Valoración de las Técnicas LLLT y PDT en la Mejora de la Cicatrización de Heridas … · 2021....
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©INAOE 2019 Derechos Reservados El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir copias de esta tesis en su totalidad o en partes mencionando la fuente. Valoración de las Técnicas LLLT y PDT en la Mejora de la Cicatrización de Heridas Cutáneas Por: Ulises González Reyes Tesis como requisito para obtener el grado de: Maestro en Ciencias y Tecnologías Biomédicas En el: Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica Agosto de 2019 Tonantzintla, Puebla Supervisada por: Director de Tesis: Dra. Teresita Spezzia Mazzocco Co-asesores: Dra. Wendy A. García Suastegui, Dr. Juan P. Padilla Martínez
Transcript of Valoración de las Técnicas LLLT y PDT en la Mejora de la Cicatrización de Heridas … · 2021....
©INAOE 2019
Derechos Reservados
El autor otorga al INAOE el permiso de
reproducir y distribuir copias de esta tesis en su
totalidad o en partes mencionando la fuente.
Valoración de las Técnicas LLLT y PDT en
la Mejora de la Cicatrización de Heridas
Cutáneas
Por:
Ulises González Reyes
Tesis como requisito para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias y Tecnologías Biomédicas
En el:
Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y
Electrónica
Agosto de 2019
Tonantzintla, Puebla
Supervisada por:
Director de Tesis: Dra. Teresita Spezzia Mazzocco
Co-asesores: Dra. Wendy A. García Suastegui,
Dr. Juan P. Padilla Martínez
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Agradecimientos
Quedo especialmente agradecido con mis asesores, la Dra. Teresita Spezzia Mazzocco,
la Dra. Wendy A. García Suastegui y el Dr. Juan P. Padilla Martínez por su amistad,
apoyo, comentarios y sugerencias que me dieron durante el desarrollo de esta
investigación.
Agradezco también al grupo de Biofotónica, de esta institución (INAOE) por el diseño y
fabricación de las fuentes de luz que se utilizaron en el proceso experimental.
Especialmente a los doctores Rubén Ramos Ramírez y Julio César Ramírez San Juan por
la asesoría científica y técnica.
Agradezco de igual manera al laboratorio en donde realice gran parte del proceso
experimental el laboratorio de Biología y Toxicología de la Reproducción del Instituto
de Ciencias, BUAP. A mis compañeros y amigos de trabajo por su gran apoyo, amistad
y por hacer tan especial el tiempo que pasamos en este lugar.
Agradezco al personal del bioterio Claude Bernard de la BUAP, por recibirme siempre
tan amablemente, por proporcionar y cuidar de los animales que se emplearon en el
proceso experimental y por permitirme realizar las practicas pertinentes en este lugar.
Agradezco a la Dra. Hayde Peregrina Barreto por su valiosa contribución en el análisis
de imágenes histológicas.
Agradezco especialmente a mi familia, las personas que tanto quiero y que han sido un
apoyo muy fuerte durante mi desarrollo profesional, gracias por su amor, comprensión
y apoyo incondicional en todo momento.
Finalmente, le doy las gracias al INAOE que, a través del apoyo económico, de
hospedaje y alimento pude realizar mis estudios de maestría.
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Resumen
La terapia de luz de bajo nivel (LLLT; Por sus siglas en inglés) y la terapia fotodinámica
(PDT; Por sus siglas en inglés) son dos técnicas biofotónicas que ofrecen una solución
alternativa de bajo costo y con mínimos o nulos efectos secundarios a problemas
médicos como lo son las heridas crónicas. En el presente estudio se evaluó a la LLLT y a
la PDT en la mejora del proceso de cicatrización de heridas cutáneas.
La PDT involucra la activación de un colorante fotosensibilizador con una longitud de
onda específica. Los fotosensibilizadores (FSs) utilizados fueron azul de metileno (AM)
y rosa de bengala (RB), los cuales fueron activados a 633 nm (luz roja) y 532 nm (luz
verde) respectivamente. La densidad de energía empleada en la activación de los FSs
fue de 10 J/cm^2. Esta misma densidad de energía (10 J/cm^2) fue utilizada como dosis
de luz para la LLLT en longitudes de onda dentro del espectro del azul, verde y rojo;
Además se analizó el efecto de la LLLT en una terapia que combina las tres longitudes
de onda (10 J/cm^2 de luz azul, 10 J/cm^2 de luz verde y 10 J/cm^2 de luz roja).
El trabajo se realizó con un total de 35 ratas alopécicas (Rattus orvegicus) divididas
aleatoriamente en 7 grupos experimentales: i) Control, ii) LLLT R, iii) LLLT V, iv) LLLT
A, v) LLLT RVA, vi) PDT-AM y vii) PDT-RB. Para todos los animales de cada grupo, se
realizaron 2 heridas circulares (1 cm de diámetro) en el dorso. Posteriormente, se realizó
el tratamiento respectivo en cada herida a los días 0, 1, y 2 y se monitoreó el proceso de
cicatrización mediante fotografías diarias hasta el día 21. Para estudiar los cambios
histológicos provocados en el tejido epitelial se sacrificaron periódicamente los animales
de experimentación correspondientes (días 3, 5, 7, 14 y 21) y se realizaron biopsias sobre
la región de las heridas, las cuales fueron procesadas y evaluadas mediante cortes
histológicos y tinción hematoxilina y eosina (HE). Los resultados demuestran que
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ambos tipos de tratamiento (LLLT y PDT) tuvieron un efecto beneficioso sobre el
proceso de cicatrización, especialmente se observó un proceso de reepitelización
mejorado que al de los controles. La LLLT roja y la LLLT con azul, verde y rojo,
mostraron una buena separación y reestructuración de las capas epiteliales, la LLLT
verde, en especial la LLLT azul promovieron principalmente la formación de la
epidermis, de igual manera que la PDT verde con RB en donde se observó una
exagerada respuesta en la formación de la capa epidérmica. Por su parte la PDT roja con
AM favoreció la diferenciación celular, la aparición de mayor número de vasos
sanguíneos, glándulas y otras estructuras cutáneas como folículos, en todo el tejido
nuevo cicatricial lo que sugiere una re-funcionalización del tejido durante el proceso de
cicatrización, lo cual no se observó en las muestras de ratas no tratadas.
