1

3

Videnskab På Journalistisk Formel

En undersøgelse af kravene til god videnskabsjournalistik samt formidling af et molekylærbiologisk forskningsprojekt

Molekylærbiologi:

Translæsion syntese og mitokondriel dysfunktion i S. cerevisiae

Journalistik: Optimering af videnskabsjournalistik og formidling af forskning i mitokondrier

Roskilde Universitet, januar 2011 Integreret specialeafhandling af Anne Lykke

I samarbejde med

Københavns Universitet, Center for Sund Aldring

Vejledere: Journalistik: Leif Becker Jensen (intern vejleder, Roskilde Universitet)

Molekylærbiologi: Claus Desler (ekstern vejleder, Københavns Universitet) samt Birgitte Munch-Petersen (intern vejleder, Roskilde Universitet)

ECTS:

Molekylærbiologi: Speciale = 25 ECTS (+ 5 ECTS point i kurser) Journalistisk: Speciale = 30 ECTS

Specialet udgør 249.087 anslag (inklusiv indstik), hvilket svarer til 99,6 normalsider a 2.500 anslag

4

Abstract This master thesis combines Molecular Biology with Journalism in order to investigate how complex science can be reported to a broader public in the most comprehensive way. The aim in Molecular Biology is to investigate how dysfunctional mitochondria and lack of a functional translesion polymerase zeta (pol zeta) influence the survival of yeast cells (S. cerevisiae) when exposed to different doses of the DNA-damaging agent methyl methanesulfonate (MMS). The experiments show that cells with dysfunctional mitochondria (rho0) and wildtype (WT) cells survive equally well after exposure to MMS, suggesting that mitochondrial dysfunction does not influence survival in S. cerevisiae. Furthermore, the survival frequencies of rho0 and WT with knock out of the active subunit of pol zeta are equally and significantly reduced compared to the parental strains, suggesting that pol zeta is essential for survival in both WT and rho0 after exposure to MMS. In order to investigate the mutational pattern of pol zeta, CAN1 mutants exposed to MMS are sequenced. These experiments indicate that rho0 cells reduce the error prone use of pol zeta compared to WT cells when exposed to MMS. Together with preliminary mutation frequency experiments done by Desler this suggests that rho0 cells use a more error free way to replicate across lesions than WT cells do, when DNA damage from MMS has occurred. The biological experiments are then reported on journalistically. Because this piece of science is very basic and not yet applied, four other scientific stories were identified within the topic of mitochondrial research in order to investigate if they differed from the first story. The five produced articles are then analyzed using certain ‘ideal requirements’, which are a set of standards that science stories should encompass, identified in a theoretical review of literature on Science Journalism. Three distinct types of ideal requirements were identified and two of these were used in the analysis: 1) A set of ‘journalistic ideal requirements’ that call for the story to be timely, substantial, fascinating and the topic or sources to be identifiable to the reader. Also the story should address a big audience, it must preferably have the potential to set the media agenda, be critical in its approach, and have a low complexity. 2) A set of ‘scientific ideal requirements’, articulated primarily by scientists. These requirements call for the story to encompass information about the method and any bias of experimental data, the data to be peer reviewed and for the journalists to make certain reservations about the results. Furthermore, according to the scientific requirements, the science in question must be explained to the reader. The analysis shows that compared to the other articles, the article dealing with my experiments is very scientific. This is probably partly because I try to protect my integrity as a scientist. Furthermore, the analysis reveals that some of the journalistic and scientific ideal requirements are directly contradictory. This makes it extremely difficult to honour all of the demands in one article. Consequently, the journalist experiences a dilemma between being loyal to the science or to the reader. It is recommended that science stories both encompass requirements derived from the world of journalism and requirements from the world of science in order to be adequate, comprehensive and entertaining. If both types of ideal requirements are met, the story is more likely to have most ‘scientific journalistic potential’ or ‘capital’, which refers to the story’s potential to make the headlines and at the same time to inform its audience.

5

Resumé Denne specialeafhandling integrerer Molekylærbiologi og Journalistik for at undersøge, hvordan kompleks videnskab kan formidles journalistisk til en bred læserskare på den mest fyldestgørende måde. I Molekylærbiologi undersøges det, hvordan dysfunktionelle mitokondrier samt mangel på translæsion polymerase zeta (pol zeta) influerer på overlevelsen i gæren S. cerevisiae, når gærcellerne udsættes for forskellige doser af det DNA-skadende stof methyl metan sulfonat (MMS). Forsøgene viser, at celler med dysfunktionelle mitokondrier (rho0) og wildtype (WT) overlever lige godt efter udsættelse for MMS, hvilket indikerer, at mitokondriel dysfunktion ikke påvirker overlevelsen i S. cerevisiae. Yderligere viser forsøgene, at overlevelsesfrekvensen for rho0 og WT med knockout af den aktive subunit af pol zeta reduceres signifikant og i lige høj grad i forhold til de parentiale stammer, hvilket indikerer, at pol zeta er essentiel for overlevelsen i både WT og rho0 efter udsættelse for MMS. For at undersøge mutationsspektrummet for pol zeta, sekventeres en række CAN1-mutanter udsat for MMS. Disse forsøg indikerer, at rho0 celler reducerer antallet af mutationer introduceret af pol zeta sammenlignet med WT-celler. Når disse resultater sammenholdes med præliminære mutationsfrekvens-forsøg udført af Desler, tyder det på, at rho0-celler anvender en mere fejlfri måde at bypasse DNA-læsioner end WT efter DNA-skade. De molekylærbiologiske eksperimenter formidles derefter journalistisk i en videnskabsartikel. Idet forskningen stadig er meget grundvidenskabelig og endnu ikke anvendt, identificeres fire andre historier inden for feltet ’mitokondrieforskning’ for at undersøge, om disse skiller sig betydeligt ud fra den første historie. De fem producerede artikler analyseres via såkaldte ’idealkrav’ – et sæt krav til videnskabsjournalistiske historier – der er identificeret i et teoretisk litteraturstudie af videnskabsjournalistik. Tre forskellige idealkrav blev identificeret, og to af disse anvendes i analysen: 1) Den første type kaldes de ’journalistiske idealkrav’, der fordrer, at den videnskabsjournalistiske artikel skal være aktuel, væsentlig, fascinerende og skabe identifikation hos læseren. Yderligere skal historiens forventede publikum være stort, og historien skal være dagsordensættende, kritisk og have en lav kompleksitet. 2) Den anden type idealkrav kaldes de ’videnskabelige idealkrav’ og er primært italesat af videnskabsmænd. Disse idealkrav fordrer, at historien indeholder metodebeskrivelser af forsøgene, som historien omhandler, og nævner eventuelle bias i forsøgsopstillingen og resultaterne. Resultaterne bør være kollegialt bedømte (peer reviewed), og historien bør omtale væsentlige forbehold om resultaternes validitet. Endvidere skal videnskaben, der omtales, også forklares til læseren. Analysen viser, at sammenlignet med de andre artikler, er artiklen om mine forsøg meget videnskabelig, formentligt fordi jeg forsøger at beskytte min integritet som videnskabsmand. Endvidere viser analysen, at nogle af de journalistiske og videnskabelige idealkrav direkte strider mod hinanden. Derfor er det meget svært at opfylde alle idealkravene i samme artikel. Konsekvensen er, at journalisten oplever et dilemma mellem at skulle være loyal over for videnskaben eller over for læseren. Det anbefales, at videnskabshistorier både opfylder så mange af de videnskabelige- og journalistiske idealkrav som muligt, for at historien bliver både korrekt, fyldestgørende og underholdende. Hvis begge typer idealkrav opfyldes, vil historien have mest ’videnskabsjournalistisk potentiale’ eller ’kapital’, hvilket refererer til en histories potentiale for at historien skaber overskrifter, samtidig med at den informerer sit publikum.

6

Indhold Abstract ...................................................................................................................................... 4

Resumé ....................................................................................................................................... 5

Læsevejledning ........................................................................................................................... 9

Ordforklaringsliste ................................................................................................................... 10

1. Indledning ............................................................................................................................. 12

1.1 Journalistisk problemformulering: ................................................................................. 14

1.2 Molekylærbiologisk problemformulering: ..................................................................... 14

2. Molekylærbiologi ................................................................................................................. 15

2.1 Teori ............................................................................................................................... 15

2.1.1 DNA reparation og translæsion syntese .................................................................. 17

2.1.2 TLS-polymerasernes funktion ................................................................................. 18

2.1.3 TLS involverer enten én eller to TLS-polymeraser ................................................ 21

2.1.4 Hvornår i cellecyklus sker TLS? ............................................................................. 21

2.1.5 Template switching ................................................................................................. 23

2.1.6 PCNA rekrutterer TLS-polymeraser til læsioner .................................................... 25

2.1.7 TLS-polymeraser i S. cerevisiae ............................................................................. 26

2.1.8 TLS-polymeraser med overlappende funktionalitet ................................................ 29

2.1.9 TLS og dNTP ubalance ........................................................................................... 30

2.1.10 Mitokondrier og dNTP .......................................................................................... 33

2.1.11 Teoretisk introduktion til mutationsspektrum-forsøg ........................................... 34

2.2 Materialer og Metoder .................................................................................................... 36

2.2.1 Cellestammer og medium ........................................................................................ 36

2.2.2 Fremstilling af rho0 .................................................................................................. 37

2.2.3 Dapi-farvning .......................................................................................................... 37

2.2.4 Overlevelsesforsøg .................................................................................................. 38

2.2.5 CAN1 mutationsspektrum-forsøg ............................................................................ 40

2.3 Resultater ........................................................................................................................ 44

2.3.1 Verificering af rho0 ved YPG og DAPI-farvning .................................................... 44

2.3.2 Overlevelsesforsøg med MMS ................................................................................ 45

2.3.3 Overlevelsesforsøg med Hydroxyurea .................................................................... 48

2.3.4 CAN1 mutationsspektrum ....................................................................................... 49

7

2.4 Diskussion ...................................................................................................................... 55

2.5 Konklusion ..................................................................................................................... 62

2.6 Perspektivering ............................................................................................................... 63

3. Populærvidenskabelig opsummering af molekylærbiologien .............................................. 64

4. Journalistik ........................................................................................................................... 66

4.1 Afgrænsning og begrebsafklaringer ............................................................................... 66

4.2 Teori og meninger om videnskabsjournalistik ............................................................... 67

4.2.1 Hvad er videnskabsjournalistik? ............................................................................. 67

4.2.2 Genrer ...................................................................................................................... 68

4.2.3 Hvordan udvælges videnskabshistorier? ................................................................. 69

4.2.4 Hvordan forholder medierne sig til videnskab? ...................................................... 73

4.2.5 Udfordringer i journalistens behandling af videnskabelige resultater .................... 75

4.2.6 Opstilling af idealkravene ....................................................................................... 80

4.3 Journalistisk produktion ................................................................................................. 83

4.4 Metode til analysen ........................................................................................................ 84

4.5 Analyse ........................................................................................................................... 86

4.5.1 Anvender kræftceller ’sjuskede kopimaskiner’ til at overleve bedre? .................... 86

4.5.2 Spis mindre – lev længere? ..................................................................................... 87

4.5.3 Når motion er den eneste medicin ........................................................................... 88

4.5.4 Sygdommene lægerne ikke opdager ....................................................................... 89

4.5.5 Er to genetiske mødre én for meget? ....................................................................... 90

4.5.6 Tabel over idealkrav opfyldt i historierne ............................................................... 91

4.6 Diskussion ...................................................................................................................... 93

4.6.1 Idealkravene strider mod hinanden ......................................................................... 93

4.6.2 Kapital og nyhedsværdi ........................................................................................... 93

4.6.3 Hvad sker der, når journalisten også er forskeren? ................................................. 94

4.6.4 Hvad kræver det at flytte x’er? ................................................................................ 95

4.6.5 Faktabokse kan opfylde flere idealkrav .................................................................. 95

4.6.6 Genrer: Videnskabsjournalistik i ny indpakning? ................................................... 96

4.6.7 Idealkravene til diskussion ...................................................................................... 96

4.6.8 Hvordan forenes videnskab og journalistik? ......................................................... 100

4.7 Konklusion ................................................................................................................... 103

8

5. Litteratur ............................................................................................................................. 107

5.1 Molekylærbiologi ......................................................................................................... 107

5.2 Journalistik ................................................................................................................... 121

Bilag ....................................................................................................................................... 126

Bilag 1 ................................................................................................................................ 126

Bilag 2 ................................................................................................................................ 130

Bilag 3 ................................................................................................................................ 133

Bilag 4 ................................................................................................................................ 135

9

Læsevejledning

Alle kan læse indledningen og journalistikafsnittene. De molekylærbiologiske afsnit er primært skrevet til fagkyndige inden for molekylærbiologi, hvorfor det kan være særdeles vanskeligt for andre at læse, da sproget og indholdet er meget fagspecifikt. Det anbefales dog, at ufagkyndige skimmer molekylærbiologiafsnittene for at få en ide om indholdet. Som hjælp til ufagkyndige findes en populær opsummering af de biologiske forsøg og resultater lige efter biologi-afsnittene. Dette gør, at læseren uden særlig molekylærbiologisk indsigt også kan få et overblik over molekylærbiologien. Yderligere er specifikke ord i teksten forklaret i en ordforklaringsliste. Disse ord er skrevet med fed+kursiv, første gang de optræder, og her er det muligt at slå betydningen op i listen. Engelske ord, der ikke er oversat i teksten, er skrevet i kursiv. God fornøjelse med læsningen!

10

Ordforklaringsliste

Journalistik: Gatekeeping: Refererer til mediernes ’filter’, som bestemmer, hvilke informationer, der kommer ud til offentligheden. Gatekeeping udøves både af journalister og redaktører, og resultatet er meget forskelligt fra medie til medie. For eksempel er den information, der slipper igennem filteret på magasinet ’ALT for damerne’, meget forskellig fra Politiken, fordi målgrupperne er forskellige. Grundforskning: Originale undersøgelser uden et egentligt mål om praktisk anvendelse, men hvis hovedformål er at opnå ny videnskabelig viden og forståelse. ’Anvendt forskning’ er derimod viden, der har fået en praktisk, og ofte kommerciel, anvendelse. Metatekst: Henviser i denne sammenhæng til teksten uden om et budskab, det vil sige budskabets indpakning. Mikrofonholderi: Et slangudtryk om ukritisk journalistik; tegner et billede af en ukritisk journalist, der holder mikrofonen for en kilde, som uden modspørgsmål fra journalisten kan levere sine holdninger til en sag. Omnibuspressen: Betyder en presse, der er til for alle. Omnibusaviser behandler samtlige emner, der betragtes som interessante for offentligheden. Paradigme: Den fælles viden og fælles baggrund som videnskabsmænd inden for en given videnskab tillægger sig og arbejder ud fra. En videnskabsmand, der opdrages i et paradigme, optager undervejs en gennemprøvet og gruppeautoriseret måde at se verden på, som er ubevidst og automatisk [Brier 1997: 112-114]. Forskning, der foregår inden for et givent paradigme, er ikke mere sand end anden forskning, men blot mere objektiv, idet den foretages systematisk. Peer review: Betyder kollegial bedømmelse, og peer reviewed betyder kollegialt bedømt, hvor bedømmerne oftest er artiklens forfattere ubekendte. Rubrik: Overskriften på en journalistisk historie kaldes i fagsprog rubrikken.

Molekylærbiologi: 4-NQO: 4-nitroquinoline-N-oxide eller 4-nitroquinoline-N-oxide, DNA-skadende stof, der giver store skader, for eksempel fotodimerer og 8-hydroxyguanin [Friedberg et al. 1995]. ADP: Adenosin difosfat AP-sites: Sites uden baser i DNA’et. ATP: Adenosin trifosfat Benzo[a]pyrene: DNA-skadende stof, der blandt andet forårsager store adduktioner på guanin [Friedberg et al. 1995]. Bypasse: Betyder omføring eller omkørsel og refererer til TLS-polymerasernes evne til at omgå DNA-skader. CDP: Cytidin difosfat

11

dA: deoxyadenosin dATP: deoxyadenosin trifosfat dCTP: deoxycytidin trifosfat dC: deoxycytidin dG: deoxyguanosin dGTP: deoxyguanosin trifosfat dNTP: deoxyribonukleosidtrifosfat dT: deoxythymidin dTTP: deoxythymidin trifosfat E. coli: Escherichia coli EMS: Ethyl metan sulfonat ETC: elektrontransportkæden Frameshift: Skift i læserammen i forbindelse med replikation GDP: Guanosin difosfat Km-værdi: Beskriver den koncentration af substrat, der skal til for at opnå halvdelen af enzymets maksimale hastighed. Minor groove: DNA-helixens to strenge er ikke placeret præcis overfor hinanden, og derfor fremkommer der to forskellige ’fordybninger’ i længderetningen, som kaldes den store fordybning (major groove) og en mere snæver fordybning (minor groove). MMS : Methyl metan sulfonat mtDNA: mitokondrielt DNA nDNA: nukleart DNA OD: Optical density PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen. PCNA er den eukaryote klemme, der loader og fastholder polymeraser til DNA-strengen under replikationen. Rho0: Celler uden mitokondrielt DNA. RNR: Ribonukleotid reduktase S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae, bagegær ssDNA: Enkeltstrenget DNA TLS: Translæsion syntese Template switching: Fejlfri omgåelse af DNA-skader ved brug af en uskadet DNA-template. T^T: Thymin-thymin cyclobutan pyrimidin dimer UDP: Uridin difosfat WT: Wildtype YPD: Yeast extract peptone-dextrose YPG: Yeast extract peptone glycerol Nomenklatur: Gener angives i kursiv og proteiner med stort begyndelsesbogstav.

12

1. Indledning I løbet af de sidste tre århundreder er forskere langsomt blevet mere og mere autonome og differentierede i forhold til samfundet og den almene befolkning [Bucchi: 1998: 1]. Dette har skabt et ”videnshul” imellem forskere og ikke-forskere, som dagspressen og magasiner forsøger at udfylde ved at formidle naturvidenskabelig og teknologisk viden til befolkningen på en populariseret måde [Bucchi: 1998: 1-2]. Men medierne formår ifølge kritikerne ikke at levere sober videnskabsjournalistik. Journalister forsimpler forskningen ’unødig meget’ [MVTU 2004: 29], og mange kritiserer den nuværende videnskabsjournalistik for at være for overfladisk, ensidig og unuanceret. Steen Gammeltoft, professor dr. med. og redaktør for Biokemisk Forenings medlemsblad ’BioZoom’, mener, at videnskabsjournalister generelt ved for lidt om videnskab og ikke har overblik over, hvad der rører sig internationalt i forskningsverdenen, hvilket efterlader den danske borger uoplyst [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f]. Gammeltoft kritiserer danske videnskabsjournalister for at skrive artikler, der mangler ’faglige detaljer’ samt ’aktualitet og kontinuitet’. Videnskabsjournalister kritiserer han for at ’komme og gå’, for at være overfladiske og ukritiske overfor deres kilder og for at glemme at undersøge kildernes videnskabelige kvalifikationer [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f]. Udenlandske medieforskere kan ligeledes konstatere, at videnskabelige artikler er ukomplette: Der mangler kildereaktioner, metodebeskrivelser og historierne generaliserer specifikke resultater [Stocking i Friedman et al. 1999, Pellechia 1997]. De fleste mennesker har hverken erfaring eller uddannelsesmæssig baggrund i videnskaberne, hvilket betyder, at deres forståelse tager udgangspunkt i den virkelighed, som medierne præsenterer [Nelkin 1995: 2]. Nyhedsmedierne anses efter skoleårene som den primære kilde til information om videnskab [”Science and Society” i Allan 2002: 71] og om sundhed [Voss 2003]. Derfor kan dårlig videnskabsjournalistik svække befolkningens demokratiske magt [Nelkin 1995: 2]. Et fungerende demokrati1 forudsætter således et publikum (vælgere), der har adgang til viden, og på baggrund af dette kan træffe velinformerede valg [Nelkin 1995: 2, Hornmoen 1999: 15, Burkett 1973: 39]. I dag er nyhedsmedierne og internettet de vigtigste kilder til information i offentligheden, og derfor kan dårlig dækning af videnskab ultimativt føre til, at patienter får falske forhåbninger om nye medicinske fremskridt, prøver udokumenterede og potentielt farlige behandlingsformer eller til unødvendig frygt i befolkningen [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f, Voss 2003]. Hvis vi antager, at videnskabsjournalistikken er af så ringe kvalitet, som kritikerne påstår, er spørgsmålet: Kan man skrive journalistik om videnskab på en mere hensigtsmæssig måde? Ud fra litteraturen på området vil jeg identificere en række punkter, hvor videnskabsjournalistikken ifølge kritikerne fejler, altså hvor publikum fejlinformeres eller 1 Jeg afgrænser mig fra at gå ind i en dybere redegørelse af, hvad demokrati egentlig er, men her anskues det som et folkestyre, hvor alle har lige ret og mulighed for at udfolde sine evner.

13

misinformeres. Ud fra disse kritikpunkter opstilles en række idealer for god videnskabsjournalistik, og ud fra disse vil jeg formidle min egen forskning i molekylærbiologi. Min biologiske forskning omhandler i grove træk kroppens energifabrikker (mitokondrierne), der befinder sig inde i alle kroppens celler. Basalt set har jeg observeret, hvordan gærceller med og uden funktionelle mitokondrier overlever, når cellerne udsættes for et kræftfremkaldende stof (MMS). Yderligere har jeg observeret, hvad der sker, hvis deres evne til at overkomme skader på deres DNA forringes. Forskning i mitokondrier er relativt ung. Først i 1950 kunne mitokondrier observeres med elektronmikroskopi, og i 1963 fandt Nass og Nass ud af, at mitokondrier indeholder deres eget DNA [Nass og Nass 1963]. Denne opdagelse var meget overraskende, da man ellers kun kendte til DNA i cellens kerne. Mitokondrierne er dermed de eneste selvstændige dele af cellen, der indeholder DNA ud over cellekernen2. Forskning i mitokondrier er i dag et voksende felt, fordi dårlige mitokondrier er blevet sammenkædet med aldring, arvelige energisygdomme (mitokondriesygdomme) samt nogle typer kræft og diabetes. Der er dog skrevet forsvindende lidt om mitokondrier i de danske medier, selv om emnet gemmer på flere journalistiske historier efter min mening. En Infomedia-søgning med søgeordet ’mitokondrier’ de sidste 10 år gav cirka 150 hits3, hvoraf mange historier var gengangere, det vil sige, at originalartiklen var citeret af andre medier, og ofte var videnskaben ikke i fokus. Jeg vil således skrive nogle journalistiske historier om et relativt ukendt og svært biologisk emne ud fra en række videnskabsjournalistiske ’idealkrav’, der opstilles i journalistik-teoriafsnittet.

2 Klorofyl i planteceller indeholder også deres eget DNA. 3 Undersøgelsen er ikke videnskabelig, men skal blot give et indtryk af omfanget af mediedækningen.

14

1.1 Journalistisk problemformulering:

• Hvordan kan man formidle en kompleks videnskabelig problemstilling i gode journalistiske historier, der opfylder de opstillede videnskabsjournalistiske idealkrav?

For at besvare problemformuleringen vil jeg på baggrund af den teoretiske ramme selv formidle den biologiske viden, jeg har indsamlet igennem et halvt års forløb i laboratoriet, hvor arbejdet udførtes ud fra følgende problemformulering:

1.2 Molekylærbiologisk problemformulering:

• Hvordan overlever wildtype (WT) gær i forhold til gær med dysfunktionelle mitokondrier (rho0)? Benytter rho0-gærceller pol zeta og i så fald hvor meget i forhold til WT?

Ud fra journalistikteorien vil det blive diskuteret, hvordan den biologiske ”tekst-masse” i nærværende speciale kan formidles journalistisk. Specialet er derfor et såkaldt produktionsspeciale som defineret på Journalistik på RUC’s hjemmeside [RUC].

15

2. Molekylærbiologi

2.1 Teori

Integriteten af arvemassen kan trues af DNA-skadende påvirkninger som UV-lys, biprodukter af metabolisme og udefrakommende DNA-skadende stoffer [Friedberg et al. 1995]. DNA-læsioner, der ikke er blevet repareret af cellens reparationsmekanismer, blokerer replikationsgaflen [McGregor 1999, Woodgate 1999], idet de replikative polymeraser går i stå ved læsionen. Standsede replikationsgafler er meget toksiske for cellen, og kan lede til dobbeltstrengede brud på DNA-strengen, kromosomal ustabilitet og død [reviewed i Branzei og Foiani 2007]. For at afvikle de standsede gafler så replikationen kan fuldføres, kan cellen aktivere nogle specialiserede polymeraser kaldet translæsion syntese polymeraser (TLS-polymeraser), som udfører DNA-syntese forbi ureparerede læsioner [Woodgate 1999, Friedberg et al. 2000]. TLS-polymeraserne erstatter den replikative polymerase og omgår (eller bypasser) læsionerne, så replikationen kan fortsætte [reviewed i Prakash et al. 2005, reviewed i Rattray og Strathern 2003]. En TLS-event introducerer ofte en mutation, idet det skadede DNA anvendes direkte som template [Friedberg et al. 2005b], og fordi TLS-polymeraser har lav fidelitet og processivitet [Washington et al. 1999, Ogi et al. 1999, Matsuda et al. 2000, Ohashi et al. 2000, Dominguez et al. 2000, Trincao et al. 2001, Ling et al. 2001, Silvian et al. 2001]. De syntetiserer derfor med meget højere fejlrater end de replikative polymeraser både i syntesen af beskadiget og ubeskadiget DNA [Lee og Pfeifer 2008, reviewed i Goodman 2002, reviewed i Kunkel 2003a og 2004b]. En TLS-event siges at være fejlfri, hvis TLS-polymerasen indsætter den korrekte nukleotid overfor læsionen og dermed bypasser læsionen uden at introducere fejl i den nye streng. Omvendt siges TLS-eventen at være fejlagtig, hvis der indsættes en forkert nukleotid overfor den skadede base, så der introduceres en mutation [reviewed i Prakash et al. 2005, reviewed i Rattray og Strathern 2003]. Men overordnet set vil TLS-polymeraser introducere flere fejl til genomet end de replikative DNA-polymeraser, idet TLS-polymeraser mangler 3’-5’ exonuklease aktivitet [reviewed i Kunkel et al. 2003b]. Det betyder, at TLS-polymeraser, i modsætning til de replikative polymeraser, ikke kan korrekturlæse og rette de fejl, den begår (proofreading). Det er vist, at TLS-polymeraser ofte er signifikant overudtrykt i tumorer fra forskellige væv, blandt andet livmoder-, ovarie-, prostata- og mavecancer [Albertella et al. 2005]. Hvis TLS-polymeraserne ikke reguleres nøje af cellen, kan det føre til øget mutagenese [reviewed i Waters et al. 2009]. TLS-polymerase-generne kan derfor anses som oncogener, hvis de er overudtrykte [Albertella et al. 2005]. Sammenhængen mellem overekspression af TLS-polymeraserne og tumorgenese anses for at være et resultat af øget og ureguleret TLS, der

16

øger mutationsfrekvensen i genomet, hvilket i sidste ende kan føre til udviklingen af ondartede cancerceller [Albertella et al. 2005]. Yderligere kan TLS-polymeraseaktivitet sammenkobles med resistens overfor det kemoterapeutiske stof cisplatin samt andre kemoterapeutiske stoffer [Lin et al. 2006a, Lin et al. 2006b, Albertella et al. 2005, Levine et al.. 2001; Chen et al.., 2006]. Det er blevet foreslået, at TLS-polymeraserne fremmer celleoverlevelse ved at sikre, at replikationen kan gennemføres over et stort antal skader i genomet fra de kemoterapeutiske stoffer, hvilket resulterer i øget resistens overfor de kemoterapeutiske stoffer [Albertella et al. 2005]. For nyligt er der fundet indikationer på, at byggestenene til DNA, deoxyribonukleosidtrifosfat (dNTP), kan spille en rolle i reguleringen af TLS-responset [Chabes et al. 2003]. I wildtype (WT) S. cerevisiae øges dNTP-poolen 6-8 gange i S-fasen efter vedvarende DNA-skader fra 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO), MMS og UV-lys [Chabes et al. 2003]. Denne markante stigning i dNTP-poolen øger chancen for overlevelse efter DNA-skade, men giver samtidig en øget mutationsfrekvens [Chabes et al. 2003]. Dette menes at være et resultat af reduceret fidelitet fra de replikative polymeraser og/eller mere TLS-aktivitet ved forhøjede dNTP pools [Chabes et al. 2003, Lis et al. 2008]. Endvidere er det vist, at TLS-polymeraserne in vitro kræver op til 10 gange højere dNTP-pools for effektivt at indsætte et nukleotid overfor forskellige læsioner i forhold til at indsætte et nukleotid overfor uskadet DNA [Shimizu et al. 2002, Minko et al. 2002, Haracska et al. 2000, Haracska et al. 2001b]. På baggrund af denne sammenhæng foreslår Chabes et al. (2003), at forskellige TLS polymeraser har deres optimale aktivitet ved bestemte dNTP-niveauer, hvor optimummet er forskelligt for hver enkelt TLS-polymerase [Chabes et al. 2003]. Der er derfor stærke indikationer på, at dNTP-poolen spiller en regulatorisk rolle under et TLS-respons, og at størrelsen af dNTP-poolen har betydning for effektiviteten af TLS. Mitokondriel dysfunktion kan føre til uregulerede dNTP-niveauer. Löffler et al. (1997) har foreslået et direkte link mellem mitokondriel dysfunktion og reguleringen af nukleotid-poolen i mammale celler via det mitokondrie-bundne enzym dihydroorotate ubiquinone oxidoreductase, som udgør et uundværligt trin i de novo pyrimidin-syntesen [Löffler et al. 1997]. Hypotesen om, at dysfunktionelle mitokondrier per se fører til ubalancerede dNTP-pools i cellen, understøttes af, at humane celler uden funktionelle mitokondrier (rho0) har lavere dNTP-pools end WT efter DNA-skader [Desler et al. 2007]. Yderligere er det vist, at humane rho0-cellers dNTP-pools er ubalancerede, det vil sige at koncentrationerne af de fire dNTP’er er ændrede i rho0-celler i forhold til koncentrationerne i de parentiale celler [Desler et al. 2007]. Endvidere udviser rho0-gærceller forhøjede mutationsfrekvenser i det nukleare genom i forhold til WT [Rasmussen et al. 2003]. Sammenhængen mellem dysfunktionelle mitokondrier og øgede mutationsfrekvenser i nDNA er endnu relativt ukendt, men Rasmussen

17

et al. (2003) foreslår, at deletion af mtDNA i rho0 genererer ubalancerede nukleotid-pools samt flere DNA-skader, der omdannes til nukleare mutationer af TLS-polymeraserne [Rasmussen et al. 2003]. I tråd med dette er det vist, at mutator-fænotypen i rho0-gærs nukleare genom kan undertrykkes ved at inaktivere to TLS polymeraser (Rev1 og polymerase zeta) [Rasmussen et al. 2003]. Dette indikerer, at rho0-gær i høj grad anvender TLS til at bypasse læsioner [Rasmussen et al. 2003]. Rasmussen et al. (2003) antager som sagt, at der er en sammenhæng mellem mitokondriel dysfunktion og TLS-responset, og Chabes et al. (2003) har foreslået, at TLS-responset til dels reguleres af dNTP-niveauet. Det er dog endnu ikke vist, om der findes en egentlig sammenhæng mellem de tre størrelser; altså om mitokondriel dysfunktion og de medfølgende uregulerede dNTP-pools er direkte indvirkende på TLS-responset. Nærværende speciale ønsker at kaste lys over denne mulige sammenhæng ved at undersøge TLS’s indflydelse i gærceller med dysfunktionelle mitokondrier, og hvordan dysfunktionelle mitokondrier påvirker overlevelsesfrekvensen. Det kan tænkes, at celler med dysfunktionelle mitokondrier udviser et ændret TLS-respons som følge af deres manglende evne til at syntetisere dNTP, hvilket ifølge Chabes et al. (2003) forringer chancen for overlevelse. Derfor er det muligt, at gærceller med dysfunktionelle mitokondrier bliver tvunget til at anvende TLS-responset på en anderledes måde end utransformerede celler. TLS-polymerase zeta (pol zeta) udfører langt de fleste mutagene events i gær [Lawrence og Maher 2001] og spiller også en meget vigtig rolle for overlevelsen og for mutagenesen i højere eukaryoter [Wittschieben et al. 2000, reviewed i Gan et al. 2008]. Forsøgene fokuserer derfor på pol zetas funktion i gæren S. cerevisiae. Der anvendes methyl metan sulfonat (MMS) som DNA-skadende stof i forsøgene. MMS methylere baserne i DNA, specielt adenin på N-3 positionen (3meA) og guanin på N-7 positionen (7meG) [Beranek et al. 1980, Lawley et al. 1975]. Disse skader blokerer effektivt DNA-replikationen via de replikative polymeraser og aktiverer TLS-responset. MMS-inducerede skader er yderligere et kendt substrat for pol zeta [Wittschieben et al. 2006].

2.1.1 DNA reparation og translæsion syntese

I mammale celler genereres der cirka 30.000 spontane DNA-læsioner i døgnet [Lindahl og Barnes 2000]. De største kilder til spontane DNA-skader er reaktive oxygen molekyler, base deamineringer (specielt cytosin til uracil) samt depurinering og depyrimidinering [Lindahl og Barnes 2000, Friedberg et al. 2005a]. Yderligere kan mange miljømæssige faktorer forårsage DNA-skader, såsom UV-stråling og kemiske stoffer som MMS, cisplatin, og benzo[a]pyrene [Friedberg et al. 2005a]. Disse stoffer kan forårsage base-modifikationer, store uoverkommelige læsioner, der skaber forstyrrelser i dobbelthelixen (bulky adducts) og brud på sukker-fosfat rygraden i DNA’et.

18

Skader på DNA’et repareres af cellens DNA reparationssystemer, som består af følgende overordnede systemer: nucleotide exision repair (NER), base exision repair (BER), direct reversal (DR), mismatch repair (MMR) og reparation af dobbeltstrengede brud, der enten repareres ved homolog rekombination eller via uhomolog sammenkædning af enderne (non-homolog end-joining, NHEJ). DR, NER og BER skanner konstant DNA’et, mens MMR er et post-replikativt system, som under S-fasen scanner strengen lige efter den replikative polymerase og retter fejl begået af denne [reviewed i Larsen et al. 2005]. Nogle skader repareres dog ikke, og de bevirker, at den replikative polymerase går i stå (staller), fordi den ikke er i stand til at replikere forbi skaden [Branzei og Foiani 2005]. Replikative polymeraser har et meget stringent aktivt site, hvis høje selektivitet favoriserer korrekt nukleotid-inkorporation over for template, og en beskadiget base vil derfor ikke passe ind i det aktive site [Baker og Bell 1998, Friedberg et al. 2005a, Kool 2002]. TLS-polymeraser er derimod i stand til at syntetisere forbi en beskadiget base på template-strengen, idet deres aktive sites er mindre specifikke end de replikative polymerasers, hvilket øger risikoen for indsættelse af forkerte baser [reviewed i Prakash et al. 2005].

2.1.2 TLS-polymerasernes funktion

TLS-polymeraser er næsten alle medlem af Y-familien af polymeraser, dog med undtagelse af pol zeta, der er medlem af B-familien. TLS-polymeraser misinkorporerer gennemsnitligt 10-1000 nukleotider pr. 105 nukleotider syntetiseret, hvorimod de replikative polymeraser gennemsnitligt inkorporerer 1 forkert pr. 105 nukleotider (se Tabel 1) [Lee og Pfeifer 2008, Matsuda et al. 2001, Ohashi et al. 2000, Zhong et al. 2006, Kunkel et al. 1989, Shcherbakova et al. 2003, Fortune et al. 2005, reviewed i Goodman 2002, reviewed i McCulloch og Kunkel 2008]. Dog er der meget stor forskel på fejlraten af de forskellige TLS-polymeraser, hvilket tydeligt ses i tabellen. Nogle TLS-polymeraser syntetiserer over en specifik type læsion med stor præcision, hvorfor læsionen kaldes TLS-polymerasens kognate læsion, og her betegnes TLS-polymerasen som fejlfri [reviewed i Waters et al. 2009]. For eksempel syntetiserer TLS-polymerase eta (pol eta) over T^T dimerer fejlfrit både i gær og humane celler, mens den bypasser andre læsioner meget fejlagtigt, hvorfor fejlraten overordnet set er stor [Washington et al. 1999, McCulloch et al. 2007, McCulloch et al. 2004b, Matsuda et al. 2001].

19

DNA polymerase Familie Fejlrate (×10−5) Reference

Substitution Indel

TLS hpol eta (η) pol Y 3500 240 Matsuda et al. 2001

TLS hpol kappa (κ) pol Y 580 180 Ohashi et al. 2000

TLS ypol eta (η) pol Y 950 93 McCulloch et al. 2007

TLS ypol zeta (ζ) pol B 130 4,4 Zhong et al. 2006

Rep. ypol alpha (α) pol B 9,6 3,1 Kunkel et al. 1989, Shcherbakova et al. 2003

Rep. ypol delta (δ) pol B ≤1,3 1,3 Fortune et al. 2005

Rep. ypol epsilon ( ) pol B ≤2 ≤0,05 Shcherbakova et al. 2003 Tabel 1: Viser enkelt-base fejlrater for udvalgte TLS-polymeraser (TLS) og replikative polymeraser (rep.). ’hpol’ henviser til humane polymeraser, og ’ypol’ henviser til polymeraser fundet i gær. Indel: Indersion/deletion. Polymerasernes fejlrate findes blandt andet ud fra antallet af en given type mutation i forhold til det totale antal mutanter samt mutationsfrekvensen. For flere detaljer om udregning af fejlrater, se Zhong et al. 2006. Replikative polymeraser griber om DNA-templaten med tommelfinger-domænet, der har kontakt til DNA minor groove og med finger-domænerne, der ligger over baseparret samt med ’håndflade’-domænet, som er enzymets aktive site [Nair et al. 2004]. Y-familiernes tommel- og finger-domæner er dog små og stumpede, hvilket betyder, at de har et løst greb om DNA-templaten og væsentligt lavere processivitet end replikative polymeraser [Ling et al. 2001, Trincao et al. 2001, Silvian et al. 2001]. Processiviteten af en polymerase henviser til, hvor mange nukleotider den indsætter, før den dissocierer væk fra template [reviewed i Kelman 1998]. Y-familien har yderligere et lillefinger-domæne eller PAD-domæne (polymerase accessory domain), der kontakter læsionen på template-strengen [Ling et al. 2001, Silvian et al. 2001, Trincao et al. 2001]. PAD-domænet er formentligt involveret i læsion-specificitet, der definerer, hvilke typer læsioner polymerasen bypasser, og dermed hvilket mutationsspektrum den genererer [Boudsocq et al. 2004]. Humane celler besidder fem kendte TLS-polymeraser: kappa, iota, eta, zeta og Rev1 [reviewed i Waters et al. 2009], og for nyligt er der fundet to andre eukaryote DNA polymeraser med lav fidelitet, der menes at udføre TLS: pol nu [Arana et al. 2007, Takata et al. 2006] og pol theta [Seki et al. 2003, Seki og Wood 2008]. E.coli har to TLS-polymeraser (pol II og pol IV) [reviewed i Sutton 2010] og S. cerevisiae har tre TLS-polymeraser (zeta, eta og Rev1) [Morrison et al. 1989, Nelson et al. 1996b, Johnson et al. 1999, Nelson et al. 1996a]. Funktionen af alle polymeraserne er opsummeret i Tabel 2.

20

Tabel 2: Tabellen viser alle kendte polymeraser i E.coli, S. cerevisiae og H. sapiens [Sutton 2010].

