Vergleich der Auswirkung einer oralen Therapie mit ... · Aus dem Pathologisch-Anatomischen...
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Aus dem Pathologisch-Anatomischen Institut der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann
Vergleich der Auswirkung einer oralen Therapie mit
Metformin und EMD 387008 auf renale Schäden im
Tiermodell der diabetogenen ZDF-Ratte
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Mareile Arntrudis Bezold
aus
Bayreuth
2009
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Kerstin Amann Korreferent: Prof. Dr. med. Karl Hilgers Tag der mündlichen Prüfung: 20. Januar 2010
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ............................................................................................................... 1
Zusammenfassung auf Englisch......................................................................................... 3
1 Einleitung .............................................................................................................. 5
1.1 Diabetes mellitus .................................................................................................... 5 1.2 Komplikationen des Diabetes mellitus................................................................... 7 1.3 Diabetische Nephropathie....................................................................................... 8
2 Zielsetzung der Arbeit........................................................................................ 13
3 Material und Methodik...................................................................................... 17
3.1 Versuchstiere ........................................................................................................ 17 3.2 Studiendesign ....................................................................................................... 18 3.3 Versuchsbedingungen........................................................................................... 19 3.4 Behandlung der Tiere ........................................................................................... 19 3.4.1 Medikamentenbeschreibung................................................................................. 19 3.4.2 Verabreichung der Medikamente ......................................................................... 23 3.5 Laboranalyse......................................................................................................... 23 3.5.1 Urinanalyse........................................................................................................... 23 3.5.2 Serum- und Plasmaanalyse................................................................................... 23 3.6 Fixation und Gewebeaufbereitung ....................................................................... 24 3.6.1 Perfusionsfixation................................................................................................. 24 3.6.2 Histologische Gewebeaufbereitung...................................................................... 24 3.7 Auswertung........................................................................................................... 25 3.7.1 Semiquantitative Untersuchungen der Glomerula hinsichtlich ihres
Schädigungsausmaßes .......................................................................................... 25 3.7.2 Morphometrische und stereologische Untersuchung der Glomerula ................... 28 3.8 Statistik ................................................................................................................. 34
4 Ergebnisse ........................................................................................................... 37
4.1 Tierparameter........................................................................................................ 38 4.1.1 Körpergewicht ...................................................................................................... 38 4.1.2 Körpergröße.......................................................................................................... 39 4.1.3 Nierengewicht....................................................................................................... 40 4.2 Futter- und Wasseraufnahme............................................................................... 40 4.3 Urinparameter....................................................................................................... 41 4.3.1 Diurese.................................................................................................................. 42 4.3.2 Albumin-Exkretion............................................................................................... 42 4.3.3 Kreatinin ............................................................................................................... 43 4.3.4 Kreatinin-Clearance.............................................................................................. 44 4.3.5 Harnstoff-Exkretion.............................................................................................. 44 4.4 Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels ........................................... 44 4.4.1 Parameter des Glucosestoffwechsels.................................................................... 46 4.4.2 Elektrolyte ............................................................................................................ 50 4.4.3 Parameter des Fettstoffwechsels........................................................................... 52 4.5 Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren ............................................. 53 4.5.1 Glomeruloskleroseindex....................................................................................... 54 4.5.2 Mesangiolyseindex ............................................................................................... 54 4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex................................................................ 55 4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex .............................................................................. 56
4.5.5 Umfang des Kapillarkonvoluts............................................................................. 56 4.5.6 Durchmesser, Fläche und Volumen des Kapillarkonvoluts ................................. 57 4.6 Semidünnschnitte ................................................................................................. 59 4.6.1 Werte des Kapillarkonvoluts und der Kapillaren ................................................. 61 4.6.2 Volumendichte der einzelnen Zellarten................................................................ 62 4.6.3 Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart................................................................. 63 4.6.4 Durchschnittsvolumen der jeweiligen Zellart....................................................... 63 4.6.5 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Fläche ............................................................. 63 4.6.6 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Volumen......................................................... 64 4.6.7 Gesamtzahl der jeweiligen Zellart pro Glomerulum ............................................ 65 4.7 Photodokumentation der Befunde ........................................................................ 66 4.7.1 Glomerulosklerose................................................................................................ 66 4.7.2 Tubulointerstitielle Schädigung............................................................................ 69 4.7.3 Vaskuläre Schädigung .......................................................................................... 73
5 Diskussion............................................................................................................ 77
5.1 Pathogenetische Grundlagen ................................................................................ 77 5.1.1 Auswirkung einer Hyperglykämie auf die Niere.................................................. 77 5.1.2 Albuminurie und Nephropathie............................................................................ 80 5.1.3 Auswirkungen einer Dyslipidämie auf die Niere................................................. 81 5.2 Diskussion der eigenen Ergebnisse ...................................................................... 82 5.2.1 Blut- und Urinparameter....................................................................................... 82 5.2.2 Wirkung von Metformin und EMD auf Gefäße und Endothel............................. 85 5.2.3 Auswirkungen von Metformin und EMD auf die Nierenfunktion und
Morphologie ......................................................................................................... 87 5.2.4 Schlussfolgerung .................................................................................................. 91
Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 93
Abkürzungsverzeichnis..................................................................................................... 99
Danksagung...................................................................................................................... 100
Lebenslauf ........................................................................................................................ 101
1 Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele Die diabetische Nephropathie stellt in Deutschland die häufigste Ursache einer
Dialysepflicht dar [41]. Sie manifestiert sich als zunehmende glomeruläre Okklusion
und tubulointerstitielle Fibrose und führt zu Proteinurie, zur Entwicklung oder
Verstärkung von Hypertonie und Dyslipoproteinämie sowie zu einer kontinuierlichen
Abnahme der Nierenfunktion [32].
Mehrere Studien belegen, dass normoglykämische Blutzuckerwerte das Fortschreiten
einer Nierenschädigung verzögern können [10, 12, 19, 26]. Das Biguanid Metformin ist
heute das am weitesten verbreitete blutzuckersenkende Medikament in der Behandlung
des Typ-2-Diabetes [10]. Neben seiner antihyperglykämischen Wirkung führt es zu
einer Verminderung der mikro- und makrovaskulären Schäden, die für die Pathogenese
der diabetischen Nephropathie von entscheidender Bedeutung sind. Ein ähnlich
positives Wirkspektrum wird von dem von der Firma Merck® entwickelten oralen
Antidiabetikum EMD 387008 erwartet, wobei es gegenüber dem Metformin jedoch eine
bessere metabolische Verträglichkeit aufweisen soll.
Im Rahmen dieser Arbeit verglichen wir daher im diabetischen Tiermodell die
Auswirkungen einer Therapie mit Metformin bzw. EMD 387008 auf die Entwicklung
und Progression einer renalen Schädigung.
Methoden Für die Versuche wurde das Tiermodell der „Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte)
verwendet. Die männlichen Phänotypen des Stamms „ZDF-fatty“ entwickeln einen
Typ-2-Diabetes und im Verlauf eine diabetische Nephropathie [62]. Als Kontrolle
dienten Tiere des Wildtyps „ZDF-lean“, welche keinen Diabetes entwickeln.
Nach 10 Versuchswochen wurden Tiere der Gruppen ZDF-fatty (n=10) und ZDF-lean
(n=9) untersucht, um Ausgangswerte vor der nachfolgenden Behandlung zu erhalten.
Die verbleibenden ZDF-fatty-Ratten wurden randomisiert 3 Gruppen zugeordnet, die
nun für den Zeitraum von 16 Wochen entweder mit Metformin (150 mg/kg/24h; n=10;
ZDF-F-Met), EMD 387008 (200 mg/kg/24h; n=9; ZDF-F-EMD) oder einem Placebo
(n=8; ZDF-F-P) behandelt wurden. Die ZDF-lean-Tiere erhielten ebenfalls ein
Placebopräparat (n=8; ZDF-L-P).
2 Zusammenfassung
Am Ende des Versuchs wurden die Nierenfunktion und physiologische Parameter der
Tiere untersucht. Der Grad der renalen Schädigung wurde histologisch an Paraffin- und
Semidünnschnitten bestimmt und zwischen den einzelnen Gruppen verglichen.
Ergebnisse und Beobachtungen Die Wirkung von EMD war mit der des Metformins in vielen untersuchten Parametern
vergleichbar. So unterschieden sich die Glucose- und Insulinserumspiegel beider
Gruppen nicht signifikant voneinander, wenngleich die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD
geringfügig niedrigere Werte aufwiesen als die Tiere der Gruppe ZDF-F-Met. In Bezug
auf die Nierenfunktion ließ sich unter Therapie mit EMD keine Verbesserung erreichen:
die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD wiesen, wenn auch nicht signifikant, eine niedrigere
Kreatinin-Clearance und eine stärkere Albuminurie auf als die Tiere der Gruppe ZDF-F-
Met. Ein erhöhtes glomeruläres Volumen und eine verstärkte Diurese der mit EMD
behandelten Tiere könnten Hinweise für eine diabetestypische glomeruläre
Hypertrophie mit konsekutiver Hyperfiltration sein.
Morphologische Veränderungen wie Glomerulosklerose sowie vaskuläre und tubulo-
interstitielle Schädigung wurden durch EMD dagegen effektiver bekämpft als durch
Metformin. Die Gruppe ZDF-F-EMD zeigte signifikant niedrigere Werte des
vaskulären Schädigungsindex als die Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-Met. Die
signifikante Erhöhung der Volumendichte von Endothelzellen und der Endothelzellzahl
pro Fläche zeigt, dass EMD offenbar einer Hyperglykämie-induzierten Apoptose von
Endothelzellen entgegenwirken konnte. Auch die Glomerulosklerose und die Störung
der tubulointerstitiellen Architektur konnten durch EMD wirksamer bekämpft werden
als durch Metformin.
Praktische Schlussfolgerungen Die vorliegenden Ergebnisse der morphologischen und biochemischen Untersuchungen
lassen noch kein abschließendes Urteil über die Wirkung des EMD im Vergleich zu
Metformin zu. Wenngleich sich das neu entwickelte Medikament hinsichtlich
Parametern der Nierenfunktion sowie hämatologischer Parameter des
Glucosestoffwechsels nicht signifikant positiv vom Metformin abhob, zeigte EMD
jedoch vor allem auf morphologische Veränderungen wie vaskuläre Schäden,
tubulointerstitielle Fibrose und Glomerulosklerose vielversprechend positive
Wirkungen. Eine genauere Untersuchung des neu entwickelten Medikaments erscheint
daher lohnenswert.
3 Zusammenfassung auf Englisch
Zusammenfassung auf Englisch
Background and Aims Diabetic nephropathy represents the most common cause for dialysis in Germany [41].
It manifests itself as an increasing glomerular occlusion and tubulointerstitial fibrosis
and leads to proteinuria, to the development or aggravation of hypertension, and to
dyslipoproteinemia, as well as to a continuous decrease of the renal function [32].
Different studies prove that normoglycemic blood glucose levels can delay renal
damage [10, 12, 19, 26]. Today, the biguanide Metformin is the most commonly used
antidiabetic agent for decreasing blood glucose concentration in type 2 diabetes patients
[10]. Besides its antihyperglycemic effect, it results in a reduction of micro- and
macrovascular damage, which are of crucial importance for the pathogenesis of diabetic
nephropathy. The oral antihyperglycemic agent EMD 387008, developed by the
pharmaceutical company Merck®, is expected to show a similarly positive effect.
However, a better metabolic tolerance is anticipated.
In this study, we used an animal model to compare the effects of a Metformin therapy to
the effects of EMD 387008 with regard to the development and progression of renal
damage using morphological and functional parameters.
Methods The „Zucker diabetic fatty rat“ (ZDF rat) animal model was employed in this study. The
male phenotypes of the ZDF-fatty stock develop type 2 diabetes and diabetic
nephropathy [62]. Animals of the ZDF-lean wild type, which do not develop diabetes,
but hypertension, were used as a control group. After 10 weeks, animals assigned to the
ZDF-fatty (n=10) and ZDF-lean (n=9) groups were examined to obtain baseline values
for the subsequent therapy. The remaining ZDF-fatty rats were randomly assigned to 3
groups that were from now on and for a duration of 16 weeks treated with Metformin
(150 mg/kg/24h; n=10; ZDF-F-Met), EMD 387008 (200 mg/kg/24h; n=9; ZDF-F-
EMD), or placebo (n=8; ZDF-F-P) respectively. The ZDF-lean animals were also given
placebo (n=8; ZDF-L-P). At the end of the study renal function and physiological
parameters of the animals were examined. The degree of renal damage was determined
histologically using paraffin and semi-thin sections and compared among the different
groups.
4 Zusammenfassung auf Englisch
Results and Observations The effects of EMD were comparable to the effects of Metformin with regard to many
of the examined parameters. Glucose and insulin serum levels of both groups were not
significantly different. However, the ZDF-F-EMD animals showed slightly lower levels
than the ZDF-F-Met animals. With regard to the renal parameters an EMD therapy did
not show improvements: the ZDF-F-EMD group had, although not significantly, a
lower creatinine clearance and a stronger albuminuria than the ZDF-F-Met group. An
increased glomerular volume and an enhanced diuresis of the animals treated with EMD
can indicate a glomerular hypertrophy with consecutive glomerular hyperfiltration that
is characteristical for diabetes.
Morphological alterations, such as glomerular sclerosis, vascular damage, and
tubulointerstitial fibrosis, were reduced more effectively by EMD than by Metformin.
The ZDF-F-EMD group showed significantly lower levels of the vascular damage index
than the ZDF-F-P and ZDF-F-Met groups. The significant enlargement of the volume
density of endothelial cells and the number of endothelial cells per area shows that
EMD can antagonize a hyperglycemia-induced apoptosis of endothelial cells. Moreover,
the glomerular sclerosis and the changes of the tubulointerstitial architecture were
fought more successfully by EMD than by Metformin.
Conclusion The presented results of the morphological and biochemical examinations do not allow
for a final judgement about the effect of EMD compared to Metformin. On the one
hand, the new antidiabetic agent does not significantly improve the effect of Metformin
with regard to renal function parameters as well as hematological parameters of the
glucose metabolism. On the other hand, EMD yielded promising results especially for
morphological alterations such as vascular damage, tubulointerstitial fibrosis, and
glomerular sclerosis. Therefore, a more detailed examination of the new antidiabetic
agent seems worthwile.
5 Einleitung
1 Einleitung
Dieses Kapitel stellt Grundlagen der Epidemiologie und Pathophysiologie des Diabetes
mellitus und seiner Komplikationen vor. Besonders berücksichtigt wird hierbei die
diabetische Nephropathie als Komorbidität, der durch ihre hohe Prävalenz ein
bedeutsamer Stellenwert bei der Behandlung des Diabetes und der Diabetes-assoziierten
Erkrankungen beizumessen ist. Ein entscheidender Beurteilungsparameter bei der
Erforschung neuer Arzneimittel muss daher auch eine wirksame Verhinderung von
Auftreten und Progression renaler Schäden sein.
1.1 Diabetes mellitus
Der Begriff „Diabetes mellitus“ leitet sich vom altgriechischen „διαβαίνειν“ (=
hindurchgehen, hindurchfließen) und dem lateinischen „mellitus“ (= honigsüß) ab und
bedeutet so viel wie honigsüßer Durchfluss. Antike Ärzte prägten die Bezeichnung für
dieses Krankheitsbild, das sich durch einen in Folge der Glukosurie süßlich
schmeckenden Urin auszeichnete. Heute wissen wir, dass es sich beim Diabetes mellitus
um eine chronische Regulationsstörung des Stoffwechsels handelt, die auf einem
absoluten oder relativen Insulinmangel beruht und durch den Leitbefund der
chronischen Hyperglykämie charakterisiert ist.
Die moderne Lebensweise in den Industrieländern, die bei geringerer körperlicher
Aktivität in Verbindung mit einer unausgewogenen Ernährungsweise zu einem
erheblichen Anstieg an Übergewichtigkeit in der Allgemeinbevölkerung führte, ließ den
Diabetes mehr und mehr zur Volkskrankheit werden. Weltweit ist von einer Zunahme
der Diabetesprävalenz auszugehen (vgl. Abbildung 1): Daten der WHO zeigen, dass die
globale Krankheitsprävalenz im Jahr 2000 bei 2,8 % lag und 2030 schätzungsweise
4,4 % betragen wird. Das bedeutet, dass sich die Patientenzahlen von 171 Mio. im Jahr
2000 auf 366 Mio. im Jahr 2030 erhöhen würden [81].
6 Einleitung
Abbildung 1: Geschätzte Zahl erwachsener Diabetespatienten, unterschieden nach Alter, Jahr und Herkunft (aus [81])
Den größten Anteil der Diabetespatienten machen mit 90-95 % die Typ 2-Diabetiker
aus [82]. Der Diabetes mellitus Typ 2 lässt sich auf zwei pathogenetische Mechanismen
zurückführen: zum einen ist die frühe postprandiale Insulinsekretion gestört, was zu
einer postprandialen Hyperglykämie führt [33, 46]. Zum anderen weisen die Patienten
eine herabgesetzte Insulinwirkung (Insulinresistenz) auf, die auf einen
Insulinrezeptordefekt mit konsekutiver Herabregulierung oder auf einen Post-Rezeptor-
Defekt mit gestörter Signaltransduktion (z.B. Tyrosinkinasen) zurückgeführt werden
kann. Auch Veränderungen in Stoffwechselvorgängen wie dem insulinsensitiven
Glucose-Transport oder der Glycogensynthese können für die Insulinresistenz
verantwortlich sein [46, 65]. Am Anfang der Erkrankung steht meist die Insulinresistenz
der Zellen von Skelettmuskel, Fettgewebe und Leber, so dass erhöhte Glucosespiegel
für die Glucoseverwertung benötigt werden. Die daraus resultierende Hyperinsulinämie
7 Einleitung
führt zu einer Herabregulation der Insulinrezeptoren und damit der Insulinwirkung, was
kompensatorisch wiederum eine erhöhte Insulinausschüttung nach sich zieht. Dieser
Circulus vitiosus führt über die permanent vorhandene Hyperinsulinämie auch zu einem
verstärkten Hungergefühl bei den Patienten und begünstigt das Auftreten von
Adipositas und Atherosklerose. Dieser Umstand erklärt, warum in der Therapie des
Typ-2-Diabetes, im Gegensatz zum Typ 1, weniger die Insulinsubstitution als vielmehr
eine Ernährungsumstellung, körperliche Aktivität sowie die Behandlung mit oralen
Antidiabetika im Vordergrund stehen.
Manifestationsfaktoren des Typ-2-Diabetes können neben einer genetischen Disposition
Stressfaktoren wie z.B. Operationen, Traumata oder Infektionen, aber auch
Endokrinopathien und Medikamente sein. Die Mehrzahl der Erkrankungen entwickelt
sich jedoch auf dem Boden eines metabolischen Syndroms (sog. Wohlstandssyndrom),
das durch das Zusammentreffen der vier Risikofaktoren „abdominelle Adipositas“,
„Dyslipoproteinämie“ (d.h. Erhöhung von Triglyceriden und LDL-Cholesterin bei
gleichzeitiger Verminderung von HDL-Cholesterin im Blut), „essentielle Hypertonie“
und „Glucosetoleranzstörung“ gekennzeichnet ist [7]. Die Bezeichnung dieser
Befundkonstellation mit „Wohlstandssyndrom“ verweist auf die entscheidende
Bedeutung des modernen Lebensstils, der durch Überernährung bei gleichzeitig
mangelnder körperlicher Bewegung als Hochrisikofaktor für ein metabolisches
Syndrom und damit für den Diabetes mellitus Typ 2 gilt.
Die Vererbung des Diabetes mellitus erfolgt polygen-multifaktoriell. Allerdings sind die
zu Grunde liegenden genetischen Faktoren im Detail noch unbekannt. Untersuchungen
an eineiigen Zwillingen zeigten, dass die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung beider
Geschwister an einem Typ-2-Diabetes zwischen 50 und 100 % liegt [54]. Die
genetische Penetranz ist also sehr hoch.
Ein Typ-2-Diabetes kann in seltenen Fällen auch bei Jugendlichen auftreten [6].
International wurde in den letzten Jahren eine Zunahme dieser Fälle beschrieben [38].
1.2 Komplikationen des Diabetes mellitus
Die meisten Spätfolgen des Diabetes mellitus sind auf Veränderungen der Blutgefäße,
sog. Angiopathien, zurückzuführen, die sich als sog. Endorganschäden an einer Vielzahl
von Organen manifestieren (siehe Tabelle 1).