Palabras clave: terapia fotodinámica, heridas cutáneas, fotosensibilizador.
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Índice general
CAPÍTULO 1 .................................................................................................................................... 11
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 11
1.1 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................... 12
1.2 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................. 14
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................ 14
CAPÍTULO 2 .................................................................................................................................... 15
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................ 15
2.1 HISTOLOGÍA DE LA PIEL ............................................................................................................ 15
2.1.1 EPIDERMIS .............................................................................................................................. 16
2.1.1.1 ESTRATOS EPIDÉRMICOS ..................................................................................................... 17
2.1.2 DERMIS .................................................................................................................................. 18
2.1.3 HIPODERMIS .......................................................................................................................... 18
2.1.4 ANEXOS CUTÁNEOS ................................................................................................................ 19
2.1.4.1 COMPLEJO PILOSEBÁCEO ..................................................................................................... 19
2.1.4.2 GLÁNDULAS SUDORÍPARAS ................................................................................................ 20
2.2 CICATRIZACIÓN DE HERIDAS .................................................................................................... 20
2.2.1 HEMOSTASIA .......................................................................................................................... 21
2.2.2 FASE VASCULAR ..................................................................................................................... 21
2.2.3 FASE INFLAMATORIA .............................................................................................................. 22
2.2.4 FASE PROLIFERATIVA ............................................................................................................. 22
2.2.5 FASE DE REMODELADO ........................................................................................................... 23
2.3 BIOLOGÍA CELULAR ................................................................................................................... 23
2.3.1 LA MITOCONDRIA .................................................................................................................. 23
2.3.2 CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES ............................................................................ 24
2.4 BIOFOTÓNICA ........................................................................................................................... 26
2.4.1 NATURALEZA DUAL DE LA LUZ ............................................................................................... 27
2.4.2 NATURALEZA DE LA LUZ COMO PARTÍCULA ........................................................................... 27
2.4.3 PROPAGACIÓN DE LA LUZ COMO ONDA ................................................................................. 28
2.4.4 ABSORCIÓN Y ESPARCIMIENTO .............................................................................................. 30
2.5 LLLT ......................................................................................................................................... 31
2.5.1 EFECTOS DE LA LLLT EN LAS CÉLULAS ................................................................................... 31
2.5.2 EFECTOS DE LA LLLT EN LA RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL Y LA SÍNTESIS DE ATP ............... 32
2.5.3 EFECTO DE LA LLLT EN EL POTENCIAL REDOX ....................................................................... 33
2.6 PDT .......................................................................................................................................... 33
2.6.1 FS EN PDT .............................................................................................................................. 34
8
2.6.2 FS AM .................................................................................................................................... 36
2.6.3 FS RB ..................................................................................................................................... 36
CAPÍTULO 3 .................................................................................................................................... 38
3. ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 38
CAPÍTULO 4 .................................................................................................................................... 43
4. METODOLOGÍA ........................................................................................................................... 43
4.1 PRÁCTICAS CON MODELOS MURINOS ....................................................................................... 43
4.2 MATERIAL BIOLÓGICO Y CONDICIONES AMBIENTALES ............................................................ 44
4.3 GENERACIÓN DE HERIDAS ........................................................................................................ 46
4.4 TOMA DE FOTOGRAFÍAS ........................................................................................................... 49
4.5 PRÁCTICA DE PDT Y LLLT ....................................................................................................... 50
4.5.1 PREPARACIÓN FSS ................................................................................................................. 51
4.5.2 FUENTES DE LUZ Y DOSIS EMPLEADAS .................................................................................... 51
4.6 TOMA DE BIOPSIAS ................................................................................................................... 53
4.7 DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN DE BIOPSIAS .......................................................................... 55
4.8 CORTES HISTOLÓGICOS ............................................................................................................ 56
4.9 TINCIÓN DE CORTES HISTOLÓGICOS ........................................................................................ 59
4.10 TOMA DE FOTOGRAFÍAS DE LAS HISTOLOGÍAS ....................................................................... 61
4.11 ANÁLISIS DE IMÁGENES DE LAS HERIDAS ............................................................................... 63
4.12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................................... 65
4.13 ANÁLISIS DE HOMOGENEIDAD DE LAS IMÁGENES HISTOLÓGICAS ......................................... 66
CAPÍTULO 5 .................................................................................................................................... 69