Navn Familie Biologisk funktion(er) E.coli

Pol I A DNA replikation, modning af Okazaki fragmenter, DNA reparation

Pol II B TLS

Pol III C DNA replikation og reparation

Pol IV Y TLS, formodet involveret i DNA-skade checkpoint kontrol

Pol V Y TLS S. cerevisiae Pol gamma (γ) A Mitokondriel DNA replikation

Pol alpha (α) B Priming i nuklear DNA replikation

Pol delta (δ) B Nuklear DNA replikation

Pol epsilon (ɛ) B Nuklear DNA replikation

Pol zeta (ζ) B TLS

Pol IV (λ) X Non-homologous end joining), base excision repair

Pol eta (η) Y TLS

Rev1 Y TLS H. sapiens

Pol gamma (γ) A Mitokondriel DNA replikation

Pol theta (θ) A TLS, base excision repair

Pol nu (ν) A DNA reparation, TLS

Pol alpha (α) B Priming af nuklear DNA replikation

Pol delta (δ) B Nuklear DNA replikation

Pol epsilon (ɛ) B Nuklear DNA replikation

Pol zeta (ζ) B TLS, somatisk hypermutation

Pol beta (β) X Base excision repair

Pol lamda (λ) X Non-homologous end joining

Pol mu (µ) X Non-homologous end joining

Pol eta (η) Y TLS, somatisk hypermutation, rekombination

Pol iota (ι) Y TLS, somatisk hypermutation, base excision repair

Pol kappa (κ) Y TLS, nucleotide excision repair

Rev1 Y TLS, somatisk hypermutation

21

2.1.3 TLS involverer enten én eller to TLS-polymeraser

TLS-polymeraserne indsætter som sagt én eller flere baser overfor en læsion for at bypasse denne. I nogle tilfælde involverer en TLS-event dog to TLS-polymeraser, hvor den første polymerase bypasser læsionen og den næste polymerase forlænger strengen [reviewed i Chang og Cimprich 2009]. Man har længe antaget, at nogle TLS-events involverer mere end én TLS-polymerase, fordi nogle TLS-polymeraser er bedst til at syntetisere over skader, men ikke kan forlænge strengen efter skaden [Prakash og Prakash 2002]. Andre TLS-polymeraser er derimod bedst til at forlænge, når skaden er forbigået af en anden TLS-polymerase [Prakash og Prakash 2002]. Forlængelse af strengen er et meget vigtigt trin i en TLS-event, så læsionen ikke opdages af den replikative polymerases proofreading aktivitet, der er sensitivt overfor forstyrrelser i DNA-helixen [Fujii og Fuchs 2007]. Et nyt studie verificerer to-polymerase-modellen, idet det med stor sikkerhed viser, at flere læsioner kræver to TLS-polymeraser for at blive bypasset [Shachar et al. 2009]. Shachar et al. (2009) anvendte et nyt kvantitativt TLS-assay i mammale celler, hvor de selekterede for celler, der kunne udfylde et ssDNA hul i et plasmid. Gruppen viste, at benzo[a]pyrene-guanin, der er en tobaksrygnings-induceret læsion, kræver både polymerase kappa og zeta for at blive passeret og for at replikationen kan fuldendes [Shachar et al. 2009]. Yderligere viste de, at cisplatin-GG læsioner kræver både pol eta og zeta for at blive bypasset [Shachar et al. 2009]. Det er også vist i gær, at replikation forbi AP-sites - hvor basen mangler på sukker-fosfat rygraden i DNA’et - kræver både pol eta og zeta [Yuan et al. 2000]. Dog menes det, at pol zeta godt kan bypasse nogle læsioner alene, fordi den både er god til at passere selve læsionen samt forlænge strengen [Prakash og Prakash 2002, Zhong et al. 2006].

2.1.4 Hvornår i cellecyklus sker TLS?

Selv om mange antager, at TLS foregår direkte på replikationsgaflen, er det endnu uvist, om TLS sker øjeblikkeligt under replikationen eller først efter endt replikation [reviewed i Sutton 2010]. Nogle studier peger på, at TLS-events foregår øjeblikkeligt under replikationen, direkte ved stallede replikationsgafler (se Figur 1A). Formålet er her at genstarte stallede replikationsgafler [reviewed i Waters et al. 2009]. En øjeblikkelig TLS-event kræver, at der sker en udskiftning af den replikative polymerase med en TLS-polymerase direkte på replikationsgaflen (polymerase switching). I S. cerevisiae er det vist, at den replikative delta (pol delta) skiftes ud med TLS pol eta ved stallede replikationsgafler, og at udskiftningen kræver stalling af det replikative holoenzym bestående af pol delta og PCNA [Zhuang et al. 2008]. Dette viser, at TLS-eventen sker under selve replikationen direkte på stallede replikationsgafler [Zhuang et al. 2008].

22

Figur 1: To modeller for TLS, der ikke udelukker hinanden: (A) Polymerasemodellen, hvor den replikative polymerase skal udskiftes med en TLS polymerase direkte på replikationsgaflen. TLS-polymerasenlappen, hvorefter den replikative polymerase overtagerreplikat ivt, hvor en TLS polymerase formentligtanden TLS polymerase forlænger lappen.PCNA loader og fastholder polymeraser til DNAgap-filling processen, hvor PCNA primært er involveret i DNAstrengen i S-fase. Oftest vil den forlængende TLS polymerase (translæsion polymerase 2) være pol zeta [Shachar et al. 2009]. [F

: To modeller for TLS, der ikke udelukker hinanden: (A) Polymerasemodellen, hvor den replikative polymerase skal udskiftes med en TLS polymerase direkte på

polymerasen bypasser skaden, og en anden TLS polymerase forlænger , hvorefter den replikative polymerase overtager. (B) Gap-filling modellenivt, hvor en TLS polymerase formentligt loades på hullet, bypasser

ase forlænger lappen. 9-1-1 komplekset er en alternativ klemmeloader og fastholder polymeraser til DNA-strengen. 9-1-1 tænkes dog at være involveret

filling processen, hvor PCNA primært er involveret i DNA-replikation direkte på DNOftest vil den forlængende TLS polymerase (translæsion polymerase 2) være

[Figur fra Waters et al. 2009].

: To modeller for TLS, der ikke udelukker hinanden: (A) Polymerase-switching

modellen, hvor den replikative polymerase skal udskiftes med en TLS polymerase direkte på og en anden TLS polymerase forlænger

filling modellen sker post-r skaden og hvor en

1 komplekset er en alternativ klemme, der ligesom 1 tænkes dog at være involveret i

replikation direkte på DNA-Oftest vil den forlængende TLS polymerase (translæsion polymerase 2) være

23

Andre studier tyder på, at TLS også kan ske efter replikationen, hvor formålet ikke er at genstarte replikations-maskineriet, men at udfylde ssDNA-huller i den nye DNA-streng. Disse huller opstår formentligt på grund af, at DNA replikationsenzymerne er blevet koblet på en ny primer (re-primet) længere nedstrøms for en uoverkommelig læsion [Lopes et al. 2006]. Modellen kaldes hulfyldnings-modellen (gap-filling modellen), og den antager, at huller både på leading og lagging streng udfyldes efter replikationen [Lopes et al. 2006, reviewed i Waters et al. 2009], se Figur 1B. Modellen baseres på Rupp og Howard-Flanders opdagelse af, at der findes ssDNA-huller efter replikationen i E. coli [Rupp og Howard-Flanders 1968]. I S. cerevisiae er der blevet observeret store huller på flere hundrede nukleotider på DNA-strengen efter cellerne har været udsat for UV-lys. Hullerne eksisterer helt indtil G2-fase og ses både på leading og lagging strengene langt efter replikationsgaflerne [Lopes et al. 2006]. Hulfyldnings-modellen støttes endvidere af, at Rev1 mRNA primært er til stede i G2/M-fase af cellecyklus, hvilket indikerer, at Rev1 primært virker uden for S-fase [Waters og Walker 2006]. Yderligere er det vist i E. coli, at replikationen kan genstartes på leading strengen nedstrøms for en uoverkommelig læsion, fordi primasen på lagging strengen kan re-prime både leading og lacking strengene [Heller og Marians 2006]. Endvidere er det vist, at TLS-pol zeta syntetiserer forbi svære fotoprodukter efter at replikationen er fuldendt i museembryo fibroblaster, bl.a. (6-4) pyrimidine-pyrimidine fotoprodukter [Jansen et al. 2009]. Disse forsøg tyder på, at pol zeta er involveret i et sent S-fase/G2-fase TLS-respons. I lyset af forskningen, som både viser et øjeblikkeligt TLS, der er koblet til replikationen samt et hulfyldnings-TLS, antages det, at begge dele sker. Om TLS sker øjeblikkeligt eller udfylder huller i sen S-fase/G2-fase afhænger formodentligt af læsionens natur, hvor læsionen befinder sig, og hvornår i cellecyklus den forekommer [reviewed i Waters et al. 2009].

2.1.5 Template switching

Udover TLS kan cellen benytte sig af nogle andre mekanismer til at bypasse læsioner med, kaldet template switching, der i modsætning til mange TLS-events er fejlfrie. Der er blevet foreslået to forskellige måder, hvorpå template switching kan ske: 1) Via en regression af replikationsgaflen, hvor den nysyntetiserede streng på lacking-strengen bruges som template, kaldet chicken-foot modellen [reviewed i Chang og Cimprich 2009]. 2) Eller via en form for template switching, der minder om homolog rekombination, hvor søsterkromatidet invaderes med efterfølgende opløsning af Holliday junctions, [reviewed i Chang og Cimprich 2009, reviewed i West 2003] se Figur 2. De fejlfrie template switching mekanismer kan dog kun foregå i S- og G2-fasen, hvor søsterkromatidet er til stede [reviewed i West 2003]. Der er stadig usikkerhed om, hvorvidt template switching sker via chicken-foot modellen eller via rekombination. Men forsøg tyder på, at begge dele forekommer [Zhang og Lawrence 2005, reviewed i Chang og Cimprich 2009]. Om en læsion bypasses af TLS-systemet eller via template switching afhænger af konformationen PCNA. Denne mekanisme beskrives nærmere i næste afsnit.

24

Figur 2: Ud over TLS kan cellen anvende template switching til at opløse stallede replikationsgafler. Template switching er dog altid, i modsætning til TLS, fejlfri. Den blå cirkel på den øverste template-streng repræsenterer en replikations-blokkerende skade. Til venstre ses en rekombinations-event: Søster kromatid invasion, efterfulgt af syntese og Holliday junction-opløsning. Til højre ses en template switching event, der foregår via chicken-foot modellen: Gaffel-regression efterfulgt af annealing med nascerende streng fra det nye søsterkromatid (lacking strand), der anvendes som template. Denne model kræver samtidig unwinding og annealing af de to nye syntetiserede DNA-strenge og syntese over sekvensen, hvor læsionen befinder sig. Yderligere kræver det unwinding af det nye dupleks, således at de nye strenge kan anneale med deres originale templates igen og genoprette gaflens rigtige konformation [Wang 2001, Andersen et al. 2008 og Chang og Cimprich 2009].

Rekombination Chicken-foot modellen

25

2.1.6 PCNA rekrutterer TLS-polymeraser til læsioner

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) er det eukaryote protein, der loader og fastholder DNA-polymeraser til DNA-strengen under replikationen. Flere forsøg tyder på, at en TLS-event igangsættes og reguleres af PCNA. Som respons til DNA-skade i både gær og humane celler mono-ubiquitineres PCNA på Lysin 164 (K164), hvilket rekrutterer TLS-polymeraserne til skaden [Frampton et al. 2006, Hoege et al. 2002, Stelter og Ulrich 2003, Kannouche et al., 2004]. Mono-ubiquitineringen udføres af Rad6 og Rad18, der rekrutteres til replikationsgaflen som følge af blottet ssDNA [Bailly et al. 1997]. ssDNA forekommer, når helikasen fortsætter med at vikle DNA-dobbelthelixen ud, selv om den replikative polymerase er stoppet ved en læsion [Chang et al. 2006]. Eukaryote Y-familie polymeraser har to konserverede ubiquitin bindingsmotifer, som gør, at de kan binde til PCNA [Bienko et al. 2005]. Y-familie polymeraser har en større affinitet for mono-ubiquitineret PCNA end til ikke-ubiquitineret PCNA, hvilket støtter antagelsen om, at PCNA regulerer TLS-responset [Bi et al. 2006, Watanabe et al. 2004, Bienko et al. 2005, Guo et al. 2006b]. For eksempel er det vist, at binding til PCNA er essentiel for pol etas funktion i TLS, da mutationer i PCNA-bindingsmotivet gør pol eta ufunktionel in vivo [Haracska et al. 2001a]. Pol zeta har dog ingen PCNA-bindingssites, men enzymets katalytiske subunit, Rev3, kan interagere med Rev1 [Acharya et al. 2006, Guo et al. 2003], der kan binde til PCNA in vitro og in vivo [Guo et al. 2006a]. På den måde kan pol zeta interagere med PCNA igennem Rev1. Det er yderligere vist, at mono-ubiquitinering af PCNA forøger interaktionen mellem Rev1 og PCNA [Guo et al. 2006a], hvilket støtter antagelsen om, at Rev1 er hjælpeprotein for pol zeta under et TLS-respons. Efter mono-ubiquitineringen kan flere ubiquitin-molekyler blive sat på PCNA, hvilket aktiverer den føromtalte fejlfrie måde at bypasse læsioner på, kaldet template switching, se Figur 3 [Chiu et al. 2006, Hoege et al. 2002]. Denne såkaldte poly-ubiquitinering af PCNA udføres af et E2 ubiquitin-konjugerede enzym Mms2-Ubc13 (en heterodimer af Mms2 og Ubc13) og af E3 ligasen Rad5 [Hoege et al. 2002]. Fjernelsen af mono-ubiquitineringen fra PCNA er i S. cerevisiae vigtig, for at den normale replikation kan genoptages af den replikative polymerase, pol delta [Zhuang et al. 2008]. I humane celler kan enzymet USP1 deubiquitinere PCNA [Huang et al. 2006], og således hæmme aktivering af TLS-polymeraserne via PCNA. Et lignende de-ubiquitineringsenzym mangler dog at blive identificeret i gær.

26

Figur 3: Ved genotoksisk stress rekrutterer TLS- polymeraserne conjugerende enzymer, og Rad18 og Rdeubiquitinerings-enzym, der endnu ikke er identificeret i poly-ubiquitineres i K63-forbundne kæder, hvilket promoverer med hjælp fra helikase-aktiviteten af Rad5. Hverken monoPCNA til nedbrydning [figur modificeret fra Chan og Cimpri I S. cerevisiae tyder det dog på, at Rev1 også kan virkepolymeraser under et TLS-respons ligesom PCNA [Friedberg 2006, Guo et al. 2004]. Det er vist, at replikationsgaflen, selv uden afhængig af PCNA-binding [Acharya forsøg i mammale celler på, at Rev1 er vigtig i det øjeblikkelige TLkun er vigtig i den postreplikative 2008]. Herunder gives en indføring i funktionen og aktiviteten af de tre kendte polymeraser i S. cerevisiae, hvilket er af størst interesse for

2.1.7 TLS-polymeraser i S.

2.1.7.1 Polymerase eta

S. cerevisiae pol eta (kodet af nukleotider, den indsætter, når den kopierer uskadet DNA McCulloch et al. 2007]. Pol eta reparerer dog(T^T ) fejlfrit in vitro [Johnson dimerer, og det tyder på, at polovertager [Washington et al. understøttes af forsøg, der viser, at pol etas processivitet er meget lav1999, McCulloch et al. 2004bprimære funktion er at reparere fotoprodukter genereret af UVmutagenesen, formentligt fordi fotoprodukter ikke længere kan

isk stress mono-ubiquitineres PCNA på Lysin 164 polymeraserne til replikationsgaflen. Rad6 og Ubc13-Mms2 er E2 ubiquitin

conjugerende enzymer, og Rad18 og Rad5 er E3 ubiquitin ligaser. USP1 erenzym, der endnu ikke er identificeret i gær. Mono-ubiquti

forbundne kæder, hvilket promoverer template switchingaktiviteten af Rad5. Hverken mono- eller polyubiqutineringen mærker

PCNA til nedbrydning [figur modificeret fra Chan og Cimpri ch 2009].

tyder det dog på, at Rev1 også kan virke som en platform for forskellige respons ligesom PCNA [Friedberg et al. 2005b,

Det er vist, at Rev1-pol zeta komplekset har at PCNA er mono-ubiquitineret, mens pol etas adgang er mere

binding [Acharya et al. 2006, Watanabe et al. 2004forsøg i mammale celler på, at Rev1 er vigtig i det øjeblikkelige TLS-respons,

vigtig i den postreplikative gap-filling mekanisme i mammale celler Herunder gives en indføring i funktionen og aktiviteten af de tre kendte polymeraser i

, hvilket er af størst interesse for dette speciale.

polymeraser i S. cerevisiae

(kodet af rad30 genet) syntetiserer overordnet 1når den kopierer uskadet DNA in vitro [Washington

Pol eta reparerer dog thymin-thymin cyclobutan[Johnson et al. 1999]. Pol etas kognate læsion siges derfor at være T^T

at pol eta syntetiserer henover T^T, hvorefter andre polymeraser 1999, McCulloch et al. 2004a, McCulloch et al.

der viser, at pol etas processivitet er meget lav 2004b]. In vivo-forsøg i S. cerevisiae verificerer ligeledes, at pol etas reparere fotoprodukter genereret af UV-lys og uden pol eta øges

mutagenesen, formentligt fordi fotoprodukter ikke længere kan bypasses fejlfrit

quitineres PCNA på Lysin 164 (K164). Dette

Mms2 er E2 ubiquitin-1 er i humane celler et

ubiquti neret PCNA kan template switching formentligt

eller polyubiqutineringen mærker

som en platform for forskellige 2005b, Acharya et al.

pol zeta komplekset har adgang til , mens pol etas adgang er mere

2004]. Yderligere tyder respons, mens PCNA

i mammale celler [Edmunds et al. Herunder gives en indføring i funktionen og aktiviteten af de tre kendte polymeraser i

syntetiserer overordnet 1 fejl pr. 100-1000 [Washington et al. 1999,

cyclobutan pyrimidin dimerer 1999]. Pol etas kognate læsion siges derfor at være T^T syntetiserer henover T^T, hvorefter andre polymeraser

et al. 2004b]. Dette [Washington et al.

verificerer ligeledes, at pol etas og uden pol eta øges

fejlfrit [McDonald et

al. 1997, Roush et al. 1998]. Dog er der stadig en visprimært bypasser in vivo. Et forsøg i gær viser, at pol eta spiller en afgørende rolle i bypass (6-4) fotoprodukter [Bresson og Fuchs 2002]celler har dog vist, at pol eta formentligt ingen rolle har i bypass af disse skader et al. 2005, Szüts et al. 2008].

Figur 4: Dimerisering mellempyrimidiner er den mest almindelige fotoreaktionnår DNA absorberer UV radiation. De to fotoprodukter, der oftest dannes, er cyclobutanpyrimidin dimerer i cis- syn konfiguration og i omkring 25 % af tilfældfotoprodukter [ Cleaver og MitchellSidstnævnte dannes oftest af tilstødende thymincytosin nukleotider. (6-4) fotoprodukterbetydeligt mere distortive end cyclobutanpyrimidin dimerer, fordi (6 -forårsager en 47° helix bøjning i forhold til en 7° helix bøjning, som cyclobutandimererne forårsager, hvilket betyderfotoprodukterne oftest er dødeligemutagene [Cleaver og Mitchellmodificeret fra Cleaver og Mitchell Korrekt regulering af pol etapigmentosum variant (XP-V) er en genetisk hudsygdom, hvor patienter i høj grad udvikler sol-induceret hudcancer. XP-V paligesom pol eta i S. cerevisiaeJinks-Robertson. 2006, Gibbs anden polymerase, hvis kognate læsion ikke er Tog flere mutationer [Wang et al.

2.1.7.2 Polymerase zeta

Pol zeta er produktet af rev31996]. Rev3 er den katalytiske subunit og Rev7 den regulatoriske [NelsonTidlige forsøg i S. cerevisiaeantimutator fænotype [Lemontt 1971, Lemontt 1972zeta-mutanterne blev identificeretWT-allelen efter udsættelse for UV Flere forsøg har bekræftet, at generne har meget lave mutationsfrekvenserskadende stoffer som 254 nm UV

. Dog er der stadig en vis usikkerhed om, hvilke skader pol eta . Et forsøg i gær viser, at pol eta spiller en afgørende rolle i bypass

[Bresson og Fuchs 2002], se Figur 4. Andre forsøg i gær og i mammale celler har dog vist, at pol eta formentligt ingen rolle har i bypass af disse skader

2008].

mellem to tilstødende

pyrimidiner er den mest almindelige fotoreaktion, når DNA absorberer UV radiation. De to

er oftest dannes, er cyclobutan syn konfiguration og i

omkring 25 % af tilfældene dannes (6-4) Cleaver og Mitchell 2003]. es oftest af tilstødende thymin-

4) fotoprodukter er e end cyclobutan -4) fotoprodukterne

forårsager en 47° helix bøjning i forhold til en 7° cyclobutan pyrimidin

forårsager, hvilket betyder, at (6-4) dødelige i stedet for

Cleaver og Mitchell 2003]. Figur Cleaver og Mitchell 2003.

pol eta er afgørende for integriteten af DNAV) er en genetisk hudsygdom, hvor patienter i høj grad udvikler

V patienter mangler pol eta funktion [Masutani visiae bypasser UV-inducerede T^T relativt fejlfrit [Abdulovic og

Robertson. 2006, Gibbs et al. 2005]. XP-V patienters celler anvender polymerase, hvis kognate læsion ikke er T^T, hvilket øger risikoen for fejlindsættelser

et al. 2007].

rev3 og rev7-generne [Morrison et al. 1989; Lawrence og Hinkle den katalytiske subunit og Rev7 den regulatoriske [Nelson

cerevisiae viste, at gær med mutationer i pol zetafænotype [Lemontt 1971, Lemontt 1972, Lawrence et al. 1985, Quah 1980].

tanterne blev identificeret, fordi de ikke kunne reversere en bestemt markørudsættelse for UV-lys (reversionless, deraf Rev) [Lemontt 1971

Flere forsøg har bekræftet, at S. cerevisiae med loss-of-function mutationer i mutationsfrekvenser, når de behandles med et bredt udvalg af DNA

skadende stoffer som 254 nm UV-lys [Lemontt 1971, Lawrence et al. 1985, Lemontt 1972,

27

usikkerhed om, hvilke skader pol eta . Et forsøg i gær viser, at pol eta spiller en afgørende rolle i bypass af

. Andre forsøg i gær og i mammale celler har dog vist, at pol eta formentligt ingen rolle har i bypass af disse skader in vivo [Gibbs

DNA’et. Xeroderma V) er en genetisk hudsygdom, hvor patienter i høj grad udvikler

funktion [Masutani et al. 1999], der relativt fejlfrit [Abdulovic og

anvender formentligt en T, hvilket øger risikoen for fejlindsættelser

1989; Lawrence og Hinkle den katalytiske subunit og Rev7 den regulatoriske [Nelson et al. 1996b].

pol zeta konstituerer en 1985, Quah 1980]. Pol

en bestemt markør-allel til , deraf Rev) [Lemontt 1971].

mutationer i rev3 eller rev7-, når de behandles med et bredt udvalg af DNA-

1985, Lemontt 1972,

28

Lawrence og Christensen 1976, Lawrence et al. 1984], ioniserende stråling [McKee og Lawrence 1979], 4-NQO [Prakash 1976], EMS [Lemontt 1972, Prakash 1976] samt MMS og N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin [Lawrence et al. 1985]. Baseret på reversion af 16 definerede mutationer er det blevet estimeret, at Rev3s funktion er forudsætning for produktionen af ~98% af alle basepar substitutioner og ~90% af alle frameshifts induceret af UV-lys [Lawrence 2002]. Senere forsøg har vist, at knockout af Rev3 i WT-gærceller resulterer i en antimutator fænotype både i forhold til spontane mutationer [Rasmussen et al. 2003] samt efter udsættelse for MMS [Johnson et al. 2007]. Sakamoto et al. (2007) har yderligere vist, at Rev3 knockout-gær overlever signifikant dårligere end WT efter udsættelse for 10 og 20 J/m2 UV-lys. Dette betyder sammenlagt, at TLS-responset via pol zeta er essentielt for overlevelse i S. cerevisiae, og at pol zeta er involveret i bypass af næsten alle typer skader i gær [Lawrence 2002]. Pol zeta genererer 130 basesubstitutioner pr. 105 syntetiserede nukleotider [Zhong et al. 2006] i modsætning til de replikative B-familie polymeraser, der typisk misinkorporerer under ét nukleotid pr. 105 nukleotider (se Tabel 1). Pol zeta introducerer mange såkaldte komplekse mutationer, ofte en enkelt base frameshift mutation kombineret med efterfølgende basesubstitutioner [Zhong et al. 2006, Abdulovic et al. 2008], hvilket øger dens samlede substitutionsfejlrate. Pol zetas primære funktion er formentlig at forlænge misparrede baser overfor læsioner, der er blevet bypasset af en anden TLS-polymerase [reviewed i Goodman 2002]. Det er vist både i gær og i mammale celler, at pol zeta effektivt forlænger misparrede baser overfor læsioner introduceret af andre TLS-polymeraser, selv om den geometriske forstyrrelse af DNA-strengen er stor [Johnson et al. 2000, Haracska et al. 2001b, Haracska et al. 2003, Prakash og Prakash 2002]. Et in vitro-forsøg i gær viste endvidere, at pol zeta typisk indsætter 1-10 nukleotider og nogle gange op til 40 nukleotider på uskadet DNA, før den dissocierer væk fra DNA-templaten [Stone et al. 2009]. Det tyder på, at pol zeta kan bypasse mange forskellige DNA-læsioner, blandt andet en del bulky adducts, der giver forstyrrelser i dobbelthelixen [Guo et al. 2004, Shachar et al. 2009, reviewed i Rattray og Strathern 2003]. Adskillige cellulære mekanismer arbejder for at holde pol zeta på et lavt niveau [Lawrence 2004], hvilket indikerer, at overekspression kan være meget skadeligt for cellen. Overekspression af pol zeta i S. cerevisiae forårsager for eksempel øget mutagenese efter UV-lys [Rajpal et al. 2000].

29

2.1.7.3 Rev1

Rev1 er ikke en egentlig polymerase, men derimod en transferase, der kan indsætte dCMP overfor G’er eller AP-sites [Nelson et al. 1996a, Haracska et al. 2001b, Haracska et al. 2002]. Flere forsøg peger på, at Rev1s rolle i TLS ikke er katalytisk, men oftest regulativ [reviewed i Lehmann et al. 2007, Nelson et al. 2000]. Det er vist, at C-terminalen i mammale Rev1 kan binde til alle kendte Y-polymeraser [Ohashi et al. 2004 (human), Tissier et al. 2004, Guo et al. 2003]. Rev1 kan binde til ssDNA, primer-ender [Masuda og Kamiya 2006] samt den regulatoriske subunit (Rev7) af pol zeta [Murakumo et al. 2001 (humane celler), Acharya et al. 2005 (gær)]. Dette indikerer, at Rev1 lokaliserer specifikke TLS-polymeraser til stallede replikationsgafler [Friedberg 2005b, Tissier et al. 2004]. Yderligere stimulerer interaktion mellem Rev3 og Rev1 aktiviteten af pol zeta til at forlænge mismatchede primer-ender og til at bypasse specifikke mutationer [Acharya et al. 2006, Guo et al. 2004]. Andre forsøg viser yderligere, at pol zeta/Rev1 enzymkomplekset står for introduktionen af 50-70% af de spontane DNA mutationer i S. cerevisiae [Lawrence og Maher 2001]. Det er vist i in vivo-forsøg i mammale celler, at Rev1 ligeledes er essentiel for, at blandt andet pol zeta syntetiserer i den rigtige læseramme (in frame) på DNA-templaten [Szüts et al. 2008]. Gruppen konstruerede nul-mutanter af Rev1 i mammale celler, der genererede +1 frameshift-mutationer efter at have bypasset (6-4) fotoprodukter, som højst sandsynligt bypasses af pol zeta i disse celler. Cellelinjen med funktionelle Rev1-proteiner genererede ikke disse fejl, og derfor peger forsøgene på, at Rev1 er essentiel for, at pol zeta ikke skrider på templaten [Szüts et al. 2008].

2.1.8 TLS-polymeraser med overlappende funktionalitet

Endnu er det relativt uvist, præcis hvilke skader de bestemte TLS-polymeraser er ansvarlige for at bypasse, idet der synes at være et overlap i funktionalitet mellem nogle polymeraser [Bresson og Fuchs 2002, Gibbs et al. 2005, Szüts et al. 2008]. Forsøg udført af Abdulovic og Jinks-Robertson (2006) antyder, at der findes et hierarki mellem de forskellige polymeraser, som gør, at cellen anvender polymeraserne afhængigt af, hvor stor graden af DNA-skade er og altså ikke afhængigt af typen af skader [Abdulovic og Jinks-Robertson 2006]. I et in vivo deletionsforsøg med rev3, rad30 og en dobbeltmutant, rev3rad30, der blev udsat for UV-induceret mutagenese, viste det sig, at bidraget til mutationsfrekvensen fra henholdsvist pol zeta og pol eta var dosis-afhængig [Abdulovic og Jinks-Robertson 2006]. Pol zeta var vigtigst for overlevelse ved lave UV-doser (under 20 J/m2), hvor Rad30∆-mutanten overlevede på højde med WT. Ved højere doser af UV-bestråling (40-80 J/m2) overlevede Rad30∆-mutanten dog dårligere end Rev3∆-mutanten, hvilket viser, at pol eta her var vigtigst for overlevelsen [Abdulovic og Jinks-Robertson 2006]. Deletions-forsøget tydede yderligere på, at der var et overlap af funktionalitet mellem pol eta og pol zeta i området fra 20-40 J/m2 [Abdulovic og Jinks-Robertson 2006]. Lis et al. (2008) har ligeledes fundet indikationer på, at der findes et hierarki mellem polymeraserne, hvor brugen af polymerasen primært afhænger af, hvor potent det DNA-skadende stof er til at stoppe replikationen via pol delta og epsilon

30

[Lis et al. 2008]. Forsøgene viste, at UV- og MMS-inducerede skader er mere potente replikations-blokere end for eksempel EMS [Lis et al. 2008]. Dette tyder på, at det er graden af stress på genomet, der aktiverer en bestemt polymerase, og ikke specificiteten af læsionerne [Lis et al. 2008].

2.1.9 TLS og dNTP ubalance

En balanceret tilførsel af deoxynukleosidtrifosfat (dNTP) er afgørende for DNA-repair og replikation [Ke et al. 2005, Reichard 1988]. Øget fejlagtigt bypass af DNA-læsioner er blevet foreslået at forekomme ved ubalance i dNTP-poolen [Meuth 1989]. Chabes et al. (2003) har vist, at dNTP-poolen i S. cerevisiae behandlet med 4-NQO, MMS og UV-lys øges 6-8 gange sammenlignet med dNTP-niveauerne i ubehandlede kontroller [Chabes et al. 2003]. Chabes et al. (2003) viste dog også, at selv om de forhøjede dNTP-pools fører til bedre overlevelse, er det på bekostning af en fordobling af mutationsfrekvensen i forhold til WT [Chabes et al. 2003], hvilket kunne tyde på øget fejlagtigt TLS. Denne hypotese understøttes endvidere af, at pol eta kræver op til 10 gange højere koncentration af dNTP’er in vitro for effektivt at indsætte et nukleotid overfor en læsion end den replikative DNA-polymerase epsilon behøver for at indsætte et nukleotid overfor uskadet DNA [Chabes et al. 2003, Haracska et al. 2001b]. Dette er målt ud fra polymerasens affinitet for at indsætte de fire nukleotider overfor en bestemt base i DNA’et. For eksempel har den replikative polymerase epsilon en Km-værdi på 0,28 µM for at binde dCTP overfor et uskadet dG [Shimizu et al. 2002], mens TLS-pol etas affinitet for at binde et dCTP overfor en γ-hydroxypropanodeoxyguanosin læsion er væsentlig mindre (Km = 2.0 µM), og derved kræver cirka syv gange højere substratkoncentration [Minko et al. 2002]. Dette indikerer, at koncentrationen af dNTP’er skal være forhøjet, før pol eta kan bypasse en læsion. Samme tendens gælder for pol zeta. Se Tabel 3 for disse og flere Km -værdier. polymerase Event (det indsatte nukleotid - template) Km-værdi kilde epsilon dCTP-dG 0,28 µM Shimizu et al. 2002 eta dCTP-dG 0,19 µM Minko et al., 2002 eta dCTP- γ-hydroxypropanodeoxyguanosin 2,0 µM Minko et al., 2002 eta dCTP- O6-methylguanin 5.1 µM Haracska et al. 2001b eta dATP-dT 0,48 µM Johnson et al. 2001 eta dATP-dT på 3’enden af et T^T fotoprodukt 180 µM Johnson et al. 2001 zeta dATP-dT 0,39 µM Johnson et al. 2003 zeta dATP-Thymin glycol 2,2 µM Johnson et al. 2003

Tabel 3 viser forskellige km-værdier in vitro for TLS pol eta, epsilon og zeta. Jo højere dNTP-poolen er, jo mere fejlagtigt og dermed mutagent vil TLS-responset ud fra denne hypotese blive. Polymerasernes affinitet for deres substrat er dog ikke undersøgt med accessory-proteiner som for eksempel PCNA og Rev1, hvilket formentligt vil ændre værdierne. Men tallene tyder kraftigt på, at pol eta behøver en højere dNTP-pool for at

31

indsætte et nukleotid overfor en beskadiget nukleotid i DNA-strengen, end hvis den skal inkorporere et nukleotid overfor et intakt nukleotid. In vitro-forsøgene tyder derfor på, at TLS-polymerasernes affinitet for læsionerne til dels reguleres af dNTP-niveauet i cellen [Chabes et al. 2003]. I delende celler syntetiseres dNTP’er primært via de novo reduktionen af ribonukleotider, hvilket udføres af det cytosoliske enzym ribonukleotid reduktase (RNR) [Reichard et al. 1961], se Figur 5. RNR har et aktivt site samt to regulatoriske allosteriske sites. Det ene allosteriske site regulerer aktiviteten via dATP/ATP forholdet, hvor ATP-binding aktiverer RNR, og dATP-binding hæmmer enzymet [Reichard et al., 2000, Nordlund og Reichard 2006]. Det andet allosteriske site regulerer enzymspecificiteten, som styres af koncentrationen af de fire dNTP’er indbyrdes [reviewed i Nordlund og Reichard 2006]. Se også Figur 5 for flere detaljer omkring RNR’s regulatoriske sites.

Figur 5: RNR har et aktivt site og to allosteriske (regulatoriske) sites. I det aktive site konverteres ribonukleotiderne (UDP, CDP, ADP og GDP) til dNTP’er. Det ene allosteriske site (øverst på figuren) kan detektere cellens dATP/ATP forhold. RNR aktiveres, når ATP bindes, og hæmmes, når dATP bindes [se Nordlund og Reichard 2006]. Enzymaktiviteten hæmmes derfor i takt med at dATP-koncentrationen, og dermed de øvrige dNTP’er, stiger. Det andet allosteriske site regulerer, hvilken af de fire dNTP’er, der skal syntetiseres, og regulerer dermed forholdet mellem de fire dNTP’er. A = når dATP eller ATP bindes i det allosteriske site accepterer enzymet UDP og CDP i det katalytiske site; B = når dGTP bindes i det allosteriske site accepteres ADP i det katalytiske site; C = når dTTP er bundet i det allosteriske site bindes GDP i det katalytiske site.

32

RNR kan aktiveres af DNA-læsioner og af blokerede replikationsgafler. Blokerede replikationsgafler og DNA-skader starter en fosforyleringskaskade, der initieres af proteinkinaserne Mec1 og Rad53 [Allen et al. 1994, Weinert et al. 1994, Paulovich og Hartwell 1995], se Figur 6. Dette stopper progressionen af cellecyklus [reviewed i Lambert og Carr 2005]. Mec1 rekrutteres til stallede replikationsgafler og til DNA-læsioner, hvor kinasen fosforylerer Rad53, som derefter fosforylerer og inaktiverer RNRs hæmmere, Crt1 og Sml1. Det betyder, at DNA-skader, der initierer et Rad53-afhængigt checkpoint, aktiverer RNR ved at inaktivere enzymets hæmmere. Dermed øges dNTP-poolen i cellen. dNTP-poolen reguleres herefter af feedbackmekanismen fra dATP/ATP [Reichard et al. 2000, Chabes et al. 2003].

Figur 6: Ved DNA-skade eller replikationsblokade aktiveres det Rad53-medierede intra-S checkpoint. Checkpointet stopper cellecyklus-progression og aktiverer RNR ved at fosforylere RNRs hæmmere. Dermed stiger mængden af dNTP’er, hvilket faciliterer DNA reparation. Sml1 nedbrydes under S-fase og i celler, der udsættes for genotoksisk stress som følge af check-point fosforyleringskaskaden [Zhao et al. 2001]. Crt1 hæmmer transkriptionen af tre ud af fire af RNR-generne i S. cerevisiae, men ved DNA-skade og replikationsgaffel-blokade fosforyleres og falder Crt1 fra RNR-promoterne [Huang et al. 1998], [Figur fra Koc og Merril 2007]. Det er vist, at behandling med hydroxyurea, der hæmmer udvidelsen af dNTP-poolen, giver ubalance i dNTP-poolen og er mutagent [Snyder 1988]. Det er vist i S. cerevisiae, at udsættelse for DNA-skadende stoffer resulterer i en forskydning af de fire dNTP’er sammenlignet med dNTP-pools i ubehandlede celler [Chabes et al. 2003]. Ubalancer i de fire indbyrdes dNTP-koncentrationer forstyrrer replikationen, øger mutagenesen og inducerer base-substitutioner og frameshift-mutationer [Meuth 1989, Bebenek og Kunkel 1990]. Yderligere forårsager ubalance i dNTP-pools forsinkelse af DNA replikationsgaflen, hvilket

33

øger risikoen for skrøbelige sites på kromosomerne, som kan udmønte sig i kromosomale omrokeringer, knæk og tab [Ke et al. 2005, Jacky et al. 1983, Golos og Malec 1991]. S. cerevisiae rho0-celler har lavere dNTP-pools end WT efter udsættelse for MMS [Ge og Ye 2009 upubliceret], hvorfor det antages, at mangel på det mitokondrielle genom per se hæmmer dNTP-pool-udvidelsen efter DNA-skade [Desler et al. 2007, Desler et al. 2010 (se også Bilag 4)].

2.1.10 Mitokondrier og dNTP

Mutationer i mtDNA kan være patogene og anses som en biomarkør for udvikling af cancer [Modica-Napolitano og Singh 2002, Modica-Napolitano og Singh 2004]. Somatiske- og kimcelle-mutationer i gener involveret i både Krebs cyklus og oxidativ fosforylering er således blevet identificeret i flere cancer-former [Tomlinson et al. 2002, Selak et al. 2005, Pollard et al. 2005]. mtDNA i mammale celler indeholder ingen introns og er ikke viklet om histoner, og dette sammenholdt med den store udsættelse for ROS produceret i oxidativ fosforylering gør, at mutationsfrekvensen i mtDNA er ti gange højere end i nDNA [Grossman and Shoubridge 1996; reviewed i Johns 1995]. Mutationer i mtDNA kan betyde tab af funktion af de subunits i elektron transportkæden (electric transport chain, ETC), som mtDNA’et koder for. Det kan ødelægge funktionen af ETC og svække den elektrokemiske gradient, der driver ATP-produktionen gennem ATP-synthasen (kompleks V). Bestemte mutationer i nDNA kan ligeledes føre til tab af funktionen af ETC, idet nDNA koder for gener involveret i oxidativ fosforylering [DiMauro og Schon 2003]. Ødelæggelsen af den elektrokemiske gradient kan betyde, at mitokondrielt lokaliserede enzymer, hvis funktion og lokalisering til mitokondrierne er afhængige af et intakt membranpotentiale, mister deres funktion [Rawls et al. 2000, Boveris et al. 2006, Valdez et al. 2006], se Figur 7. I tråd med dette er det blevet foreslået, at mitokondrielt lokaliserede enzymer, som er involveret i purin- og pyrimidin-syntesen, hæmmes af et faldende membranpotentiale [reviewed i Desler et al. 2010]. Ligeledes bevirker et reduceret membranpotentiale sandsynligvis, at signalmolekylet nitrogen monooxid (NO) hæmmer ribonukleotid reduktasen, så dNTP-niveauet falder [reviewed i Desler et al. 2010]. En anden sammenhæng mellem mitokondriel dysfunktion og faldende dNTP-pools kan skyldes, at ødelæggelsen af ETC betyder, at ATP-mængden falder [Desler et al. 2007 (humane celler), Chen og Clark-Walker 1999 (gær)]. Et fald i ATP-mængden vil formentligt forstyrre feedbackmekanismen i RNR-enzymerne og ændre dNTP-poolen. Desler et al. (2007) har vist, at humane HeLa rho0-celler og rho0-celler fra brystcancer cellelinjen MDAMB435 udviser ubalancerede dNTP-pools og kromosomale omrokeringer sammenlignet med deres parentiale cellelinjer [Desler et al. 2007]. Den største forskel sås i dTTP-poolen, hvor der blev målt en 3 gange reduktion i forhold til normalen, når der normaliseredes til antal celler i S-fase [Desler et al. 2007].

34

Forsøg med S. cerevisiae viste ligeledes, at rho0-gær havde ubalancerede dNTP-pools og et generelt lavere niveau af dNTP-pools i forhold til WT [Ge og Ye 2009 upubliceret].

Figur 7: Mitokondrier er omsluttet af en dobbeltmembran, hvor elektron transportkæden (ETC) sørger for at opretholde en elektrokemisk gradient mellem inter-membran rummet og det mitokondrielle matrix. Mitokondrier indeholder deres eget genom (mtDNA), som koder for 37 gener af hvilke 13 koder for polypeptider, der er afgørende for funktionen af ETC [Wallace 1999; DiMauro og Schon 2003]. Resten af de mitokondrielle gener koder for to ribosomale og 22 transfer RNAs, som er nødvendige for syntesen af de mitokondrielt kodede ETC enzymer [Anderson et al. 1981]. Forsøg med rho0-gær har yderligere vist, at mangel på mtDNA fører til øgede spontane mutationsfrekvenser i nDNA i forhold til WT, samt langt højere resistens overfor det oxiderende stof 4-NQO end WT [Rasmussen et al. 2003]. Disse forsøg indikerer tilsammen, at mitokondriel dysfunktion forårsager ubalance i dNTP-poolen [Desler et al. 2007], og at mitokondriel dysfunktion giver øgede nDNA-mutationsfrekvenser, der formentligt involverer TLS-systemet [Rasmussen et al. 2003]. Teorien antyder, at der er et muligt link mellem mitokondriel dysfunktion og TLS, der formentligt reguleres af cellens dNTP-pool, hvilket er fokus for dette speciales empiri.

