

paveiksluose.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

MO

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

Reakcijų sąlygos Reakcija 1 2 3 4 5 6 7 8 TMP ir MO molinis santykis 1:3,5 1:3,5 1:3,5 1:3,5 1:4,5 1:4,5 1:4,5 1:4,5 Temperatūra, oC 37 37 47 47 37 37 47 47 Trukmė, val. 48 72 48 72 48 72 48 72 3.22 pav. Molinio substratų santykio, reakcijos trukmės ir temperatūros įtaka Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo MO transesterinimo TMP efektyvumui.

Įvertinus molinio substratų santykio įtaką Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos

MO transesterinimo TMP reakcijos efektyvumui, esant 37oC ir 47oC temperatūroms,

nustatyta, kad, TMP-TO išeigos didesnės, kai TMP ir MO molinis santykis yra 1 : 3,5,

kas lėmė jo pasirinkimą tolimesniems tyrimams. Be to, esant šiam santykiui, pakėlus

reakcijos temperatūrą nuo 37oC iki 47oC, triesterių išeiga išauga nuo 14 iki 31 % (3.22

pav.), todėl, siekiant optimizuoti proceso sąlygas, tyrimai tęsti, esant 60oC temperatūrai.

MO transesterinimo (3.23 pav.) bei OR esterinimo (3.24 pav.) TMP reakcijos vykdytos

ne tik vandenyje (3.23 (B) ir 3.24 (B) pav.), bet ir tret-butanolyje (3.23 (A) ir 3.24 (A)

pav.).

105

A

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 24 48 72 120


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

MO

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

B

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 24 48 72 120


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

MO

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.23 pav. Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo MO transesterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, tret-butanolyje (A) ir vandenyje (B) eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

A

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 24 48 72 120


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

B

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 24 48 72 120


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.24 pav. Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, tret-butanolyje (A) ir vandenyje (B) eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

106

Išanalizavus gautus duomenis, nustatyta, kad, esant 60oC temperatūrai, tiek OR

esterinimo, tiek MO transesterinimo reakcijos efektyviau vyksta vandenyje nei tret-

butanolyje, ypač dideli susidariusių produktų kiekių skirtumai stebimi MO

transesterinimo reakcijos metu: po 120 val. tret-butanolyje TMP-TO išeiga tesiekia vos 7

%, o vandenyje – 31 %. Be to, vandenyje esterinimo reakcija dvigubai efektyvesnė nei

transesterinimo: TMP-TO išeigos sudaro 62 ir 31 %, atitinkamai. Didžiausios triesterių

išeigos gautos OR esterinimo TMP vandenyje metu po 72 val., ir reakcijos trukmės

ilginimas tos išeigos nekeitė (3.24 (B) pav.).

Tyrimų metu buvo keistos įvairios reakcijų sąlygos, bet viskas vykdyta tik su

vienu fermentu – Lipoprime 50T, tad, norint dar labiau optimizuoti procesą, buvo

siekiama įvertinti, kokios įtakos tirtų reakcijų metu susidarančių produktų kokybinei ir

kiekybinei išraiškai turėtų kitų fermentinių preparatų naudojimas. Todėl be anksčiau tirto

Lipoprime 50T pasirinkti dar 9 komerciniai lipolizinių fermentų preparatai bei palygintas

jų katalizinis aktyvumas po 72 val. nuo reakcijos pradžios. Be to, siekiant sukurti

ekonomiškesnį procesą, buvo sumažintas reakcijoms naudojamų fermentų kiekis - nuo

literatūroje aprašytų 40 % (w/w) iki mūsų parinktų 15 % (w/w) (3.25 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

Nov

ozym

435

Lipo

lase

100T

Lipo

clea

n 200

0T

Lipo

zym

e TL IM

Lipo

pan 5

0BG

Lipo

pan F

BG

Lipe

x 10

0T

Lipo

zym

e RM

IM

Nov

ozym

435

FG

Lipo

prime 5

0T

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.25 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, reakcijos metu po 72 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Paaiškėjo, kad fermento kiekio sumažinimas turi itin didelę įtaką būtent

Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos reakcijos efektyvumui: TMP-TO išeiga sumažėja

nuo 62 iki 10 %. Be to, tirtomis sąlygomis TMP-TO apskritai nesusidaro, kai reakcijoms

naudoti tokie fermentiniai preparatai kaip Lipolase 100T, Lipozyme TL IM, Lipopan

50BG, Lipopan FBG bei Lipex 100T fermentai. Didžiausia gauta TMP-TO išeiga siekia

107

beveik 52 % tik tuo atveju, kai reakcija buvo katalizuojama Lipozyme RM IM lipazės

(3.25 pav.).

Kadangi, kaip nustatyta ir žinoma, lipazių katalizuojamiems procesams labai

didelę įtaką turi vandens kiekis reakcijų sistemose, siekiant optimizuoti sąlygas, tyrimai

tęsti pradedant nuo bevandenių reakcijų mišinių. Duomenys pateikti 3.26 paveiksle.

A

0

20

40

60

80

100

120

Novo

zym

435

Lipo

lase

100T

Lipo

clea

n 200

0T

Lipo

zyme T

L IM

Lipo

pan

50BG

Lipo

pan

FBG

Lipe

x 10

0T

Lipo

zyme R

M IM

Novo

zym

435

FG

Lipo

prim

e 50

T

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

B

0

20

40

60

80

100

120

Novo

zym

435

Lipo

lase

100T

Lipo

clea

n 200

0T

Lipo

zyme T

L IM

Lipo

pan

50BG

Lipo

pan

FBG

Lipe

x 10

0T

Lipo

zyme R

M IM

Novo

zym

435

FG

Lipo

prim

e 50

T

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

C

0

20

40

60

80

100

120

Novo

zym

435

Lipo

lase

100T

Lipo

clea

n 200

0T

Lipo

zyme T

L IM

Lipo

pan

50BG

Lipo

pan

FBG

Lipe

x 10

0T

Lipo

zyme R

M IM

Novo

zym

435

FG

Lipo

prim

e 50

T

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.26 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, reakcijos metu po 24 (A), 48 (B) ir 72 val. (C) susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

108

Taigi akivaizdu, kad vandens pašalinimas iš reakcijos mišinio nekeitė ir anksčiau

gautos didžiausios TMP-TO išeigos - Lipozyme RM IM atveju susidarė tie patys 52 %

TMP-TO. Bevandenėje aplinkoje, kaip ir vandens turinčiuose reakcijų mišiniuose,

Lipopan FBG ir Lipopan 50BG atveju TMP-TO apskritai nesusidaro. Vandens

pašalinimas iš reakcijos mišinio turėjo neigiamą efektą tik vienam fermentui – Lipoclean

2000T - TMP-TO išeiga sumažėjo nuo 35 iki 8 %. Visais kitais tirtais atvejais stebimas

teigiamas bevandenės aplinkos poveikis: TMP-TO susidaro ir tada, kai reakcija

katalizuojama fermentų, kurių atveju vandens turinčioje sistemoje triesteriai nesusidarė

apskritai (Lipolase 100T, Lipozyme TL IM ir Lipex 100T); Novozym 435 ir Novozym

435 FG katalizuojamų reakcijų metu triesterių kiekis padidėja 5 ir 10 %, atitinkamai,

susidarant 45 ir 45 % TMP-TO.

Kadangi TMP-TO esteriai gali būti gauti ne tik esterinimo, bet ir transesterinimo

metu, analogiškomis sąlygomis buvo vykdomas būtent MO transesterinimas TMP.

Nustatyta, kad visų tirtų komercinių preparatų atveju gautų produktų išeigos neprilygo

OR esterinimo reakcijoms (3.27 pav.)

0

20

40

60

80

100

120

Nov

ozym

435

Lipo

lase

100T

Lipo

clea

n 200

0T

Lipo

zym

e TL IM

Lipo

pan 5

0BG

Lipo

pan F

BG

Lipe

x 10

0T

Lipo

zym

e RM

IM

Nov

ozym

435

FG

Lipo

prime 5

0T

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

MO

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.27 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos MO transesterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, reakcijos metu po 96 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Kadangi OR esterinimo TMP bevandenėje aplinkoje reakcijų metu buvo gautos

didžiausios TMP-TO išeigos, kai reakcijoms naudoti Lipozyme RM IM ir Novozym 435

fermentai, buvo detaliau įvertinta šių reakcijų eigos optimizavimo galimybė (3.28 pav.).

109

0

20

40

60

80

100

120

3 24 48 72 96 3 24 48 72 96


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.28 pav. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM lipazių katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

Taigi priešingai nei vandenyje vykstančių reakcijų atveju, bevandenėje aplinkoje

reakcijos trukmės ilginimas po 72 val. didina reakcijų efektyvumą, nes po 96 val.

nustatytos didžiausios triesterių išeigos - 59 ir 62 % (bendra TMP tri-, di- ir monoesterių

išeiga sudaro 83 ir 85 %), kai reakcijoms naudoti Novozym 435 ir Lipozyme RM IM

fermentai, atitinkamai (3.28 pav.). Kadangi Novozym 435 lipazės atveju TMP-TO

susidarymas pastebėtas tik po 24 val., buvo ištirta pradinė reakcijų eiga 1 - 6 val.

Pasirodo, kad Novozym 435 lipazės katalizuojamos reakcijos metu nedidelis TMP-TO

kiekis susidaro po 6 valandų, o Lipozyme RM IM – jau po 2 val. (3.29 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6


San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s m

išin

yje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.29 pav. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM lipazių katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

Abiejų fermentų katalizuojamo OR esterinimo TMP eiga reakcijos pradžioje

nevienoda (3.29 pav.), tačiau po 96 val. jų efektyvumas tampa praktiškai identiškas (3.28

pav.). Žinoma, kad Lipozyme RM IM yra 1,3-savita, o Novozym 435 – nesavita lipazė,

Novozym 435

Novozym 435

Lipozyme RM IM

Lipozyme RM IM

110

todėl, siekiant gauti didesnes TMP-TO išeigas, analogiškoms reakcijoms buvo pasirinkti

abiejų fermentų mišiniai bei tiriama jų kiekio įtaka reakcijos produktyvumui (3.30 pav.).

0

20

40

60

80

100

120

I II III IV V VI VII

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

TMP-TO

OR

TMP-DO

TMP-MO

3.30 pav. Novozym 435 (I) ir Lipozyme RM IM (VII) lipazių bei jų mišinių (II - VI) katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, metu po 9 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM santykis mišiniuose: II – 4:1; III – 3:2; IV – 1:1; V – 2:3; VI – 1:4.

Fermentų mišinio naudojimas nepasiteisino: didinant Lipozyme RM IM lipazės

dalį mišinyje, TMP-TO kiekis auga, bet didžiausia išeiga išlieka, kai naudojamas grynas

Lipozyme RM IM fermentas (3.30 pav., VII stulpelis).


Palyginus Lipoprime 50T katalizuojamų OR esterinimo bei MO transesterinimo

trimetilolpropanu reakcijas, nustatyta, kad OR esterinimas yra efektyvesnis TMP-TO

gavimo būdas nei MO transesterinimas. Be to, abiejų tirtų reakcijų produktyvumo

atžvilgiu vanduo yra tinkamesnis tirpiklis nei tret-butanolis. Įvertinus kai kurių reakcijų

sąlygų įtaką proceso efektyvumui, nustatyta, kad reakcija efektyviau vyksta, kai

reaguojančių medžiagų (TMP ir OR ar MO) santykis yra mažesnis - 1:3,5, o temperatūra

aukščiausia iš visų tirtų – 60oC.

Didžiausia gauta TMP-TO esterių išeiga siekia 62 %, o bendra TMP tri-, di- ir

monoesterių išeiga sudaro 83 bei 85 % Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos reakcijos

metu po 72 val. bei Lipozyme RM IM – po 96 val., atitinkamai. Nors Lipozyme RM IM

katalizuojama reakcija yra ilgiau trunkantis procesas, tačiau tik jis potencialiai gali būti

taikomas didelio masto TMP-TO gamybai, nes vyksta bevandenėje aplinkoje, o fermento

kiekis sudaro tik 15 % (w/w), kai tuo tarpu Lipoprime 50T - net 40 % (w/w).

Kadangi analogiškos literatūroje aprašytos reakcijos paprastai vykdomos

sumažinto slėgio (2 – 16 kPa) sąlygomis, naudojant labai didelius fermento kiekius (40

111

% (w/w)), jos negali būti pritaikytos didelio masto gamybai ne tik dėl sudėtingos įrangos,

bet ir dėl labai didelių ekonominių sąnaudų. Tuo tarpu mūsų pakankamai palankiomis

sąlygomis gautos apie 62 % siekiančios TMP-TO išeigos ir 83 % bendra TMP tri-, di- ir

monoesterių išeiga, nenaudojant jokios sudėtingos įrangos bei sumažinus reikalingus

fermento kiekius, leidžia daryti išvadas, kad ateityje procesas gali būti dar labiau

optimizuotas ir pritaikytas pramoninei biotepalų gamybai.

3.3 Įvairių biotechnologijai svarbių esterių sintezė

Kaip minėta, lipazės yra labai svarbi fermentų grupė, turinti didžiules pritaikymo

galimybes maisto, detergentų, farmacijos, tekstilės, kosmetikos ir kitose pramonės srityse

ir didžiąją jų taikymo biotechnologijoje dalį sudaro įvairių vertingų esterių sintezė. Šie

junginiai gali būti gaminami ir naudojant cheminius katalizatorius, bet tokių reakcijų

metu neretai susidaro šalutiniai nepageidaujami produktai, o lipazių katalizuojamų

reakcijų pagalba gaunami gryni produktai, kurie gali būti traktuojami kaip natūralūs, kas

yra ypatingai svarbu sintetinant įvairius maisto priedus [227]. Be to, šie fermentai veikia

esant švelnioms reakcijų sąlygoms (tai sumažina vykdomų procesų ekonomines sąnaudas

bei reagentų ar produktų degradacijos galimybę), yra stabilūs daugelyje organinių

tirpiklių, pasižymi ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei regio- ir / ar

stereoatrankumu, todėl, priešingai nei cheminės katalizės metu, čia nesusidaro

nepageidaujami šalutiniai produktai, nereikia papildomų priemonių reakcijos metu

susidariusiems junginiams atskirti [226].

3.3.1 Skirtingų aliejų transesterinimas β-citroneloliu

Terpenų esteriai - RR junginiai, pasižymintys įvairiomis skonio ir kvapo

savybėmis, labai plačiai naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir kosmetikos pramonėse.

Nustatyta, kad kai kuriems tokio tipo esteriams būdingas ir biologinis aktyvumas -

antioksidacinės ir/ar antibakterinės savybės [239].

Kadangi darbų metu buvo siekiama įvertinti lipazių gebą katalizuoti įvairius

biotechnologijai svarbius junginius, buvo atlikta naujų potencialių lipazių substratų

paieška. Atranka vykdyta, pasirinkus standartinę mūsų daugiausiai tirtą RA

transesterinimo reakciją kaip acilakceptorius naudojant įvairius iki šiol mūsų netirtus di-

112

ir trihidroksilius aromatinius alkoholius (buvo siekiama įvertinti lipazių savitumą šių

junginių atžvilgiu, mat lipolizinių fermentų substratais gali būti ne tik alifatiniai, bet ir

alicikliniai, bicikliniai ir aromatiniai junginiai [50, 183, 184]) bei terpenolius (pasirinkti

dėl anksčiau minėtų terpenų esterių savybių). Tyrimams naudotų alkoholių struktūrinės

formulės pavaizduotos 3.31 paveiksle. Šiems eksperimentams pasirinkti du jau anksčiau

mūsų naudoti komerciniai lipazių preparatai – Lipolase 100L ir Lipex 100L.

Aliejų transesterinimo reakcijoms tinkamų acilakceptorių - potencialių lipazių

substratų - atrankos chromatografinis vaizdas pateiktas 3.31 paveiksle. Kadangi abiejų

tirtų fermentų katalizuojamos reakcijos vyko praktiškai identiškai, 3.31 pav. pateiktas tik

vieno fermento - Lipolase 100L - katalizuojamų reakcijų chromatografinis vaizdas.

K 1 2 3 4 5 6 7

Linalolisβ-Citronelolis

Pirogalolis

3.31 pav. Lipolase 100L lipazės katalizuojamos RA transesterinimo įvairiais alkoholiais (1 - 7) reakcijos chromatografinis vaizdas bei reakcijoms naudotų alkoholių struktūrinės formulės. Reakcijos sąlygos: 30oC, 24 val., tirpiklis - n-heksanas.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis vyksta tik RA transesterinimo dviem

terpenoliais - β-citroneloliu bei geranioliu - reakcija (3.31 pav. 5 ir 6 takeliai). Linalolio

atveju esterių sintezė nevyko, nes tretiniai alkoholiai paprastai yra prasti lipazių

substratai (3.31 pav. 7 takelis). Rezorcinolio, katecholio bei pirogalolio atveju ne tik

nevyko sintezės procesas, bet ir buvo slopinama aliejaus hidrolizė (3.31 pav. 1, 3, 4

takeliai), kuri vyko kai reakcijoms buvo naudoti hidrochinonas bei linalolis (3.31 pav. 2

ir 7 takeliai). Kadangi abiejų terpenolių atveju reakcija vyko panašiai, tolimesniems

tyrimams buvo pasirinktas tik vienas jų – β-citronelolis.

113

Pirmiausia buvo palygintas Lipolase 100L ir Lipex 100L lipazių katalizuojamų

vienuolikos skirtingų aliejų transesterinimo β-citroneloliu reakcijų tret-butanolyje bei n-

heksane efektyvumas (3.32 pav.). Be anksčiau naudotų aštuonių (3.1 lentelė) buvo

pasirinkti dar trys – kokosų (KA), vynuogių sėklų (VSA) bei dagių (DA, Carthamus

Tinctorius) – aliejai (3.3 lentelė).

3.3 lentelė. Riebalų rūgščių kiekis (%) tirtuose aliejuose [452]

Riebalų rūgštys

Kaprilo C8:0

Kaprino C10:0

Lauro C12:0

Miristo C14:0

PalmitinoC16:0

Stearino C18:0

Oleino C18:1

Linolo C18:2

Linoleno C18:3

Aliejai Kokosų 7,0 5,4 48,9 20,2 8,4 2,5 6,2 1,4 - Dagių - - - 0,3 11,9 2,3 29,2 55,9 0,4 Vynuogių sėklų

- - - - 7,2 4,8 19,4 68,1 0,1

A

0

5

10

15

20

25

30

RA JA SA AA RiA KS LSA RLA KA VSA DA

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, % Lipolase 100L, tret-butanolis

Lipolase 100L, n-heksanas

Lipex 100L, tret-butanolis

Lipex 100L, n-heksanas

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

RA JA SA AA RiA KS LSA RLA KA VSA DA

Sa

nty

kin

is e

ste

rių

kie

kis

re

ak

cijo

s

miš

iny

je, % Lipolase 100L, tret-butanolis

Lipolase 100L, n-heksanas

Lipex 100L, tret-butanolis

Lipex 100L, n-heksanas

3.32 pav. Lipolase 100L ir Lipex 100L lipazių katalizuojamo įvairių aliejų transesterinimo β-citroneloliu n-heksane bei tret-butanolyje metu po 3 (A) ir 24 val. (B) susidariusių esterių santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

114

Lipex 100L katalizuojama reakcija tret-butanolyje vyko ypatingai neefektyviai,

ir, nors reakcijos pradžioje po 3 val. Lipolase 100L atveju reakcija vyko gana

produktyviai abiejuose tirpikliuose, tačiau jau po 24 val. nustatytas smarkus susidariusių

esterių kiekio išaugimas n-heksane, palyginus su atitinkamomis reakcijomis tret-

butanolyje. Iš visų tirtų aliejų prasčiausiai transesterintas RiA, o efektyviausiai – KA

(Lipolase 100L katalizuojamos reakcijos n-heksane metu po 24 val. susidariusių esterių

išeiga siekia 72 %, o Lipex 100L – 46 %). Todėl KA ir buvo pasirinktas tolimesniems

tyrimams - proceso sąlygų ir parametrų optimizavimui.