5. RESULTADOS .............................................................................................................................. 69
5.1 RESULTADOS LLLT ................................................................................................................... 69
5.1.1 FOTOGRAFÍAS CONVENCIONALES DE LOS GRUPOS LLLT ...................................................... 69
5.1.2 HISTOGRAMAS TRIDIMENSIONALES DE LOS GRUPOS LLLT .................................................. 71
5.1.3 CONTRACCIÓN DE LA HERIDA DE LOS GRUPOS LLLT ............................................................ 73
5.1.4 ANÁLISIS HISTOLÓGICO DE LOS GRUPOS LLLT ..................................................................... 75
5.2 RESULTADOS PDT .................................................................................................................... 88
5.2.1 FOTOGRAFÍAS CONVENCIONALES E HISTOGRAMAS TRIDIMENSIONALES DE LOS GRUPOS
PDT ................................................................................................................................................ 88
5.2.2 CONTRACCIÓN DE LA HERIDA DE LOS GRUPOS PDT ............................................................. 89
5.2.3 ANÁLISIS HISTOLÓGICO DE LOS GRUPOS PDT ...................................................................... 92
5.3 RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE HOMOGENEIDAD ..................................................................... 98
CAPÍTULO 6 .................................................................................................................................. 104
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 104
CAPÍTULO 7 .................................................................................................................................. 112
7. CONCLUSIÓN ............................................................................................................................ 112
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Tabla 1 Descripción de parámetros utilizados
Parámetro Unidad Descripción
Longitud de onda nm Distancia real que recorre una
perturbación electromagnética en un
determinado intervalo de tiempo
Irradiancia W cm^2 Magnitud utilizada para describir la
potencia incidente por unidad de
superficie
Energía J Magnitud para medir la cantidad de carga
Tiempo s Es necesario para dosificar la irradiación
Densidad de
energía
J cm^2 Potencia por tiempo
Estructura de
pulso
Poder (W)
Frecuencia
(Hz)
Potencia de la fuente
Frecuencia de oscilaciones sobre tiempo
Lista de Acrónimos
➢ LLLT: Acrónimo en inglés de terapia de luz de bajo nivel
➢ PDT: Acrónimo en inglés de terapia fotodinámica
➢ FS: Fotosensibilizador
➢ FSs: Fotosensibilizadores
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➢ AM: Azul de metileno
➢ RB: Rosa de bengala
➢ HE: Hematoxilina y eosina
➢ IR: Infrarrojo
➢ UV: Ultravioleta
➢ LED: Acrónimo en inglés de diodos emisores de luz
➢ ROS: Acrónimo en inglés de especies reactivas de oxígeno
➢ HTS: Homogeneidad del tejido sano
➢ HTC: Homogeneidad del tejido cicatricial
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Capítulo 1
1. Introducción
Una característica importante de la biofotónica radica en el uso de la luz para
diagnóstico y tratamiento de enfermedades. La LLLT y la PDT son ejemplos claros del
uso de la luz con fines médicos y serán punto de observación y evaluación en este
trabajo. Estas técnicas constituyen un área multidisciplinaria que ha experimentado un
crecimiento considerable en las actividades de investigación en todo el mundo. La
LLLT es una técnica no invasiva y la PDT es una técnica mínimamente invasiva de la
biofotónica, ambas técnicas pueden influir significativamente en los sistemas biológicos
y pretenden dar solución a problemas que van en crecimiento y que la medicina aún no
ha logrado controlar eficazmente; tal es el caso de las heridas crónicas, problemas de
deformación ósea o regeneración de tejidos [1].
La LLLT surge a partir de los experimentos del Dr. Endre Mester, en la Universidad
Médica Semmelweis (Hungría) en 1967. Mester rasuró el dorso de ratones, indujo la
formación de tumores y aplicó luz láser de rubí (694 nm) intentando curar el tumor
maligno en los ratones, solo que debido a un error en el experimento Mester solo aplicó
una fracción de la energía que se necesitaba para tratar el tumor. Mester no curó ningún
tumor, sin embargo observó una mayor tasa de crecimiento de vello en los ratones
tratados en comparación con los controles, a lo que llamó efecto "bioestimulación con
láser" [2]. Actualmente es una técnica en desarrollo que consiste en la aplicación de luz
de baja densidad con el fin de promover la regeneración de tejidos, efectos analgésicos y
disminuir la inflamación [3].
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En cambio, la PDT es una técnica que utiliza fuentes de luz para activar fármacos
fotosensibles denominados FSs los que a su vez pueden producir especies reactivas de
oxígeno (ROS; por sus siglas en inglés) u oxígeno molecular singulete y finalmente la
muerte celular por activación de procesos biológicos. La PDT fue descubierta
accidentalmente hace más de 100 años cuando Oskar Raab y su asesor de doctorado,
Hermann von Tappeiner, de la Universidad de Munich, encontraron que paramecios
(microorganismos acuáticos) teñidos con acridina naranja murieron cuando fueron
colocados en una zona muy iluminada. Posteriormente, encontraron que la acridina
naranja se vuelve tóxica bajo iluminación visible. Con base en esto, Von Tappeiner
propuso la PDT para tratar carcinomas de piel. Sin embargo, esta terapia fue
prácticamente olvidada a pesar de que otro pionero de la PDT, Niels Ryberg Finsen,
obtuvo el premio Nobel de Medicina en 1903, por haber descubierto el efecto
germinicida de la luz UV. La PDT fue redescubierta en la década de 1970 por varios
investigadores estadounidenses que usaron derivados de la hematoporfirina combinada
con luz roja para tratar cáncer de vejiga en animales y humanos. Existe actualmente una
gran controversia sobre el efecto que tienen estas técnicas biofotónicas en la
regeneración del tejido, las dosis óptimas y los procesos tisulares involucrados, por lo
que en este trabajo planteamos estudiar el efecto de diferentes longitudes de onda con y
sin FSs con la finalidad de aportar nuevo conocimiento del tema.
1.1 Justificación
Las heridas se encuentran entre los problemas de salud más comunes en todo el
mundo. Tan solo en los Estados Unidos de América, aproximadamente 6.5 millones de
personas sufren úlceras crónicas y cada año se gastan más de 25 mil millones de dólares
en complicaciones relacionadas con las heridas [4]. De acuerdo con la Organización
Internacional del Trabajo (ILO; por sus siglas en inglés) se estima que en todo el mundo
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cada 15 segundos, 153 trabajadores tienen un accidente laboral [5]. Dicha prevalencia
relativamente alta de heridas y los altos costos de operación ha impulsado el rápido
aumento de los métodos alternativos de curación de heridas [5]. Las enfermedades
cardiovasculares, alergias, diabetes o infecciones alteran el proceso de cicatrización, sea
consecuencia de la propia afección en el organismo o como efecto de los fármacos
utilizados en su tratamiento lo que puede desarrollar heridas crónicas, después de una
lesión simple [6].