2.1.11 Teoretisk introduktion til mutationsspektrum-forsøg

For at undersøge pol zetas rolle i rho0-celler anvendes en pol zeta mutant i mutationsspektrum-forsøgene (se også metoder). Mutanten har en aminosyresubstitution i position 979 i det katalytiske Rev3 domæne (L979F), som gør pol zeta i denne stamme mere fejlagtig end WT pol zeta [Sakamoto et al. 2007]. Rev3-mutant gærstammen, herefter kaldet Rev3-, efterlader en fejl-signatur, hvilket kan detekteres i sekventeringer. Således kan det udledes, om TLS-responset via pol zeta har været aktiveret i en given gærstamme. Der

udføres et mutationsspektrummutationer pol zeta står for i S. Rev3- genererer flere komplekse mutationer, tandem dobbelt mutationer og insertion/deletion loops (indels) end WT både in vivoforsøg [Sakamoto et al. 2007, Stone aktivitet in vivo, idet for eksempel komplekse mutationer med stor sandsynlighed er udført af pol zeta, se Figur 8. Aminosyredenne cellelinje i forhold til WT [Sakamoto

Figur 8: MutationsfrekvenserMutationsfrekvenserne er fundet mutation samt den totale mutationsfrekvens fundet iSakamoto et al. 2007]. Sakamoto et al. (2007) har vist, at fhøjere i Rev3- end i WT efter behandling med UV[Sakamoto et al. 2007]. Komplekse mutationer består af mange tætte basesubstiindels [Sakamoto et al. 2007]. ligeledes mindst 100 gange ved udsættelse for UV lys (20 J/m2) sammenlignet med de spontane mutationsfrekvenser [Sakamoto mutationer er resultatet af mutagent bypass af UV[Sakamoto et al. 2007]. Yderligere har Rev3til T-A transversioner i end WT fænomen er formentligt, at Rev3dG på template i forhold til WT

udføres et mutationsspektrum-forsøg med Rev3--mutanten for at identificmutationer pol zeta står for i S. cerevisiae WT og rho0.

flere komplekse mutationer, tandem dobbelt mutationer og insertion/deletion in vivo i S. cerevisiae efter behandling med UV

2007, Stone et al. 2009]. Derfor kan Rev3- bruges til at spore pol zeta , idet for eksempel komplekse mutationer med stor sandsynlighed er udført af

Aminosyre-substitutionen giver ikke anledning til øget dødelighed i denne cellelinje i forhold til WT [Sakamoto et al. 2007].

Mutationsfrekvenser i S. cerevisiae for WT og Rev3- udsat for 20J/mer fundet både ud fra mutationsspektrummet for le mutationsfrekvens fundet i CAN1r-forsøg [Figuren er m

(2007) har vist, at frekvensen af komplekse mutationer er cirkaend i WT efter behandling med UV-lys, hvilket skyldes mindre korrekt TLS

omplekse mutationer består af mange tætte basesubsti2007]. Frekvensen af indels og komplekse mutationer i Rev3

ligeledes mindst 100 gange ved udsættelse for UV lys (20 J/m2) sammenlignet med de spontane mutationsfrekvenser [Sakamoto et al. 2007]. Dette tyder på, atmutationer er resultatet af mutagent bypass af UV-fotoprodukter, som udføres af pol zeta

2007]. Yderligere har Rev3- en 5-7 gange øget affinitet for at generere end WT efter UV-lys [Sakamoto et al. 2007]. Forklaringen på dette

fænomen er formentligt, at Rev3- pol zeta har en øget affinitet for at indsætte dATP overfor dG på template i forhold til WT in vitro, hvilket netop genererer G-C til T

35

for at identificere, hvilke

flere komplekse mutationer, tandem dobbelt mutationer og insertion/deletion efter behandling med UV-lys og i in vitro-

bruges til at spore pol zeta , idet for eksempel komplekse mutationer med stor sandsynlighed er udført af

substitutionen giver ikke anledning til øget dødelighed i

udsat for 20J/m2 UV-lys.

mutationsspektrummet for den specifikke type [Figuren er modificeret fra

komplekse mutationer er cirka 9 gange lys, hvilket skyldes mindre korrekt TLS

omplekse mutationer består af mange tætte basesubstitutioner og Frekvensen af indels og komplekse mutationer i Rev3- forhøjes

ligeledes mindst 100 gange ved udsættelse for UV lys (20 J/m2) sammenlignet med de 2007]. Dette tyder på, at UV-inducerede

som udføres af pol zeta 7 gange øget affinitet for at generere G-C

2007]. Forklaringen på dette pol zeta har en øget affinitet for at indsætte dATP overfor

C til T-A transversioner

36

[Stone et al. 2009]. I resultatafsnittet vil tandem, indels, komplekse mutationer og G:C til T:A basesubstitutioner derfor primært anses som MMS-inducerede mutationer udført af pol zeta. Sakamoto et al. (2007) har yderligere vist, at Rev3- pol zeta genererer 2-8 gange flere spontane G:C til C:G transversioner end WT in vivo [Sakamoto et al. 2007]. Dette skyldes sandsynligvis, at Rev3- har en øget præference i forhold til WT for at indsætte dGTP overfor dG på template [Stone et al. 2009]. I resultatbehandlingen vil spontane G:C til C:G transversioner derfor regnes for at være resultat af pol zeta aktivitet på lige fod med tandem, indels og komplekse mutationer. Analysen tager derfor udgangspunkt i pol zetas mutationsmønstre fundet i in vitro-forsøg og i forsøg efter behandling med UV-lys. Dog er det meget sandsynligt, at MMS på nogle punkter genererer et andet mutationsspektrum end UV-lys, da pol zeta formentligt bypasser skader forårsaget af MMS anderledes end skader efter UV-lys.

2.2 Materialer og Metoder

2.2.1 Cellestammer og medium

Alle gær-strains anvendt i disse forsøg er afledte af den haploide S. cerevisiae 8C-YUNI101 (MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA) [Pavlov et al. 2001], se Tabel 4. WT, Rev3∆ og Rev3- er venligst doneret af Thomas Kunkel og kolleger. Alle cellelinjerne lagres ved -80ᵒC i 25% (v/v) autoklaveret glycerol i 2ml fryserør (Nunc). Cellerne dyrkes i YPD-medium (Clontech, Medinova Scientific A/S, Denmark) og udplades på YPD- eller YPG-agar (1% Bacto yeast extract (Becton, Dickinson and co.), 2% bacto peptone (Becton, Dickinson and co.), 3% (v/v) glycerol, 2% agar). For at undersøge mutationsspektrene plades cellerne ud på SD/-Arg + 60 µg/ml canavanin (Clontech, Medinova Scientific A/S, Denmark) og de canavanin-resistente kolonier sekventeres. Stamme Genotype Kilde WT MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-

1UAA Pavlov et al. 2001

rho0 MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA + manglende oxidativ fosforylering

Disse forsøg

Rev3∆ MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA + ∆rev3::LEU2 (deletion af rev3)

Pavlov et al. 2001

Rev3∆rho0 MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA + ∆rev3::LEU2 + manglende oxidativ fosforylering

Disse forsøg

Rev3- MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA + aminosyresubstitution L979F i rev3 (resulterer i bestemt mutationsspektrum)

Pavlov et al. 2001

Rev3-rho0 MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3∆bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade 2-1UAA + aminosyresubstitution L979F i rev3 (resulterer i bestemt mutationsspektrum)

Disse forsøg

Tabel 4: Stammer som benyttes i specialet.

37

Cellekoncentrationen bestemmes ved at tælle 50 µl cellekultur i en passende fortynding på en celletæller (CASY model TT, Innovatis). CASY-celletælleren indstilles til ’aggregate on’ således at gærceller, der er lige ved at dele sig, tælles som to celler. Herved bliver målingen af celler/ml mere pålidelig. Cellekulturernes optiske densitet (OD) måles ved 660 nm i et

spektrofotometer (Holm og Halby). Alle celler inkuberes under rystning ved 30◦C og vokser til logaritmisk fase, OD660 ~0,4-0,5.

2.2.2 Fremstilling af rho0

Det mitokondrielle DNA depleteres fra WT, Rev3- og Rev3∆ stammerne, hvilket resulterer i

korresponderende rho0-cellelinjer. Cellerne vokser natten over ved 30◦C og fortyndes derefter

100 gange i nyt YPD-medium tilsat 20µg/ml ethidiumbromid (EtBr), som før beskrevet [Chen og Kaplan 2001]. Cellerne dyrkes i 24 timer og fortyndes igen 100 gange i YPD-medium

tilsat 20µg/ml EtBr. Dette gentages i alt i tre døgn. Hvert døgn plades celler ud på YPD-plader og de resulterende kolonier podes over på nye YPD- og YPG-plader. Rho0 fænotypen verificeres ved dyrkning på YPG-plader, hvor karbonkilden er glycerol, som ikke giver anledning til vækst af rho0-celler, idet glycerol ikke kan indgå i glykolysen. Der laves positive kontroller med WT på YPG-pladerne.

2.2.3 Dapi-farvning

Cellerne farves med DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma) for at verificere genotypen af rho0. DAPI er en blå fluorescerende DNA-farve, som binder til AT-clusters i minor groove på DNA-strenge, hvorved fluorescensen stiger cirka 20 gange i forhold til i ubundet form (excitation/emmision i bundet form: 364 nm/454 nm). DAPI kan passere gennem en intakt cellemembran, hvilket gør det ideelt at bruge på levende celler. Mounting medium fremstilles som beskrevet i Methods in Yeast Genetics [Amberg et al. 2005: 146], dog uden DAPI. Mounting medium: 100mg p-phenylenediamin (Sigma) opløses i 10ml PBS, og pH justeres til over 8.0 med 0,5M Na carbonat buffer (Na2CO3

, pH 9.0). Der tilsættes autoklaveret glycerol

til en total volumen på 100ml. Mounting mediet mixes omhyggeligt og opbevares på -20◦C. DAPI-farvning: 0,5*107 celler høstes fra en overnatskultur ved centrifugering i 5 minutter ved

1500G ved 4◦C. Pellet vaskes i 70 % ethanol i 5 min., spindes ned ved 3000G i 5 minutter

ved 4◦C. Cellerne resuspenderes i 200µl 0,1% Triton X-100 i BPS i 5 min. Cellerne spindes ned ved 1500G i 5 minutter ved 4ᵒC, og supernatanten hældes fra. Der vaskes med PBS, cellerne spindes ned igen og inkuberes derefter i 20 min ved stuetemperatur i 1ml 100ng/ml

DAPI (Sigma, D9542) i PBS. Cellerne spindes ned (1500G i 5 minutter ved 4◦C),

resuspenderes i 1ml mounting medium og observeres i et fluorescence mikroskop (mikroskop: Leica DM5500B; objektiv: Leica 63x #506184; DAPI-filter: Leica Microsystems Filter system A UV #11513873).

38

2.2.4 Overlevelsesforsøg

Der foretages overlevelsesforsøg for at udlede, hvordan rho0 overlever i forhold til WT samt hvordan manglende pol zeta-funktion influerer på overlevelsen. Alle gærstammerne stryges først ud på YPD-plader fra frysekulturer. YPD-pladerne forsegles med paraffin-film og

opbevares ved 4◦C. Ved hvert forsøg anvendes disse til at lave overnatskulturer fra. Overnatskulturer fortyndes til OD660 0,2 i friskt YPD-medium og overføres til vækstrør. Kulturerne vokser til logaritmisk fase OD660 ~ 0,40-0,45 under omrystning og der tilsættes methyl metan sulfonat, MMS (Sigma M4016) eller Hydroxyurea, HU (Sigma H8627) til de endelige slutkoncentrationer: 0 %, 0,025 %, 0,05 %, 0,1 % og 0,2 %. De ubehandlede prøver (0%) tilsættes autoklaveret vand.

2.2.4.1 Procedure

Delforsøg 1: Der arbejdes med WT og rho0, og forsøget udføres med 3-6 ægte replikater for hver koncentration af MMS. Hvert ægte replikat udregnes ud fra 3 pseudoreplikater for at minimere pipetteringsfejl. Et ægte replikat er en gærkultur, der er strøget fra YPD-stammepladen og vokset op i YPD-medie, hvorved det kan siges at være uafhængigt af de andre replikater, fordi vækstbetingelserne i overnatskulturen er uafhængig. Et pseudoreplikat er derimod udportioneringer fra samme overnatskultur, hvorfor gærcellerne ikke kan siges at

være uafhængige. Gærcellerne inkuberes med MMS i 2 timer ved 30◦C under omrystning i et vandbad, hvorefter de spindes ned ved 3000G i 5 minutter ved 4◦C. Gærcellerne resuspenderes i 1ml vand, og hver kultur fortyndes nøje i en fortyndingsrække på 10, 100, 1000 og 10.000 gange; der arbejdes her på is. Antallet af gærceller pr. ml bestemmes på CASY-tælleren, og en volumen svarende til præcis 100 gærceller fra hvert replikat udplades på YPD-plader, således at overlevelsen kan bestemmes ud fra de faktiske overlevelsesfrekvenser. Ved 0,2 % MMS udplades typisk 4 gange så mange celler som normalt, idet dødeligheden er meget stor. Da der tidsmæssigt kun kunne gennemføres forsøg med 3 ægte replikater af én stamme om dagen (det vil sige 3 ægte x 3 pseudoreplikater), tog det cirka 20 arbejdsdage at gennemføre forsøg med alle koncentrationer af WT og rho0. Derfor ændredes proceduren i delforsøg 2, således at alle stammer indgik i ét forsøg. Delforsøg 2: I dette forsøg arbejdes der med WT, rho0, Rev3∆ og Rev3∆rho0. Her arbejdes der kun med ét ægte replikat om dagen af alle MMS-koncentrationer af hver gærstamme, således at hele forsøget udføres på én dag. Forsøget gentages 4 gange, det vil sige, at der foreligger 4 ægte replikater for hver koncentration af MMS, men ingen pseudoreplikater. Gærcellerne inkuberes med MMS i 2 timer ved 30◦C under omrystning i et vandbad,

hvorefter de spindes ned ved 3000G i 5 minutter ved 4◦C. Gærcellerne resuspenderes i 1ml vand (der arbejdes på is). Hver kultur fortyndes derefter nøje i en fortyndingsrække på 10, 100, 1000 og 10.000 gange. Da celle-tællingen, der blev anvendt i delforsøg 1, var meget

39

tidskrævende, droppes dette step. Antal celler/ml tælles således ikke, i stedet udpipetteres 100µl fra hver 10.000 gange fortynding. Antallet af ubehandlede celler, der vokser op, anses for 100% overlevelse, og de andre overlevelsesfrekvenser udregnes relativt til den ubehandlede. Hydroxyurea (HU): Dette forsøg udføres for at teste, om stammerne kan overleve 10mM og 100mM HU samt for at finde ud af, om stammerne overlever forskelligt. HU hæmmer ribonukleotid reduktasen, hvilket depleterer og skaber ubalance i dNTP-poolen. Der udføres 2 forsøg med et ægte replikat af hver koncentration. Gærcellerne inkuberes med 0, 10 eller 100 mM HU i 2 timer under omrystning i vandbad ved 30◦C, hvorefter de spindes ned ved 3000G i 5 minutter ved 4◦C. Resten af proceduren er som i delforsøg 2.

2.2.4.2 Statistisk analyse af overlevelsesforsøg

Der foretages statistik på resultaterne af overlevelsesforsøgene for at finde ud af, om stammerne overlever signifikant forskelligt. De statistiske tests er udført i programmet SYSTAT, version 11 i samarbejde med Morten Foldager, lektor i Miljøbiologi ved Roskilde Universitet. I delforsøg 1 måles overlevelse på 2 stammer (WT og rho0), 5 MMS-koncentrationer (ubehandlet medregnet) og i alt 3-6 ægte replikater. Overlevelserne i hvert punkt fandtes som et gennemsnit af overlevelserne af de 3 pseudoreplikater inden for hvert ægte replikat for at mindske pipetteringsfejl. I delforsøg 1 udføres de statistiske tests med de faktiske overlevelser, idet tallene refererer til overlevelser i forhold til 100 udportionerede celler. Tallene er dog i grafen, som præsenteres i resultatafsnittet, normaliseret til ’procent overlevelse’ i forhold til overlevelsen af de ubehandlede celler. I andet delforsøg arbejdes der med 4 stammer (WT, rho0, Rev3∆, Rev3∆rho0), 5 MMS-koncentrationer (ubehandlet medregnet) og overlevelse måles ud fra 4 ægte replikater. De statistiske tests foretages på procenttal, fordi overlevelsen ses i forhold til de ubehandlede, hvis overlevelse anses som 100 %. Data transformeres i delforsøg 2 til den naturlige logaritme plus 1 (ln+1), for at varianserne bliver ens. Ved at transformere tallene undgås også nuller, som testen ikke kan bruge som input. Der kan ikke foretages statistik på de ubehandlede prøver, som alle er 100%, hvorved variansen er 0. I både delforsøg 1 og 2 testes normalfordelingen først via en visuel vurdering ud fra et normalfordelingsplot og derefter statistisk via en Kolmogorov–Smirnov test, hvor datasæt med P > 0,05 betragtes som normalfordelte. Varianserne testes via Levene’s test, hvor varianserne betragtes som ens hvis P > 0,05. Data er i enkelte tilfælde ikke normalfordelte, hvilket er en svaghed for den videre test. Varianserne er dog i begge del-forsøg forholdsvist ens, hvorved det anses som forsvarligt at udføre en variansanalyse (ANOVA). Der udføres en parametrisk 2-faktor ANOVA efterfulgt af en Tukey’s ’multiple range’ test for at teste overlevelsesfrekvenserne i forhold til stammer og koncentrationer (se ANOVA-skemaer samt P-værdier i Bilag 1). Individuelle datasæt anses for statistisk signifikant forskellige fra hinanden, hvis P < 0,05 i matrixen, det vil sige, at de med 95% sandsynlighed er forskellige

40

fra hinanden (95% konfidensniveau). Da den statistiske metode er relativt konservativ, tillader jeg mig at diskutere tilfælde, hvor P = (0,05 til 0,20). Her er sandsynligheden for, at datasættene er ens, ’kun’ omkring 20%. Her er datasættene altså med cirka 80% sandsynlighed forskellige (80% konfidensniveau). For at se alle data fra overlevelsesforsøgene – se Bilag 2.

2.2.5 CAN1 mutationsspektrum-forsøg

Der udføres et forward CAN1 mutationsspektrum-forsøg for at detektere, hvor stor en andel af de samlede mutationer, som pol zeta står for i WT og rho0 in vivo efter DNA-skade med MMS. Derfor anvendes Rev3- stammen.

2.2.5.1 Gærkoloni PCR

WT, rho0, Rev3- og Rev3-rho0 fra YPD-plader podes ned i 50ml YPD-medium og vokser

natten over under rystning ved 30◦C. Overnatskulturerne fortyndes til OD660 ~ 0,2 og vokser

til OD660 ~ 0,4, hvorefter der tilføres MMS til de endelige koncentrationer 0%, 0,025%,

0,05%, 0,1% og 0,2%. Der rystes i 2 timer ved 30◦C, cellerne spindes ned ved 3000G i 5

minutter ved 4◦C, supernatanten hældes fra og der tilsættes 1ml milliQ vand. Cirka 0,5ml af

cellekulturen i vand udportioneres på SD/-Arg + 60 µg/ml canavanin-plader. Canavanin er en toksisk analog til Arginin, som importeres af argininpermease, der kodes for af CAN1-locuset. Resistens forekommer derfor primært ved mutationer i dette locus, om end der kan forekomme lav resistens ved mutationer i andre loci [Amberg et al. 2005: 209]. Total-DNA fra 8 canavanin-resistente kolonier fra hver stamme udsat for de givne MMS-koncentrationer oprenses ved brug af Chelex perler (Bio-Rad), der binder proteiner og metal-ioner, som kan hæmme PCR-reaktionen, men ikke DNA. En gærkoloni fra en canavnin-plade overføres med

en steril plastik-podepind til 300µL 10% Chelex (opbevares ved 4◦C). Røret whirlmixes for at opløse kolonien i Chelexen, spindes ned i 10-15 sekunder i en mikrocentrifuge og inkuberes i

varmeblok ved 95◦C i 20 minutter (whirlmixes efter 10 minutter og sættes tilbage i varmeblokken). Røret spindes ned i 1 minut ved 1000G, og 150µL supernatant indeholdende DNA overføres til et nyt rør. Efterfølgende foretages der en PCR-reaktion med 1µL af det oprensede DNA, se Tabel 5 for PCR-reaktionsmix. Reagent PCR reaktion (µL) Belyst vand 14,3 PCR-buffer (10x) 2,0 dNTPs (2mM) (Fermentas) 1,5 Forward primer (20µM) 0,5 Reverse primer (20µM) 0,5 AmpliTaq® DNA Polymerase (Applied Biosystems) 0,2 DNA oprenset med Chelex 1,0 Total volume 20,0 Tabel 5: PCR-reaktions mix.

41

For hver stamme anvendtes der kolonier fra mindst 2 forsøg. CAN1-genet amplificeres med PCR ved brug af følgende primere: CAN1F (5´ CTT CAG ACT TCT TAA CTC C-3´) og CAN1R (5´-GAG GGT GAG AAT GCG AAA T-3´) [Huang et al. 2002]. Primerne flankerer et PCR-produkt på 1.8 kilobaser. For primernes eksakte position på CAN1-genet, se Figur 9. PCR-programmet var indstillet således: 5 minutter ved 95◦C, 35 cyklusser (30 sek. ved 95◦C, 30 sek. anneling 30 sek. ved 58◦C, 1 minut 45 sek. ved 72◦C) og elongation i 10 minutter ved 72◦C. PCR-produktet køres på en 1% agarosegel for at verificere at CAN1-genet på 1.8 kilobaser er blevet amplificeret. PCR-produkterne sekventeres hos Macrogen Korea med følgende primere som i Huang et al. 2002: CAN seq. Forward (5´-GGCATATTCTGTCACGCAG-3´), CAN seq. Reverse A (5´-GAGGGTGAGAATGCGAAAT-3´), CAN seq. Reverse B (5´-GCCTGCAACACCAGTGATA-3´), CAN seq. Reverse C (5´-GTAACAGGGATGAATGTAG-3´).

2.2.5.2 Detektion af mutationer

Sekvenserne fra de 4 overlappende primere samles i Vector nti via ContigExpress, og blast-sekvensen af CAN1-genet i S.cerevisiae bruges som konsensus-sekvens (GeneID 856646). Sekvenserne alignes, og der analyseres i alt 1170 basepar fra hvert sekventeret gen fra og med følgende konsensus-sekvenser: AAATAAA (reverse komplimentær TTTATTT) til GTGAAA (reverse komplimentær TTTCAC). Sekvensen blev udvalgt, fordi alle eller flere af primerprodukterne overlapper, hvilket øger sikkerheden af analysen. En mulig mutation verificeres dog også visuelt i histogrammet. Sekvenserne fra primeren ’Can seq Reverse C’ var generelt af dårlig kvalitet og overlappede ikke med de andre primere, hvorfor produktet fra denne primer fravælges i analysen. Figur 9 viser nukleotidsekvensen af CAN1-genet i S.cerevisiae, hvor placeringerne af primerne samt start- og slut-sekvenser er angivet.

42

Figur 9: S. cerevisiae CAN1-genet Farvekoder: Udvalgte start- og slutsekvens: UdvalgtPrimer seq. forward: Primerproduktet løber mod højre i læseretningen. Primer seq. Reverse A:: Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen.Primer seq. Reverse B:: Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen.Primer seq. reverse C: Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen.Område med 3 strenge at analysere udTo strenge at analysere udfra. Én streng at analysere udfra.

2.2.5.4 Databehandling

Mutationerne deles op i transversionpyrimidin↔pyrimidin), tandem (indels) og komplekse mutationer. indels og flere tæt-på-hinandenkategoriseres som komplekse mutationer ligesom i Sakamoto

genet med markering af primer-placeringer samt analyse

Udvalgt i forhold til kvaliteten af sekventeringer. Primerproduktet løber mod højre i læseretningen.

Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen. Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen.

Primerproduktet løber mod venstre i læseretningen. e med 3 strenge at analysere udfra.

Mutationerne deles op i transversioner (purin↔pyrimidin), transitioner (purin), tandem basepar substitutioner (tandem), insertion/deletion

og komplekse mutationer. 1 eller 2 base insertions eller deletions kategoriseres som hinanden-forekommende base substitutioner og/eller indels

kategoriseres som komplekse mutationer ligesom i Sakamoto et al. (2007). Da

placeringer samt analyse-sekvens.

), transitioner (purin↔purin og basepar substitutioner (tandem), insertion/deletion loops

eletions kategoriseres som forekommende base substitutioner og/eller indels

(2007). Da datamaterialet

43

desværre er meget begrænset, foretages der ikke statistik på tallene, men der udledes i stedet tendenser ved tallene, som må efterprøves senere i et mere omfattende forsøg. 118 sekventeringer blev analyseret, og ud af disse var der ingen mutationer i 26 kolonier i det analyserede stykke af CAN1-genet; svarende til 22%. Da kolonierne netop er selekteret på grund af mutationer i CAN1, kan dette undre. Dog er der kun udført analyse på 1170 basepar ud af CAN1-genets 1773 basepar. Såfremt mutationerne er ligeligt fordelt vil 34% af mutationerne således befinde sig udenfor analysesekvensen ((1773-1170)/1773 = 0,34). De 22% ’umuterede’ kolonier må derfor antages at være muteret udenfor den sekvens af CAN1-genet, der analyseres på her. Alligevel tælles de med for at få et billede af mutationsspektret. Det kan ikke udelukkes, at nogen af de mutationer, der findes i kolonierne, kan være forårsaget af Taq DNA-polymerasen, der blev anvendt i PCR-reaktionen, men idet der oftest ses på overlappende PCR-sekventeringer, vil bidraget af fejl fra Taq-polymerasen formentligt være relativt beskedent. Mutationerne præsenteres som i Machado et al. (2009), hvor det totale antal mutationer inden for en gærstamme divideres med det antal kolonier, der er analyseret, for at finde antal mutationer/koloni. Det samme gøres for hver enkelt type mutation. Dette omregnes til procent, hvilket giver et udtryk for hyppigheden [Machado et al. 2009]. Herefter analyseres det, hvor stor en procentdel af de samlede mutationer, som pol zeta står for. Eksempel på udregning: Der er analyseret på 8 kolonier, hvor der totalt er observeret 7 mutationer, hvoraf de 4 vurderes at være pol zeta-associerede. Denne gærstamme vil således generere et mutationsspektrum på 87,5% (7/8), hvor 50% (4/8) af disse er udført af pol zeta, mens de resterende 37,5% (3/8) er ikke-pol zeta associerede. Det totale mutationsspektrum transformeres yderligere op til 100%, det vil sige, at man antager, at alle kolonier er muterede. Pol zeta vil således stå for 57,1% (4/7) af det samlede antal mutationer i 100% muterede kolonier. Dette gøres med henblik på at anvende mutationsspektrene på nogle præliminære mutationsfrekvens-resultater af Desler (upubliceret 2010), som præsenteres senere.

44

2.3 Resultater

2.3.1 Verificering af rho

For at verificere depletion af mtDNA i rhoudpladning på YPG-plader samt en visuel verificering med den fluorescerende DNAbindende farve, DAPI. YPG gav ikke anledning til vækst af rhoanledning til vækst i deres korresponderende parentiale stammer. mtDNA med DAPI vises på billederne nedenforomkring nukleus, hvilket ikke ses i celler uden mtDNAsamt billederne verificerer, at cellerne er funktionelle mtDNA-molekylerteste om dette er tilfældet, kunne sammenlignet med WT i en Seahorse Extracellular Flux (XF) Analyzer maskinedog ikke muligt inden for tidsrammenmolekyler, vil de fremover blive refereret til som

erificering af rho0 ved YPG og DAPI-farvning

af mtDNA i rho0, Rev3-rho0 og Rev3∆rho0 stammerne udførtes en plader samt en visuel verificering med den fluorescerende DNA

bindende farve, DAPI. YPG gav ikke anledning til vækst af rho0-stammerneanledning til vækst i deres korresponderende parentiale stammer. Verificering af depletion af

vises på billederne nedenfor. Celler med mtDNA udviser en ’sky’ et ikke ses i celler uden mtDNA. Selv om både vækst

verificerer, at cellerne er rho0, kan det ikke udelukkes, at demolekyler og kan udføre oxidativ fosforylering i mindre grad

kunne man have udført test af rho0-cellernes oxygenforbrug i en Seahorse Extracellular Flux (XF) Analyzer maskine

inden for tidsrammen, så selv om cellerne muligvis indeholder få mtDNA vil de fremover blive refereret til som rho0.

WT

Rev3∆

stammerne udførtes en plader samt en visuel verificering med den fluorescerende DNA-

stammerne, men gav cering af depletion af

. Celler med mtDNA udviser en ’sky’ Selv om både væksthæmnings-testen

at de stadig besidder få i mindre grad. For at

cellernes oxygenforbrug i en Seahorse Extracellular Flux (XF) Analyzer maskine. Dette var

indeholder få mtDNA

rho0

Rev3∆rho

2.3.2 Overlevelsesforsøg med MMS

Herunder præsenteres resultaterne af overlevelsesforsøgene. Tabel 6. P-værdi Betydning

>0,05 Ikke signifikant

0,20-0,05 Ikke signifikant, men forskellen er relativt sandsynlig (80

0,01 til 0,05 Signifikant

0,001 til 0,01 Meget signifik

< 0,001 Ekstrem signifik

Tabel 6: Angiver, hvordan P-værdierne

forsøg med MMS

Herunder præsenteres resultaterne af overlevelsesforsøgene. P-værdierne

Betegnelse

ant ns

Ikke signifikant, men forskellen er relativt sandsynlig (80-95%)

(ns)

*

signifikant **

signifikant ***

værdierne vil blive tolket i resultatafsnittet.

Rev3-

45

ne tolkes som anvist i

Rev3-rho0

46

Figur 10: I første forsøg (4-6 ægte replikater) overlever rho0 signifikant bedre end WT ved MMS 0,025%, 0,05% og 0,1% (P<0,05).

2.3.2.1 Rho0 er mere resistente overfor MMS end WT

Overlevelsesforsøgene blev udført med henblik på at bestemme, hvordan rho0 og WT med og uden funktionel pol zeta overlever efter MMS-behandling. På Figur 10 ses det, at rho0 overlever signifikant bedre end WT i første delforsøg. Metoden ændredes dog i andet delforsøg, således at hele forsøget kunne gennemføres hurtigere. Alle stammer blev i delforsøg 2 undersøgt i samme forsøg. Med den nye forsøgsgang overlever WT og rho0 relativt ens (se Figur 11). I nogle forsøg overlevede rho0 bedst og i andre overlevede WT bedst, hvilket betyder, at forskellen på overlevelsesfrekvenserne på WT og rho0 i delforsøg 2 er ikke-signifikant. Sammenlagt indikerer resultaterne fra delforsøg 1 og 2, at rho0-gærceller er lige så resistente eller endog lidt mere resistente overfor MMS end WT.

0

20

40

60

80

100

-4,72E-16 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 0,2

% o

verle

vels

e

MMS koncentration

WT

rho0

***

**

ns

* ns

47

Figur 11: WT og rho0 overlever generelt signifikant bedre end Rev3∆ og Rev3∆rho0 ved udsættelse for MMS i to timer (N=4 i hvert data-punkt). Mørkeblå+røde tegn indikerer den signifikante forskel mellem WT og rev3∆. Mørkblå+lyseblå tegn indikerer den signifikante forskel mellem WT og Rev3∆rho0. Grønne+røde tegn indikerer den signifikante forskel mellem rho0 og Rev3∆, og grønne+lyseblå tegn indikerer den signifikante forskel mellem rho0 og Rev3∆rho0. WT og rho0 overlevelser ved alle MMS-koncentrationer relativt ens (P = ns), hvilket også gælder for Rev3∆ og Rev3∆rho0 (P = ns). Disse er derfor ikke angivet på grafen. Alle P-værdier findes i Bilag 1.

2.3.2.2 Funktionen af Rev3 er afgørende for overlevelse af rho0

Gær med knockout af pol zetas aktive subunit, Rev3∆, overlever signifikant dårligere end WT ved udsættelse for 0,05% MMS og til dels 0,1%, se Figur 11. Ligeledes ses det, at Rev3∆rho0 generelt overlever dårligere end rho0. Forskellene er dog ikke-signifikante efter udsættelse for 0,025% MMS, men ved MMS 0,05% er P=0,091 for rho0 sammenlignet med Rev3∆rho0. Dette er tæt på at være signifikant ud fra 95% konfidensniveauet, hvorfor der er stor sandsynlighed for at de to datasæt er forskellige. Ved 0,1% MMS er P=0,189, hvilket ligger inden for 80% konfidensniveauet, og det er derfor relativt sandsynligt, at de to datasæt er forskellige. Derfor tyder dataene på, at Rev3∆rho0 overlever signifikant dårligere end rho0 efter udsættelse for MMS. Funktionen af Rev3-subunitten og dermed pol zeta er derfor afgørende for overlevelse efter MMS-inducerede DNA-skader både i WT og rho0. Dette betyder, at rho0-gær i høj grad anvender pol zeta efter MMS-påvirkning.

0

20

40

60

80

100

0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 0,2

% o

verle

vels

e

MMS koncentration

WT

rho0

Rev3∆

Rev3∆rho0

♦▲: * ♦×: ** ■▲: (ns) ■×: (ns)

♦▲: (ns) ♦×: ** ■▲: ns ■×: (ns) ♦▲: ns

♦×: ** ■▲: ns ■×: ns

♦▲: ns ♦×: ns ■▲: ns ■×: ns

48

2.3.2.3 Funktionelle mitokondrier er ikke afgørende for overlevelse

I delforsøg 2 overlever rho0 lige så godt som WT efter MMS-udsættelse, og Rev3∆rho0 overlever statistisk set lige så dårligt som Rev3∆. Yderligere er overlevelsesfrekvensen mellem rho0 og WT-stammerne signifikant højere end for Rev3∆rho0 og Rev3∆-stammerne. Dette indikerer, at funktionen af mitokondrierne ikke har afgørende betydning for overlevelsen. Celler uden mitokondrier har dermed kun en ringere chance for overlevelse, såfremt de mangler pol zeta, men ikke som funktion af manglende mitokondrier.

2.3.3 Overlevelsesforsøg med Hydroxyurea

Figur 12: Viser overlevelsesfrekvenser for WT, rho0, Rev3∆ og rev3∆rho0 efter udsættelse for HU i 2 timer ved hhv 10mM og 100mM HU. Hvert datamærke baseres kun på 2 ægte replikater (N=2), og resultaterne skal derfor tages med forbehold. Ingen af P-værdierne viser en signifikant forskel mellem overlevelse, strains og toksicitetsniveau, og derfor vises ANOVA-tabellerne ikke i bilagene. Celler behandles med HU for at hæmme dNTP-produktion. Det svage fald i overlevelsesfrekvensen ved højere HU-koncentrationer må forventes at være på grund af spontane mutationer og mangel på dNTP’er jo kraftigere RNR hæmmes og dermed de novo dNTP-produktionen. Der er ingen signifikant forskel på overlevelsen imellem de 4 stammer hverken efter 10mM eller 100mM HU. Yderligere ses det, at overlevelsen ikke påvirkes i særligt høj grad ved HU-påvirkning, hvorfor lave dNTP-pools i sig selv ikke giver anledning til forringet overlevelse.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 20 40 60 80 100

% o

verle

vels

e

HU (mM)

WT

rho0

Rev3∆

Rev3Δrho0

ns

ns

49

2.3.4 CAN1 mutationsspektrum

Her præsenteres resultaterne fra mutationsspektrum-forsøgene. Idet sekventeringerne af de 8 kolonier af Rev3- udsat for 0,1% MMS alle var af for dårlig kvalitet, og idet mange af sekventeringerne ved 0,2% MMS også var af ringe kvalitet, analyseres der fortrinsvist på sekvenserne fra kolonierne udsat for 0%, 0,025% og 0,05% MMS, se Tabel 7.

50

Stamme og

MMS konc.→

Mut. Event↓

WT

0 %

(N=5)

WT

0,025%

(N=8)

WT 0,05%

(N=6)

rho0

0%

(N=8)

rho0

0,025%

(N=8)

rho0

0,05%

(N=8)

Rev3-

0% (N=6)

Rev3-

0,025%

(N=8)

Rev3-

0,05%

(N=7)

Rev3-rho

0

0 %

(N=3)

Rev3-rho

0

0,025%

(N=7)

Rev3-rho

0

0,05%

(N=6)

A:T→G:C - - - - - 12,5% (1/8) - - - - - -

G:C→A:T 20% (1/5) 37,5% (3/8) 33,3% (2/6) 12,5% (1/8) - 37,5% (3/8) 16,7% (1/6) 25% (2/8) 14,3% (1/7) 33,3% (1/3) - 16,7% (1/6)

A:T→T:A - - 33,3% (2/6) - - - - 25% (2/8) 14,3% (1/7) - 14,3% (1/7) 16,7% (1/6)

A:T→C:G - - 12,5% (1/8) - - - 12,5% (1/8) - - - -

G:C→T:A 40% (2/5) 12,5% (1/8) 16,7% (1/6) 25% (2/8) 12,5% (1/8) 25% (2/8) - 12,5% (1/8) 28,6% (2/7) - 14,3% (1/7) -

G:C→C:G - 12,5%(1/8) - 12,5% (1/8) 25% (2/8) - 33,3% (2/6) - - 33,3% (1/3) - 16,7% (1/6)

Tandem - - - - - - - - 14,3% (1/7) - - -

Indels - 12,5% (1/8) - 12,5% (1/8) 12,5% (1/8) - - 25% (2/8) 14,3% (1/7) 33,3% (1/3) 42,9% (3/7) 33,3% (2/6)

komplekse - 12,5% (1/8) 16,7% (1/6) - - - - 12,5% (1/8) - - - -

Sum mut.

Total

60% (3/5) 87,5% (7/8) 100% (6/6) 75% (6/8) 50%

(4/8)

75%

(6/8)

50% (3/6) 112,5%

(9/8)

85,7% (6/7) 100% (3/3) 71,4% (5/7) 83,3% (5/6)

Andel pol

zeta

0% (0/5) 37,5% (3/8) 33,3% (2/6) 25% (2/8) 25% (2/8) 25% (2/8) 33,3% (2/6) 50% (4/8) 57,1% (4/7) 66,6% (2/3) 57,1% (4/7) 33,3% (2/6)

Andel af pol

zeta ud af

100%

0%(0/3) 42,9% (3/7) 33,3% (2/6) 33,3% (2/6) 50% (2/4) 33,3% (2/6) 66,6% (2/3) 44,4% (4/9) 66,6% (4/6) 66,6% (2/3) 80% (4/5) 40% (2/5)

Tabel 7: Viser mutationsspektret. Procenttallene angiver hyppigheden af den givne mutation. ’Andel pol zeta’ henviser til den procentdel af mutationer, som pol zeta står for. Dette tal er fundet ved at summere andelen af tandem-, indels-, komplekse- og G:C til T:A mutationer for de MMS-behandlede prøver. For alle de ubehandlede prøver (0% MMS) er ’Andel pol zeta’-tallet fundet ved at tage summen af tandem-, indels-, komplekse- og G:C til C:G mutationer. ”Andel af pol zeta ud af 100%” angiver hvor stor en procentdel af de samlede mutationer, som pol zeta vil stå for, hvis 100% af kolonierne var muterede. Dette tal findes ved at dividere de pol zeta-inducerede mutationer med det samlede antal mutationer fundet i den givne stamme udsat for den givne MMS-koncentration.

51

2.3.4.1 MMS øger antallet af komplekse mutationer, hvilket tyder på TLS-

aktivitet

Sammenlignes den spontane mutationsprocent for Rev3- med den 0,025 % MMS-inducerede mutationsprocent for Rev3-, stiger antallet af indels/komplekse mutationer fra 0% (0/6) til 37,5% (3/8), se Tabel 7. Samme tendens ses i WT, hvor der sker en øgning fra 0% (0/8) til 25% (2/8). Udsættelse for MMS synes derfor at øge antallet af komplekse mutationer, hvilket tyder på TLS-aktivitet.