8 Einleitung
Tabelle 1: Alters- und geschlechtsadjustierte „Odds Ratios“ für Komorbiditäten von Patienten mit Diabetes mellitus im Vergleich zu Personen ohne Diabetes mellitus (vgl. [28])
Komorbidität
Odds Ratio
95%iges KI
KHK 3,32 3,12 – 3,53 Periphere arterielle Verschlusskrankheit 3,14 2,79 – 3,53 Zerebrovaskuläre Erkrankungen 2,26 1,94 – 2,62
Arterielle Hypertonie 2,83 2,71 – 2,90
Augenerkrankungen 3,10 2,94 – 3,27
Nierenerkrankungen 4,63 3,86 – 5,54
Periphere Nervenerkrankungen 2,26 1,98 – 2,58 Man unterscheidet dabei zwischen den diabetesassoziierten makrovaskulären und den
diabetesspezifischen mikrovaskulären Komplikationen.
Die diabetische Makroangiopathie ist mit der Atherosklerose des Nichtdiabetikers
vergleichbar. Die wichtigsten Folgezustände sind Koronarsklerose, periphere
Durchblutungsstörungen und zerebrovaskuläre Schädigungen [82].
Die diabetische Mikroangiopathie hingegen ist charakterisiert durch eine Verdickung
der kapillären Basalmembran und abhängig von der Krankheitsdauer und der Güte der
Stoffwechseleinstellung. Dabei führt eine erhöhte Glucosekonzentration langfristig zu
einer nichtenzymatischen Kohlenhydratbindung an Proteine (Glykosylierung) und
Kollagen sowie zu einer Lamininvermehrung. Diese irreversible Glykosylierung führt
zu einer Beeinträchtigung der Kollagenvernetzung der kleinen Gefäße vorwiegend im
Augenhintergrund und in den Nierenglomerula (renoretinales Syndrom) [69]. Prinzipiell
kann allerdings jedes Kapillargebiet betroffen sein. So wird die diabetische
Mikroangiopathie auch als ätiopathogenetischer Faktor der diabetischen Neuropathie
diskutiert [28].
1.3 Diabetische Nephropathie
Tabelle 1 zeigt das stark erhöhte Risiko von Diabetes-Patienten, sekundär eine
Nierenerkrankung zu entwickeln. 20-40 % aller Patienten mit Typ-1- oder Typ-2-
Diabetes entwickeln im Verlauf ihrer Erkrankung eine Nierenschädigung [3]. Als
diabetische Nephropathie werden Nierenläsionen im Spätstadium eines Diabetes
mellitus bezeichnet, die klinisch zu einer zunehmenden Albuminausscheidung und zur
Veränderung der glomerulären Filtrationsrate führen und die mit einem erhöhten
kardiovaskulären Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko assoziiert sind [32].
9 Einleitung
Nach Mogensen wird die Erkrankung in 5 Stadien eingeteilt [50] (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2: Nephropathie-Stadien nach Mogensen, 1983 (vgl. [32])
Nephropathie-Stadium
Albumin-ausscheidung
Serum-Kreatinin
GFR
I Stadium der Hyperfunktion Erhöht Normal Erhöht
II Stadium der klinischen Latenz Normal Normal Normal bis erhöht
III Beginnende Nephropathie Persistierende Mikroalbumin-urie
Im Normbereich ansteigend
Abnehmend
IV Kinisch-Manifeste Nephropathie
Makroalbumin-urie
Im Normbereich ansteigend
Abnehmend
V Niereninsuffizienz Makroalbumin-urie
Erhöht Erniedrigt
Die anhaltende Hyperglykämie führt einerseits über eine Erhöhung der Glukagon- und
Wachstumshormonkonzentration im Blut zu einer Zunahme der glomerulären
Filtrationsrate (GFR) (Stadium I und II). Auch Veränderungen der Konzentration an
Angiotensin-II, Katecholaminen und Prostaglandinen können zur glomerulären
Hyperfiltration beitragen [34].
Andererseits begünstigt die erhöhte Blutglukosekonzentration auch die Aktivierung von
Wachstumsfaktoren, wie TGF-β und das oben erwähnte Angiotensin-II in den Nieren.
Diese sind verantwortlich für eine Hypertrophie renaler Strukturen und eine
Größenzunahme der Glomerula. Gleichzeitig findet eine Verdickung der Basalmembran
statt, die auf einem gesteigerten Anbau und einem verminderten Abbau von
Basalmembrankollagenen beruht. Diese enthalten vermehrt Glukosyl-Galaktosyl-
Disaccharide und vermindert Sialinsäure und Heparansulfat. Daraus resultiert eine
funktionelle Beeinträchtigung der Filtrationsbarriere gegenüber kleinmolekularen
Proteinen, die eine glomeruläre Permeabilitätsstörung zur Folge hat [69]. Eine
Mikroalbuminurie, also das Auftreten von 30-300 mg Albumin im 24-Stunden-Urin
[32], setzt als erstes klinisches Symptom ein (Stadium I). Aus einer intermittierenden
Mikroalbuminurie kann sich bei 20-40 % der Typ-2-Diabetiker über eine persistierende
Mikroalbuminurie (Stadium III) eine Makroalbuminurie (Stadium IV und V) bis hin
zum terminalen Nierenversagen entwickeln, wenn die Krankheit nicht spezifisch
therapiert wird. Im weiteren Verlauf führen eine Verbreiterung des Mesangiums und im
10 Einleitung
Spätstadium eine glomeruläre Okklusion und tubulointerstitielle Fibrose nicht selten zur
terminalen Niereninsuffizienz (Stadium V) [3]. Morphologisch sind die Nieren zunächst
leicht vergrößert und weisen bei begleitender Arteriolosklerose eine fein granuläre
Oberfläche auf. Die Glomerula sind im Frühstadium eines Diabetes messbar vergrößert
und zeigen eine Mesangiumzellproliferation [69]. Im Spätstadium steht die noduläre
Glomerulosklerose nach Kimmelstiel und Wilson [40] im Vordergrund. Dabei handelt
es sich um eine Verbreiterung des Mesangiums durch eine diffuse, später noduläre
Ablagerung von PAS-positivem Material. Häufig lagert sich dieses Material auch
tropfenförmig zwischen der Bowmannschen Kapsel und dem Kapselepithel ab (sog.
Kapseltropfen) und Plasmasubstanzen sickern zwischen Basalmembran und Deckzellen
ein (sog. fibrinoide Kappen). Ferner sind die glomerulären Hilusgefäße
arteriosklerotisch verändert [69].
Die pathogenetischen Mechanismen, die eine diabetische Nephropathie verursachen,
sind noch nicht eindeutig bekannt. Mehrere Faktoren, die unmittelbar mit einer
Hyperglykämie verknüpft sind, werden diskutiert. Dazu zählen die Bildung von
„advanced glycosylation end products“ (AGEs) [13], die intrazelluläre Akkumulation
von Sorbitol über den sogenannten Polyol-Pathway [13], eine Aktivierung der
Proteinkinase C (PKC) in den Glomerula [13, 15] und eine Stimulation der Synthese
von „transforming growth factor beta-1“ (TGF-β-1) und „plasminogen activator
inhibitor-1“ (PAI-1) über den sogenannten Hexosamin-Pathway [13]. Veränderungen
des Blutflusses, eine erhöhte Kapillarpermeabilität, mesangiale Matrixvermehrung,
Thrombosierung und Proliferation glatter Muskelzellen der Kapillaren sowie die
Freisetzung proinflammatorisch wirkender Moleküle sind die Folge [13].
Neben einer unzureichenden Blutzuckereinstellung stellen Hypertonie, Nikotinkonsum,
erhöhte Eiweißzufuhr und eine genetische Prädisposition Risikofaktoren für die
Entwicklung einer diabetischen Nephropathie dar [32]. Bei Patienten mit Typ-2-
Diabetes zeigt eine Mikroalbuminurie ein erhöhtes kardiovaskuläres Morbiditäts- und
Mortalitätsrisiko an [32, 48]. Überdies ist die diabetische Nephropathie assoziiert mit
der Entwicklung von Hypertonie, koronarer Herzkrankheit, Schlaganfall, peripherer
arterieller Verschlusskrankheit und vorzeitiger Mortalität [3].
Alle in diesem Kapitel dargestellten Befunde verweisen auf die Anfälligkeit immer
größerer Personenkreise für den Diabetes mellitus sowie die diabetische Nephropathie
in den westlichen Industrienationen. Dies hat nicht nur die Minderung der
Lebensqualität einer steigenden Anzahl von Menschen zur Folge, sondern auch eine
11 Einleitung
stärkere Belastung der Sicherungssysteme unseres Gesundheitswesens. Die Entwick-
lung neuer effizienter Medikamente liegt daher nicht nur im Interesse gegenwärtiger
wie zukünftiger Patienten, sondern ihr kommt darüber hinaus eine gesundheitspolitische
Bedeutung zu.
In den folgenden Kapiteln werden Ergebnisse einer Studie vorgestellt, welche die
Auswirkungen eines von der Firma Merck® neu entwickelten Antidiabetikums, des
Medikaments EMD 387008, auf die Verhinderung von renalen Schäden im diabetischen
Tiermodell untersuchte.
13 Zielsetzung der Arbeit
2 Zielsetzung der Arbeit
Mit der Verbesserung der Überlebensprognose von Diabetikern hat die
Niereninsuffizienz infolge renaler Diabeteskomplikationen eine erschreckende
Dimension angenommen. So sind in den westlichen Industrienationen 30-50 % der
Dialysepatienten Diabetiker [64]. In Europa, Japan und den USA ist die diabetische
Nephropathie mit 25-42 % der Fälle die Hauptursache der terminalen Niereninsuffizienz
[61]. Eine optimale Stoffwechseleinstellung sowie die Prävention und Behandlung der
diabetischen Nephropathie ist daher von essentieller Bedeutung.
Mehrere Studien belegen, dass normoglykämische Blutzuckerwerte das Fortschreiten
einer Nierenschädigung verzögern können [1, 2, 19, 26, 32, 71]. Das Biguanid
Metformin findet breite Anwendung in der Behandlung des Typ-2-Diabetes,
insbesondere bei übergewichtigen Patienten. Seine unmittelbaren Stoffwechseleffekte,
wie die Minderung der hepatischen Glucosefreisetzung, Verbesserung der peripheren
Glucoseverwertung sowie eine positive Beeinflussung des Lipidstatus gehen einher mit
einer messbaren Verminderung von diabetesassoziierten Komplikationen. So konnte
eine in Großbritannien durchgeführte Studie (UK Prospective Diabetes Study, UKPDS)
bei nach Diagnosestellung mit Metformin behandelten Patienten eine Risikoreduktion
von 32 % für das Auftreten von diabetesbedingten mikro- und makrovaskulären
Komplikationen (plötzlicher Tod, Tod durch Hypo- oder Hyperglykämie,
Myokardinfarkt, Angina pectoris, Herzversagen, Apoplex, Nierenversagen, Amputation,
Glaskörperhämorrhagien, koagulations-bedürftige Retinopathie, einseitige Blindheit,
Kataraktextraktion), von 42 % für diabetes-assoziierte Todesfälle (Tod nach
Myokardinfarkt, Apoplex, pAVK, renaler Schädigung, Hypoglykämie, Hyperglykämie,
plötzlicher Tod), sowie von 36 % für die Gesamtmortalität gegenüber der rein diätetisch
behandelten Kontrollgruppe zeigen [2]. Auch im Vergleich zu einer Behandlung mit
Sulfonylharnstoffen oder Insulin war die Risikoreduktion für diabetesassoziierte
Komplikationen durch Metformin signifikant [1].
Diese positiven Effekte sind nicht nur durch die antihyperglykämischen Effekte dieses
Medikaments zu erklären, sondern auch durch davon unabhängige vasoprotektive
Wirkungen. So kann Metformin in frühen Stadien des Diabetes den kapillären Blutfluss
erhöhen, die arterielle Vasomotorik stimulieren und die lokale Aktivität der NO-
Synthase erhöhen. Ferner reduziert Metformin die Endothelpermeabilität und somit die
Entstehung von Ödemen. Diese Wirkung lässt sich laut Bailey [10] durch die
14 Zielsetzung der Arbeit
verminderte Glykosilierung der Basalmembran erklären, die mit erhöhter
Wandelastizität der Gefäße einhergeht.
Nach wie vor gehört Metformin zu den am häufigsten eingesetzten Antidiabetika, unter
anderem, weil es sich in vielerlei Hinsicht positiv von anderen Präparaten abhebt. Dazu
gehört etwa die Blutzuckersenkung ohne Hypoglykämie und ohne Hyperinsulinämie,
eine günstige Beeinflussung des Lipidprofils und des Körpergewichts sowie ein
antiatherogener Effekt [49].
Allerdings erfährt der Indikationsbereich durch zahlreiche Kontraindikationen eine
gewisse Einschränkung. Hierzu zählen ein hohes Lebensalter, Zustände mit schlechter
Sauerstoffversorgung des Gewebes, Lebererkrankungen und besonders die bei
Diabetikern häufig eingeschränkte Nierenfunktion (ab einer Serum-Kreatinin-
Konzentration von 1,2 mg/dl) [5]. Wünschenswert wäre daher die Entwicklung eines
Antidiabetikums, das die positiven Effekte von Metformin mit einem breiteren
Indikationsspektrum vereint.
Die Firma Merck® (Darmstadt, Deutschland) entwickelte in diesem Zusammenhang
das Medikament EMD 387008, im Folgenden kurz „EMD“ genannt, das sich derzeit in
präklinischer Testung befindet. In der vorliegenden Arbeit wurde im Tiermodell der
„Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-fatty) der Therapieerfolg von EMD 387008 und
Metformin hinsichtlich des Auftretens renaler Schäden verglichen. Die Untersuchungen
erfolgten mittels laborchemischer und histopathologischer Parameter. Als Kontrolle
diente ein Rattenwildtyp (ZDF-lean), der bei identischem genetischen Hintergrund
keine Symptome eines Diabetes und den sich daraus ergebenden Endorganschäden
ausbildet, wohl aber einen Hypertonus. Eine Veränderung der Nieren von ZDF-lean und
-fatty-Ratten, die bereits vor Beginn der Behandlung untersucht wurden, konnte als
Ausgangswert für die Progression der Erkrankung über den 16-wöchigen
Versuchszeitraum herangezogen werden. Mit Placebo behandelte ZDF-lean- und -fatty-
Tiere der entsprechenden Altersgruppen dienten als direkter Vergleich für mögliche
protektive Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die diabetische
Nephropathie.
Die folgenden Parameter wurden untersucht:
• Tierparameter wie Körpergewicht [g], Körperlänge [mm] und Nierengewicht [g]
• Futter- [g/24 h] und Wasseraufnahme [ml/24 h] der Tiere
• Diurese [ml/24 h]
15 Zielsetzung der Arbeit
• Albumin-Exkretion [mg/24 h]
• Kreatinin-Exkretion [mmol/24 h]
• Serum-Kreatinin [µmol/l]
• Kreatinin-Clearance [ml/min]
• Harnstoff-Exkretion [mg/24 h]
• Urin-Albumin-Kreatinin-Ratio
• Serum-Glucose [mg/dl]
• Urin-Glucose [g/dl]
• Serum-Insulin [ng/ml]
• HbA1c [%]
• Serum- Natrium, Serum-Kalium, Serum-Calcium, Serum-Chlorid [mmol/l]
• Serum-Lactat [mmol]
• Serum-Cholesterin, Serum-HDL, Serum-LDL [mg/dl]
• An Paraffinschnitten:
- Glomerulärer, Mesangialer, Tubulointerstitieller und Vaskulärer
Schädigungsindex
- Umfang [µm], Fläche [µm²] und Volumen [10³ µm³] des Kapillarkonvoluts
- größter und kleinster Glomerulumdurchmesser [µm]
• An Semidünnschnitten:
- Mittlere Kapillarquerschnittsfläche [µm²]
- Längendichte [1/mm²] und Volumendichte [%] der Kapillaren
- Volumendichte von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen [%]
- Gesamtvolumen von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen
[10³ µm³]
- Zahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro Fläche
[1/mm²]
- Zahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro Volumen
[1/mm³]
- Gesamtzahl der Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen pro
Glomerulum
- Durchschnittsvolumen eines Podozyten, einer Mesangiumzelle und einer
Endothelzelle [µm³]
17 Material und Methodik
3 Material und Methodik
3.1 Versuchstiere
In der nachfolgend beschriebenen Versuchsreihe wurde das Modell der „Zucker-
Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte) verwendet. Die ZDF-Ratte stellt ein klinisch
relevantes Tiermodell für die Untersuchung der Typ-2-diabetischen Nephropathie des
Menschen dar und wurde durch partielle Inzucht aus dem Stamm der „Zucker-Fatty“-
Ratten herausgezüchtet, welche in den 1960er Jahren vom Ehepaar Zucker beschrieben
wurden [87]. Diese Ratten tragen eine autosomal-rezessiv vererbte Mutation des Leptin-
Rezeptors (fa), die eine Verkürzung des Rezeptors und in der Folge eine ungenügende
Hormon-Rezeptor-Interaktion bedingt. Bei homozygoten männlichen Tieren (fa/fa)
führt diese Mutation zu Hyperphagie, Hyperlipidämie, Adipositas und nur leicht
verminderter Glucosetoleranz [16, 62]. Immer wieder trat jedoch auch ein männlicher
Phänotyp stark übergewichtiger Ratten mit sehr hohem Glukosespiegel und einer
gestörten Glukosetoleranz auf. Diese, ausschließlich männliche Tiere betreffende,
Spontanmutation wurde mit normalgewichtigen Zucker Ratten (+/fa) gepaart, die ein
hohes diabetisches Potential in sich trugen. Es handelte sich dabei fast ausschließlich
um Bruder x Schwester-Inzucht. Bereits ab der zweiten Generation konnte ein
konstanter Phänotyp herausgezüchtet werden, bei dem der Diabetes monogenetisch
determiniert ist und autosomal ausschließlich an männliche Nachkommen vererbt wird
[62]. Diese weisen im Alter von sieben Wochen eine Hyperglykämie auf, im Alter von
zwölf Wochen zeigt sich ein manifester Typ-2-Diabetes. Im Verlauf sind erhöhte
Plasmaspiegel des Glykoproteins HbA1c, als Marker für eine erhöhte Blutglukose, sowie
eine Proteinurie, Hypertriglyceridämie, Hypercholesterinämie und ein erhöhter Spiegel
freier Fettsäuren im Blut zu finden. Neuropathie, diabetische Nephropathie, gestörte
Wundheilung und ein milder Hypertonus sind weitere Kennzeichen dieses
Rattengenotyps (ZDF-fatty) [14, 25, 31, 62, 76]. Während die Serum-Insulinspiegel
zwischen der 7. und 10. Woche ansteigen, fallen sie später auf Grund der abnehmenden
Fähigkeit der β-Zellen, adäquat auf Glucosereize zu reagieren, wieder auf ein niedriges
Niveau ab [14, 76]. Die weiblichen Nachkommen bilden bei handelsüblicher Diät trotz
Fettleibigkeit und Insulinresistenz keinen Diabetes aus. Eine spezielle Nahrung (RD
13004 von Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) führt jedoch auch bei
18 Material und Methodik
weiblichen Tieren zur Ausbildung eines Diabetes mellitus im Alter von 6 bis 25
Wochen [14].
Tiere, die heterozygot für die Mutation im fa-Gen (ZDF-lean fa/+) sind oder dem
Wildtyp entsprechen, entwickeln keinen Diabetes, jedoch einen Hypertonus. Sie stellen
in diesem Versuch die Kontrollgruppe dar. Somit kann sichergestellt werden, dass
renale Veränderungen der Versuchstiere im Vergleich zur Kontrollgruppe auf den
Diabetes und nicht auf eine hypertensive Schädigung zurückzuführen sind.
3.2 Studiendesign
Dem hier beschriebenen Experiment lag folgender Versuchsaufbau zu Grunde:
Sechzig „Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratten wurden randomisiert 6 Gruppen zugeordnet.
Um Ausgangswerte der histologischen Nierenveränderungen der Ratten vor der
nachfolgenden Behandlung zu erhalten, wurden jeweils 10 Tiere der Gruppen ZDF-fatty
und ZDF-lean bereits nach 10 Versuchswochen untersucht.
Die verbleibenden ZDF-fatty-Ratten wurden randomisiert 3 Gruppen zugeordnet, die
nun für den Zeitraum von 16 Wochen entweder mit Metformin (150 mg/kg/24 h im
Futter), EMD 387008 (200 mg/kg/24 h im Futter) oder einem Placebo behandelt
wurden. Tiere aus der Gruppe ZDF-lean erhielten ebenfalls ein Placebo für den
Zeitraum von 16 Wochen.
Somit ergab sich die in Tabelle 3 gezeigte Gruppeneinteilung.