La LLLT ha demostrado ser una esperanza prometedora para muchos pacientes;
muestra una alta eficacia terapéutica para heridas crónicas, especialmente heridas en la
piel, úlceras diabéticas y heridas necróticas. La LLLT está ampliamente estudiada para
longitudes de onda dentro del rango del rojo e infra rojo cercano (IRC) sin embargo hay
pocos estudios para longitudes de onda dentro del espectro de color verde y aún menos
estudios de los efectos en longitudes de onda dentro del color azul. De aquí la
importancia de nuestro trabajo ya que se realizará una comparativa de los efectos
empleando estas tres bandas de luz dentro del espectro visible (rojo, verde y azul).
En cambio, la PDT es una técnica principalmente utilizada para eliminar células
cancerígenas, o infecciones microbianas. Existen pocos estudios del papel que juega en
la regeneración de tejidos. Por lo que en este trabajo proponemos evaluar el efecto de la
PDT en el proceso de cicatrización de heridas modulando la densidad de energía a
dosis bajas de luz, y empleando dos FSs distintos.
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1.2 Objetivo general
Valorar la eficiencia de la LLLT con tres diferentes longitudes de onda (en el espectro
del azul, verde y rojo) y la PDT utilizando AM y RB como FSs, en el proceso de la
cicatrización cutánea, utilizando un modelo murino.
1.3 Objetivos específicos
1. Aprender técnicas de manejo y vías de administración de fármacos en animales
de laboratorio.
2. Determinar mediante análisis histológicos y planimétricos, el efecto de la LLLT
con luz azul (450 nm), verde (532 nm) y roja (630 nm) sobre el proceso de
cicatrización empleando una densidad de energía de luz de 10 J/cm^2.
3. Determinar mediante análisis histológicos y planimétricos, el efecto de la PDT
sobre el proceso de cicatrización, usando AM y RB como FSs. Estimulándolos con
luz roja y verde respectivamente, a una densidad de energía de luz de 10 J/cm^2.
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Capítulo 2
2. Marco teórico
2.1 Histología de la piel
La piel es la interfaz que separa el medio interno del externo, se origina inicialmente de
dos capas blastodérmicas: ectodermo y mesodermo. Es el órgano más extenso del
cuerpo humano principalmente esta diferenciado por tres zonas, epidermis, dermis e
hipodermis [7]. Las funciones de la piel están relacionadas íntegramente por su labor
como interfaz entre el medio externo del interno, en la Fig. 1 se observa un esquema de
Figura 1 Caricatura de la estructura de la Piel en la que se muestran las tres pacas principales (epidermis, dermis e hipodermis) y las estructuras que se dan lugar en cada capa de la piel [39]
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la estructura de la piel en la que se representan y se nombran las diferentes capas de la
piel y sus estructuras cutáneas.
La piel funciona como protección contra agentes externos físicos, químicos e
inmunológicos como es el caso de la radiación UV, solventes orgánicos y
sensibilizadores de contacto. Detecta señales sensoriales de dolor, temperatura, tacto
fino, tacto grueso y presión mediante terminaciones nerviosas libres (células de Merkel)
[8].
El equilibrio hidroelectrolítico también es una función vital de la piel, se realiza por
excreción o por barrera mediante glándulas sudoríparas ecrinas, e impide de manera
efectiva la salida de líquido tisular, con lo que evita la deshidratación. De igual manera
regula la temperatura por secreción de sudor y/o regulación del flujo sanguíneo,
mediante glándulas sudoríparas ecrinas y comunicaciones arteriovenosas. Por último,
la piel tiene un efecto de regulación de la libido mediante la secreción de feromonas por
las glándulas sudoríparas apocrinas [9].
2.1.1 Epidermis
La epidermis es la parte más superficial y está separada de la dermis por una delgada
lámina basal que permite su adhesión. La epidermis se organiza en capas
morfológicamente diferentes llamadas estratos, se reconocen de cuatro a cinco estratos
dependiendo de la región corporal (basal, espinoso, gránulos, lucido y corneo).
Constituidos por cuatro células epidérmicas: queratinocitos, melanocitos, células de
Langerhans y células de Merkel [8].
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2.1.1.1 Estratos epidérmicos
Estrato basal: El estrato basal está formado por células cilíndricas que se disponen
generalmente en una sola hilera, se tiñen intensamente con la hematoxilina. En esta
capa se localizan las células madre de los queratinocitos, posen un proceso de mitosis
activa que da lugar a las células de los estratos superiores.
Estrato espinoso: El estrato espinoso está constituido por grandes células poligonales
que se unen entre ellas y a la vez con las capas adyacentes mediante puentes
intercelulares. El número de hileras de queratinocitos es de cuatro a diez dependiendo
de la región corporal de que se trate. Se tiñe pálidamente con la hematoxilina. Los
queratinocitos de las capas superiores de este estrato presentan organelos llamados
cuerpo lamelares, que en su interior contienen glucoproteínas, ésteres de ceramidas,
colesterol y varios complejos enzimáticos, son los que dan lugar a una barrera que se
conoce como barrera epidérmica de permeabilidad.
Estrato granuloso: El estrato granuloso está formado por una a tres hileras de células
romboidales con núcleos ovoides, los queratinocitos en esta fase presentan organelos
redondeados llamados gránulos queratohialina, mismos que le dan lugar a su nombre.
Estos organelos contienen varias proteínas con diferentes funciones, una de las
funciones principales de esta capa proteica es impedir que la membrana plasmática de
los queratinocitos se desintegre una vez haya muerto por apoptosis, además de
sintetizar queratina.
Estrato lúcido: El estrato lúcido se identifica en los sitios donde la piel es más gruesa, es
una línea de células eosinofilias ubicada de manera inmediata por debajo del estrato
córneo en la piel gruesa.
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Estrato córneo: La capa córnea está formada por células de gran tamaño y
extremadamente planas llamadas corneocitos, carentes de núcleo y organelos. El
principal componente proteico de este estrato es la queratina [9].