2.3.4.2 Rho0-celler har TLS-aktivitet

Det tyder på, at rho0 benytter pol zeta, da der ses pol zeta-specifikke mutationer i rho0 og Rev3-rho0 både i ubehandlede celler samt i MMS-behandlede celler. Mutationsspektrene indikerer yderligere, at af alle de spontane mutationer, der genereres i Rev3-rho0 og Rev3-, skyldes flest af disse pol zeta i Rev3-rho0. Rev3- stammen generer nemlig kun cirka 33,3% (2/6) spontane pol zeta-associerede mutationer, hvor Rev3-rho0 generer 66,6% (2/3) spontane pol zeta-inducerede mutationer.

2.3.4.3 MMS inducerer få tandem dobbelt mutationer

I modsætning til UV-lys genererer MMS formentligt ikke tandem dobbelt mutationer i samme grad. Hvis hele datasættet tages i betragtning, blev der kun dannet 1 tandem dobbelt mutation imod 5 komplekse mutationer, 18 indels og 76 basesubstitutioner. Dette kan formentligt forklares med, at MMS, i modsætning til UV-lys, ikke forårsager dimeriske fotoprodukter, der ender som tandem dobbelt mutationer. I stedet tyder det på, at MMS resulterer i, at pol zeta genererer mange basesubstitutioner på grund af skader på enkeltbaser.

52

2.3.4.4 Rev3- pol zeta-aktivitet tiltager ved MMS

Mutationsspektrummet viser en tendens til, at der sker en øgninmutagenese efter genotoksisk stress fra MMSassocierede mutagenese fra 33,3%57,1% efter 0,05% MMS. Omvendt anvender Rev3påvirkning, men nedjusterer anvendelsen af pol zeta ved genotoksisk stress fra MMS. Rev3rho0 genererer 66,6% af mutationerne33,3% efter 0,05% MMS. Samme tendens er sværere at observere i WT og rhogrundet det begrænsede datasæt.

Figur 13: Grafen viser de pol zetainkluderer spontane G:C til C:G, tandem, iinducerede G:C til T:A, tandem,

0

20

40

60

80

100

120

0,0

37,533,3

25,0

60,0

50,066,7

50,0

% m

utat

ione

raktivitet tiltager ved MMS-påvirkning

Mutationsspektrummet viser en tendens til, at der sker en øgning af den pol zetamutagenese efter genotoksisk stress fra MMS i Rev3-, se Figur 13. Rev3-

associerede mutagenese fra 33,3% i ubehandlede celler til 50% efter 0,05% MMS. Omvendt anvender Rev3-rho0 i høj grad pol zeta selv uden MMS

påvirkning, men nedjusterer anvendelsen af pol zeta ved genotoksisk stress fra MMS. Rev3af mutationerne i ubehandlede celler, 57,1% efter

05% MMS. Samme tendens er sværere at observere i WT og rhogrundet det begrænsede datasæt.

Grafen viser de pol zeta-inducerede mutationer i de sekventerede mutanter. Dissekluderer spontane G:C til C:G, tandem, indels og komplekse mutationer samt MMS

inducerede G:C til T:A, tandem, indels og komplekse mutationer.

25,0 25,0 25,033,3

50,057,1

66,6

57,1

50,0

25,0

50,0

16,7

62,5

28,6

33,4

14,3

g af den pol zeta-inducerede - øger den pol zeta-

0,025% MMS og til i høj grad pol zeta selv uden MMS-

påvirkning, men nedjusterer anvendelsen af pol zeta ved genotoksisk stress fra MMS. Rev3-

57,1% efter 0,025% MMS og 05% MMS. Samme tendens er sværere at observere i WT og rho0, formentligt

kventerede mutanter. Disse

ndels og komplekse mutationer samt MMS-

33,3

50,0

ikke-pol zeta

andel af pol zeta mutationer

2.3.4.5 Rev3- genererer flere A:T til T:A transversioner

For at se om MMS fører til mutationer, som UVgenereret ved alle MMS-koncentrationer op i en graf. Der ses en tendens til, at stammen genererer forholdsvist flere A:T til T:A transversioner end WT, cirka 35% i forhold til 10% for WT, se Figur 14.

Figur 14: (for det komplette datasæt; sekoncentrationer ikke ændrer mutationsspektrummet, hvilket er en simplificering, men på denne måde fås det størst mulige bagvedliggende datasæt for at vurdere, hvilke mutationer stammerne typisk genererer. Mutationerne er divideret med detstamme og angivet i procent. Det ses, at Rev3 Derfor ser det ud som om, at pol zeta har forårsaget denne mutation. Forklaringen på, at pol zeta skulle være skyld i denne type mutationfor at indsætte dATP overfor dA[Stone et al. 2009]. Det tyder således på, at A:T til T:A transversioner er en pol zetamutation, der opstår efter skader skabt af MMS.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

% m

utat

ione

rgenererer flere A:T til T:A transversioner

l mutationer, som UV-lys ikke fører til, stilles alle mutationerne koncentrationer op i en graf. Der ses en tendens til, at

stammen genererer forholdsvist flere A:T til T:A transversioner end WT, cirka 35% i forhold

(for det komplette datasæt; se Bilag 3). Figuren antager, at stigende MMSkoncentrationer ikke ændrer mutationsspektrummet, hvilket er en simplificering, men på denne

bagvedliggende datasæt for at vurdere, hvilke mutationer stammerne typisk genererer. Mutationerne er divideret med det antal kolonier, der er analyseret i den givne stamme og angivet i procent. Det ses, at Rev3- genererer flere A:T til T:A i forhold til WT

det ud som om, at pol zeta har forårsaget denne mutation. Forklaringen på, at pol i denne type mutation, kan være, at pol zeta Rev3-

dA på template in vitro, hvilket resulterer i denne type mutation 2009]. Det tyder således på, at A:T til T:A transversioner er en pol zeta

mutation, der opstår efter skader skabt af MMS.

Mutationstype

53

lys ikke fører til, stilles alle mutationerne koncentrationer op i en graf. Der ses en tendens til, at Rev3-

stammen genererer forholdsvist flere A:T til T:A transversioner end WT, cirka 35% i forhold

, at stigende MMS-koncentrationer ikke ændrer mutationsspektrummet, hvilket er en simplificering, men på denne

bagvedliggende datasæt for at vurdere, hvilke mutationer stammerne antal kolonier, der er analyseret i den givne

re A:T til T:A i forhold til WT .

det ud som om, at pol zeta har forårsaget denne mutation. Forklaringen på, at pol har en stor affinitet

, hvilket resulterer i denne type mutation 2009]. Det tyder således på, at A:T til T:A transversioner er en pol zeta-induceret

WT

rho0

Rev3-

Rev3-rho0

54

Hvis A:T til T:A transversionerne tælles med som en pol zetaandelen af de pol zeta-inducerede mutationer i Rev3Rev3- stiger fra 33,3% i ubehandlede celler til 71,4% i Rev3-rho0 stammen genererer pol zeta 66,6% falder til 50% i 0,05% MMS-behandlede celler, se

Figur 15: Angiver mutationsspektrummet, hvis komplekse, tandem, indels, G:C til T:A samt A:T til T:A transversioner betragtes som pol zeta mutationer.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,0

37,5

66,6

25,0

60,0

50,0

33,4

50,0

% m

utat

ione

rHvis A:T til T:A transversionerne tælles med som en pol zeta-induceret mutation, stiger

inducerede mutationer i Rev3-, se Figur 15. Mutationsspektrummet i fra 33,3% i ubehandlede celler til 71,4% i 0,05% MMS-behandlede celler. I

stammen genererer pol zeta 66,6% mutationer i ubehandlede celler, og andelen behandlede celler, se Figur 15.

ngiver mutationsspektrummet, hvis komplekse, tandem, indels, G:C til T:A samt A:T til T:A transversioner betragtes som pol zeta mutationer.

25,0 25,0 25,033,3

75,071,4

66,671,4

50,0

25,0

50,0

16,7

37,5

14,3

33,4

0,0

induceret mutation, stiger . Mutationsspektrummet i

behandlede celler. I i ubehandlede celler, og andelen

ngiver mutationsspektrummet, hvis komplekse, tandem, indels, G:C til T:A samt

50,0

33,3

ikke-pol zeta

andel af pol zeta mut. + A:T til T:A

55

2.4 Diskussion

Formålet med forsøgene var at finde ud af, hvordan WT S. cerevisiae overlever i forhold til rho0-gærceller. Yderligere var formålet at afdække, om rho0 benytter pol zeta. For at undersøge dette, udførtes der overlevelsesforsøg samt CAN1-forsøg, hvor gærstammernes respektive mutationsspektrum fandtes. I mutationsspekrum-forsøget anvendtes WT, rho0, Rev3- og Rev3-rho0. Men forsøget manglede kontroller, som kunne verificere, hvilke mutationer der faktisk var introduceret af pol zeta. Det kunne have været hensigtsmæssigt at bruge knockout-stammen som kontroller, fordi pol zeta her med sikkerhed ville være ufunktionel. Hvis knockout stammerne var brugt som kontroller, kunne Rev3∆’s mutationsspektrum ’trækkes fra’ de andre stammers mutationsspektrummer, og tilbage havde været de pol zeta-inducerede mutationer. Rev3- muterer som sagt langt oftere end WT, som beskrevet af Sakamoto et al. (2007). Mutationsspektrum-forsøget kan ikke i sig selv sige, om der findes en forskel i mutationsfrekvens mellem rho0 og WT. For at detektere en sådan forskel skulle der samtidig have været udført forsøg på de totale mutationsfrekvenser. Hvis jeg havde undersøgt mutationsfrekvenserne ved at se på antallet af overlevne CAN1r-mutanter, kunne forskellen have været detekteret. Derfor må jeg i analysen nøjes med at antage, at pol zeta har genereret de samme mutationer, som den genererer in vitro og in vivo efter UV-lys [Stone et al. 2009, Sakamoto et al. 2007]. Desler (upubliceret 2010) har dog sideløbende med mine forsøg undersøgt mutationsfrekvensen i WT og rho0 i et CAN1r-forsøg, hvor antallet af CAN1r-mutanter anses for et direkte mål for mutationsfrekvensen. Forsøgene er præliminære og skal efterprøves med et større antal replikater, men de indikerer, at WT har en markant højere mutationsfrekvens end rho0, se Figur 16.

56

Figur 16: Præliminære forsøg af Desler (upublicerede 2010) viser, at rho0 muterer mindre end WT. Cellerne er behandlet i 2 timer med 0,025% MMS. Hvis pol zetas mutationsspektrum fundet i dette speciale anvendes på Deslers forsøg, giver det en indikation af, hvor ofte pol zeta har stået for mutationerne, se Figur 17. På figuren er mutationsspektrummet for pol zeta i WT 0% MMS, WT 0,025% MMS, rho0 0% MMS og rho0 0,025% MMS anvendt. Tallene er her transformeret op til 100% og lagt ind på Deslers figur.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

WT Rho0

Mu

tati

on

sfre

kv

en

s a

f C

AN

1r

pr.

10

9ce

lle

r

ubehandlet

behandlet med

0.025% MMS

57

Figur 17: Viser de pol zeta-inducerede mutationer i forhold til mutationsfrekvensen i WT og rho0 fundet af Desler (upubliceret 2010). De mørkeblå tal refererer til den andel af de samlede mutationer, som pol zeta forventes at stå for i WT og rho0 (mine resultater). Selv om Deslers og mine forsøg er præliminære, indikerer de tilsammen, at WT muterer mere via pol zeta end rho0 ved MMS-påvirkning. Denne sammenhæng kan findes, fordi overlevelsesforsøgene tyder på, at rho0 er lige så afhængig af pol zeta for at overleve som WT efter MMS-påvirkning. Men Deslers forsøg viser samtidig, at pol zeta introducerer flere mutationer til genomet i WT S. cerevisiae end i rho0. Dette må betyde, at forskellen mellem de pol zeta-inducerede mutationer ligger i, at der ’gemmer’ sig nogle fejlfrie pol zeta events i rho0, som ikke detekteres i disse forsøg, fordi de ikke inducerer mutationer i genomet. Men eventene er essentielle for, at rho0 kan overleve i lige så høj grad som WT efter behandling med MMS. I princippet kan WT også godt udføre flere fejlfrie TLS-events efter MMS-behandling, som heller ikke detekteres, men det er svært at udlede af disse forsøg. I næste figur er mutationsspektrummet for Rev3- 0% MMS, Rev3- 0,025% MMS, Rev3-rho0 0% MMS og Rev3-rho0 0,025% MMS på samme måde transformeret op til 100% og lagt ind på Deslers figur, se Figur 18. Det kan umiddelbart synes ulogisk at anvende disse tal på WT og rho0, men sikkerheden for at pol zeta har udført de TLS-events, der giver anledning til mutationerne i Rev3- og Rev3-rho0 er større end den er i WT. Mønstret kan derfor tænkes at være mere virkelighedstro. Yderligere er det tidligere vist, at pol zeta står for langt de fleste mutagene TLS-events i gær efter MMS [Lawrence et al. 1985], og tallene fra Rev3--

0

1

2

3

4

5

6

WT ubehandlet WT 0.025% MMS Rho0 ubehandlet Rho0 0.025% MMS

Mu

tati

on

sfre

kv

en

s C

AN

r p

r. 1

09

cell

er

Andel af pol zeta mutationer

ikke-pol zeta

pol zeta mutationer

Forskel: fejlfrie pol zeta events

58

mutanterne afspejler bedre, at pol zeta skulle være involveret i størstedelen af de mutagene events. På Figur 18 er forskellen på de fejlagtige events endnu større end på Figur 17, hvorfor det styrker formodningen om, at der gemmer sig nogle fejlfrie TLS-events, som udgør forskellen mellem mutationsfrekvenserne i WT og rho0 efter MMS-behandling.

Figur 18: Baserer sig på de præliminære forsøg af Desler vist i forrige graf, hvor de pol zeta associerede mutationer fundet i dette speciale er indført (mørkeblå søjle). Disse er udregnet på følgende måde ud fra mit datasæt: Rev3- 0% MMS: 66,6% (2/3), Rev3- 0,025%: 66,6% (6/9), Rev3-rho0 0% MMS: 66,6% (2/3), Rev3-rho0 0,025%: 100% (5/5). A:T til T:A er her medregnet som en pol zeta-mutation. Arbejdshypotesen ud fra ovenstående resultater er derfor, at rho0 muterer mindre end WT, fordi de ikke kan booste deres dNTP-pool og derfor ikke kan iværksætte samme TLS-respons efter DNA-skade som WT, se Figur 19. Hypotesen er, at WT og rho0 begge anvender et dNTP-uafhængigt TLS-respons under normale vækstbetingelser. Ved genotoksisk stress aktiverer WT et dNTP-afhængigt TLS-respons, som bypasser læsioner fejlagtigt og som

0

1

2

3

4

5

6

WT ubehandlet WT 0.025% MMS Rho0 ubehandlet Rho0 0.025%

MMS

Andel af pol zeta mutationer

ikke-pol zeta

pol zeta mutationer

Mu

tati

on

sfre

kv

en

s a

f C

AN

1rp

r. 1

09

cell

er

Forskel: fejlfrie pol zeta events

59

skaber mange mutationer i genomet. I takt med at stresset på genomet stiger, vil der være så mange stallede replikationsgafler, at checkpointet initieres via Rad53. Herved stiger dNTP-poolen i WT og øger antallet af fejlagtige TLS-event, hvilket i WT resulterer i højere mutationsfrekvenser. Ud fra hypotesen vil det dNTP-afhængige TLS-respons udeblive eller forsinkes i rho0 grundet et manglende dNTP-boost, hvorfor det antages, at rho0 fortsat under genotoksisk stress anvender et dNTP-uafhængigt TLS-respons, der anvender pol zeta på en mere fejlfri måde sammenlignet med det dNTP-afhængige TLS-respons. Denne hypotese underbygges af, at TLS-polymeraserne behøver forhøjede dNTP-pools for at indsætte et nukleotid overfor en læsion. Det betyder formentligt, at det fejlagtige TLS-respons i rho0 vil have et senere begyndelsespunkt i forhold til graden af DNA-skade. Se scenarierne for WT og rho0 i Figur 19. WT’s store mutationsfrekvens kan skyldes, at et fejlagtigt TLS-respons er hurtigere at udføre end fejlfrie mekanismer. Forsøg har vist, at WT-celler deler sig hurtigere end rho0 [Conrad-Webb og Butow 1995], hvilket også gælder i disse forsøg [denne undersøgelse, data ikke vist]. Derfor kan det tænkes, at rho0-celler har ’tid’ til at udføre langsomme fejlfrie mekanismer, der benytter sig af den intakte streng (template switching). Disse fejlfrie events må ud fra arbejdshypotesen involvere pol zeta. Der er fundet stærke indikationer på, at fejlfrit bypass af (6-4) T^T fotoprodukter igennem template switching i gæren S. pompe kræver pol zeta [Coulon et al. 2010]. Hvis rho0 i højere grad benytter sig af fejlfri template switching end WT, kan det til dels forklare, hvorfor rho0 muterer mindre, men samtidig er lige så afhængig af pol zeta og overlever lige så godt som WT efter MMS-behandling. Hypotesen stemmer overens med Chabes resultater, hvor celler, der kan booste sine dNTP-pools, har øget chance for overlevelse, dog med øgede mutationsfrekvenser som følge af dette [Chabes et al. 2003]. Rho0 overlever dog på højde med WT, hvilket indikerer, at et lavt niveau i dNTP-poolen er forbundet med fejlfrit bypass af DNA-skader.

60

Overlevelsesforsøgene viste, at WT og rho0 overlever ens. Rev3∆ og Rev3∆rho0 overlever også ens, men signifikant dårligere end WT og rho0 efter MMS. Rho0-cellernes resistens overfor MMS var overraskende, idet det forventedes, at rho0-celler ikke kunne booste deres dNTP-pool, og at dette ville have en negativ indvirkning på overlevelsen efter DNA-skade.

dNTP-niveau

dNTP-niveau

(få) DNA-skader

Fejlfrie mekanismer

Fejlagtige mekanismer

Celledød

Fejlagtige mekanismer

Celledød Fejlfrie mekanismer

WT

rho0

Figur 19: Er en illustration af arbejdshypotesen, som er blevet udtænkt på baggrund af mine og Deslers prælinimære forsøg. I WT stiger dNTP-niveauet hurtigt efter starttidspunktet for DNA -skade, hvor der først igangsættes fejlfrie mekanismer til at bypasse DNA-læsioner. Når dNTP-niveauet i WT stiger, igangsættes et mere fejlagtigt TLS. I rho 0 (nederst) stiger dNTP-niveauet ikke signifikant, og derfor igangsættes det dNTP-afhængige TLS meget senere end i WT. Det dNTP-afhængige TLS-respons forventes at være mere errorprone end det dNTP-uafhængige, hvorfor WT muterer mere end rho0.

61

Dette var ikke tilfældet, og rho0-cellerne er i forsøgene i nærværende speciale relativt resistente overfor MMS og overlever på højde med WT. Forklaringen kan være, at størrelsen af dNTP-poolen i rho0-cellerne er tilstrækkelig til aktivere pol zeta, således at det ikke influerer negativt på overlevelsen. Andre overlevelsesforsøg har ligeledes vist, at rho0 ofte udviser stor resistens over for udefrakommende genotoksiske stoffer. Park et al. (2004) har vist, at levercancer rho0-celler er resistente overfor det DNA-skadende stof doxorubicin, de oxidative stressere menadione og paraquat samt overfor udefrakommende H2O2 [Park et al. 2004]. Omvendt har Rasmussen et al. (2003) vist, at rho0-gær er meget følsom overfor H2O2 [Rasmussen et al. 2003], og det foreslås, at følsomheden skyldes, at de reparationsmekanismer, der reparerer disse skader, er ødelagte i rho0 [Rasmussen et al. 2003]. Rho0 udviser i forsøgene af Rasmussen et al. (2003) resistens over for det oxiderende stof 4-NQO, hvor WT udviser en lav 4-NQO-resistens [Rasmussen et al. 2003]. Interessant nok var mutationsfrekvenserne i CAN1-resistente rho0-celler, der blev udsat for 4-NQO også langt højere end i H2O2-mutanterne. Rasmussen et al.’s (2003) forsøg indikerer, at der sker flere fejlagtige TLS-events i rho0-celler efter 4-NQO [Rasmussen et al. 2003]. Derfor kan det antages, at øget resistens overfor et DNA-skadende stof i rho0 hænger sammen med øget mutagenese igennem fejlagtigt TLS. Dog antyder mine samt Deslers resultater, at S. cerevisiae rho0 anvender et mere fejlfrit TLS-system via pol zeta efter MMS-behandling. Dette indikerer, at det er det anvendte DNA-skadende stof, der afgør, om TLS-responset i rho0 bliver fejlfrit eller fejlagtigt.

62

2.5 Konklusion

Overlevelsesforsøgene viser, at Rev3∆ overlever signifikant dårligere end WT efter øget genotoksisk stress fra det alkylerende stof MMS (2 timers behandling med hhv. 0%, 0,025%, 0,05%, 0,1% og 0,2% MMS). Yderligere overlever Rev3∆rho0 signifikant dårligere end rho0. Dette betyder, at pol zeta-funktion er essentiel for overlevelse både i WT og rho0 S. cerevisiae. Yderligere er der indikationer på, at rho0 overlever bedre end WT. Dog kunne denne sammenhæng ikke verificeres i et andet forsøg, hvilket betyder, at der må tages forbehold for denne konklusion. Der er dog signifikant evidens for, at rho0 er meget resistent overfor MMS. Et CAN1-forsøg af mutationsspektrummet i WT og rho0 viste, at rho0 anvender TLS-pol zeta til at bypasse læsioner. Dataene antyder også, at pol zeta er stramt reguleret i WT, og at genotoksisk stress øger pol zetas bidrag til det samlede antal mutationer i denne stamme. Omvendt antyder dataene, at MMS-påvirkning reducerer pol zetas bidrag til det samlede antal mutationer i rho0. Mutationsspektrummet sammenholdes med præliminære CAN1r-forsøg af WT og rho0’s mutationsfrekvenser [Desler 2010, upubliceret], der viser, at WT muterer mere end rho0. Når resultaterne sammenholdes, tyder det på, at pol zeta anvendes på en mere fejlfri måde i rho0-celler efter MMS-påvirkning end i WT. Denne antagelse støttes af, at begge stammer er lige afhængige af pol zeta for overlevelse, men idet WT muterer mere end rho0, må det betyde, at nogle pol zeta-events ikke ses i mutationsforsøgene, fordi eventene ikke resulterer i mutationer. Det foreslås, at pol zetas anvendelse kan være styret af niveauet af cellens dNTP-pools, idet det tidligere er vist, at rho0 gær har lavere dNTP-pools end WT efter MMS-påvirkning [Ge og Ye 2009 upubliseret]. Hvis størrelsen af dNTP-poolen har indvirkning på TLS-responset, foreslås det, at rho0 og WT benytter et dNTP-uafhængigt TLS-respons under normal cellevækst. Ved genotoksisk stress aktiverer WT formentligt et dNTP-afhængigt TLS-respons, som introducerer væsentligt flere mutationer end det dNTP-uafhængige respons. Ud fra denne hypotese kan rho0 ikke aktivere det dNTP-afhængige respons og fortsætter sandsynligvis med at anvende pol zeta til fejlfrit bypass af DNA-læsioner.

63

2.6 Perspektivering

For at teste om dNTP-poolen regulerer TLS-responset, kan der udføres en række supplerende forsøg, som jeg kort vil beskrive her. Først skal mine forsøg understøttes med dNTP-målinger. Derefter skal det kontrolleres, om effekten på TLS-responset er på grund af dNTP poolen eller noget andet. Dette kan gøres ved at anvende hydroxyurea (HU), som hæmmer dNTP-pool-udvidelse. Efter behandling med MMS+HU bør mutationsfrekvensen fra pol zeta i WT og i rho0 være ens. Dette forventes, fordi ingen af stammerne kan booste deres dNTP-pool ved HU-påvirkning, og derfor bør de have det samme TLS-respons. Yderligere kunne disse forsøg også udføres i cancerceller, for at detektere om TLS-responset i cancerceller reguleres af dNTP-poolen.

64

3. Populærvidenskabelig opsummering af

molekylærbiologien4 Cellens arvemasse, DNA’et, bliver konstant udsat for skadelige stoffer, det være sig fra tobaksrøg, bilos og andre udefrakommende stoffer, men også skadelige frie radikaler, der dannes inde i cellen. Derfor har cellen et helt arsenal af forsvarsmekanismer til at reparere skaderne med, således at koderne i DNA’et beskyttes, og der ikke forekommer mutationer i arvemassen. Mutationer er nemlig ekstremt farlige for cellen, som kan risikere at udvikle sig til en kræftcelle, der deler sig uhæmmet og derved truer hele kroppen. Nogle DNA-skader bliver dog ikke repareret af de normale reparationsmekanismer og volder problemer for cellen, når den skal kopiere sit DNA for at dele sig og danne nye celler. En urepareret DNA-skade kan sammenlignes med en stor lastbil, der spærrer en motorvej. Den må fjernes, før trafikken kan glide normalt igen. Hvis ikke skaden fjernes, kan hele kopierings-processen bryde sammen, og det kan føre til, at cellen dør eller endnu værre muterer til en kræft-celle. Cellen har en række specialiserede værktøjer, enzymer, der kan kopiere over DNA-skaderne. Enzymerne kaldes TLS-polymeraser, og cellen bruger kun disse i nødstilfælde, fordi de ofte sætter forkerte ’klodser’ overfor skaden i DNA-strengen, hvorved der kommer mutationer. Fordelen ved dem er, at kopieringen af DNA’et kan fortsætte, og cellen overlever; lastbilen bliver fjernet. Men faren er, at der introduceres mutationer, som kan sammenlignes med, at der efterlades et kæmpe hul i vejen. Nu tyder det også på, at mængden af DNA’ets byggesten, (dNTP’er) spiller en rolle i aktiveringen af TLS-polymeraserne. Hvis cellen udsættes for mange DNA-skader, skal cellen hurtigt kunne lave en masse byggeklodser, dNTP’er, for at overleve. En høj koncentration af dNTP’er i cellen gør formentligt, at cellen stopper op og reparerer DNA’et, før den fortsætter med at dele sig. Når DNA’et beskadiges, skal TLS-polymeraserne altså aktiveres, og det gøres formentligt af DNA’ets byggesten, dNTP’erne. Men måske er der en tredje spiller på banen. Forsøg tyder på, at celler, der mangler funktionelle energifabrikker, kaldet mitokondrier, ikke kan lave byggeklodser hurtigt nok, når deres DNA bliver skadet. Disse celler, kaldet rho0-celler, kan derfor formentligt ikke aktivere TLS-polymeraserne ligesom de ’normale’ gærceller. Hvordan påvirker dette aktiveringen af TLS-polymeraserne? Det undersøger jeg i dette speciales biologidel. Gær kan bruges som en model-organisme for en menneskecelle til at undersøge, hvad der foregår i menneskecellen. Gærceller ligner menneskeceller meget i deres opbygning, men er lettere at arbejde med i laboratoriet end menneskeceller. Mine forsøg viser derfor ikke, hvordan tingene foregår i menneskeceller, men kan give en idé om, hvordan tingene virker i menneskeceller, fordi gær ligner vores celler så meget. Derfor vil jeg bruge gær til at

4 Dette er ikke en journalistisk produktion, men blot en populær fremstilling af min biologi-teori. Derfor vil denne tekst ikke blive analyseret i journalistikanalysen.

65

undersøge, om celler, der mangler deres energifabrikker, overlever bedre eller dårligere end deres ’forældre’, som har energifabrikker. Jeg undersøger overlevelsen både i celler, der mangler en bestemt TLS-polymerase, og i celler, som har TLS-polymerasen, for at se om celler uden energifabrikker er ekstra følsomme over for at mangle nød-polymerasen. Det kan tænkes, at de er ekstra følsomme, fordi de måske bruger nød-polymerasen i højere grad. Mine biologi-resultater viser med en relativ stor statistisk sandsynlighed, at ’normale’ gærceller (WT) overlever lige så godt som gærceller uden TLS-polymeraser ved DNA-skader. Dette er forventeligt, fordi TLS-polymeraserne er vigtige for overlevelse ved DNA-skader. Mine resultater viser også, at gærceller uden funktionelle energifabrikker (rho0-gærceller) overlever lige så godt som WT eller en anelse bedre. Det er overraskende, idet celler uden energifabrikker har mangel på byggeklodser til DNA. Forklaringen på, at rho0-celler overlever så godt, kan være, at rho0-cellerne bruger nogle mere fejlfrie mekanismer til at kopiere over DNA-skader med end WT.

66

4. Journalistik Herunder præsenteres den journalistiske del af specialet. Der gives en teoretisk gennemgang af, hvordan videnskab i teorien formidles bedst muligt i journalistiske historier. Men først vil jeg afgrænse specialets problemformulering samt definere et par begreber, der ofte anvendes i specialet.

4.1 Afgrænsning og begrebsafklaringer

Begrebsafklaring af videnskabsjournalistik Der findes et utal af betegnelser for dét at skrive om videnskab og forskning: Videnskabsjournalistik, populærvidenskab, forskningsformidling, videnskabsformidling og forskningskommunikation for at nævne nogle. Dette speciale anvender ordet ’videnskabsjournalistik’ om en journalistisk tilgang/behandling af videnskab og forskning, hvor afsenderen er en journalist. De andre termer vil blive brugt, når disse anvendes af teoretikere på feltet, og når der ikke nødvendigvis henvises til journalistik. (Natur)videnskabsjournalistik Selv om journalistiske historier om humanistisk- og samfundsvidenskabelig viden også er videnskabsjournalistik, vil ordet ’videnskabsjournalistik’ i dette speciale kun referere til naturvidenskabsjournalistik, da dette er den gængse opfattelse af ordet, og idet specialet undersøger, hvordan journalistikken behandler historier inden for det naturvidenskabelige felt. Et skrevet produkt Der afgrænses fra at producere tv- og radioprogrammer, idet fokus er på indholdet i skrevne produktioner, og derfor vil jeg koncentrere mig om at optimere indholdet i artikler. Valg af medie Artiklerne i nærværende speciale er skrevet med henblik på offentliggørelse i et landsdækkende dagblad, som for eksempel Berlingske Tidende, Jyllands-Posten eller Politiken. Formålet er at producere et videnskabsjournalistisk produkt, der skal kunne læses og forstås af den brede befolkning. JP/Politikens Hus beskriver sine læsere som ”de moderne fællesskabsorienterede” [Jppol.dk]. Berlingske Tidende definerer dog sine læsere lidt mere konkret; han eller hun er 30-60 år, ”har en god løn, lever et travlt liv og har et optimistisk livssyn” [Berlingske.dk]. Derfor skrives artiklerne med denne type læser som målgruppe. Afgrænsning fra videnskabsteoretisk stillingtagen Når emnet falder på videnskab og videnskabsjournalistik, er det nærliggende at tale om, hvad viden er, hvordan vi tillægger os viden og producerer viden. En egentlig videnskabsteoretisk gennemgang afgrænser jeg mig fra, idet dette ligger uden for specialets problemformulering.

67

4.2 Teori og meninger om videnskabsjournalistik

Mange danskere føler sig direkte uoplyste om medicinske, videnskabelige og teknologiske fremskridt, selv om de generelt angiver at være meget interesserede i videnskab og teknologi. Det antyder to Eurobarometer-undersøgelser, hvor cirka 40% af danskerne i 2005 følte sig decideret uoplyste omkring videnskabelige og tekniske opdagelser, og billedet er det samme i dag [Eurobarometer 2005: 18, Eurobarometer 2010: 15]. Hvorfor føler folk sig så uoplyste? Måske skrives der for lidt om videnskab, eller også er den videnskabsjournalistik, der trods alt produceres for dårlig? Først må vi derfor se nærmere på, hvordan videnskab formidles for at kunne forandre den.

4.2.1 Hvad er videnskabsjournalistik?

Videnskabsjournalistik er journalistik om videnskab, der skal forsøge at sætte tingene ind i en sammenhæng, som læseren kan relatere til. Medieforsker Rikke S. Kjærgaard og videnskabsjournalist Harald Hornmoen mener, at medierne fortrinsvist formidler videnskab som ’Ritzau-formidling’, hvor noget nyt og banebrydende viden eller teknologi præsenteres [Kjærgaard 2006: 20-21, Hornmoen 1999: 19]. Disse historier handler primært om sundhed og sygdom eller store landevindinger inden for medicin [Arnoldi i Kjærgaard 2006: 61]. Mange medieforskere mener, at mediernes historier om forskning primært er nyheds- og sensationsstyret. Medieforskerne anser dette for problematisk, idet forskningsformidling er andet og mere end en præsentation af ny, sensationel ”Ritzau-forskning” og spektakulære begivenheder [Kjærgaard 2006: 7, Hornmoen 1999: 19, Roepstorff i Kjærgaard: 119]. I Ritzau-historierne bliver naturvidenskaben ofte kogt ned til en række sensationer, hvor forskeren får et minut i TV-Avisen til at forklare om dramatiske begivenheder som tsunamier, eksploderende tudser eller rumfartøjer, men hvor modtageren ikke hører om den forskning, der ligger bag nyheden [Roepstorff i Kjærgaard: 119]. Samlet kan man sige, at der findes to overordnede typer af videnskabsjournalistiske historier:

1. Ritzau-historier: Sensationelle, forenklede succeshistorier, der kun fortæller de ’glade nyheder’, som kommer ’alle til gode’, men intet om forskningen eller tvivlen ved den [Lindboe i Brier 2002: 26]. Den amerikanske professor og medieteoretiker Dorothy Nelkin mener, at denne type videnskabsjournalistik reflekterer journalistens heltebillede af videnskab. Journalister anser sig selv som oversættere af den rene videnskab ’ned’ til publikum [Nelkin 1995: 82-83]. Videnskabsformidling bliver således kun et spørgsmål om at oversætte videnskaben til et mere forståeligt sprog, som lægmand forstår.

2. Problemformuleringer: Forholder sig kritisk til det pågældende emne og fokuserer på de mulige samfundskonsekvenser [Lindboe i Brier 2002: 26]. Disse historier skrives med en baggrund/perspektivering og belyser fremtidige anvendelsesmuligheder og risici enten videnskabeligt, teknologisk eller socialt og ret ofte alle tre [Farago 1976: 10]. Læseren skal tilmed involveres personligt og gives en følelse af, at der samarbejdes om at løse et vigtigt problem [Farago 1976: 11]. Medieteoretikerne

68

favoriserer problemformuleringerne, fordi de giver anledning til dialog og tænkning i stedet for belæring af læseren.

4.2.2 Genrer

Videnskabsjournalistik skrives ofte som nyheder og videnskabelige gennembrud. Men Gitte Meyer, journalist, ph.d. og lektor ved Center for Bioetik og Risikovurdering, mener, at der er brug for at gentænke videnskabsjournalistikkens genrer, fordi en meget konservativ genre-brug fastlåser videnskabsjournalistikken i den gængse ’ny viden’-genre. Herunder vil nogle journalistiske genrer blive gennemgået kort, fordi det senere bliver interessant at undersøge, hvordan videnskabsjournalistik kan skrives inden for den givne genre.

4.2.2.1 Nyhed

Nyhedshistorien er relativt kort og kontant. Udgangspunktet er at besvare hv-spørgsmål om begivenheden; hvem, hvad, hvor og hvornår etc. [Avisnet.dk: Nyhedshistorie]. En nyhed er dog ikke altid en dagsaktuel begivenhed, men kan sagtens være konstrueret af journalisten, der har fundet frem til nyheden gennem sin research. En nyhed kan derfor godt være en ’vendt bøf’, det vil sige, at den har været bragt som nyhed før. Den nye udgave af historien er blot tillagt en anden nyhedskrog, så den igen kan anses som aktuel [Schultz 2006: 175]. Hvad der er nyt afhænger derfor af, hvad læseren ved i forvejen; hvad der er en nyhed for den ene, kan være kendt information for den anden.

4.2.2.2 Baggrund/udredende reportage

Baggrundshistorien forsøger at forklare baggrunden for en nyhed, der er så kompliceret og væsentlig, at den kræver grundig orientering og forklaring. Baggrunden skal forklare og klæde læserne på, så de kan forstå en sags sammenhæng, dens årsager og dens konsekvenser. En baggrundshistorie er ikke en nyhed i sig selv, men har ofte sit udgangspunkt i døgnets nyhedsdækning. En udredende reportage indeholder, i modsætning til baggrunden, selve nyheden og er en kombination af almindelig aktuel reportage og baggrund [Meilby 2006: 70]. Ofte bringer aviserne en baggrundshistorie og en nyhedshistorie om samme emne ved siden af hinanden på siden [Avisnet.dk: Baggrund].

4.2.2.3 Feature

Featuren bygger på sansninger og oplevelser. Den minder om reportagen, fordi den er malende i sine beskrivelser af, hvad der foregår. Men til forskel fra reportagen er featuren ikke altid bundet op på en aktuel begivenhed eller hændelse, men tager i højere grad et emne op og forsøger at beskrive status på et problem. For eksempel kunne udgangspunktet for featuren være: ”Hvordan er det at vokse op på Vesterbro i København?”, eller ”hvordan er det at være forsker i Danmark, når man skal slås med sine kolleger om forskningsmidlerne?”

69

Journalistens opgave er at give læseren den samme oplevelse, som han selv eller artiklens hovedperson har haft ud fra parolen: ’Dont’ tell it, show it’ [Avisnet.dk: Feature].

4.2.2.4 Essay

Meyer mener, at en essayistisk tilgang eller grundholdning til videnskabsjournalistikken kan løsrive den fra sin fastlåste position. I et essay tolkes og granskes et emne fra alle vinkler [Meyer 2005b: 94]. Essayisten forsøger at komme rundt om et kompleks emne ved at få indsigt i emnet og på den måde danne sig en velovervejet og kvalificeret mening om det [Meyer 2005b: 94].

”Essayet kredser netop om de modsætninger, paradokser og dilemmaer, den ambivalens, der er så allestedsnærværende i det praktiske liv.” [Meyer 2005b: 94]

I et essay søger man sandheden; man skriver det for at forsøge at finde ud af noget, ikke for at fremlægge en sandhed, man allerede har fundet. Forfatteren kan gå i debat med sig selv, og han skal forsøge at bryde med den gængse opfattelse af, at en overskrift ikke kan indeholde et spørgsmål. På den måde bryder forfatteren eller journalisten med forestillingen om, at videnskaben kun giver svar, og viser, at den også giver anledning til store spørgsmål, som kan debatteres offentligt.

4.2.3 Hvordan udvælges videnskabshistorier?

Hvordan udvælger medierne, hvilke videnskabelige historier, der er interessante og relevante for befolkningen at høre om? Først må man indse, at videnskabshistorier ikke anses som hårde nyheder, men som ’det bløde mellemgulv’ af nyhedsdækningen, som ofte klemmes ud, hvis de kommer i konkurrence med mere mainstream nyheder som politiske nyheder [Hansen 1994 i Allan 2002: 79f, Hornmoen 1999: 19]. Udvælgelsen (der hænger sammen med gatekeeping) afhænger både af nyhedskriterier og af, om nyheden har nok kapital, altså om den har værdi nok til at sætte dagsorden, sælge aviser etc., som der ses nærmere på i det følgende.

4.2.3.1 Nyhedsværdien afhænger af historiens kapital

Journalistens valg af historie afhænger blandt andet af ’trends’ i forhold til den journalistiske selvforståelse af, hvad der er god journalistik. Dette afspejles for eksempel i den form for journalistik, der honoreres med journalistikverdenens mest prestigefyldte pris herhjemme, Cavlingprisen. I nyere tid har disse trends været præget af tre forskellige idealer; henholdsvis formidlende, dagsordensættende og afslørende [Schultz 2005:162]5. Fra 1945 til 1964 blev

5 Schultz har analyseret, hvem der har vundet Cavlingprisen i perioden 1945 til 2004. Hun har analyseret bevæggrundene for at vinderen er blevet kåret og har fundet frem til de tre journalistiske idealer.

70

den formidlende journalistik primært honoreret, fra 1965-1984 var det dominerende ideal at være dagsordensættende, mens afsløring har været honoreret fra 1985 og frem til i dag [Schultz 2005:168-174]. Både dagsordensættende og afslørende journalistik er ifølge Schultz ’undersøgende journalistik’ og støtter dermed journalistikkens samfundsmæssige rolle som demokratiets vagthund. At sætte dagsordenen giver magt i det politiske felt, mens afsløring giver økonomisk magt; seere og avislæsere vil have afsløring, og derfor sælger det [Schultz 2005:172]. En afsløring kan yderligere medføre, at emnet kommer på mediernes dagsorden, og derfor er der i dag mere kapital6, det vil sige symbolsk magt, forbundet med at være afslørende end dagsordensættende [Schultz 2005:163, 172]. Mange journalister anser således ikke videnskabshistorier som særligt prestigefyldte, fordi de mangler ”the drama necessary to spark lively newspapaer headlines” [Allan 2002: 68] – altså fordi muligheden for afsløring og for at sætte dagsorden i journalistens øjne er forsvindende lille, når det gælder videnskabsjournalistik. I forlængelse af dette kan videnskabshistorier kun ende som reelle nyheder, hvis de er skøre og gakkede (weird-and-wacky) [Allan 2002: 79]. Skøre videnskabshistorier opfylder fascinationskriteriet og ender ofte som en ukritisk Ritzau-historie. Den eneste anden måde, hvorpå historien kan ende som en reel nyhed, er, hvis historien har en forbindelse til beslutninger i den politiske eller økonomiske verden [Hansen 1994 i Allan 2002: 79f], så den opfylder idealet om at være dagsordensættende eller afslørende.