Tabelle 3: Gruppeneinteilung
Gruppe Behandlung
Behandlungszeitraum,
Versuchsdauer Gruppengröße
ZDF-lean ZDF-lean, unbehandelt Woche 1-10, Versuchsende nach
10 Wochen
N=10
ZDF-fatty ZDF-fatty, unbehandelt Woche 1-10, Versuchsende nach
10 Wochen
N=10
ZDF-L-P ZDF-lean, Placebogabe Woche 10-16, Versuchsende nach
26 Wochen
N=10
ZDF-F-P ZDF-fatty, Placebogabe Woche 10-16, Versuchsende nach
26 Wochen
N=10
ZDF-F-Met ZDF-fatty, Behandlung mit
Metformin
Woche 10-26, Versuchsende nach
26 Wochen
N=10
ZDF-F-EMD ZDF-fatty, Behandlung mit
EMD 387008
Woche 10-26, Versuchsende nach
26 Wochen
N=10
19 Material und Methodik
Das Experiment endete nach 10 bzw. 26 Wochen mit einer retrograden
Perfusionsfixation der Organe (vgl. Abschnitt 3.6).
Ziel des Versuchsaufbaus war ein Vergleich der renalen Schädigung zwischen der mit
EMD 387008 behandelten Gruppe (ZDF-F-EMD), der mit Metformin behandelten
Gruppe (ZDF-F-Met) und der mit Placebo behandelten Gruppe (ZDF-F-P) bezüglich
ihrer physiologischen, biochemischen und histologischen Parameter. Eine
Verlaufsbeurteilung wurde möglich durch den Vergleich der unbehandelten Gruppen
(ZDF-lean, ZDF-fatty) mit den mit Placebo behandelten Gruppen (ZDF-L-P, ZDF-F-P).
Die unbehandelten Gruppen wurden ausschließlich histologisch untersucht.
3.3 Versuchsbedingungen
Die Tierversuche wurden unter kontrollierten äußeren Bedingungen durchgeführt: die
Raumtemperatur betrug 21-24 °C und die relative Luftfeuchte lag zwischen 45 und
60 %. Auf Grund einer automatischen Lichtanlage konnte den Tieren ein künstlicher
Tag-Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht auferlegt
werden. Wasser und Futter in Form einer Kliba/Nafag-Diät (Provimi Kliba/Nafag Nr.
3433, Kaiseraugst, Schweiz) erhielten sie ad libitum.
3.4 Behandlung der Tiere
3.4.1 Medikamentenbeschreibung
Zehn Tiere der Gruppe ZDF-fatty wurden mit Metformin (Glucophage®, Merck,
Darmstadt, Deutschland) behandelt, einem Antidiabetikum aus der Gruppe der
Biguanide, die vor mehr als 40 Jahren in die Diabetestherapie eingeführt wurden.
Der genaue Wirkmechanismus dieser Stoffklasse ist bislang ungeklärt. Diese Stoffe
wirken nur in Gegenwart von Insulin, also bei genügender Produktion, jedoch
mangelnder Wirkung dieses Hormons an den Zielorganen, was typisches Kennzeichen
eines Typ-2-Diabetes ist. Metformin verbessert die Diabeteseinstellung durch eine
Verminderung der Insulinresistenz vorwiegend an der Leber und zusätzlich im Bereich
der Muskulatur, während die pankreatische Betazellsekretion nicht gesteigert wird [31].
Das Biguanid passiert als protoniertes Kation die innere Mitochondrienmembran von
Hepatozyten, reichert sich stark in der mitochondrialen Matrix an und verursacht von
dort aus eine Hemmung der Atmungskette. Dies führt zu einer Abnahme der oxidativen
Phosphorylierung und einem gleichzeitigen Anstieg der cytosolischen AMP-
20 Material und Methodik
Konzentration als Folge des Adenylatcyclase-Gleichgewichts. AMP stimuliert nun die
AMP-aktivierte Proteinkinase. Dies resultiert in einer Hemmung von Enzymen, die an
der Produktion von Glucose und Triglyceriden beteiligt sind und in einer verminderten
Expression von Genen, die in die Lipidsynthese involviert sind. Dies erklärt sowohl die
blutzuckersenkende Wirkung des Metformins als auch eine Minderung der Triglycerid-
und VLDL-Werte im Blut [5].
Nach oraler Gabe wird Metformin langsam und unvollständig resorbiert. Die
Bioverfügbarkeit beträgt nur 50-60 %, weil Metformin nicht metabolisiert, sondern
unverändert über die Niere ausgeschieden wird. Die Plasmahalbwertszeit beträgt 1,5-
4,5 Stunden. Das Biguanid wird zu weniger als 10 % an Plasmaeiweiß gebunden, wobei
sein Verteilungsvolumen 1 bis 4 l/kg beträgt. Ein geringer Anteil des resorbierten
Metformins wird in ein tiefes Kompartiment verteilt und hieraus mit einer Halbwertszeit
von 9 bis 19 Stunden eliminiert. Im Gegensatz zur sofortigen Wirkung von
Sulfonylharnstoffen setzt der blutglukosesenkende Effekt von Metformin erst nach
einigen Applikationstagen ein.
Das Medikament wird vor allem bei übergewichtigen Patienten (BMI > 25 bis 27
kg/m²) mit Diabetes mellitus Typ 2 eingesetzt, bei denen ein Therapieversuch mit
Gewichtsabnahme und Diät nicht zum Erreichen der HbA1c-Zielwerte geführt hat [1].
Durchschnittlich kommt es hier zu einer Blutglukosesenkung um 20 %, welche jedoch
nicht auf übergewichtige Patienten beschränkt ist, sondern auch bei Patienten mit
normalem Körpergewicht (BMI 24 bis 25 kg/m²) beobachtet werden kann [10].
Im Hinblick auf die blutglukosesenkende Wirkung ist Metformin mit den ebenfalls breit
eingesetzten Sulfonylharnstoffen vergleichbar [12, 49]. Von dieser Stoffklasse hebt sich
Metformin jedoch durch das fehlende Auftreten von Hypoglykämien sowie durch
seinen gewichtsregulierenden Effekt vorteilhaft ab [49].
Eine Sonderstellung nimmt Metformin bei der Wirkung auf diabetestypische
Komplikationen ein: die UKPD-Studie zeigt, dass eine verbesserte Diabeteskontrolle
durch Metformin zu einer signifikanten Reduktion mikrovaskulärer Komplikationen
führt [2], wobei die Risikoreduktion in allen Therapiegruppen (Sulfonylharnstoffe,
Metformin und Insulin) statistisch nicht signifikant unterschiedlich war.
Makrovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall, koronare Ereignisse und
diabetesbezogener Tod wurden dagegen nur durch Metformin signifikant reduziert [1].
Da die HbA1c-Reduktion unter einer Therapie mit Sulfonylharnstoffen, Metformin und
Insulin vergleichbar war, scheint der vasoprotektive Effekt von Metformin in der
21 Material und Methodik
UKPD-Studie unabhängig von der Blutglukosesenkung zu sein und auf zusätzlichen
Faktoren zu beruhen. Dazu gehört etwa die günstige Beeinflussung der bekannten
Risikofaktoren für Atherosklerose wie Hyperglykämie, Dyslipidämie, gesteigerte
Thrombozytenaggregation und endotheliale Dysfunktion durch diese Substanz [31].
Gleichwohl geht man von einem zusätzlichen Effekt von verbesserter Stoffwechsel-
kontrolle und verminderter Insulinresistenz auf die Gefäßprotektion aus [10].
Neben seinen Effekten auf den Blutglucosespiegel, wirkt Metformin auch auf andere
metabolische Parameter (vgl. Tabelle 4).
Tabelle 4: Effekte von Metformin auf Komponenten des Insulinresistenzsyndroms (vgl. [31])
Änderung gegenüber Ausgangswert
Berichtete Effekte Bereich %
Effekte auf die Diabeteseinstellung
Nüchternblutglukose (mmol/l) � 2-4 � 20-30
Postprandiale Blutglukose
(mmol/l)
� 3-6 � 30-40
HbA1c (%) � 1-2 � 10-25
Effekt auf Insulinspiegel
Nüchtern-Plasmainsulinspiegel
(µU/ml)
� 0-3,50 � 0-20
Effekte auf Lipidstoffwechsel
Serumtriglyceride (mmol/l) � 0-0,10 � 0-30
Serumcholesterin (mmol/l) � 0-0,35 � 0-10
Serum-LDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-1,00 � 0-25
Serum-VLDL-Cholesterin
(mmol/l)
� 0-0,60 � 0-39
Serum-HDL-Cholesterin
(mmol/l)
� 0-0,16 � 0-17
Freie Fettsäuren (mmol/l) � 0-0,15 � 0-14
Effekt auf vaskuläre und
Hämostaseparameter
Blutdruck (mmHg) Keine Änderung Keine Änderung
PAI-1-Spiegel (ng/ml) � 10-15 � 10-45
Peripherer Blutfluss (ml/100ml
Gewebe /min)
� 0-1,0 � 0-25
Effekt auf das Körpergewicht (kg) � 0-4 � 0-6
22 Material und Methodik
Es konnte nachgewiesen werden, dass unter einer Metformin-Therapie ein signifikanter
Anstieg von HDL-Cholesterin sowie ein Abfall von VLDL-Triglyzeriden zu beobachten
ist.
Auch ein antithrombotischer Effekt konnte für Metformin beobachtet werden. In zwei
Studien zeigte sich unter Metformin-Therapie ein signifikanter Abfall der
thrombusstabilisierenden Serinprothease PAI-1, assoziiert mit einer Senkung der
Triglyzeride. Ein zusätzlicher antithrombotischer Effekt von Metformin wurde durch
eine günstige Beeinflussung der gesteigerten Thrombozytenaggregation belegt [1, 12].
Darüber hinaus wurde unter Metformin über eine signifikante Verminderung der AGE-
Bildung um 25 % bei niedriger und 72 % bei hoher Metformindosis berichtet [31].
Als Nebenwirkungen einer Metformintherapie treten besonders zu Beginn der
Behandlung Übelkeit, Magendruck, Blähungen, Durchfälle und metallischer
Mundgeschmack auf. Am häufigsten sind Appetitlosigkeit und Magendruck,
wohingegen Durchfälle relativ selten sind. Bei einer Langzeittherapie kann es zur
herabgesetzten Resorption von Vitamin B 12 und Folsäure kommen. Die gefährlichste
Nebenwirkung ist jedoch die Laktatazidose (Blut-pH < 7,25, Laktatkonzentration > 5
mmol/l) [42]. Ihre Inzidenz unter Metformin beträgt 0,01-0,08 Fälle/1000
Patientenjahre bei einem Mortalitätsrisiko von bis zu 50 % [12]. Es sind daher
bestimmte Kontraindikationen beim Einsatz dieses Medikaments zu beachten. Dazu
gehört die mangelnde Eliminationsfähigkeit des Metformins durch den Organismus bei
Niereninsuffizienz oder eine stark eingeschränkte Stoffwechsellage. Das Medikament
sollte daher bereits bei einem Kreatininwert von über 1,5 mg/dl bei Männern und über
1,4 mg/dl bei Frauen sowie bei anderen Zuständen, die zur Stoffwechselentgleisung mit
Gefahr der Laktatazidose prädisponieren (Reduktionskost, Infekte, Neoplasien,
eingeschränkte Leberfunktion, kardiorespiratorische Insuffizienz, Hypoxie), nicht
angewendet werden [12].
Das Medikament EMD 387008 (EMD) wurde von der Firma Merck® als orales
Antidiabetikum mit einem dem Metformin vergleichbaren Wirkspektrum bei besserer
metabolischer Verträglichkeit entwickelt. Der Wirkmechanismus ist noch nicht
vollständig aufgeklärt.
23 Material und Methodik
3.4.2 Verabreichung der Medikamente
Die medikamentös behandelten Versuchstiere erhielten ab der 10. Woche täglich 150
mg/kg Körpergewicht Metformin bzw. 200 mg/kg Körpergewicht EMD im Futter. In
gleicher zeitlicher Anordnung wie die Tiere der Medikamentengruppen wurde den
Tieren der Vergleichsgruppen das Placebo verabreicht. Die Behandlung wurde über 16
Wochen fortgesetzt.
3.5 Laboranalyse
3.5.1 Urinanalyse
Für die Sammlung eines 24-h-Urins wurden die Tiere in einem metabolischen Käfig
untergebracht, der eine stuhlfreie Sammlung des Urins ermöglichte.
Folgende Parameter wurden im Urin analysiert:
• Glucose
• Kreatinin und Harnstoff
• Kreatinin-Clearance (Berechnung unter Zuhilfenahme der Parameter Plasma-
und Urinkonzentration von Kreatinin)
• Albumin-Exkretion
• Um eine Verfälschung der Ergebnisse für die Albumin-Exkretion durch
Unterschiede in der Diuresemenge vorzubeugen, wurde zusätzlich der Parameter
„Albumin-Exkretion pro Kreatininausscheidung“ (µg/µg Kreatinin) berechnet.
3.5.2 Serum- und Plasmaanalyse
Die Blutentnahme erfolgte bei der Perfusion aus der Bauchaorta unter Thiopental-
Narkose in Li-Heparin und K2EDTA-Röhrchen, die mit 3000 rpm bei 4°C für 10
Minuten zentrifugiert wurden.
Das Plasma wurde umgehend untersucht auf:
• Kreatinin, Cholesterin, LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Natrium, Kalium,
Calcium, Chlorid, Laktat
• Glucose, Serum-Insulin, HbA1c
24 Material und Methodik
3.6 Fixation und Gewebeaufbereitung
3.6.1 Perfusionsfixation
Die Perfusionsfixation wurde nach einem im Labor des Pathologischen Instituts der
Universität Erlangen-Nürnberg entwickelten standardisierten Verfahren durchgeführt
[8]. Nach einer Vornarkotisierung mit Äther wurden die Tiere mit einem Gemisch aus
0,4 ml Rompun® 2 % und 1,6 ml Ketavet®, in der Konzentration 100 mg/ml,
vollnarkotisiert. Dazu wurden die beiden Medikamente mit 2 ml NaCl 0,9 % verdünnt
und den Tieren pro 10 g Körpergewicht ca. 0,1 ml dieser Lösung i.m. gespritzt.
Anschließend wurde der Bauchraum der Tiere über einen medianen Längsschnitt
eröffnet und die Aorta abdominalis katheterisiert. Nun wurde das Gefäßsystem des
Tieres etwa zwei Minuten mit Dextran 40 (Rheomakrodex®) unter Zusatz von 2 %
Novocain gespült. Dextran 40 fungierte hierbei als hyperonkotische Lösung, die durch
Weitstellung der Gefäße die Ausbildung eines artifiziellen Ödems des Interstitiums
verhindern und einer thrombotischen Verlegung der perfundierten Gefäße
entgegenwirken sollte. Um einen Abfluss der Perfusionslösung zu gewährleisten und
einen übermäßigen Druckanstieg innerhalb der Gefäße zu verhindern, wurde
unmittelbar nach Beginn der Perfusionsbehandlung die Vena Cava eröffnet. Danach
wurde das Gefäßsystem zunächst mit 0,9 % NaCl und anschließend bei einem
Perfusionsdruck von 110 mmHg mit 3%igem Glutaraldehyd in 0,2 molarer Phosphat-
pufferlösung gespült. Nach der Perfusionsfixation wurden die Organe entnommen und
nach einer Gewichtsbestimmung in 3%igem Glutaraldehyd und 0,2 molarer
Phosphatpufferlösung eingelagert.
3.6.2 Histologische Gewebeaufbereitung
Zur Gewebaufbereitung wurden die in Pufferlösung eingelagerten Nieren von ihren
Faszien gereinigt, gewogen und anschließend senkrecht zu ihrer Interpolarachse in ca.
1,5-2 mm dicke Scheiben geschnitten. Mittels des „Area weighted sampling“-
Verfahrens [60] wurden aus diesen Scheiben pro Niere 10 kleine Rindenstücke
ausgewählt: auf ein Gitter mit 99 Punkten wurden die 10 Nierenscheiben zufällig
platziert und diejenigen Rindenanteile bestimmt, die auf Gitterpunkte zufällig gezogener
Koordinaten fielen. Hieraus schnitt man mit einer scharfen Rasierklinge sektorförmige
Rindenanteile (ca. 2x2x2 mm³), die dann als Material für die Semidünnschnitttechnik
25 Material und Methodik
dienten. Aus den verbleibenden Nierenquerschnittsscheiben wurden Paraffinschnitte
angefertigt.
3.6.2.1 Paraffinschnitttechnik
Die gemäß Abschnitt 3.6.2 gewonnenen Nierenscheiben wurden in Sörensenpuffer (pH
7,2-7,4) gewaschen und in aufsteigender Isopropanol-Reihe und anschließend in einem
Intermedium dehydriert. Nach Einbettung der Präparate in Einbettkassetten wurde das
Gewebe mit Paraffin ausgegossen und auf einem Rotations-Mikrotom (Leica RM 2145,
Wetzlar, Deutschland) in 1 µm dicke Scheiben geschnitten. Diese wurden dann mit
Hämatoxylin-Eosin (HE), Periodic Acid Schiff Reaktion (PAS) und Siriusrot, einer
speziellen Bindegewebsfärbung, gegengefärbt.
3.6.2.2 Semidünnschnitttechnik
Die durch „Area weighted sampling“ (vgl. Abschnitt 3.6.2) gewonnenen
Nierensektoren wurden gemäß des in Abschnitt 3.6.2.1 erläuterten Verfahrens
gewaschen, in 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert, entwässert und in Epon-Araldit
eingebettet. Danach folgte eine Aushärtungsperiode von 18 bis 20 Stunden bei 70°C im
Brutschrank. Im Anschluss wurde eine zufällige Auswahl 5 fertiger Eponblöcke bis zu
der Tiefe angetrimmt, in der man erstes Gewebe antraf. Mit einem Rotations-Mikrotom
(Leica RM 2145, Wetzlar, Deutschland) wurden Schnitte mit einer Dicke von 1 µm
hergestellt und anschließend hitzefixiert. Diese wurden auf einem Objektträger zunächst
mit Fuchsin beschichtet und anschließend mit Methylenblau gegengefärbt.
3.7 Auswertung
3.7.1 Semiquantitative Untersuchungen der Glomerula hinsichtlich ihres Schädigungsausmaßes
3.7.1.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)
Der Glomeruloskleroseindex (GSI) erlaubt eine Quantifizierung der glomerulären
Schädigung hinsichtlich einer Proliferation von Mesangiumzellen und Sklerosierung der
mesangialen Matrix. Dazu wurden die PAS-gefärbten Paraffinschnitte in 400-facher
Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop (Standard 25, Firma Zeiss, Oberkochen,
Deutschland) mäanderförmig durchfahren und pro Tier 100 Glomerula beurteilt.
26 Material und Methodik
Wie in Tabelle 5 zu sehen, wurde das Schädigungsausmaß jedes Glomerulums gemäß
der Methode von El Nahas et al. [24] in 5 verschiedenen Stadien angegeben:
Tabelle 5: Stadien der Glomerulosklerose
Stadium Histologische Veränderungen
Anteil der Veränderungen des Konvoluts
0 Normales Glomerulum 0 %
1 Mesangiale Verdickung mit und ohne Proliferation von Mesangiumzellen.
Keine Kapillarbeteiligung. < 25 %
2 Mesangiale Proliferation mit partieller
Gefäßwandbeteiligung. Segmentale Sklerose.
< 50 %
3 Obliteration eines Großteils der Kapillaren
durch mesangiale Proliferation oder Narbenformation. Diffuse Sklerose.
< 75 %
4 Totale Obliteration der Kapillaren mit oder ohne Kapillarthrombose. Globale Sklerose
mit Kapillarkollaps. 100 %
Aus den 100 Einzelwerten lässt sich der Glomeruloskleroseindex wie folgt berechnen:
43210
43210 )4()3()2()1()0(
nnnnn
nnnnnGSI
++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅
= (1)
(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Glomerula mit Stadium 0 bis 4)
3.7.1.2 Mesangiolyseindex (MSI)
Neben dem GSI dient auch der Mesangiolyseindex (MSI) der Erfassung eines
glomerulären Schadens. Wiederum an PAS-gefärbten Paraffinschnitten beurteilte man
hierfür den Verlust an Mesangiumzellen und die damit einhergehenden
Kapillaraussackungen unter dem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung.
Einhundert Glomerula wurden untersucht und das Ausmaß ihrer Schädigung 5
verschiedenen Stadien zugeordnet (siehe Tabelle 6).