2.1.2 Dermis
La dermis es la capa situada por debajo de la epidermis y por lo menos es 10 veces más
gruesa que la epidermis, su grosor varía dependiendo de la región corporal, la función
y la cantidad de anexos en ella. La dermis está constituida por tejido conjuntivo, fibras
de colágeno, y fibras elásticas. Las células de la dermis incluyen fibroblastos,
macrófagos, mastocitos y adipocitos y en ella se encuentran vasos sanguíneos, nervios,
glándulas subcutáneas y folículos pilosos. A la parte superior próxima a la epidermis se
le conoce como dermis papilar, a la parte inferior se le conoce como dermis reticular. Se
diferencian por el grosor de las fibras de colágeno, la celularidad y la vascularizad
presentes en ellas. Se une a la epidermis mediante una capa ondulada producida por la
presencia de papilas de tejido conjuntivo laxo [10].
2.1.3 Hipodermis
La hipodermis es la tercera y última capa de la piel, que protege contra impactos, ayuda
a mantener la temperatura del organismo y sirve de apoyo a los anexos cutáneos, es un
tejido adiposo, constituido por adipocitos. En la hipodermis también se encuentra el
soporte de las arterias y los vasos sanguíneos enriquecen la piel. Esta capa profunda
actúa como una interfaz entre la piel y los órganos, hueso o músculos [9].
19
2.1.4 Anexos cutáneos
Se mencionará dos tipos de anexos cutáneos; el complejo pilosebáceo y glándulas
sudoríparas.
2.1.4.1 Complejo pilosebáceo
El complejo pilosebáceo está constituido por el folículo piloso, glándulas sebáceas y
musculo piloerector. El folículo piloso esta diferenciado por tres segmentos.
➢ Infundíbulo
➢ Istmo
➢ Segmento inferior
El infundíbulo comprende desde el poro del conducto hasta el orificio folicular. El
siguiente segmento de llama istmo desde la desembocadura del conducto sebáceo hasta
la inserción del músculo erector, el extremo inferior o bulbo se localiza en el extremo
más profundo hasta la inserción del músculo erector. Es la parte más compleja del
folículo piloso. La papila dérmica, es la responsable del crecimiento del pelo y es rica en
mucopolisacáridos ácidos. La matriz capilar da origen al pelo [11].
Las glándulas sebáceas integran el complejo pilosebáceo, pero también se les puede
encontrar de forma aislada en ciertas regiones corporales, como el pezón y labios
menores, y están ausentes en palmas y plantas. Secretan holocrina sustancia constituida
principalmente por triglicéridos y fosfolípidos.
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2.1.4.2 Glándulas sudoríparas
Las glándulas sudoríparas se diferencian en dos, glándulas sudoríparas ecrinas y
apocrinas. Las glándulas sudoríparas ecrinas distribuidas por toda la superficie cutánea,
excepto en borde libre de labios, lechos ungueales, labios menores, glande y cara interna
de prepucio. En palmas, plantas y axilas su número es mayor. Como todas las glándulas
pose dos grandes segmentos. La zona secretora está formada por estructuras con una
sola capa de células claras y obscuras, ricas en glucógeno. La zona excretora está
constituida por dos grandes hileras de células epiteliales cuboidales basófilas,
uniformes, atraviesa a manera de conducto toda la dermis y penetran en la epidermis.
Las glándulas sudoríparas apocrinas son 10 veces más grandes que las ecrinas cuyo
origen comparte con el complejo pilosebáceo, se pueden encontrar en axilas, región
anogenital y areolas mamarias. Son glándulas odoríferas ya que confieren un olor
característico. De las glándulas sudoríparas apocrinas derivan las glándulas cerumicas
del conducto auditivo, las glándulas de Moll de los párpados y las glándulas mamarias
[9].
2.2 Cicatrización de heridas
La cicatrización es un proceso dinámico encaminado a la reparación correcta de las
heridas, en el que involucra mediadores solubles extracelulares, células sanguíneas,
células de la matriz tisular, y del parénquima.
Figura 2 Línea del tiempo análoga de las fases de cicatrización respecto a los días de cicatrizado.
21
Para facilitar el estudio y comprensión del proceso de reparación de las heridas, se le ha
dividido en fases las cuales ocurren de manera secuencial, pero se superponen en el
tiempo, la Fig. 2 nos muestra un estimado de los días de cicatrizado con respecto a la
fase de cicatrización (hemostasia, vascular, inflamatoria, proliferativa, y remodelado)
[12].
El proceso de cicatrización o curación de heridas está determinado por la continuidad
de cada una de las fases que lo caracteriza (hemostasia, inflamación, proliferación y
remodelación); cuando se presenta algún tipo de alteración que entorpezca su
desarrollo en el tiempo preestablecido como normal, se genera una lesión crónica, la
cual presenta un detenimiento o retraso en la fase de inflamación o en la fase
proliferativa [13].
2.2.1 Hemostasia
Una vez ocurre la lesión, se produce un daño en los vasos sanguíneos, lo que ocasiona
la pérdida de plasma y células. La hemostasia y consecuentemente la coagulación inicia
con la activación de los elementos celulares de la sangre y lleva a la formación del
coágulo o tapón hemostático, proceso en el cual interfiere la cascada de los factores de la
coagulación y el fenómeno de agregación plaquetaria. Las plaquetas también sintetizan
factores de crecimiento con acción mitógena y quimiotáctica en los fibroblastos y
estimulan la epitelización [14].
2.2.2 Fase vascular
En esta fase los neutrófilos migran al intersticio, ahí se dan las interacciones célula-
célula y célula-matriz iniciando así la función de fagocitosis de bacterias y proteínas de
22
la matriz por medio de liberación de enzimas específicas (hidrolasas, proteasas y
lisozimas) y radicales libres de oxígeno. Finalmente, los neutrófilos agotados quedan
atrapados en el coágulo y los que permanecen en tejido viable mueren por apoptosis y
posteriormente son removidos por los macrófagos o fibroblastos [14].
