Valoración microbiológica de ATB
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Ensayo de Rectas
Paralelas
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Ensayo de rectas paralelas.
Condiciones necesarias para el cumplimiento delmodelo:
1) LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS DEBEN ASIGNARSEAL AZAR A LAS UNIDADES EXPERIMENTALES.
2) LAS RESPUESTAS A CADA TRATAMIENTO SEDISTRIBUYEN NORMALMENTE.
3) LA DESVIACIÓN TIPICA, S=√S2 , DE LA RESPUESTADENTRO DE CADA GRUPO DE TRATAMIENTO ESINDEPENDIENTE DE LA RESPUESTA MEDIA.
) LA RELACIÓN ENTRE EL LOGARITMO DE LA DOSIS YLA RESPUESTA PUEDE REPRESENTARSE POR UNALINEA RECTA A LO LARGO DEL INTERVALO DE DOSIS
USADAS.!) PARA CUAL"UIER PREPARACIÓN DESCONOCIDA
EN EL ENSAYO, LA L#NEA RECTA DEBE SER PARALELAA LA DEL PATRÓN.
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Ensayo de Rectas Paralelas
En la curva Dosis Respuesta establecimos el rango de linealidadentre el Log Dosis y la respuesta.
LogDosis
Rta.
Rango
Rta. = β Log (Dosis) + α
Para el StandardY(DS) = β Log DS+ α
Para la Muestra
Y(DM) = β Log DM+ α DM = ?
Para la Muestra
Y(DM) = β Log (DM sup .R)+ α
= Pot Std (xS)
DM= R.DMsup
Para la Muestra
Y(DM) = β Log DM sup + β LogR+ α
α’
R=Pot.Mtra.real (DM)
Pot Mtra.Supuesta
(DMsup
)
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Ensayo de Rectas Paralelas
Para el Standard Y(DS) = β Log DS+ α
Y(DS) -Y(DM)- = β Log DS + α −β Log DM sup − β LogR− α
Pot Mtra.Sup (DMsup) = Pot Std (Ds)
Para la Muestra Y(DM) = β Log DM sup + β LogR+ α
Pot Mtra.real (DM) = R. Pot Mtra.Supuesta (DMsup)
Y(DS) −Y(DM) = Log DS − Log DMsup − LogR
β
LogR = Log DS − Log DM sup + Y(DM) -Y(DS)β
M =
R = antiLog Y(DM) -Y(DS)
β
xS x M
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Diseño Experimental
Es el plan formal para la realización de un
experimento.
Incluye la selección de: respuestas, factores,
niveles, tratamientos, restricciones, etc.
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Diseño completamente aleatorio
• Cada unidad experimental recibe untratamiento.
• La asignación de las unidades a los
tratamientos debe hacerse en forma aleatoria.
• Se utiliza cuando la totalidad de las unidades
experimentales parecen ser razonablementehomogéneas.
• Cuando no hay evidencia que el entorno
experimental puede dar una variación sesgadaa un grupo de repuestas.
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Diseño en bloque aleatorio
• Cada unidad experimental recibe todoslos tratamientos.
• En este diseño es posible segregar una
fuente identificable de variación, como lavariación entre placas Petri en un ensayo por
difusión.
• Cuando no hay evidencia que el entorno
experimental puede dar una variación sesgadaa un grupo de repuestas.
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Diseño en cuadrado latino
S1 M1 M2 S3 S2 M3
M1 M3 S1 S2 M2 S3
M2 S3 S2 S1 M3 M1S3 S2 M3 M1 S1 M2
S2 M2 S3 M3 M1 S1
M3 S1 M1 M2 S3 S2
Este diseño puede ser utilizado tanto en el ensayo
en placa como en el ensayo en tubo. Lo que lo
diferencia de los otros ensayos es la distribuciónespacial de los tratamientos.
El diseño consiste en que cada tratamiento se
encuentre una vez en todas las filas y en todaslas columnas.