4.2.3.2 Videnskabsjournalistikkens nyhedskriterier

Stuart Allan, formand for Journalistuddannelsen på Bournemouth University i England, har undersøgt britiske videnskabsjournalisters meninger om, hvilke nyhedskriterier, der skal være opfyldt, for at videnskabsnyheder slipper igennem journalistens finmaskede net (en del af gatekeeping-processen på mediet) og ud i nyhedsstrømmen [Allan 2002: 77-78].

• Fascination: Historien skal være fascinerende. Folk vil gerne kunne tænke, ’hvor utroligt, det vidste jeg ikke!’

• Størrelsen af emnets publikum: Størrelsen på det antal læsere, der allerede ved, at de vil være interesserede i at læse en historie om et givent emne, er afgørende. For eksempel vil det naturlige publikum være større for en velkendt sygdom, som mange har eller frygter at få, end for en sjælden sygdom.

• Væsentlighed: Historien er kun interessant, hvis den gør en forskel for mennesker ude i den ’virkelige verden’. Det vil sige, at opdagelsen eller opfindelsen skal have en relevant sammenhæng for læseren. Washington Post-journalisten Rensberger mener, at det skal vurderes, om den videnskabelige opdagelse eller opfindelse gør en forskel

6 Kapital skal her forstås som prestige, og at det ’sælger bedre’ at skrive nyheder, der er afslørende frem for dagsordensættende eller bare formidlende. Jeg er bevidst om, at den franske sociolog Pierre Bourdieu pionerede i begrebet ’kapital’, men jeg afgrænser mig for en videre redegørelse heraf og forholder mig til Schultzs udlægning af begrebet.

71

”in the real world, especially in that of the average newspaper reader” [Rensberger i Allan 2002].

• Pålidelighed af resultaterne: Forskningen skal være kollegialt bedømt (peer reviewed), idet det er den bedste måde til at sikre, at forskningen er af høj kvalitet.

• Aktualitet: Jo nyere nyheden er, jo mere nyhedsværdig er den. For journalister er det vigtigt for en histories nyhedsværdi, at forskningen er ’ny’. Derfor er en historie bragt i Nature ’i dag’ mere nyhedsværdig, end hvis forskningsresultater samles op og ses som en proces [Dunwoody i Bucchi og Trench 2008: 19-20]. Yderligere bliver en historie endnu mere interessant, hvis forskeren giver den eksklusivt til én journalist (solohistorie) [Dunwoody i Bucchi og Trench 2008: 19-20].

En anden undersøgelse af videnskabsjournalistik i den britiske presse udført af Hansen afslører flere nyhedskriterier:

• Menneskelig vinkel/identifikation: Journalister mener, at en historie med en menneskelig vinkel har mere nyhedsværdi end andre historier, fordi læseren kan identificere sig med videnskaben og sætte den ind i en hverdagssammenhæng. Hvis journalisten kan ’konstruere’ en sådan menneskelig vinkel, er succesraten for historien høj [Hansen i Allan 2002: 79]. Et speciale om fortællende populærvidenskab antyder yderligere, at læserne synes, at fortællende populærvidenskabelige artikler er sjovere, lettere at forstå og lige så troværdige som traditionelle artikler [Paludan 2005]. Dette indikerer, at den menneskelige vinkel samt fortællende elementer kan bruges til at øge læserens interesse for at læse videnskabshistorien, forudsat at læserens interesse allerede er vakt af for eksempel rubrikken.

• Historiens kompleksitet: Kompleksiteten er afgørende for videnskabshistoriens succes primært på grund af produktionskrav. Journalisten har deadline hængende over hovedet, og en kompleks videnskabshistorie kræver tid at ’oversætte’ og gøre interessant for læseren [Hansen i Allan 2002: 79].

4.2.3.3 Nyhedsværdi er et relativt begreb

Nyhedskriterierne kan dog være mere eller mindre afgørende. I forhold til publikumsstørrelse er der for eksempel adskillige eksempler på, at medierne skriver historier, selv om det naturlige publikum er relativt lille, for eksempel Creutzfeldt-Jakob sygdom, den menneskelige udgave af kogalskab [Allan 2002: 78-96]. Selv om kun cirka én ud af en million mennesker rammes, får sygdommen usædvanligt meget omtale, fordi medierne vurderer, at risikoen for befolkningen er stor [Allan 2002: 78-96]. Andre historier har naturlig adgang til medierne, selv om de ikke umiddelbart opfylder nogle af de opstillede nyhedskriterier (journalisten forklarer i nogle tilfælde udvælgelsen med en mavefornemmelse eller instinkt [Allan 2002: 82]), for eksempel global opvarmning. Allan mener, at emnet i sig selv er interessant i mediernes optik, fordi det er en del af den politiske debat, og derfor har historierne potentiale

72

for at sætte den politiske dagsorden [Allan 2002: 2, 92]. Ifølge Hornmoen er nyhedskriterier dog ikke en iboende egenskab, men noget journalisten ofte selv skaber i sin research.

”Nyheter er produkter av iakttakelserne, overveielsene og valgene til journalisten. Nyhetsverdi er gjerne noe man tilfører et oppslag når man bearbeider og vinkler stoffet. Journalisten gjør stoffet aktuelt og vesentlig og skaper identifikasjon hos publikum ved måten hun fremstiller det på.” [Hornmoen 1999: 19f]

Derfor er antallet af nyhedskriterier, som en historier opfylder, relativt, fordi journalisten selv kan tilføre dem i sin research.

4.2.3.4 Vinkling og skarpvinkling

Nu har vi identificeret, hvilke kriterier, der ved første øjekast skal opfyldes, for at der er fundament for en god videnskabshistorie i journalistens øjne. Når historien skal skrives, er der dog også nogle krav, som journalisten ønsker opfyldt, for at vinklen på historien bliver stram – altså at historien har en klar rød tråd. En vinkel er en indfaldsvinkel på stoffet og en afskæring af dele af helheden [Kramhøft 2000: 33]. Vinklen skal gøre stoffet forståeligt, koncentrere læserens opmærksomhed om den udvalgte del af emnet og give ham eller hende den nødvendige viden for at forstå historien og dens relevans [Strand 2004: 64f]. At selektere og udvælge netop de informationer, der er relevante for læseren, er essensen i vinkling [Jensen 2001: 123]. Journalisten må tilstræbe at ”gøre vinklen så skarp og præcis”, at det umiddelbart er klart, hvad historien handler om [Strand 2004: 64f], og udelade ”alle mindre væsentlige detaljer, som kan stå i vejen for den hurtige tilegnelse af hovedbudskabet” [Kramhøft 2000: 33]. Sproget må heller ikke blive for kompakt, hvilket kan ske i formidlingen af svære emner og stofområder. Faren ved vinkling er, at der vinkles for skarpt. Dette kan ske i alle journalistiske historier, men sker oftest i politisk journalistik ifølge Arne Hardis, journalist og politisk redaktør på Weekendavisen [Hardis i Krause-Kjær 2003: 38]. Skarpvinkling kan derfor anses som negativt, når journalisten skærer så mange informationer om et sagsforløb væk, at ”nyheder står i vejen for sandheden” [Hardis i Krause-Kjær 2003: 38]. Et meget skarpvinklet indhold, der er plukket for informationer, og som fordrejer sandheden, kan således være negativt for læseren. På den måde har journalisten en stor magt, fordi det udelukkende er ham, der vurderer og i sidste ende bestemmer, hvilke detaljer, der er væsentlige for, at læseren kan tilegne sig budskabet. Journalisten bestemmer, hvilke aktører der citeres, hvem der skal have mulighed for at udtale sig, hvor meget og i hvilken sammenhæng [Lund 2002: 167]. Derfor må journalisten være guidet af begreber som fairness – her forstået som etisk forsvarlig fremstilling af sagens parter – nøjagtighed og public service [Kramhøft 2000: 43]. Historien skal til syvende og sidst være sand og dækkende [Kramhøft 2000: 34f]. Ved sand menes, at journalisten aldrig må skrive noget, som han ikke har hørt, og han må aldrig manipulere med

73

udtalelser. Ved en dækkende journalistisk fremstilling af begivenheder menes, at artiklen giver et realistisk billede af forholdene, og at den derfor ikke er ensidig og misvisende [Kramhøft 2000: 34]. Til dette hører også, at journalisten skal undgå perspektivforskydninger ved kun at høre én part, således at der skabes et misvisende billede af begivenheden eller sagen [Kramhøft 2000: 41].

4.2.4 Hvordan forholder medierne sig til videnskab?

For at blive klogere på, hvorfor videnskab formidles, som den gør, er det nødvendigt at se forskningskommunikation i forhold til nogle politiske og demokratiske diskurser7. Disse diskurser er måder at anskue det politiske/demokratiske felt på, som forskningskommunikationen, herunder videnskabsjournalistikken, foregår i [Jensen i Kjærgaard 2006: 77]. Diskurserne danner grundlag for, hvilken verdensopfattelse videnskaben formidles ud fra. Pointen er, at journalistens verdensopfattelse influerer på hans journalistik.

4.2.4.1 Forståelsesunderskud i befolkningen

Én måde at anskue videnskabsformidling på er ud fra ideen om, at der hos befolkningen er et forståelsesunderskud for forskningens nødvendighed og betydning. Dette medfører, at borgeren skal oplyses, og at forskning fremstilles som ’gode fortællinger’. I forståelsesunderskudsdiskursen er der således tale om information, ikke samarbejde og ikke megen involvering af læseren. Ifølge flere medieforskere formidles naturvidenskab herhjemme typisk ud fra forståelsesunderskudsdiskursen [Jensen i Kjærgaard 2006: 78, Meyer 2004]. Modtageren af naturvidenskabeligt stof er ”Maren i Kæret”, der opfattes som uvidende og skeptisk overfor naturvidenskab og teknik [Kjærgaard 2006: 17, Roepstorff i Kjærgaard 2006: 111]. Der er dog ikke meget empirisk belæg for, at der findes et forståelsesunderskud i befolkningen [Jensen i Kjærgaard 2006: 77f], hvorfor det formentligt ikke er hensigtsmæssigt at formidle på denne måde. Hornmoen efterlyser en anden diskurs, ofte kaldet dialogdiskursen, hvor det antages, at borgerne er oplyste og kan deltage i en dialog som videnskab. Her handler det om at skabe mulighed for, at en kritisk offentlighed kan komme til orde og søge indflydelse på forskningens indhold og konsekvenser. Denne diskurs udspringer af et borgerønske om at få indflydelse på, hvilken forskning der giver mening for dem selv og samfundet, og borgerne stiller sig ikke længere tilfredse med at være publikum for forskningens profilering [Jensen i Kjærgaard 2006: 82]. Journalisten bør derfor indse, at folk er fornuftige, tænkende mennesker, der har forudsætninger for at deltage i en dialog om videnskab og dens betydning i samfundet [Hornmoen et al. 2006: 30].

7 Jeg afgrænser mig fra at anvende diskurs-teori, idet det ikke er relevant for besvarelse af problemformuleringen. Med diskursbegrebet menes ’antagelser om -’ eller ’måder at anskue’ samfundet på.

74

En undersøgelse af Siune og Vinther (1998) støtter antagelsen om, at medier formidler ud fra forståelsesunderskudsdiskursen og ikke forsøger at skabe dialog og deltagelse. Undersøgelsen viser, at cirka 70% af alle videnskabelige artikler (både omhandlende humaniora, samfunds- og naturvidenskab) udelukkende præsenterer rene forskningsresultater. Kun i cirka 10% af artiklerne præsenteres forskning som led i en argumentation, og i cirka 6% kombineres dette med en direkte opfordring til handling [Siune og Vinther 1998: 17] 8.

4.2.4.2 Ukritisk videnskabsjournalistik, og hvad vil det sige?

I dette afsnit undersøges, hvorfor videnskabsjournalistikken kritiseres for at være for ukritisk i dens tilgang til videnskab, og hvorfor mange medieteoretikere mener, at journalistikken svigter sin rolle som demokratiets vagthund, når der er videnskab på menuen. Meyer har i sin ph.d.-afhandling interviewet 35 forskere i biomedicin og økonomi samt folketingsmedlemmer og dagbladsjournalister for at undersøge mulighederne og forhindringerne for at bedrive kritisk journalistik om forskning og videnskab. På baggrund af interviewene konkluderer Meyer, at den gængse måde at formidle videnskab på forhindrer videnskabsjournalister i at grave uorden og overtrædelser af regler og normer i samfundet frem [Meyer 2005a: 489]. Videnskabsjournalistik har i Meyers øjne en undersåt-relation til videnskab og kan dårligt opfattes som journalistik [Meyer 2005a: 372-373]. Forklaringen ifølge Meyer er, at det journalistiske ideal om objektivitet fordrer, at journalisten ikke må tænke selv, og dette tænketabu ender med mikrofonholderi, hvilket udarter sig til ren PR for videnskaberne [Meyer i Hornmoen 2006: 84-85]. Meyer opfordrer altså journalister til mindre formidling af videnskab og mere kritisk tænkning. Videnskabsjournalist på Weekendavisen, forfatter og neurobiolog Lone Frank er dog ikke enig i, at videnskaben formidles for meget. Frank mener, at formidling af videnskaben er nødvendig for en sober debat, idet videnskabelig ”viden og indsigt er forudsætningen for at kunne være kritisk på en begavet måde” [Frank 2005].

”Ingen kan forholde sig til den voldsomt politiserede klimadebat uden gedigne forklaringer på de forskellige forskningsretninger og deres resultater. Ingen kan heller tage informeret stilling til gensplejsede fødevarer uden at have gaflet en pæn portion viden om basal genetik indenbords. Derfor mener jeg, det er helt rimeligt, at de medier, som også skal være kritiske, samtidig lægger spalteplads og sendeflade til en sober formidling af videnskaben.” (…)

8 Undersøgelsen analyserer artikler fra 5 danske dagblade (Politiken, Berlingske Tidende, Jyllands-Posten, Aktuelt og Information) over 3 måneder. De 70% refererer til videnskabelige artikler med videnskab som hovedindhold, det vil sige hvor forskning og udvikling er bærende for artiklen [Siune og Vinther 1998].

75

”Hvis videnskabsjournalister holder fast i viljen til også at formidle, kan man håbe, at danskerne en dag bliver i stand til at forholde sig ikke bare kritisk, men kvalificeret kritisk, til den forskning og videnskab som omgiver dem og former deres verden.” [Frank 2005]

Gammeltoft og Frank kritiserer overordnet videnskabsjournalister for at fejle i at oplyse om de egentlige videnskabelige spørgsmål og for at markedsføre den politiske og populistiske skepsis overfor for eksempel genmodificerede organismer [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 160, Frank 2004: kap 2]. Problemet ved ikke at forklare om selve videnskaben i nyheden er, at modtageren ikke har forudsætninger for at forstå nyheden [Friedman et al. 1999: 188, Hornmoen 1999: 135-136]. Kristian Hvidtfelt Nielsen, lektor og ph.d. på Institut for Videnskabsstudier ved Aarhus Universitet, mener, at Franks insisteren på at fortælle læserne om substansen i de videnskabelige emner gør læseren ” i stand til at forstå og forholde sig kritisk til videnskab og teknologi”:

”Franks kritiske videnskabsjournalistik er det, jeg vil kalde, substanskritisk og udpræget demokratisk og overlader den mere overordnede og samfundsrelaterede kritik til læserne selv.” [Nielsen 2005]

Ud over spørgsmålet om hvor meget substansen skal fylde i videnskabsartikler, kritiserer medieforskerne også videnskabsjournalister for at være for blåøjede og ukritiske i forhold til forskere. Hornmoen mener, at videnskabsjournalister bør indse, at forskere ikke er uafhængige af særinteresser [Meyer i Hornmoen 2006:132, Dean 2002]. I lægemiddelindustrien står milliarder på spil, når et nyt medikament skal på markedet. Her vil kun de positive virkninger ved midlet blive præsenteret af forskeren, hvorfor journalisten bør stille sig kritisk overfor forskningens resultater. Forskeren har yderligere en magtposition i samfundet, fordi hans viden indgår i politiske beslutninger [Hornmoen 1999: 16]. Journalisterne bør derfor granske denne magt - interessere sig for, om forskningen er af rimelig kvalitet og hvor meget fusk, der foregår med resultaterne - ligesom de interesserer sig for fusk begået af politiske og af økonomiske magthavere [Sylwan i Hornmoen et al. 2006: 62, Hornmoen 1999: 16]. Pointerne er, at videnskabsjournalistik bør indeholde oplysninger om det videnskabelige stof. Samtidig skal den være kritisk, idet videnskab indgår i det politiske spil, og fordi videnskab er del af samfundet og ikke bare kan anses som sandheder, der svæver over offentlig diskussion.

4.2.5 Udfordringer i journalistens behandling af videnskabelige

resultater

Nu er der blevet defineret en række overordnede problemer for samfundet i forhold til journalistens tilgang til videnskabsjournalistik. Lektor i Journalistik ved Indiana University i USA Holly Stocking har undersøgt videnskabshistorier og defineret nogle fejl og mangler på indholds- og tekstniveau. Disse fejl og mangler vil blive gennemgået herunder for at få et

76

overblik over, hvad videnskabsjournalisten skal være bevidst om i sin research og i skriveprocessen.

4.2.5.1 Manglende kildekritik

Flere medieforskere kritiserer, at medierne ofte sætter højt respekterede forskere overfor forskere, hvis videnskabelige standpunkt ikke accepteres af forskerverdenen. Stocking mener, at dette er kritisabelt, idet læseren ikke gøres opmærksom på uligevægten. Et af de mest ekstreme eksempler på denne kildebrug kommer fra USA, hvor forskere, der var ansat af tobaksindustrien, fik lige så meget taletid i amerikansk presse som universitetsforskere i spørgsmålet omkring risikoen for udvikling af lungecancer forårsaget af rygning [Stocking i Friedman et al. 1999: 29]. Samme tendens sås i klimadebatten (og gør måske stadig), hvor videnskabsfolk fra industrien med interesse i at nedtone konsekvenserne blev tildelt lige så stor vægt af medierne som uafhængige forskere [undersøgelse af Wilkins 1993, se Friedman et al. 1999: 29]. Ved at præsentere begge meninger på denne måde kan læseren ikke vurdere, hvilket et af synspunkterne, der er mest empirisk belæg for [Nelkin 1995: 88]. Denne ’ligevægtige, men ufortjente ligevægtige’ kildebrug er med til at få videnskab til at fremstå mere kontroversiel og usikker end størstedelen af forskere anser den for at være [Stocking i Friedman et al. 1999: 29]. Kildebrugen skyldes formentligt journalisters stræben efter objektivitet, der gør, at han/hun ukritisk hører parter i sagen, også selv om flest videnskabelige resultater støtter det ene synspunkt [Dunwoody i Friedman et al. 1999: 71-73]. Denne naive tilgang til objektivitetsbegrebet, hvor forskellige meninger ukritisk balanceres mod hinanden, øger ikke den offentlige forståelse for videnskab [Nelkin 1995: 60]. Hornmoen mener derfor, at hvis der ikke er konsensus inden for et givent videnskabeligt område (og hvor begge ’forsker-lejre’ har gode, valide argumenter for, at deres hypotese er rigtig), skal det præsenteres som ideer og hypoteser og som en diskussion imellem forskerne/kilderne på feltet i stedet for at præsenteres som fakta [Hornmoen et al. 2006: 77]. Hvis hypoteserne præsenteres som fakta i enkeltartikler, ender det nærmest med at være ’komisk’ dårlig journalistik, som da Aftenposten skrev om akrylamid, der dannes, når madvarer frituresteges eller steges. Først blev der slået alarm om de kræftfremkaldende effekter af at indtage akrylamid, derefter blev alarmen afblæst og få uger senere var stoffet igen kræftfremkaldende: ”Full alarm om gift i maten” (24.04.02), ”Akrylamid øker ikke kreftfaren”(28.01.03) og ”Akrylamid fortsatt farlig” (06.02.03) [Hornmoen et al. 2006: 74].

4.2.5.2 Journalister vurderer ikke validiteten af forskningen

Flere enkeltsager og studier viser, at journalister ofte ikke vurderer, om videnskabelige resultater er valide, og om data er tilstrækkelige til at forskningsresultaterne offentliggøres [Voss 2003, Frank 2004: 32, Jelsøe et al. i Gaskell og Bauer 2001: 162-163]. Et amerikansk studie fra 1998 viste, at mere end en tredjedel af alle de sundhedsnyheder, der var blevet præsenteret på store videnskabelige konferencer i 1998, og som endte i pressen, kun var

77

baseret på foreløbige forsøg. Det vil sige, at der kun indgik få forsøgspersoner i de kliniske forsøg, eller at forsøgene kun var udført på dyr. Tre år senere var kun halvdelen af original-forskningen publiceret i førende peer reviewed medicinske journaler, få var publiceret i mindre journaler, og andre var slet ikke publicerede [Schwartz i Voss 2003]. En sag fra 1999 om gensplejsede kartofler illustrerer ligeledes, hvordan journalister har svært ved at vurdere, hvor sikker forskning er. En forsker, Dr. Pusztai fra det britiske Rowan Institute, stod frem og erklærede, at genmodificerede kartofler var giftige, og at gensplejsning som metode var farlig. En flok forsøgsrotter var nemlig blevet syge af gensplejsede kartofler, der producerede et giftigt protein [Frank 2004: 32, Jelsøe et al. i Gaskell og Bauer 2001: 162-163]. Rotterne var dog ikke blevet syge af at spise konventionelle kartofler drysset med proteinet, hvorfor forskeren konkluderede, at gensplejsningen i sig selv var sygdomsårsagen. Problemet var, at Dr. Pusztai ikke havde målt indholdet af protein i henholdsvis de gensplejsede kartofler og på de dryssede kartofler [Frank 2004: 33]. Ifølge Frank var forsøgene altså dårligt udført, og der var bias i forsøgsopstillingen. Både Frank og Gammeltoft mener, at ’ufærdige eksperimenter’, det vil sige data, der endnu ikke er peer reviewed, ikke skal gøres til genstand for offentlig debat [Frank 2004: 33, Gammeltoft 2004].

4.2.5.3 Sprogbrug forhindrer kritisk tilgang

Flere medieforskere understreger, at så længe journalister anser forskningsresultater som sikker viden, der ikke kan gøres til genstand for offentlig overvejelse, og så længe forskeren anses som objektiv og neutral, kan videnskabsjournalistik aldrig antage en kritisk form [Meyer 2005b:62, Hornmoen 1999: 16, Steele i Albæk et al. 2002: 17, Gilbert i Bucchi 1998: 124]. Sprogbruget i videnskabsartikler afspejler videnskabsjournalistikkens insisteren på sikker viden i den klassiske indledning til videnskabsartikler: ’Ny forskning viser’ [Hornmoen 1999:180f], eller ’En ny undersøgelse viser’. Sprogbrugen giver opfattelsen af, at videnskab er en stor objektiv virksomhed (hvorved der ikke kan sås tvivl om resultaterne). I stedet bør disse indledninger undgås og forskningens usikkerheder, forbehold og fremgangsmåden (metoden) bør synliggøres [Hornmoen 1999:186]. Yderligere bruges begrebet ”forskerne” i bestemt form og flertal, hvilket antyder, at alle forskere kan skæres over én kam [Meyer 2000: 29, Hornmoen 1999:180f]. Dette skaber en afstand mellem ’dem’, altså forskerne og ’os’, det vil sige læseren. Derfor bør journalister være mere påpasselige i deres sprogbrug og præcisere, hvilke forskere det drejer sig om, og hvilke fagområder de repræsenterer [Hornmoen 1999: 180].

4.2.5.4 Vigtige forbehold og usikkerheder udelades

En kvantitativ undersøgelse af socialvidenskabelig forskning i omnibuspressen viste, at journalister generelt udelader forbehold om sikkerheden af videnskabelige resultater [Weiss og Singer 1988 i Friedman et al. 1999: 24-25]. Mange videnskabsmænd mener faktisk, at det største problem i journalistiske videnskabsartikler er udeladelse af vigtige informationer og detaljer [Nelkin 1995: 118]. I en undersøgelse fra 1989 skulle videnskabsmænd vurdere, om

78

de syntes en populær artikel om et videnskabeligt resultat var fyldestgørende eller ej. Én af forskerne udtalte:

“If a popular article reports that a new drug seems to cure some disease but fails to mention its severe side effects, we would not view the article as a sufficiently comprehensive representation of the drug’s effects. To represent reality fully, a message must address all dimensions of a topic that readers expect to learn about.” [Rowan 1989 i Pellechia 1997: 51]

Flere undersøgelser antyder da også, at en journalistisk fremstilling af et emne oftest får forskningsresultater til at fremstå mere sikre end før den journalistiske bearbejdning [Stocking i Friedman et al. 1999: 25]. Samme tendens viste sig i en tekstanalyse foretaget af professor i engelsk Jeanne Fahnestock i 1986, hvor videnskabelige artikler skrevet i Science Magazine blev sammenlignet med artikler fra nyhedsmedier om samme forskning [Fahnestock 1986 i Friedman et al. 1999: 25]. De populære versioner overdrev de videnskabelige påstande, nedtonede de videnskabelige forbehold og opjusterede sikkerheden af opdagelserne. For eksempel blev en konklusion om køn og matematisk kunnen beskrevet således i Science Magazine:

“We favor the hypothesis, that sex differences in achievement and in attitude toward mathematics result from superior male mathematical ability, which may in turn be related to greater male mathematical ability in spatial tasks.” [artikel af Benbow og Stanley i Friedman et al. 1999: 25]

Den populære version i Newsweek lød dog:

”The author’s conclusion: sex differences in achievement and in attitude toward mathematics result from superior male mathematical ability.” [Friedman et al. 1999: 25]

Ved at fjerne forbeholdene i teksten, strammes budskabet for meget. I dette tilfælde fordi forskerne understreger, at der er tale om en hypotese, som de hælder til, men dette forbehold udelades i den populære version. Stocking anbefaler således, at artikler inkluderer tre former for forbehold:

Ord og fraser, som tager forbehold for usikkerheder inkluderes (”dette indikerer” eller ”dette betyder måske”).

1. Forbehold for undersøgelsens sikkerhed, for eksempel ”tilfældigheder kan forklare udsvingene i resultaterne” eller ”der er tale om en hypotese”.

2. Begrænsninger i forhold til data, for eksempel skal det fremgå, hvis dataene er foreløbige og behæftet med stor usikkerhed [Stocking i Friedman et al. 1999: 35].

79

En stor kvantitativ undersøgelse af læserens opfattelse af journalisters og forskeres pålidelighed konkluderer faktisk, at læserne (N=601) anser både journalisten og forskeren som mere troværdige, hvis sproglige forbehold som ”kan”, ”måske”, ”vil måske” og information om undersøgelsens begrænsninger inkluderes i artiklerne [Jensen 2008]. Læserne mente yderligere, at troværdigheden var størst, hvis forbeholdene kom fra forskeren selv og ikke fra forskerkolleger [Jensen 2008]. Forklaringen på at journalister helst undgår forbehold og usikkerheder i forhold til forsøgsresultater er ifølge medieteoretikeren Marianne G. Pellechia, at historien bliver mere nyhedsværdig ved ikke at inddrage for meget kontekst [Pellechia 1997: 62]. De populære avisartikler bliver altså mere spændende og sensationelle i journalistens og redaktørens øjne uden forbehold og tekniske detaljer [Rowan 1989 og Fahnestock 1993 i Pellechia 1997: 62].

4.2.5.5 Metoden beskrives ikke

Yderligere viser flere undersøgelser, at journalistiske historier udelader metodebeskrivelser [opsamlet i Bucchi og Trench 2008: 19, Pellechia 1997: 51]. En undersøgelse fra 2002 af videnskabshistorier i fire græske aviser viste for eksempel, at 75% af alle historierne ikke indeholdt nogen metodeovervejelser, og at metodediskussionerne i de resterende 25% var overfladiske og korte [Dimopoulos og Koulaidis 2002 i Bucchi og Trench 2008: 19]. Manglen på metodebeskrivelser eller beskrivelser af forsøgs-designet kan betyde, at resultaterne fremstår mere sikre, end de er, fordi modtageren ikke kan vurdere, om forsøgene er store og dækkende nok. Der argumenteres for, at hvis metoden beskrives, har læserne selv mulighed for at vurdere validiteten af forskningen. For eksempel bør der nævnes, hvor mange forsøgsdyr der er tale om, og hvor statistisk sikre resultaterne er [Pellechia 1997: 53]. Idet mange mennesker udelukkende lærer om videnskab gennem pressen, vil udladelse af metodebeskrivelser potentielt resultere i, at specifikke resultater og videnskab generelt misforstås [Pellechia 1997: 64].

4.2.5.6 Glemmer videnskabelig kontekst

Ifølge Stocking glemmer journalister at undersøge, hvad der er skrevet om et videnskabeligt emne før – altså sætte videnskaben ind i en sammenhæng med tidligere forsøg og undersøgelser. Pellechia (1997) fandt ud af, at lidt under 60% af de videnskabsartikler fra tre årtier i New York Times, Chicago Tribune og Washington Post nævnte andre undersøgelser på området [Pellecia i Friedman et al. 1999: 26]. Cirka 40% af artiklerne blev således ikke sat i kontekst. Et andet studie viste yderligere, at New York Times havde bragt en historie om, at børn, der så vold på tv, efterfølgende kunne udvikle aggressiv opførsel. Historien var skrevet på baggrund af en rapport fra National Institute of Mental Health (NIMH). En måned senere bragte New York Times en anden historie om den positive effekt af børns tv-kiggeri uden at nævne NIMH-rapporten [Weiss og Singer 1988 i Friedman et al. 1999: 26]. Men uden resultaterne fra NIHM-rapporten kunne læseren foranlediges til at drage forkerte konklusioner om effekten af børns tv-vaner. Manglende kontekst kan også betyde, at videnskab ikke ses

80

som en proces, men som isolerede videnskabelige gennembrud og facts. Den videnskabelige kontekst anses derfor som et vigtigt element i god videnskabsjournalistik [Pellechia 1997: 59].

4.2.5.7 Overdriver risiko-momenter

Allan kritiserer historier, hvor en risiko, der er forsvindende lille, overdrives, fordi medierne håber, at historien kan sætte den politiske dagsorden [Allan 2002: 88-92]. Allan kalder mediernes brug af risikoberegninger for ”organiseret uansvarlighed”, fordi medierne med vilje misinformerer folk og skaber panik [Allan 2002: 95]. Folk reagerer på mediernes udlægning af farer, og dette kan føre til ændringer i holdninger, livsstil og forbrugsvaner [Nelkin 1995: 70, Voss 2003]. For eksempel førte mediernes intense dækning af, at fede mælkeprodukter kan give hjertesygdom, til, at folk købte mindre fed mælk, æg og kød [Nelkin 1995: 70]. Ligeledes fik en historie om, at nogle kvinder er genetisk disponeret for brystcancer, mange kvinder til at forlange gentests, og raske kvinder fik endda fjernet deres bryster forebyggende [Nelkin 1995: 70]. Overdrivelse af risici kan derfor have store konsekvenser i samfundet og føre til dramatiske ændringer af opførsel [Nelkin 1995: 71].

4.2.5.8 Mange énkilde-historier

Journalister skriver mange énkilde-historier, viser både internationale- og danske undersøgelser, hvilket mange medieforskere kritiserer. Albæk et al. har vist, at det gennemsnitlige antal forskere pr. historie har ligget stabilt på cirka 1,3 fra 1961-2001, hvilket indikerer, at forskernes synspunkter oftest ikke udfordres af andres synspunkter [Albæk et al. 2002: 42]. Samme tendens ses i en dansk indholdsanalyse af Siune og Vinther, hvor der i over 80% af artikler om forskning i danske aviser kun indgår én eller ingen mundtlige kilder [Siune og Vinther 1998: 27]. En undersøgelse af amerikanske videnskabsartikler viste, at selv i en kontroversiel sag om sundhedsfarerne ved pesticidet Alar, hvor man ville forvente flere ekspertudtalelser, anvendte en tredjedel af historierne kun én kilde [se undersøgelse i Friedman et al. 1999: 26]. Journalisten bør høre flere kilder, for at forskerens udtalelser og meninger ikke står alene, men udfordres af andre kilder.

4.2.6 Opstilling af idealkravene

I det forrige har jeg gennemgået, hvordan flere medieteoretikere italesætter deres opfattelse af god videnskabsjournalistik samt gennemgået teorien på området. Ud fra dette opstilles et skema med nogle krav til videnskabsjournalistikken. Disse krav udgør tilsammen ’formlen’ til den, i teoretikernes øjne, gode videnskabsjournalistik. Kravene omtales derfor herefter som ’idealkrav’ og vil danne grundlag for analysen. Disse idealer består af tre slags krav til journalistikken.

81

Først nogle såkaldte normative krav, der ikke kun gælder for videnskabsjournalistikken, men for journalistik generelt, for eksempel kravet om, at journalistik skal være sand og dækkende. For det andet nogle journalistiske idealkrav, der stammer fra den kritiske journalistiske tradition. Disse journalistiske idealkrav er primært italesat af journalister og tilstræber, at historien vækker læserens interesse. Disse krav fordrer tilmed, at historien har en forbindelse til beslutninger i den politiske eller økonomiske verden, således at idealet om at være dagsordensættende eller afslørende opfyldes. Til sidst opstilles der ud fra teorien nogle videnskabelige krav, som primært værner om det videnskabelige indhold. Disse er primært italesat af forskere og kritikere af videnskabsjournalistikken, som den skrives i dag. Disse krav fordrer, at historien blandt andet skal forklare videnskaben samt indeholde metodebeskrivelser og videnskabelig kontekst. De journalistiske og de videnskabelige idealkrav udspringer af to forskellige paradigmer med forskellige formål: Videnskabsfolk er drevet af at finde ud af, hvordan verden hænger sammen og værner derfor om videnskaben. Videnskabsmanden mener, at kun videnskaben og dens kontekst er relevant og interessant i en tekst – alt andet er fyld. Journalisten er drevet af at fange læserens interesse med sin tekst, hvorfor journalisten primært værner om sin modtager. Der opstår derfor et spændingsfelt mellem de to paradigmer, som afspejles i de opstillede idealkrav, se Tabel 8. I analysen vil de videnskabelige og journalistiske idealkrav blive anvendt som ideal for god videnskabsjournalistik. Analysen undersøger, hvor mange idealkrav de producerede artikler opfylder for at besvare problemformuleringen. De normative krav vil ikke blive analyseret, idet disse gælder for alt journalistik.

82

Normative idealkrav

Journalistikken skal være sand og dækkende

Journalistikken skal være substanskritisk

Journalistikken skal forsøge at afsløre uorden, overtrædelser og fusk

Kilder skal vurderes kritisk i forhold til særinteresser

Journalisten skal høre begge sider og ikke markedsføre den politiske og populistiske

holdning til et emne

Journalistiske idealkrav Videnskabelige idealkrav

Dagsordensættende/afslørende Kritisk Skarpt vinklet Fascinerende (skørt, weird and wacky) Væsentlig for læseren Aktuel (nyt!) Historien skal skabe identifikation/ have en menneskelig vinkel Publikumsstørrelsen skal anses som relativt stor Fortællende elementer kan bruges til at øge interessen Kompleksiteten af videnskaben skal være relativt lav, det vil sige, at historien ikke må tynges for meget af videnskabelige informationer

Flere kilder skal høres Historien skal ikke kun være fascinerende ’Forskere’ skal ikke skæres over én kam Sproglige forbehold: Sprogbrugen skal ikke give indtryk af sikker viden Risici må ikke overdrives Forskningens validitet skal vurderes: Den skal være peer reviewed, og ufærdige resultater skal ikke gøres til offentlig diskussion Vigtige indholdsmæssige forbehold, usikkerheder og metodebeskrivelser skal inkluderes Videnskaben bør forklares Videnskaben skal sættes i kontekst og ikke præsenteres som enkelt-forsøg Hvis der ikke er konsensus, skal videnskaben præsenteres som ideer og hypoteser og som en diskussion mellem forskere (en essayistisk tilgang).

Tabel 8: Tabellen viser idealkravene til videnskabsjournalistikken identificeret i teorien.

83

4.3 Journalistisk produktion

Med de opstillede idealkrav in mente er der produceret fem journalistiske historier, som præsenteres herunder i et indstik. Historierne forsøger at opfylde idealkravene og skrives ud fra antagelsen om, at publikum er fornuftige, vidende borgere, der kan føre en dialog om videnskab og samfundet. I forlængelse af dette stræbes der mod at skrive problemformuleringer og ikke Ritzau-historier, som beskrevet tidligere. Den første historie er skrevet på baggrund af de resultater, jeg selv har produceret i laboratoriet på Panum Instituttet. De fire resterende historier omhandler ikke min egen forskning, men omhandler det emne, jeg har bevæget mig inden for i forskningsverdenen, nemlig mitokondrieforskning. De fire sidste historier er produceret med henblik på at opfylde nogle af de idealer, som historien om min forskning umiddelbart ikke opfylder, for eksempel idealet om at sætte dagsorden. Jeg har fundet frem til de fire historier ved at researche på Google9 , Nature, Science og InfoMedia samt i research-interview med flere forskere. Historierne forsøger at sætte mitokondrieforskning ind i en sammenhæng, der er relevant for læseren ved at se på, hvad mitokondrieforskning har af konsekvenser i samfundet. Hvem er ofrene? Hvad er udfordringerne for ’forskningsområdet’ og dets implicerede? Der er bevidst søgt efter historier, som er videnskabelige og samtidig har en politisk, menneskelig eller filosofisk vinkel. Ved at anlægge en menneskelig vinkel opfylder historien kravet om identifikation. Ved at anlægge en filosofisk eller diskuterende vinkel opfylder historien kravet om, at man ikke må insistere på sand viden, men at videnskab skal ses som en proces. Og ved at anlægge en politisk vinkel har historien potentiale for at opfyldes kravet om at sætte dagsorden. For at kunne referere til historierne senere, gives de et nummer i forhold til rækkefølgen i indstikket: Historie 1 (Egen forskning): Anvender kræftceller sjuskede kopimaskiner til at overleve bedre? Historie 2: Spis mindre – lev længere? Historie 3: Når motion er den eneste medicin Historie 4: Sygdommene lægen ikke opdager Historie 5: Er to genetiske mødre én for meget?10 OBS: Den formidlende artikel, som er et krav fra Journalistik, findes på sidste side i indstikket. Læs venligst først denne artikel efter selve specialeafhandlingen. Anslag i indstik: 27.090

9 På Google søges på blandt andet følgende søgeord: mitochondria+aging, mitochondria+diabetes, mitochondria+obesity+clinical trials. Hvis der findes dokumenter, der refererer til originalartikler, findes disse. Selve research-metoden uddybes ikke yderligere, da research-delen ikke er fokus for dette speciale. 10 Historien blev skrevet i 2010, så når der står i historien, at Etisk Råd vedtager en anbefaling senere på året, henviser det til 2010.

Kan med fordel læses som et opslag

84

4.4 Metode til analysen

Herunder er udvalgte idealkrav fra teorien opstillet i analysepunkter. Disse idealkrav analyseres mere indgående end de andre idealkrav nævnt i teorien, fordi de enten stammer fra den journalistiske tradition eller den videnskabelige tradition. De udvalgte analysepunkter er således enten meget karakteristiske for det journalistiske arbejdsområde eller vigtige for videnskabsmanden. De primære analysepunkter er opstillet i Tabel 9:

Hvilke af disse journalistiske idealkrav er opfyldt i teksten?

Hvilke af disse videnskabelige idealkrav er opfyldt i teksten?

Dagsordensættende/afslørende

Kritisk

Skarpt vinklet

Fascinerende (skør, weird-and-wacky)

Væsentlig for læseren

Aktuel (nyt!)

Historien skal skabe identifikation/ have en menneskelig vinkel

Publikumsstørrelsen skal anses som relativt stor

Fortællende elementer

Kompleksiteten af videnskaben skal være lav: Historien må ikke blive tynget for meget af videnskabelige informationer

Videnskaben skal forklares

Sproglige og indholdsmæssige forbehold

Forskningens validitet skal vurderes (peer reviewed) og ufærdige resultater skal ikke gøres til offentlig diskussion

Usikkerheder og metodebeskrivelser skal inkluderes

Videnskaben skal sættes i kontekst og ikke præsenteres som enkelt-forsøg

Hvis der ikke er konsensus, skal videnskaben præsenteres som ideer og hypoteser og som en diskussion mellem forskere (en essayistisk tilgang).

Tabel 9: Her er de idealkrav opstillet, som indgår i analysen. De idealkrav, der ikke lægges så meget vægt på i analysen, er: Flere kilder skal høres, ’forskere’ skal ikke skæres over én kam, sprogbrugen skal ikke give indtryk af sikker viden, risici må ikke overdrives, og historien må ikke kun være fascinerende. Disse idealkrav er enten meget overordnede eller kan kun vurderes i nogle artikler. For eksempel kan det kun vurderes, om en risiko overdrives, hvis der beskrives en risiko. Desuden gælder det for alle artikler, at der høres flere kilder for at opfylde dette idealkrav. Yderligere præsenteres forskere ved navn, når det er muligt, for at opfylde idealkravet om, at forskere ikke må skæres over én kam. Der undgås også fraser som ’en ny undersøgelse viser’, for ikke at give indtryk af sikker viden.