2.2.3 Fase inflamatoria
En este proceso, se produce una acumulación de monocitos que reemplazan a los
neutrófilos. Los monocitos de los vasos, al migrar al tejido se transforman en
macrófagos y se unen a proteínas de la matriz extracelular mediante receptores de
integrina. Así se produce la desinfección del foco y la eliminación del tejido no deseado
facilitado por la liberación de enzimas como las colagenasas. Los macrófagos, una vez
unidos a la matriz extracelular, sufren un cambio fenotípico y pasan de comportarse
como células inflamatorias a células reparadoras, que liberan citoquinas y factores de
crecimiento (TGF α y β, PDGF, FGF y IGF-1) con un importante papel en la
neoformación tisular; procesos descritos permiten la inducción de la angiogénesis y la
formación de tejido de granulación, preparando el lecho de la lesión para la siguiente
etapa fisiológica [15].
2.2.4 Fase proliferativa
En la fase proliferativa el tejido se regenera formando una nueva barrera dérmica, los
fibroblastos constituyen las células más importantes en la producción de la matriz
dérmica, llegan a la herida desde músculo, tendón, fascia y una vez en el lecho de la
lesión, migran con movimientos activos sobre una matriz laxa. Los fibroblastos
depositan una matriz nueva provisional de fibronectina y ácido hialurónico
estimulados por citoquinas y factores de crecimiento, para comenzar a sintetizar la
23
matriz de colágeno. Una vez que se depositó una suficiente cantidad, cesa la
producción, la misma matriz se inhibe la proliferación de fibroblastos y la síntesis de
colágeno. Mientras que los queratinocitos migran a la membrana basal desde los
bordes de la herida o desde los anexos y mediante el proceso de mitosis activa de los
queratinocitos reconstruyen los estratos superiores de la epidermis[15].
2.2.5 Fase de remodelado
Esta fase se caracteriza por la formación, organización y resistencia que obtiene el tejido
al formar la cicatriz, lo cual se adquiere con la contracción de la herida generada por los
miofibroblastos y la organización de los paquetes de colágeno; esta inicia
simultáneamente con la síntesis de la matriz extracelular en la fase de proliferación y
puede durar entre uno y dos años, dependiendo la extensión y características de la
lesión [16].
2.3 Biología celular
En esta sección se presenta una breve introducción referente a la biología celular
mitocondrial ya que nuestra investigación está íntimamente ligada a la modificación del
comportamiento mitocondrial causado por estímulos de luz.
2.3.1 La mitocondria
Las mitocondrias son organelos complejos altamente especializados en la producción de
energía. Es en ellas donde se produce más del 90% del ATP celular, mediante el proceso
de respiración celular. Se localizan prácticamente en todas las células eucariontes,
24
donde pueden llegar a ocupar hasta un 25% del volumen del citoplasma. Para
comprender la importancia de la función principal de las mitocondrias, es necesario
recordar dos puntos. El primero es que todos los organismos requieren energía para
vivir. El segundo es que el único tipo de energía que los seres vivos utilizan, directa o
indirectamente, es la que se encuentra en el ATP. El ATP es la moneda con la que se
pagan todos los procesos anabólicos que ocurren en todos los organismos vivientes. De
hecho, no es posible aceptar que exista vida sin la existencia de ATP [17].
Cada mitocondria está rodeada por una membrana doble. La membrana mitocondrial
externa es lisa y permite el paso de muchas moléculas, en cambio, la membrana
mitocondrial interna tiene muchos pliegues y regula estrictamente el tipo de moléculas
que pueden atravesarla. Cada pliegue es llamado cresta y se extienden hacia el interior
de la matriz. Las crestas aumentan considerablemente el área de la membrana
mitocondrial interna proporcionando una superficie para las reacciones químicas que
transforman la energía química de las moléculas alimenticias en ATP [18].
2.3.2 Cadena de transporte de electrones
El sistema que transporta electrones con la finalidad de sintetizar ATP está localizado
en la membrana internan de las mitocondrias, y se conoce como cadena de transporte
de electrones. La cadena está formada por una serie de enzimas diseñadas por la
evolución para aceptar y ceder electrones, es decir que su función es la de reducirse y
oxidarse. El aceptor final de los electrones que viajan por la cadena respiratoria es el
oxígeno. La mayor parte del oxígeno que nosotros respiramos se usa para aceptar los
electrones que pasan por la cadena respiratoria; después de que un átomo de oxígeno
recibe dos electrones, éste reacciona con dos H+ y forma una molécula de agua.
25
El viaje de los electrones a través de la cadena respiratoria es la fuente de energía para la
síntesis de ATP. Algunos de los componentes de la cadena respiratoria tienen un color
característico, denominados citocromos (del griego citos, célula y cromos, color), ya que
absorben luz a longitudes de onda específicas como se observa en la Fig. 3.
Es importante señalar que los citocromos, excepto el citocromo c, son proteínas
complejas formadas por varias subunidades, y no ha sido sino hasta los últimos años
cuando se ha logrado conocer las subunidades que las forman y cómo éstas se colocan
en la membrana para formar una estructura funcional.
Figura 3. Espectros de absorción de los citocromos de la cadena respiratoria mitocondrial. 1 = citocromo b; 2 = citocromo oxidasa; 3 = citocromo c; 4 = segunda longitud de onda en que absorbe el citocromo b; 5 = longitud de onda en que absorbe el citocromo oxidasa
26
La maquinaria mitocondrial de la cadena de transporte de electrones se compone de
cuatro complejos (Fig. 4) de multisubunidades. A partir de los acarreadores NADH y
FADH^2 donan dos electrones cada uno, NADH tiene relación con el complejo I y
FADH^2 dona sus electrones al complejo II. La coenzima Q trasporta los electrones al
complejo III, seguido por el citocromo que transporta un electrón a la vez hacia el
complejo IV los cuatro electrones interactúan con el O^2 y forman dos moléculas de
agua. La energía redox liberado durante el proceso de transferencia de electrones en los
complejos I, III y IV se utiliza para bombear activamente H+ de la matriz mitocondrial al
espacio intermembrana; el gradiente electroquímico de H+ a través de la membrana
interna es utilizado finalmente por el complejo ATP sintasa para producir ATP [19].