Tabelle 6: Stadien der Mesangiolyse
Stadium Histologische Veränderungen Anteil der Veränderung des Konvoluts
0 Keine Veränderung der Kapillaren 0 % 1 Erweiterung einzelner Kapillaren <25 %
27 Material und Methodik
2 Erweiterung von Kapillaren
ODER Kapillaraneurysma
> 25 %
< 50 % 3 Kapillaraneurysma 50 – 75 % 4 Kapillaraneurysma > 75 %
Der Mesangiolyseindex errechnet sich aus den 100 Einzelwerten wie folgt:
43210
43210 )4()3()2()1()0(
nnnnn
nnnnnMSI
++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅=
(2)
(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Glomerula mit Stadium 0 bis 4)
3.7.1.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex (TSI )
Zur Beurteilung tubulärer und interstitieller Veränderungen wurden die Sirius-gefärbten
Präparate unter dem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung mäanderförmig
durchfahren und pro Niere jeweils 40 Gesichtsfelder in der Mark-Rinden-Grenze
beurteilt. Eine Einteilung in 4 Schweregrade erfolgte nach der Methode von Véniant et
al. [75] (vgl. Tabelle 7).
Tabelle 7: Stadien der tubulointerstitiellen Schädigung
Stadium Histologische Veränderungen
Anteil der tubulointerstitiellen Schädigung am Gesichtsfeld
0 Normales Tubulussystem 0 %
1 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie
< 25 %
2 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation
25 – 50 %
3 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation
> 50 %
Aus den 40 Einzelwerten lässt sich der tubulointerstitielle Schädigungsindex (TSI) wie
folgt berechnen:
3210
3210 )3()2()1()0(
nnnn
nnnnTSI
+++⋅+⋅+⋅+⋅
= (3)
(n0, n1, n2, n3: Anzahl der bestimmten Gesichtsfelder mit Stadium 0 bis 3)
28 Material und Methodik
3.7.1.4 Vaskulärer Schädigungsindex (VSI)
Auch vaskuläre Veränderungen sind Marker, die auf eine Schädigung des Glomerulums
hinweisen. Entscheidend ist dabei das Ausmaß der Gefäßwandverdickung und der
fibrinoiden Nekrose der Aa. arcuatae, der Aa. interlobulares und der Kapillaren im
Nierenrindenbereich. Unter dem Lichtmikroskop wurden dabei in 200-facher
Vergrößerung 40 Gesichtsfelder pro Tier untersucht. Gemäß der Methode von Véniant
et al. [75] erfolgte die Einteilung in 5 Stadien (vgl. Tabelle 8).
Tabelle 8: Stadien der vaskulären Schädigung
Stadium Histologische Veränderungen Gefäßwandverdickung 0 Normale Gefäße 0 %
1 Geringe Gefäßwandverdickung < 25 %
2 Moderate Gefäßwandverdickung 25 – 50 %
3 Schwere Gefäßwandverdickung > 50 %
4 Fibrinoide Nekrose der Gefäße
Der Vaskuläre Schädigungsindex (VSI) errechnet sich aus den 40 Einzelwerten wie
folgt:
43210
43210 )4()3()2()1()0(
nnnnn
nnnnnVSI
++++⋅+⋅+⋅+⋅+⋅= (4)
(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Gefäße mit Stadium 0 bis 4)
3.7.2 Morphometrische und stereologische Untersuchu ng der Glomerula
3.7.2.1 Morphometrie und Stereologie
Morphometrie (griechisch: Gestaltmessung) und Stereologie (griechisch: Raumlehre)
sind Begriffe aus der Naturwissenschaft und bezeichnen Verfahren, die bei der
Beschreibung räumlicher Strukturen Verwendung finden.
Morphometrische Verfahren dienen der quantitativen Analyse von Partikeln und
Strukturelementen [57]. Mit Hilfe stereologischer Methoden ist es möglich, aus
zweidimensionalen Abbildungen dreidimensionaler Strukturen Informationen über
deren dreidimensionale Struktur zu erhalten [78, 79]. Ermöglicht wird dies durch die
Gesetze der geometrischen Wahrscheinlichkeit, wonach sich eine dreidimensionale
Struktur anhand ihrer zufällig getroffenen zweidimensionalen Abschnitte abbildet. Das
29 Material und Methodik
bedeutet, dass nach adäquatem „Sampling“ Aussagen über die räumliche Struktur eines
Gewebes im histologischen Schnittpräparat gemacht werden können.
3.7.2.2 Punktezählverfahren
Ein Beispiel für die Anwendung stereologischer Verfahren gibt das Delesse’sche
Prinzip [22], das besagt, dass die volumetrische Zusammensetzung eines Gewebes,
unabhängig von seiner Orientierung, direkt in der Flächenzusammensetzung der
Schnittflächen repräsentiert ist. Somit kann das Volumen einer Struktur anhand eines
histologischen Schnittes durch das sog. Punktezählverfahren ermittelt werden. Dazu
wurde im aktuellen Versuch ein 10er Okular mit einer Integrationsplatte (Firma
Olympus, Hamburg, Deutschland), auf dem sich ein quadratisches Gitter mit 121
symmetrisch verteilten Punkten befand, verwendet. Durch das Okular projizierte sich
das Messgitter auf den jeweiligen histologischen Schnitt.
Der gemessene zweidimensionale Flächenanteil AA einer Struktur entspricht nun,
gemäß des Delesse’schen Prinzips, ihrem Volumenanteil VV. Damit ergibt sich folgende
Formel:
AA = VV (5)
Es kann gefolgert werden, dass die Zahl der gezählten Punkte PP eines Messgitters, die
auf das zu messende Gewebe projiziert werden, deren Flächenanteil entspricht. Somit
ergibt sich:
PP = AA (6)
PP steht dabei für die Anzahl der gezählten Punkte des Messgitters, die zufällig auf die
zu vermessende Struktur fallen, im Verhältnis zur Gesamtpunktzahl des Gitters.
Aus den beiden oben genannten Formeln ergibt sich dann:
PP = AA = VV (7)
Das bedeutet, dass der Volumenanteil VV dem Anteil der Trefferpunkte PP, bezogen auf
die Gesamtpunktzahl, entspricht.
30 Material und Methodik
3.7.2.3 Morphometrische Untersuchung des glomerulär en Umfangs, der Fläche, des Volumens sowie des minimalen und maxima len Durchmessers an Paraffinschnitten
Mit Hilfe eines halbautomatischen Bildanalysesystems (Analysis Pro, SIS, Münster,
Deutschland) wurden an PAS-gefärbten Paraffinschnitten in 400-facher Vergrößerung
planimetrische Untersuchungen der oben genannten glomerulären Parameter
durchgeführt. Dabei wurde der Leuchtpunkt einer Steuerungsmaus über ein
Spiegelsystem des Mikroskops in den Strahlengang projiziert. Damit konnte die zu
vermessende Struktur umfahren und markiert werden. Unter mäanderförmigem
Abfahren der Nierenrinde konnte auf diese Weise von 50 Glomerula pro Tier der
Umfang der Kapillarknäuel manuell umfahren und mit Hilfe des angeschlossenen
Bildanalysesystems die glomeruläre Fläche berechnet werden. Auch der minimale und
maximale Durchmesser eines Glomerulums konnten auf diese Art bestimmt werden.
Das Volumen eines Glomerulum konnte anhand folgender Formel aus der Fläche
bestimmt werden:
[ ] 3/2²)(04,1
38,1mmFläche⋅ = Volumen in mm³ (8)
3.7.2.4 Morphometrische Untersuchung des Kapillarko nvoluts und der glomerulären Zellen an Semidünnschnitten
An den gemäß Abschnitt 3.6.2.2 angefertigten Semidünnschnitten wurden quantitative
Untersuchungen der Feinstruktur der Glomerula durchgeführt. Unter dem
Lichtmikroskop wurden pro Tier zufällig 20 Glomerula ausgewählt und in 1000-facher
Vergrößerung unter Verwendung von Immersionsöl ausgewertet.
Zunächst wurde die Anzahl folgender Zellen und Strukturen ausgezählt:
- Podozyten
- Mesangiumzellen
- Endothelzellen
- Parietalzellen
- Kapillaranschnitte
31 Material und Methodik
Außerdem wurden, gemäß des unter Abschnitt 3.7.2.2 erläuterten Punktezählverfahrens,
pro Glomerulum die Anzahl der Gitterpunkte des Zählgitters ermittelt, die jeweils auf
eine der folgenden Strukturen entfiel:
- Podozyten
- Mesangiumzellen
- Endothelzellen
- Parietalzellen
- Kapillaranschnitte
- Bowman-Kapselraum
- Mesangiale Matrix
Bei Auszählung am Gitterrand liegender Zellen wurden nur 2 der 4 Außenseiten in
Betracht gezogen. Glomerula, deren Größe das Gitter überschritt, wurden getrennt
ausgewertet, indem man das Gitter auf die Überschnittfläche erneut ansetzte und den
Überschnitt auszählte.
Nach den oben erwähnten Messungen konnten mit Hilfe der in den folgenden
Abschnitten dargestellten Formeln die morphometrischen Eigenschaften der Glomerula
und bestimmter Zelltypen ermittelt werden.
Die Fläche der dabei verwendeten Integrationsplatte mit 121 (11x11) Gitterpunkten
betrug entsprechend der 1000-fachen Vergrößerung 9,801 ⋅ 10-3 mm².
Längendichte der Kapillaren
Eine Berechnung der Längendichte der Kapillaren setzt die Kenntnis der Anzahl der
Kapillaranschnitte pro Fläche Kapillarkonvolut (QA) voraus. Diese wird ermittelt aus
der Anzahl der Kapillaranschnitte pro Glomerulum (nkap) im Verhältnis zur Fläche des
Kapillarkonvoluts Akon:
QA = nkap / Akon [1/mm²] (9)
Akon errechnet sich aus der Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf das Kapillarkonvolut
entfallen (GPkon), und der Gitterfläche.
32 Material und Methodik
Akon = (GPkon/121) ⋅ 9,801 ⋅ 10-3 [mm²] (10)
GPkon schließt dabei alle Gitterpunkte, die auf Endothelzellen (ez), Podozyten (pz),
Mesangiumzellen (mz), Kapillaranschnitte (kap) und mesangiale Matrix (mm) entfallen,
ein. Es ergibt sich somit:
GPkon = GPez + GPpz + GPmz + GPkap + GPmm (11)
Volumendichte der Kapillaren
Das Verhältnis von Gitterpunkten, die auf Kapillaranschnitte entfielen (GPkap), zur
Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf dem Kapillarkonvolut zu liegen kamen, entspricht
der Volumendichte der Kapillaren (Vvkap ).
Es ergibt sich somit folgende Formel:
Vvkap = (GPkap/ GPkon) ⋅ 100 [%] (12)
Mittlere Kapillarquerschnittsfläche
Aus der Volumendichte der Kapillaren kann die mittlere Kapillarquerschnittsfläche a
ermittelt werden. Da Vvkap in Prozent angegeben wird, ist eine Multiplikation mit 0,01
nötig.
a = (Vvkap / L vkap) ⋅ 0,01 ⋅ 106 [µm²] (13)
Volumendichte der jeweiligen Zellart
Die Volumendichte der jeweiligen Zellart pro Glomerulum (VvZellen) entspricht dem
Verhältnis der Gitterpunktzahl, die auf die jeweilige Zellart entfallen (GPZellen), zu der
sich auf das gesamte Konvolut projizierenden Gitterpunktzahl (GPkon):
VvZellen = GPZellen / GPkon ⋅ 100 [%] (14)
Die Volumendichte wurde für Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen
bestimmt.
33 Material und Methodik
Gezählte Zellart pro Fläche
Die Anzahl der gezählten Zellen pro Glomerulumfläche (nAZellen) wird wie folgt
berechnet:
nAZellen = n Zellen /Akon [1/mm²] (15)
nZellen steht dabei für die ausgezählte Zellzahl der jeweiligen Zellart (Podozyten,
Mesangiumzellen und Endothelzellen) pro Glomerulum.
Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart
Aus der Volumendichte der jeweiligen Zellart (VvZellen) und dem mittleren
glomerulären Volumen (Vglom semi) kann das Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart
(VgesZellen) bestimmt werden. Da die Volumendichte in Prozent angegeben wird, muss
auch hier der Faktor 0,01 in die Formel einfließen:
VgesZellen = VvZellen ⋅ Vglom semi ⋅ 0,01 [10³µm³] (16)
Es wurde das Gesamtvolumen von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen
berechnet.
Vglom semi wurde dabei wie folgt ermittelt
Vglom semi = (β/κ) x Akon 3/2 ⋅ 106 [10³ µm³] (17)
Dabei ist κ der Größenkoeffizient der untersuchten Strukturen und hat, in Abhängigkeit
von Form und Volumendichte, in diesem Fall den Wert 1,04. Der Koeffizient β fungiert
als Formfaktor, der die Gestalt der gemessenen Partikel beschreibt und der für die
annähernd sphärische Form der Glomerula 1,38 beträgt [56].
Nummerische Dichte der jeweiligen Zellart pro Konvo lutvolumen
Folgende Gleichung gilt für die Berechnung der nummerischen Dichte einer Zellart pro
Konvolutvolumen (NVZellen) :
NVZellen = (κ /β) ⋅ [nAZellen3/2/ (VvZellen ⋅ 0,01)1/2] [1/mm³] (18)
34 Material und Methodik
Der Koeffizient κ hat stets den Wert 1,04, während β für Mesangium- und
Endothelzellen den Wert 1,4 und für Podozyten den Wert 1,5 besitzt.
Gesamtzahl der jeweiligen Zellart
Aus der nummerischen Dichte der Zellen (NVZellen ) und dem mittleren glomerulären
Volumen (Vglom semi ) kann die Gesamtzahl der jeweiligen Zellart (ngesZellen) ermittelt
werden:
ngesZellen = NVZellen ⋅ Vquer glom / 106 (19)
Gesamtzahl der Zellen pro Glomerulum
Aus der Addition der Zellzahlen aller Zellarten (Podozyten, Mesangiumzellen und
Endothelzellen) ergibt sich die Anzahl aller Zellen eines Glomerulums:
ngesGlom = ngesPod + ngesMes + ngesEnd (20)
Durchschnittliches Volumen der jeweiligen Zellart
Das durchschnittliche Volumen (VZellen) der jeweiligen Zellart wird folgendermaßen
berechnet:
VZellen = VgesZellen/ ngesZellen [10³µm³] (21)
3.8 Statistik
Von sämtlichen gemessenen und errechneten Parametern aller sechs Versuchsgruppen
wurden im Rahmen einer statistischen Untersuchung zunächst Mittelwerte und
Standardabweichungen der jeweiligen Gruppe ermittelt. Diese wurden computergestützt
mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (Version 15.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois,
USA) verglichen und auf signifikante Unterschiede hin untersucht.
35 Material und Methodik
Dabei wurden die Messwerte auf Normalverteilung und Homogenität getestet. Als
normalverteilt und homogen galten die Werte, wenn sie in der Darstellung als Boxplots
diesen Kriterien entsprachen.
Für die Mehrfachvergleiche zwischen den verschiedenen Gruppen wurde bei nicht
normalverteilten bzw. nicht homogenen Werten der Kruskal-Wallis-Test eingesetzt. Ein
signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde für eine Irrtumswahrschein-
lichkeit (p) ein Wert von kleiner als 0,05 angenommen. War dieser gegeben, wurde
anschließend ein paarweiser Gruppenvergleich mit Hilfe des nicht-parametrischen
Wilcoxon-Rangsummentests (U-Test) durchgeführt. Signifikanz wurde auch hier
angenommen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit (p) unter 0,05 lag.
Unterschiede zwischen den nicht diabetogenen Gruppen ZDF-lean/ZDF-L-P und den
diabetogenen ZDF-fatty/ZDF-F-P/-Met/-EMD wurden wegen der mangelnden
Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Genotypen nicht berücksichtigt und nur in
bestimmten Graphiken zur Verdeutlichung mit angegeben. Auf Differenzen zwischen
den Paaren ZDF-lean und ZDF-fatty sowie zwischen ZDF-L-P und ZDF-F-P wird in
den Wertetabellen verwiesen, sie werden jedoch der Übersichtlichkeit halber nicht
graphisch dargestellt.
37 Ergebnisse
4 Ergebnisse
Die in dieser Arbeit vorgestellten histopathologischen Parameter wurden für die Tiere
aller Gruppen in eigenen Untersuchungen ermittelt, während die laborchemischen
Untersuchungsdaten von den Laboratorien der Firma Merck® (Darmstadt, Deutschland)
zur Verfügung gestellt und nur für die Tiere der Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-
Met und ZDF-F-EMD erhoben wurden. Die Daten zu Körpermaßen der Tiere, die
ebenfalls durch die Firma Merck® ermittelt wurden, standen für die Tiere aller Gruppen
zur Verfügung.
Die Zahl der untersuchten Tiere pro Gruppe unterschied sich bei den jeweiligen
Parametern. Bei den an Semidünnschnitten untersuchten Größen wurden jeweils vier
Tiere pro Gruppe ausgewertet, während für die an Paraffinschnitten durchgeführten
Messungen folgende Gruppengrößen zur Verfügung standen:
- ZDF-lean: n = 10
- ZDF-fatty: n = 9
- ZDF-L-P: n = 8
- ZDF-F-P: n = 8
- ZDF-F-Met: n = 10
- ZDF-F-EMD: n = 9
Die Differenz zwischen den Gruppengrößen bei Versuchsbeginn und den tatsächlich
ausgewerteten Tieren entstand durch den vorzeitigen Tod von Versuchstieren sowie
durch Organpathologien und Artefakte bei der Gewebeaufbereitung, die eine adäquate
Auswertung verhinderten.
Die Labordaten und Tierparameter waren bis auf die Gruppe ZDF-L-P, die nur 9 Tiere
umfasste, vollständig (10 Tiere pro Gruppe). Standen für den statistischen Vergleich bei
einzelnen Parametern weniger Tiere pro Gruppe zur Verfügung, wurde dies in der
zugehörigen Wertetabelle vermerkt.
38 Ergebnisse
4.1 Tierparameter
Tabelle 9: Körpergewicht, Körperlänge, Nierengewicht
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P
ZDF-F-Met
ZDF-F-EMD
Kruskal-Wallis-Test
Körpergewicht bei Versuchs-ende (g)
265±19,5ae 349±27,0b 387±20,9 421±62,5 481±79,0 461±110,4 p<0,001
∆ KG nach Behandlung (g)
- - 120±27,2 80±60,6 133±79,9 117±105,7 n. s.
Körpergröße (mm) [Gruppe ZDF-fatty: n = 9]
216±6,2a 218±6,2b 235±3,5 229±7,5 233±4,8 228±4,3d p<0,001
Nierengewicht (g) 0,83±0,06ae 1,11±0,14 1,02±0,06 1,51±0,11ae 1,50±0,09 1,53±0,19 p<0,001
a: p<0,001 vs. ZDF-L-P b: p<0,01 vs. ZDF-F-P c: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD d: p<0,05 vs. ZDF-F-Met e: p<0,001 vs. ZDF-fatty Der Wert ∆ KG entspricht der Differenz der Körpergewichte der Tiere aus den Gruppen
ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD vor und nach 16-wöchiger
Behandlung.
4.1.1 Körpergewicht
Abbildung 2: Körpergewicht
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
0
100
200
300
400
500
600
700
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
g
10 Wochen
26 Wochen
p < 0,001
p < 0,01
*
39 Ergebnisse
Erwartungsgemäß wogen sowohl die Tiere der Gruppe ZDF-L-P als auch der Gruppe
ZDF-F-P nach 16-wöchiger Placebo-Behandlung signifikant mehr als die Tiere der
Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty, die bereits nach den ersten 10 Versuchswochen
untersucht wurden.
Im Vergleich zum Placebo führten sowohl Metformin als auch EMD zu einer stärkeren
Gewichtszunahme, jedoch waren die Unterschiede nicht signifikant.
4.1.2 Körpergröße
Abbildung 3: Körpergröße
Mit durchschnittlich 228 mm war die Körpergröße der mit EMD behandelten Tiere
signifikant geringer als die der mit Metformin behandelten Tiere (233 mm). Sie lag
somit näher an derjenigen der mit Placebo behandelten Tiere (229 mm).
Erwartungsgemäß unterscheiden sich die mit Placebo behandelten Tiere sowohl
hinsichtlich des Körpergewichts als auch hinsichtlich der Körpergröße signifikant von
den nicht medikamentös behandelten Tieren.
0
50
100
150
200
250
300
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mm
p < 0,001
p < 0,01
p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
40 Ergebnisse
4.1.3 Nierengewicht
Abbildung 4: Nierengewicht
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
g
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen. ◊◊◊◊: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen außer zur Gruppe ZDF-fatty.
Das durchschnittliche Nierengewicht unterschied sich nicht signifikant zwischen den
mit Placebo, Metformin und EMD behandelten Gruppen, nahm aber mit zunehmendem
Alter der Tiere signifikant zu.