KA iš kitų aliejų išsiskiria tuo, kad daugiau nei 90 % jo sudėtyje esančių RR yra

sočiosios, iš kurių apie 49 % sudaro lauro rūgštis (C12:0), kuriai, kaip žinoma, yra

būdingos antivirusinės bei antibakterinės savybės (3.3 lentelė). Kakavos svieste taip pat

daug sočių RR, tačiau jų daugumą sudaro ilgesnės anglies grandinės RR - palmitino

(C16:0) bei stearino (C18:0) (3.1 lentelė). Tad galima teigti, kad tiriami fermentai yra

labiau saviti sočioms trumpesnės anglies grandinės RR. Kita vertus, yra nustatyta, kad

KA tirpumas alkoholiuose yra didesnis, palyginus su kitais įprastais aliejais ar riebalais.

Todėl negalima atmesti prielaidos, kad ne tik lipazių savitumas, bet ir reaguojančių

medžiagų tirpumo skirtumai gali sąlygoti tokį skirtingą reakcijos produktyvumą.

Kaip žinia, lipazių savitumas pasireiškia ne tik RR, bet ir naudojamų alkoholių

atžvilgiu, ir ši savybė, priklausomai nuo reakcijų sąlygų, gali kisti. Todėl buvo palyginta

Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu eigos

priklausomybė nuo reakcijos trukmės dviejuose tirtuose tirpikliuose – n-heksane bei tret-

butanolyje. Tyrimo rezultatai pateikti 3.33 paveiksle.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3.33 pav. Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu n-heksane (4 - 6) ir tret-butanolyje (7 - 9) eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės chromatografinis vaizdas. 4 – po 1 val.; 5 – po 3 val.; 6 – po 24 val.; 7 – po 1 val.; 8 – po 3 val.; 9 – po 24 val. Kontrolės: 1 – KA; 2 – β-citronelolis; 3 – KA ir β-citronelolio mišinys.

115

Kaip ir anksčiau vykdytų įvairių reakcijų metu, taip ir šiuo atveju tret-butanolyje

vyksta tik efektyvi aliejaus hidrolizė, o susidariusių esterių kiekis – minimalus (3.33 pav.

7 - 9 takeliai). Nors n-heksane pradinis aliejaus hidrolizės procesas yra lėtesnis, tačiau čia

po 24 val. susidaro gerokai didesnis esterių kiekis, siekiantis 72 % (3.33 pav. 6 takelis),

kai tuo tarpu tret-butanolyje jis sudaro tik apie 19 % (3.33 pav. 9 takelis).

Kadangi pradiniai tyrimai buvo vykdomi tik su dviem komerciniais fermentais –

Lipolase 100L ir Lipex 100L - buvo įvertintas ir kitų anksčiau tirtų lipolizinių fermentų –

Lipex 100T, Lipolase 100T, Lipoclean 2000T, Lipopan 50BG, Lipoprime 50T,

Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Novozym 435, Lecitase Ultra, Lipozyme TL100L,

Palatase 20000L, Resinase A2X - efektyvumas, katalizuojant KA transesterinimo β-

citroneloliu n-heksane reakciją, bei atrinkti aktyviausi (3.34 pav.).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Lipe

x 10

0T

Lipo

lase

100

T

Lipo

clea

n 20

00T

Lipo

pan

50BG

Lipo

pan

FBG

Lipo

prim

e 50

T

Lipo

zym

e RM

IM

Lipo

zym

e TLI

M

Nov

ozym

435

Lecita

se U

ltra

Lipe

x 10

0L

Lipo

lase

100

L

Lipo

zym

e TL1

00L

Palat

ase

2000

0L

Res

inas

e A2X

Sa

nty

kin

is e

ste

rių

kie

kis

re

ak

cijo

s m

išin

yje

, %

3 val.

24 val.

3.34 pav. Įvairių lipolizinių fermentų katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu n-heksane metu susidariusių esterių santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Mažiausia esterių išeiga, nesiekianti nė 30 %, susidarė, kai reakciją katalizavo

Lipopan FBG. Lipolase 100L kaip ir Lipozyme TL100L bei Resinase A2X, pasirodė

esantys efektyviausi fermentai, katalizuojantys tiriamą β-citronelolio esterių sintezės

reakciją: po 24 val. susidariusių esterių kiekis viršija 70 %. Lyginant fermentų aktyvumą

reakcijos pradžioje (po 3 val.), nustatyta, kad didžiausios esterių išeigos, siekiančios 57 ir

62 %, susidaro, naudojant Lipozyme RM IM bei Lipozyme TL IM lipazes, atitinkamai.

Šis kiekis reakcijos laikotarpiu tarp 3 ir 24 val. kinta mažai ir nepasiekia didžiausių

nustatytų esterių kiekių, gautų, naudojant tris kitus anksčiau minėtus fermentus. Todėl,

116

priklausomai nuo tikslo bei esamų sąlygų, KA transesterinimo proceso trukmę ir eigą

galima keisti, pasirenkant atitinkamą fermentinį preparatą.

Kadangi kiti nauji naudoti fermentiniai preparatai neprilygo arba pasižymėjo

panašiu aktyvumu kaip ir anksčiau tirta lipazė Lipolase 100L, ji ir pasirinkta

tolimesniems eksperimentams. Atsižvelgus į tai, kad tirtų reakcijų eiga tret-butanolyje

bei n-heksane taip drastiškai skyrėsi (3.33 pav.), nutarta įvertinti ir kitų organinių

tirpiklių įtaką KA transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui (3.35 pav.). Naudotų

tirpiklių sąrašas pateiktas 3.4 lentelėje.

3.4 lentelė. Tyrimams naudoti organiniai tirpikliai bei jų logP vertės

Nr. Pavadinimas LogP Nr. Pavadinimas LogP

1 n-Oktanas +4,78 11 tret-Butilmetilo eteris +0,94

2 Izooktanas +4,37 12 tret-Butanolis +0,83

3 n-Heptanas +4,00 13 Piridinas +0,62

4 Cikloheksanas +3,80 14 2-Butanonas +0,61

5 n-Heksanas +3,50 15 Tetrahidrofuranas +0,50

6 n-Pentanas +3,25 16 Acetonas -0,26

7 Toluenas +2,50 17 Acetonitrilas -0,36

8 Benzenas +2,00 18 Dimetilformamidas -0,83

9 Diizopropilo eteris +2,00 19 Dioksanas -1,10

10 tret-Amilo alkoholis +1,30 20 Dimetilsulfoksidas -1,30

Kaip žinoma, organinių tirpiklių naudojimas gali išspręsti prasto reaguojančių

medžiagų tirpumo, žemo lipazių savitumo ir sudėtingo susidariusių produktų gryninimo

problemas, būdingas vandeninėje aplinkoje vykstančioms reakcijoms [67]. Be to,

nustatyta, kad nepoliniai tirpikliai daugeliu atvejų yra tinkamesni už polinius, mat

pastarieji, kitaip nei nepoliniai tirpikliai, patraukia vandenį iš fermento aktyvaus centro,

taip sumažindami jo katalizinį aktyvumą [68]. Įprastai lipazių katalizuojamoms esterių

sintezės reakcijoms naudojami įvairūs nepoliniai tirpikliai [69].

Yra duomenų, kad >3 logP (kur P - tirpiklio pasiskirstymo tarp 1-oktanolio ir

vandens koeficientas) vertės tirpikliai paprastai tinkamiausi aliejų ir riebalų įvairių

modifikacijų reakcijoms, o mažesnės logP vertės tirpikliai naudojami, kai substratai labai

117

skiriasi poliškumu. Kadangi idealiu atveju abu substratai turi būti ištirpę reakcijos

mišinyje bent jau dalinai, paprastai pasirenkama vidutinio poliškumo terpė.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Sa

nty

kin

is e

ste

rių

kie

kis

re

ak

cijo

s m

išin

yje

, %

3 val.

24 val.

3.35 pav. Įvairių organinių tirpiklių įtaka Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui. Skaičiai atitinka 3.4 lentelėje nurodytus tirpiklius.

Taigi paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis reakcija apskritai nevyko diizopropilo

eteryje, piridine, tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside.

Nors ir būtų galima daryti išvadą, kad transesterinimas nevyksta mažiausios logP vertės

tirpikliuose (dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside) (3.35 pav. 18 - 20

stulpeliai), tačiau tai nepaaiškina, kodėl reakcija nevyksta diizopropilo eteryje (9

stulpelis), kurio logP yra +2,00 ar piridine (+0,62; 13 stulpelis) bei tetrahidrofurane

(+0,50; 15 stulpelis), kai tuo tarpu, pavyzdžiui, acetone (-0,26; 16 stulpelis) bei

acetonitrile (-0,36; 17 stulpelis) – vyksta. Tad šiuo atveju ryškios tiesioginės

priklausomybės tarp reakcijos efektyvumo bei logP vertės nenustatyta, kas neretai

nurodoma ir įvairiuose literatūriniuose šaltiniuose, kai pažymima, kad svarbios ir kitos

tirpiklių charakteristikos, pavyzdžiui, dielektrinė konstanta ir pan. [68].

Transesterinimo reakcija produktyviausiai vyko hidrofobiniuose tirpikliuose,

kurių logP vertė didesnė arba lygi 3,50 - n-oktane, izooktane, n-heptane, cikloheksane ir

n-heksane (3.35 pav. 1 - 5 stulpeliai) – čia susidariusių esterių išeigos siekė 72 %.

Palyginus su procesais, vykstančiais kituose tirpikliuose, galima teigti, kad reakcijos

neblogai vyko ir kiek mažesnės logP vertės tirpikliuose: benzene (+2,00), toluene (+2,50)

bei n-pentane (+3,25) (3.35 pav. 6 - 8 stulpeliai). Gauti rezultatai atitinka literatūroje

rastus duomenis, kur teigiama, kad neretai didesnis fermentų aktyvumas pastebimas, kai

118

logP vertė yra didesnė už 2. Be to, labiau hidrofobiniuose tirpikliuose stebimas ir

didesnis fermentų stabilumas [421]. Minėtuose organiniuose tirpikliuose buvo vykdoma

ir kita anksčiau tirta Lipolase 100L katalizuojama reakcija – RA transesterinimas

metilacetatu (3.36 pav.). Tad buvo palygintas fermento aktyvumas, katalizuojant

skirtingas reakcijas tuose pačiuose 20 organinių tirpiklių (3.4 lentelė).

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcij

os

miš

inyje

, %

3.36 pav. Tirpiklių įtaka Lipolase 100L lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metilacetatu efektyvumui. Reakcijos sąlygos: 35oC temperatūra, RA ir metilacetato molinis santykis 1:4, 48 val.

Šių palyginamųjų tyrimų metu nustatyta, kad abi reakcijos nevyko tuose pačiuose

anksčiau minėtuose penkiuose organiniuose tirpikliuose: diizopropilo eteryje, piridine,

tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside. Tačiau įdomu tai,

kad skyrėsi tirpikliai, kuriuose reakcija vyksta efektyviausiai. Kaip minėta, KA

transesterinimas β-citroneloliu efektyviausiai vyksta didžiausios logP vertės tirpikliuose,

tuo tarpu RA transesterinimo metilacetatu reakcija produktyviausia tret-butilmetilo

eteryje, kurio logP siekia tik +0,94. Tai galėtų būti paaiškinta skirtingu acilakceptorių

hidrofobiškumu: β-citronelolis yra hidrofobiškesnis už metilacetatą, todėl, siekiant

užtikrinti efektyvų visų reaguojančių medžiagų tirpumą reakcijos mišinyje, terpenolio

atveju, matyt, reikalingi hidrofobiškesni tirpikliai.

3.3.2 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas

Tiriant lipazių savitumą, dažnai kaip substratai naudojami skirtingą

hidroksigrupių skaičių turintys alkoholiai (dioliai, trioliai), tačiau duomenų apie lipazių

katalizuojamas vieną, dvi ir daugiau karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimo reakcijas

literatūroje aptinkama ypatingai mažai ir dažniausiai tai yra patentuoti tyrimai. Tad,

119

pasirinkus penkias skirtingas karboksirūgštis - oksalo, glutaro, citrinų, ftalo bei galo

(3.37 pav.), – buvo siekiama įvertinti lipazių gebą katalizuoti šių rūgščių esterinimo

dviem skirtingais alkoholiais – β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu - reakciją. Šių

eksperimentų metu naudotas vienas labiausiai tyrinėjamų lipazių preparatų - Novozym

435 – pasižymintis ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei geba katalizuoti ir įvairias,

paprastai lipazėms nebūdingas, reakcijas.

3.37 pav. Tyrimams naudotų karboksirūgščių struktūrinės formulės: A – oksalo; B – glutaro; C – citrinų; D – ftalo; E – galo.

Pirmiausia buvo ištirta Novozym 435 lipazės geba katalizuoti minėtų rūgščių

esterinimo β-citroneloliu n-heksane reakciją. Duomenys pateikti 3.38 paveiksle.

N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3.38 pav. Novozym 435 lipazės katalizuojamo karboksirūgščių (1 – oksalo, 3 – glutaro, 5 – ftalo, 7 – galo, 9 – citrinų) esterinimo β-citroneloliu n-heksane, esant 40oC temperatūrai, metu po 24 val. susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. N - fermentas+tirpiklis. Kontrolės: rūgštys be fermento: 2 – oksalo; 4 – glutaro; 6 – ftalo; 8 – galo; 10 – citrinų.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis vyksta tik oksalo bei glutaro rūgščių

esterinimas (3.38 pav. 1 ir 3 takeliai), kitais atvejais, kaip tikėtina, reakcija nevyko dėl

naudotų karboksirūgščių struktūrų sterinių efektų, mat lipazių savitumą tam tikroms

rūgštims ar alkoholiams paprastai nulemia du pagrindiniai veiksniai: steriniai efektai ir

hidrofobinės sąveikos [175, 176] (3.37 (C – E) pav.), tačiau įdomu tai, kad oksalo

rūgšties atveju produktas susidaro ir reakcijos mišinyje be fermento (3.38 pav. 2 takelis).

Nors literatūroje ir aptinkama duomenų, kad kai kuriais atvejais spontaninė oksalo

120

rūgšties esterinimo reakcija gali vykti, visgi mūsų tirtos sąlygos yra per švelnios bet

kokiems literatūroje aprašytiems savaiminiams virsmams, todėl būtinas šio atvejo

detalesnis ištyrimas kitais metodais.

Literatūroje yra duomenų, kad tam tikrais atvejais iš Novozym 435 preparato gali

atsiplauti pats fermentas ir/ar įvairūs priedai, kurie kaip substratai gali dalyvauti įvairių

nepageidaujamų šalutinių reakcijų metu [131]. Todėl, norint įsitikinti, kad minėtų

junginių susidarymas nėra sąlygotas iš Novozym 435 preparato atsiplovusių priedų

buvimo, vykdytos oksalo rūgšties esterinimo ne tik β-citroneloliu, bet ir oleilo alkoholiu

reakcijos, naudojant du fermentus – Novozym 435 bei Lipex 100T. Be to, žinant, kad

Novozym 435 lipazė efektyvesnė bevandenėje aplinkoje, šį kartą vandens pašalinimui iš

reakcijos mišinio naudoti ir molekuliniai sietai. Tyrimo rezultatai pateikti 3.39 paveiksle.

LE C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3.39 pav. Novozym 435 ir Lipex 100T katalizuojamo oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu (1 - 6) bei oleilo alkoholiu (7 - 12) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, metu po 24 val. susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. 1,7 – Novozym 435 ir molekuliniai sietai; 2,8 – Novozym 435; 3,9 – Lipex 100T ir molekuliniai sietai; 4,10 – Lipex 100T; 5,11 – molekuliniai sietai; 6,12 – be fermento. Kontrolės: LE – linalolio esteris, C – β-citronelolis.

Reakcija vyko visais atvejais. Įdomu, kad produktas be fermento susidaro ir β-

citronelolio, ir oleilo alkoholio atveju (3.39 pav. 6 ir 12 takeliai). Kadangi iki šiol naudoti

tik imobilizuoti komerciniai lipazių preparatai, tyrimai pakartoti, vykdant oksalo rūgšties

esterinimo β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu reakcijas, katalizuojamas skysto komercinio

lipolizinio fermento – Lipozyme TL100L (3.40 pav.).

Produktas 1

Produktas 2

Produktas 3

MO OA 1 2 3 4

X

3.40 pav. Novozym 435 (1) ir Lipozyme TL100L (2) katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo oleilo alkoholiu bei Lipozyme TL100L katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu (4) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, reakcijos metu susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. Kontrolės: MO – metiloleatas; OA – oleilo alkoholis. 3 – reakcijos mišinys be fermento.

121

Taigi paaiškėjo, kad oksalo rūgšties esterinimo oleilo alkoholiu reakcijos metu

skirtingomis sąlygomis susidaro trys produktai. Įdomu tai, kad oksalo rūgšties esteriai

gaunami be fermentų katalizės (3.40 pav. 3 takelis), nes nustatytas didžiausias produkto 1

kiekis (bet mažiausias produkto 3 kiekis), o abiejų fermentinių preparatų naudojimas

esterių išeigų nepadidina. Be to, tik skystos lipazės Lipozyme TL100L atveju stebimas

produkto 2 susidarymas (3.40 pav. 2 ir 4 takeliai). Savaiminio ir fermentinio oksalo

rūgšties esterinimo dviem tirtais alkoholiais skirtumas yra produktų 2, 3 ir X susidarymas.

Deja, esamomis sąlygomis jų identifikuoti nepavyko – tai bus atlikta ateityje Chemijos

fakulteto Organinės chemijos katedroje.

Kadangi, kaip minėta, skystos lipazės Lipozyme TL100L atveju stebimas

produkto 2 susidarymas (3.40 pav. 2 ir 4 takeliai) su oleilo alkoholiu, o naudojant β-

citronelolį, atsiranda dar vienas papildomas produktas X, kurio buvimas kitais tirtais

atvejais nenustatytas (3.40 pav. 4 takelis), buvo nutarta palyginti reakcijos eigos

ypatumus, naudojant ir kitą skystą fermentinį preparatą – Resinase A2X (3.41 pav.).

C 1 2 3 4 OA 5 6 7 8 3.41 pav. Resinase A2X katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu (1 - 4) bei oleilo alkoholiu (5 - 8) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, reakcijos metu susidarančių produktų priklausomybės nuo laiko chromatografinis vaizdas. 1,5 – po 1 val.; 2,6 - po 3 val.; 3,7 - po 24 val.; 4,8 – po 48 val. Kontrolės: C - β-citronelolis.; OA – oleilo alkoholis.

Akivaizdu, kad Resinase A2X lipazės katalizuojamos esterinimo reakcijos eiga

yra kokybiškai panaši į anksčiau naudoto Lipozyme TL100L fermento atvejį, kai

esterinimo β-citroneloliu (3.41 pav. 2 - 4 takeliai) metu susidaro vienu produktu daugiau

nei reakcijos su oleilo alkoholiu metu (3.41 pav. 6 - 8 takeliai).