2.4 Biofotónica
La biofotónica es la ciencia encargada de darle un uso a la interacción entre la luz y la
materia biológica, en esta corriente se funden dos grandes ramas de la ciencia, la
Figura 4 Esquema de la cadena de trasporte de electrones, se observan los cinco complejos proteicos que están involucrados en la síntesis del ATP. Se muestran también las reacciones y los hidrógenos liberados en cada complejo [38].
27
fotónica que utiliza fotones para transmitir, procesar y almacenar información y la
biología encargada del estudio de los seres vivos.
La comprensión de las propiedades de la luz y el tejido biológico constituye la base
fundamental para crear una visión de la naturaleza de las interacciones entre la luz y los
sistemas biológicos [20].
2.4.1 Naturaleza dual de la luz
La naturaleza dual de la luz se pone de manifiesto por el hecho de que se propaga en el
espacio como lo hace una onda; demostrando, sin embargo, un comportamiento de
partícula durante los procesos de emisión y absorción. La energía radiante
electromagnética es creada y destruida en cuantos o fotones y no continuamente como
una onda clásica. Sin embargo, la compresión del movimiento a través de una lente, un
agujero o un conjunto de rendijas, está sujeto a sus características ondulatorias. La
electrodinámica clásica, conduce invariablemente a la idea de una transferencia
continua de energía por medio de ondas electromagnéticas. Mientras que la
electrodinámica cuántica describe los interacciones electromagnéticas y trasporte de
energía en términos de partículas elementales sin masa, denominadas fotones [21].
2.4.2 Naturaleza de la luz como partícula
El fotón es la partícula elemental responsable de las manifestaciones cuánticas del
fenómeno electromagnético. El fotón tiene una masa invariante cero, lleva asociado un
momento lineal, una polarización y viaja en el vacío con una velocidad constante [22].
Se comporta como una onda en fenómenos como la refracción que tiene lugar en una
lente, o en la cancelación por interferencia destructiva de ondas reflejadas; sin embargo,
28
se comporta como una partícula cuando interactúa con la materia para transferir una
cantidad fija de energía, que viene dada por la expresión:
𝐸 =ℎ𝑐
𝜆= ℎ𝑣
donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, λ es la longitud de onda y
v la frecuencia de la onda. Para la luz visible, la energía portada por un fotón es de
alrededor de 4×10^-19 J; esta energía es suficiente para excitar las células oculares
fotosensibles y dar lugar a la visión [23].
2.4.3 Propagación de la luz como onda
La mayoría de las interacciones entre la luz y las moléculas de interés biológico son de
naturaleza fotoeléctrica. Por lo tanto, la descripción de una onda de luz se enfoca en la
naturaleza del campo eléctrico oscilante E, que tiene tanto una dirección como una
amplitud.
La dirección del campo eléctrico, E, para una onda plana que viaja en una dirección es
siempre perpendicular tanto a la dirección de propagación como al campo magnético
oscilante B, como se muestra en la Fig. 5 [24].
Figura 5 Propagación de onda circularmente polarizada, con respecto a el vector B y el vector E
29
La propagación de la luz en la dirección z con su campo eléctrico oscilante E (z, t) se
describe matemáticamente como
𝐸(𝑧, 𝑡) = 𝐸0cos(𝜔𝑡 − 𝑘𝑧)
a medida que E0 define la amplitud del campo eléctrico. El término ω es la frecuencia
angular de la luz dada como 2πv; k, llamado vector de propagación, se define como
𝑘 = (2𝜋
𝜆)
Caracteriza la fase de la onda óptica con respecto a un punto de referencia (z = 0); por lo
tanto, kz describe el desplazamiento de fase relativo con respecto al punto de referencia.
La velocidad de una onda óptica se describe por la propagación de ondas en un medio.
Esta propagación se caracteriza por dos velocidades:
• Velocidad de fase, que describe el recorrido de un frente de fase de una sola
onda. La velocidad de fase es lo que se define como la velocidad de una onda
electromagnética a través de un medio.
• Velocidad de grupo, que describe la propagación de un paquete de ondas que
consta de muchas ondas que viajan juntas.
Para un medio con índice de refracción n, como se describió anteriormente, la velocidad
de fase de una onda está dada por
𝑣 =𝑐
𝑛
En general, un material como medio de propagación óptica muestra una dispersión del
índice de refracción en función de la longitud de onda. El comportamiento de
dispersión normal muestra un aumento del índice de refracción, n, con una
disminución en la longitud de onda [24].
30
2.4.4 Absorción y esparcimiento
Un átomo puede reaccionar a la luz entrante de dos maneras distintas, dependiendo de
la frecuencia de incidencia o, de forma equivalente, de la energía del fotón entrante. Por
lo general el átomo esparcirá la luz, dándole otra dirección, pero sin alterarla. Por otro
lado, si la energía del fotón equivale a la de los estados excitados, el átomo absorberá la
luz realizando un salto cuántico hasta ese nivel más alto de energía. En el medio
atómico denso de gases, sólidos y líquidos normales es muy probable que esta energía
excitadora se transfiera rápidamente, por colisiones, al movimiento atómico aleatorio,
energía térmica, antes de que pueda emitirse un fotón. Este proceso típico se conoce de
forma clásica como absorción, pero hoy en día este término se utiliza más a menudo
para referirse sólo al hecho de captura, independientemente de lo que luego ocurra con
la energía y se denomina de mejor manera como absorción disipativa [21].