4.2 Futter- und Wasseraufnahme
Tabelle 10: Futter- und Wasseraufnahme
ZDF-L-P (n=9)
ZDF-F-P (n=10)
ZDF-F-Met (n=10)
ZDF-F-EMD (n=10)
Kruskal-Wallis-Test
Futteraufnahme (g/24h)
12,5±4,58 32,5±10,36a 31,6±4,67 34,4±5,21 p<0,001
Wasseraufnahme (ml/24h)
16,3±4,88 126,9±43,38b 86,5±37,77 107,3±51,33 p<0,001
a: p<0,01 vs. ZDF-L-P b: p<0,001 vs. ZDF-L-P Die Tiere der Gruppe ZDF-F-P nahmen jeweils signifikant mehr Wasser und Nahrung
zu sich als die Tiere der Gruppe ZDF-L-P. Signifikante Unterschiede zwischen den
medikamentös behandelten Gruppen zeigten sich nicht.
p < 0,001
p < 0,001
10 Wochen
26 Wochen
*
◊◊◊◊
41 Ergebnisse
4.3 Urinparameter
Tabelle 11: Urinparameter
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD Kruskal-
Wallis-Test
Diurese (ml/24h) 8,8±3,06a 125,1±38,9b 85,1±40,7 100,73±51,5 p<0,001
Albumin-Exkretion
(mg/24h)
[Gruppe ZDF-L-P:
n=9)
0,48±0,35a 208,9±105,7 186,0±171,1 233,4±335,1 p<0,001
Kreatinin-Exkretion
(mmol/24h)
94,6±32,5 89,3±14,3 96,2±16,3 92,1±12,2 n.s.
S-Kreatinin (µmol/l)
[Gruppen ZDF-F-P,
ZDF-F-Met, ZDF-F-
EMD: n=9]
35,7±8,59 28,3±14,3 17,4±9,52 23,7±13,0 p<0,05
Kreatinin-Clearance
(ml/min)
[Gruppen ZDF-F-P,
ZDF-F-Met, ZDF-F-
EMD: n=9]
2,08±1,28 3,04±2,45b 4,93±2,72 4,13±3,93 p<0,05
Harnstoff-Exkretion
(mg/24h)
[Gruppe ZDF-F-P:
n=4; Gruppe ZDF-F-
EMD: n=9]
654,4±199,9 603,7±202,3 663,6±371,5 538,8±423,3 n.s.
U-Albumin/Kreatinin-
Ratio
0,05±0,02a 20,72±9,75 17,22±14,76 25,64±41,56 P<0,001
a: p<0,001 vs. ZDF-F-P
b: p<0,05 vs. ZDF-F-Met
42 Ergebnisse
4.3.1 Diurese
Abbildung 5: Diurese
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
ml/m
in
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die Tiere der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P zeigten am Ende des
Experiments eine signifikant höhere Diurese als die mit Metformin behandelten Tiere.
Auch die Diureserate der mit EMD behandelten Tiere war tendenziell niedriger als die
der Placebo-Gruppe. Mit durchschnittlich 101 ml/24 h lag sie jedoch 16 % über der
Diureserate der Gruppe ZDF-F-Met.
4.3.2 Albumin-Exkretion
Abbildung 6: Albumin-Exkretion
0
100
200
300
400
500
600
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mg/
24 h
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
p < 0,001
*
*
43 Ergebnisse
Ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Albumin-Ausscheidung zeigte sich
lediglich zwischen den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P. Eine signifikante Differenz
zwischen den drei mit Placebo, Metformin oder EMD behandelten Gruppen zeigte sich
nicht. Die höchste Albumin-Exkretion wiesen die Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD auf.
Diese Verhältnismäßigkeit blieb auch beim Bezug auf die Kreatinin-Ausscheidung
gleich.
4.3.3 Kreatinin
Die Kreatinin-Exkretion unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant. Das
Serum-Kreatinin unterschied sich zwischen den mit Placebo, Metformin und EMD
behandelten Tieren ebenfalls nicht signifikant. Dieser Retentionsparameter wies jedoch
bei der mit Metformin behandelten Gruppe die geringsten Werte auf, während Tiere der
Gruppe ZDF-L-P die höchsten Werte zeigten.
Abbildung 7: Serum-Kreatinin
0
10
20
30
40
50
60
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
µmol
/l
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) besteht zu den Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-
EMD.
*
44 Ergebnisse
4.3.4 Kreatinin-Clearance
Abbildung 8: Kreatinin-Clearance
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
ml/m
in
Am Ende des Experiments konnte eine signifikant höhere Kreatinin-Clearance bei den
mit Metformin behandelten Tieren gegenüber der Placebo-Gruppe verzeichnet werden.
Auch die Kreatinin-Clearance der mit EMD behandelten Tiere lag um 26 % höher als
die der Placebo-Gruppe, jedoch fand sich hier kein signifikanter Unterschied.
4.3.5 Harnstoff-Exkretion
Die Harnstoff-Exkretion zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Gruppen.
4.4 Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsel s
Tabelle 12: Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD Krsukal-
Wallis-Test
Serum-Glucose
(mg/dl)
118,2±10,2a 508,6±166, 5 435, 5±125,5 427,8±163,9 p<0,001
Urin-Glucose
(g/dl)
0,03±0,02a 10,10±1,37 10,20±3,23c 7,83±4,22 p<0,001
Serum-Insulin
(ng/ml)
[Gruppe ZDF-
F-EMD: n=9]
0,79±0,17a 2,58±1,19 5,23±6,70 4,49±3,66 p<0,001
HbA1c (%) 2,23±0,39b 5,59±2,07 5,07±1,12 6,06±2,42 p<0,001
p < 0,05
45 Ergebnisse
Serum-Natrium
(mmol/l)
[Gruppe ZDF-
F-Met: n=8]
151±1,57b 144±3,44 144±3,74 145±3,45 p<0,01
Serum-Kalium
(mmol/l)
[Gruppe ZDF-
F-Met: n=8]
4,68±0,21 4,88±0,41 4,63±0,28 4,65±0,26 n.s.
Serum-Calcium
(mmol/l)
[Gruppe ZDF-
F-Met: n=8]
2,72±0,08 2,69±0,11 2,75±0,16 2,83±0,11 n.s.
Serum-Chlorid
(mmol/l)
[Gruppe ZDF-
F-Met: n=8]
97,8±1,09b 89,5±3,91 88,5±2,51 88,9±2,78 p<0,01
Serum-Lactat
(mmol/l)
[Gruppe ZDF-
F-Met: n=8]
2,90 ±0,48b 3,95±0,53 5,30±0,63a 5,39±0,80a p<0,001
Serum-
Cholesterin
(mg/dl)
126±23,1b 224±59,4 270±63,19 243±45,8 p<0,001
Serum-LDL
(mg/dl)
31,5±15,9 39,5±15,3 34,3±13,6 37, 8±16,4 n.s.
Serum-HDL
(mg/dl)
43,9±10,6a 90,1±23,1 108,3±39,3 97,9±24,1 p<0,001
a: p<0,001 vs. ZDF-F-P; b: p<0,01 vs. ZDF-F-P; c: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD
46 Ergebnisse
4.4.1 Parameter des Glucosestoffwechsels
Abbildung 9: Serum-Glucosespiegel
0
100
200
300
400
500
600
700
800
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mg/
dl
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Neben den erwartungsgemäß stark erhöhten Blutzuckerwerten der diabetischen Tiere
der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF- F-EMD im Vergleich zur Gruppe ZDF-
L-P zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. Die mit EMD
behandelten Tiere wiesen zwar im Vergleich zur Placebo-Gruppe einen um 16 %
niedrigeren Glucosespiegel auf, allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant.
Im Zeitverlauf wiesen die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P zu allen
Messzeitpunkten die niedrigsten Serum-Glucosespiegel auf, während bei den Tieren der
Gruppe ZDF-F-P stets die höchsten Blutzuckerwerte gemessen wurden. Während die
Serum-Glucosespiegel der mit EMD behandelten Tiere zu den ersten beiden
Messzeitpunkten über denjenigen der mit Metformin behandelten Tiere lagen, wurden
nach 22 und 26 Wochen in der Gruppe ZDF-F-EMD geringfügig niedrigere Werte für
die Serum-Glucose gemessen als in der Gruppe ZDF-F-Met. Signifikant waren die
Unterschiede zwischen diesen beiden Gruppen jedoch zu keinem Messzeitpunkt.
Tabelle 13: Serum-Glucosespiegel im Zeitverlauf.
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Serum-Glucose nach
10 Wochen (mg/dl)
139,0±35,1a 380,7±111,9 342,6±143,9 362,9±124,4
Serum-Glucose nach
14 Wochen (mg/dl)
150,9±16,1a 434,5±150,1b 287,4±177,3 353,5±167,7
*
47 Ergebnisse
Serum-Glucose nach
18 Wochen (mg/dl)
143,0±22,7a 460,0±131,3 352,6±165,4 418,3±187,0
Serum-Glucose nach
22 Wochen (mg/dl)
141,2±18,2a 624,4±86,2 554,4±186,3 538,3±166,2
Serum Glucose nach
26 Wochen (mg/dl)
118,2±10,2a 508,6±166,5 435,5±125,5 427,8±163,9
a: p< 0,001 vs. ZDF-F-P b: p< 0,05 vs. ZDF-F-Met
Abbildung 10: Urin-Glucosespiegel
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mg/
dl
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die Urin-Glucosekonzentration war bei den mit EMD behandelten Tieren signifikant
gegenüber den mit Metformin behandelten Tieren erniedrigt. Auch eine nicht
signifikante Verminderung um 23 % gegenüber der Placebo-Gruppe war hier zu
verzeichnen.
p < 0,05
*
48 Ergebnisse
Abbildung 11: Serum-Insulinspiegel
0
2
4
6
8
10
12
14
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
ng/m
l
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Unter den Tieren der diabetogenen Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD
waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Serum-Insulin-Konzentration zu
verzeichnen. Auf Grund der Insulinresistenz in diesen Gruppen wiesen die Tiere
deutlich höhere Spiegel auf, als die Tiere der Gruppe ZDF-L-P, die keinen Diabetes
ausbilden.
Tabelle 14: Serum-Insulinspiegel im Zeitverlauf.
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Serum-Insulin nach
10 Wochen (ng/ml)
0,62±0,32a 15,64±9,61 16,60±7,36 15,74±9,10
Serum-Insulin nach
14 Wochen (ng/ml)
0,62±0,25a 9,07±9,43 10,54±5,47b 5,80±5,22
Serum-Insulin nach
18 Wochen (ng/ml)
0,65±0,33a 5,22±3,90 9,80±7,58 5,83±4,21
Serum-Insulin nach
22 Wochen (ng/ml)
1,16±0,93a 4,21±2,62 8,32±8,07 8,73±8,45
Serum-Insulin nach
26 Wochen (ng/ml)
0,79±0,17a 2,58±1,19 5,23±6,70 4,49±3,66
a: p<0,001 vs. ZDF-F-P b: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD
*
49 Ergebnisse
Bei der Untersuchung der Serum-Insulinspiegel im Zeitverlauf wiesen die mit Placebo
behandelten Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P zu allen Messzeitpunkten (Ausnahme:
Messung nach 14 Wochen) geringere Insulinspiegel im Blut auf als die medikamentös
behandelten Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD. Die höchsten Serum-
Insulinspiegel wurden bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-Met gemessen, wobei der
Unterschied zu den Tieren der Gruppe ZDF-F-EMD lediglich bei der Messung nach 14
Wochen signifikant war. Zu den anderen Messzeitpunkten zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede zwischen den diabetogenen Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met
und ZDF-F-EMD.
Abbildung 12: HbA 1c im Blut
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
%
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die Tiere der 16 Wochen lang behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-
EMD unterschieden sich nicht signifikant bezüglich ihres HbA1c-Wertes. Als Indikator
für einen chronisch erhöhten Blutzucker war dieser Parameter jedoch in der Gruppe
ZDF-F-P signifikant gegenüber der nicht diabetogenen Gruppe ZDF-L-P erhöht.
*
50 Ergebnisse
Abbildung 13: Serum-Laktat
0
1
2
3
4
5
6
7
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mm
ol/l
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Sowohl die mit Metformin als auch die mit EMD behandelten Tiere wiesen am Ende
der Behandlung signifikant höhere Laktatspiegel im Serum auf als die Placebo-Gruppe.
Die Werte der Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD unterschieden sich kaum. Die
niedrigsten Laktatspiegel wies die Gruppe ZDF-L-P auf.
4.4.2 Elektrolyte
Abbildung 14: Serum-Natrium
138
140
142
144
146
148
150
152
154
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mm
ol/l
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die mittleren Natrium-Konzentrationen befanden sich bei allen Tieren der Gruppe ZDF-
fatty im Normbereich (135-145 mmol/l). Bei Tieren der Gruppe ZDF-L-P war der Wert
mit durchschnittlich 150,7 mmol/l leicht erhöht und lag signifikant über dem
Durchschnittswert der Gruppe ZDF-F-P.
p < 0,001
p < 0,001
*
*
51 Ergebnisse
Die Kaliumkonzentrationen unterschieden sich zwischen den Gruppen nicht signifikant.
Abbildung 15: Serum-Calcium
Die mittleren Calcium-Konzentrationen aller Gruppen lagen geringfügig über dem
Normbereich von 2,2-2,6 mmol/l. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen
zeigten sich dabei nicht.
Abbildung 16: Serum-Chlorid
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P wiesen signifikant höhere
Serum-Chlorid-Spiegel auf als die ebenfalls mit Placebo behandelten diabetogenen
Tiere der Gruppe ZDF-F-P.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mm
ol/l
0
20
40
60
80
100
120
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mm
ol/l
*
52 Ergebnisse
Zwischen den Tieren der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD waren nur
unwesentliche Unterschiede zu verzeichnen. Bei allen Gruppen lag die mittlere Serum-
Chloridkonzentration im Normbereich (97-108 mmol/l).
4.4.3 Parameter des Fettstoffwechsels
Abbildung 17: Serum-Cholesterin
0
50
100
150
200
250
300
350
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mg/
dl
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die Serum-Cholesterinwerte aller diabetogenen Gruppen lagen außerhalb des
Normbereichs (< 200 mg/dl). Damit unterschieden sie sich signifikant von der Gruppe
ZDF-L-P. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen mit durchschnittlich 243 mg/dl
niedrigere Gesamt-Cholesterin-Werte auf als die mit Metformin behandelten (270
mg/dl), wobei jedoch keine Signifikanz bestand.
Abbildung 18: Serum-HDL
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
mg/
dl
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Zwischen den 16 Wochen lang behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-
F-EMD fand sich auch bei den mittleren Konzentrationen des Serum-HDL kein
signifikanter Unterschied. Entsprechend der Gesamtcholesterinwerte zeigten sich bei
*
*
53 Ergebnisse
der Gruppe ZDF-L-P signifikant niedrigere Durchschnittswerte als bei den anderen
Gruppen. Die höchsten Serum-HDL-Spiegel konnten bei den mit Metformin
behandelten Tieren gemessen werden.
Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zeigten sich dagegen bei den
LDL-Konzentrationen im Serum.
4.5 Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren
Tabelle 15: Schädigungsindizes und Morphometrie der Nieren
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P
ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis-
Test
GSI1 (Score) 0,18±0,10ac 0,42±0,26 0,34±0,13 0,57±0,09c 0,44±0,10e 0,40±0,06f p<0,001
MSI2
(Score)
0,19±0,04b 0,33±0,06 0,24±0,10 0,29±0,07 0,24±0,05 0,24±0,07 P<0,01
TSI3 (Score) 1,50±0,25 1,35±0,17 1,72±0,14 1,62±0,19a 1,18±0,15f 0,93±0,16fg p<0,001
VSI4 (Score) 0,21±0,13c 0,22±0,10 0,64±0,50 0,54±0,33a 0,64±0,49 0,18±0,18eg p<0,001
Umfang des
Kapillar-
konvoluts
(µm)
335±13,4ac 373±30,9 369±34,6 420±12,8ac 415±12,6 422±19,0 p<0,001
Fläche des
Kapillar-
konvoluts
(µm²)
5515±344bd 6898±458 6756±478 9610±486bd 9648±729 10219±652eg p<0,001
Volumen
des Kapillar-
konvoluts
(10³ µm³)
548±49,5bd 767±77,2 740±85,3 1235±162,4bd 1267±146,1 1382±130,6eg p<0,001
Größter
Durch-
messer des
Kapillar-
konvoluts
(µm)
92,4±2,05bd 103,9±2,97 101,9±3,01 120,7±3,13bd 121,9±4,61 125,4±4,03eg p<0,001
Kleinster
Durch-
messer des
Kapillar-
konvoluts
(µm)
72,9±3,79ad 79,7±4,11 80,7±3,21 96,9±2,53bd 96,1±3,92 99,4±2,95g p<0,001
54 Ergebnisse
a: p<0,05 vs. ZDF-fatty b: p<0,001 vs. ZDF-fatty c: p<0,05 vs. ZDF-L-P d: p<0,001 vs. ZDF-L-P e: p<0,05 vs. ZDF-F-P f: p<0,001 vs. ZDF-F-P g: p<0,05 vs. ZDF-F-Met
4.5.1 Glomeruloskleroseindex
Abbildung 19: Glomeruloskleroseindex
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Sco
re
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) besteht zu allen anderen Gruppen.
Der Glomeruloskleroseindex zeigte sich am Ende des Experiments bei allen „fatty“-
Gruppen stärker ausgeprägt als bei den „lean“-Gruppen. Auch ein mit der längeren
Versuchsdauer korrelierender Anstieg bei den Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-
Met und ZDF-F-EMD im Vergleich zu den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty ließ sich
beobachten. Am stärksten betroffen war dabei die Gruppe ZDF-F-P, deren
Glomeruloskleroseindex signifikant höher lag als derjenige der mit Metformin
behandelten Tiere. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen signifikant weniger
Glomerulosklerose auf als die Placebogruppe.
4.5.2 Mesangiolyseindex
Das Ausmaß der Mesangiolyse war in allen Gruppen ähnlich und lediglich in der
Gruppe ZDF-fatty signifikant höher als in der Gruppe ZDF-lean. Höhere Werte zeigten
sich auch in den mit Placebo behandelten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten
1 GSI = Glomeruloskleroseindex 2 MSI = Mesangiolyseindex 3 TSI = tubulointerstitieller Schädigungsindex 4 VSI = vaskulärer
Schädigungsindex
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,001
10 Wochen
26 Wochen
*
55 Ergebnisse
Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty, jedoch waren diese Unterschiede nicht signifikant.
Die mit Metformin und EMD behandelten Gruppen unterschieden sich im Ausmaß der
Mesangiolyse kaum voneinander.
4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex
Abbildung 20: Tubulointerstitieller Schädigungsindex
Die tubulointerstitielle Schädigung der mit Placebo behandelten Tiere der Gruppen
ZDF-L-P und ZDF-F-P nahm gegenüber den Durchschnittswerten vor der Behandlung
in den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty zu. Signifikant war dabei der Unterschied
zwischen den Gruppen ZDF-fatty und ZDF-F-P. Im Verlauf der Behandlung zeigten
sich sowohl durch Gabe von Metformin als auch durch Gabe von EMD signifikant
bessere Werte für den TSI als durch Verabreichung eines Placebopräparates. EMD
schnitt dabei signifikant besser ab als Metformin.
0
0,5
1
1,5
2
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Sco
re
p < 0,05 p < 0,001
p < 0,001
p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
56 Ergebnisse
4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex
Abbildung 21: Vaskulärer Schädigungsindex
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Sco
re
Die Schädigung der renalen Gefäße war bei den mit EMD behandelten Tieren
signifikant geringer ausgeprägt als bei den mit Placebo bzw. den mit Metformin
behandelten Tieren. Der mittlere vaskuläre Schädigungsindex konnte in der Gruppe
ZDF-F-EMD sogar auf ein Niveau gesenkt werden, das mit dem vor
Behandlungsbeginn (ZDF-fatty) vergleichbar ist.
Im Verlauf zeigte sich bei den mit Placebo behandelten Tieren jeweils eine signifikante
Zunahme der vaskulären Schäden im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen.
4.5.5 Umfang des Kapillarkonvoluts
Der Konvolutumfang wies neben dem auf Grund des längeren Beobachtungszeitraums
erwarteten Anstieg in den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P im Vergleich zu den
unbehandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen auf.
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
57 Ergebnisse
4.5.6 Durchmesser, Fläche und Volumen des Kapillark onvoluts
Abbildung 22: Größter Durchmesser des Kapillarkonvoluts
0
20
40
60
80
100
120
140
ZDF-lean ZDF-f atty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
µm
p < 0,001 p < 0,05
p < 0,05
Abbildung 23: Kleinster Durchmesser des Kapillarkonvoluts
0
20
40
60
80
100
120
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
µm
Die minimalen und maximalen Durchmesser des Kapillarkonvoluts nahmen im Verlauf
des Experiments zu, wie sich an signifikant höheren Werten der mit Placebo
behandelten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen zeigt. Außerdem
wies die Gruppe ZDF-F-EMD im Mittel signifikant höhere Durchmesser als die Gruppe
ZDF-F-Met auf. Auch im Vergleich zur Placebo-Gruppe fielen bei den mit EMD
p < 0,001
p<0,05
p<0,001
p<0,001
10 Wochen
26 Wochen
10 Wochen
26 Wochen
58 Ergebnisse
behandelten Tieren höhere Durchmesser auf. Beim maximalen Konvolutdurchmesser
war dieser Unterschied signifikant.