Taigi tirtų reakcijų metu gautų produktų nustatymui TLC metodu (pagal

medžiagos pasiskirstymo koeficientą – Rf) trūksta atskaitos taško – kontrolių, t.y.,

konkrečių grynų medžiagų - atitinkamų karboksirūgščių mono- ar diesterių-, su kuriomis

būtų galima palyginti susidariusių produktų išsidėstymą chromatogramose, tačiau tyrimų

122

metu mes jų neturėjome, kadangi, kaip paaiškėjo, įsigyti galima tik trumpagrandžių

esterių – etilo bei butilo, bet ne mūsų tirtų. Todėl VU Chemijos fakultete Organininės

chemijos katedroje buvo atlikta minėtų produktų cheminė analizė bei masių

spektrometrija. Tam tikslui Novozym 435 lipazės katalizuojamos glutaro rūgšties

esterinimo β-citroneloliu n-heksane, esant 40oC, reakcijos mišiniai buvo išfrakcionuoti

TLC metodu ant dviejų skirtingų chromatografinių plokštelių. Kadangi ir GC, ir HPLC

metodams trukdytų jodo pėdsakai, viena iš identiškai paruoštų chromatogramų buvo

ryškinta jodo garų kameroje, o kita – ne. Iš pastarosios, lyginant su dėmių padėtimis jodu

ryškintoje chromatogramoje (3.42 (A) pav.), buvo išskusti silikagelio sluoksniai su

atitinkamomis medžiagomis ir pateikti 1H BMR spektroskopinei analizei atlikti.

3.42 pav. Novozym 435 lipazės katalizuojamo glutaro rūgšties esterinimo β-citroneloliu n-heksane, esant 40oC temperatūrai, chromatografinis vaizdas (A) bei chromatogramoje pažymėto produkto - glutaro rūgšties ir β-citronelolio diesterio - struktūrinė formulė ir vandenilių cheminiai poslinkiai 1H BMR spektre (CHF, doc. V. Masevičius) (B).

Gauti 3.42 (A) paveiksle pažymėtos medžiagos analizės duomenys patvirtino, kad

reakcijos metu susidarantis produktas yra glutaro rūgšties ir β-citronelolio diesteris

(struktūrinė formulė pateikta 3.42 (B) pav.). GC-MS analizės metu nustatyta, kad

junginys yra pakankamai grynas. Pagrindinės priemaišos yra: acto rūgštis (TLC eliucijos

sistemos sudedamoji dalis) bei alkanai (iš petrolio eterio). Atitinkamai buvo paruošti ir

kitų reakcijų metu susidarančių produktų mėginiai, tyrimai taip pat bus atlikti Chemijos

fakultete.


Buvo atlikta naujų substratų (acilakceptorių), tinkamų Lipolase 100L ir Lipex

100L lipazių katalizuojamam RA transesterinimui, atranka. Tyrimams pasirinkti įvairūs

123

iki šiol mūsų netirti di- ir trihidroksiliai aromatiniai alkoholiai (rezorcinolis, katecholis,

pirogalolis, hidrochinonas) bei terpenoliai (β-citronelolis, geraniolis, linalolis). Nustatyta,

kad tirtomis sąlygomis vyksta tik RA transesterinimo dviem terpenoliais - β-citroneloliu

bei geranioliu – reakcijos.

Palyginus minėtų lipazių katalizuojamų vienuolikos skirtingų aliejų (RA, JA, SA,

AA, RiA, KS, LSA, RLA, KA, VSA, DA) transesterinimo β-citroneloliu reakcijų tret-

butanolyje bei n-heksane efektyvumą, paaiškėjo, kad daugeliu atvejų sintezė efektyvesnė

n-heksane, o iš visų tirtų aliejų produktyviausiai transesterinamas KA. Kadangi didžiąją

KA sudėtyje esančių RR dalį sudaro sočiosios RR, iš kurių apie 46 % - lauro rūgštis

(C12:0), galima daryti išvadą, kad tirti fermentai yra savitesni sočioms trumpesnės

anglies grandinės RR. Atlikus aktyviausių tiriamos KA transesterinimo β-citroneloliu

reakcijos atžvilgiu fermentų atranką, nustatyta, kad reakciją efektyviausiai katalizuoja

Lipolase 100L, Lipozyme TL100L bei Resinase A2X - po 24 val. susidariusių esterių

kiekis viršija 70 %.

Įvertinus kitų pasirinktų organinių tirpiklių įtaką Lipolase 100L katalizuojamo

KA transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui, paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis

reakcija produktyviausiai vyko hidrofobiniuose tirpikliuose, kurių logP vertė didesnė

arba lygi 3,50 - n-oktane, izooktane, n-heptane, cikloheksane ir n-heksane – čia

susidariusių esterių išeigos siekė 72 %. Reakcija apskritai nevyko diizopropilo eteryje,

piridine, tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside.

Ištyrus pasirinktų komercinių lipolizinių fermentinių preparatų gebą katalizuoti

įvairių vieną ar daugiau karboksi ir/ar hidroksigrupių turinčių organinių rūgščių

esterinimo β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu reakcijas, nustatyta, kad tirtomis sąlygomis

iš visų pasirinktų rūgščių (oksalo, glutaro, ftalo, galo, citrinų) reakcijos efektyviausiai

vyksta tik su glutaro ir oksalo rūgštimis. VU Chemijos fakultete 1H BMR

spektroskopijos ir GC-MS analizės metodais patvirtinta, kad Novozym 435 lipazės

katalizuojamos glutaro rūgšties esterinimo β-citroneloliu reakcijos metu susidaro glutaro

rūgšties β-citronelolio diesteris.

Įdomu tai, kad oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu ir oleilo alkoholiu metu

gaunamas skirtingas produktų skaičius, kuris kinta ir naudojant skirtingus komercinius

lipolizinius fermentus. Gautų produktų nustatymas TLC metodu (pagal medžiagos

124

pasiskirstymo koeficientą – Rf) nebuvo galimas, nes trūko kontrolių (konkrečių grynų

medžiagų), su kuriomis būtų galima palyginti susidariusių produktų išsidėstymą

chromatogramose. Įsigyti, deja, galima tik trumpagrandžių esterių – etilo bei butilo, bet

ne mūsų tirtų, todėl VU Chemijos fakultete Organininės chemijos katedroje bus atlikta ir

kitų tiriamų reakcijų metu susidariusių produktų cheminė analizė bei masių

spektrometrija.

3.4 Lipazių tinkamumo riebalinių atliekų (pamuilių) utilizavimui tyrimas

Lietuvos Mokslo, inovacijų ir technologijų agentūros (MITA) finansuojamos De

minimis pagalbos (inovacinio čekio), kurio gavėjas buvo AB “NAUJOJI RINGUVA”,

dėka atlikti tyrimai „Lipolizinių fermentų skatinamų riebalinių atliekų virsmų produktų

susidarymo iš pamuilių biotechnologinio panaudojimo perspektyvos“, kurių tikslas buvo

ištirti riebalinių gamybos atliekų – pamuilių – biotechnologinio utilizavimo ir gautų

produktų praktinio panaudojimo galimybes.

Įvairiose pramonės šakose susikaupiančių riebalinių atliekų utilizavimo ir/ar

praktinio panaudojimo problemos sprendimo būdai yra sudėtingi, todėl nėra išspręsti iki

šiol ir yra aktualūs ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje. Muilo gamybos metu

susidariusios riebalinės atliekos (pamuilės) dažniausiai panaudojamos žemesnės kokybės

techninės paskirties muilui (taip vadinamam, ūkiniam) ir plovimo bei valymo

priemonėms (pavyzdžiui, šveitimo pastoms) gaminti.

Galimas ir kitoks šių atliekų panaudojimas – pamuilės gali būti potenciali

biodyzelino ar kitos paskirties RR esterių gamybos žaliava, transesterinant bei esterinant

jas atitinkamais alkoholiais. Kaip žinoma, svarbiausia priežastis, stabdanti biodyzelino

komercializacijos procesą, yra dideli gamybos kaštai, kurių 70 - 80 % sudaro žaliavos

(maistinių aliejų) kaina [252, 304]. Riebalinių atliekų naudojimas vietoj grynų aliejų

galėtų veiksmingai (60 - 90 %) sumažinti biodyzelino kainą bei dirbamos žemės plotus,

skirtus reikalingoms aliejingoms kultūroms auginti [254].

Riebalinės atliekos savo sudėtimi gana skiriasi nuo įprastai naudojamų šviežių

aliejų: joms būdingas gerokai didesnis vandens bei laisvų RR kiekis [331], todėl šiuo

atveju tradicinė cheminė katalizė negali būti taikoma [332, 333], ir tinkamiausi yra

125

fermentų katalizuojami procesai, nes lipazės gali esterinti visas atliekose esančias laisvas

RR [334]. Pavyzdžiui, palyginus komercinės Novozym 435 lipazės katalizuojamas

biodyzelino sintezės reakcijas, kai kaip žaliava buvo naudotas atliekų bei grynas aliejus,

nustatyta, kad, nors didesnis vandens kiekis atliekose ir sumažino reakcijos greitį, tačiau

jos pusiausvyrai įtakos neturėjo - galutinės produktų išeigos buvo panašios [335]. Tai

patvirtina lipazių pritaikymo galimybę, perdirbant riebalines atliekas [334].

Kita biodyzelino gamybos žaliava – dumbliai, mat kai kurios jų rūšys sukaupia

ypatingai daug lipidų [326], kurie savo sudėtimi yra analogiški iš įprastų augalinių

kultūrų (rapsų, saulėgrąžų, palmių ir kt.) gaunamiems aliejams [327, 328]. Tai -

mikroskopiniai autotrofiniai ir heterotrofiniai organizmai [321, 322], sparčiai

besidauginantys ir augantys tiek sintetinėse, tiek ir natūraliose terpėse - nuotekose [323].

Tad pamuilės galėtų būti panaudotos kaip dumblių auginimo terpė.

3.4.1 Pamuilių cheminės sudėties analizė

Tyrimų metu buvo siekiama įvertinti ne tik lipazių gebą katalizuoti negrynintose

pamuilėse esančių laisvų RR esterinimo bei TAG transesterinimo alkoholiais reakcijas,

bet ir dumblių potencialą utilizuoti susidariusias atliekas, panaudojant jas kaip augimo

terpę. Kadangi fermentų katalizuojamų procesų efektyvumui bei dumblių augimui labai

didelę įtaką turi reakcijos mišinio bei augimo terpės, atitinkamai, sudėtis, pirmiausia ir

buvo atlikta kokybinė ir kiekybinė pamuilių sudėties analizė. Pagrindinių cheminių

elementų sudėtis pamuilėse buvo nustatyta atominės absorbcinės spektrometrijos metodu

VU Chemijos fakultete (prof. S. Tautkus) (3.5 lentelė), o riebalinių komponentų analizė

dujinės chromatografijos metodu buvo atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir

Veterinarijos akademijos Gyvulininkystės instituto chemijos laboratorijoje (dr. G.

Švirmickienė) (3.6 lentelė).

3.5 lentelė. Pamuilėse esančių pagrindinių cheminių elementų kiekis Metalas Kiekis, g/kg drėgnos masės Kalcis 3,41 Magnis 0,29 Natris 1,33 Kalis 0,017 Geležis 2,3 Švinas 0,0019

126

3.6 lentelė. Pamuilėse esančių riebalų rūgščių kiekis Riebalų rūgštis Santykinis kiekis, % nuo viso RR kiekio Tetradekano (miristo, C14:0) 5,10 Heksadekano (palmitino (C16:0) 31,97 9-Heksadeceno (palmitoleino, C16:1) 2,87 Oktadekano (stearino, C18:0) 17,01 cis-9-Oktadeceno (oleino, C18:1) 38,48 11- Oktadeceno (vakeno, C18:1) 2,36 trans- 9,12-Oktadekadieno (linolo, C18:2) 2,21

Atlikus cheminę sudėties analizę, nustatyta, kad pamuilėse daugiausiai yra kalcio,

geležies, natrio bei magnio, nustatytas nedidelis kiekis kalio bei aptikti švino pėdsakai

(3.5 lentelė). Įvertinus pamuilėse esančių RR kiekius, nustatyta, kad dominuoja

ilgagrandės RR (C16 - C18), o sočiosios sudaro 54 % viso pamuilėse esančių RR kiekio

(3.6 lentelė). Pamuilėse esančių riebalinių komponentų sudėtis įvertinta ir TLC metodu -

n-heksanu ekstrahuotų pamuilių mišinių chromatografinis vaizdas pateiktas 3.43 pav.

3.43 pav. Pamuilių mišinio, ekstrahuoto n-heksanu, viršutinės (1) ir apatinės (2) fazių chromatografinis vaizdas. TO, OR – kontrolės.

Taigi paaiškėjo, kad didžiąją pamuilėse esančių riebalinių komponentų dalį

sudaro laisvos RR, kiek mažiau randama TAG, be to, aptinkama ir DAG bei MAG

pėdsakų. Vadinasi, lipazių katalizuojami procesai turės apimti ne tik laisvų RR

esterinimo, bet ir TAG, DAG bei MAG transesterinimo reakcijas. Be to, nors pamuilės n-

heksane išsisluoksniuoja į skaidrią viršutinę ir drumstą apatinę fazes, akivaizdu, kad jų

sudėtis yra praktiškai identiška (3.43 pav. 1 - 2 takeliai), tad lipzių katalizuojamoms

reakcijoms turi būti naudojama ne viena konkreti fazė, bet jų mišinys.

3.4.2 Pamuilių, kaip potencialios biodyzelino žaliavos, transesterinant bei esterinant jas atitinkamais alkoholiais, panaudojimo tyrimas

Lipazių katalizuojamų pamuilių esterinimo bei transesterinimo alkoholiais

reakcijų tyrimų pradžioje buvo įvertintas šių atliekų tirpumas dešimtyje pasirinktų

127

organinių tirpiklių (tūrio santykiu 1:1), kurie įvairių riebalų esterinimo bei

transesterinimo reakcijų metu paprastai yra lipazių substratai (acilakceptoriai): metanolis,

etanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis, 1-heksanolis, izopropanolis, izobutanolis, izoamilo

alkoholis, metil- bei butilacetatas. Pamuilių ir šių tirpiklių mišinių fotovaizdas pateiktas

3.44 paveiksle.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3.44 pav. Pamuilių ir įvairių organinių tirpiklių mišinių (tūrio santykiu 1:1) fotovaizdas: 1 – metanolis; 2 – etanolis; 3 – 1-butanolis; 4 - 1-pentanolis; 5 - 1-heksanolis; 6 – izopropanolis; 7 – izobutanolis; 8 – izoamilo alkoholis; 9 – metilacetatas; 10 – butilacetatas.

Kaip matome iš 3.44 paveiksle pateikto fotovaizdo, ilgesnės anglies grandinės

(C4 - C6) alkoholių bei acetato atveju mišinys išsisluoksniuoja į dvi fazes: skaidrią

viršutinę bei drumstą apatinę (3.44 pav. 3 – 5, 7, 8 ir 10 mėginiai), o pamuilės su trumpos

grandinės (C1 - C3) alhoholiais bei acetatu sudaro drumstą mišinį (3.44 pav. 1, 2, 6 ir 9

mėginiai). Tai gali būti paaiškinta skirtingu mišinius sudarančių komponentų

hidrofiliškumu. Kaip žinoma, alkoholio molekulėje esanti polinė hidroksigrupė suteikia

junginiui hidrofiliškumo, o nepolinė anglies grandinė - hidrofobiškumo. Ilgėjant anglies

grandinei, molekulė tampa vis labiau hidrofobine, todėl tik tokie trumpagrandžiai

alkoholiai kaip metanolis, etanolis, 1-propanolis bei jo izomeras 2-propanolis

(izopropanolis) yra tirpūs vandenyje (taip pat tirpus ir tret-butanolis - vienintelis iš visų

keturis anglies atomus turinčių izomerų, tačiau jis kaip acilakceptorius nenaudotas, nes

tretiniai alkoholiai ir jų esteriai yra prasti lipazių substratai [180, 181]). Ilgesnės anglies

grandinės junginiai su vandeniu nesimaišo, todėl pastarųjų atveju ir susidaro dvi fazės:

vandeninė (gautos pamuilės buvo tiršta gelsvos spalvos vandeninga masė) ir hidrofobinė

- naudotas tirpiklis.

Taigi buvo tirta šių tirpiklių įtaka komercinių lipolizinių fermentų katalizuojamų

pamuilėse esančių riebalinių komponentų virsmų efektyvumui, kai reakcijos mišinyje jie

buvo naudoti kaip fermentų substratai (acilakceptoriai). Reakcijos mišinį sudarė pamuilių

mišinys, tirpiklis (vanduo, tret-butanolis ar n-heksanas) bei fermentas - imobilizuotas

128

Lipex 100T ir skystas Lipolase 100L preparatai. Reakcijos vykdytos, esant 30oC

temperatūrai. Tyrimų rezultatai pateikti 3.45 paveiksle.

A

010

2030

4050

6070

8090

Met

anolis

Eta

nolis

1-Buta

nolis

1-Pent

anolis

1-Hek

sanol

is

Izop

ropa

nolis

Izob

utan

olis

Izoa

milo

alkoh

olis

Met

ilace

tata

s

But

ilace

tata

s

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcij

os

miš

inyje

, %

Vanduo

tret-Butanolis

n-Heksanas

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Met

anolis

Eta

nolis

1-Buta

nolis

1-Pent

anolis

1-Hek

sanol

is

Izop

ropa

nolis

Izob

utan

olis

Izoa

milo

alkoh

olis

Met

ilace

tata

s

But

ilace

tata

s

San

tykin

is e

ste

rių

kie

kis

reakcij

os

miš

inyje

, %

Vanduo

tret-Butanolis

n-Heksanas

3.45 pav. Komercinių lipazių Lipex 100T (A) ir Lipolase 100L (B) katalizuojamų pamuilių esterinimo ir transesterinimo įvairiais acilakceptoriais skirtinguose tirpikliuose reakcijų metu po 5 val. susidariusių esterių santykinis kiekis reakcijos mišinyje.

Akivaizdu, kad abiejų tirtų fermentų atveju reakcija efektyviausiai vyksta n-

heksane, kai mišinys ekstrahuotas metanoliu, t.y., kai acilakceptorius yra metilo alkoholis

(Lipex 100T atveju esterių išeiga siekia 78 % (3.45 (A) pav.), o Lipolase 100L – 71 %

(3.45 (B) pav.)). Pamuilių transesterinimo/esterinimo visais alkoholiais, išskyrus

izopropanolį, reakcijos efektyvesnės n-heksane, o, kai kaip acilakceptoriai naudoti

acetatai, Lipex 100T katalizuojamos reakcijos visuose tirpikliuose vyksta vienodai

neefektyviai, tuo tarpu Lipolase 100L atveju reakcijos produktyvesnės tret-butanolyje bei

vandenyje. Iš visų tirtų alkoholių izopropanolis išsikyrė labiausiai: reakcija efektyviausiai

vyko vandenyje, o gauta esterių išeiga gerokai mažesnė, palyginus su kitais naudotais

alkoholiais. Prastas lipolizinių fermentų katalizinis aktyvumas izopropanolio atžvilgiu

galėtų būti susijęs su tuo, kad tai yra antrinis alkoholis (visi kiti naudoti alkoholiai –

129

pirminiai), o, kaip žinoma, lipazių aktyvumas skirtingų alkoholių klasių atžvilgiu yra

išsidėstęs tokia tvarka: pirminiai > antriniai > tretiniai alkoholiai [179].

Kadangi didžiausia esterių išeiga gauta pamuilių transesterinimo/esterinimo

metanoliu n-heksane metu, ištirta reakcijos trukmės įtaka jos eigai. Chromatografinės

analizės duomenys pateikti 3.46 paveiksle.

A B

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

3.46 pav. Komercinių lipazių Lipex 100T (A) ir Lipolase 100L (B) katalizuojamo pamuilių esterinimo bei transesterinimo metanoliu n-heksane eigos chromatografinis vaizdas. 3 – po 30 min.; 4 – po 1 val.; 5 – po 1,5 val.; 6 – po 2 val.; 7 – po 3 val. Kontrolės: 1 – MO; 2 – pradinis reakcijos mišinys.