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PRINCIPIOS DEL ANOVA
Yijk = µ + ε + αi
∆Ybloques/filas+ ∆Ycolumnas+
+ β j + γ k
ε N (0;σ)
∆Yerror ∆Ytratamientos+( Yijk Ymedia) =
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PRINCIPIOS DEL ANOVA
• SCtotales= SCerror+ SCtratamientos+ SCbloques
No aplicable a Diseño
Completamente Aletorizado
SCRegresión SCDesvio Linealidad SCDesvio Paralelismo SCPreparaciones+ + +
∆YCurvatura Combinada ∆YCurvatura Opuesta+
(k-1)
(1)
(n-1)(Por sustracción)
N: número de respuestas totales
h: número de preparaciones
d: número de dosis
n: número de replicas (o bloques)
k=h x d : número de tratamientos
h. (d-2) (h-1) (h-1)
(h-1) (1)
(N-1)
+ SCcolumnas
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ANOVA y pruebas de validez para un diseño en bloques
Fuente variac g l SC CM=SC/gl Fexp=CM/CMerr
Preparac. 1 [(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n
Regresión 1 [(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
Paralelismo 1 [(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
Curvatura comb. 1 [(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2
/12nCurvatura op. 1 [(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Desv. lineal. 2 SC curv. comb + SC curv. opuesta
Tratamient. d-1 [(S12+S2
2+S32+U1
2 +U22+U3
2)/n]-G2 /N
Bloques n-1 (∑R j2 / 6)-G2 /N
Error (N-6)-(n-1) SC total - SC tratam- SC bloques s2
Total N-1 ∑Y2 - G2 /N
k =dxh = nº de tratamientos G2 /N = (
yi )2 / N
n = nº de respuestas de cada tratamiento (replicas) yi = respuesta individualN = nº total de respuestas
R j = sumatoria de todos los valores experimentales del bloque j.
SC = suma de cuadrados CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patrón
s2 = Estimador de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.
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• Obtención del estadístico de pruebaPara cada Fuente de Variación que se quiere corroborar
Fcalculado= CM Fuente de variación
CMError =
ANOVA y pruebas de validez:
S 2
•Regresión•Desviación Linealidad
•Desviación Paralelismo
•Preparaciones
•Bloques
F F (g.l.efecto;g.l.error)
Sea o no la H0 verdadera E ( CMerror) = σ2
Si y solo sí, H0 es verdadera E ( CMefecto a medir) = σ2
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•Comparar contra el valor de tabla de Fisher parauna determinada probabilidad con los grados de
libertad correspondientes al CM del numerador y del
denominador
Zona de Rechazo
Si Fcalculado > F (α;1,N-d)
Se rechaza H0 con un nivel de significación α.
α= 0,0595%
4,242 7,77
α= 0,01
ANOVA y pruebas de validez:
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Significado estadístico del test:
Fcalculado
α= 0,0595%
4,242 7,77
P< 0,01
α= 0,01
• Cuando el F calculadoes mayor que el F tabla se pude decir que el
termino es SIGNIFICATIVO ( la variación del termino comparado
es mucho mas importante que la del Error Experimental).
• En este caso el nivel de significación α representaría:
– La probabilidad máxima de equivocarme al decir que el efecto
es SIGNIFICATIVO. (probabilidad máxima de equivocarme
al rechazar H0)
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• Cuando el F calculado es menor que el F tabla se pude decir que el
termino es NO SIGNIFICATIVO ( la variación del termino
comparado NO es importante con respecto al Error Experimental).
Significado estadístico del test:
α= 0,0595%
4,242 7,77
α= 0,01
2,92
P > 0,05
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ANOVA y pruebas de validez:
•Regresión
-Es el termino que relaciona el cambio de respuesta con el
cambio de dosis.
para Log D2 > Log D1H0 : Y2 = Y1 H1: Y2 ≠ Y1
β = 0 β ≠ 0-El CMRegresión.da idea del valor de la pendiente del ensayo (a
mayor pendiente mayor CMRegresión.).
Log D2Log D1
Error
R
e
g
r
es
i
ó
n
En el caso del Fcalculado > Ftabla. α=0,05implicara que la Diferencia entre Dosis es
SIGNIFICATIVA con respecto al error
experimental.
La probabilidad de equivocarme al rechazar
H0 es menor al 5 %.
En el caso del Fcalculado > Ftabla. α=0,01
implicara que la Diferencia entre Dosis esMUY SIGNIFICATIVA.
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ANOVA y pruebas de validez:
•Desviación del paralelismo
-Es el termino que relaciona la diferencia de pendientes entre las
distintas preparaciones.
H0 : βStd = βMtra H1 : βStd ≠ βMtra
Error
∆β =βStd - βMtraβ =∆Y
∆x
Log D3Log D1
ε =∆YStd - ∆YMtra
En el caso del Fcalculado < Ftabla. α=0,05Implicara que la Diferencia entre las
pendientes es NO SIGNIFICATIVA con
respecto al error experimental.
En este caso no se podrá rechazar H0porque de hacerlo se realizaría con un error
mayor al 5% (P> 0,05) .
En el caso de que la desviación sea
SIGNIFICATIVA el ensayo es invalido porincumplimiento del principio de similitud.
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ANOVA y pruebas de validez:
En el caso del Fcalculado < Ftabla. a=0,05Implicara que la Diferencia entre las
Preparaciones es NO SIGNIFICATIVA con
respecto al error experimental.