Auch in der Fläche und im Volumen des Kapillarkonvoluts setzte sich diese Tendenz
fort.
Abbildung 24: Fläche des Kapillarkonvoluts
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
µm²
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,001) besteht zu allen anderen Gruppen.
Die glomeruläre Konvolutfläche zeigte am Ende der Behandlung mit EMD einen
signifikanten Anstieg im Vergleich zu den Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-Met. Die mit
Placebo behandelten Tiere wiesen jeweils eine signifikante Zunahme des Volumens im
Vergleich zu den unbehandelten Gruppen auf.
Die gleichen Verhältnismäßigkeiten wie für die Fläche ergaben sich auch für das
Volumen des Kapillarkonvoluts.
10 Wochen
26 Wochen
p<0,001
p<0,001 p<0,05
p<0,05
*
59 Ergebnisse
4.6 Semidünnschnitte
Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der Auswertung der Semidünnschnitte
dargestellt.
Tabelle 16: Analyse der glomerulären Kapillaren
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis-
Test
Längendichte der
Kapillaren (1/mm²)
13564±1635 11524±581,7 12176±927,7 9375±278,9ab 9124±375,7 9170±609,2 p<0,01
Volumendichte der
Kapillaren (%)
39,9±2,63 38,6±1,41 39,4±2,99 38,2±2,04 35,8±3,86 41,9±1,32 n.s.
Mittlere
Kapillarquer-
schnittsfläche (µm²)
29,8±4,88 33,6±1,90 32,4±1,71 40,7±2,42ab 39,2±4,34d 45,6±3,04c p<0,01
a: p<0,05 vs. ZDF-fatty c: p<0,05 vs. ZDF-F-P
b: p<0,05 vs. ZDF-L-P d: p<0,05 vs. ZDF-F-EMD
Tabelle 17: Analyse der glomerulären Zellart.
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F- EMD
Kruskal-
Wallis-
Test
Volumendichte der
Podozyten (%)
3,98±0,58 3,02±0,97 3,12±0,43 2,29±0,33 2,52±0,33 3,06±0,32 n.s.
Volumendichte der
Mesangiumzellen
(%)
4,91±0,58 4,27±0,79 3,50±0,48a 3,63±0,17 4,15±0,22c 3,54±0,31d p<0,05
Volumendichte der
Endothelzellen (%)
3,57±0,31 3,04±0,51 3,10±0,41c 1,85±0,36b 1,88±0,36 3,17±0,81cd p<0,01
Gesamtvolumen
der Podozyten
(10³ µm³)
21,7±3,89 21,5±4,88 21,01±2,10 28,4±6,32 28,8±3,83 33,0±4,80 p<0,05
Gesamtvolumen
der Mesangium-
zellen (10³ µm³)
26,8±3,89 31,0±6,40 23,8±3,87c 44,7±3,74b 47,7±7,83 38,1±4,09 p<0,05
Gesamtvolumen
der Endothelzellen
(10³ µm³)
19,5±2,83 22,1±4,62 20,9±2,23 23,0±5,94 21,5±5,04 34,6±11,42 n.s.
Podozyten pro
Fläche (1/mm²)
2061±278 1456±396 1705±282c 1037±132 1264±139 1285±143 p<0,01
60 Ergebnisse
Mesangiumzellen
pro Fläche (1/mm²)
4053±913 2914±419 2788±406 2685±233 3011±101 2041±475d p<0,05
Endothelzellen pro
Fläche (1/mm²)
2657±142b 2171±158 2303±254c 1468±196b 1476±125 1805±250dc p<0,01
Podozytenzahl pro
Volumen (1/mm³)
325358
±42221
222107
±56031
276835
±52987c
153919
±24593
196079
±19869
183147
±24701
p<0,01
Mesangiumzellzahl
pro Volumen
(1/mm³)
877659
±286109
576713
±141780
594884
±91194
542692
±61583
603050
±26817
366671
±109239cd
p<0,05
Endothelzellzahl
pro Volumen
(1/mm³)
539541
±35281b
434545
±49064
467065
±54065c
307682
±36185b
310051
±40331
321979
±43734
p<0,01
Gesamtzahl der
Podozyten pro
Glomerulum
178±31,5 160±30,9 186±26,2 189±35,1 223±20,4 197±26,4 n.s.
Gesamtzahl der
Mesangiumzellen
pro Glomerulum
474±144 414±80,3 398±80,0c 670±109,5b 692±99,0 393±110,0cd p<0,05
Gesamtzahl der
Endothelzellen pro
Glomerulum
295±37,2 314±26,2 316±33,0 379±56,6 352±29,0 348±61,2 n.s.
Durchschnitts-
volumen eines
Podozyten (µm³)
122±3,5 135±17,9 114±14,7 151±33,5 129±7,0 168±20,2d p<0,05
Durchschnitts-
volumen einer
Mesangiumzelle
(µm³)
60,7±20,3 79,6±32,0 60,1±4,4 67,4±5,6 68,9±4,9 103,0±30,1 n.s.
Durchschnitts-
volumen einer
Endothelzelle
(µm³)
66,4±7,65 71,1±17,7 66,6±8,07 60,1±7,45 61,6±15,4 99,0±22,1 n.s.
a: p<0,05 vs. ZDF-lean
b: p<0,05 vs. ZDF-fatty
c: p<0,05 vs. ZDF-F-P
d: p<0,05 vs. ZDF-F-Met
61 Ergebnisse
4.6.1 Werte des Kapillarkonvoluts und der Kapillare n
Abbildung 25: Mittlere Kapillarquerschnittsfläche
0
10
20
30
40
50
60
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
µm²
Auch in den Semidünnschnitten erwies sich die mittlere Kapillarquerschnittsfläche der
Gruppe ZDF-F-EMD als signifikant höher als diejenige der mit Placebo und Metformin
behandelten Tiere. Die Tiere der Gruppe ZDF-F-P wiesen signifikant höhere Werte auf
als die Tiere der unbehandelten Gruppe ZDF-fatty.
Abbildung 26: Längendichte der Kapillaren
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
1/m
m²
Die Längendichte der Kapillaren lag bei allen behandelten Tieren der Gruppe ZDF-fatty
auf einem ähnlichen Niveau. Eine signifikante Zunahme der Werte fand sich lediglich
zwischen den Tieren der Gruppe ZDF-fatty und ZDF-F-P.
Für den Parameter Volumendichte der Kapillaren ergaben sich keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Gruppen.
10 Wochen
26 Wochen
p < 0,05
p < 0,05 p < 0,05
p < 0,05 10 Wochen
26 Wochen
62 Ergebnisse
4.6.2 Volumendichte der einzelnen Zellarten
Abbildung 27: Volumendichte der Mesangiumzellen
0
1
2
3
4
5
6
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
%
Die mit EMD behandelten Tiere zeigten im Schnitt die, nach der Gruppe ZDF-L-P,
niedrigste Volumendichte der Mesangiumzellen aller 6 Gruppen und unterschieden sich
auch signifikant von der mit Metformin behandelten Gruppe. Die mit Placebo
behandelten Tiere der Gruppe ZDF-F-P wiesen ebenfalls eine signifikant niedrigere
Volumendichte der Mesangiumzellen auf als die Tiere der Gruppe ZDF-F-Met.
Die unbehandelten Tiere der Gruppe ZDF-lean wiesen eine signifikant höhere
Mesangiumzelldichte auf als die mit Placebo behandelten Tiere der Gruppe ZDF-L-P.
Abbildung 28: Volumendichte der Endothelzellen
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
%
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05 p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
10 Wochen
26 Wochen
63 Ergebnisse
Die Volumendichte der Endothelzellen nahm im Verlauf des Versuchs tendenziell ab,
wie ein Vergleich mit den vor Behandlungsbeginn gemessenen Werten der Gruppen
ZDF-lean und ZDF-fatty zeigt. Der Unterschied zwischen den ZDF-fatty- und den
ZDF-F-P-Tieren war hier signifikant. Die Behandlung mit EMD führte jedoch sowohl
gegenüber der Gruppe ZDF-F-P als auch gegenüber der Gruppe ZDF-F-Met zu einer
signifikanten Erhöhung der Endothelzelldichte, die mit dem Niveau vor der 16-
wöchigen Behandlungsdauer vergleichbar war.
In Bezug auf die Volumendichte der Podozyten unterschieden sich die Gruppen nicht
signifikant voneinander.
4.6.3 Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart
Signifikante Unterschiede im Gesamtvolumen von Podozyten, Endothel- und
Mesangiumzellen waren zwischen den behandelten Gruppen ZDF-F-P, ZDF-L-P und
ZDF-F-EMD am Ende des Experiments nicht festzustellen.
Das Gesamtvolumen der Mesangiumzellen unterschied sich nur zwischen der
unbehandelten Gruppe ZDF-fatty und der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P,
sowie zwischen ZDF-L-P und ZDF-F-P.
Bei Podozyten und Endothelzellen ließ sich in den durchgeführten Gruppenvergleichen
kein signifikanter Unterschied feststellen.
4.6.4 Durchschnittsvolumen der jeweiligen Zellart
Die mittleren Volumina von Endothel- und Mesangiumzellen unterschieden sich nicht
signifikant voneinander. Auch das durchschnittliche Podozytenvolumen zeigte
zwischen den medikamentös behandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede.
4.6.5 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Fläche
Am Ende des Versuchs unterschieden sich die Podozytenzahlen pro Fläche der
einzelnen Gruppen nur unwesentlich voneinander. Lediglich die Differenz zwischen den
mit Placebo behandelten Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P war signifikant.
64 Ergebnisse
Abbildung 29: Mesangium- und Endothelzellen pro Fläche des Kapillarkonvoluts
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
1/m
m²
Die Zahl der Mesangiumzellen pro Fläche lag bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-EMD
signifikant niedriger als bei den ZDF-F-EMD-Tieren. Die größten Mesangiumzell-
zahlen zeigten die unbehandelten Tiere der Gruppe ZDF-lean.
Im Verlauf der Behandlung fiel die Zahl der Endothelzellen tendenziell ab. Signifikant
wurde dieser Unterschied zum Beispiel zwischen den Gruppen ZDF-fatty und ZDF-F-P.
Die mit EMD behandelten Tiere wiesen allerdings signifikant höhere Werte auf als die
mit Metformin oder Placebo behandelten Tiere.
4.6.6 Anzahl der jeweiligen Zellart pro Volumen
Abbildung 30: Anzahl der Mesangiumzellen pro Volumen
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
1/m
m³
*: Ein signifikanter Unterschied (p<0,01) besteht zu allen anderen Gruppen.
Mesangiumzellen 10 Wochen 26 Wochen
Endothelzellen 10 Wochen 26 Wochen
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
p < 0,05
*
65 Ergebnisse
Die mit EMD behandelten Tiere wiesen die geringste Anzahl von Mesangiumzellen pro
Kubikmillimeter Kapillarkonvolut auf. Im Vergleich zu den Gruppen ZDF-F-P und
ZDF-F-Met war dieser Unterschied signifikant.
Die Anzahl der Podozyten pro Fläche sowie deren Anzahl pro Volumen unterschieden
sich kaum und zeigten lediglich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-
L-P und ZDF-F-P.
Signifikante Unterschiede bezüglich der Endothelzellzahl pro Volumen zeigten sich
zwischen den diabetogenen Tieren der Gruppen ZDF-fatty bzw. ZDF-F-P und den
Gruppen ZDF-lean bzw. ZDF-L-P, die keinen Diabetes entwickeln. Statistisch relevante
Differenzen zwischen den medikamentös behandelten Gruppen waren hier jedoch nicht
zu verzeichnen.
4.6.7 Gesamtzahl der jeweiligen Zellart pro Glomeru lum
Die Gesamtzahl der Podozyten und Endothelzellen pro Glomerulum unterschied sich
zwischen den verschiedenen Gruppen nicht signifikant.
Abbildung 31: Anzahl der Mesangiumzellen pro Glomerulum
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Die Betrachtung der Mesangiumzellzahl pro Glomerulum zeigte hingegen bei den mit
EMD behandelten Tieren signifikant niedrigere Werte als bei denjenigen, die
Metformin oder ein Placebo erhalten hatten. Die 16-wöchige Placebo-Behandlung
führte bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-P zu signifikant höheren Mesangiumzellzahlen
als in der unbehandelten Kontrollgruppe ZDF-fatty.
p < 0,05 p < 0,05
p < 0,05
10 Wochen
26 Wochen
66 Ergebnisse
4.7 Photodokumentation der Befunde
4.7.1 Glomerulosklerose
Abbildung 32: ZDF-lean: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
Abbildung 33: ZDF-fatty: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
67 Ergebnisse
Abbildung 34: ZDF-L-P: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
Abbildung 35: ZDF-F-P: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
68 Ergebnisse
Abbildung 36: ZDF-F-Met: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
Abbildung 37: ZDF-F-EMD: PAS-Färbung, 400-fache Vergrößerung
69 Ergebnisse
In den PAS-gefärbten Paraffinschnitten zeigten die meisten Glomerula der
unbehandelten Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty sowie der mit Placebo behandelten
ZDF-L-P-Tiere ein regelmäßiges kapillar- und zellreiches Erscheinungsbild (vgl.
Abbildung 32,
Abbildung 33 und Abbildung 34). Im Vergleich hierzu zeigte sich, wie in Abbildung 35
zu sehen, die normale glomeruläre Struktur bei den ebenfalls mit Placebo behandelten
ZDF-F-P-Tieren zu einem großen Teil stark modifiziert. Der Grad der glomerulären
Schädigung mit zum Teil diffuser Sklerose und kapillärer Obstruktion lag signifikant
höher als jener in der Gruppe ZDF-L-P. Auch in den mit Metformin und EMD
behandelten Gruppen waren Schäden im Sinne einer gesteigerten Bildung mesangialer
Matrix in zahlreichen Glomerula erkennbar (vgl. Abbildung 36 und Abbildung 37).
Diese Veränderungen waren jedoch signifikant geringer ausgeprägt als in der mit
Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P. Dabei ist festzuhalten, dass das Ausmaß der
Glomerulosklerose in der Gruppe ZDF-F-EMD geringer war als in der Gruppe ZDF-F-
Met. Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant.
4.7.2 Tubulointerstitielle Schädigung
Abbildung 38: ZDF-lean: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
70 Ergebnisse
Abbildung 39: ZDF-fatty: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
Abbildung 40: ZDF-L-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
71 Ergebnisse
Abbildung 41: ZDF-F-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
Abbildung 42: ZDF-F-Met: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
72 Ergebnisse
Abbildung 43: ZDF-F-EMD: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
In der Siriusfärbung der Paraffinschnitte zeigten sich bei den unbehandelten Tieren der
Gruppe ZDF-lean (vgl. Abbildung 38) und ZDF-fatty (vgl. Abbildung 39) dicht
aneinanderliegende Tubulus-Quer- und Längsschnitte. Sie wiesen ähnlich große
Lumina, gleichmäßig angeordnete Epithelzellen und eine homogene Anfärbung auf. Im
weiteren Verlauf des Experiments − dies zeigt sich in den mit Placebo behandelten
Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P beispielhaft in Abbildung 40 und Abbildung 41 − trat
eine ausgeprägte Fibrose des Interstitiums sowie eine zunehmende unregelmäßige
Dilatation und Epithelatrophie der Tubuli auf, welche durch EMD und Metformin
gebessert werden konnten (vgl. Abbildung 42 und Abbildung 43).
73 Ergebnisse
4.7.3 Vaskuläre Schädigung
Abbildung 44: ZDF-lean: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
Abbildung 45: ZDF-fatty: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
74 Ergebnisse
Abbildung 46: ZDF-L-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
Abbildung 47: ZDF-F-P: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
75 Ergebnisse
Abbildung 48: ZDF-F-Met: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
Abbildung 49: ZDF-F-EMD: Siriusrot-Färbung, 200-fache Vergrößerung
76 Ergebnisse
Die vaskuläre Schädigung lag in den Gruppen ZDF-L-P (vgl. Abbildung 46), ZDF-F-P
(vgl. Abbildung 47 ) und ZDF-F-Met (vgl. Abbildung 48) auf einem ähnlichen Niveau
und zeigte sich in einer moderaten Gefäßwandverdickung mit Proliferation glatter
Muskelzellen. Diese Gruppen unterschieden sich somit signifikant von den
unbehandelten Gruppen ZDF-lean (vgl. Abbildung 44) und ZDF-fatty (vgl. Abbildung
45), aber auch von der mit EMD behandelten Gruppe, bei der sich weitgehend
unauffällige Gefäßverhältnisse zeigten (vgl. Abbildung 49).
77 Diskussion
5 Diskussion
In der vorliegenden Sekundärpräventionsstudie wurden am Modell der „Zucker-
Diabetic-Fatty“-Ratte die Effekte einer Therapie mit dem neu entwickelten Medikament
EMD 387008 auf die Progression diabetischer Folgeschäden an der Niere untersucht
und mit den Effekten einer Therapie mit Metformin bzw. mit dem natürlichen Verlauf
der Erkrankung verglichen. Die Tiere wurden hinsichtlich ihrer Nierenfunktion, ihrer
Glucose- und Lipidstoffwechsellage und ihrer Nierenmorphologie untersucht.
EMD konnte histologisch messbare Nierenveränderungen wie Glomerulosklerose,
tubulointerstitielle Schädigung und vaskuläre Schädigung positiv beeinflussen und
zeigte sich hier als dem Metformin überlegen. Hinsichtlich Nierenfunktion und
Stoffwechsellage setzte sich dieser Trend jedoch nicht fort. Beide Medikamente führten
hier zu ähnlichen Ergebnissen, wobei sich Metformin in einzelnen Parametern
signifikant positiv von EMD abhob.
Zu Beginn der Ergebnisdiskussion soll auf einzelne Faktoren, die maßgeblich an der
Pathogenese der diabetischen bzw. hypertensiven Nephropathie beteiligt sind, näher
eingegangen werden. Anschließend werden die in den voranstehenden Kapiteln
dargestellten Ergebnisse mit diesen Faktoren in Zusammenhang gestellt und diskutiert.
5.1 Pathogenetische Grundlagen
Dieser Abschnitt stellt die Auswirkungen der im Rahmen eines Diabetes mellitus
auftretenden Stoffwechselveränderungen dar, die für die Pathogenese der diabetischen
Nephropathie verantwortlich sind.
5.1.1 Auswirkung einer Hyperglykämie auf die Niere
In mehreren Studien konnte nachgewiesen werden, dass eine andauernde
Hyperglykämie bei diabetischer Stoffwechsellage zu Veränderungen an den Glomerula
führt. Dabei können alle glomerulären Strukturen wie Endothel, Podozyten und
Mesangium sowie das Tubulointerstitium betroffen sein. Eine Verdickung der
Basalmembran, die Synthese extrazellulärer Matrixproteine mit nachfolgender
Glomerulosklerose, Veränderungen der Podozytenschlitzmembran sowie eine
tubulointerstitielle Fibrose werden in der Literatur beschrieben [16, 36, 59]. Auch ein
78 Diskussion
gestörter Zellzyklus sowie das frühzeitige Absterben von Endothelzellen sind Folge zu
hoher Blutglukosespiegel [43].
Von besonderer Bedeutung für die Entwicklung diabetischer Folgeschäden ist die nicht-
enzymatische Glykosylierung von extra- und intrazellulären Proteinen, Lipiden und
Nukleinsäuren, die über zunächst reversible Zwischenprodukte zur Bildung irreversibler
Verbindungen, sogenannter „advanced glycation endproducts“ (AGEs), führt [37].
AGEs entstehen intrazellulär durch Autooxidation von Glucose aus intermediären
Dicarbonylverbindungen. Sie schädigen ihre Zielzellen auf drei verschiedene Arten:
Erstens binden sie an intrazelluläre Proteine und modifizieren deren natürliche Funktion
[13, 36]. Zweitens verändern sie Bestandteile der extrazellulären Matrix, so dass sie mit
anderen Matrixproteinen zu sogenannten „cross-link“-Formationen reagieren oder
abnorme Interaktionen zwischen Matrixproteinen und deren Rezeptoren entstehen [13].