Paaiškėjo, kad jau po 30 min. susidaręs metilo esterių kiekis, ilginant reakcijos

trukmę, nekinta - reakcijos mišinių sudėtis identiška visais tirtais laiko tarpais (3.46

pav.). Kadangi reakcija tokia greita net ir esant švelnioms sąlygoms (30oC temperatūra),

gauti rezultatai leidžia daryti išvadą, kad gali būti sukurtas ekonominiu atžvilgiu

patrauklus pamuilių panaudojimo RR esterių sintezei metodas.

Atsižvelgus į gautus rezultatus, pasirinkti trys alkoholiai, kuriuos naudojant

reakcijos vyko efektyviausiai (metanolis, etanolis bei 1-butanolis) ir tirtos analogiškos

reakcijos be tirpiklių. Pasirinkti penki komerciniai lipoliziniai fermentai (Lipex 100T,

Lipolase 100L, Resinase A2X, Lipozyme TL100L ir Lecitase Ultra) ir tyrimų metu

palygintas jų aktyvumas pamuilių transesterinimo/esterinimo atitinkamais alkoholiais

reakcijų metu (3.47 pav.).

A

0

20

40

60

80

100

120

Pra

dinis m

išinys

Lipe

x 10

0T

Lipo

lase

100L

Res

inase

A2X

Lipo

zym

e TL10

0L

Lecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Metilo esteriai

TAG

RR

DAG

MAG

130

B

0

20

40

60

80

100

120

Pra

dinis m

išinys

Lipe

x 10

0T

Lipo

lase

100L

Res

inase

A2X

Lipo

zym

e TL10

0L

Lecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Etilo esteriai

TAG

RR

DAG

MAG

C

0

20

40

60

80

100

120

Pra

dinis m

išinys

Lipe

x 10

0T

Lipo

lase

100L

Res

inase

A2X

Lipo

zym

e TL10

0L

Lecita

se U

ltra

San

tykin

is m

ed

žia

gų

kie

kis

reakcijo

s

miš

inyje

, %

Butilo esteriai

TAG

RR

DAG

MAG

3.47 pav. Skirtingų komercinių lipazių katalizuojamo pamuilių transesterinimo bei esterinimo metanoliu (A), etanoliu (B) bei 1-butanoliu (C) metu po 1 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Iš visų tirtų fermentų Lecitase Ultra pasižymėjo prasčiausiu aktyvumu, kai kaip

acilakceptoriai naudoti metanolis bei etanolis: reakcijų mišiniuose vis dar lieka

santykinai didelis TAG kiekis, o esterių išeigos bent 10 % mažesnės, palyginus su kitais

fermentais. Visų fermentų atveju reakcijos veiksmingiausios, kai acilakceptorius yra

metanolis (išlieka ta pati tendencija kaip ir anksčiau tirtų reakcijų metu). Visgi akivaizdu,

kad reakcijos be tirpiklio vyksta ne taip efektyviai kaip n-heksane, kuriame didžiausa

gauta esterių išeiga siekia 78 % (Lipex 100T), o sistemoje be tirpiklių – 61 % (Lipolase

100L).

Tyrimų metu pamuilės buvo ekstrahuotos ir kitais paprastai lipazių

katalizuojamoms reakcijoms naudojamais tirpikliais - vandeniu, tret-butanoliu, toluenu,

n-heksanu (šio mišinio chromatografinis vaizdas pateiktas 3.43 pav.) bei n-heptanu.

Buvo ištirtos bei palygintos Lipex 100T ir Lipolase 100L lipazių katalizuojamos pamuilių

esterinimo bei transesterinimo metanoliu šiuose tirpikliuose reakcijos (3.48 pav.).

131

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Vanduo tret-Butanolis Toluenas n-Heptanas n-Heksanas

San

tykin

is m

eti

lo e

ste

rių

kie

kis

reakcij

os

miš

inyje

, %

Lipex 100T

Lipolase 100L

3.48 pav. Lipex 100T ir Lipolase 100L lipazių katalizuojamo pamuilių esterinimo bei transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose metu po 3 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Paaiškėjo, kad reakcija vėlgi efektyviausiai vyksta n-heksane: Lipex 100T

katalizuojamos reakcijos metu po 3 val. susidariusių esterių išeiga siekia 81 % (3.48

pav.), o po 4 val. mišinį sudaro praktiškai vien produktas – metilo esteriai (3.49 pav.).

MO TO OR 1 2 3.49 pav. Lipex 100T katalizuojamo pamuilių esterinimo/transesterinimo metanoliu n-heksane metu susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. 1 - po 1 val.; 2 - po 4 val. Kontrolės: MO – metilo oleatas; TO – trioleinas; OR – oleino rūgštis.

Visuose tirtuose tirpikliuose abiejų fermentų aktyvumas buvo panašus, išskyrus

tolueną, kuriame Lipex 100T katalizuojamos reakcijos metu esterių išeiga siekia 73 %, o

Lipolase 100L – 50 %. Tai gali būti susiję su skirtingu fermentų stabilumu šiame

organiniame tirpiklyje. Reikėtų atsižvelgti į tai, kad Lipex 100T yra imobilizuotos, o

Lipolase 100L – skystos formos komerciniai preparatai, o, kaip žinoma, imobilizacija

neretai padidina fermentų atsparumą bei stabilumą įvairių organinių tirpiklių atžvilgiu.

Kadangi laboratorijoje vykdomi dumblių auginimo bei įvairių bioproduktų

išskyrimo iš jų biomasės tyrimai, ieškoma ne tik efektyvių medžiagų ekstrakcijos metodų

(tyrimų metu vienas metodas buvo patentuotas), bet ir alternatyvių dumblių auginimo

132

terpių. Todėl buvo atliktas pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės, panaudojimo

tyrimas. Dumblių pritaikymo utilizuoti susidariusias atliekas tyrimams buvo pasirinktos

dvi plačiai pasaulyje tiriamos jų rūšys – Chlorella vulgaris bei Scenedesmus dimorphus.

Buvo siekiama ištirti pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės komponentų, panaudojimo

galimybę, tačiau visomis tirtomis sąlygomis abi dumblių padermės visai neaugo net ir

įvairiai skiestose pamuilėse. Tai gali būti susiję su kai kurių pagrindines gyvybines

dumblių funkcijas užtikrinančių makrokomponentų - azoto, fosforo junginių bei kitų

mineralinių medžiagų - trūkumu.

Skyriaus apibendrinimas

Ištyrus pamuilių sudėtį, nustatyta, kad didžiąją šiose atliekose esančių riebalinių

komponentų dalį sudaro laisvos RR: dominuoja ilgos grandinės RR (C16 - C18), o

sočiosios sudaro 54 % viso pamuilėse esančių RR kiekio. Taip pat aptinkama ir TAG,

DAG bei MAG.

Fermentinis riebalinių atliekų esterinimas/transesterinimas, susidarant įvairiems

RR esteriams, yra efektyvus pamuilių utilizavimo būdas. Komercinio preparato Lipex

100T katalizuojamo n-heksanu ekstrahuotų pamuilių esterinimo/transesterinimo

metanoliu, esant 30oC temperatūrai, metu po 4 val. susidariusių esterių išeiga siekia

beveik 100 %.

Pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės, panaudojimas pasirodė esąs

neveiksmingas: visomis tirtomis sąlygomis abi tirtos dumblių padermės visai neaugo

kaip terpę naudojant įvairiai skiestas pamuiles. Tai gali būti susiję su kai kurių

pagrindines gyvybines dumblių funkcijas užtikrinančių makrokomponentų (azoto,

fosforo junginių bei kitų mineralinių medžiagų) trūkumu.

133

IŠVADOS

1. tret-Butanolis yra tinkamesnis organinis tirpiklis lipazių katalizuojamoms aliejų hidrolizės, o n-heksanas – transesterinimo reakcijoms vykdyti. Įvairių organinių tirpiklių, naujų priedų, džiovinimo agentų naudojimas bei alkoholio pakeitimas jo acto rūgšties esteriu rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu produktyvumui didinti gali pasižymėti ir neigiamu efektu, priklausomai nuo naudojamo fermento bei kitų reakcijos parametrų.

2. Oleino rūgšties esterinimas trimetilolpropanu yra efektyvesnis triesterių gavimo

būdas nei metiloleato transesterinimas, o palankiomis sąlygomis gautos produktų išeigos patvirtina šio proceso pritaikymo pramoninei biotepalų gamybai potencialą.

3. Lipolase 100L katalizuojamas kokosų aliejaus transesterinimas terpenoliu - β-

citroneloliu – yra efektyvus vertingomis savybėmis pasižyminčių esterių gavimo būdas, gaunant didžiausias produktų išeigas, kai reakcijos vykdomos hidrofobiniuose tirpikliuose, kurių logP vertė didesnė arba lygi 3,50.

4. Priklausomai nuo naudojamos organinės rūgšties struktūros, lipazės gali gana

efektyviai katalizuoti ne tik mono-, bet ir dikarboksirūgščių (glutaro bei oksalo) esterinimą alkoholiais, susidarant atitinkamiems diesteriams bei kitiems produktams, kurių skaičius kinta, naudojant skirtingus alkoholius bei komercinius lipazių preparatus.

5. Lipolase 100L bei Lipex 100L katalizuojamas muilo gamybos atliekų

esterinimas/transesterinimas, susidarant įvairiems riebalų rūgščių esteriams, gali būti efektyvus tokių atliekų utilizavimo būdas.

134

PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA

1. Kiriliauskaitė V, Bendikienė V, Juodka B. Environment-friendly biodiesel

production by transesterification of rapeseed oil: effect of reaction parameters.

Journal of Environmental Engineering and Landscape Management.

2013;21(1):42-51.

2. Kiriliauskaitė V, Bendikienė V, Juodka B. Synthesis of trimethylolpropane

esters of oleic acid by Lipoprime 50T. Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology. 2011;38(9):1561-6.

3. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V, Juodka B. Production of environmentally

friendly biodiesel by enzymatic oil transesterification. Journal of Environmental

Engineering and Landscape Management. 2011;19(2):123-9.

Publikacijos nerecenzuojamuose leidiniuose:

1. Kiriliauskaitė V, Šinkūnienė D, Bendikienė V. Lipazių katalizuojamų

biotechnologijai svarbių procesų tyrimas. Konferencijos “Mokslas Gamtos

mokslų fakultete” pranešimai. ISBN: 978-9955-33-602-0.Vilniaus universiteto

leidykla, Vilnius. 2010;74-84.

PATENTAS

Bendikienė V, Romaškevičius O, Kiriliauskaitė V. Method and system of algal cells

disruption and isolation of bioproducts therefrom. International Application No.

PCT/2013LT/000005. Lietuvos Respublikos Valstybinis Patentų Biuras: „Dumblių

ląstelių ardymo ir bioproduktų išskyrimo būdas ir sistema“, Nr. 6018; 2014-04-25.

KONFERENCIJOS

1. Bendikienė V, Arelis A, Kiriliauskaitė V. Study of green algae Chlorella

vulgaris cultivation in piggery wastewater. The International Conference

“Biotechnology and quality of life” and XII International Specialized Exhibition

“BIOTECH WORLD’ 2014” March 18-20, 2014, Moscow.

2. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V. Lipid analysis by thin-layer chromatography.

Proceedings of IV International Conference on Science and Education. Goa,

India. February 23-March 2, 2013. P. 59-63.

135

3. Kiriliauskaitė V, Budrienė S, Juodka B, Bendikienė V. The investigation of

substrate specificity of some lipase-catalyzed esterification reactions. Stendinis

pranešimas Vilniaus universiteto konferencijai, skirtai Vilniaus universiteto

Biochemijos ir biofizikos katedros 50 metų jubiliejui „Biochemija ir biofizika

Vilniaus universitete“, vykusiai 2012-09-29:

4. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V, Juodka B, Kostkevičienė J, Leigaitė K,

Vaičiulytė S. The investigation of algal-based biofuel and biomaterials.

Proceedings of 5th International Conference “Modern Achievements of Science

and Education”. Netanya, Israel. 27 September – 4 October, 2011. P. 34-36.

5. Bendikienė V, Juodka B, Kiriliauskaitė V, Šinkūnienė D. The study of

biotechnologically important processes catalyzed by lipopytic enzymes. Modern

Achievements of Science and Education. IV International Conference, September

11-18, 2010, Budva, Montenegro. p. 198-200.

6. Bendikienė V, Budrienė S, Juodka B, Kiriliauskaitė V. The investigation of

substrate specificity of some lipase-catalyzed esterification reactions. XI-toji

tarptautinė Lietuvos biochemikų draugijos konferencija "LBD 50". 2010 m.

birželio 15-17 d. d., Tolieja (Molėtų raj.). P. 22.

PROJEKTAI

1. 2011 m. atlikti tyrimai „Lipolizinių fermentų skatinamų riebalinių atliekų virsmų

produktų susidarymo iš pamuilių biotechnologinio panaudojimo perspektyvos“.

De minimis pagalbos (inovacinio čekio) gavėjas - AB „NAUJOJI RINGUVA“,

generalinė direktorė J. Žilninskaitė. Inovacinio čekio paslaugos teikėjas - Vilniaus

universiteto Gamtos mokslų fakultetas, dr. Vida Bendikienė.

2. 2008-2009 metais Lietuvos VMSF (N-16), o 2010 m. – Lietuvos Mokslo Tarybos

projektas (PBT-07/2010-2) „Kontroliuojamo degumo ir atsparių senėjimui

bioskalių esterių kūrimas ir įvertinimas“.

MOKSLO POPULIARINIMAS: parengta paskaita Nacionaliniam Mokslo festivaliui

“Erdvėlaivis Žemė” 2011: “Žaliadumblių biotechnologinio pritaikymo tyrimas”. 2011-

09-15, Vilniaus universitetas, Gamtos mokslų fakultetas.

136

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei dr. Vidai Bendikienei už suteiktą galimybę būti

nuostabaus kolektyvo dalimi, visapusišką patirties ir įgūdžių perdavimą, įdomių ir

aktualių tyrimų organizavimą, puikias eksperimentinio darbo sąlygas, nesuskaičiuojamas

diskusijų, patarimų bei konsultacijų valandas, palaikymą, kantrybę ir supratingumą.

Pirmaisiais studijų metais mano darbui vadovavusiam prof. habil. dr. Benediktui Juodkai

dėkoju už patarimus metodiniais klausimais, padrąsinimą bei įkvėpimą.

Esu labai dėkinga visiems VU GMF BMBK katedros darbuotojams, ypač abiems

katedros vedėjoms, prof. Vidai Kirvelienei ir prof. Editai Sužiedelienei, už visokeriopą

pagalbą, patarimus bei konsultacijas organizaciniais studijų bei šio darbo rengimo

klausimais. Ypatingai dėkoju dr. Sauliui Servai už itin atidų disertacijos juodraščio

perskaitymą, vertingus komentarus bei patarimus. Taip pat esu dėkinga visiems

studentams ir darbuotojams, su kuriais turėjau galimybę dirbti, diskutuoti bei kurti puikią

bendrą darbinę atmosferą.

Labai dėkoju UAB „Biopolis“ už galimybę savo tyrimams naudoti tiek daug

komercinių lipolizinių preparatų.

Esu itin dėkinga savo tėvams už meilę, tikėjimą manimi ir palaikymą visais

gyvenimo atvejais.

137

LITERATŪRA

1. Bansal P, Roth K. Why companies go green: a model of ecological responsiveness. Acad Manage J. 2000;43:717-36.

2. Wohlgemuth R. Biocatalysis — key to sustainable industrial chemistry. Curr Opin Biotech. 2010;21:713-24.

3. Robles-Medina A, Gonzalez-Moreno PA, Esteban-Cerdán L, Molina-Grima E. Biocatalysis: Towards ever greener biodiesel production. Biotechnol Adv. 2009;27:398-408.

4. Hartmeier W. Immobilized Biocatalysts. 1986. Springer, Verlag, Berlin. 5. Gupta S, Bhattacharya A, Murthy CN. Tune to immobilize lipases on polymer membranes:

Techniques, factors and prospects. Biocatal Agr Biotechnol. 2013;2:171-90. 6. Hwang HT, Qi F, Yuan C, Zhao X, Ramkrishna D, Liu D, Varma A. Lipase-catalyzed

process for biodiesel production: Protein engineering and lipase production. Biotechnol Bioeng. 2014;111:639-53.

7. Jaeger K–E, Eggert T. Lipases for biotechnology. Curr Opin Biotech. 2002;13:390-7. 8. Lozano P. Enzymes in neoteric solvents: From one-phase to multiphase systems. Green

Chem. 2010;12:555-69. 9. Balcão VM, Pavia AL, Malcata FX. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art.

Enzyme Microb Tech. 1996;18:392-416. 10. Hasan F, Shah A, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: A

comprehensive review. Biotechnol Adv. 2009;27:782-98. 11. Reis P, Holmberg K, Watzke H, Leser ME, Miller R. Lipases at interfaces: A review. Adv

Colloid Interfac. 2009;147-148:237-50. 12. Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in

fats and oils modification. J Mol Catal B-Enzym. 2010;66:15-32. 13. Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial

biocatalyst in chemical process. J Mol Catal B-Enzym. 2010;64:1-22. 14. Chandrasekeran SM, Bhartiya S. Substrate specificity of lipase in alkoxycarbonylation

reaction: QSAR model development and experimental validation. Biotechnol Bioeng. 2009;30:527-34.

15. Holt J, Hanefeld U. Enantioselective enzyme-catalyzed synthesis of cyanohydrins. Curr Org Synth. 2009;6:1005-18.

16. Fernandez-Lafuente R. Lipase from Thermomyces lanuginosus: Uses and prospects as an industrial biocatalyst. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:197-212.

17. Hasan F, Shah A, Hameed A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme Microb Tech. 2006;39:235-51.

18. Houde A, Kademi A, Leblanc Danielle. Lipases and their industrial applications. Appl Biochem Biotech. 2004;118:155-70.

19. Uosukainen E, Linko Y-Y, Lämsä M, Tervakangas T, Linko P. Transesterification of trimethylolpropane and rapeseed oil methyl ester to environmentally acceptable lubricants. J Am Oil Chem Soc. 1998;11:1557-63.

20. Du W, Li W, Sun T, Chen X, Liu D. Perspectives for biotechnological production of biodiesel and impacts. Appl Microbiol Biot. 2008;79:331-7.

21. Fjerbaek L, Christensen KV, Norddahl B. A review of the current state of biodiesel production using enzymatic transesterification. Biotechnol Bioeng. 2009;102(5):1298-315.

22. Jegannathan KR, Abang S, Poncelet D, Chan ES, Ravindra P. Production of biodiesel using immobilized lipase – A critical review. Crit Rev Biotechnol. 2008;28:253-64.

23. Nielsen PM, Brask J, Fjerbaek L. Enzymatic biodiesel production: Technical and economical considerations. Eur J Lipid Sci Tech. 2008;110:692-700.

138

24. Ranganathan SV, Narasimhan SL, Muthukumar K. An overview of enzymatic production of biodiesel. Bioresource Technol. 2008;99:3975-81.

25. Jaeger K-E, Ransac S, Dijkstra BW, Colson C, van Heuvel M, Misset O. Bacterial lipases. FEMS Microbiol Rev. 1994;15:29-63.

26. Rahman RNZRA, Leow TC, Salleh AB, Basri M. Geobacillus zalihae sp. nov., a thermophilic lipolytic bacterium isolated from palm mill effluent in Malaysia. Microbiology. 2007;7:77.

27. Sztajer H, Maliszewska I, Wieczorek J. Production of exogenous lipase by bacteria, fungi and actinomycetes. Enzyme Microb Tech. 1988;10:492-7.

28. Wang Y, Srivastava KC, Shen GJ, Wang HY. Thermostable alkaline lipase from newly isolated thermophilic Bacillus strain, A30-1 (ATCC 53841). J Ferment Bioeng. 1995;79:433-8.

29. Arpigny L J, Jaeger K-E. Bacterial lipolytic enzymes: Classification and properties. Biochem J. 1999;343:177 – 83.

30. Vakhlu J, Kour A. Yeast lipases: Enzyme purification, biochemical properties and gene cloning. Electron J Biotechnol. 2006;9(1):69-85.