85

Ud fra punkterne foretages en tekstanalyse af de fem artikler, hvor det analyseres, hvilke idealkrav historierne opfylder. Tekstanalysen er selektiv, det vil sige, at den ikke ser generelt på teksten, men på en række specifikke punkter, nemlig idealkravene. Jeg afgrænser mig derfor fra at give en længere teoretisk gennemgang af tekstanalyse som værktøj. Resultatet af tekstanalysen skal bruges til at (for)tolke og vurdere, hvorfor teksterne enten opfylder eller fejler i at opfylde idealkravene. Denne tolkning findes i diskussionen. Herunder præciseres nogle af idealkravene, så det er klart for læseren, hvorfor jeg i analysen argumenterer for, at netop dette punkt er opfyldt eller ikke er opfyldt. Kritisk I teorien præsenteredes Meyers og Franks syn på kritisk journalistik. Jeg mener overordnet, at journalisten kan være kritisk på mange måder, men at det først og fremmest indebærer, at journalisten er lyttende og interesseret i at komme frem til så sandfærdig og væsentlig information som muligt, altså substanskritisk i modsætning til aggressiv. I analysen vil jeg dog bruge en lidt mere snæver betydning af ordet. En historie vil anses for at være kritisk, hvis den stiller spørgsmålstegn ved og forholder sig kritisk til en problemstilling. En historie, der primært forsøger at formidle videnskab, vil derfor ikke anses som kritisk i denne sammenhæng, selv om jeg som journalist har været reflekterende i min tilgang til alle historierne og aktivt forsøgt at undgå mikrofonholderi. Skarpvinkling Det analyseres om artiklen er skarpt vinklet, hvilket defineres ud fra, hvor stramt disponeret historien er. Det vil sige, at mange detaljer, forbehold og nuancer i journalistisk forstand gør vinklen mindre skarp. En historie uden et skarpt budskab vil ofte heller ikke anses som skarpvinklet. Identifikation Identifikationskriteriet anses som værende særligt godt opfyldt, hvis den menneskelige vinkel indgår, idet videnskaben på den måde bringes tættere på læseren. Men identifikationskriteriet anses også som opfyldt i en vis grad, hvis emnet er relevant for læseren. Klassisk set handler identifikationskriteriet nemlig om interesse for eliten, personificering, relevans for modtageren (især i form af konsekvenser), følelser (især genkendelse og samhørighed eller fællesskab) samt om, hvad modtageren kan bruge en nyhed til i sin hverdag [Meilby 2006: 59]. Lav kompleksitet Et af de journalistiske idealkrav anbefaler, at videnskaben ikke må være for kompleks eller tynge historien for meget. Kompleksitet afhænger i mine øjne af mange ting. Sprogets sværhedsgrad, fagudtryk, tekstens opbygning og om teksten forklarer svære sammenhænge for at nævne nogle. Jeg vurderer derfor, hvor kompleks hver enkelt tekst er ved at se på, hvor

86

mange fagudtryk der anvendes, hvor mange videnskabelige forklaringer, metodebeskrivelser og forbehold der er, fordi disse elementer øger kompleksiteten. Metodebeskrivelser Pellechia mener, at journalisten eksplicit bør skrive, om der er tale om et ’eksperiment’ eller en ’spørgeskemaundersøgelse’, fordi disse udtryk er metodespecifikke [Pellechia 1997: 56]. Generelle udtryk som ’et studie viser’, ’en rapport viser’ eller ’en undersøgelse viser’ er ikke metodespecifikke benævnelser og blev ikke registreret i en kvantitativ undersøgelse af videnskabsjournalistiske artikler foretaget af Pellechia [Pellechia 1997: 56]. Metodebeskrivelser på under 30 ord i en artikel anses som utilstrækkeligt af Pellechia [Pellechia 1997: 56], hvilket også vil være et pejlemærke for denne analyse. Jeg er opmærksom på, at dette er en konservativ måde at måle, om der er nok metodebeskrivelser. Men dette er en bekvem måde at sammenligne teksternes metodebeskrivelser på.

4.5 Analyse

Herunder analyseres det, hvilke idealkrav de fem historier lever op til. Som Hornmoen påpeger, er nyhedsværdi noget, journalisten tilfører artiklen, når han bearbejder og vinkler stoffet [Hornmoen 1999: 19f]. Her forsøger jeg derfor at besvare: Hvor mange idealkrav opfylder hver artikel? Formålet er at finde ud af, om en historie kan opfylde alle idealkrav på én gang, eller om der opstår nogle uforudsete problemer.

4.5.1 Anvender kræftceller ’sjuskede kopimaskiner’ til at overleve

bedre?

Historie 1 er en journalistisk formidling af min egen forskning, som er sat ind i sammenhæng med kræft, for at gøre den mere væsentlig for læseren. De videnskabelige idealkrav fordrer, at forskningsresultater skal være sikre, verificerede og kollegial bedømt (peer reviewed). Mine resultater opfylder ikke disse idealkrav, idet de er relativt usikre, foreløbige og fordi de ikke er kollegialt bedømt. Jeg har desuden udført mine forsøg i gær, en modelorganisme for menneskeceller. Derfor er det svært at drage paralleller til læserens verden, fordi forsøgene ikke kan bruges til at sige noget om menneskeceller. Yderligere mener mange forskere, som jeg har talt med11 samt medieteoretikerne, at forsøg på enkeltceller ikke er nok til at kunne sige noget generelt. De mener, at forsøg som et minimum skal være foretaget på dyr, før man med rimelig sandsynlighed kan sige noget om, hvordan tingene forholder sig i mennesker. Min historie opfylder dermed ikke kravet om peer review,

11 Jeg interviewede tre internationale forskere til en konference ’Ph.d. Mitochondrial summer School 2010’. Her sagde Dr. Keshav Singh samt Dr. Susan LeDoux, at de mente, at det var for tidligt at gå ud med resultater, der kun var afprøvet i celler eller dyr. Faktisk mente de, at det var for tidligt at offentliggøre resultater før der var gennemført kliniske tests, for ikke at give folk falske forhåbninger, hvis det handler om en kur mod en sygdom eller udvikling af medikamenter.

87

og Frank vil formentligt mene, at resultaterne er for foreløbige til at bringe ud i offentligheden. Artiklen henviser dog til publicerede forsøg, hvor det er vist, at kræftceller har opregulerede niveauer af TLS-polymeraser [Albertella et al. 2005], hvorfor kravet om peer review til dels er opfyldt. Et andet idealkrav siger, at usikker videnskab kan præsenteres som en diskussion eller med en diskuterende tilgang. Dette krav opfylder historien, idet den oplyser læseren om, at der er tale om en hypotese. Idet der refereres til processen og de foreløbige hypoteser, mener jeg, at videnskaben er sat i kontekst, hvorfor dette idealkrav også er opfyldt. Historien er ikke i klassisk forstand kritisk; der høres ingen kritiske kilder, og journalisten stiller ikke kritiske spørgsmål. Der tages både indholdsmæssige og sproglige forbehold for artiklens påstande. Kompleksiteten af historien er høj, idet der for eksempel anvendes mange fagspecifikke ord som translæsion polymeraser, arvemasse, DNA, mutationer, enzymer, kræftudvikling og mitokondrier. Der er bevidst prioriteret at forklare videnskaben, tage forbehold og forklare metoderne. Historien er ikke skarpt vinklet, blandt andet fordi rubrikken indeholder et spørgsmålstegn, og på grund af alle de videnskabelige elementer. Historien opfylder nyhedskriteriet væsentlighed, hvis det anses ud fra betydningen ’oplysning’ og ikke betydningen ’nytte’. Læseren får indsigt i forskningens verden, men kan ikke direkte bruge informationen i sin hverdag. Om historien opfylder aktualitetskriteriet og kriteriet om publikumsstørrelse er dog mindre sikkert. Det naturlige publikum er svært at definere, idet borgeren skal have en naturlig nysgerrighed for forskning. Men historien omhandler kræft, hvilket er et meget nyhedsværdigt emne. Mange mennesker rammes af kræft eller kender nogen, der er ramt, hvorfor publikumsstørrelsen må anses for relativt stor. Historien kan yderligere siges at være aktuel, selv om der ikke er vinklet på ’ny forskning’, fordi kræft er aktuelt som emne. Fascinationskriteriet er opfyldt, idet mange mennesker anser forskning som fascinerende og en smule mystisk i kraft af dens utilgængelighed for resten af befolkningen. At jeg har forsket i gær vil af nogle anses som skørt og fascinerende. Nyhedskriteriet identifikation opfyldes absolut ikke, fordi læseren ikke kan identificere sig med laboratoriearbejde. Genremæssigt kan artiklen bedst betragtes som en nyhedsartikel med essay-elementer. Den har ikke formatet til at sætte dagsorden, og den er ikke afslørende, hvorfor den ikke vil have så stor kapital i medieverdenen og formentligt ikke blive prioriteret særlig højt.

4.5.2 Spis mindre – lev længere?

Historien er en nyhed om, at mindre mængder mad kan forlænge livet. Historien er substanskritisk, men ikke kritisk i klassisk forstand. Den fokuserer på flere forsøg og præsenterer forskningen som en kontinuerlig proces. Artiklen sætter dermed videnskaben i kontekst. Der anvendes kun skriftlige kilder, der er peer reviewed i artiklen, og mindst fire skriftlige kilder understøtter nyhedens budskab [Lane et al. 2002, Masoro 2000, Finkel og Holbrook 2000, Phelan og Rose 2006], hvoraf et af disse er publiceret i et af de mest

88

anerkendte tidsskrifter i verden, Nature [Finkel og Holbrook 2000]. Det har været kendt i over 70 år, at kalorierestriktion får kortlevende dyr som gnavere og orme til at leve længere [Lane et al. 2002]. Derfor vurderes det, at der er stor evidens for, at også mennesker vil leve længere, hvis de spiser kalorierestriktivt. Selv om artiklen er en nyhed, indeholder rubrikken et spørgsmålstegn, hvilket bløder vinklen op. Jeg mener således, at kravet om en essayistisk tilgang til videnskaben er opfyldt. Men samtidig mener jeg, at vinklen er relativt skarp i forhold til for eksempel historie 1, idet budskabet er klart: Spis mindre og lev længere – sandsynligvis med færre livsstils- og aldersrelaterede sygdomme end ellers. Derfor anses historien som relativt skarpvinklet. Historien opfylder kriterierne om væsentlighed og identifikation, fordi mange mennesker i dag efterstræber evig ungdom, hvilket samtidig betyder, at publikumsstørrelsen er stor. Det er mere usikkert, om aktualitetskriteriet er opfyldt. Kalorierestriktion som livsforlængende faktor har været kendt i forskningsverdenen længe, og det er således ikke er ’ny’ opdagelse. Aktualitetskriteriet i betydningen ’ny opdagelse’ udhules endvidere, når forskning præsenteres som en proces, som idealkravene fordrer. Men der kan argumenteres for, at nyheden er ’ny’ og aktuel, hvis folk ikke har hørt historien før. Historien er ikke umiddelbart fascinerende, og opfylder således fire ud af de fem videnskabsjournalistiske nyhedskriterier. Historien vil formentligt ikke være dagsordensættende, idet der ikke afsløres noget fusk. Dagsordensættende betyder også ofte, at der kan følges op på historien, hvilket denne nyhed ikke har format til. Der tages relativt mange sproglige forbehold for usikkerheden omkring effekten af kalorierestriktion i mennesker, for eksempel ved brug af fraser som ”det lader nemlig til” og ”tyder på”. Yderligere uddybes begrebet kalorierestriktion for læseren, så denne forstår, at det ikke handler om direkte at sulte sig selv. Dette forbehold er vigtigt, da informationen ellers i mine øjne kunne være vildledende. Jeg fandt yderligere selv frem til modellen, der estimerer, at mennesker kun kan drage begrænset fordel af at leve af en kalorierestriktiv kost, fordi jeg bevidst søgte efter data, der kunne nuancere budskabet. Jeg mener, at dette indholdsmæssige forbehold er med til at gøre historien dækkende og komplet. Historien må overordnet set siges at være relativt kompleks, idet der nævnes mange fagord som ’frie radikaler’ og fordi der er mange metodebeskrivelser med (over 30 ord), hvor der henvises til forsøg i forskellige dyrearter og til computermodellen.

4.5.3 Når motion er den eneste medicin

Genren kan siges at være en baggrund/ feature, fordi den forsøger at besvare spørgsmålet: Hvordan er det at leve med en uhelbredelig sygdom? Men den har en nyhedskrog, fordi den med fordel kan læses sammen med historie 4. Artiklen forsøger at beskrive sygdommen fra patientens perspektiv ved hjælp af fortællende reportage/feature-elementer. Det er ikke en hård nyhed, hvorfor den gør op med den klassiske måde at skrive om videnskab på ved at eksperimentere med andre genrer end nyheden.

89

Historien opfylder først og fremmest kriteriet om den menneskelige vinkel, idet historien fortælles af en erfaringskilde. Brugen af fortællende reportage-elementer opfylder kravet om den menneskelige vinkel, fordi folk i hvert fald på et følelsesmæssigt plan kan identificere sig med Ulla Isbye og hendes kamp mod en uhelbredelig sygdom, selv om de ikke selv kender nogen, der lider af denne sygdom. På den anden side er mitokondriesygdomme ukendt for de fleste, og derfor opfylder selve problemstillingen ikke identifikationskriteriet. Historiens naturlige publikum er yderligere relativt begrænset. Kun 300-400 mennesker i Danmark har diagnosen mitokondriesygdom, og derfor opfylder historien ikke dette kriterium. Omvendt synes jeg, at historien er væsentlig, for selv om mitokondriesygdomme er sjældne, er det vigtigt at befolkningen kender til dem, for at patienterne ikke bliver ved med at føle sig fremmedgjorte. Så ligesom historier om kræft anses for væsentlige, vil jeg argumentere for, at historier om sjældne sygdomme er væsentlige, hvis de kan bidrage med ny viden og har en relevant sammenhæng for læseren. Derfor opfylder journalisten sin rolle som den fjerde statsmagt ved nogle gange at beskrive minoriteter og deres problemer. Opsummerende vil jeg mene, at historien opfylder tre nyhedskriterier: Identifikationskriteriet (den menneskelige vinkel), væsentlighedskriteriet og til dels aktualitetskriteriet, idet mitokondriesygdomme for de fleste er ukendte og vil fremstå som en gruppe ’nye’ sygdomme. Jeg mener ikke, at risikoen for at udvikle mitokondriesygdom er overdrevet i teksten. Det fremgår tydeligt, at få mennesker udvikler mitokondriesygdomme og at forskerne regner med, at nogle lidelser er forårsaget af mitokondriesygdom. Kompleksiteten er lav, fordi der vinkles på det menneskelige, og derfor beskrives videnskaben kun kort. Der nævnes relativt få fagord (mitokondrier og DNA), der er få metodebeskrivelser af cykelforsøgene (< 30 ord), der findes ingen egentlige forbehold og ingen historisk kontekst, hvorfor historien ikke opfylder disse kriterier. I historien omtales der dog nogle cykelprojekter, som alle er publicerede og peer reviewed, blandt andet Jeppesen et al. (2006). Derfor er kravet om peer review opfyldt. De naturvidenskabelige forklaringer er isoleret i en faktaboks, hvilket strammer historien, men giver læseren mulighed for at søge flere informationer.

4.5.4 Sygdommene lægerne ikke opdager

Dette er en kritisk, problematiserende nyhedshistorie. Den er relativt skarpt vinklet på nyheden, og der gives således ikke mange ekstra informationer i selve artiklen. Historien er afslørende i den forstand, at der afsløres en samfundsmæssig uorden, nemlig at de praktiserende læger ikke opdager sjældne sygdomme. Ud fra teorien mener jeg, at historien er afslørende, da ’uordenen’ i lægeverdenen kun kan løses, hvis folk bliver opmærksomme på den. Historien er hermed også væsentlig for befolkningen. Yderligere har historien relativt stort potentiale for at kunne sætte den politiske dagsorden, fordi der afsløres uorden i samfundet. Historien har således meget kapital, altså værdi og symbolsk magt i medieverdenen. Kapitalen øges også, fordi der er et element af konflikt i historien. Yderligere er historien aktuel, både fordi den ikke er skrevet før, og fordi sundhed og sygdom generelt er

90

aktuelt og nyhedsværdigt. Publikumsstørrelsen er umiddelbart lille, hvis man kun regner de 300-400 patienter som publikum. Men idet artiklen belyser et samfundsmæssigt problem, synes jeg godt, at man kan argumentere for, at publikummet er stort. Artiklen bygger på mundtlige påstande, og der omtales ikke forskningsempiri i artiklen, hvorfor idealkravet om peer review ikke kan opfyldes. Nyheden omhandler lægernes manglende viden om mitokondriesygdomme og beskriver kun kort, hvordan sygdommene opstår, og hvad symptomerne er. Kompleksiteten er lav, fordi der af fagord kun nævnes mitokondriesygdommen CPEO og mitokondriesygdomme generelt. Faktaboksen forklarer dog de mest kendte mitokondriesygdomme. På denne måde kan den nysgerrige læser få mere information, men man kan også nøjes med at læse nyheden. Historien indeholder ingen henvisninger til videnskabelige resultater, men baserer sit budskab på personlige holdninger. Derfor findes der ingen forbehold i forhold til videnskabelige resultater. Artiklen indeholder dog et sprogligt forbehold, der knytter sig til den eksisterende viden om, hvor mange der udvikler mitokondriesygdomme. Dette består i, at John Vissing ”estimerer”, at cirka én procent af alle hørenedsættelser og diabetestilfælde er på baggrund af mitokondriesygdom. Alligevel anses kravet om forbehold ikke for at være opfyldt, fordi der ikke tages forbehold for artiklens hovedbudskab. Der er ingen metodebeskrivelser eller kontekst i historien, da der er vinklet relativt stramt på nyheden.

4.5.5 Er to genetiske mødre én for meget?

Historie 5 er en længere nyhed/udredende reportage med en diskuterende, essayistisk stil. Længdemæssigt er den for lang til at være en nyhed, men informationen vil for mange være en nyhed. Historien opfylder mange af nyhedskriterierne. Gensplejsning er i sig selv fascinerede, og der er et element af ’weird-and-wacky’ i historier om ’gensplejsede’ børn. Yderligere mener jeg, at historien skaber identifikation hos læseren, fordi de fleste på et følelsesmæssigt plan kan sætte sig ind i, hvordan det må føles at være syg og måske få et sygt barn som følge af det. Historiens problemstilling er væsentlig og aktuel, idet der skal træffes politiske beslutninger om teknikken inden for en overskuelig fremtid. Om historien er ny, kan der sættes spørgsmålstegn ved. Ingeniøren bragte i september en historie med overskriften: ”Forskere uenige om børn med to gen-mødre” [Ing.dk 2010], og i december 2010 anbefalede Etisk Råd, at metoden fortsat ikke bør tillades i Danmark, idet medlemmerne mener, at menneskelige æg, der bruges til befrugtning, ikke må være manipulerede [Etisk Råd 2010]. Jeg opdagede historien i august 2010, før Ingeniøren havde skrevet den, og på det tidspunkt var den meget aktuel. Derfor anses historien for at være aktuel. Størrelsen af historiens naturlige publikum er svær at definere, men man kan argumentere for, at publikum er alle borgere i samfundet, idet de skal oplyses for at kunne deltage i en saglig offentlig debat om emnet. Historien baseres på to peer reviewed skriftlige kilder [Hawes et al. 2002, Barritt et al. 2001], hvilket gør, at den opfylder kravet om peer review. Der indgår yderligere tre mundtlige kilder, hvorfor kriteriet om flere kilder er opfyldt. Klassisk set er historien ikke afslørende, men der

91

afsløres uorden i forskningsverdenen, som ikke har været beskrevet før (heller ikke i Ingeniørens udgave), nemlig at 2 ud af 17 fostre havde Turners syndrom. Dette fandt jeg ud af ved at søge på nettet på mitokondrie-transplantation. Dog vinkles historien ikke på uordnen/afsløringen, fordi jeg vurderede, at det ville være usagligt kun at fokusere diskussionen på denne lille undersøgelse, som i sig selv formentligt ikke viser et repræsentativt billede af teknikkens ’farer’. Hvis der var vinklet på undersøgelsen, ville en risiko være blevet overdrevet, og historien havde forbrudt sig mod dette videnskabelige idealkrav. Derfor var det vigtigt for mig, at læseren ikke tror, at næsten 12% (2 ud af 17 fostre) af alle fostre får Turners syndrom, for det er der ikke belæg for at sige. Men det er relevant at diskutere risikoen, hvorfor der indgår et par sproglige/indholdsmæssige forbehold i mit spørgsmål (”Måske var det et tilfælde, men er det forsvarligt, hvis risikoen for Turners syndrom måske er relativt stor?”). Brugen af den essayistiske stil betyder, at artiklen i sig selv er et langt indholdsmæssigt forbehold, fordi artiklen diskuterer, om fertilitetsteknikken er etisk og biologisk forsvarlig at anvende. Historien er tilmed substanskritisk, fordi kilderne diskuterer for og imod teknikken både i et biologisk og etisk perspektiv. Idet der henvises til 20 år gamle forsøg, mener jeg, at historien sættes i kontekst, fordi det gøres klart for læseren, at metoden har eksisteret længe. Der henvises til flere forsøg, og metodebeskrivelserne fylder samlet 120 ord, hvilket ifølge Pellechia er tilstrækkeligt. Kompleksiteten er stor, idet der nævnes mange fagspecifikke ord (DNA-defekter, mitokondrie-transplantation, cellekerne, kromosom-fordeling, Turners syndrom, kønskromosomer samt kromosomfejl), og fordi der tages mange indholdsmæssige forbehold, hvilket også øger kompleksiteten. Artiklens vinkel er relativt blød, idet der ikke er et egentligt budskab. Yderligere benyttes der ikke fortællende elementer, hvorfor historien ikke opfylder dette krav.

4.5.6 Tabel over idealkrav opfyldt i historierne

Analysepunkterne opsummeres for overblikkets skyld herunder i en samlet tabel, se Tabel 10. I midten af tabellen er historierne opstillet ud fra deres nummer. På venstre side er de journalistiske idealkrav opstillet og på højre side de videnskabelige idealkrav. Et ’x’ repræsenterer, at det pågældende idealkrav er opfyldt.

92

Journalistiske idealkrav Historie Videnskabelige idealkrav

Nyhedskriterier fortæl-lende

dagsorden/ afslørende

kritisk skarpt vinklet

lav komplek-sitet

videnskaben forklares

Forbehold peer reviewed

metode videnskabelig kontekst

manglende konsensus (diskuterende)

Væsentlig (=oplysning), aktuel, fascinerende, (publikumsstørrelse)

1 x x (x) x x x

Væsentlig (=nytte), aktuel, identifikation, publikumsstørrelse

(x) 2 x x x x x x

Identifikation: den menneskelige vinkel, væsentlig (=oplysning), (aktuel)

x x x x 3 (x) x

Væsentlig (=nytte), aktuel, (publikumsstørrelse)

x x x x 4 (x)

Fascination, væsentlig (=nytte+oplysning), aktuel, publikumsstørrelse (identifikation)

(x) x 5 x x x x x x

Tabel 10: Historie 1: ”Anvender kræftceller sjuskede kopimaskiner til at overleve bedre? Historie 2: Spis mindre – lev længere? Historie 3: Når motion er den eneste medicin. Historie 4: Sygdommene lægen ikke opdager. Historie 5: Er to genetiske mødre én for meget?

93

4.6 Diskussion

Diskussionen tager udgangspunkt i specialets journalistiske problemformulering: Hvordan kan man formidle en kompleks videnskabelig problemstilling i gode journalistiske historier, der opfylder de opstillede videnskabsjournalistiske idealkrav? Diskussionen forsøger at besvare problemformuleringen ved først at tage udgangspunkt i de tendenser, der er identificeret i analysen. Herefter diskuteres nogle dilemmaer eller problemstillinger, der knytter sig til udvalgte idealkrav. Til sidst diskuteres det, hvilke overordnede udfordringer videnskabsjournalistikken står over for i mediesamfundet.

4.6.1 Idealkravene strider mod hinanden Svaret på problemformuleringen er til dels, at det er svært at opfylde alle idealkravene på én gang i en videnskabsjournalistisk historie, fordi nogle af idealkravene fra de to forskellige traditioner strider mod hinanden. Tag for eksempel kompleksitet; artikel 3 og 4 opfylder primært de journalistiske idealkrav og har lav kompleksitet. Netop fordi de ikke har forbehold, kritiske kilder, kontekst og information om bias med. Derved er de lettere at gøre nyhedsværdige ifølge Pellechia (1997). Omvendt opfylder historie 1, 2 og 5 de videnskabelige idealkrav og har videnskabelige forklaringer, metodebeskrivelser, indholdsmæssige forbehold og kontekst med, hvorved kompleksiteten bliver høj. Det er derfor svært både at skrive en historie, der har lav kompleksitet samtidig med at den indeholder metodebeskrivelser, forbehold og usikkerheder, idet dette gør den mere kompleks. Yderligere vil komplekse historier ofte anses som mindre skarpvinklede af journalister end historier, der undlader forbehold og tekniske forklaringer. Nogle idealkrav vil derfor ikke kunne opfyldes samtidigt, fordi de strider mod hinanden.

4.6.2 Kapital og nyhedsværdi

De fem historier forsøger at sætte svær videnskab på journalistisk formel. Men hvad er den mest vellykkede? Analysen viser, at nogle historier primært opfylder de videnskabelige idealkrav, mens andre primært opfylder de journalistiske idealkrav. Historie 5 og 2 opfylder dog både en del idealkrav fra den journalistiske og videnskabelige tradition. Disse to historier har således mest, hvad jeg vil kalde ’videnskabsjournalistisk kapital’, fordi de både opfylder de videnskabelige idealkrav samt mange af de journalistiske idealkrav. De opfylder hver især mange nyhedskriterier og besidder derfor relativt meget nyhedsværdi. Det er interessant, at historierne har en essayistisk tilgang til videnskaben, hvilket normalt ikke vil være så nyhedsværdigt som en skarp nyhed med et slagkraftigt budskab.

94

Historie 4 har meget journalistisk kapital blandt andet på grund af konflikt-elementet, og fordi den har potentiale til at sætte mediernes dagsorden og måske den politiske dagsorden. Historie 4 er dog ikke særlig videnskabelig, hvorfor den samlet set ikke opnår så meget ’videnskabsjournalistisk kapital’. Historie 3 og 4 har langt mere journalistisk kapital end videnskabelig kapital og vil som opslag formentligt primært være interessant for medierne på grund af historie 4s afslørende natur. Historie 3 har relativt lidt kapital samlet set, primært fordi det er en blød historie, der ikke i sig selv sælger aviser. Yderligere findes der så mange sjældne sygdomme, at det er svært at argumentere for, hvorfor netop denne er interessant at høre om. Men i kraft af, at historie 3 om Ulla Isbye kan ses som et opslag sammen med historie 4, vil det samlede opslag være relativt nyhedsværdigt og opnå moderat stor kapital. Historie 1 om min forskning egner sig nok bedst til en videnskabssektion, fordi den er meget fokuseret på videnskab og har meget lidt journalistisk kapital. Denne historie kan klassificeres som en klassisk videnskabshistorie, fordi den primært forsøger at forklare komplicerede videnskabelige sammenhænge og arbejdsprocesser, altså kun er formidlende – ikke dagsordensættende eller afslørende. Den vil formentligt blive prioriteret lavere end de mere samfundsrelevante historier, idet videnskabshistorier generelt prioriteres lavt [Nelkin 1995: 106]. Derfor har historie 1 samlet set ret lidt kapital, selv om den scorer højt inden for de videnskabelige idealkrav. Grunden til at videnskabsartikler ses som ’det bløde mellemgulv’ i nyhedsstrømmen er sandsynligvis, fordi de hårdere (politiske) nyheder kan sætte dagsorden i modsætning til videnskabsartikler. Derfor giver de journalistiske idealkrav mere kapital end de videnskabelige idealkrav ude på redaktionerne. Men hvis videnskabsjournalisten er opmærksom på dette, kan han forsøge at tilføre historien mere journalistisk kapital ved at identificere videnskabshistorier med en samfundsrelevant vinkel. Analysen viser yderligere, at en videnskabshistorie både skal have meget videnskabelig kapital og journalistisk kapital for at opnå mest ’videnskabsjournalistisk’ kapital. På den måde kan historien både siges at være spændende og oplysende for læseren på én gang. At opfylde de journalistiske idealkrav giver symbolsk magt i medieverdenen og gør, at historien sælger, mens de videnskabelige idealkrav giver historien tyngde og troværdighed. Så selv om de journalistiske idealer om afsløring og fascination måske vejer tungest i medieverdenen, vil en videnskabshistorie ofte ikke kunne stå alene uden også at indeholde noget videnskab, som forklarer læseren, hvorfor informationen er vigtig.

4.6.3 Hvad sker der, når journalisten også er forskeren?

Historie 1 om min egen forskning opfylder primært de videnskabelige idealkrav til en tekst, men ikke særlig mange af de journalistiske idealkrav. Derfor kan man argumentere for, at jeg har taget mere hensyn til den videnskabelige tradition end til læseren. Jeg har således primært værnet om mit ry som forsker end mit ry som journalist. Som forsker vil man gerne have alle forbehold og detaljer med, og jeg kunne mærke, at det var sværere for mig at skrive denne

95

historie end de fire andre historier, fordi jeg følte mig personligt forbundet med historien, fordi forskningen var mit hjertebarn. Fordelen ved både at være forskeren og journalisten er dog, at jeg forstår videnskaben og bedre kan finde på analogier og metaforer, der passer til det videnskabelige fænomen, end hvis jeg ikke vidste noget om forskningen. Alligevel mener jeg, at der er god fornuft i, at videnskabsmanden og journalisten normalt ikke er én og samme person, fordi det giver større journalistisk frihed at være uafhængig af forskningen, og fordi der på den måde bedst værnes om læserens interesser.

4.6.4 Hvad kræver det at flytte x’er?

Nogle historier har som sagt enten meget videnskabelig kapital eller meget journalistisk kapital, fordi jeg som journalist enten har forsøgt at værne om videnskaben eller forsøgt ikke at belaste læseren for meget med videnskabelig information, hvorfor historierne hurtigt falder ind under én kategori af idealkrav. Men kan det lade sig gøre at flytte x’erne i tabellen over i den anden blok, og i så fald hvordan? Jeg mener, at det langt hen ad vejen godt kan lade sig gøre igennem en række bevidste valg. Hvis jeg i højere grad havde forsøgt at opfylde de journalistiske idealkrav i historien om min egen forskning, kunne jeg have forklaret videnskaben meget kort uden alle de tekniske mellemregninger. Den korte version havde lydt: ”Forskere mener, at kræft ikke kun udvikles på grund af udefrakommende stoffer, men også som resultat af mutationer, som cellen selv laver. Derfor bør kræft måske angribes anderledes end i dag, mener forskerne”. Denne historie kunne krydres med reportage-elementer fra laboratoriet, for eksempel: ”Gæren står i en kolbe og skvulper frem og tilbage og ligner tynd kartoffelsuppe.” Med fortællende elementer og færre videnskabelige forklaringer, kunne jeg have opfyldt flere af de journalistiske idealkrav og færre af de videnskabelige idealkrav. Hvad der er mest rigtigt i den givne situation er op til journalisten at vurdere, men jeg mener, at journalisten primært bør sikre sig, at budskabet ikke strammes for meget, selv om de videnskabelige forklaringer skæres fra. Når journalisten ’placerer’ x’erne, mener jeg, at han skal finde en balance mellem journalistik og videnskab, så læseren både føler sig underholdt og samtidig har mulighed for at blive klogere. Dog er der nogle x’er i skemaet, hvor historien og ikke journalisten bestemmer om det er opfyldt eller ej. For eksempel er det en iboende egenskab om en historie er dagsordensættende eller afslørende eller ej. Journalisten kan dog forsøge at vinkle på noget kontroversielt i sagen for at opfylde kravet, men bør aldrig overdrive eller fordreje en sag for at opnå dette.

4.6.5 Faktabokse kan opfylde flere idealkrav

Når journalisten er blevet opmærksom på, hvilke idealkrav der ikke er opfyldt i teksten, kan han aktivt forsøge at opfylde dem uden for brødteksten. Hvis artiklen opfylder mange af de journalistiske idealkrav, men få af de videnskabelige idealkrav som for eksempel historie 3 ”Når motion er den eneste medicin” og til dels historie 4 ”Sygdommene lægen ikke opdager”, mener jeg, at en løsning kan være, at bruge videnskabelige faktabokse. Herved har læseren mulighed for at indsamle informationer om videnskaben, selv om teksten ikke kan bære de

96

’tunge’ forklaringer. Omvendt kan artikler, der primært opfylder de naturvidenskabelige idealkrav tilføjes elementer, som skaber identifikation. I historie 1 er der for eksempel tilføjet en boks, hvor forskeren besvarer nogle skæve spørgsmål, så der sættes ansigt på videnskabsmanden. Herved opfyldes det journalistiske krav om identifikation, selv om den videnskabelige artikel ikke formår dette alene. Også billedtekster, fremhævede citater og mellemrubrikker er afgørende for, at læseren giver sig i kast med historien [Jacobsen 2005]. Disse elementer kan fastholde den moderat interesserede læser, så denne overbevises om, at historien er spændende nok til at læse [Jacobsen 2005].

4.6.6 Genrer: Videnskabsjournalistik i ny indpakning?

Analysen viser, at videnskab sagtens kan skrives i andre genrer end som klassiske nyhedsartikler, for eksempel som feature/reportage eller i en udredende baggrundsartikel. Jeg mener, at journalisten bør vælge genren ud fra videnskabens modenhed og natur. Hvis informationsmængden på et forskningsområde er begrænset og usikker, eller hvis der er tale om en videnskabelig proces, bør der anvendes en diskuterende genre. Hvis den videnskabelige proces er meget billedlig, kan der anvendes feature og reportageelementer. Hvis videnskaben er meget moden (for eksempel meget verificeret og peer reviewed i adskillige artikler) behøver journalisten ikke i samme grad diskutere resultaterne, men kan derimod bedre tillade sig at præsentere videnskabens anvendelsesmuligheder i en klassisk nyhedsartikel – dog med nødvendige forbehold. Journalisten bør derfor altid vurdere, hvilken genre den enkelte historie kan ’bære’. Nogle historier kan strammes mere end andre grundet mere viden på området. For eksempel kan man med rette skrive en artikel med overskriften ”Mænd bliver aggressive af testosteron,” så længe man tager sine forbehold, fordi denne påstand er verificeret flere gange igennem mange års forskningsarbejde og i adskillige videnskabelige tidsskriftartikler. Men hvis nogle nye resultater viser det omvendte, bør journalisten derimod ikke skrive historien: ”Testosteron gør mænd blide som lam”, fordi forskningen er kontroversiel og der er fare for, at det kan være en and. Derimod bør journalisten anvende en essayistisk, diskuterende tilgang: ”Bliver mænd blide som lam af testosteron?”, og derefter diskutere de nye resultater kritisk. Videnskabens modenhed og natur er derfor afgørende for valg af genre. Jeg mener, at det er lettere for journalisten at foretage valgene i hver enkelt skriveproces, hvis han kender idealkravene, fordi han ved, hvad god videnskabsjournalistik kræver.

4.6.7 Idealkravene til diskussion

4.6.7.1 Drop aktualitetsbegrebet i betydningen ’ny’

I teorien er det tydeligt, at videnskabsjournalister anser ’ny viden’ som mere nyhedsværdigt end ’gammel viden’, der ikke er lige så aktuelt. ’Gammel viden’ vil sige forskning, der er udført, men som ikke har prædikatet ’ny’. Jeg mener dog, at ’gammel viden’ kan være lige så

97

interessant, for hvornår er en given vidensproduktion slut? Aktualitet i betydningen ’ny viden’ er derfor et pseudo-kriterium. I stedet mener jeg, at en videnskabshistorie kan opfylde kravet om aktualitet, når informationen er ukendt viden for læseren. Journalisten bør derfor droppe idealet om ’ny viden’, men i stedet forsøge at sætte fokus på etableret viden, forskningsprocesser eller spørgsmål, der dukker op i forbindelse med forskning og videnskab. Spørgsmål er også spændende, ikke kun svar. For eksempel har National Geographics produceret nogle programmer om Mars-bilerne Spirit og Opportunity, der siden 2004 har udforsket Mars' overflade. Programmerne fokuserer primært på rejsen og de farer, der lurer: Hvordan kommer bilerne til at klare de store storme? Hvad sker der, hvis noget går i stykker på bilerne? Der er masser af gode proceshistorier og historier om ’gammel viden’, der venter på at blive skrevet, men journalister ser dem ikke, fordi de er optaget af, hvad der er ’nyt’ inden for forskning og videnskab. At formidle en proces kræver dog meget research fra journalistens side, men jeg mener, at videnskabelige processer fortjener mere opmærksomhed, end de får i dag.

4.6.7.2 Er peer review garanti for god videnskab?

Et af de videnskabelige idealkrav fordrer, at kun peer reviewed videnskab bør formidles i medierne. Jeg mener, det er en forfejlet måde at anskue videnskab på, fordi videnskab er langt mere end det, der kan publiceres i et tidsskrift, som før nævnt. Yderligere tyder flere undersøgelser på, at peer review ikke er garanti for god videnskab. Gennemlæsningen fra kollegernes side er ofte overfladisk, og bedømmerne nøjes ofte med at tjekke litteraturlisten, men ikke data og metoder [Hornmoen 1999: 92]. Om den videnskabelige artikel accepteres eller ej, afhænger ofte af forfatternes navne og renomme end af indholdet, viser en omfattende undersøgelse, hvor samme tekst blev sendt til kollegial bedømmelse med to forskellige sæt forfattere. Den ene gruppe var kendte, respekterede forskere, og den anden gruppe var ukendte forskere [Hornmoen 1999: 92]. Bedømmerne accepterede artiklen med de kendte navne, men ikke samme artikel med de ukendte navne [Hornmoen 1999: 92]. Derfor mener jeg, at kollegial bedømmelse ikke kan stå alene. Journalister bør derfor altid stille sig kritisk overfor peer reviewed artikler og invitere forskeren til at tale om metodens begrænsninger.

4.6.7.3 Hvad er væsentligt for læseren?

I analysen stod det klart, at væsentlighedskriteriet er en svær bestemmelig størrelse, idet væsentlighedsbegrebet i betydningen ’nytte’ betyder, at meget få videnskabshistorier vil være væsentlige for læseren. For eksempel vil meget grundforskning som min forskning ikke kunne opfylde nyttekriteriet, fordi læseren ikke direkte kan bruge det i sin hverdag. Jeg mener, at væsentlighedsbegrebet, som et spørgsmål om maksimal nytte, opfordrer til et syn på videnskab, der lægger op til den nuværende regerings ”fra forskning til faktura”-tankegang, hvor forskning skal give profit så hurtigt som muligt. Jeg mener, det er farligt for videnskaben, fordi den tvinges til at producere hurtige resultater, uden at nogen bekymrer sig om kvaliteten af forskningen. Men hvis væsentlighedskriteriet bruges i betydningen ”en

98

information, der er med til at ændre folks verdensbillede i en mere realistisk retning” [Meilby 2006: 56], vil flere historier være væsentlige for læseren. Jeg mener, at det ofte vil være gunstigt for demokratiet, hvis journalister vurderer væsentlighed ud fra Meilbys definition. Dermed lægges der op til, at journalisten bør producere historier, som læseren bliver klogere på samfundet af.

4.6.7.4 Hvor meget videnskab er for meget?

Mange medieteoretikere påpeger som sagt, at videnskabsartikler ikke indeholder nok information om metoder, om bias i forsøgsopstillingen og videnskabelige forklaringer. Men det er primært forskere og videnskabsmænd, som har formuleret de videnskabelige idealkrav, og deres interesse er at værne om videnskaben, ikke om læserens interesser. Hvis man sammenligner metateksten – det vil sige teksten uden om budskabet – i molekylærbiologiafsnittene med metateksten i historie 1, er det iøjefaldende, at der i den videnskabelige tekst bruges meget plads på teori, materiale- og metodebeskrivelser samt på at diskutere resultaterne. I den journalistiske fremstilling er disse elementer reduceret til et absolut minimum, som kun lige er nok til at opfylde idealkravene. Dog er historie 1 med journalistisk optik stadig meget videnskabelig. Pointen er, at videnskabsmanden netop ønsker at beholde den videnskabelige metatekst, mens journalisten ønsker at skabe en helt ny metatekst for at opfylde de journalistiske idealkrav. Den nye metatekst involverer menneskelige følelser, meninger og holdninger – elementer, som den videnskabelige tekstmasse ikke indeholder. Derfor mener jeg, at journalisten bør have friheden til at opfinde en ny metatekst, hvilket er essentielt for journalistikken. Denne metatekst skal både oplyse læseren, men ikke belaste ham eller hende med unødige detaljer fra den videnskabelige metatekst. For eksempel er det uinteressant for læseren at vide, hvor stor en koncentration af det kræftfremkaldende stof, MMS, jeg har behandlet gærcellerne med i mine forsøg, mens det er afgørende viden for videnskabsmanden. Jeg mener, at de videnskabelige idealkrav overordnet set giver bedre videnskabsjournalistik, men faren ved dem er, at teksten ender som en videnskabelig afhandling, hvis ikke der findes en balance mellem hensynet til læseren og hensynet til videnskaben.