Drittens reagieren auch Plasmaproteine mit AGEs und können so an Rezeptoren von
Endothel- und Mesangiumzellen sowie an Makrophagen binden [36]. Mehrere
zellständige AGE-Rezeptor-Proteine konnten mittlerweile in Zellkulturen auf
Makrophagen, Mesangiumzellen und Endothelzellen identifiziert werden. Bei
Aktivierung führen diese zu einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen und
Wachstumsfaktoren wie „Insulin-like Growth Faktor-1“ (IGF-1), „Interleukin-1“ (IL-1),
„Tumor-Nekrose-Faktor alpha“ (TNF-α) oder „Platelet-derived growth factor“ (PDGF)
durch Makrophagen und Mesangiumzellen, sowie zur Bildung koagulatorischer und
proinflammatorischer Moleküle wie Thrombomodulin, „Tissue Faktor“ (TF) oder dem
Zell-Adhäsionsmolekül „Vascular Cell Adhesion Molecule-1“ (VCAM-1) durch
Endothelzellen. Die AGE-Rezeptor-Interaktion scheint überdies für die diabetestypische
Hyperpermeabilität der Kapillarwand verantwortlich zu sein [13]. Über oben erwähnte
Mechanismen führen dauerhaft erhöhte Werte an AGEs zu mesangialer
Matrixproliferation und tubulointerstitieller Fibrose [71].
Neben der nicht-enzymatischen Glykosylierung von Molekülen tragen weitere durch
Hyperglykämie induzierte Stoffwechselvorgänge zu den Diabetes-typischen vaskulären
Komplikationen bei.
Hier sei als erstes die Aktivierung verschiedener Isoformen der Proteinkinase C (PKC)
genannt. Eine Aktivierung der PKC führt zu endothelialer Dysfunktion mit
Verminderung der endothelialen Stickstoffmonoxid (NO)-Synthese bei gleichzeitig
vermehrter Aktivität von „Endothelin-1“ (ET-1) und von „Vascular Endothelial Growth
Factor“ (VEGF). Zugleich bewirkt die erhöhte Aktivität der PKC die Ausschüttung
79 Diskussion
weiterer Zytokine wie „Transforming Growth Factor beta “ (TGF-β), „Plasminogen-
Aktivator-Inhibitor“ (PAI-1) und „Nuclear Factor - kappa Beta“ (NF-κΒ). Die Folgen
sind Störungen des regelmäßigen Blutflusses, erhöhte Kapillarpermeabilität, sowie die
Induktion einer lokalen Entzündungsreaktion, die zur Thrombosierung von Kapillaren
führt und so die vaskuläre Schädigung verstärkt [37].
Ein weiterer Mechanismus, der die Pathogenese diabetischer Komplikationen
begünstigt, ist der vermehrte Abbau der intrazellulär exzessiv anfallenden Glucose über
den sogenannten Hexosamin-Pathway. Die hierbei entstehenden Stoffwechsel-
endprodukte führen wiederum zu veränderter Genexpression mit vermehrter Bildung
von TGF-β, „Fibroblast Growth Factor alpha“ (FGF-α) und PAI-1, gestörter
Proteinfunktion und dem Entstehen einer Insulinresistenz [35, 80]. Darüber hinaus gibt
es Erkenntnisse, wonach der Hexosamin-Pathway durch die Auslösung von oxidativem
Stress zur Schädigung der β-Zellen beiträgt [35, 80].
Als vierter Faktor führt der sogenannte Polyol-Pathway durch eine vermehrte
Konversion von Glukose zu Sorbitol durch das Enzym Aldose-Reductase und weiter zu
Fruktose durch das Enzym Sorbitol-Dehydrogenase zu Diabetes-assoziierten Schäden.
Die Umwandlung von Glukose über diesen Abbauweg ist jedoch stark gewebe- und
speziesabhängig [13]. Die NAD+-abhängige Sorbitol-Oxidation führt zu einem Anstieg
der NADH/NAD-Ratio, woraus ein vermehrter Anfall von Triosephosphaten resultiert.
Diese bedingen in der Folge die Konzentrationserhöhung sowohl des AGE-
Vorläuferproteins Methylglyoxal als auch von Diacylglycerol, welches die oben
erwähnte Proteinkinase C aktiviert. Der Polyol-Pathway mündet über die
Sorbitolproduktion also in zwei andere, zu Komplikationen führenden Abbauwege ein.
Das zelluläre Redoxpotential ist durch den Verbrauch von NADPH bei der Reduktion
von Glukose zu Sorbitol und der konsekutiven Verminderung reduzierten Glutathions
gestört. Dies kann intrazellulären oxidativen Stress verursachen oder verstärken [13,
15]. Berichte, wonach die Sorbitol-Akkumulation die Zelle durch erhöhten osmotischen
Druck schädigt, sind umstritten, da die Sorbitol-Konzentrationen im Gewebe zu niedrig
sind, um oxidative Schäden verursachen zu können [13].
Einen Überblick über die durch die Hyperglykämie induzierten Stoffwechselnebenwege
zeigt Abbildung 50.
80 Diskussion
Abbildung 50: Möglicher Mechanismus, durch den die Überproduktion von Sauerstoffradikalen verschiedene Stoffwechsel-Nebenwege aktiviert (aus [13])
Als gemeinsame Grundlage der oben beschriebenen Mechanismen gilt eine
Überproduktion von Sauerstoffradikalen durch die mitochondriale Elektronen-
transportkette [13, 36, 37, 55].
5.1.2 Albuminurie und Nephropathie
Neben einer renalen Hypertrophie mit Glomerulosklerose, interstitieller Fibrose und
Basalmembranverdickung gehört zum Krankheitsbild der diabetischen Nephropathie
auch eine Veränderung der Membranpermeabilität des glomerulären Filters. Diese führt,
ebenso wie ein gleichzeitiger Anstieg des effektiven Filtrationsdrucks, zunächst zur
Mikroalbuminurie, d. h. einer Urinausscheidungsrate von 30-300 mg Albumin pro Tag
oder ein Verhältnis von Albumin/Kreatinin von 17-250 mg/g bei Männern bzw. 25-355
mg/g bei Frauen [72]. Liegt die Proteinausscheidung über den genannten Grenzwerten,
so spricht man von einer Proteinurie [72]. Mikroalbuminurie bzw. Proteinurie stellen
prognostisch bedeutsame Marker für die Entwicklung der diabetischen Nephropathie
sowie weiterer Diabetes-assoziierter Komplikationen dar [1, 3, 32, 64].
Die pathophysiologischen Mechanismen, die für den Proteinverlust verantwortlich sind,
liegen im Verlust der negativen Ladung und der Größenselektivität des glomerulären
Filters, so dass größere Mengen an Albumin, aber auch an hochmolekularen Stoffen, die
81 Diskussion
die Filtrationsbarriere normalerweise nicht passieren könnten, in den Harn filtriert
werden [18].
Vermehrte Proteinbelastung und eine direkte toxische Wirkung der Proteine im
Tubulussystem beeinflussen deren Reabsorption negativ, was wiederum zu einer
Verstärkung der Albuminurie führt [18]. Überdies induzieren Proteine im
Tubulussystem die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und wirken proinflammatorisch
[68]. Die Folge ist eine tubulointerstitielle Schädigung bis hin zur Entwicklung einer
progressiven interstitiellen Fibrose der Niere [18, 23, 68].
Die Albuminurie stellt jedoch nicht nur einen prognostischen Parameter für die
Nephropathie dar, sie gibt auch Hinweise auf eine generalisierte mikro- und
makrovaskuläre Schädigung. Mehrere epidemiologische Studien konnten belegen, dass
eine erhöhte Proteinurie das Risiko, an einer kardiovaskulären Krankheit zu erkranken
oder daran zu versterben, drastisch erhöht [17, 28, 72, 83, 84]. In einer Metaanalyse
konnte gezeigt werden, dass bei Typ-2-Diabetikern mit Mikroalbuminurie das Risiko
für die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität um den Faktor 2 erhöht war [72].
5.1.3 Auswirkungen einer Dyslipidämie auf die Niere
Da sich Metformin auch durch seine positiven Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel
auszeichnet (vgl. Abschnitt 3.4.1), soll im Folgenden kurz dargestellt werden, wie eine
im Rahmen des Diabetes mellitus auftretende Dyslipidämie die Niere schädigen kann.
Eine Störung des Lipidhaushalts ist ein häufiger Befund bei Diabetespatienten [7, 66].
Dafür werden vor allem folgende Faktoren verantwortlich gemacht:
Zum einen können Insulinmangel bzw. Insulinresistenz entweder unmittelbar oder
mittelbar über die daraus entstehende Hyperglykämie zu einer Hyperlipidämie führen.
Grund dafür ist eine gesteigerte Aktivität der hormonsensitiven Lipase des Fettgewebes,
die zur Lipolyse und zum Anstieg der freien Fettsäuren im Blut führt [4, 73].
Zum anderen geht auch das bei fortgeschrittener Nephropathie auftretende nephrotische
Syndrom mit einer Hypercholesterinämie einher. Im Allgemeinen ist die Dyslipidämie
umso ausgeprägter, je höher die Proteinurie und je niedriger die Albuminkonzentration
im Blut ist [51, 77].
Überdies führt eine erhöhte Permeabilität der glomerulären Basalmembran zum Verlust
von Aktivatoren der endothelständigen Lipoproteinlipase wie Apolipoprotein-C II und
somit zu einer Beeinträchtigung des normalen Lipoproteinmetabolismus [51].
82 Diskussion
Tierexperimentelle Untersuchungen und klinische Befunde zeigen, dass eine
Hyperlipidämie die Entwicklung einer Glomerulosklerose sowie die Progredienz der
Niereninsuffizienz beeinflussen kann [30, 39, 51]. Bei einer Schädigung der
Kapillarwände des Glomerulums durch einen erhöhten Filtrationsdruck und/oder eine
Hyperglykämie können Lipide und Lipoproteine in die mesangiale Matrix eindringen.
Dies führt zu einer Stimulierung der DNA-Synthese in Mesangiumzellen mit
nachfolgend vermehrter Produktion von Mitogenen und extrazellulären Matrixproteinen
[30, 51]. Außerdem infiltrieren Makrophagen die Glomerula und degenerieren nach
Aufnahme oxidierter LDL-Partikel zu Schaumzellen. Über die Produktion von
Wachstumsfaktoren und inflammatorischen Zytokinen halten die oxidierten LDL-
Lipoproteine den entzündlichen und proliferativen Prozess aufrecht und wirken so
apoptosefördernd. Überdies werden sie verantwortlich gemacht für eine erhöhte
Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und vasokonstriktorisch wirkender Substanzen
wie Endothelin, Thromboxan und Renin bei gleichzeitig verminderter
Stickstoffmonoxidbildung. Diese Imbalance vasoaktiver Stoffe führt in der Konsequenz
zu vermehrter Vasokonstriktion [39].
Diese bisherigen Erkenntnisse weisen also auf eine Nephrotoxizität der Lipide hin und
attestieren ihnen eine prognostische Bedeutung für die Manifestation und Progression
der diabetischen Nephropathie.
5.2 Diskussion der eigenen Ergebnisse
Im Folgenden werden die in diesem Versuch ermittelten und in Kapitel 4 dargestellten
Ergebnisse interpretiert und in Bezug auf die aktuelle Datenlage in der Literatur
diskutiert.
5.2.1 Blut- und Urinparameter
Die beiden untersuchten Medikamente Metformin und EMD konnten die Serum-
glucosespiegel jeweils etwa gleich stark um ca. 15 % senken, ohne dass dieser
Unterschied jedoch signifikant war. Erwartungsgemäß waren die Werte der Gruppe
ZDF-L-P bezüglich aller Parameter des Glucosestoffwechsels signifikant gegenüber den
anderen Gruppen erniedrigt.
Die Konzentrationen des Langzeitparameters HbA1c waren in der Gruppe ZDF-F-Met
mit ca. 5 % um knapp einen Prozentpunkt geringer als in der Gruppe ZDF-F-EMD. Die
83 Diskussion
mit EMD behandelten Tiere wiesen sogar höhere HbA1c-Konzentrationen im Serum auf
als die Tiere der Placebogruppe. Wenngleich dieser Unterschied nicht signifikant war,
fällt eine Diskrepanz im Vergleich zu den ermittelten Serumglucosespiegeln dennoch
auf. Diese Ergebnisse können zum Teil erklärt werden durch die Beobachtung der
Blutglucose im Zeitverlauf, in dem die mit EMD behandelten Tiere zu den ersten drei
Messzeitpunkten höhere Werte aufwiesen als die mit Metformin behandelten Tiere. Die
Messungen nach 22 und 26 Wochen ergaben dann bei den Tieren der Gruppe ZDF-F-
EMD jedoch geringfügig niedrigere Serum-Glucosespiegel als bei den Tieren der
Gruppe ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.4.1). Die Diskrepanz zwischen den HbA1c-Werten
der Gruppe ZDF-F-P und der Gruppe ZDF-F-EMD kann mit den vorliegenden
Ergebnissen jedoch nicht erklärt werden.
Die Insulinspiegel im Serum unterschieden sich zwischen den Gruppen ZDF-F-EMD,
ZDF-F-Met und ZDF-F-P zwar nicht signifikant voneinander, waren in den
medikamentös behandelten Gruppen jedoch höher als in der Placebogruppe. Die mit
EMD behandelten Tiere wiesen um knapp 15 % niedrigere Insulin-Serumspiegel auf
als die mit Metformin behandelten Tiere. Dieser Trend bestätigte sich auch im
Zeitverlauf (vgl. Abschnitt 4.4.1).
Die bei diesen Werten auftretenden hohen Standardabweichungen weisen jedoch auf die
breite Streuung und die somit nur bedingte Aussagekraft der Ergebnisse hin. So stehen
die im Vergleich zur Placebogruppe erhöhten Insulin-Serumspiegel in den
medikamentös behandelten Gruppen im Widerspruch zu den Ergebnissen zahlreicher
Studien. Diese Studien haben gezeigt, dass Metformin eine effektive Blutzuckersenkung
und Verbesserung der Insulinsensitivität bewirkt, die sich in einer Verminderung der
Serum-Insulinkonzentrationen ausdrückt. Grund hierfür ist eine verminderte
Glucoseabgabe der Hepatozyten, eine vermehrte Aufnahme und Oxidation von Glucose
ins Fettgewebe, eine verbesserte Insulinrezeptorbindung mit nachfolgend erhöhter
Tyrosinkinase-Aktivität sowie eine vermehrte Translokation von GLUT-1- und GLUT-
4-Glucose-Transportern in die Membran verschiedener Zellarten [12]. Metformin
verbessert die orale Glucosetoleranz, wobei die Plasma-Insulin-Antwort auf Glucose
unverändert bleibt oder bei Patienten mit Hyperinsulinämie gesenkt wird [12]. An
isolierten Hepatozyten verstärkten bereits therapeutische Konzentrationen des
Medikaments die insulinbedingte Unterdrückung der Glukoneogenese und verminderten
gleichzeitig die glukoneogenetische Glucagonwirkung [12, 85]. Im Tierversuch konnte
eine gesteigerte Aufnahme von Glukose in den Muskel nachgewiesen werden, die sich
84 Diskussion
in vermehrter Glykogenproduktion und Glucoseoxidation bei gleichzeitig nicht erhöhter
Laktatproduktion zeigte [11].
Die Senkung der Plasmaglucose durch Metformin ist besonders für die Verhinderung
von Komplikationen von Bedeutung, wie sie durch die in Abschnitt 5.1.1 dargestellten
Abbauwege und den daraus resultierenden oxidativen Stress entstehen. So wurde
gezeigt, dass Metformin die Bildung von AGEs reduzieren und antioxidative
Mechanismen, etwa durch den Anstieg von Glutathion oder Superoxiddismutase,
stärken kann [10].
In der vorliegenden Studie konnten diese positiven Ergebnisse jedoch nicht bestätigt
werden. Weder mit Metformin noch mit EMD wurde eine signifikante Senkung der
Glucose- und Insulin-Serumkonzentrationen im Vergleich zur Placebogruppe erreicht.
Ein deutlicher Unterschied zwischen beiden Medikamenten wurde bei der signifikant
stärkeren Senkung der Uringlucose durch EMD im Vergleich zu Metformin beobachtet.
Bei stark erhöhter Diurese in der Gruppe ZDF-F-EMD im Vergleich zur Gruppe ZDF-
F-Met dürfte hier jedoch am ehesten ein Verdünnungseffekt eine Rolle spielen.
Die oben erwähnten, in bisherigen Studien gewonnen Ergebnisse zeigen, dass man im
vorliegenden Versuch positivere Auswirkungen der Metforminbehandlung auf den
Glucosestoffwechsel erwartet hätte. Offenbar gelang es in dieser Studie nicht, die
Insulinresistenz zu durchbrechen, obwohl mit vergleichbaren oder sogar höheren
Metformin-Dosen als in früheren Studien gearbeitet wurde [67, 70].
Eine gefürchtete Nebenwirkung des Metformins ist die Laktatazidose, die durch
vermehrte anaerobe Glykolyse bei Sauerstoffmangelversorgung des Organismus
entsteht. Ab einer Serumkonzentration von 5 mmol/l und einem Blut-pH-Wert von 7,25
spricht man von einer signifikanten Laktatazidose [42]. Es konnte beobachtet werden,
dass eine Metformin-Therapie zu einem Anstieg der basalen und postprandialen
Laktatkonzentration im Blut führt, ohne dass jedoch der Normbereich überschritten
wird [12]. In der vorliegenden Studie lagen die Durchschnittswerte der
Laktatkonzentration in den Gruppen ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD mit durchschnittlich
5,30 mmol/l und 5,39 mmol/l formal über dem oben genannten Grenzwert und
unterschieden sich damit signifikant von der mit Placebo behandelten Gruppe ZDF-F-P.
Obwohl in dieser Studie keine Blut-pH-Messungen durchgeführt wurden, legen diese
Ergebnisse dennoch nahe, dass EMD bezüglich der Gefahr einer Laktatazidose
gegenüber Metformin keine Vorteile mit sich bringt.
85 Diskussion
Wie in Abschnitt 3.4.1 und 4.4.3 erläutert, kann Metformin eine Dyslipidämie, welche
die Entwicklung einer Glomerulosklerose sowie die Progredienz der Niereninsuffizienz
begünstigen kann [30, 39, 51], positiv beeinflussen. Es führt zu einer 10-20%igen
Verminderung der Fettsäureoxidation, einer Reduktion der Plasma-
Trigylceridkonzentration sowie einer herabgesetzten Synthese von „Very Low
Densitiy“-Lipoproteinen (VLDL) in der Leber [10, 12, 53, 86]. In einigen Studien
wurde außerdem ein leichtes Absinken der Cholesterinkonzentrationen im Plasma und
ein leichter Anstieg von „High Densitiy“-Lipoproteinen (HDL) festgestellt [12]. Im
vorliegenden Versuch konnten diese Ergebnisse teilweise reproduziert werden.
Während durch EMD eine effektivere Senkung der Gesamtcholesterinkonzentration
erreicht werden konnte als mit Metformin (243 mg/dl vs. 270 mg/dl), zeigte Metformin
im Hinblick auf den Anstieg der HDL-Konzentrationen eine bessere Wirkung als EMD.
Signifikant waren die Unterschiede, auch gegenüber der Placebogruppe, jedoch nicht.
Alle hypertonen Tiere der Gruppe ZDF-L-P wiesen signifikant niedrigere
Fettstoffwechselparameter auf als die diabetogenen Tiere, die genetisch determiniert
eine Hyperphagie und Hyperlipidämie ausbilden (vgl. Abschnitt 3.1).
Damit konnten die Ergebnisse dieser Studie hinsichtlich des Glucose- und
Fettstoffwechsels sowohl für Metformin als auch für EMD kaum signifikante, positive
Effekte gegenüber der Placebogruppe zeigen.
5.2.2 Wirkung von Metformin und EMD auf Gefäße und Endothel
Die Metformintherapie geht, wie etwa in der UKPD-Studie gezeigt werden konnte, mit
einer signifikanten Reduktion der mikro- und makrovaskulären Komplikationen einher
[1]. Neben der Reduktion weiterer Risikofaktoren für Atherosklerose wie
Hyperglykämie, Dyslipidämie und Gerinnungsstörung verbessert das Medikament auch
die endotheliale Dysfunktion [10, 31, 47]. In Frühstadien der Krankheit kann Metformin
zu einem Anstieg der endothel-vermittelten Vasodilatation sowie zu einer Senkung der
Blutdruckerhöhung auf vasokonstriktorische Stimuli hin führen [10, 47]. Unklar ist
bislang, ob hierbei eine Erhöhung der durch die anhaltende Hyperglykämie bedingten
verminderten Stickstoffmonooxid(NO)-Freisetzung eine Rolle spielt [9, 45, 47]. NO
hemmt die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen und reguliert „Endothelin-1“
(ET-1), einen sehr wirksamen Vasokonstriktor [27, 29]. Allerdings liegen auch Studien
86 Diskussion
vor, die keinen signifikanten Effekt von Metformin auf die endothelabhängige
Vasodilatation nachweisen konnten [10].