31. Elibol M, Ozer D. Influence of oxygen transfer on lipase production by Rhizopus arrhizus. Process Biochem. 2001;36:325-9.

32. Gupta R, Gupta N, Rathi P. Bacterial lipases: An overview of production, purification and biochemical properties. Appl Microbiol Biot. 2004;64:763-81.

33. Hasan F, Hamed A. Optimization of lipase production from Bacillus sp. Pakistan J Bot. 2001;33:789-96.

34. Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria: The luxR-luxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol. 1994;176:269-75.

35. Kameshwar Sharma YVR, Neelima B, Prasidhi T. Isolation, purification and characterization of secondary structure and kinetic study of lipase from Indian major carp, Catla catla (Catla). Enzyme Eng. 2014;3(1):1-8.

36. Brady L, Brzozowski AM, Derewenda ZS, Dodson E, Dodson G, Tolley S, Turkenburg JP, Christiansen L, Huge-Jensen B, Norskov L, Thim L, Menge U. A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase. Nature. 1990;343:767-70.

37. Carrasco-Lopez C, Godoy C, de las Rivas B, Fernandez-Lorente G, Palomo JM, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R, Martinez-Ripoll M, Hermoso JA. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of the BTL2 lipase from the extremophilic microorganism Bacillus thermocatenulatus. Acta Crystallogr F. 2008;64:1043-5.

38. Ericsson DJ, Kasrayan A, Johansson P, Bergfors T, Sandstrom AG, Backval JE, Mowbray SL. X-ray structure of Candida antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely mode of interfacial activation. J Mol Biol. 2008;376(1):109-19.

39. Kim KK, Hwang KY, Jeon HS, Kim S, Sweet RM, Yang CH, Suh SW. Crystallization and preliminary-X-ray crystallographic analysis of lipase from Pseudomonas cepacia. J Mol Biol. 1992;227(4):1258-62.

40. Ransac S, Blaauw M, Lesuisse E, Schanck K, Colson C, Dijkstra BW. Crystallization and preliminary-X-ray analysis of a lipase from Bacillus subtilis. J Mol Biol. 1994;238(5):857-9.

41. Schrag JD, Li Y, Cygler M, Lang D, Burgdorf T, Hecht HJ, Schmid R, Schomburg D, Rydel TJ, Oliver JD, Strickland LC, Dunaway CM, Larson SB, Day J, McPherson A. The open conformation of a Pseudomonas lipase. Structure. 1997;5:187-202.

42. Guncheva M, Zhiryakova D. Catalytic properties and potential applications of Bacillus

lipases. J Mol Catal B-Enzym. 2011;68:1-21. 43. Nardini M, Dijkstra BW. α/β Hydrolase fold enzymes: The family keeps growing. Curr

Opin Struc Biol. 1999;9:732-7.

139

44. Ollis DL, Cheah E, Cygler M, Dijkstra B, Frolow F, Franken SM et al. The α/β hydrolase fold. Protein Eng. 1992;5:197-211.

45. Schrag JD, Cygler M. Lipases and α/β hydrolase fold. Methods Enzym (Rubin B., Dennis E. eds.). Acad Press. 1997;284:85–107.

46. Winkler FK, d'Arcy A, Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase. Nature. 1990;343:771-4.

47. Dodson GG, Lawson DM, Winkler FK. Structural and evolutionary relationships in lipase mechanism and activation. Faraday Discuss. 1996;93:95-105.

48. Uppenberg J, Hansen MT, Patkar S, Jones TA. The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica. Structure. 1994;2:293-308.

49. Pleiss J, Fischer M, Schmid RD. Anatomy of lipase binding sites: The scissile fatty acid binding site. Chem Phys Lipids. 1998;93:67-80.

50. Schmid RD, Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications. Angew Chem Int Edit. 1998;37:1608-33.

51. Carrasco-Lopez C, Godoy C, de las Rivas B, Fernandez-Lorente G, Palomo JM, Guisan JM, Fernández-Lafuente R, Martínez-Ripoll M, Hermoso JA. Activation of bacterial thermoalkalophilic lipases is spurred by dramatic structural rearrangements. J Biol Chem. 2009;284:4365-72.

52. Hjorth A, Carriere F, Cudrey C, Woldike H, Boel E, Lawson DM, Ferrato F, Cambillau C, Dodson GG, Thim L, Verger R. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospho)lipase. Biochemistry. 1993;32:4702-7.

53. Martinelle M, Hult K. Kinetics of acyl transfer reactions in organic media catalysed by Candida antarctica lipase B. Biochim Biophys Acta. 1995;1251:191-7.

54. Noble MEM, Cleasby A, Johnson LN, Frenken LGJ, Egmond MR. The crystal structure of triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate. FEBS Lett. 1993;331:123-8.

55. Jaeger K-E, Ransac S, Koch HB, Ferrato F, Dijkstra BW. Topological characterization and modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 1993;332:143-9.

56. Thirstrup K, Verger R, Carriere F. Evidence for a pancreatic lipase subfamily with new kinetic properties. Biochemistry. 1994;33:2748-56.

57. Van Oort MG, Deveer AMTJ, Dijkman R, Tjeenk ML, Verheij HM, De Haas GH, Wenzig E, Götz F. Purification and substrate specificity of Staphylococcus hyicus lipase. Biochemistry. 1989;28:9278-85.

58. Brzozowski AM, Derewenda U, Derewenda ZS, Dodson GG, Lawson DM, Turkenburg JP, Bjorkling F, Huge-Jensen B, Patkar SA, Thim L. A model for interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase-inhibitor complex. Nature. 1991;351:491-4.

59. Derewenda ZS, Sharp AM. News from the interface: The molecular structures of triacylglyceride lipases. Trends Biochem Sci. 1993;18:20-5.

60. Groshulski P, Li Y, Schrag JD, Bouthillier F, Smith P, Harrison D, Rubin B, Cygler M. Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase. J Biol Chem. 1993;268:12843-7.

61. Brzozowski AM, Savage H, Verma CS, Turkenburg JP, Lawson DM, Svendsen A, Patkar S. Structural origins of the interfacial activation in Thermomyces (Humicola) lanuginosa lipase. Biochemistry. 2000;39:15071-82.

62. Egloff MP, Marguet F, Buono G, Verger R, Cambillau C, van Tilbeurgh H. The 2.45 Å resolution structure of the pancreatic lipase-colipase complex inhibited by a C11 alkyl phosphonate. Biochemistry. 1995;34:2751-62.

140

63. Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, Serreqi AN, Schrag JD, Ziomek E, Cygler M. Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate binding site in Candida

rugosa lipase. Biochemistry. 1994;33:3494-500. 64. Roussel A, Miled N, Berti-Dupuis L, Riviere M, Spinelli S, Berna P, Gruber V, Verger R,

Cambillau C. Crystal structure of the open form of dog gastric lipase in complex with a phosphonate inhibitor. J Biol Chem. 2002;277:2266-74.

65. Aloulou A, Rodriguez JA, Fernandez S, van Oosterhout D, Puccinelli D, Carrière F. Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies. Biochim Biophys Acta. 2006;1761:995-1013.

66. Klibanov AM. Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature. 2001;409:241-6.

67. Persson M, Mladenoska I, Wehtje E, Adlercreutz P. Preparation of lipases for use in organic solvents. Enzyme Microb Tech. 2002;31:833–41.

68. Idris A, Bukhari A. Immobilized Candida antarctica lipase B: Hydration, stripping off and application in ring opening polyester synthesis. Biotechnol Adv. 2012;30:550-63.

69. Dhake KP, Thakare DD, Bhanage BM. Lipase: A potential biocatalyst for the synthesis of valuable flavour and fragarance ester compounds. Flavour Frag J. 2013;28:71-83.

70. Brocca S, Secundo F, Ossola M, Alberghina L, Carrea G, Lotti M. Sequence of the lid affects activity and specificity of Candida rugosa lipase isoenzymes. Protein Sci. 2003;12(10):2312-9.

71. Chakravorty D, Parameswaran S, Dubey VK, Patra S. Unraveling the rationale behind organic solvent stability of lipases. Appl Biochem Biotech. 2012;167(3):439-61.

72. Yedavalli P, Rao NM. Engineering the loops in a lipase for stability in DMSO. Protein Eng Des Sel. 2013;26(4):317-24.

73. Bezbradica D, Karalazić I, Ognjanović N, Mijin D, Šiler-Marinković S, Knežević Z. Studies on the specificity of Candida rugosa lipase catalyzed esterification reactions in organic media. J Serb Chem Soc. 2006;71(1):31-41.

74. Bezbradica D, Mijin D, Marinkovic SS, Knezevic Z. The Candida rugosa lipase catalyzed synthesis of amyl isobutyrate in organic solvent and solvent-free system: A kinetic study. J Mol Catal B-Enzym. 2006;38:11-6.

75. Janssen PH, Monk CR, Morgan HW. A thermophilic, lipolytic Bacillus sp., and continuous assay of its p-nitrophenyl-palmitate esterase activity. FEMS Microbiol Lett. 1994;120:195-200.

76. Levisson M, Van der Oost J, Kengen S. Carboxylic ester hydrolases from hyperthermophiles. Extremophiles. 2009;13:567-81.

77. Kojima Y, Yokoe M, Mase T. Purification and characterization of alkaline lipase from Pseudomonas fluorescens AK102. Biosci Biotech Bioch. 1994;58:1564-8.

78. Sidhu P, Sharma R, Soni SK, Gupta JK. Effect of cultural conditions on extracellular lipase production by Bacillus sp. RS-12 and its characterization. Indian J Microbiol. 1998;38:9-12.

79. El-Shafei HA, Rezkallah LA. Production, purification and characterization of Bacillus lipase. Microbiol Res. 1997;52:199-208.

80. Salameh M, Wiegel J. Lipases from extremophiles and potential for industrial applications. Adv Appl Microbiol. 2007;61:253-83.

81. Yu XW, Tan NJ, Xiao R, Xu Y. Engineering a disulfide bond in the lid hinge region of Rhizopus chinensis lipase: Increased thermostability and altered acyl chain length specificity. PloS ONE. 2012;7(10):e46388.0

82. Zhu K, Jutila A, Tuominen EKJ, Patkar SA, Svendsen A, Kinnunen PK. Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability. Biochim Biophys Acta. 2001;1547:329-38.

141

83. Arroyo M, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV. Thermal stabilization of immobilized lipase B from Candida antarctica on different supports: Effect of water activity on enzymatic activity in organic media. Enzyme Microb Tech. 1999;24:3-12.

84. Yucel Y. Optimization of immobilization conditions of the Thermomyces lanuginosus lipase on olive pomace powder using response surface methodology. Biocatal Agr Biotechnol. 2012;1:39-44.

85. Natarajan E, Venkatesh KP. Production and characterization of biodiesel using Pongamia oil by immobilized Rhizopus oryzae. Adv Biotech. 2012;11:32-4.

86. Tan TW, Lu JK, Nie KL, Deng L, Wang F. Biodiesel production with immobilized lipase: A review. Biotechnol Adv. 2010;28:628-34.

87. Cao L. Immobilized enzymes: Science or art? Curr Opin Chem Biol. 2005;9:217-26. 88. Padmini P, Raskhit SK, Baradarajan A. Studies on immobilization of lipase on alumina for

hydrolysis of rice bran oil. Bioprocess Eng. 1993;9:43-6. 89. Wisdom RA, Dunnill P, Lilly MD, Macrae RA. Enzyme esterification of fats: Factors

influencing the choice of support for immobilized lipase. Enzyme Microb Tech. 1984;6:443-6.

90. Shaw JF, Chang RC, Wang HJ. Lipolytic activities of a lipase immobilized on six selected supporting materials. Biotechnol Bioeng. 1990;35:132-7.

91. Zaidi A, Gainer JL, Carta G. Fatty acids esterification using nylon-immobilized lipase. Biotechnol Bioeng. 1995;48:601-5.

92. Telefoncu A, Dinekaya E, Vorlop KD. Preparation and characterization of pancreatic lipase immobilized on Eudragit matrix. Appl Biochem Biotech. 1990;26:311-7.

93. Winayanuwattikun P, Kaewpiboon C, Piriyakananon K, Chulalaksananukul W, Yongvanich T, Svasti T. Immobilized lipase from potential lipolytic microbes for catalyzing biodiesel production using palm oil as feedstock. Afr J Biotechnol. 2011;10:1666-73.

94. Yagiz F, Kazan D, Akin AN. Biodiesel production from waste oils by using lipase immobilized on hydrotalcite and zeolites. Chem Eng J. 2007;134:262-7.

95. Nie K, Xie F, Wong F, Tan T. Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel: Optimization of the biodiesel production. J Mol Catal B-Enzym. 2006;43:142-7.

96. Zaidi A, Gainer JL, Carta G, Mrani A, Kadri T, Belarbi Y, Mir A. Esterification of fatty acids using nylon-immobilized lipase in n-hexane: Kinetic parameters and chain-length effects. J Biotechnol. 2002;93(3):209-16.

97. Serri NA, Kamaruddin AH, Long WS. Studies of reaction parameters on synthesis of citronellyl laurate ester via immobilized Candida rugosa lipase in organic media. Bioprocess Biosyst Eng. 2006;29(4):253-60.

98. Silva JE, Jesus PC. Evaluation of the catalytic activity of lipases immobilized on chrysotile for esterification. An Acad Bras Cienc. 2003;75(2):157-62.

99. Aucoin MG, Erhardt FA, Legge RL. Hyperactivation of Rhizomucor miehei lipase by hydrophobic xerogels. Biotechnol Bioeng. 2004;85:647-55.

100. Fernandez-Lafuente R, Armisen P, Sabuquillo P, Fernandez-Lorente G, Guisan JM. Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports. Chem Phys Lipids. 1998;93:185-97.

101. Palomo JM, Munoz G, fernandez-Lorente G, mateo C, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM. Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-sephabeads): Immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases. J Mol Catal B-Enzym. 2002;19-20:279-86.

102. Shah S, Solanki K, Gupta MN. Enhancement of lipase activity in non-aqueous media upon immobilization on multi-walled carbon nanotubes. Chem Central J. 2007;1:30.

142

103. Sorensen MH, Nq JB, Bergstrom L, Alberius PC. Improved enzymatic activity of Thermomyces lanuginosus lipase immobilized in a hydrophobic particulate mesoporous carrier. J Colloid Interf Sci. 2010;343:359-65.

104. Wilson L, Palomo JM, Fernandez-Lorente G, Illanes A, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R. Improvement of the functional properties of a thermostable lipase from alcaligenes sp. via strong adsorption on hydrophobic supports. Enzyme Microb Tech. 2006;38:975-80.

105. Al-Duri B, Yong YP. Lipase immobilization: An equilibrium study of lipases immobilized on hydrophobic and hydrophilic/hydrophobic supports. Biochem Eng J. 2000;4:207-15.

106. Palomo JM, Penas MM, Fernandez-Lorente G, Mateo C, Pisabarro AG, Fernandez-Lafuente R, Ramírez L, Guisán JM. Solid-phase handling of hydrophobins: Immobilized hydrophobins as a new tool to study lipases. Biomacromolecules. 2003;4:204-10.

107. Palomo JM, Ortiz C, Fernandez-Lorente G, Fuentes M, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R. Lipase-lipase interactions as a new tool to immobilize and modulate the lipase properties. Enzyme Microb Tech. 2005;36:447-54.

108. Palomo JM, Ortiz C, Fuentes M, Fernandez-Lorente G, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R. Use of immobilized lipases for lipase purification via specific lipase-lipase interactions. J Chromatogr A. 2004;1038:267-73.

109. Wang TH, Lee WC. Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles. Biotechnol Bioproc Eng. 2003;8:263-7.

110. Tiwari A, Dhakate SR. Chitosan-SiO2-multiwall carbon nanotubes nanocomposite: A novel matrix for the immobilization of creatine amidinohydrolase. Int J Biol Macromol. 2009;44:408-12.

111. Fang H, Niu HT, Tong L, Wang XG. Applications of electrospun nanofibers. Chin Sci Bull. 2008;53:2265-86.

112. Tiwari A, Terada D, Yoshikawa C, Kobayashi H. An enzyme-free highly glucose-specific assay using self-assembled aminobenzene boronic acid upon polyelectrolytes electrospun nanofibers-mat. Talanta. 2010;82:1725-32.

113. Jha BK, Svensson M, Kronberg B, Holmberg K. Titration microcalorimetry studies of the interaction between Humicola lanuginosa lipase and ionic surfactants. J Colloid Interf Sci. 1999;213:262-4.

114. Derewenda U, Swenson L, Green R, Wei Y, Yamaguchi S, Joerger R, Haas MJ, Derewenda ZS. Current progress in crystallographic studies of new lipases from filamentous fungi. Protein Eng. 1994;7(4):551–7.

115. Berg OG, Cajal Y, Butterfoss GL, Grey RL, Alsina MA, Yu BZ, Jain MK. Interfacial activation of triglyceride lipase from Thermomyces (Humicola) lanuginosa: Kinetic parameters and a basis for control of the lid. Biochemistry. 1998;37(19):6615–27.

116. Palomo JM, Fuentes M, Fernández-Lorente G, Mateo C, Guisan JM, Fernández-Lafuente R. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality. Biomacromolecules. 2003;4(1):1-6.

117. Krishna SH, Karanth NG. Lipases and lipase-catalyzed esterification reactions in nonaqueous media. Catal Rev. 2002;44:499-591.

118. Miller C, Austin H, Posorske L, Gonzlez J. Characteristics of an immobilized lipase for the commercial synthesis of esters. J Am Oil Chem Soc. 1988;65:927-31.

119. Dominguez de Maria P, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV, Alcántara AR. Understanding Candida rugosa lipases: An overview. Biotechnol Adv. 2006;24:180-96.

120. Berger M, Schneider MP. Lipases in organic solvents: The fatty acid chain length profile. Biotechnol Lett. 1991;13:641-5.

121. Rangheard M-S, Langrand G, Triantaphylides C, Baratii J. Multi-competitive enzymatic reactions in organic media: A simple test for the determination of lipase fatty acid specificity. Biochim Biophys Acta. 1993;1004:20-8.

143

122. Böttcher D, Bornscheuer UT. Protein engineering of microbial enzymes. Curr Opin Microbiol. 2010;13:274-82.

123. Lai J-Q, Hu Z-L, Wang P-W, Yang Z. Enzymatic production of microalgal biodiesel in ionic liquid [BMIm][PF6]. Fuel. 2012;95:329-33.

124. Watanabe Y, Pinsirodom P, Nagao T, Kobayashi T, Nishida Y, Takagi Y, Shimada Y. Production of FAME from acid oil model using immobilized Candida antarctica lipase. J Am Oil Chem Soc. 2005;82(11):825-31.

125. Domínguez de María P, Carboni-Oerlemans C, Tuin B, Bargeman G, van der Meer A, van Gemert R. Biotechnological applications of Candida antarctica lipase A: State-of-the-art. J Mol Catal B-Enzym. 2005;37:36-46.

126. Haraldsson GG, Gudmundsson BÖ, Almarsson Ö. The synthesis of homogeneous triglycerides of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid by lipase. Tetrahedron. 1995;51:941-52.

127. Irimescu R, Furihata K, Hata K, Iwasaki Y, Yamane T. Utilization of reaction medium-dependent regiospecificity of Candida antarctica lipase (Novozym 435) for the synthesis of 1,3-dicapryloyl-2-docosahexaenoyl (or eicosapentaenoyl) glycerol. J Am Oil Chem Soc. 2001;78:285-90.

128. Bartling K, Thompson JUS, Pfromm PH, Czermak P, Rezac ME. Lipase-catalyzed synthesis of geranyl acetate in n-hexane with membrane-mediated water removal. Biotechnol Bioeng. 2001;75(6):676-81.