Si el Fcalculado > Ftabla. a=0,05 la diferencia entrepreparaciones es significativa. Esto no invalida el
ensayo pero lleva aparejado una disminución
considerable de la precisión.
Error
Log D3Log D1
Prep
•Preparaciones
-Es el termino que relaciona la diferencia de respuestas media
entre las distintas preparaciones.
H0 : YStd = Ymtra H1 : YStd ≠ Ymtra-Refleja la diferencia entre las respuestas entre las Preparaciones
y por ende en sus potencias .
ε = YStd - YMtra
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ANOVA y pruebas de validez:
•Desviación de la Linealidad-Es el termino que relaciona la falta ajuste ,para un modelo
lineal, del aumento de la respuesta en función del Log Dosis.
H0 : µi = a+bxi H1 : µi ≠ a+bxi
DesviaciónLinealidad
Log D3Log D1
Error
Para evaluar la desviación de la
Linelidad se desglosa en el
estudio de las Curvaturas.
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El estudio de las Curvaturas se hace a través de las derivadas
segundas.
Para una Recta la derivada segunda = 0.Las funciones no lineales tendrán derivadas segundas ≠ 0
y = a+bx = a+∆y x
∆xf(x)
•Desviación de la Linealidad (continuación)
ANOVA y pruebas de validez:
f ’’(x)
f ’(x)
∆∆y = (y3-y2) - (y2-y1) =
= y3 -2y2 +y1 = Q
∆y = y2-y1 = y3-y2
∆x x2-x1 x3-x2
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ANOVA y pruebas de validez:
•Desviación de la Linealidad (continuación) Estudio de curvaturas
-Curvatura Combinada: la suma de ambas curvaturas no debe ser
significativa. ε = Qs+ Qu-Curvatura Opuesta: la resta de ambas curvaturas no debe ser
significativa. ε = Qs- Qu
Log D3Log D1Log D3Log D1
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ANOVA y pruebas de validez:
•Bloque
-Es el termino que relaciona la diferencia entre los distintas
bloques, independientemente de los tratamientos.
H0 : µ1 = µ2 = µ j H1 :algun µ ≠ µ j
En el caso del Fcalculado < Ftabla. a=0,05implicara que la diferencia entre las bloques es
NO SIGNIFICATIVA con respecto al error
experimental.
Si el Fcalculado > Ftabla. a=0,05 la diferencia entre
bloques es significativa. Esto no invalida elensayo pero es necesaro reevaluar los criterios de
validez sin tener en cuenta la placa anomala.
β1=β2=β j=0 algun β ≠ 0
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Paralelismo= Signif .
Regresión= Signif.
Desv. Linealidad= Signif.
Dif. e/ Preparaciones= Signif.
Error residual= grande
Dif. e/ Bloques= Signif.
Aceptar el ensayo
y el cálculo de Potencia
Repetir el ensayo y
ajustar la Pot. supuesta
Rechazar
el ensayo
Descartar placaanómala
ANOVA
Modelo de líneas paralelas
SI
NO
NO
SI
SI
NO
SI
NOSI
NO
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DATOS PERDIDOS
La simplicidad del diseño equilibrado puede perderse por la
perdida de una respuesta, pero puede mantenerse
reemplazando la respuesta perdida por un valor calculado.
La perdida de información se tiene en cuenta disminuyendo
los grados de libertad de la SCtotal y de la SCerror.
Los valores reemplazados no deben ser superiores al 5 % delas respuestas.
• Diseño Completamente Aleatorio.
El valor perdido puede ser reemplazado por la media
aritmética de las otras respuestas del mismo tratamiento.
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B’ = suma de respuestas del bloque o fila..
C’ = suma de respuestas de la columna.
T’ = suma de respuestas del tratamiento.
G’ = suma de todas las respuestas registradas.
DATOS PERDIDOS
• Diseño en Bloque Aleatorio.
y’ = n B’ + k T’ - G’(n-1) (k-1)
• Diseño en Cuadrado Latino.
y’ = k (B’+ T’ + C’) - 2G’
(k-1) (k-2)
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CÁLCULO DE POTENCIA
Ýu =(U1 +U2+U3) / 3 n
Ýs = (S1 +S2+S3) / 3 n
b =[(S3- S
1)+( U
3- U
1)] / 4 n I
I=log 2da dosis - log 1ra dosis
log R (relac de pot.) = M (log de la pot.) = (Ýu - Ýs) / b
Log D3Log D1
M
R = antilog MP = R x Psupuesta
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CORRECCION POR PESADA
Potmtrasup x pesorealmtra
Potmtrateor x pesomtrateor
=Potstdreal x pesorealstd
Potstdteor x pesoteorstd
x pesorealmtra
Potmtrateor x pesomtrateor= pesorealstd
pesoteorstd
Potmtrasup x
Preal = R x Psup
Potstdteor x pesoteorstd x f dilución = Potmtrateor x pesoteormtra x f dilución
Vteor Vteor
Potstdreal x pesorealstd x f dilución = Potmtrasup x pesorealmtra x f dilución
Vreal Vreal
R x Potmtrateor x pesomtrateor x pesorealstd
pesorealmtra pesoteorstd
=
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CÁLCULO DEL INTERVALO DE CONFIANZAMs
C x M ± V (C - 1) (C x M2 + c' I2)MI
C = E/E-s2 t2
E = SC regresión
S2
= Estimador de la varianza por el CM del error en el ANOVA.t = Estadístico de Student.M = Logaritmo de la relación de Potencias.c' = 4/3 hh = nº preparacionesI = Logaritmo de la relación entre dosis adyacentes.