4.6.7.5 Konflikt er ikke et videnskabsjournalistisk nyhedskriterium –

hvorfor?

Det er interessant, at konflikt ikke er nævnt eksplicit af teoretikerne som et nyhedskriterium for videnskabsjournalistik, selv om det er et af de vigtigste nyhedskriterier for klassisk nyhedsjournalistik og kan beskrives således:

99

”Ligesom kampen mellem det gode og det onde spiller en stor rolle i eventyr, triviallitteratur og film, har konflikt mellem mennesker stor betydning i mange nyheder. Konflikten indeholder et dramatisk element, som pirrer nysgerrigheden.” [Meilby 2006: 58]

Jeg mener, at konflikt kan være mange ting. Der kan være konflikt mellem forskere i form af faglig uenighed, men der kan også være andre slags konflikter. Hvem når først til Månen – russerne eller amerikanerne? Dette er en konflikt, der øger spændingen i en fortælling. Eller har forskeren brugt forskningskroner til privatforbrug? Dette er en konflikt, der handler om redelighed. Men hvis vi ser på konflikt isoleret som faglig uenighed, honoreres dette ikke i videnskabsjournalistik. Forklaringen er ifølge flere teoretikere, at en videnskabelig historie bliver mere sensationel og skarp, hvis der er konsensus om forskningen. Journalistens ’tro’ på sikker viden underminerer således konflikt som nyhedskriterium: Hvis forsker A har bevist, at jorden er firkantet, og journalisten skriver historien: ”Ny forskning viser, at jorden er firkantet’, vil det jo synes tåbeligt, hvis forsker B er uenig og mener, at jorden er rund. Derfor citeres forsker B ikke, men ’glemmes’. Videnskabsjournalister bør nok ændre deres holdning til, at viden er sikker og være villige til at bruge konfliktkriteriet konstruktivt. Jeg mener, at ’faglig uenighed’ bør anses som et sundhedstegn og give anledning til at diskutere, hvorfor forskerne er uenige. Blot skal uenigheden præsenteres ordentligt og ikke nødvendigvis som om den ene forsker har ret (med mindre størstedelen af forskningen viser, at han har ret). Historie 5 (Er to genetiske mødre én for meget?) er i mine øjne et godt eksempel på, at det kan lade sig gøre at præsentere et emne som en diskussion/konflikt på en sober måde. Her mener jeg, at læseren selv kan vælge, hvilken side af sagen han eller hun vil sympatisere med og selv kan danne sig en mening om sagen ud fra oplysningerne.

4.6.7.6 Hvor kritisk skal journalisten være?

Jeg mener, at journalisten bør have en kritisk tilgang til stoffet, så videnskabshistorierne lægger op til dialog og tænkning. Men jeg mener også, at journalisten kun skal være aggressiv kritisk, hvis der er grund til det. Ellers skal han være åben, lyttende og stille opfølgende (kritiske) spørgsmål til indholdet på vegne af den tænkende læser. Altså støtter jeg Franks syn på kritisk journalistik, hvor læseren i de fleste tilfælde bør være den, der fælder dommen over, hvad der er rigtigt og forkert - ikke journalisten. Jeg mener, at journalisten kan vise læseren, at han har stillet opfølgende og kritiske spørgsmål til forskeren ved at bruge spørgsmål/svar, også kaldet Q&A i sin artikel, ligesom jeg har gjort i artikel 5.

4.6.7.7 Sprogbrug: Er ”forskere” et fyord?

Generelt forsøges der i artiklerne at undgå vendinger som ”undersøgelser har vist” eller ”forskere har fundet ud af”. Som udgangspunkt er jeg enig i, at journalisten altid bør være så konkret som mulig og ikke skære forskere over én kam. En molekylærbiolog og en astrofysiker forsker i meget forskellige ting, hvorfor det virker mærkeligt med fællesbetegnelsen. Men nogle gange er det dog vanskeligt ikke at skrive ’forskere’, idet videnskabsfolkene bag et givent forsøg ofte har forskellige uddannelsesbaggrunde. Det vil

100

nærmest være komisk, hvis journalisten skulle uddybe alle forskere ved titel: ”En molekylærbiolog, en kemiker, to læger og en biokemiker har fundet ud af, at …”. Så skal journalisten først finde alle titlerne, og derudover er det ligegyldige informationer for læseren. Derfor synes jeg, det er i orden at skrive ’forskerne’, når man har gjort læseren opmærksom på, hvad der undersøges, og inden for hvilket forskningsområde forskeren arbejder.

4.6.8 Hvordan forenes videnskab og journalistik?

4.6.8.1 Den videnskabelige skrivestil hæmmer videnskabsjournalistikken

Én forhindring for at bedrive god videnskabsjournalistisk er den sproglige afstand, der findes mellem naturvidenskaberne og lægmand, herunder journalisten. Her diskuteres sprog-distancen med udgangspunkt i nærværende speciale. Specialet står som sagt over for en sproglig udfordring, der afsløres allerede i læsevejledningen. Biologerne kan læse alle de afsnit, der handler om journalistik, mens det nærmest er umuligt for ikke-biologer at udlede betydningen af biologiafsnittene. Hvorfor nu det? Først og fremmest vil jeg gerne forklare, hvorfor jeg har anlagt denne skrivestil i biologiafsnittene. Forklaringen er, at molekylærbiologi skrives på en bestemt måde – en skrivemåde, der inkluderer mange fagtermer, der er meget indforståede og upersonlige. Skrivestilen er institutionelt bevidst, således at forskerne ikke har andet valg end at tillægge sig denne stil, hvis de vil gøre karriere inden for området [Kjaer 2007]. Jeg har således ikke forsøgt at revolutionere hele den molekylærbiologiske skrivestil, idet dette ikke var fokus for specialet. Carsten R. Kjaer, redaktør på ’Aktuel Naturvidenskab’, mener, at den svære, indforståede skrivestil blandt andet skyldes, at mange akademiske afhandlinger skrives som middel til at opbygge en karriere – ikke for at de skal blive læst [Kjaer 2007]. Den akademiske professionalisme har således udviklet sig til “hyperprofessionalisme”, hvilket i praksis vil sige, at de akademiske miljøer lukker sig om sig selv og bliver selvrefererende [Kjaer 2007]. I et selvrefererende forskningsmiljø læser ingen forskningsartiklerne, medmindre de er nødt til det. Den faglige jargon er nok kommet for at blive, mener jeg. Men hvis videnskaben fastholder denne skrivestil, er det vigtigt, at forskerne er villige til at forklare deres videnskab til journalisterne og i det hele taget snakke med pressen. Forskeren bør se det som sin demokratiske pligt at fortælle om sin forskning til journalister, fordi den svære skrivestil afskærer journalisten fra at indsamle viden igennem det skriftlige materiale.

4.6.8.2 Uddannelse af videnskabsjournalister

Idealkravene stiller store krav til journalisten; han skal sætte sig grundigt ind i videnskaben, identificere eventuelle bias i forsøgsopstillingen, vurdere risici og vurdere, om forskningen er grundig nok. Det betyder, at journalisten langt hen ad vejen er nødt til at forstå den videnskabelige metatekst for at vurdere, hvad der er overflødigt, og hvad der er vigtigt at fortælle læseren. Men har han kompetencerne til at gøre dette? Jeg tror, at langt de fleste journalister ikke har kompetencerne. Derfor mener jeg, at uddannelse af journalister kan

101

tilskynde mere kompetent, kritisk videnskabsjournalistik. Selv om der er delte meninger om, hvorvidt det er en fordel at journalister er specialiserede inden for ét felt, mener jeg, at det er en fordel. Det giver mulighed for at bruge flere skriftlige kilder, fordi journalisten kan forstå det videnskabelige sprog. På den måde kan journalisten hurtigt få overblik over et forskningsområde, i stedet for at være tvunget til at ringe en forsker op, for at få forklaret videnskaben. Uddannelse inden for et videnskabeligt område kan formentligt øge journalistens mulighed for at vurdere, hvor sikre forsøgsresultater egentligt er. Jeg mener, at journalistuddannelserne skal udbyde kurser eller valgfag, der giver en kort introduktion til forsøgsdesign og statistik.

4.6.8.3 Ud af laboratoriet, ind i samfundet

I løbet af min tid i laboratoriet har jeg fået et indtryk af, at forskere meget sjældent taler med andre end fagfæller om deres forskning, fordi lægmænd ikke forstår deres forskning. Jeg mener, at forskeren så at sige må bestræbe sig på at komme ud af laboratorierne og ind i samfundet, for at rammerne for den gode videnskabsjournalistik kan skabes. Det vil sige, at forskeren skal tale med andre mennesker i videnssamfundet end sine kolleger og derved få en bredere horisont. Hvis forskere aldrig taler med andre end fagfæller, vil de til sidst glemme, hvorfor de forsker og hvorfor deres forskning er spændende, fordi de ikke er vant til at tænke i de baner. Til sidst kan de kun tale fagsproget, kan kun fokusere på detaljer ved forskningen og holder på den måde sig selv uden for samfundet. Hvis forskerne kommer ud af laboratoriet, tror jeg også, at de får øjnene op for, at lægfolk har en anden tilgang til forskning end dem selv. Den almindelige borger er mere interesseret i det store billede, i etik og risikoen for deres helbred, hvor forskeren generelt er interesseret i detaljer, statistik og i den rene videnskab [Hornmoen et al. 2006: 36-38]. Netop derfor tror jeg, at skemaet om idealkravene ser ud, som det gør. For forskeren er alt andet end videnskaben ’fyld’. Forskeren mener, at journalisten bør interessere sig for den rene forskning og ikke putte forskningen ind i en boks af anvendelsesmuligheder, som den ikke kan bære. Men forhåbentlig kan samtaler med lægmænd åbne forskerens øjne for, at det er naturligt at spørge til anvendelsesmulighederne af hans forskning, fordi folk gerne vil vide, hvad formålet med forskningen er.

4.6.8.4 Internettet giver mulighed for den offentlige fornuft

Jeg mener, at der er ved at ske et skred i måden, hvorpå videnskabskommunikation sker på, som fremmer dialogdiskursen i stedet for forståelsesunderskudsdiskursen – takket være internettet. De stående medieteorier antyder, at videnskab kommunikeres til den lidt dumme ’Maren i Kæret’, hvor videnskabsmanden uforstyrret kan belære den mikrofon-holdende, lidt benovede journalist, som bare videreformidler den kloge forskers ord. Denne model skaber ingen involvering af modtageren. Men nu kan modtageren lettere få en stemme, idet flere og flere medier giver mulighed for at kommentere på artikler og tv-indslag, blandt andet

102

Tv2nyhederne.dk, Ingeniørens webside (Ing.dk), Videnskab.dk, Berlingske.dk og Information.dk. Dette betyder, at læseren kan skrive direkte til journalisten, hvis journalisten har misforstået noget, eller hvis læseren gerne vil have noget uddybet. Dette oplever mange journalister dagligt, og debatten raser ofte. Det er altså blevet lettere at deltage i debatten og at skabe en offentlig dialog om videnskab. Derfor vil vi måske i fremtiden se, at formidlingen styres over mod den kritiske demokratiske diskurs, hvor der dannes en kritisk offentlighed.

103

4.7 Konklusion

Udgangspunktet for den journalistiske del af specialet var at finde ud af, hvordan man bedst kan formidle en kompleks videnskabelig problemstilling i gode journalistiske historier.

Ud fra en teoretisk gennemgang af litteratur om videnskabsjournalistik opstilledes en række såkaldte idealkrav, som videnskabsjournalistikken bør opfylde for at kunne siges at være komplet og dækkende. Der findes tre kategorier af idealkrav. Først de normative idealkrav, som gælder for al journalistik. Disse krav fordrer, at journalstikken skal være dækkende, sand og substanskritisk. Journalisten skal høre begge sider af en sag og ikke markedsføre den politiske eller populistiske holdning til et emne. Yderligere skal journalisten afsløre uorden, overtrædelser og fusk samt vurdere om kilder har særinteresser.

Dernæst findes de journalistiske idealkrav, der primært sætter krav til historiens vinkel – altså krav, der styrer udvælgelsen af historier (gatekeeping) og historieproduktionen. De journalistiske idealkrav fordrer endvidere, at historien skal være dagsordensættende/afslørende, kritisk, skarpt vinklet, fascinerende (skør) og væsentlig for modtageren. Historiens naturlige publikum skal desuden være relativt stort og kompleksiteten lav. Ligeledes skal videnskaben være aktuel, hvilket for journalisten ofte betyder, at forskningen skal være ”ny.” Endelig fordrer de journalistiske idealkrav, at historien skal skabe identifikation, helst med en menneskelig vinkel, og at der bruges fortællende elementer for at øge publikums interesse.

Til sidst findes de videnskabelige idealkrav, der primært stiller krav til indholdet. De videnskabelige idealkrav fordrer, at flere kilder skal høres, at historien ikke kun skal være fascinerende, at ’forskere’ ikke skæres over én kam, at der er sproglige forbehold i teksten og at sprogbrugen ikke giver indtryk af sikker viden. Desuden må risici ikke overdrives, forskningens validitet skal vurderes og forskningen bør være kollegialt bedømt (peer reviewed), således at ufærdige resultater ikke gøres til offentlig diskussion. Vigtige indholdsmæssige forbehold, usikkerheder og metodebeskrivelser skal inkluderes. Yderligere bør videnskaben forklares og sættes i kontekst, hvilket betyder, at andre forsøg på området bør præsenteres. Hvis der ikke er konsensus om forskningsresultaterne, skal videnskaben præsenteres som ideer og hypoteser og som en diskussion mellem forskere (en essayistisk tilgang).

Der skrives fem journalistiske videnskabshistorier inden for feltet ’mitokondrieforskning’, hvor idealkravene forsøges opfyldt. En af disse historier er skrevet på baggrund af min egen forskning. De fem artikler analyseres for at udlede, hvor mange idealkrav hver artikel opfylder. Selv om alle idealkravene i princippet bør være opfyldt for at opnå den bedste videnskabsartikel, viste det sig dog at være vanskeligt, fordi nogle af de journalistiske- og videnskabelige idealkrav strider mod hinanden. For eksempel vil en meget skarpt vinklet

104

journalistisk historie ofte ikke indeholde forbehold, metodebeskrivelser og lange videnskabelige forklaringer. Omvendt vil en meget videnskabelig artikel ofte ikke anses som skarpvinklet. Derfor vil en historie ikke både kunne opfylde kravet om skarpvinkling samtidig med at den opfylder de førnævnte videnskabelige idealkrav. En løsning på dette paradoks kan være, at journalisten supplerer historiens brødtekst med tekstbokse, der opfylder de idealkrav, som artiklens brødtekst ikke opfylder. Når man sammenligner metateksten – det vil sige teksten uden om budskabet – i molekylærbiologi-afsnittene med metateksten i den journalistiske historie om min forskning, ses det, at de videnskabelige idealkrav forsøger at bibeholde den videnskabelige metatekst. Dette udspringer formentligt af, at videnskabsmændene, der primært har formuleret de videnskabelige idealkrav, værner om videnskaben. Omvendt lægger de journalistiske idealkrav op til en helt ny metatekst. Journalisten er i sin gode ret til at omskrive metateksten og kun bibeholde de få oplysninger fra den videnskabelige metatekst, som er vigtige for læseren at få. Men journalisten skal ikke inkludere oplysninger, bare fordi videnskabsmanden synes, at det kunne være rart. Journalisten må derfor altid finde en balance mellem hensynet til videnskaben og hensynet til læseren. Der arbejdes med et koncept om kapital, som refererer til en histories forventede potentiale for at sætte dagsordnen og sælge aviser. Det er tilrådeligt, at videnskabshistorier både opfylder mange af de videnskabelige idealkrav og de journalistiske idealkrav for både at være informativ, dækkende og underholdende for læseren. På den måde opnår historien mest såkaldt ’videnskabsjournalistisk kapital’, fordi historien både er nyhedsværdig, det vil sige, at den slipper igennem mediernes nåleøje, og samtidig er videnskabeligt dækkende, så borgeren ikke misledes eller fejlinformeres. Dog vil de journalistiske idealer formentligt veje tungest på mediernes vægtskål. En videnskabshistorie vil derfor sandsynligvis opnå mest kapital ved at være dagsordensættende og afslørende i forhold til bare at være formidlende. Journalisten kan gennem en række bevidste valg modellere historien, så den opfylder både nogle af de journalistiske- og videnskabelige idealkrav. For eksempel kan der skæres i de videnskabelige forklaringer, forbehold og nuancer, så historien bliver mindre kompleks og vinklen mere skarp. Om dette er forsvarligt at gøre, afhænger af historien. Men historien må aldrig strammes, så læseren fejlinformeres. Det er vist i specialet, at videnskab kan skrives i andre genrer end som klassiske nyhedsartikler. Journalisten bør bevidst vælge genren ud fra videnskabens modenhed. Hvis videnskaben er verificeret igennem adskillige forsøg, og der synes at være relativt stor konsensus om en videnskabelig påstand/sammenhæng, kan historien med fordel præsenteres som en nyhed, dog med nødvendige forbehold. Men hvis der er stor usikkerhed inden for forskerverdenen om, hvad der er op og ned på det givne videnskabelige felt, kan en mere essayistisk og diskuterende skrivestil vælges, hvorfor nyheds-genren ikke længere er oplagt. Journalisten bør derfor altid vurdere, hvad den enkelte historie kan bære. Nogle historier kan

105

strammes mere end andre grundet mere viden på området, men overordnet set kan alt videnskab præsenteres journalistisk. Idealkravenes formål er at sikre, at en videnskabelig tekst bliver så dækkende og sand som mulig. De kan dog virke begrænsende for den gode videnskabsjournalistik. For eksempel fordrer kravet om kollegial bedømmelse af forskning (peer review), at der udelukkende fokuseres på resultater, der foreligger i videnskabelige artikler. Herved glemmes de videnskabelige processer og -spørgsmål, hvilket ikke er hensigtsmæssigt. Jeg mener, at en videnskabelig hypotese kan være lige så væsentlig og vigtig som resultater. Derfor bør journalister være mere åbne for at kigge på videnskabelige processer og -spørgsmål i stedet for kun at fokusere på resultater. Desuden er peer review ikke altid garanti for god videnskab. Derfor bør journalisten altid stille sig kritisk over for en påstand, selv om den bygger på forskning, der er kollegialt bedømt. Yderligere kan nyhedskriteriet aktualitet virke begrænsende i udvælgelsen af videnskabsjournalistiske historier, når det bruges i betydningen ’ny viden’. Det fordrer, at journalisten kun skal søge efter videnskabelige nyheder i dugfriske videnskabelige magasiner. Men vidensproduktionen er langsommelig og kan ikke anses som en isoleret ny begivenhed ligesom andre dagsaktuelle begivenheder. Jeg mener, at aktualitetskriteriet bør anses som opfyldt, når informationen er ’ukendt viden’ for læseren. Herved bliver videnskabelige processer og ’gammel viden’ også interessant. Væsentlighedskriteriet kan ligeledes virke begrænsende på, hvilke videnskabshistorier der anses som nyhedsværdige, hvis kriteriet anvendes i betydningen ’direkte nyttig’ for publikum. Hvis forskningen eller den videnskabelige proces skal være direkte nyttig for læseren, vil meget grundforskning ikke kunne opfylde dette kriterium. Men hvis væsentligt bruges i betydningen ’oplysende’, vil grundforskning også være nyhedsværdigt. Kriteriet om væsentlighed bør derfor anses som værende opfyldt, når informationen er oplysende for læseren. Når man ser på de videnskabelige idealkrav, er det tydeligt, at de stiller store krav til journalisten: Han skal kunne vurdere videnskabens modenhed og validitet samt stille sig kritisk overfor forskerens påstande. Journalisten kun vil have kompetencerne til dette, hvis han eller hun har modtaget undervisning i forsøgsdesign og statistik. Jeg mener, at uddannelse ruster videnskabsjournalisten til at stille kritiske spørgsmål til metoden og resultaterne. At journalisten har forsøgt at stille sig kritisk overfor forskerens udtalelser kan demonstreres meget eksplicit i artiklen ved at bruge spørgsmål/svar, også kaldet Q&A, hvor journalistens spørgsmål gerne må være opfølgende. Herved er det tydeligt, at journalisten har forsøgt at være kritisk på læserens vegne. Videnskabshistorier skrives i dag fortrinsvist ud fra en antagelse om, at læseren er i forståelsesunderskud og skal oplyses, men ikke involveres. Det kan tænkes, at internettet

106

giver mulighed for mere involvering af læseren, fordi læseren har mulighed for at kommentere på artiklerne. Journalisten bliver på den måde gjort opmærksom på, hvis han har misforstået noget, eller hvis læseren har ubesvarede spørgsmål og vil have nogle detaljer uddybet. Kommentarerne styrker samtalen mellem forskeren, journalisten og læseren og lægger op til mere dialog i stedet for formidling. Jeg mener, at der er brug for en holdningsændring både fra journalistens og forskerens side i forhold til den anden part, før vilkårene for at bedrive god videnskabsjournalistik forbedres. Journalisten må have tålmodighed med forskeren, når denne skal udtale sig, da det ofte er en uvant situation for forskeren at skulle sætte forskningen ind i et større perspektiv. Omvendt må forskeren være mere åben over for journalisten og acceptere, at journalisten forsøger at sætte hans forskning ind i en sammenhæng, der er relevant for læseren, selv om forskeren mener, at videnskaben i sig selv er interessant nok. Yderligere må forskeren stole på, at journalisten gør sit arbejde ordentligt. Forskeren bør anerkende videnskabsjournalistik på lige fod med forskning. Begge dele er nemlig et spørgsmål om tænkning, uddannelse og håndværk.

107

5. Litteratur

5.1 Molekylærbiologi

OBS: Kilderne i denne liste refererer kun til kilder anvendt i molekylærbiologiafsnittene. Alle andre kilder fra indledningen og Journalistik-afsnittene findes i næste liste. Abdulovic A.L. og Jinks-Robertson S. (2006) The in Vivo Characterization of Translesion Synthesis Across UV-Induced Lesions in Saccharomyces cerevisiae: Insights Into Pol ζ - and Polη-Dependent Frameshift Mutagenesis. Genetics, 172 (3), 1487-98.

Abdulovic A.L., Minesinger B.K., Jinks-Robertson S. (2008) The effect of sequence context on spontaneous Polζ-dependent mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae, Nucleic Acids Res. 36, 2082–2093.

Acharya N., Haracska L., Johnson R.E., Unk I., Prakash S. og Prakash L. (2005) Complex Formation of Yeast Rev1 and Rev7 Proteins: a Novel Role for the Polymerase-Associated Domain, Mol Cell Biol. 25 (21): 9734–9740.

Acharya, N., Johnson R.E., Prakash S., og Prakash L. (2006). Complex formation with Rev1 enhances the proficiency of Saccharomyces cerevisiae DNA pol zeta for mismatch extension and for extension opposite from DNA lesions. Mol. Cell. Biol. 26, 9555–9563.

Albertella M.R., Lau A. og O’Connor M.J. (2005) The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer, DNA Repair. 4, 583–593.

Allen J.B., Zhou Z., Siede W., Friedberg E.C. and Elledge S.J. (1994) The SAD1/RAD53 protein kinase controls multiple checkpoints and DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev. 8, 2416– 2428.

Amberg D.C., Burke D.J. og Strathern J.N. (2005) Methods in Yeast Genetics – A cold spring harbor laboratory course manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0-87969-728-8

Andersen P.L., Xu F., and Xiao W. (2008) Eukaryotic DNA damage tolerance and translesion synthesis through covalent modifications of PCNA. Cell Res. 18, 162–173.

Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J., Staden R., Young I.G. (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290, 457-465.

Arana M.E., Takata K., Garcia-Diaz M., Wood R.D., Kunkel T.A. (2007) A unique error signature for human DNA polymerase ν. DNA Repair (Amst); 6, 213-223.

Bailly V., Lauder S., Prakash S. og Prakash L. (1997) Yeast DNA repair proteins Rad6 and Rad18 form a heterodimer that has ubiquitin conjugating, DNA binding, and ATP hydrolytic activities, J. Biol. Chem. 272, 23360–23365.

108

Baker T.A. og Bell S.P. (1998) Polymerases and the replisome: machines within machines. Cell. 92, 295–305.

Bartek J, Lukas C og Lukas J (2004) Checking on DNA damage in S phase, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5 (10), 792-804

Bebenek K. og Kunkel T.A. (1990) Frameshift errors initiated by nucleotide misincorporation, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4946–4950.

Beranek D.T., Weis C.C. og Swenson D.H. (1980) A comprehensive quantitative analysis of methylated and ethylated DNA using high pressure liquid chromatography. Carcinogenesis 1:595-606.

Bi X., Barkley L.R., Slater D.M., Tateishi S., Yamaizumi M., Ohmori H. og Vaziri C. (2006) Rad18 regulates DNA polymerase kappa and is required for recovery from S-phase checkpoint-mediated arrest, Mol. Cell. Biol. 26 3527–3540.

Bienko M., Green C.M., Crosetto N., Rudolf F., Zapart G., Coull B., Kannouche P., Wider G., Peter M. Lehmann A.R., Hofmann K., Dikic I. (2005) Ubiquitin-binding domains in Y-family polymerases regulate translesion synthesis, Science. 310 1821–1824.

Boudsocq F., Kokoska R.J., Plosky B.S., Vaisman A., Ling H., Kunkel T.A., Yang W. og Woodgate R. (2004) Investigating the role of the little finger domain of Y-family DNA polymerases in low fidelity synthesis and translesion replication. J. Biol. Chem. 279, 32932–32940.

Boveris A, Valdez L. B., Zaobornyj T., and Bustamante J., (2006) Mitochondrial metabolic states regulate nitric oxide and hydrogen peroxide diffusion to the cytosol,” Biochimica et Biophysica Acta. 1757, 535–542.

Branzei D. og Foiani M (2005), The DNA damage response during DNA replication, Curr. Opin. Cell Biol. 17, 568–575.

Branzei D. og Foiani M. (2007) Interplay of replication checkpoints and repair proteins at stalled replication forks, DNA Repair. 6, (7), 994-1003.

Bresson A. og Fuchs R.P. (2002) Lesion bypass in yeast cells: Pol eta participates in a multi-DNA polymerase process. EMBO J. 21, 3881-3887.

Bunting K.A., Roe S.M. og Pearl L.H. (2003) Structural basis for recruitment of translesion DNA polymerase Pol IV/DinB to the beta-clamp. EMBO J. 22:5883-92.

Chabes A, Georgieva B., Domkin V.,. Zhao X, Rothstein R., Thelander L. (2003) Survival of DNA damage in yeast directly depends on increased dNTP levels allowed by relaxed feedback inhibition of ribonucleotide reductase, Cell. 112, 391–401.

Chang D.J. og Cimprich K.A (2009) DNA Damage Tolerance: When It’s OK to Make Mistake, Mutation Research. 625, 112–124.

109

Chang, D.J., Lupardus, P.J., and Cimprich, K.A. (2006) Monoubiquitination of PCNA induced by stalled replication requires uncoupling of DNA polymerase and MCM helicase activities. J. Biol. Chem. 281, 32081–32088.

Chen O.S. og Kaplan J. (2001) YFH1-mediated iron homeostasis is independent of mitochondrial respiration, FEBS Letters 509, 131-134.

Chen X. J. og Clark-Walker G.D. (1999) α and β subunits of F1-ATPase are required for survival of petite mutants in Saccharomyces cerevisiae, Mol Gen Genet 262: 898-908

Chen, Y. W., Cleaver, J. E., Hanaoka, F., Chang, C. F., and Chou, K. M. (2006) A Novel Role of DNA Polymerase η in Modulating Cellular Sensitivity to Chemotherapeutic Agents. Molecular cancer research : MCR 4, 257-265

Chiu RK, Brun J., Ramaekers C., Theys J., Weng L., Lambin P., Gray D.A. og Wouters B.G. (2006) Lysine 63-polyubiquitination guards against translesion synthesis-induced mutations. PLoS Genet; 2:(7) e116.

Cleaver J.E og Mitchell D.L. (2003) Ultraviolet Radiation Carcinogenesis, Holland-Frei Cancer Medicine, 6th edition, Hamilton (ON): BC Decker, ISBN: 1-55009-213-8.

Conrad-Webb H. og Butow R.A. (1995) A Polymerase Switch in the Synthesis of rRNA in Saccharomyces cerevisiae, Molecular and cellular biology. 15 (5), 2420–2428.

Coulon S., Ramasubramanyan S., Alies C., Philippin G., Lehmann A. and Fuchs R.P. (2010) Rad8Rad5/Mms2–Ubc13 ubiquitin ligase complex controls translesion synthesis in fission yeast, The EMBO Journal. 29, 2048 – 2058.

Desler C., Lykke A. og Rasmussen L.J. (2010) The Effect of Mitochondrial Dysfunction on Cytosolic Nucleotide Metabolism, Journal of Nucleic Acids, vol. 2010, Article ID 701518, 9 pages.

Desler C., Munch-Petersen, B., Stevnsner, T., Matsui, S., Kulawiec, M., Singh, K. K., and Rasmussen, L. J. (2007) Mitochondria as determinant of nucleotide pools and chromosomal stability, Mutation research 625, 112-124.

DiMauro S. og Schon E.A. (2003) Mitochondrial respiratory-chain diseases. The New England journal of medicine. 348, 2656-2668.

Dominguez J., Ruiz F., Lain de Lera T., Garcia-Diaz M., Gonzalez M.A., Kirchhoff T., Martinez A.C., Bernad A. og Blanco L. (2000) DNA polymerase mu (PollÞ, homologous to TdT, could act as a DNA mutator in eukaryotic cells, EMBO J. 7, 1731–1742.

Edmunds CE., Simpson LJ., and Sale JE. (2008) PCNA Ubiquitination and REV1 Define Temporally Distinct Mechanisms for Controlling Translesion Synthesis in the Avian Cell Line DT40, Molecular Cell. 30, 519–529.

Elledge S.J. og Davis R.W. (1990) Two genes differentially regulated in the cell cycle and by DNA-damaging agents encode alternative regulatory subunits of ribonuclease reductase. Genes De. 4,740-751.

110

Fortune J.M., Pavlov Y.I., Welch C.M., Johansson E., Burgers P.M., Kunkel T.A. (2005) Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase delta: high fidelity for base substitutions but lower fidelity for single- and multi-base deletions, J Biol Chem. 280 (33), 29980-7.

Frampton J., Irmisch A., Green C.M., Neiss A., Trickey M., Ulrich H.D., Furuya K., Watts F.Z., Carr A.M. og Lehmann A.R. (2006) Postreplication repair and PCNA modification in Schizosaccharomyces pombe, Mol Biol Cell. 17, 2976–2985.

Friedberg E.C., Feaver W.J. og Gerlach V.L. (2000) The many faces of DNA polymerases: strategies for mutagenesis and for mutational avoidance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 5681–5683.

Friedberg E.C., Lehmann A.R., Fuchs R.P. (2005b) Trading places: how do DNA polymerases switch during translesion DNA synthesis? Mol Cell. 18, 499–505.

Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R. D., Schultz R. A., and Ellenberger T. (2005a) DNA repair and mutagenesis, 2nd ed. ASM Press, Washington, DC, ISBN-10: 1555813194.

Friedberg E.C., Walker G.C. og Siede W. (1995) DNA Repair and Mutagenesis. ASM Press, Washington, DC.

Fujii S. og Fuchs R.P. (2007) Interplay among replicative and specialized DNA polymerases determines failure or success of translesion synthesis pathways, J Mol Biol. 372, 883–893.

Gan G.N., Wittschieben J.P., Wittschieben B.Ø., Wood R.D. (2008) DNA polymerase zeta in higher eukaryotes, Cell. Res. 18, 174–183.

Ge Y og Ye F (2009) The Effect of Adenine Starvation on dNTP Pools in Yeast. Module 3 report in Molecular Biology, Roskilde University, Department of Science, Systems and models.

Gibbs P.E., McDonald R., Woodgate R., Lawrence C.W. (2005) The relative roles in vivo of Saccaromyces cerevisiae pol eta, pol zeta, Rev1 protein and Pol32 in the bypass and mutation induction of an abasic site, T-T (6-4) photoadduct and T-T cis-syn cyklobutane dimmer, Genetics. 169, 575-582.

Golos B. og J. Malec (1991) Comparison of the effect of hydroxyurea and methotrexate on DNA fragmentation at various reaction conditions, Neoplasma 38 559–564.

Goodman M. F. 2002. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 71, 17–50.

Grossman L.I. og Shoubridge E.A. (1996) Mitochondrial genetics and human disease. BioEssays. 18, 983–991.

Guo C, Tang T.S., Bienko M., Parker J.L., Bielen A.B., Sonoda E., Takeda S., Ulrich H.D., Dikic I. og Friedberg E.C. (2006b) Ubiquitin-binding motifs in REV1 protein are required for its role in the tolerance of DNA damage, Mol Cell Biol. 26 (23):8892-8900

111

Guo C., Fischhaber P.L., Luk-Paszyc M.J., Masuda Y., Zhou J., Kamiya K., Kisker C., Friedberg E.C. (2003) Mouse Rev1 protein interacts with multiple DNA polymerases involved in translesion DNA synthesis, EMBO J. 22, 6621–6630.

Guo C., Sonoda E., Tang T-S, Parker J.L., Bielen A.B., Takeda S., Ulrich H.D. og Friedberg E.C. (2006a) REV1 Protein Interacts with PCNA: Significance of the REV1 BRCT Domain In Vitro and In Vivo, Molecular Cell. 23 (2), 265-271.

Guo D., Xie Z., Shen H., Zhao B., og Wang Z. (2004) Translesion synthesis of acetylaminofluorene-dG adducts by DNA pol zeta is stimulated by yeast Rev1 protein. Nucleic Acids Res. 32, 1122–1130.

Haracska L., Kondratick C.M., Unk I., Prakash S., Prakash L. (2001a) Interaction with PCNA is essential for yeast DNA polymerase eta function, Mol Cell. 2, 407-15.

Haracska L., Prakash S. og Prakash L. (2002) Yeast Rev1 protein is a G template-specific DNA polymerase. J Biol Chem. 277 (18), 15546-51.

Haracska L., Prakash S., Prakash L. (2003) Yeast DNA Polymerase ζ Is an Efficient Extender of Primer Ends Opposite from 7,8-Dihydro-8-Oxoguanine and O6-Methylguanine Mol. Cell Biol. 23, 1453–59.

Haracska L., Prakash S. og Prakash L. (2000) Replication past O6-methylguanine by yeast and human DNA polymerase η, Mol. Cell. Biol. 20, 8001–8007.

Haracska L., Unk I., Johnson R.E., Johansson E., Burgers P.M., Prakash S. og Prakash L. (2001b) Roles of yeast DNA polymerases δ and ζ and of Rev1 in the bypass of abasic sites, Genes Dev. 15, 945–954.

Heller og Marians (2006) Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand, Nature. 439, 557-562.

Hoege C., Pfander B., Moldovan G.L., Pyrowolakis G., Jentsch S. (2002) RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO, Nature. 419, 135–141.

Huang M, Zhou Z, Elledge SJ (1998) The DNA replication and damage checkpoint pathways induce transcription by inhibition of the Crt1 repressor. Cell. 94 (5), 595-605.

Huang M.E., Rio A.G., Galibert M.D. og Galibert F. (2002) Pol32, a Subunit of Saccharomyces cerevisiae DNA Polymerase δ Suppresses Genomic Deletions and Is Involved in the Mutagenic Bypass Pathway, Genetics. 160, 1409–1422.

Huang T.T., Nijman S.M.B., Mirchandani K.D., Galardy P.J., Cohn M.A., Haas W., Gygi S.P., Ploegh H.L., Bernards R. og D'Andrea A.D. (2006) Regulation of monoubiquitinated PCNA by DUB autocleavage. Nat Cell Biol 8, 339–347.

Jacky P.B., Beek B., Sutherland G.R. (1983) Fragile sites in chromosomes: possible model for the study of spontaneous chromosome breakage, Science. 220, 69–70.

112

Jansen J.G., Tsaalbi-Shtylik A., Hendriks G., Verspuy J., Gali H., Haracska L. og Wind N.D. (2009) Mammalian polymerase zeta is essential for post-replication repair of UV-induced DNA lesions, DNA Repair (Amst). 8 (12), 1444-51.

Johns D.R. (1995) Mitochondrial DNA and disease, The New England Journal of Medicine, 333 (10), 638-644.

Johnson R.E., Haracska L., Prakash S., and Prakash L. (2001) Role of DNA Polymerase η in the Bypass of a (6-4) TT Photoproduct, Molecular and Cellular Biology. 21 (10), 3558-3563.

Johnson R.E., Prakash S. og Prakash, L. (1999) Efficient bypass of a thymine-thymine dimer by yeast DNA polymerase, Pol η, Science 283, 1001–1004.

Johnson R.E., Washington M.T., Haracska L., Prakash S., Prakash L. (2000) Eukaryotic polymerases iota and zeta act sequentially to bypass DNA lesions, Nature. 406, 1015–1019.

Johnson R.E., Yu S.-L., Prakash S, og Prakash L. (2003) Yeast DNA polymerase zeta (ζ) is essential for error-free replication past thymine glycol, Genes Dev. 17, 77-87

Johnson R.E., Yu S.L., Prakash S. og Prakash L. (2007) A Role for Yeast and Human Translesion Synthesis DNA Polymerases in Promoting Replication through 3-Methyl Adenine, Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7198-7205.

Kannouche P. L., Wing, J., and Lehmann, A. R. (2004) Interaction of human DNA polymerase eta with monoubiquitinated PCNA: a possible mechanism for the polymerase switch in response to DNA damage, Mol. Cell. 14, 491-500.

Ke P.Y., Kuo Y.Y., Hu C.M., Chang Z.F. (2005) Control of dTTP pool size by anaphase promoting complex/cyclosome is essential for the maintenance of genetic stability, Genes Dev. 19, 1920–1933.

Kelman Z., Jerard Hurwitz and Mike O’Donnell (1998), Processivity of DNA polymerases: two mechanisms, one goal, Structure. 6 (2), 121–125.

Koc A. og Merrill G.F. (2007) Checkpoint deficient rad53-11 yeast cannot accumulate dNTPs in response to DNA damage, Biochemical and Biophysical Research Communications 353, 527–530.

Kool E.T. (2002) Active site tightness and substrate fit in DNA replication. Annu Rev Biochem. 71, 191-219.

Kunkel T.A. (2003a) Considering the cancer consequences of altered DNA polymerase function, Cancer Cell. 2003 Feb;3(2):105-10.

Kunkel T.A. (2004b) DNA replication fidelity. J. Biol. Chem. 279, 16895–16898.

Kunkel T.A., Hamatake R.K., Motto-Fox J., Fitzgerald M.P., Sugino A. (1989) Fidelity of DNA polymerase I and the DNA polymerase IDNA primase complex from Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol. 9, 4447-4458.

113

Kunkel T.A., Pavlov Y. I, Bebenek K. (2003b) Functions of human DNA polymerases η, κ and ι suggested by their properties, including fidelity with undamaged DNA templates, DNA Repair. 2, 135–149.

Lambert S og Carr AM. (2005) Checkpoint responses to replication fork barriers, Biochimie. 87 (7), 591-602.

Larsen N.B., Rasmussen M., Rasmussen L.J. (2005) Nuclear and mitochondrial DNA repair: similar pathways? Mitochondrion. 5, 89–108.

Lawley P.D., Orr D.J. og Jarman M. (1975). Isolation and identification of products from alkylation of nucleic acids: ethyl- and isoproyl-purines, Biochem. J. 145,73-84.

Lawrence C.W. (2004) Cellular functions of DNA polymerase zeta and Rev1 protein. Adv. Protein Chem. 69, 167–203.

Lawrence C.W. og D.C. Hinkle (1996), DNA polymerase zeta and the control of DNA damage induced mutagenesis in eukaryotes, Cancer Surv. 28, 21–31.

Lawrence C.W., P.E. Nisson, R.B. Christensen (1985) UV and chemical mutagenesis in rev7 mutants of yeast, Mol. Gen. Genet. 200, 86–91.

Lawrence C.W. og Christensen R.B. (1976) UV mutagenesis in radiation sensitive strains of yeast, Genetics 82, 207–232.

Lawrence C.W., T. O’Brien, J. Bond (1984) UV-induced reversion of his4 frameshift mutations in rad6, rev1, and rev3 mutants of yeast, Mol. Gen. Genet. 195, 487–490.

Lawrence C.W. (2002) Cellular roles of DNA polymerase zeta and Rev1 protein. DNA Repair 1, 425–435.