129. Jeong G-T, Park D-H. Lipase-catalyzed transesterification of rapeseed oil for biodiesel production with tert-butanol. Appl Biochem Biotech. 2008;148:131-9.

130. Larios A, García HS, Oliart RM, Valerio-Alfaro G. Synthesis of flavor and fragarance esters using Candida antarctica lipase. Appl Microbiol Biot. 2004;65:373-6.

131. Zhao H, Song Z. Migration of reactive trace compounds from Novozym 435 into organic solvents and ionic liquids. Biochem Eng J. 2010;49:113-8.

132. Adlercreutz P. Immobilisation and application of lipases in organic media. Chem Soc Rev. 2013;42:6406-36.

133. Adamczak M, Krishna SH. Enzyme for efficient biocatalysis. Food Technol Biotech. 2004;42(4):251–64.

134. Kapoor M, Gupta MN. Lipase promiscuity and its biochemical applications. Process Biochem. 2012;47:555-69.

135. Al-Zuhair S. Production of biodiesel: Possibilities and challenges. Biofuel Bioprod Bior. 2007;1:57-66.

136. Miller DA, Prausnitz JM., Blanch W. Kinetics of lipase-catalyzed interesterification of triglycerides in cyclohexane. Enzyme Microb Tech. 1991;13:98–103.

137. Verger R. Interfacial activation of lipases: Facts and artifacts. Trends Biotechnol. 1997;15:32-8.

138. Benzonana G, Desnuelle P. Kinetic study of the action of pancreatic lipase on emulsified triglycerides. Enzymology assay in heterogeneous medium. Biochim Biophys Acta. 1965;105:121-36.

139. Schonheyder F, Volqvartz K. On the affinity of pig pancreas lipase for tricaproin in heterogeneous solution. Acta Physiol Scand. 1945;9: 57–67.

140. Svendsen A. Lipase protein engineering. Biochim Biophys Acta. 2000;1543:223-38. 141. Sarda L, Desnuelle P. Actions of pancreatic lipase on esters in emulsions. Biochim

Biophys Acta. 1958;30(3):513–21. 142. Wong D. Food enzymes: Structure and mechanisms. Chapman & Hall. 1995. 143. Al-Zuhair S. Production of biodiesel by lipase-catalyzed transesterification of vegetable

oils: A kinetics study. Biotechnol Progr. 2005;21:1442-8. 144. Desnuelle P. Pancreatic lipase. Adv Enzymol RAMBL. 1961;23:129-61.

144

145. Patton JS, Carey MC. Watching fat digestion. Science. 1979;204:145–8 146. Verger R, de Haas GH. Enzyme reactions in membrane model. 1. A new technique to study

enzyme reactions in monolayers. Chem Phys Lipids. 1973;10:127–36. 147. Verger R, de Haas GH. Interfacial enzyme kinetics of lipolysis. Annu Rev Biophys Bioeng.

1976;5:77-117. 148. Van Tilbeurgh H, Egloff MP, Martinez C, Rugani N, Verger R, Cambillau C. Interfacial

activation of the lipase-procolipase complex by mixed micelles revealed by X-ray crystallography. Nature. 1993;362:814-20.

149. Chapus C, Sémériva M. Mechanism of pancreatic lipase action. 2. Catalytic properties of modified lipases. Biochemistry. 1976;15(23):4988–91.

150. Panaitov I, Verger R. Physical chemistry of biological interfaces. Editors: Baszkin A, Norde W, Dekker M. New York, Basel, 2000.

151. Reis P, Watzke H, Leser M, Holmberg K, Miller R. Interfacial mechanism of lipolysis as self-regulated process. Biophys Chem. 2010;147:93-103.

152. Ribeiro BD, de Castro AM, Coelho MAZ, Freire DMG. Production and use of lipases in bioenergy: A review from the feedstocks to biodiesel production. Emzyme Res. 2011; doi:10.4061/2011/615803.

153. Macrae AR, Hammond RC. Present and future applications of lipases. Biotechnol Genet Eng. 1985;3:193-217.

154. Saxena RK, Ghosh PK, Gupta R, Davidson WS, Bradoo S, Gulati R. Microbial lipases: Potential biocatalysts for the future. Curr Sci. 1999;77:101-15.

155. Jensen RG. Characteristics of the lipase from the mold, Geotrichum candidum: A review. Lipids. 1974;9:149-57.

156. Charton E, Macrae AR. Substrate specificities for lipases A and B from Geotrichum

candidum CMICC 33546. Biochim Biophys Acta. 1992;1123:59-64. 157. Jensen RG, Dejong FA, Clark RM. Determination of lipase specificity. Lipids.

1983;18:239-52. 158. Jensen RG, Galluzzo DR, Bush VJ. Selectivity is an important characteristic of lipases

(acylglycerol hydrolases). Biocatal Biotransfor. 1990;3:307–16. 159. Fureby AM, Tian L, Adlercreutz P, Mattiasson B. Preparation of diglycerides by lipase-

catalyzed alcoholysis of triglycerides. Enzyme Microb Tech. 1997;20:198-206. 160. Fureby AM, Virto C, Adlercreutz P, Mattiasson B. Acyl migration in 2-monoolein.

Biocatal Biotransfor. 1996;14:89-111. 161. Yang T, Fruekilde M-B, Xu X. Suppression of acyl migration in enzymatic production of

structured lipids through temperature programming. Food Chem. 2005;92:101-7. 162. Holmberg K, Osterberg E. Enzymatic preparation of monoglycerides in microemulsion. J

Am Oil Chem Soc. 1988;65:1544-8. 163. Antczak MS, Kubiak A, Antczak T, Bielecki S. Enzymatic biodiesel synthesis – Key

factors affecting efficiency of the process. Renew Energ. 2009;34:1185-94. 164. Li W, Du W, Li Q, Li R-W, Liu D. Dependence on the properties of organic solvent: Study

on acyl migration kinetics of partial glycerides. Bioresource Technol. 2010;101:5737-42. 165. Li W, Du W, Li Q, Sun T, Liu D. Study on acyl migration kinetics of partial glycerides:

Dependence on temperature and water activity. J Mol Catal B-Enzym. 2010;63:17-22. 166. Wang Y, Wu H, Zong MH. Improvement of biodiesel production by Lipozyme TL IM-

catalyzed methanoysis using response surface methodology and acyl migration enhancer. Bioresource Technol. 2008;99:7232-7.

167. Du W, Xu Y-Y, Liu D-H, Li Z-B. Study on acyl migration in immobilized Lipozyme TL-catalyzed transesterification of soybean oil for biodiesel production. J Mol Catal B-Enzym. 2005;37:68-71.

145

168. Sjursnes BJ, Anthonsen T. Acyl migration on 1,2-dibutyrin dependence on solvent and water activity. Biocatalysis. 1994;9:285-97.

169. Xu X. Enzymatic production of structured lipids: Process reactions and acyl migration. Inform. 2000;11:1121-31.

170. Hernandez K, Garcia-Verdugo E, Porcar R, Fernandez-Lafuente R. Hydrolysis of triacetin catalyzed by immobilized lipases: Effect of the immobilization protocol and experimental conditions on diacetin yield. Enzyme Microb Tech. 2011;48(6-7):510-7.

171. Sonnet PE. Lipase selectivities. J Am Oil Chem Soc. 1988;65:900-5. 172. Akesson B, Gronowitz S, Herslof B, Michelsen P, Olivecrona T. Stereospecificity of

different lipases. Lipids. 1983;18:313-8. 173. Borgstrom B, Brockman HL. Lipases. New York: Elsevier Science Publishing Co. Inc.;

1984. 174. Rogalska E, Cudrey C, Ferrato F, Verger R. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by

animal and microbial lipases. Chirality. 1993;5:24-30. 175. Bevinakatti HS, Banerji AA. Lipase catalysis: Factors governing transesterification.

Biotechnol Lett. 1988; 6:397-8 176. Cygler M, Grochulski P, Kazlauskas RJ, Scharg JD, Bouthillier F, Rubin B, Serreqi AN,

Gupta AK. A structural basis for the chiral preferences of lipases. J Am Chem Soc. 1994;116:3180-6.

177. Long K, Ghazali HM, Ariff A, Che Man Y, Bucke C. Substrate preference of mycelium-bound lipase from a strain of Aspergillus flavus Link. Biotechnol Lett. 1998;20:369-72.

178. Borgdorf R, Warwel S. Substrate selectivity of various lipases in the esterification of cis- and trans-octadecenoic acid. Appl Microbiol Biot. 1999;51:480-5.

179. Kuo S-J, Parkin KL. Substrate preferences for lipase mediated acyl-exchange reactions with butter oil are concentration-dependent. J Am Oil Chem Soc. 1993;70:393-9.

180. Bosley JA, Casey J, Macrae AR, Mycock G. Process for the esterification of carboxylic acids with tertiary alcohols using a lipase from Candida antarctica. 1997. US patent 5658769, vol. 5. p. 658-769.

181. O‘Hagan D, Zaidi NA. The resolution of tertiary α-acetylene-acetate esters by the lipase from Candida cylindracea. Tetrahedron-Asymmetr. 1994;5:1111-8.

182. Yeo S-H, Nihira T, Yamada Y. Screening and identification of a novel lipase from Bukholderia sp. YY62 which hydrolyses t-butyl esters effectively. Appl Microbiol Biot. 1998;51:480-5.

183. Chen C-S, Sih CJ. General aspects and optimization of enantioselective biocatalysis in organic solvents: The use of lipases. Angew Chem Int Edit. 1989;28:695-708.

184. Ghanem A. Trends in lipase-catalyzed asymmetric access to enantiomerically pure/enriched compounds. Tetrahedron. 2007;63:1721-54.

185. Gutman AL, Shapira M. Synthetic applications of enzymatic reactions in organic solvents. In: Fiechter A, editor. Advances in biochemical engineering and biotechnology, vol 52. Heidelberg: Springer; 1995. p. 87-128.

186. Hult K, Berglund P. Enzyme promiscuity: Mechanism and applications. Trends Biotechnol. 2007;25:231-8.

187. O‘Brien PJ, Herschlag D. Catalytic promiscuity and evolution of new enzymatic activities. Chem Biol. 1999;6:R91-105.

188. Wu Q, Liu B-K, Lin X-F. Enzyme promiscuity for organic synthesis and cascade process. Curr Org Chem. 2010;14:1966-88.

189. Copley SD. Enzymes with extra talents: Moonlighting functions and catalytic promiscuity. Curr Opin Chem Biol. 2003;7:265-72.

190. Babtie A, Tokuriki N, Hollfelder F. What makes an enzyme promiscuous. Curr Opin Chem Biol. 2010;14:1-8.

146

191. Bornscheuer UT, Kazlauskas RJ. Catalytic promiscuity in biocatalysis: Using old enzymes to form new bonds and follow new pathways. Angew Chem Int Edit. 2004;43:6032-40.

192. Kazlauskas RJ. Enhancing catalytic promiscuity for biocatalysis. Curr Opin Chem Biol. 2005;9:195-201.

193. Khersonsky O, Roodveldt C, Tawfik DS. Enzyme promiscuity: Evolutionary and mechanistic aspects. Curr Opin Chem Biol. 2006;10:498-508.

194. Yasutake Y, Yao M, Sakai N, Kirita T, Tanaka I. Crystal structure of the Pyrococcus

horikoshii isopropylmalate isomerase small subunit provides insight into the dual substrate specificity of the enzyme. J Mol Biol. 2004;344:325-33.

195. Busto E, Gotor-Fernandez V, Gotor V. Hydrolases: Catalytically promiscuous enzymes for non-conventional reactions in organic synthesis. Chem Soc Rev. 2010;39:4504-23.

196. Gupta MN, Kapoor M, Majumder AB, Singh V. Isozymes, moonlighting proteins and promiscuous enzymes. Curr Sci. 2011;100:1152-62.

197. Branneby C, Carlqvist P, Magnusson A, Hult K, Brinck T, Berglund P. Carbon-carbon bonds by hydrolytic enzymes. J Am Chem Soc. 2003;125:874-5.

198. Svedendahl M, Hult K, Berglund P. Fast carbon-carbon bond formation by a promiscuous lipase. J Am Chem Soc. 2005;127:1798-9.

199. Li C, Feng X-W, Wang N, Zhou Y-J, Yu X-Q. Biocatalytic promiscuity: The first lipase-catalysed asymmetric aldol reaction. Green Chem. 2008;10:616-8.

200. Majumder AB, Ramesh NG, Gupta MN. Lipase catalyzed condensation reaction with a tricyclic diketone - Yet another example of biocatalytic promiscuity. Tetrahedron Lett. 2009;50:5190-3.

201. Torre O, Alfonso I, Gotor V. Lipase catalysed Michael addition of secondary amines to acrylonitrile. Chem Commun. 2004:1724-5.

202. Bjorkling F, Godtfredsen SE, Kirk O. Lipase-mediated formation of peroxycarboxylic acids used in catalytic epoxidation of alkenes. J Chem Soc Chem Comm. 1990:1301-3.

203. Svedendahl M, Carlqvist P, Branneby C, Allner O, Frise A, Hult K, Berglund P, Brinck T. Direct epoxidation in Candida antarctica lipase B studied by experiment and theory. ChemBioChem. 2008;9:2443-51.

204. Wang L, Li C, Wang N, Li K, Chen X, Yu X-Q. Enzyme-mediated domino synthesis of 2-alkylbenzimidazoles in solvent-free system: A green route to heterocyclic compound. J Mol Catal B-Enzym. 2010;67:16-20.

205. Wu M-Y, Li K, He T, Feng X-W, Wang N, Wang X-Y, Yu X-Q. A novel enzymatic tandem process: Utilization of biocatalytic promiscuity for high stereoselective synthesis of 5-hydroxyimino-4,5-dihydrofurans. Tetrahedron. 2011;67:2681-8.

206. Wang J-L, Liu B-K, Yin C, Wu Q, Lin X-F. Candida antarctica lipase B-catalyzed the unprecedented three-component Hantzsch-type reaction of aldehyde with acetamide and 1,3-dicarbonyl compounds in non-aqueous solvent. Tetrahedron. 2011;67:2689-92.

207. Klibanov AM. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. Acc Chem Res. 1990;23:114-20.

208. Soliman NA, Knoll M, Abdel-Fattah YR, Schmid RD, Lange S. Molecular cloning and characterization of termostable esterase and lipase from Geobacillus thermoleovorans YN isolated from desert soil in Egypt. Process Biochem. 2007;42:1090-100.

209. Bradoo S, Saxena RK, Gupta R. Partitioning and resolution of mixture of two lipases from Bacillus stearothermophilus SB-1 in aqueous two-phase system. Process Biochem. 1999;35:57-62.

210. Lesuisse E, Schanck K, Colson C. Purification and preliminary characterization of the extracellular lipase of Bacillus subtilis 168, an extremely basic pH-tolerant enzyme. Eur J Biochem. 1993;216:155-60.

147

211. Capewell A, Wendel V, Bornscheuer U, Meyer HH, Scheper T. Lipase-catalyzed kinetic resolution of 3-hydroxy esters in organic solvents and supercritical carbon dioxide. Enzyme Microb Tech. 1996;19:181-6.

212. Majumder AB, Singh B, Dutta D, Sadhukhan S, Gupta MN. Lipase catalyzed synthesis of benzyl acetate in solvent-free medium using vinyl acetate as acyl donor. Bioorg Med Chem Lett. 2006; 16:4041-4.

213. Nunes PA, Pires-Cabral P, Ferreira-Dias S. Production of olive oil enriched with medium chain fatty acids catalysed by commercial immobilized lipases. Food Chem. 2011;127:993-8.

214. Sharma UK, Sharma N, Kumar R, Kumar R, Sinha AK. Biocatalytic promiscuity of lipase in chemoselective oxidation of aryl alcohols/acetates: A unique synergism of CAL-B and [hmim]Br for the metal-free H2O2 activation. Org Lett. 2009;11:4846-8.

215. Zhang K-P, Lai J-Q, Huang Z-L, Yang Z. Penicillium expansum lipase-catalyzed production of biodiesel in ionic liquids. Bioresource Technol. 2011;102:2767-72.

216. Ulijn RV, Halling PJ. Solid to solid biocatalysis: Thermodynamic feasibility and energy efficiency. Green Chem. 2004;6:488-96.

217. Antonini E, Carrea G, Cremonesi P. Enzyme catalyzed reactions in water-organic solvent two-phase systems. Enzyme Microb Tech. 1981;3:291-6.

218. Lilly MD. Two-liquid-phase biocatalytic reactions. J Chem Technol Biot. 1982;32:162-9. 219. Semenov AN, Khmelnitski Yu L, Beresin IV. Water-organic solvent two-phase systems as

media for biocatalytic reactions: The potential for shifting chemical equilibria towards higher yield of end products. Biocatalysis. 1987;1:3-8.

220. Tweddell RJ, Kermasha S, Combes D, Marty A. Esterification and interesterification activities of lipases from Rhizopus niveus and Mucor miehei in three different types of organic media: A comparative study. Enzyme Microb Tech. 1998;22:439-45.

221. Kim KH, Kwon DY, Rhee JS. Effects of organic solvents on lipase for fat splitting. Lipids. 1984;19(12):975-7.

222. Brink LES, Tramper J. Optimization of organic solvent in multiphase biocatalysis. Biotechnol Bioeng. 1985;27(8):1258-69.

223. Hirose Y, Kaiya K, Sasaki T, Kurono Y, Ebiikef H, Achiwa K. Drastic solvent effect on lipase catalysed enantioselective hydrolysis of prochiral 1,4-dihydropyridines. Tetrahedron Lett. 1992;33:7157-60.

224. Rubio E, Fernandez-Mayorales A, Klibanov AM. Effect of solvent on enzyme regioselectivity. J Am Chem Soc. 1991;113:696.

225. Terradas F, Teston-Henry M, Fitzpatrick PA, Klibanov AM. Marked dependence of enzyme prochiral selectivity on the solvent. J Am Chem Soc. 1993;115:390-6.

226. Snellman EA, Sullivan ER, Colwell RR. Purification and properties of the extracellular lipase, LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1. FEBS J. 2002;269:5771-9.

227. Athawale V, Manjrekar N, Athawale M. Effect of reaction parameters on synthesis of citronellyl methacrylate by lipase-catalyzed transesterification. Biotechnol Progr. 2003;19:298-302.

228. Hilal N, Kochkodan V, Nigmatullin R, Goncharuk V, Al-Khati L. Lipase-immobilized biocatalytic membranes for enzymatic esterification: Comparison of various approaches to membrane preparation. J Membrane Sci. 2006;268:198-207.

229. Hilal N, Nigmatullin R, Alpatova A. Immobilization of cross-linked lipase aggregates within microporous polymeric membranes. J Membrane Sci. 2004;238:131-41.

230. Ved JJ, Pai JS. Preparation of short chain esters by the lipase from Mucor miehei using heptane and silica gel. Biotechnol Technol. 1996;10:855-6.

148

231. Keng PS, Basri M, Zakaria MRS, Abdul Rahman MB, Ariff AB, Abdul Rahman RNZ, Salleh AB. Newly synthesized palm esters for cosmetics industry. Ind Crop Prod. 2009;29:37-44.

232. Dhake KP, Tambade PJ, Qureshi RS, Bhanage BM. HPMC-PVA film immobilized Rhizopus oryzae lipase as a biocatalyst for transesterification reaction. ACS Catal. 2011;1:316-22.

233. Bezbradica D, Mijin D, Marinkovic SS, Knezevic Z. The effect of substrate polarity on the lipase-catalyzed synthesis of aroma esters in solvent-free systems. J Mol Catal B-Enzym. 2007;45:97-101.

234. Romero MD, Calvo L, Alba C, Daneshfar A. A kinetic study of isoamyl acetate synthesis by immobilized lipase-catalyzed acetylation in n-hexane. J Biotechnol. 2007;127:269-77.