Rs = antilog Ms Ps = Rs x Pot. supuesta Ls= (Ps- P)/Px100RI = antilog Mi PI = RI x Pot. supuesta Li= (P - PI)/Px100
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Fuente g l SC CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr
Preparac. 1 [(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n
Regresión 1 [(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
Paralelismo 1 [(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
Curvatura comb. 1 [(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Curvatura op. 1 [(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Desv. lineal. 2 SC curv. comb + SC curv. opuesta
Tratamient. k-1 [(S1
2+S2
2+S3
2+U1
2 +U2
2+U3
2)/n]-G2 /N
Error (N-k) SC total - SC tratam s2
Total N-1 ∑Y2 - G2 /N
k = nº de tratamientos
n = nº de respuestas de cada tratamiento (replicas)N = nº total de respuestas
G2 /N = (∑yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patróns2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.
ANOVA y pruebas de validez para un diseñocompletamente aleatorio
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Fuente g l SC CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr
Preparac. 1 [(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n
Regresión 1 [(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
Paralelismo 1 [(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
Curvatura comb. 1 [(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Curvatura op. 1 [(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Desv. lineal. 2 SC curv. comb + SC curv. opuesta
Tratamient. k-1 [(S1
2+S2
2+S3
2+U1
2 +U2
2+U3
2)/n]-G2 /N
Error (N-k) SC total - SC tratam s2
Total N-1 ∑Y2 - G2 /N
k = nº de tratamientos
n = nº de respuestas de cada tratamiento (replicas)N = nº total de respuestas
G2 /N = (∑yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patróns2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.
ANOVA y pruebas de validez para un diseñocompletamente aleatorio
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Fuente g l SC CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr
Preparac. 1 [(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n
Regresión 1 [(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
Paralelismo 1 [(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
Curvatura comb. 1 [(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Curvatura op. 1 [(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Desv. lineal. 2 SC curv. comb + SC curv. opuesta
Tratamient. k-1 [(S12+S2
2+S32+U1
2 +U22+U3
2)/n]-G2 /N
Error (N-k) SC total - SC tratam s2
Total N-1 ∑Y2 - G2 /N
k = nº de tratamientos
n = nº de respuestas de cada tratamiento (replicas)N = nº total de respuestas
G2 /N = (∑yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patróns2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.
ANOVA y pruebas de validez para un diseñocompletamente aleatorio
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Fuente g l SC CM=SC/gl Fexp= CM/CMerr
Preparac. 1 [(S1 +S2+S3)-( U1 +U2+U3)]2 /6n
Regresión 1 [(S3- S1)+( U3 - U1)]2 /4n
Paralelismo 1 [(S3- S1) - ( U3 - U1)]2 /4n
Curvatura comb. 1 [(S1 - 2S2+S3)+( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Curvatura op. 1 [(S1 - 2S2+S3)-( U1 -2U2+U3)]2 /12n
Desv. lineal. 2 SC curv. comb + SC curv. opuesta
Tratamient. k-1 [(S12+S2
2+S32+U1
2 +U22+U3
2)/n]-G2 /N
Error (N-k) SC total - SC tratam s2
Total N-1 ∑Y2 - G2 /N
k = nº de tratamientos
n = nº de respuestas de cada tratamiento (replicas)N = nº total de respuestas
G2 /N = (∑yi )2 / N
yi = respuesta individual
SC = suma de cuadrados CM = cuadrado medio
S1 = sumatoria de respuestas para la dosis 1 del patróns2 = Estimado de la varianza correspondiente al cuadrado medio del error.
ANOVA y pruebas de validez para un diseñocompletamente aleatorio
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Bibliografía:
• Farmacopea Argentina Séptima Ed
• Real Farmacopea Española.• Elementos de Bioestadistica. Cátedra de matemática (FFyB - UBA)
• Farmacopea Europea.
• William Hewitt Microbiogycals Assay.
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¡Muchas Gracias!