Lawrence C.W. og Maher V.M. (2001). Mutagenesis in eukaryotes dependent on DNA polymerase zeta and Rev1p, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1405), 41–46.

Lee D.H. og Pfeifer G. P. (2008) Translesion synthesis of 7,8-dihydro-8-oxo-2-deoxyguanosine by DNA polymerase eta in vivo. Mutat. Res. 641, 19–26.

Lehmann AR., Niimi A, Ogi T, Brown S, Sabbioneda S, Wing J F., Kannouche P L., Green C M. (2007) Translesion synthesis: Y-family polymerases and the polymerase switch, DNA repair. 6, 891–899.

Lemontt J.F. (1971) Mutants of yeast defective in mutation induced by ultraviolet light, Genetics 68, 21–33.

Lemontt J.F. (1972), Induction of forward mutations in mutationally defective yeast, Mol. Gen. Genet. 119, 27–42.

Levine, R. L., Miller, H., Grollman, A., Ohashi, E., Ohmori, H., Masutani, C., Hanaoka, F., and Moriya, M. (2001) Translesion DNA Synthesis Catalyzed by Human Pol η and Pol κ across 1,N6-Ethenodeoxyadenosine, The Journal of biological chemistry. 276, 18717-18721.

114

Lin X., Trang J., Okuda T., og Howell S.B.. (2006a). DNA polymerase zeta accounts for the reduced cytotoxicity and enhanced mutagenicity of cisplatin in human colon carcinoma cells that have lost DNA mismatch repair. Clin. Cancer Res. 12, 563–568.

Lin X., Okuda T., Trang J. og Howell S.B. (2006b) Human REV1 Modulates the Cytotoxicity and Mutagenicity of Cisplatin in Human Ovarian Carcinoma Cells, Molecular Pharmacology. 69 (5), 1748-1754.

Lindahl T. og Barnes D.E. (2000) Repair of endogenous DNA damage. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 65, 127–133.

Ling H., Boudsocq F., Woodgate R., Yang W. (2001) Crystal structure of a Y-family DNA polymerase in action: a mechanism for error-prone and lesion-bypass replication, Cell. 107 (1), 9-12.

Lis E T., O’Neill B.M., Gil-Lamaignere C., Chin J.K., Romesberg F.E. (2008) Identification of pathways controlling DNA damage induced mutation in Saccharomyces cerevisiae, DNA repair. 7, 801–810.

Löffler M., Jockel J., Schuster G. og Becker C. (1997) Dihydroorotateubiquinone oxidoreductase links mitochondria in the biosynthesis of pyrimidine nucleotides. Mol. Cell. Biochem. 174, 125-129.

Lopes M., Foiani M., Sogo J.M. (2006) Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions, Mol. Cell. 21, 15–27.

Machado A.M.D., Figueiredo C., Touati E., Maximo V., Sousa S., Michel V., Carneiro F., Nielsen F.C, Seruca R og Rasmussen LJ (2009) Helicobacter pylori Infection Induces Genetic Instability of Nuclea And Mitochondrial DNA in Gastric Cells, Clin Cancer Res. 15, 2995-3002.

Masuda Y. og Kamiya K. (2006) Role of single-stranded DNA in targeting REV1 to primer termini. J Biol Chem. 281, 24314–24321.

Masutani C., Kusumoto R., Yamada A., Dohmae N., Yokoi M., Yuasa M., Araki M., Iwai S., Takio K., Hanaoka F. (1999), The XPV (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human DNA polymerase eta, Nature. 399, 700–704.

Matsuda T., Bebenek K., Masutani C., Rogozin I.B., Hanaoka F., Kunkel T.A. (2001) Error rate and specificity of human and murine DNA polymerase eta. J Mol Biol. 312 (2), 335-46.

Matsuda T., Bebenek K., Masutani C., Hanaoka F., Kunkel T.A. (2000) Low fidelity DNA synthesis by human DNA polymerase-η, Nature. 404, 1011–1013.

McCulloch S.D. og Kunkel T.A. (2008) The fidelity of DNA synthesis by eukaryotic replicative and translesion synthesis polymerases, Cell Research. 18, 148-161.

McCulloch S.D., Wood A., Garg P., Burgers P.M., Kunkel T.A. (2007) Effects of accessory proteins on the bypass of a cis-syn thyminethymine dimer by Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase η. Biochemistry, 46, 8888-8896.

115

McCulloch S.D., Kokoska R.J., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F. og Kunkel T.A. (2004b) Preferential cis-syn thymine dimer bypass by DNA polymerase eta occurs with biased fidelity, Nature. 428, 97–100.

McCulloch S.D., Kokoska R.J., Chilkova O., Welch C.M., Johansson E., Burgers P.M. og Kunkel T.A. (2004a) Enzymatic switching for efficient and accurate translesion DNA replication, Nucleic Acids Res. 32, 4665– 4675.

McDonald J.P., Levine A.S. og Woodgate R. (1997) The Saccharomyces cerevisiae RAD30 gene, a homologue of Escherichia coli dinB and umuC, is DNA damage inducible and functions in a novel error-free postreplication repair mechanism, Genetics. 147, 1557–1568.

McGregor W.G. (1999) DNA repair, DNA replication, and UV mutagenesis, J. Invest. Dermatol. 4, 1–5.

McKee R.H. og Lawrence C.W. (1979) Genetic analysis of gamma-ray mutagenesis in yeast. II. Allele-specific control of mutagenesis, Genetics. 93, 375–381.

Meuth M. (1989) The molecular basis of mutations induced by deoxyribonucleoside triphosphate pool imbalances in mammalian cells, Exp. Cell Res. 181, 305–316.

Minko I.G., Washington M.T., Kanuri M., Prakash L., Prakash S., and Lloyd R.S. (2002) Translesion synthesis past acrolein-derived DNA adduct, γ hydroxypropanodeoxyguanosine, by yeast and human DNA polymerases η. J. Biol. Chem. 278, 784–790.

Modica-Napolitano J.S. og Singh K. (2002) Mitochondria as target for detection and treatment of cancer. Expert Rev. Mol. Med. 4, 1-19.

Modica-Napolitano J.S. og Singh K. (2004) Mitochondrial dysfunction in cancer. Mitochondrion. 4, 755-762.

Morrison A., Christensen R.B., Alley J., Beck A.K., Bernstine E.G., Lemontt J.F. og Lawrence C.W (1989) REV3, a Saccharomyces cerevisiae gene whose function is required for induced mutagenesis, is predicted to encode a nonessential DNA polymerase. J. Bacteriol. 171, 5659–5667.

Murakumo Y., Ogura Y., Ishii H., Numata S., Ichihara M., Croce C.M., Fishel R., Takahashi M. (2001) Interactions in the error-prone postreplication repair proteins hREV1, hREV3, and hREV7, J. Biol. Chem. 276, 35644–35651.

Nair D.T., Johnson R.E., Prakash S., Prakash L., Aggarwal A.K. (2004) Replication by human DNA polymerase-iota occurs by Hoogsteen base-pairing. Nature. 430, 377–380.

Nelson J.R., Gibbs P.E.M., Nowicka A.M., Hinkle D.C. og Lawrence C.W. (2000) Evidence for a second function for Saccharomyces cerevisiae Rev1p. Mol. Microbiol. 37, 549–554.

Nelson J.R., Lawrence C.W., Hinkle D.C. (1996a) Deoxycytidyl transferase activity of yeast REV1 protein. Nature. 382, 729–731.

116

Nelson, J.R., Lawrence C.W. og Hinkle D.C. (1996b). Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta. Science. 272, 1646–1649.

Nordlund P. og Reichard P. (2006) Ribonucleotide Reductases, Annu. Rev. Biochem. 75, 681–706.

Ogi T., Kato Jr T.., Kato T., Ohmori H. (1999) Mutation enhancement by DINB1, a mammalian homologue of the Escherichia coli mutagenesis protein DinB, Genes Cells. 4, 607–618.

Ohashi E., Bebenek K., Matsuda T., Feaver W.J., Gerlach V.L., Friedberg E.C., Ohmori H. og Kunkel T.A. (2000) Fidelity and processivity of DNA synthesis by DNA polymerase kappa, the product of the human DINB1 gene. J Biol Chem. 275 (50), 39678-84.

Ohashi, E., Murakumo Y., Kanjo N., Akagi J., Masutani C., Hanaoka F., og Ohmori H. (2004) Interaction of hREV1 with three human Y-family DNA polymerases. Genes Cells. 9, 523–531.

Park S.Y., Chang I., Kim J.Y., Kang S.W., Park S.H., Singh K. og Lee M.S. (2004) Resistance of Mitochondrial DNA-depleted Cells against Cell Death – Role of mitochondrial superoxide dismutase, J Biol Chem. 279 (9), 7512-20.

Paulovich A.G. og Hartwell L.H. (1995) A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82, 841–847.

Pavlov Y.I., Shcherbakova P.V. og Kunkel T.A. (2001) In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta, Genetics. 159, 47–64.

Pollard P.J., Briere J.J., Alam N.A., Barwell J., Barclay E., Wortham N.C., et al. (2005) Accumulation of Krebs cycle intermediates and over-expression of HIF1alpha in tumours which result from germline FH and SDH mutations. Hum Mol Genet. 14 (15), 2231–9.

Prakash L. (1976) Effect of genes controlling radiation sensitivity on chemically induced mutations in Saccharomyces cerevisiae, Genetics. 83, 285–301.

Prakash S. og Prakash L. (2002) Translesion DNA synthesis in eukaryotes: a one or two-polymerase affair, Genes Dev. 16, 1872–1883.

Prakash S., Johnson R.E., Prakash L. (2005) Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: Specificity of structure and function. Annu Rev Biochem. 74, 317–353.

Quah S.K., von Borstel R.C. and Hastings P.J. (1980) The origin of spontaneous mutation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 96, 819–839.

Rajpal D.K., Wu X., og Wang Z. (2000) Alteration of ultraviolet-induced mutagenesis in yeast through molecular modulation of the REV3 and REV7 gene expression. Mutat. Res. 461, 133–143.

117

Rasmussen A.K., Chatterjee, A., Rasmussen, L.J. og Singh K. K. (2003) Mitochondria-mediated nuclear mutator phenotype in Saccaromyces cerevisiae. Nucleic acids research 31, 3909-3917.

Rattray A.J. og Strathern J.N. (2003) Error-prone DNA polymerases: When making a mistake is the only way to get ahead. Annu Rev Genet. 37:31–66.

Rawls J., Knecht W., Diekert K., Lill R. og Löffler M. (2000) Requirements for the mitochondrial import and localization of dihydroorotate dehydrogenase, European Journal of Biochemistry. 267 (7), 2079–2087.

Reichard P. (1988) Interactions between deoxyribonucleotide and DNA synthesis, Annual Review of Biochemistry. 57, 349–374.

Reichard P., Baldesten A., Rutberg L. (1961) Formation of deoxycytidine phosphates from cytidine phosphates in extracts from Escherichia coli. J Biol Chem. 236, 1150-57.

Reichard P., Eliasson R., Ingemarson R., and Thelander L. (2000) Cross-talk between the allosteric effector-binding sites in mouse ribonucleotide reductase. J. Biol. Chem. 275, 33021–33026.

Roush A.A., Suarez M., Friedberg E.C., Radman M., og Siede W (1998) Deletion of the Saccharomyces cerevisiae gene RAD30 encoding an Escherichia coli DinB homolog confers UV radiation sensitivity and altered mutability. Mol. Gen. Genet. 257, 686–692.

Rupp W.D. og Howard-Flanders P. (1968) Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation, J. Mol. Biol. 31, 291–304.

Sakamoto A.N., Stone J.E., Kissling G.E., McCulloch S.D., Pavlov Y.I. og Kunkel T.A. (2007) Mutator alleles of yeast DNA polymerase zeta, DNA repair. 6, 1829–1838.

Seki M. og Wood R.D. (2008) DNA polymerase θ (POLQ) can extend from mismatches and from bases opposite a (6-4) photoproduct. DNA Repair (Amst). 7, 119-127.

Seki M., Marini F., Wood R.D. (2003) POLQ (Pol θ), a DNA polymerase and DNA-dependent ATPase in human cells. Nucl Acids Res. 31, 6117-6126.

Selak M.A., Armour S.M., MacKenzie E.D., Boulahbel H., Watson D.G., Mansfield K.D., et al. (2005) Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-alpha prolyl hydroxylase. Cancer Cell. 7 (1), 77–85.

Shachar S., Ziv O., Avkin S., Adar S., Wittschieben J., Reissner T., Chaney S., Friedberg E.C., Wang Z., Carell T., Geacintov N. og Livneh Z. (2009) Two-polymerase mechanisms dictate error-free and error-prone translesion DNA synthesis in mammals, EMBO J. 28, 383–393.

Shcherbakova P.V., Pavlov Y.I., Chilkova O., et al. (2003) Unique error signature of the four-subunit yeast DNA polymerase ε. J Biol Chem. 278, 43770-43780.

118

Shimizu, K., Hashimoto, K., Kirchner, J.M., Nakai, W., Nishikawa,H., Resnick, M.A., and Sugino, A. (2002) Fidelity of DNA polymerase epsilon holoenzyme from budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 277, 37422–37429.

Silvian L.F., Toth E.A., Pham P., Goodman M.F. og Ellenberger T. (2001) Crystal structure of a DinB family error-prone DNA polymerase from Sulfolobus solfataricus. Nat. Struct. Biol. 8, 984–989.

Snyder R.D. (1988) Consequences of the depletion of cellular deoxynucleoside triphosphate pools on the excision-repair process in cultured human fibroblasts. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 200 (1-2), 193-199.

Stelter P. og Ulrich H.D. (2003) Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation. Nature, 425, 188-91.

Stone J.E., Kissling G.E., Lujan S.A., Rogozin I.B., Stith C.M., Burgers P.M.J. og Kunkel T.A. (2009) Low-fidelity DNA synthesis by the L979F mutator derivative of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase ζ, Nucleic Acids Research, 37 (11), 3774–3787.

Sutton M D. Coordinating DNA polymerase traffic during high and low fidelity synthesis (2010) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins & Proteomics 1804 (5), 1167-1179.

Szüts D., Marcus A.P., Himoto M., Iwai S. og Sale J. E. (2008) REV1 restrains DNA polymerase ζ to ensure frame fidelity during translesion synthesis of UV photoproducts in vivo, Nucl. Acids Res. 36 (21), 6767-6780.

Takata K., Shimizu T., Iwai S., Wood R.D. (2006) Human DNA polymerase ν (POLN) is a low fidelity enzyme capable of error-free bypass of 5S-thymine glycol. J Biol Chem. 281, 23445-23455.

Tissier A., Kannouche P., Reck M.-P., Lehmann A.R., Fuchs R.P.P., og Cordonnier A. (2004) Co-localization in replication foci and interaction of human Y-family members, DNA polymerase pol eta and REVl protein, DNA Repair Amst. 3, 1503–1514.

Tomlinson I.P., Alam N.A., Rowan A.J., Barclay E., Jaeger E.E., Kelsell D., et al. (2002) Germline mutations in FH predispose to dominantly inherited uterine fibroids, skin leiomyomata and papillary renal cell cancer. Nat Genet. 30 (4), 406–10.

Trincao J., Johnson R. E., Escalante C. R., Prakash S., Prakash L. og Aggarwal A.K. (2001) Structure of the catalytic core of S. cerevisiae DNA polymerase eta: implications for translesion DNA synthesis, Mol. Cell. 8, 417–426.

Valdez L.B., Zaobornyj T. og Boveris A. (2006) Mitochondrial metabolic states and membrane potential modulate mtNOS activity, Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (3), 166–172.

Wallace D.C. (1999) Mitochondrial Diseases in Man and Mouse. Science, 283, 1482-1488.

Wang Y., Woodgate R., McManus T. P., Mead S., McCormick J. J. og Maher V.M. (2007) Evidence that in xeroderma pigmentosum variant cells, which lack DNA polymerase eta,

119

DNA polymerase iota causes the very high frequency and unique spectrum of UV-induced mutations. Cancer Res. 67, 3018–3026.

Wang Z. (2001) DNA damage-induced mutagenesis: A novel target for cancer prevention. Molecular interventions. 1 (5), 269-281.

Washington M.T., Johnson R.E., Prakash S. og Prakash L. (1999) Fidelity and processivity of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase η, J. Biol. Chem. 274, 36835–36838.

Watanabe K., Tateishi S., Kawasuji M., Tsurimoto T., Inoue H., Yamaizumi M. (2004) Rad18 guides polymerase eta to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination, EMBO J. 28, 3886–3896.

Waters L.S. og Walker G.C. (2006) The critical mutagenic translesion DNA polymerase Rev1 is highly expressed during G2/M phase rather than S phase. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 8971–8976.

Waters L.S., Minesinger B.K., Wiltrout M.E., D’Souza S., Woodruff R.V. og Walker G.C. (2009) Eukaryotic Translesion Polymerases and Their Roles and Regulation in DNA Damage Tolerance, Microbiology and molecular biology reviews. 73 (1) 134–154.

Weinert T.A., Kiser G.L. og Hartwell L.H. (1994) Mitotic checkpoint genes in budding yeast and the dependence of mitosis on DNA replication and repair. Genes Dev. 8, 652–665.

West S. (2003) Molecular views of recombinational proteins and their control. Mol Cell Biol. 4, 1-11.

Wittschieben J., Shivji M.K., Lalani E., Jacobs M.A., Marini F., Gearhart P.J., Rosewell I., Stamp G. og Wood R.D. (2000) Disruption of the developmentally regulated Rev3l gene causes embryonic lethality, Curr. Biol. 10, 1217–1220.

Wittschieben J.P., Gollin S.M., Reshmi S.C., Wood R.D. (2006) Loss of DNA polymerase zeta causes chromosomal instability in mammalian cells. Cancer Res. 66, 134-142.

Woodgate R. (1999) A plethora of lesion-replicating DNA polymerases, Genes Dev. 13, 2191–2195.

Yuan F., Zhang Y., Rajpal D.K., Wu X., Guo D., Wang M., Taylor J.-S. og Wang Z. (2000) Specificity of DNA lesion bypass by the yeast DNA polymerase η, J. Biol. Chem. 275, 8233–8239.

Zhao X., Chabes A., Domkin V., Thelander L. og Rothstein R. (2001) The ribonucleotide reductase inhibitor Sml1 is a new target of the Mec1/Rad53 kinase cascade during growth and in response to DNA damage. EMBO J. 20, 3544–3553.

Zhong X., Garg P., Stith C.M., McElhinny S.A.N., Kissling G.E., Burgers P.M.J. og Kunkel T.A. (2006) The fidelity ofDNAsynthesis by yeastDNApolymerasezeta alone and with accessory proteins, Nucleic Acids Research. 34 (17), 4731–4742.

120

Zhang H. og Lawrence C.W. (2005) The error-free component of the RAD6/RAD18 DNA damage tolerance pathway of budding yeast employs sister-strand recombination. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 15954–15959.

Zhuang Z., Johnson R.E., Haracska L., Prakash L., Prakash S. og Stephen J.B (2008) Regulation of polymerase exchange between Pol η and Polδ by monoubiquitination of PCNA and the movement of DNA polymerase holoenzyme, PNAS. 105 (14), 5361–5366.

121

5.2 Journalistik

Albertella M.R., Lau A. og O’Connor M.J. (2005) The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer, DNA Repair. 4, 583–593.

Albæk E., Christiansen P.M. & Togeby L. (2002) Eksperter i medierne – dagspressens brug af forskere 1961 -2001, Magtudredningen, 87-987581-9-5.

Allan S. (2002) Media, Risk and Science. Open University Press, 0-33520-663-8.

Avisnet.dk: Baggrund http://www.avisnet.dk/AvisNET/application.do?command=getDocument&documentId=B826C5684BFCCC1DC12570A0004AAF11, redigeret af Louise Zabel, (ingen info om hvornår siden er oploadet eller opdateret).

Avisnet.dk: Feature http://www.avisnet.dk/AvisNET/application.do?command=getDocument&documentId=6D01F82B4041C2E4C12570A0004ABDC5, redigeret af Louise Zabel, (ingen info om hvornår siden er oploadet eller opdateret).

Avisnet.dk: Nyhedshistorie http://www.avisnet.dk/AvisNET/application.do?command=getDocument&documentId=C20695E6FB0DD8FDC12570A0004A7EDC, redigeret af Louise Zabel, (ingen info om hvornår siden er oploadet eller opdateret).

Barritt JA, Brenner CA, Malter HE og Cohen J (2001) Mitochondria in human offspring derived from ooplasmic transplantation, Human reproduction. 16 (3), 513-516.

Berlingske.dk: http://www.berlingske.dk/upload/webred/pdf/TPLBerlingskeT.pdf

Brier S. (1997) Videnskabens Ø, NSU Press, ISBN: 87-87564-76-9.

Brier S. (2002) Fra Fakta til Fikta, Akademisk Forlag, 87-500-3755-2.

Bucchi M. (1998) Science and the Media – alternative routes in scientific communication, Routhledge, New York, ISBN: 0-415-18952-7.

Bucchi M. og Trench B. red (2008): Handbook of public communication of science and technology, Routledge, New York, ISBN: 978-0-415-38617-3 (hbk).

Burkett D.W. (1973) Writing science news for the mass media, Gulf Publishing Company, ISBN: 0-87201-924-1.

Dean C. (2002): New Complications in Reporting on Science, Nieman Reports, Harvard University, http://www.nieman.harvard.edu/reportsitem.aspx?id=101291

122

Etisk Råd (2010) Rapport: Etiske aspekter ved nye typer af stamceller og befrugtningsteknikker, Udgivet af Det Etiske Råd 2010, Rosendahls - Schultz Grafisk, ISBN: 978-87-91112-23-2.

Eurobarometer (2005) Europeans, Science & Technology, Special EUROBAROMETER 224, produceret for Europakommisionen, http://ec.europa.eu/public_opinion/archives/ebs/ebs_224_report_en.pdf

Eurobarometer (2010) Science and Technology, Special Eurobarometer 340 / Wave 73.1 – TNS Opinion & Social, produceret for Europakommisionen http://ec.europa.eu/public_opinion/archives/ebs/ebs_340_en.pdf

Farago P. (1976) Science and the media, Oxford University Press, ISBN: 0-198-58324-9.

Finkel T. og Holbrook N.J. (2000) Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing, Nature, 408 (6809), 239-47.

Frank L. (2005). Substans, tak, Weekendavisen, 4. sektion, 18. marts 2005.

Frank L. (2004) Det nye liv – opgør med usund skepsis og politisk uansvarlighed, Gyldendal, ISBN: 87-02-02381-4.

Friedman S.M, Dunwoody S. og Rogers C.L red. (1999) Communicating uncertainty – Media Coverage of New and Controversial Science, Lawrence Erlbaum Associates, ISBN: 0-8058-2728-5.

Gammeltoft S. (2004) Videnskab og medier – et ulykkeligt ægteskab, BioZoom, Nr 2.

Gaskell G. og Bauer M. W. red. (2001) Biotechnology 1996-2000 – the years of controversy, Science Museum, ISBN: 1-900747-43.

Hawes S.M., Sapienza C. og Latham K.E. (2002) Ooplasmic donation in humans, The potential for epigenic modifications, Hum. Reprod. 17 (4): 850-852.

Hornmoen H. (1999) Vitenskapens vakthunder: innføring i forskningsjournalistikk, Tano Aschehoug, ISBN: 82-518-3959-0.

Hornmoen H., Meyer G. og Sylwan P. (2006) Fornuften har flere stemmer – offentligheden, forskeren og journalisten, Cappelen Akademisk Forlag, ISBN-10: 82-02-24400-5.

Ing.dk (2010): http://ing.dk/artikel/112090-forskere-uenige-om-boern-med-to-gen-moedre, 19. september 2010.

123

Jacobsen P.F. (2005) Artiklen på tryk: Fortæl historien lag for lag, UPDATE, http://www.update.dk/cfje/vidbase.nsf/(VBFriTekstMultiDB)/E968549948FF227FC125701500401460?OpenDocument

Jensen J.D. (2008): Scientific Uncertainty in News Coverage of Cancer Research: Effects of Hedging on Scientists’ and Journalists’ Credibility. Human Communication Research, ISSN: 0360-3989, http://www.wikiway.net/images/9/99/Jensen2008hcr.pdf

Jensen L.B. (2001): Den sproglige dåseåbner – om at formidle faglig viden forståeligt, Roskilde Universitetsforlag, ISBN-13: 978-87-7867-110-3

Jppol: http://www.jppol.dk/da/artikler/dagblade/politiken.aspx, - ingen info om hvornår siden er oploadet eller opdateret.

Kjaer C. (2007) Ulidelig læsning, Aktuel Naturvidenskab, nr. 5.

Kjærgaard R.S. red. (2006) Elfenbenstårnet - Universiteter mellem forskning og formidling, Aarhus universitetsforlag, ISBN: 87-7934-236-1.

Kramhøft P. (2000) Journalistik med omtanke: arbejdsmetoder i udredende og analytisk journalistik, Forlaget Ajour, Århus, ISBN-10: 87-89235-23-1.

Krause-Kjær N. (2003): Den politiske landsby: Om Christiansborg, journalisterne og politikerne, Forlaget Ajour, ISBN-10: 8791620953.

Lane M.A., Mattison J, Ingram D.K., og Roth G.S. (2002) Caloric Restriction and Aging in Primates: Relevance to Humans and Possible CR Mimetics, Microsc Res Tech. 59 (4), 335-8.

Lund A.B. (2002): Den redigerende magt – nyhedsinstitutionens politiske indflydelse, Aahus Universitetsforlag, ISBN-10: 8779348203.

Masoro E.J. (2000) Caloric restriction and aging: an update, Experimental Gerontology 35: 299–305.

Meilby M. (2006) Journalistikkens grundtrin - Fra ide til artikel, 1. udgave, 7. oplag, Forlaget Ajour, ISBN: 87-89235-22-3.

Meyer G. (2000) De andres viden – Frygt og underdanighed i vidensamfundet, Høst og Søn, ISBN: 87-14-29585-7.

Meyer G. (2004) Når journalistikken går i opløsning, Biozoom 2004/nr 2 Videnskabsformidling, http://www.biokemi.org/biozoom/issues/502/articles/2103

Meyer G. (2005a) Offentlig Fornuft? Videnskab, journalistik og samfundsmæssig praksis, Syddansk Universitetsforlag, 87-7838-968-2.

124

Meyer G. (2005b) Hvorfor skulle der ikke kunne være en offentlig fornuft? Syddansk Universitetsforlag, 87-7674-010-2.

MVTU (2004): Rapporten ”Forsk og fortæl”, Ministeriet for Videnskab, Teknologi og Udvikling: Tænketank vedrørende forståelse for forskning, http://www.vtu.dk/fsk/div/forstaelseforf/forskogfortael>

Nass M.M.K. og Nass S. (1963) Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. I. Fixation and electron staining reactions, J. Cell Biol. 19, 593–611.

Nelkin D. (1995) Selling Science – how the press covers science and technology, Freeman and Company, New York, ISBN: 0-7167-2595-9.

Nielsen K.H. (2005) “Mellem forståelse og værdsættelse. Aktuel videnskabskommunikation i Danmark” Journal of Science Communication 4 (4), ISSN 1824 – 2049, http://jcom.sissa.it/archive/04/04/A040402/jcom0404(2005)A02-da.pdf

Paludan K. (2005) At fortælle om videnskab - En undersøgelse af den fortællende journalistiks fordele og ulemper i to populærvidenskabelige artikler, Speciale fra Det Humanistiske Fakultet Københavns Universitet http://www.update.dk/cfje/Kildebase.nsf/ID/KB01081927/$file/At_fortaelle_om_videnskab.pdf?OpenElement

Pellechia M.G. (1997) Trends in science coverage: a content analysis of three US newspapers, Public Understanding of Science. vol. 6 no. 1, 49-68.

Phelan J.P. og Rose M.R. (2006) Caloric restriction increases longevity substantially only when the reaction norm is steep, Biogerontology 7: 161–164,

RUC: http://magenta.ruc.dk/jour/uddannelsen/specialeskrivning/specialetyper/

Schultz I. (2005) Bag om Nyhedskriterierne – en etnografisk feltanalyse af nyhedsværdier i journalistisk praksis, Skriftserie for Journalistisk på RUC Nr.2/2006, ISBN: 87-7349-671-5.

Schultz I. (2006) Bag nyhederne – værdier, idealer og praksis, Forlaget Samfundslitteratur, København, ISBN-10: 87-593-1241-6.

Siune K. og Vinther T. (1998), Aviser om forskning: Indholdsanalyse af avisernes omtale af forskning og udviklingsarbejde, Rapport 1998/3 udg., Analyseinstitut for Forskning, Århus, ISBN: 87-90698-02-9.

Strand K. (2004): Interview for journalister - spørgeteknik, skarpvinkling og struktur, Politisk Revu, ISBN 87-7953-608-5.

125

Universitetsloven (2003) nr. 403 af 28. maj 2003 om universiteter m.fl. http://www.au.dk/da/regler/2003/lov403

Voss, M. (2003): Why reporters and Editors Get Health Coverage Wrong, Nieman Reports, Vol. 57, No. 1, http://www.nieman.harvard.edu/reportsitem.aspx?id=101180

Wilkins L. og Patterson P. (1991) red., Risky Business: Communicating Issues Of Science, Risk, And Public Policy, Greenwood Press, ISBN: 0313266018.

126

Bilag

Bilag 1

Forsøg 1: ANOVA-tabel

Source Sum-of-Squares df Mean-Square F-ratio P

TYPE$

2957.219 1

2957.219

36.142

0.000

LEVEL$

26776.088 4

6694.022

81.812

0.000

LEVEL$*TYPE

$

1931.271 4

482.818

5.901

0.001

Error

3272.883 40

81.822

Delforsøg 1: Relevante P-værdier fra Tukey’s test P-værdier ved alle MMS-koncentrationer

WT 0% WT 0.025% WT 0.05% WT 0.1% WT 0.2%

Rho0 0% 0.393 Rho0 0.025% 0.014 Rho0 0.05% 0.000 Rho0 0.1% 0.002 Rho0 0.2% 0.912 Forsøg 1: Tukey’s matrix ROW LEVEL$ TYPE$

1 0.000 Wto

2 0.000 rho

3 0.0250 Wto

4 0.0250 rho

5 0.050 Wto

6 0.050 rho

7 0.100 Wto

8 0.100 rho

9 0.200 Wto

10 0.200 rho

Forsøg 2: ANOVA-tabel Analysis of Variance

Source Sum-of-Squares

TYPE$22.451

LEVEL$91.155

LEVEL$*TYPE$2.198

Error15.849

Delforsøg 2: Relevante P-værdier fra Tukey’s test P-værdier ved MMS 0.025%

WT

WT 1.000 Rho0 1.000 Rev3∆ 0.971 Rev3∆Rho0 0.463

df Mean-Square F-ratio

3

7.484 22.665

3

30.385 92.025

9

0.244 0.740

48

0.330

værdier fra Tukey’s test

Rho0 Rev3∆

1.000 0.997 1.000 0.693 1.000

127

ratio P

22.665

0.000

92.025

0.000

0.740

0.671

128

P-værdier ved MMS 0.05%

WT Rho0 Rev3∆

WT 1.000 Rho0 1.000 1.000 Rev3∆ 0.024 0.192 1.000 Rev3∆Rho0 0.009 0.091 1.000 P-værdier ved MMS 0.1%

WT Rho0 Rev3∆

WT 1.000 Rho0 0.977 1.000 Rev3∆ 0.143 0.943 1.000 Rev3∆Rho0 0.003 0.189 P-værdier ved MMS 0.2%

WT Rho0 Rev3∆

WT 1.000 Rho0 0.689 1.000 Rev3∆ 0.412 1.000 1.000 Rev3∆Rho0 0.022 0.935 0.994

Delforsøg 2: Tukey’s matrix ROW LEVEL$ TYPE$

1 0.025 rev3D

2 0.025 rev3Drho

3 0.025 rho

4 0.025 wt

5 0.05 rev3D

6 0.05 rev3Drho

7 0.05 rho

8 0.05 wt

9 0.1 rev3D

10 0.1 rev3Drho

11 0.1 rho

12 0.1 wt

13 0.2 rev3D

14 0.2 rev3Drho

15 0.2 rho

16 0.2 wt

Using least squares means.

Post Hoc test of SUR

Matrix of pairwise comparison probabilities:

Matrix of pairwise comparison probabilities:

129

130

Bilag 2

Alle overlevelsesdata. Data fra delforsøg 1

WT0 90,33333

WT0 66,33333

WT0 83,66667

WT0 79,66667

WT0 65,66667

WT0 71,66667

WT0.025 67,33333

WT0.025 65,66667

WT0.025 67,33333

WT0.025 75,33333

WT0.025 64,66667

WT0.025 71,33333

WT0.05 46,67

WT0.05 46,67

WT0.05 49,33

WT0.05 48,00

WT0.05 61,67

WT0.05 58,67

WT0.1 40,00

WT0.1 37,00

WT0.1 41,67

WT0.1 40,33

WT0.1 45,00

WT0.1 41,33

WT0.2 14,33

WT0.2 16,00

WT0.2 16,00

rho00 92,33

rho00 105,33

rho00 71,00

rho00 94,50

rho00 81,67

rho00 84,33

rho00.025 123,00

rho00.025 85,00

rho00.025 86,67

rho00.025 73,33

131

rho00.025 79,00

rho00.05 89,00

rho00.05 79,00

rho00.05 78,67

rho00.05 78,00

rho00.1 63,33

rho00.1 66,33

rho00.1 62,33

rho00.1 76,67

rho00.2 6,00

rho00.2 5,67

rho00.2 5,67

rho00.2 6,67

Data fra delforsøg 2

% overlevelse ift. ubehandlet

ln+1

WT0.025 65,4 4,196

WT0.025 66,3 4,209

WT0.025 67,5 4,227

WT0.025 79,6 4,389

WT0.05 29,1 3,405

WT0.05 58,4 4,084

WT0.05 42,5 3,773

WT0.05 61,7 4,138

WT0.1 5,5 1,872

WT0.1 18,0 2,944

WT0.1 10,0 2,398

WT0.1 18,9 2,991

WT0.2 1,6 0,956

WT0.2 5,6 1,887

WT0.2 5,0 1,792

WT0.2 4,6 1,723

rho00.025 80,6 4,402

rho00.025 48,9 3,910

rho00.025 45,0 3,829

rho00.025 75,0 4,331

rho00.05 39,8 3,709

rho00.05 21,7 3,122

rho00.05 22,0 3,135

rho00.05 56,7 4,055

132

rho00.1 0,0 0,000

rho00.1 8,7 2,272

rho00.1 12,0 2,565

rho00.1 17,7 2,929

rho00.2 0,0 0,000

rho00.2 0,0 0,000

rho00.2 9,0 2,303

rho00.2 0,6 0,470

rev3D0.025 29,6 3,421

rev3D0.025 34,8 3,578

rev3D0.025 52,7 3,983

rev3D0.025 33,2 3,532

rev3D0.05 3,7 1,548

rev3D0.05 7,1 2,092

rev3D0.05 15,4 2,797

rev3D0.05 13,1 2,646

rev3D0.1 1,5 0,916

rev3D0.1 2,7 1,308

rev3D0.1 3,3 1,459

rev3D0.1 2,9 1,361

rev3D0.2 0,0 0,000

rev3D0.2 1,8 1,030

rev3D0.2 1,1 0,742

rev3D0.2 0,4 0,336

rev3Drho00.025 20,0 3,045

rev3Drho00.025 13,3 2,660

rev3Drho00.025 28,4 3,381

rev3Drho00.025 44,2 3,811

rev3Drho00.05 8,0 2,197

rev3Drho00.05 2,7 1,308

rev3Drho00.05 8,8 2,282

rev3Drho00.05 14,7 2,754

rev3Drho00.1 0,1 0,095

rev3Drho00.1 1,3 0,833

rev3Drho00.1 1,0 0,693

rev3Drho00.1 2,3 1,194

rev3Drho00.2 0,0 0,000

rev3Drho00.2 0,0 0,000

rev3Drho00.2 0,0 0,000

rev3Drho00.2 0,0 0,000

133

Bilag 3

Komplette datasæt for CAN1-mutationsspektrum-forsøgene. Mut.

Event

WT

0 (N=5)

WT

0.025

(N=8)

WT

0.05

(N=6)

WT 0.1

(N=5)

WT 0.2

(N=8)

rho0 0

(N=8)

rho0

0.025

(N=8)

rho0

0.05

(N=8)

rho0

0.1

(N=8)

rho0

0.2

(N=2)

A:T til G:C

- - - - 12,5%

(1/8)

- - 12,5%

(1/8)

12,5%

(1/8)

-

G:C til A:T

20%

(1/5)

37,5%

(3/8)

33,3%

(2/6)

- 12,5%

(1/8)

12,5%

(1/8)

- 37,5%

(3/8)

12,5%

(1/8)

50%

(1/2)

A:T til T:A

- - 33,3%

(2/6)

20%

(1/5)

- - - - - -

A:T til C:G

- - - 12,5%

(1/8)

12,5%

(1/8)

- - - -

G:C til T:A

40%

(2/5)

12,5%

(1/8)

16,7%

(1/6)

60%

(3/5)

37,5%

(3/8)

25%

(2/8)

12,5%

(1/8)

25%

(2/8)

50%

(4/8)

-

G:C til C:G

- 12,5%

(1/8)

- - - 12,5%

(1/8)

25%

(2/8)

- 12,5%

(1/8)

50%

(1/2)

Tandem - - - - - - - - - -

Indels - 12,5%

(1/8)

- 20%

(1/5)

12,5%

(1/8)

12,5%

(1/8)

12,5%

(1/8)

- 25%

(2/8)

-

komplekse

- 12,5%

(1/8)

16,7%

(1/6)

- 12,5%

(1/8)

- - - - -

Sum mut. Total

60%

(3/5)

87,5%

(7/8)

100%

(6/6)

100%

(5/5)

100%

(8/8)

75%

(6/8)

50%

(4/8)

75%

(6/8)

112,5%

(9/8)

100%

(2/2)

Andel pol zeta

0%

(0/5)

37,5%

(3/8)

33,3%

(2/6)

80%

(4/5)

62,5%

(5/8)

25%

(2/8)

25%

(2/8)

25%

(2/8)

75%

(6/8)

0%

(0/2)

Andel af pol zeta ud af 100%

0%

(0/3)

42,9%

(3/7)

33,3%

(2/6)

80%

(4/5)

62,5%

(5/8)

33,3%

(2/6)

50%

(2/4)

33,3%

(2/6)

75%

(6/9)

0%

(0/2)

134

Mut. Event Rev3- 0 (N=6)

Rev3- 0.025 (N=8)

Rev3- 0.05 (N=7)

Rev3-

0.1 (N=0)

Rev3- 0.2 (N=5)

Rev3- rho0 0 (N=3)

Rev3-

rho0 0.025 (N=7)

Rev3-

rho0 0.05 (N=6)

Rev3-

rho0 0.1 (N=8)

Rev3-

rho0 0.2 (N=2)

A:T til

G:C

- - - ingen

data

- - - - - -

G:C til

A:T

16,7%

(1/6)

25%

(2/8)

14,3%

(1/7)

ingen

data

- 33,3%

(1/3)

- 16,7%

(1/6)

- -

A:T til

T:A

- 25%

(2/8)

14,3%

(1/7)

ingen

data

80%

(4/5)

- 14,3%

(1/7)

16,7%

(1/6)

12,5%

(1/8)

50%

(1/2)

A:T til

C:G

- 12,5%

(1/8)

- ingen

data

- - - - - -

G:C til

T:A

- 12,5%

(1/8)

28,6%

(2/7)

ingen

data

20%

(1/5)

- 14,3%

(1/7)

- 25%

(2/8)

50%

(1/2)

G:C til

C:G

33,3%

(2/6)

- - ingen

data

- 33,3%

(1/3)

- 16,7%

(1/6)

- -

Tandem - - 14,3%

(1/7)

ingen

data

- - - - - -

Indels - 25%

(2/8)

14,3%

(1/7)

ingen

data

- 33,3%

(1/3)

42,9%

(3/7)

33,3%

(2/6)

25%

(2/8)

-

kompleks

e

- 12,5%

(1/8)

- ingen

data

- - - - 12,5%

(1/8)

-

Sum mut.

Total

50%

(3/6)

112,5%

(9/8)

85,7%

(6/7)

ingen

data

100%

(5/5)

100%

(3/3)

71,4%

(5/7)

83,3%

(5/6)

75%

(6/8)

100%

(2/2)

Andel pol

zeta

33,3%

(2/6)

50%

(4/8)

57,1%

(4/7)

ingen

data

20%

(1/5)

66,6%

(2/3)

57,1%

(4/7)

33,3%

(2/6)

62,5%

(5/8)

0%

(0/2)

Andel af

pol zeta

ud af

100%

66,6%

(2/3)

44,4%

(4/9)

66,6%

(4/6)

ingen

data

20%

(1/5)

66,6%

(2/3)

80%

(4/5)

40%

(2/5)

83,3%

(5/6)

0%

(0/2)

135

Bilag 4

136

137

138

139

140

141

142

143