235. Wolfson A, Atyya A, Dlugy C, Tavor D. Glycerol triacetate as solvent and acyl donor in the production of isoamyl acetate with Candida antarctica lipase B. Bioprocess Biosyst Eng. 2010;33:363-6.

236. Castro HF, Oliveira PC, Pereira EB. Evaluation of different strategies for lipase catalysed synthesis of citronellyl acetate. Biotechnol Lett. 1997;9:229-32.

237. Ikeda Y, Kurokawa Y. Synthesis of geranyl acetate by lipase entrap-immobilized in cellulose acetate-TiO2 gel fiber. J Am Oil Chem Soc. 2001;78:1099-103.

238. Yadav GD, Borkar I. Kinetic and mechanistic investigation of mikrowave-assisted lipase catalyzed synthesis of citronellyl acetate. Ind Eng Chem Res. 2009;48:7915-22.

239. Yadav GD, Lathi PS. Synthesis of citronellol laurate in organic media catalyzed by immobilized lipases: Kinetic studies. J Mol Catal B-Enzym. 2004;27:113 –9.

240. Oxenbøll K, Ernst S. Environment as a new perspective on the use of enzymes in the food industry. Food Sci Technol. 2008;22:45-7.

241. Gupta R, Rathi P, Bradoo S. Lipase mediated upgradation of dietary fats and oils. Crit Rev Food Sci. 2003;43(6):635-44.

242. Iding H, Siegert P, Mesch K, Pohl M. Application of alpha-keto acid decarboxylases in biotransformations. Biochim Biophys Acta. 1998;1385:307-22.

243. Bonratval.W, Karge R, Netscher T. Lipase-catalyzed transformations as key-steps in the large-scale preparation of vitamins. J Mol Catal B-Enzym. 2002;19-20:67-72.

244. Starodub NF. Biosensors for the evaluation of lipase activity. J Mol Catal B-Enzym. 2006;40:155-60.

245. Svedsen A, Clausen IG, Patkar SA, Borch K, Thellersen M. Protein engineering of microbial lipases of industrial interest. Methods Enzymol. 1997.

246. Novak J, Kralova B, Demnerova K, Prochazka K, Vodrazka Z, Tolman J, Rysova D, Smidrkal J, Lopata V. Enzyme agent based on lipases and oxireductases for washing, degreasing and water reconditioning. European Patent 355,228 (1990).

247. Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnol Adv. 2001;19:627-62.

248. Li S, Li J, Yi J, Shan Z. Cleaner beam house process trial on cattle sofa leather. J Clean Prod. 2010;18:471-7.

249. Bajpai P. Application of enzymes in the pulp and paper industry. Biotechnol Progr. 1999;15(2):147-57.

250. Jeganathan J, Nakhl G, Bassi A. Hydrolytic pretreatment of oily wastewater by immobilized lipase. J Hazard Mater. 2007;145(1-2):127-35.

251. Gui MM, Lee KT, Bhatia S. Feasibility of edible oil vs. non-edible oil vs. waste edible oil as biodiesel feedstock. Energy. 2008;33(11):1646-53.

252. Yan Y, Li X, Wang G, Gui X, Li G, Su F, Wang X, Liu T. Biotechnological preparation of biodiesel and its high-valued derivatives: A review. Appl Energ. 2014;113:1614-31.

149

253. Kafuku G. Mbarawa M. Alkaline catalyzed biodiesel production from Moringa oleifera oil with optimized production parameters. Appl Energ. 2010;87(8):2561-5.

254. Talebian-Kiakalaieh A, Amin NAS, Mazaheri H. A review on novel processes of biodiesel production from waste cooking oil. Appl Energ. 2013;104:683-710.

255. Shariff FM, Rahman RNZRA, Ali MSM, Chor ALT, Basri M, Salleh AB. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of highly thermostable L2 lipase from the newly isolated Bacillus sp. L2. Acta Crystallogr F. 2010;66:715-7.

256. Yusuf NNAN, Kamarudin SK, Yaakub Z. Overview on the current trends in biodiesel production. Energ Convers Manage. 2011;52:2741-51.

257. Agarwal AK, Das LM. Biodiesel development and characterisation for use as a fuel in compression ignition engines. J Eng Gas Turb Power. 2001;123:440-7.

258. Demirbas A. Biodiesel production via non-catalytic SCF method and biodiesel fuel characteristics. Energ Convers Manage. 2006;47(15-16):2271-82.

259. Demirbas A. Relationships derived from physical properties of vegetable oil and biodiesel fuels. Fuel. 2008;87:1743-8.

260. Huang G, Chen F, Wei D, Zhang X, Chen G. Biodiesel production by microalgal biotechnology. Appl Energ. 2010;87(1):38-46.

261. Huang Y, Zheng H, Yan YJ. Optimization of lipase-catalyzed transesterification of lard for biodiesel production using response surface methodology. Appl Biochem Biotech. 2010;160:504-15.

262. Demirbas A. Comparison of transesterification methods for production of biodiesel from vegetable oils and fats. Energ Convers Manage. 2008;49:125-30.

263. Andrade JE, Perez A, Sebastian PJ, Eapen D. A review of biodiesel production processes. Biomass Bioenerg. 2011;35(3):1008-20.

264. Chincholkar SP, Srivastava S, Rehman A, Dixit S, Lanjewar A. Biodiesel as an alternative fuel for pollution control in diesel engine. Asian J Exp Sci. 2005;19(2):13-22.

265. Lapuerta M, Armas O, Rodríguez-Fernández J. Effect of biodiesel fuels on diesel engine emissions. Prog Energ Combust. 2008;34(2):198-223.

266. Leduc S, Natarajan K, Dotzauer E, McCallum I, Obersteiner M. Optimizing biodiesel production in India. Appl Energ. 2009;86(S1):S125-31.

267. Lee SB, Lee JD, Hong IK. Ultrasonic energy effect on vegetable oil based biodiesel synthetic process. J Ind Eng Chem. 2011;17(1):138-43.

268. Wu X, Leung DYC. Optimization of biodiesel production from camelina oil using orthogonal experiment. Appl Energ. 2011;88:3615-24.

269. Srivastava A, Prasad R. Triglycerides-based diesel fuels. Renew Sust Energ Rev. 2000; 4:111-33.

270. Vincente G, Coteron A, Martinez M, Aracil J. Application of factorial design of experiments and response surface methodology to optimize biodiesel production. Ind Crop Prod. 1998;8:29-35.

271. Janulis P, Makarevičienė V. Environmental effect of rapeseed oil ethyl ester. Renew Energ. 2003;28:2395-403.

272. Vincente G, Martinez M, Aracil J. Integrated biodiesel production: A comparison of different homogeneous catalysts systems. Bioresource Technol. 2004;92:297-305.

273. Ramadhas AS, Jayaraj S, Muraleedharan C. Use of vegetable oils as I.C. engine fuels – A review. Renew Energ. 2004;29:727-42.

274. Boehman AL. Foreward – Biodiesel production and processing. Fuel Process Technol. 2005;86:1057-8.

275. Keskin A, Gürü M, Altiparmak D, Aydin K. Using of cotton oil soapstock biodiesel–diesel fuel blends as an alternative diesel fuel. Renew Energ. 2008;33:553-7.

150

276. Brennan L, Owende P. Biofuels from microalgae - A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:557-77.

277. Naik SN, Goud VV, Rout PK, Dalai AK. Production of first and second generation biofuels: A comprehensive review. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:578-97.

278. Leung DYC, Guo Y. Transesterification of neat and used frying oil: Optimization for biodiesel production. Fuel Process Technol. 2006;87:883-90.

279. Meka PK, Tripathi V, Singh RP. Synthesis of biodiesel fuel from safflower oil using various reaction parameters. J Oleo Sci. 2007;56:9-12.

280. Balat M, Balat H. Progress in biodiesel processing. Appl Energ. 2010;87(6):1815-35. 281. Lian S, Li H, Tang J, Tong D, Hu C. Integration of extraction and transesterification of

lipid from Jatropha seeds for production of biodiesel. Appl Energ. 2012;98:540-7. 282. Fukuda H, Kondo A, Noda H. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J

Biosci Bioeng. 2001;92:405–16. 283. Sharma YC, Singh B. Development of biodiesel from karanja, a tree found in rural India.

Fuel. 2008;67:1740-2. 284. Sree R, Babu S, Prasad SPS, Lingaia N. Transesterification of edible and non-edible oils

over basic solid Mg/Zr catalysts. Fuel Process Technol. 2009;90:152-7. 285. Chisti Y. Biodiesel production from microalgae. Biotechnol Adv. 2007;25:294-306. 286. Ma F, Hanna MA. Biodiesel production: A review. Bioresource Technol. 1999;70:1-15. 287. Bajaj A, Lohan P, Jha PN, Mehrotra R. Biodiesel production through lipase catalyzed

transesterification: An overview. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:9-14. 288. Sinha S, Agarwal AK, Garg S. Biodiesel development from rice bran oil:

Transesterification process optimization and fuel characterization. Energ Convers Manage. 2008;49:1248-57.

289. Suehara K, Kawamoto Y, Fujii E, Kohda J, Nakano Y, Yano T. Biological treatment of wastewater discharged from biodiesel fuel production plant with alkali-catalyzed transesterification. J Biosci Bioeng. 2005;100(4):437-42.

290. Basri M, Heng AC, Razak CNA, Wan Yunus WMZ, Ahmad M, Rahman RNA, Ampon K, Salleh AB Alcoholysis of palm oil mid-fraction by lipase from Rhizopus rhizopodiformis. J Am Oil Chem Soc. 1997;74:113–6.

291. Chen JW, Wu WT. Regeneration of immobilized Candida antarctica lipase for transesterification. J Biosci Bioeng. 2003;95:466–9.

292. Vasudevan PT, Briggs M. Biodiesel production – Current state of the art and challenges. J Ind Microbiol Biot. 2008;A35:421-30.

293. Vyas AP, Verma JL, Subrahmanyam N. A review on FAME production process. Fuel. 2010;89:1-9.

294. Saka S, Kusdiana D. Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol. Fuel. 2001;80(2):225-31.

295. He HY, Sun SY, Wang T, Zhu SL. Transesterification kinetics of soybean oil for production of biodiesel in supercritical methanol. J Am Oil Chem Soc. 2007;84(4):399-404.

296. Saka S, Kusdiana D, Minami E. Non-catalytic biodiesel fuel production with supercritical methanol technologies. J Sci Ind Res. 2006;65(5):420-5.

297. Enweremadu CC, Mbarawa MM. Technical aspects of production and analysis of biodiesel from used cooking oil – A review. Renew Sust Energ Rev. 2009;12-13(9):2205-24.

298. Knothe G. Biodiesel and renewable diesel: A comparison. Prog Energ Combust. 2010;36:364-73.

299. Dunn RO. Effects of minor constituents on cold flow properties and performance of biodiesel. Prog Energ Combust. 2009;35:481-9.

151

300. Akoh CC, Chang S, Lee G, Shaw J. Enzymatic approach to biodiesel production. J Agr Food Chem. 2007;55:8995-9005.

301. Pinto AC, Lilian LN, Guarieiroa LLN, Rezendea MJC, Ribeiroa NM. Biodiesel: An overview. J Brazil Chem Soc. 2005;16:1313-30.

302. Knothe G. Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters. Fuel Process Technol. 2005;86:1059-70.

303. Janaun J, Ellis N. Perspectives on biodiesel as a sustainable fuel. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:1312-20.

304. Marchetti JM. Miguel VU. Errazu AF. Technoeconomic study of different alternatives for biodiesel production. Fuel Process Technol. 2008;89(8):740-8.

305. Chisti Y, Yan J. Energy from algae: Current status and future trends: Algal biofuels – a status report. Appl Energ. 2011;88(10):3277-9.

306. Ganapathy T, Murugesan K, Gakkhar RP. Performance optimization of Jatropha biodiesel engine model using Taguchi approach. Appl Energ. 2009;86:2476-86.

307. Hama S, Kondo A. Enzymatic biodiesel production: An overview of potential feedstocks and process development. Bioresource Technol. 2013;135:386-95.

308. Montefrio MJ, Xinwen T, Obbard JP. Recovery and pre-treatment of fats, oil and grease from grease interceptors for biodiesel production. Appl Energ. 2010;87(10):3155-61.

309. Sánchez A, Maceiras R, Cancela A, Pérez A. Culture aspects of Isochrysis galbana for biodiesel production. Appl Energ. 2013;101:192-7.

310. Rodrigues RC, Volpato G, Wada K, Ayub MAZ. Enzymatic synthesis of biodiesel from transesterification reactions of vegetable oils and short chain alcohols. J Am Oil Chem Soc. 2008;85:925-30.

311. Cao P, Dubé MA, Tremblay AY. High-purity fatty acid methyl ester production from canola, soybean, palm, and yellow grease lipids by means of a membrane reactor. Biomass Bioenerg. 2008;32:1028-36.

312. Knothe G. Current perspectives on biodiesel. Inform. 2002;13:900-3. 313. Demirbas A. Biodiesel production from vegetable oils via catalytic and non-catalytic

supercritical methanol transesterification methods. Prog Energ Combust. 2005;31:466-87. 314. Sumathi S, Chai SP, Mohamed AR. Utilization of palm as a source of renewable energy in

Malaysia. Renew Sust Energ Rev. 2008;12(9):2404-21. 315. Santosa SJ. Palm oil boom in Indonesia: From plantation to downstream products and

biodiesel. Clean Soil Air Water. 2008;36(5-6):453-65. 316. Pinzi S, Garcia IL, Lopez-Gimenez FJ, Luque de Castro MD, Dorado G, Dorado MP. The

ideal vegetable oil-based biodiesel composition: A review of social, economical and technical implications. Energ Fuel. 2009;23(5):25-41.

317. Achten WMJ, Maes WH, Aerts R, Verchot L, Trabucco A, Mathijs E, Singh VP, Muys B. Jatropha: From global hype to local opportunity. J Arid Environ. 2010;74:164-5.

318. GuanHua H, Chen F, Wei D, Zhang XW, Chen G. Biodiesel production by microalgal biotechnology. Appl Energ. 2010;87:38-46.

319. Mata TM, Martins AA, Caetano NS. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:217-32.

320. Demirbas A. Use of algae as biofuel sources. Energ Convers Manage. 2010;51:2738-49. 321. Oswald WJ. My sixty years in applied algology. J Appl Phycol. 2003;15:99-106. 322. Oswald WJ, Gotaas HB, Ludwig HF, Lynch V. Algae symbiosis in oxidation ponds.

Photosynthetic oxygenation. Sewage and Industrial Wastes. 1953;25(6):692-705. 323. Mulbry W, Westhead EK, Pizarro C, Sikora L. Recycling of manure nutrients: Use of algal

biomass from dairy manure treatment as a slow release fertilizer. Bioresource Technol. 2005;96:451-8.

152

324. Demirbas A, Demirbas MF. Importance of algae oil as a source of biodiesel. Energ Convers Manage. 2011;52:163-70.

325. Golueke CG, Oswald WJ, Gotaas HB. Anaerobic digestion of algae. Appl Microbiol. 1957;5(1):47-55.

326. Thompson GA. Lipids and membrane function in green algae. Biochim Biophys Acta. 1996;1306:17-45.

327. Chisti Y. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends Biotechnol. 2008;26(3):126-31.

328. Chisti Y. Response to Reijnders: Do biofuels from microalgae beat biofuels from terrestrial plants? Trends Biotechnol. 2008;26:351–2.

329. Daroch M, Geng S, Wang G. Recent advances in liquid biofuel production from algal feedstocks. Appl Energ. 2013;102:1371-81.

330. Erickson BE. Dioxin food crisis in Belgium. Anal Chem. 1999;71:541-3. 331. Marmesat S, Macado RE, Velasco J, Dorbangarnes MC. Used frying fats and oils.

Comparison of rapid tests based on chemical and physical oil properties. Int J Food Sci Tech. 2007;42:601-8.

332. Jacobson K, Gopinath R, Meher LC, Dalai AK. Solid acid catalyzed biodiesel production from waste cooking oil. Appl Catal B-Environ. 2008;85:86-91.

333. Zhang Y, Dube MA, McLean DD, Kates M. Biodiesel production from waste cooking oil: 1. Process design and technological assessment. Bioresource Technol. 2003;89:1-16.

334. Sanchez F, Vasudevan PT. Enzyme catalyzed production of biodiesel from olive oil. Appl Biochem Biotech. 2006;135:1-14.

335. Shimada Y, Watanabe Y, Sugihara A, Tominaga Y. Enzymatic alcoholysis for biodiesel fuel production and application of the reaction to oil processing. J Mol Catal B-Enzym. 2002;17:133-42.

336. Tashtoush GM, Al-Widyan MI, Al-Jarrah MM. Experimental study on evaluation and optimization of conversion of waste animal fat into biodiesel. Energ Convers Manage. 2004;45:2697-711.

337. Gressel J. Transgenics are imperative for biofuel crops. Plant Sci. 2008;174(3):246-63. 338. Sticklen M. Plant genetic engineering to improve biomass characteristics for biofuels. Curr

Opin Biotech. 2006;17(3):3115-9. 339. Schuchardt U, Sercheli R, Vargas RM. Transesterification of vegetable oils: A review. J

Brazil Chem Soc. 1998; 9:199-210. 340. Demirbas A. Competitive liquid biofuels from biomass. Appl Energ. 2011;88:17-28. 341. Köse Ö, Tüter M, Aksoy HA. Immobilized Candida antarctica lipase-catalyzed

alcoholysis of cotton seed oil in a solvent-free medium. Bioresource Technol. 2002;83:125-9.

342. Baron AM, Barouh N, Barea B, Villeneuve P, Mitchell DA, Krieger N. Transesterification of castor oil in a solvent-free medium using lipase from Burkholderia cepacia LTEB11 immobilized on a hydrophobic support. Fuel. 2014;117:458-62.

343. Hideki F, Akihiko K, Hideo N. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J Biosci Bioeng. 2001;92:405-16.

344. Liu KS. Preparation of fatty acid methyl esters for gas chromatographic analysis of lipids in biological materials. J Am Oil Chem Soc. 1994;71:1179-87.

345. Atadashi IM, Aroua MK, Abdul Aziz AR, Sulaiman NMN. The effects of catalysts in biodiesel production: A review. J Ind Eng Chem. 2013;19:14-26.

346. Freedman B, Pryde EH, Mounts TL. Variables affecting the yields of fatty esters from transesterified vegetable oils. J Am Oil Chem Soc. 1984;61(10):1638-43.

347. Hara M. Environmentally benign production of biodiesel using heterogeneous catalysts. ChemSusChem. 2009;2(2):129-35.

153

348. Marchetti JM, Errazu AF. Comparison of different heterogeneous catalysts and different alcohols for the esterification reaction of oleic acid. Fuel. 2008;87:3477-80.

349. Chongkhong S, Tongurai C, Chetpattananondh P. Continuous esterification for biodiesel production from palm fatty acid distillate using economical process. Renew Energ. 2009;34:1059-63.

350. Fan X, Burton R, Austic G. Preparation and characterization of biodiesel produced from recycled canola oil. Open Fuels Energy Sci J. 2009;2:113-8.

351. Encinar JM, Juan F, Gonzalez JF, Rodriguez-Reinares A. Ethanolysis of used frying oils: Biodiesel preparation and characterization. Fuel Process Technol. 2007;88(5):513-22.

352. Ramadhas AS, Jayaraj S, Muraleedharan C. Biodiesel production from high FFA rubber seed oil. Fuel. 2005;84:335-40.

353. Casimir CA, Shu-wei C, Guan-chiun L, Shaw J. Enzymatic approach to biodiesel production. J Agr Food Chem. 2007;55:8995-9005.

354. Watanabe Y, Shimada Y, Sugihara A, Noda H, Fukuda H, Tominaga Y. Continuous production of biodiesel fuel from vegetable oil using immobilized Candida antarctica lipase. J Am Oil Chem Soc. 2000;77:355-60.