Metformin scheint die bei Typ-2-Diabetes verstärkte Monocytenadhäsion ans Endothel,
die die Ausbildung von Atherosklerose begünstigt, zu reduzieren. Dies wird auf die
verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen wie E-Selectin und ICAM-1 (d. h.
Intercellular Adhesions Molecule-1) und auf die Reduktion von AGEs zurückgeführt,
die zu einer verminderten Stimulation der Adhäsionsmoleküle führt [44].
Ferner existieren Hinweise auf eine Metformin-vermittelte Verbesserung der kapillären
Perfusion, etwa durch Antagonisierung der Insulin-induzierten Erythrozyten-
deformation, sowie auf eine verminderte Endothelpermeabilität und eine erhöhte
arterioläre Elastizität [10]. Auch eine signifikante Erhöhung des arteriellen Blutflusses
bei Patienten mit Arteriosklerose wurde beobachtet [74].
Metformin besitzt außerdem antiatherogene und antithrombotische Eigenschaften. Im
Tierversuch konnten aortale Plaqueformationen bei Kaninchen ohne Beeinflussung des
Blutlipidspiegels reduziert werden [10].
Überdies wird Metformin für ein Absinken der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-
Konzentrationen (PAI-1), einem Fibrinolyse-Inhibitor, sowie für eine herabgesetzte
Thrombozytensensitivität gegenüber aggregatorischen Substanzen verantwortlich
gemacht [1, 12].
Im vorliegenden Versuch gab der vaskuläre Schädigungsindex Hinweise auf mögliche
vasoprotektive Wirkungen der beiden getesteten Medikamente. Dabei fiel zunächst auf,
dass diejenigen Tiere, die länger den gefäßschädigenden Einflüssen Hypertonie und
Diabetes ausgesetzt waren und erst nach 26 Versuchswochen untersucht wurden (ZDF-
L-P, ZDF-F-P), signifikant höhere Werte im VSI aufwiesen als die bereits nach 10
Wochen untersuchten Gruppen. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe
„lean“ und der Gruppe „fatty“ war dabei nicht zu verzeichnen. Wenngleich In-Vitro-
Studien einen Rückgang der Proliferation glatter Muskelzellen unter Metformintherapie
dokumentieren [10], hob sich der Gefäßzustand der mit Metformin behandelten Tiere
nicht positiv von der Placebo-Gruppe ab. Die mit EMD behandelten Tiere wiesen
dagegen VSI-Werte auf, die mit denjenigen der Tiere vor Behandlungsbeginn (Gruppe
ZDF-fatty) vergleichbar waren (vgl. Abschnitt 4.5.4).
Mögliche vasoprotektive Eigenschaften können dem Medikament EMD auch bei
Betrachtung der Volumendichte der Endothelzellen und der Endothelzellzahl pro Fläche
des Kapillarkonvoluts zugeschrieben werden. Beide Parameter zeigen, dass EMD
87 Diskussion
offenbar einer Hyperglykämie-induzierten Apoptose von Endothelzellen
entgegenwirken konnte (vgl. Abschnitt 4.6.2 und 4.6.5). Während sich die
Volumendichte der Endothelzellen in der Gruppe ZDF-L-P nach 16-wöchiger
Placebobehandlung nur geringfügig im Vergleich zur Kontrollgruppe ZDF-lean
unterschied, nahm die Volumendichte bei den mit Placebo behandelten „fatty“-Tieren
(ZDF-F-P) im Vergleich zur Gruppe ZDF-fatty signifikant ab. Auf einem
vergleichbaren Niveau bewegten sich die Werte für die mit Metformin behandelten
Tiere. Lediglich EMD zeigte eine um über 40 % höhere Volumendichte der
Endothelzellen im Vergleich zu der mit Placebo behandelten Gruppe (vgl. Abschnitt
4.6.2). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch für den Parameter „Endothelzellzahl pro
Fläche des Kapillarkonvoluts“.
Die in der Literatur beschriebene Zunahme der endothelabhängigen Vasodilatation
sowie die Proliferationshemmung glatter Gefäßmuskelzellen durch Metformin konnte in
diesem Versuch nicht nachgewiesen werden. Die vaskuläre Schädigung unterschied sich
nicht signifikant von der Placebogruppe. Das neu entwickelte Medikament EMD
dagegen konnte eine renale Gefäßschädigung wirkungsvoll reduzieren.
Um eine bessere Wirksamkeit von EMD gegenüber Metformin hinsichtlich seiner
vasoprotektiven Eigenschaften zu attestieren, bedarf es noch weiterer Untersuchungen,
insbesondere im Hinblick auf Auswirkungen auf den systemischen Blutdruck und die
kapilläre Perfusion. Die hier gewonnenen Ergebnisse bescheinigen dem EMD jedoch
äußerst günstige Gefäßwirkungen. Allerdings muss darauf hingewiesen werden, dass
den hier gezeigten unzureichenden experimentellen Wirkungen des Metformins eine
Vielzahl der oben erwähnten Studien mit positiven Ergebnissen gegenüberstehen.
5.2.3 Auswirkungen von Metformin und EMD auf die Ni erenfunktion und Morphologie
Bei der Beurteilung der Nierenfunktionsparameter zeigten sich zwischen den beiden
medikamentös behandelten Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Auffallend
waren signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-L-P und ZDF-F-P, die für
die mit Placebo behandelten diabetogenen Tiere eine signifikant stärkere Proteinurie
und eine erhöhte Diurese ergaben als für die hypertonen Tiere.
Da der Grad der mikrovaskulären Komplikationen, die zur Nephropathie bis hin zum
Nierenversagen führen können, mit dem Maß der Blutzuckerkontrolle negativ korreliert
88 Diskussion
[10, 12], stellt die effektive Blutzuckersenkung einen entscheidenden Faktor bei der
Reduktion von Auftreten und Schwere dieser Komplikationen dar. Sie trägt dazu bei,
dass weniger toxische Stoffwechselprodukte über den Polyol- und Hexosaminabbauweg
entstehen und vermindert die Bildung von AGEs und die damit verbundene
Glomerulosklerose. Für Metformin wurde in mehreren Studien eine positive Wirkung
auf die Entwicklung einer diabetischen Nephropathie gezeigt [10, 32, 64, 67].
Valensi et al. konnten eine Reduktion der Kapillarpermeabilität und der Ödembildung
durch Metformin nachweisen [74]. Dies könnte auf die verminderte Glykosylierung der
Basalmembran, eine verbesserte arterioläre Elastizität und eine Reduktion von
Hyperglykämie-induzierten Kollagenquervernetzungen zurückzuführen sein [10]. Die
UKPD-Studie konnte ein um 29 % vermindertes Risiko für mikrovaskuläre
Komplikationen und ein langsameres Voranschreiten einer Mikroalbuminurie unter
Metformintherapie im Vergleich zur alleinigen Diät ermitteln [1].
Die mit Metformin und EMD behandelten Versuchstiere unterschieden sich zwar nicht
signifikant von der Placebo-Gruppe, es zeigte sich jedoch die Tendenz zu einer
positiveren Beeinflussung der Nierenfunktion durch Metformin als durch EMD. So wies
die mit Metformin behandelte Gruppe niedrigere Serum-Kreatinin-Konzentrationen und
eine verminderte Diurese auf als die Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-EMD. Auch
hinsichtlich der Albuminurie zeigte EMD mit einer rund 20 % höheren Urin-
Eiweißausscheidung und einer höheren Albumin-Kreatinin-Ratio eine leicht schlechtere
Wirking als Metformin (vgl. Abschnitt 4.3.2). Dieser Trend setzte sich im Volumen des
Kapillarkonvoluts fort, wo sich in der Gruppe ZDF-F-EMD wiederum höhere Werte als
in der Gruppe ZDF-F-Met zeigten. Dies könnte für eine diabetestypische
Nephromegalie sprechen, die mit einer glomerulären Hypertrophie und zunächst einer
begleitenden moderaten Hyperfiltration einhergeht. Im Verlauf sinkt die glomeruläre
Filtrationsrate jedoch trotz der glomerulären Volumenzunahme im Sinne einer
zunehmenden Niereninsuffizienz ab [58, 59, 68]. Im vorliegenden Versuch konnten
beide Medikamente die Kreatinin-Clearance, die Rückschlüsse auf die glomeruläre
Filtrationsrate erlaubt, im Vergleich zur Placebogruppe verbessern (vgl. Abschnitt
4.3.4). Dies könnte auf die oben erwähnte kompensatorische glomeruläre Hypertrophie
zurückzuführen sein, welche im Verlauf zunehmender Glomerulopathie
kompensatorisch auftritt [68]. Eine damit meist verbundene Zunahme des
Nierengewichts konnte im vorliegenden Versuch in der Gruppe ZDF-F-EMD jedoch
nicht gezeigt werden (vgl. Abschnitt 4.1.3). Außerdem wiesen weder die mit EMD noch
89 Diskussion
die mit Metformin behandelten Tiere im Versuchsverlauf eine Vermehrung der
glomerulären Matrix oder eine Zunahme der Mesangiumzellproliferation im Vergleich
zur Placebogruppe auf (vgl. Abschnitt 4.5.1).
Beide Phänomene lassen sich histologisch anhand des Glomeruloskleroseindex (GSI)
bewerten. Die Glomerulosklerose mit Einengung des Gefäßlumens der glomerulären
Kapillaren, Zunahme des Mesangiums, diffuser Verbreiterung der Basalmembran und
Degeneration der Podozyten ist eine typische Komplikation des Diabetes mellitus [58].
Im vorliegenden Versuch konnte im zeitlichen Verlauf erwartungsgemäß sowohl bei
den Tieren der Gruppe „lean“ als auch bei den diabetogenen Tieren der Gruppe „fatty“
eine Zunahme der Glomerulosklerose festgestellt werden. Dabei fiel auf, dass die Tiere
der „lean“-Gruppe grundsätzlich niedrigere Werte aufwiesen als die Tiere der „fatty“-
Gruppe, was möglicherweise mit der häufig zusätzlich zum Typ-2-Diabetes
vorliegenden arteriellen Hypertonie in der „fatty“-Gruppe in Zusammenhang gebracht
werden kann [58, 63]. EMD und Metformin beeinflussten die glomeruläre
Matrixvermehrung ausgesprochen positiv: Im Vergleich zur Placebo-Gruppe zeigten
sowohl die Gruppe ZDF-F-Met als auch die Gruppe ZDF-F-EMD signifikant niedrigere
Werte. Gegenüber Metformin konnte EMD die Glomerulosklerose um weitere 10 %
verbessern (vgl. Abschnitt 4.5.1). Dieses Ergebnis korreliert auch mit einer signifikant
niedrigeren Volumendichte der Mesangiumzellen sowie mit einer signifikant niedrigen
Zahl von Mesangiumzellen pro Fläche und Volumen in der mit EMD behandelten
Gruppe im Vergleich zur Placebo-Gruppe (vgl. Abschnitt 4.6.2, 4.6.5 und 4.6.6). Dies
könnte als eine Hemmung der durch hohe Blutglukosespiegel hervorgerufenen
Proliferation von Mesangiumzellen zu verstehen sein [21]. Osterby und Gundersen [59]
haben für die diabetische Nephropathie bei Typ-1-Diabetikern jedoch gezeigt, dass im
Verlauf der Erkrankung bei unveränderter Zellzahl das Volumen der einzelnen
glomerulären Zellen im Sinne einer Hypertrophie erhöht sein kann. Im vorliegenden
Versuch wies die Gruppe ZDF-F-EMD, wie schon hinsichtlich des glomerulären
Volumens, höhere Volumina von Mesanigum- und Endothelzellen sowie von
Podozyten auf als die Gruppe ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.6.3). Allerdings war der
Unterschied nur in Bezug auf das Podozytenvolumen signifikant.
Die Auswertung des Mesangiolyseindex (MSI) zeigte keine signifikanten Unterschiede
zwischen den medikamentös behandelten Gruppen. Als Mesangiolyse bezeichnet man
die Auflösung der mesangialen Matrix durch Apoptose und Nekrose der
90 Diskussion
Mesangiumzellen. Sie äußern sich als eine Erweiterung der glomerulären Kapillaren,
die im Endstadium als Kapillaraneurysmen imponieren [20, 52].
Neben den Schäden an den Glomerula liegen in der diabetisch geschädigten Niere auch
Veränderungen der tubulointerstitiellen Architektur vor, wie etwa eine tubuläre
Atrophie und eine interstitielle Fibrose [68]. Der tubulointerstitielle Schädigungsindex
zeigte sich im Zeitverlauf zwischen der Gruppe ZDF-fatty und der Gruppe ZDF-F-P als
signifikant zunehmend. Die mit Metformin und EMD behandelten Tiere wiesen
signifikant geringere Werte auf als die Tiere, die ein Placebo erhielten. Auch hier waren
die Schädigungen in der Gruppe ZDF-F-EMD signifikant geringer als in der Gruppe
ZDF-F-Met (vgl. Abschnitt 4.5.3).
Wie in Abschnitt 4.5.1, Abschnitt 4.5.3 und Abschnitt 4.5.6 gezeigt wurde, geht in der
vorliegenden Studie die bei den mit EMD behandelten Tieren stark ausgeprägte
glomeruläre Volumenzunahme weder mit einer verstärkten Glomerulosklerose noch mit
einer vermehrten tubulointerstitiellen Fibrose einher. Möglicherweise trägt eine
Zunahme der Kapillarlumina durch die Ausbildung kapillärer Loop-Strukturen mit sehr
dünner Basalmembran, wie sie sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetikern
beschrieben wurde [58], zur glomerulären Volumenexpansion bei. Die im Vergleich zur
Gruppe ZDF-F-P und ZDF-F-Met signifikant erhöhte mittlere
Kapillarquerschnittsfläche in der Gruppe ZDF-F-EMD sowie die ebenfalls erhöhte
Volumen- und Längendichte der Kapillaren in dieser Gruppe sind mit diesem
Erklärungsansatz vereinbar (vgl. Abschnitt 4.6.1).
Die hypertonen Tiere der Gruppe ZDF-L-P zeigten signifikant bessere
Nierenfunktionsparameter als alle Tiere der diabetogenen Gruppen. Auch die
Glomerulosklerose war bei diesen Tieren geringer ausgeprägt als in den
Vergleichsgruppen. Die tubulointerstitielle Fibrose war hier jedoch, ähnlich wie die
vaskuläre Schädigung, stärker ausgeprägt als in den anderen Gruppen. Möglicherweise
sind diese Veränderungen auf proinflammatorische Substanzen zurückzuführen, welche
bei glomerulärer Hypertension vermehrt ausgeschüttet werden und über eine
interstitielle Entzündungsreaktion zu Fibroblastenproliferation und Fibrogenese führen
[68].
Beide Medikamente konnten die diabetesassoziierten morphologischen Veränderungen
an der Niere positiv beeinflussen. Während sich hier eine äußerst günstige Wirkung des
EMD abzeichnete, konnte das neu entwickelte Medikament hinsichtlich der
91 Diskussion
Nierenfunktionsparameter in diesem Versuch keine Verbesserung im Vergleich zur
Placebogruppe bewirken.
5.2.4 Schlussfolgerung
Im vorliegenden Versuch beeinflussten die beiden untersuchten Medikamente den
Glucosestoffwechsel sowie die im Rahmen einer diabetischen Nephropathie
auftretenden renalen Schäden unterschiedlich. Die Serumspiegel von Insulin und
Glucose waren bei Versuchsende in der mit EMD behandelten Gruppe im Vergleich zu
den mit Metformin behandelten Tiere geringfügig erniedrigt, zeigten jedoch keine
signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Placebogruppe. Wesentliche Parameter
der Nierenfunktion, wie die Kreatinin-Clearance oder die Diurese, konnten dagegen nur
durch Metformin, nicht aber durch EMD, im Vergleich zur Placebogruppe signifikant
gebessert werden. Bei den mit dem neu entwickelten Medikament behandelten Tieren
zeigten sich vielmehr Hinweise auf eine glomeruläre Hypertrophie mit begleitender
Hyperfiltration.
Beiden Medikamenten konnte diese Studie keine positiven Wirkungen auf den
Fettstoffwechsel und die somit möglicherweise verlangsamte Progredienz von
Glomerulosklerose und Niereninsuffizienz attestieren. Eine Verminderung der Serum-
Cholesterinspiegel im Vergleich zur Placebogruppe und eine damit verbundene
Erniedrigung des Atheroskleroserisikos gelang weder mit EMD noch mit Metformin.
Hinsichtlich der morphologischen Nierenveränderung zeigte EMD eine ausgeprägtere
Wirkung als Metformin. Besonders vaskuläre Schäden, tubulointerstitielle Fibrose und
Glomerulosklerose konnten mit EMD 387008 effektiver bekämpft werden.
Es bleibt festzuhalten, dass EMD im vorliegenden Versuch vor allem hinsichtlich der
morphologischen Veränderungen vielversprechende Ergebnisse zeigte. Auch wenn
hinsichtlich der Nierenfunktion und hämatologischer Parameter des Glucosestoff-
wechsels im Vergleich zu den anderen Vergleichsgruppen teilweise keine signifikanten
Verbesserungen festgestellt werden konnten, erscheint damit eine genauere
Untersuchung des neu entwickelten Medikaments lohnenswert.
93 Literaturverzeichnis
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99 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AGE Advanced glycosilation end product
AMP Adenosinmonophosphat
EMD Merck© EMD 387008
GFR Glomeruläre Filtrationsrate
GSI Glomeruloskleroseindex
HDL high density lipoproteins
KG Körpergewicht
KI Konfidenzintervall
LDL low density lipoproteins
Met Metformin
MSI Mesangiolyseindex
PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1
PAS „Periodic Acid Schiff“-Reaktion
PKC Proteinkinase C
S Serum
TF tissue factor
TGF-β transforming growth factor beta
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor alpha
TSI Tubulointerstitieller Schädigungsindex
VLDL very low density lipoproteins
VSI Vaskulärer Schädigungsindex
ZDF Zucker diabetic fatty (Ratten-Tiermodell)
ZDF-F-P ZDF-Fatty-Ratte unter Placebogabe
ZDF-L-P ZDF-Lean-Ratte unter Placebogabe
100 Danksagung
Danksagung
Ich möchte mich bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann für die Überlassung des
Themas und die gute Betreuung während der gesamten Dauer dieser Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. med. A. Hartmann, Direktor des Pathologisch-Anatomischen Instituts
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, danke ich für die
Bereitstellung der Räumlichkeiten und der personellen Kapazitäten, sowie die
Möglichkeit, am Pathologischen Institut zu promovieren.
Besonders bedanken möchte ich mich bei den Mitarbeitern der AG Amann, allen voran
Monika Klewer, Miriam Reutelshöfer und Stefan Söllner, die mir in vielen
Fragestellungen und bei der Einarbeitung in die notwendigen Arbeitsschritte eine große
Hilfe waren. Auch die Mitdoktoranden trugen durch die gute Einweisung in die
Methodik und ihre große Hilfsbereitschaft maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.
Schließlich gilt mein Dank meiner Familie, die den Fortgang der Arbeit mit großem
Interesse verfolgt und mich während jeder Arbeitsphase in vielerlei Hinsicht unterstützt
hat. Ganz besonders danke ich Matthias für seine grenzenlose Geduld, seinen Zuspruch
und seine Unterstützung.
101 Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliches
Name Mareile Arntrudis Bezold, geb. Frank
Eltern Bernd Frank
Maria Frank
Geboren 22.09.1984 in Bayreuth
Werdegang
1990 – 1994 Besuch der Grundschule Herzoghöhe, Bayreuth; Klassen 1-4
1994 – 2003 Besuch des Humanistischen Gymnasium Christian Ernestinum, Bayreuth; Klassen 5-13
Abitur im Jahr 2003 mit Notenschnitt 1,0
Juni 2003 Erfolgreiches Ablegen der Stipendienprüfung zur Bayerischen Hochbegabtenförderung
Seit Oktober 2003 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
September 2005 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Famulaturen
03-04/2006 Famulatur im Labor für klinisch-chemische Demenzdiagnostik
08-09/2006 Unterassistentin in der Inneren Medizin am Universitätsspital Basel
09/2006 Famulatur in der Frauenklinik Bayreuth
8/2007 Famulatur in der Kinder- und Jugendpsychiatrie Erlangen
Dissertation
10/2006 Beginn der Dissertation am Pathologisch-Anatomischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg
Praktisches Jahr
102 Lebenslauf
08-12/08 Innere Medizin am Universitätsspital Basel/Schweiz
12/08-03/09 Chirurgie in der Allgemein- und Unfallchirurgie am Klinikum Bayreuth
03-07/09 Kinder- und Jugendpsychiatrie am Zentrum für psychische Gesundheit von Kindern und Jugendlichen der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Auszeichnungen
Stipendium Stipendiatin der Bayerischen Hochbegabtenförderung (BayBFG)