355. Roy I, Gupta A, Khare SK, Bisaria VS, Gupta MN. Immobilization of xylan degrading enzymes from Melanocarpus albomyces IIS 68 on the smart polymer eudragit L-100. Appl Microbiol Biot. 2003;61:309-13.

356. Shah S, Gupta MN. Lipase catalyzed preparation of biodiesel from Jatropha oil in solvent-free system. Process Biochem. 2007;42:409-14.

357. Salis A, Pinna M, Monduzzi M, Solinas V. Comparison among immobilised lipases on macroporous polypropylene toward biodiesel synthesis. J Mol Catal B-Enzym. 2008;54:19-26.

358. Akin O, Temelli F, Köseoğlu S. Membrane applications in functional foods and nutraceuticals. Crit Rev Food Sci. 2012;52:347-71.

359. De Souza MP, Cunha Petrus JC, Guaraldo Gonçalves LA. Degumming of corn oil/hexane miscella using ceramic membrane. J Food Eng. 2008;86:557-64.

360. Bousquet-Dubouch MP, Graber M, Sousa N, Lamare S, Legoy MD. Alcoholysis catalyzed by Candida antarctica lipase B in a gas/solid system obeys a ping pong bi bi mechanism with competitive inhibition by the alcohol substrate and water. Biochim Biophys Acta – Protein Structure and Molecular Enzymology. 2001;1550:90-9.

361. Kulschewski T, Sasso F, Secundo F, Lotti M, Pleiss J. Molecular mechanism of deactivation of C. antarctica lipase B by methanol. J Biotechnol. 2013;168:462-9.

362. Liu T, Liu Y, Wang X, Li Q, Wang J, Yan Y. Improving catalytic performance of Burkholderia cepacia lipase immobilized on macroporous resin NKA. J Mol Catal B-Enzym. 2011;71:45-50.

363. Liu Y, Liu T, Wang XF, Xu L, Yan YL. Biodiesel synthesis catalyzed by Burkholderia

cenocepacia lipase supported on macroporous resin NKA in solvent-free and isooctane systems. Energ Fuel. 2011;25:1206-12.

364. Iso M, Chen B, Eguchi M, Kudo T, Shrestha S. Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase. J Mol Catal B-Enzym. 2001;16:53-8.

365. Yang J, Zhang B, Yan Y. Cloning and expression of Pseudomonas fluorescens 26-2 lipase gene in Pichia pastoris and characterizing for transesterification. Appl Biochem Biotech. 2009;159:355-65.

366. Lee KW, Min K, Park K, Yoo YJ. Development of an amphiphilic matrix for immobilization of Candida antarctica lipase B for biodiesel production. Biotechnol Bioproc Eng 2010;15:603-7.

154

367. Shao P, Meng XH, He JZ, Sun PL. Analysis of immobilized Candida rugosa lipase catalyzed preparation of biodiesel from rapeseed soapstock. Food Bioprod Process. 2008;86:283-9.

368. Sim JH, Kamaruddin AH, Bhatia S. Biodiesel (FAME) productivity, catalytic efficiency and thermal stability of Lipozyme TL IM for crude palm oil transesterification with methanol. J Am Oil Chem Soc. 2010;87:1027-34.

369. Li Z, Li X, Wang Y, Wang Y, Wang F, Jiang J. Expression and characterization of recombinant Rhizopus oryzae lipase for enzymatic biodiesel production. Bioresource Technol. 2011;102:9810-3.

370. Yan J, Yan Y, Liu S, Hu J, Wang G. Preparation of cross-linked lipase-coated micro-crystals for biodiesel production from waste cooking oil. Bioresource Technol. 2011;102:4755-8.

371. Moreira A, Perez VH, Zanin GM, de Castro HF. Biodiesel synthesis by enzymatic transesterification of palm oil with ethanol using lipases from several sources immobilized on silica-PVA composite. Energ Fuel. 2007;21:3689-94.

372. Hama S, Yamaji H, Kaieda M, Oda M, Kondo A, Fukuda H. Effect of fatty acid membrane composition on whole-cell biocatalysts for biodiesel-fuel production. Biochem Eng J. 2004;21:155-60.

373. Shimada Y, Watanabe Y, Samukawa T, Sugihara A, Noda H, Fukuda H, Tominaga Y. Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase. J Am Oil Chem Soc. 1999;76:789-93.

374. Li Q, Zheng J, Yan Y. Biodiesel preparation catalyzed by compound-lipase in co-solvent. Fuel Process Technol. 2010;91:1229-34.

375. Royon D, Daz M, Ellenrieder G, Locatelli S. Enzymatic production of biodiesel from cotton seed oil using t-butanol as a solvent. Bioresource Technol. 2007;98:648-53.

376. Li X, He X, Li Z. Enzymatic production of biodiesel from Pistacia chinensis bge seed oil using immobilized lipase. Fuel. 2012;92(1):89-93.

377. Anderson EM, Larsson KM, Kirk O. One biocatalyst – many applications: The use of Candida antarctica B - Lipase in organic synthesis. Biocatal Biotransfor. 1998;16:181-204.

378. Ghamguia H, Karra Châabouni M, Gargouri Y. 1-Butyl oleate synthesis by immobilized lipase from Rhizopus oryzae: A comparative study between n-hexane and solvent-free system. Enzyme Microb Tech. 2004;35:355-63.

379. Dossat V, Combes D, Marty A. Continuous enzymatic transesterification of high oleic sunflower oil in a packed bed reactor: Influence of the glycerol production. Enzyme Microb Tech. 1999;25:194-200.

380. Li L, Du W, Liu D, Wang L, Li Z. Lipase-catalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium. J Mol Catal B-Enzym. 2006;43:58-62.

381. Wang L, Du W, Liu D, Li L, Dai N. Lipase-catalyzed biodiesel production from soybean oil deodorizer distillate with absorbent present in tert-butanol system. J Mol Catal B-Enzym. 2006;43:29-32.

382. Kumari A, Mahapatra P, Garlapati VK, Banerjee R. Enzymatic transesterification of Jatropha oil. Biotechnol Biofuels. 2009;2:1.

383. Du W, Liu D, Li L, Dai L. Mechanism exploration during lipase-mediated methanolysis of renewable oils for biodiesel production in a tert-butanol system. Biotechnol Progr. 2007;5:1087-90.

384. Türkan A, Kalay Ş. Study of the mechanism of lipase-catalyzed methanolysis of sunflower oil in tert-butanol and heptane. Turk J Biochem. 2008;33(2):45-9.

385. Fuentes G, Ballesteros A, Verma CS. Specificity in lipases: A computational study of transesterification of sucrose. Protein Sci. 2004;1:3092-103.

155

386. Garcia-Alles L, Gotor V. Alcohol inhibition and specificity studies of lipase B from Candida antarctica in organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1998;59:163-70.

387. Garcia-Alles L, Gotor V. Lipase-catalyzed transesterification in organic media: Solvent efects on equilibrium and individual rate constants. Biotechnol Bioeng. 1998;59:684-94.

388. Lu J, Deng I, Zhao R, Zang R, Wang F, Tan T. Pretreatment of immobilized Candida sp. 99-125 lipases to improve its methanol tolerance for biodiesel production. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:15-8.

389. Samukawa T, Kaieda M, Matsumoto T, Ban K, Kondo A, Shimada Y, Noda H, Fukuda H. Pretreatment of immobilized Candida antarctica lipase for biodiesel fuel production from plant oil. J Biosci Bioeng. 2000;90:180-3.

390. Al-Zuhair S, Jayaraman KV, Krishnan S, Chan YH. The effect of fatty acid concentration and water content on the production of biodiesel by lipase. Biochem Eng J. 2006;30:212-7.

391. Du W, Wang L, Liu D. Improved methanol tolerance during Novozym 435-mediated methanolysis of SODD for biodiesel production. Green Chem. 2007;9:173-6.

392. Kaieda M, Samukawa T, Kondo A, Fukuda H. Effect of methanol and water contents on production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free system. J Biosci Bioeng. 2001;91:12-5.

393. Du W, Xu Y, Liu D, Zeng J. Comparative study on lipase-catalyzed transformation of soybean oil for biodiesel production with different acyl acceptors. J Mol Catal B-Enzym. 2004;30(3-4):125-9.

394. Parawira W. Biotechnological production of biodiesel fuel using biocatalysed transesterification: A review. Crit Rev Biotechnol. 2009;29(2):82-93.

395. Zieba A, Matachowski L, Lalik E, Drelinkiewicz A. Methanolysis of castor oil catalysed by solid potassium and cesium salts of 12-tungstophosphoric acid. Catal Lett. 2008;127:183-94.

396. Sánchez-García A, Moreno-Pérez AJ, Muro-Pastor AM, Salas JJ, Garcés R, Martínez-Force E. Acyl-ACP thioesterases from castor (Ricinus communis L.): An enzymatic system appropiate for high rates of oil synthesis and accumulation. Phytochemistry. 2010;71:860-9.

397. Maleki E, Aroua MK, Sulaiman NMN. Improved yield of solvent free enzymatic methanolysis of palm and jatropha oils blended with castor oil. Appl Energ. 2013;104:905-9.

398. Thomas TP, Birney DM, Auld DL. Viscosity reduction of castor oil esters by the addition of diesel, safflower oil esters and additives. Ind Crop Prod. 2012;36:267-70.

399. Ozcanli M, Serin H, Aydin K, Serin S. Ricinus communis (castor oil) methyl ester as a natural additive for biodiesel fuels. Energy Educ Sci Tech-A. 2011;27:331-6.

400. Saribiyik OY, Ozcanli M, Serin H, Serin S, Aydin K. Biodiesel production from Ricinus

communis oil and its blends with soybean biodiesel. Strojinski Vestnik-J Mech Eng. 2010;56:811-6.

401. Kaieda M, Samukawa T, Matsumoto T, Ban K, Kondo A, Shimada Y, Noda H, Nomoto F, Ohtsuka K, Izumoto E, Fukuda H. Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by Rhizopus oryzae lipase in a water-containing system without an organic solvent. J Biosci Bioeng. 1999;88:627-31.

402. Noureddini H, Gao X, Philkana RS. Immobilized Pseudomonas cepacia lipase for biodiesel fuel production from soybean oil. Bioresource Technol. 2005;96:769-77.

403. Volkin DB, Staubli A, Langer R, Klibanov AM. Enzyme thermo inactivation in anhydrous organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1991;37:843-53.

404. Yoshida A, Hama S, Nakashima K, Kondo A. Water activity dependence of performance of surface-displayed lipase in yeast cells: A unique water requirement for enzymatic synthetic reaction in organic media. Enzyme Microb Tech. 2011;48:334-8.

156

405. Nelson LA, Foglia TA, Marmer WN. Lipase catalyzed production of biodiesel. J Am Oil Chem Soc. 1996;73:1191-5.

406. Fehér E, Major B, Bélafi-Bakó K, Gubicza L. Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol — Ionic liquid biphasic system. Desalination. 2009;241;8-13.

407. Fonteyn F, Blecker C, Lognay G, Marlier M, Severin M. Optimization of lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in solvent-free medium. Biotechnol Lett. 1994;16:693-6.

408. Kamini NR, Iefuji H. Lipase catalyzed methanolysis of vegetable oils in aqueous medium by Cryptococcus spp. S-2. Process Biochem. 2001;37:405-10.

409. Foresti ML, Ferreira ML. Solvent-free ethyl oleate synthesis mediated by lipase from Candida antarctica B adsorbed on polypropylene powder. Catal Today. 2005;107-8:23-30.

410. Liou YC, Marangoni AG, Yada RY. Aggregation behaviour of Candida rugosa lipase. Food Res Int. 1998;31:243-8.

411. Liu Y, Yan Y, Hu F, Yao A, Wang Z, Wei F. Transesterification for biodiesel production catalyzed by combined lipases: Optimization and kinetics. AlChE J. 2010;56:1659-65.

412. Stamenkovic OS, Velickovic AV, Veljkovic VB. The production of biodiesel from vegetable oils by ethanolysis: Current state and perspectives. Fuel. 2011;90:3141-55.

413. Wang Y, Zhang LH. Ectoine improves yield of biodiesel catalyzed by immobilized lipase. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:91-6.

414. Degn P, Zimmermann W. Optimization of carbohydrate fatty acid ester synthesis in organic media by a lipase from Candida antarctica. Biotechnol Bioeng. 2001;74:483-91.

415. Laane C, Boeren S, Vos K, Veeger C. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1987;30:81-7.

416. Zaks A, Klibanov AM. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J Biol Chem. 1988;263:3194-201.

417. Broos J, Visser AJWG, Engbersen JFJ, Verboom W, van Hoek A, Reinhoudt DN. Flexibility of enzymes suspended in organic solvents probed by time-resolved fluorescence anisotropy. Evidence that enzyme activity and enantioselectivity are directly related to enzyme flexibility. J Am Chem Soc. 1995;117:12657-63.

418. Soumanou MM, Bornscheuer UT. Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil. Enzyme Microb Tech. 2003;33:97-103.

419. Camacho Páez B, Robles Medina A, Camacho Rubio F, González Moreno PA, Molina Grima E. Modeling the effect of free water on enzyme activity in immobilized lipase-catalyzed reactions in organic solvents. Enzyme Microb Tech. 2003;33:845-53.

420. Laane C, Boeren S, Vos K, Veeger C. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents. Biotechnol Bioeng. 2009;102:2-8.

421. Herbst D, Peper S, Niemeyer B. Enzyme catalysis in organic solvents: Influence of water content, solvent composition and temperature on Candida rugosa lipase catalyzed transesterification. J Biotechnol. 2012;162:398-403.

422. Lu J, Nie K, Wang F, Tan T. Immobilized lipase Candida sp. 99-125 catalyzed methanolysis of glycerol trioleate: Solvent effect. Bioresource Technol. 2008;99:6070-4.

423. Matsuda T, Kanamaru R, Watanabe K, Harada T, Nakamura K. Control on enantioselectivity with pressure for lipase-catalyzed esterification in supercritical carbon dioxide. Tetrahedron Lett. 2001;42:8319-21.

424. Knez Z. Enzymatic reactions in dense gases. J Supercrit Fluid. 2009;47:357-72. 425. Rathore V, Madras G. Synthesis of biodiesel from edible and non-edible oils in

supercritical alcohols and enzymatic synthesis in supercritical carbon dioxide. Fuel 2007;86:2650-9.

157

426. Lozano P, Bernal JM, Vaultier M. Towards continuous sustainable processes for enzymatic synthesis of biodiesel in hydrophobic ionic liquids/supercritical carbon dioxide biphasic systems. Fuel. 2011;90:3461-7.

427. van Rantwijk F, Sheldon RA. Biocatalysis in ionic liquids. Chem Rev. 2007;107(6):2757-85.

428. Ma L, Persson M, Adlercreutz P. Water activity dependence of lipase catalysis in organic media explains successful transesterification reactions. Enzyme Microb Tech. 2002;31:1024-9.

429. Lozano P, Piamtongkam R, Kohns K, De Diego T, Vaultierb M, Iborra JL. Ionic liquids improve citronellyl ester synthesis catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B in solvent-free media. Green Chem. 2007;9:780-4.

430. Gotor-Fernandez V, Gotor V. Use of lipases in organic synthesis. Industrial Enzymes. 2007. Chapter 18. 301-315.

431. Yu D, Tian L, Wu H, Wang S, Wang Y, Ma D, Fang X. Ultrasonic irradiation with vibration for biodiesel production from soybean oil by Novozym 435. Process Biochem. 2010;45:519-25.

432. Kumar G, Kumar D, Poonam, Johari R, Singh CP. Enzymatic transesterification of Jatropha curcas oil assisted by ultrasonication. Ultrason Sonochem. 2011;18:923-7.

433. Ros PC, Castro HF, Carvalho AK, Soares CM, Moraes FF, Zanin GM. Microwave-assisted enzymatic synthesis of beef tallow biodiesel. J Ind Microbiol Biot. 2012;39:529-36.

434. Wang J, Huang Q, Huang F, Wang J, Huang Q. Lipase-catalyzed production of biodiesel from high acid value waste oil using ultrasonic assistant. Chin J Biotechnol. 2007;23:1121-8.

435. Barnard TM, Leadbeater NE, Boucher MB, Stencel LM, Wilhite BA. Continuous-flow preparation of biodiesel using microwave heating. Energ Fuel. 2007;21:1777-81.

436. Groisman Y, Gedanken A. Continuous flow, circulating microwave system and its application in nanoparticle fabrication and biodiesel synthesis. J Phys Chem C. 2008;112:8802-8.

437. Yu D, Wang C, Yin Y, Zhang A, Gao G, Fang X. A synergistic effect of microwave irradiation and ionic liquids on enzyme-catalyzed biodiesel production. Green Chem. 2011;13:1869-75.

438. Hendrickson HS. Fluorescence-based assays of lipases, phospholipases, and other lipolytic enzymes. Anal Biochem. 1994;219:1-8.

439. Smeltzer MS, Hart ME, Iandolo JJ. Quantitative spectrophotometric assay for Staphylococcal lipase. Appl Environ Microb. 1992;58:2815-9.

440. Hernaiz MJ, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV. Influence of the nature of modifier in the enzymatic activity of chemical modified semipurified lipase from Candida rugosa. Biotechnol Bioeng. 1997;55:252-60.

441. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.1976;248-54.

442. Silva RA, Carmona-Ribeiro AM, Petri DFS. Catalytic behavior of lipase immobilized onto Congo red and PEG-decorated particles. Molecules. 2014;19(6):8610-28.

443. Bluzmanas P. Mikrobiologinė technika. 1970. Vilnius. 444. Kamini NR, Fujii T, Kurosu T, Iefuji H. Production, purification and characterization of an

extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochem. 2000;36:317-24.

445. Lee DP, Deonarine AS, Kienetz M, Zhu Q, Skrzypczak M, Chan M, Choy PC. A novel pathway for lipid biosynthesis: The direct acylation of glycerol. J Lipid Res. 2001;42:1979-86.

158

446. Rizzo WB, Craft DA, Somer T, Carney G, Trafrova J, Simon M. Abnormal fatty alcohol metabolism in cultured keratinocytes from patients with Sjögren-Larsson syndrome. J Lipid Res. 2008;49(2):410-9.

447. Oliveira AC, Rosa MF. Enzymatic transesterification of sunflower oil in an aqueous-oil biphasic system. J Am Oil Chem Soc. 2006;83(1):21-5.

448. Žemaitis S, Sendžikienė E. Biodyzelino gamyba taikant vienalaikio aliejaus išgavimo ir peresterinimo procesą. „Studentų mokslinė praktika 2012“ konferencijos pranešimų santraukos. II dalis. Vilnius. 2012;213-5.

449. Pocius R, Kazancev K. Biotechnologinio metodo taikymas gaminant biodyzeliną in situ. „Studentų moksliniai tyrimai 2011/2012“ konferencijos pranešimų santraukos. II dalis. Vilnius. 2012;405-6.

450. Tang S, Jones CL, Zhao H. Glymes as new solvents for lipase activation and biodiesel preparation. Bioresource Technol. 2013;129:667-71.

451. Yunus R, Fakhru‘l-Razi A, Ooi TL, Omar R, Idris A. Synthesis of palm oil based trimethylolpropane esters with improved pour points. Ind Eng Chem Res. 2005;44:8178-83.

452. Krishna AG, Raj G, Bhatnagar AS., Prasanth Kumar PK, Chandrashekar P. Coconut oil: Chemistry, production and its applications - A review. Ind Coconut J. 2010;15-27.

VILNIAUS UNIVERSITETAS VITA KIRILIAUSKAITĖ ...8739430/8739430.pdf · Dr. Vida Bendikienė...

Documents

Transcript of VILNIAUS UNIVERSITETAS VITA KIRILIAUSKAITĖ ...8739430/8739430.pdf · Dr. Vida Bendikienė...