Contrariamente al proceso de excitación, el esparcimiento del estado fundamental tiene
lugar con energía radiante entrante de otras frecuencias, más bajas que las frecuencias
que los estados excitados. Este campo electromagnético de la luz incidente puede llevar
a la nube de electrones del medio a oscilar. Sin embargo, no resulta ninguna transición
atómica; el átomo permanece en su estado fundamental mientras que la nube vibra muy
débilmente a la frecuencia de la luz incidente. Una vez que la nube de electrones
empieza a vibrar con respecto al núcleo positivo, el sistema constituye un dipolo
oscilante y, teóricamente empezará a radiar inmediatamente a la misma frecuencia. La
luz dispersa resultante consta de un fotón que sale disparado hacia alguna dirección
llevando la misma cantidad de energía que el fotón incidente, este proceso se conoce
como esparcimiento elástico [25].
31
2.5 LLLT
La LLLT es una terapia no invasiva que consiste en generar una respuesta celular
positiva al irradiar con luz de baja potencia, por debajo de 500 mW, sobre el tejido
biológico deseado [1]. Las aplicaciones de la LLLT son amplias, van desde el alivio del
dolor, hasta la mejora del proceso de recuperación de lesiones nerviosas, osteoartritis y
curación de heridas [26].
Para que la LLLT tenga algún efecto sobre un sistema biológico vivo, los fotones deben
ser absorbidos por bandas de absorción electrónica que pertenezcan a fotoaceptores
moleculares, endógenos denominados cromóforos [27]. Se cree que los complejos
proteicos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial son, los cromóforos
principalmente responsables de generar la respuesta deseada en la LLLT. Sin embargo,
no es el único mecanismo de acción que favorece el uso de esta técnica. La
fotoestimulación de los canales iónicos responsables de la polarización celular es otro
efecto importante en la LLLT [1].
2.5.1 Efectos de la LLLT en las células
Varios tipos de células pueden tener sus niveles de proliferación incrementados por la
LLLT. Las células madre son particularmente sensibles a la luz. La LLLT induce la
actividad de las células madre, aumenta la migración, la diferenciación, la proliferación
y la viabilidad celular, así como la activación de la expresión de proteínas [28]. Los
queratinocitos, muestran un aumento de la proliferación y una maduración más rápida
en la migración a los sitios de la herida, después de la irradiación con luz de 660 nm.
Esto es útil para la mejora de la curación epitelial [29]. De la misma manera, los
fibroblastos muestran un aumento en su proliferación y su viabilidad celular [30].
32
La LLLT aumenta la expresión de proteínas relacionadas con la proliferación y
maduración de las células epiteliales [29]. Puede aumentar la expresión de varias otras
proteínas. Un buen ejemplo es el aumento en la producción de colágeno I por los
fibroblastos después de la irradiación con luz a 810 nm [31].
2.5.2 Efectos de la LLLT en la respiración mitocondrial y la síntesis de ATP
El citocromo c oxidasa (Cox) es el complejo proteico I de la cadena trasportadora de
electrones con un centro de cobre binuclear (CuA) junto con un centro binuclear hemo
(a3-CuB), los cuales facilitan la transferencia de los electrones del Cox soluble en agua al
oxígeno [32].
La absorción de fotones por Cox conduce a estados excitados que puede acelerar las
reacciones de transferencia de electrones [33]. Un mayor transporte de electrones
provoca necesariamente una mayor producción de ATP. El aumento de la síntesis de
ATP inducido por luz y el gradiente de protones incrementado llevan a una actividad
Figura 6 Esquema del mecanismo de acción celulares que se genera mediante la aplicación de la LLLT (modificada de [9]). El esquema hace referencia al incremento de ATP, ROS mitocondrial y la activación de la transcripción genómica después de la aplicación de la LLLT.
33
creciente de los antiportadores Na + / H + y Ca^2 + / Na +, y de todos los portadores
impulsados por ATP para iones, como las bombas ATPasa y Ca^2 + de Na + / K + [34].
2.5.3 Efecto de la LLLT en el potencial redox
La LLLT produce un cambio en el potencial redox celular total en la dirección de una
mayor oxidación, se ha reportado un aumento en la generación de ROS (por sus siglas
en inglés) y en la actividad redox celular [35]. El estado redox de una célula regula vías
de señalización celular que controlan la expresión génica. La modulación del estado
redox celular puede activar o inhibir las vías de señalización [36] como se muestra en la
Fig. 6.
2.6 PDT
La PDT es un tratamiento de mínima invasión para diferentes patologías, que utiliza
tres componentes clave: fotosensibilizador (FS), luz visible y oxígeno. Su interacción
desencadena reacciones fotoquímicas que conducen a la generación de ROS. Se ha
utilizado para el tratamiento exitoso de varias enfermedades y trastornos, incluida la
degeneración macular relacionada con la edad, la psoriasis y ciertos tipos de cáncer [37]
por medios no quirúrgicos. La práctica clínica consiste en aplicar selectivamente el FS
en el tejido deseado y posteriormente irradiar con luz de la longitud de onda que
absorbe el FS con el fin de activarlo.
A diferencia de la LLLT en donde la luz es absorbida únicamente por los cromóforos de
síntesis endógena; en la PDT además de llevarse a cabo una LLLT ya que la luz también
es absorbida por los cromóforos internos, la luz es absorbida principalmente por el FS
exógeno. La PDT se basa en un proceso de múltiples etapas. La primera de estas etapas
34
es la administración del FS en ausencia de luz. Cuando se alcanza la concentración
óptima del FS en el tejido deseado el FS es activado mediante la exposición a una dosis
de luz cuidadosamente regulada en un periodo específico de tiempo. Es la forma
activada del FS lo que provoca una respuesta de supervivencia y reparación celular
mediante señalización ROS. En caso de generar un exceso de ROS en las células, puede
resultar en muerte celular [38].
2.6.1 FS en PDT
La PDT es un tratamiento selectivo que involucra la luz y FSs, que junto con el oxígeno
molecular provocan señalización y transcripción celular. La selectividad del FS se basa
en la capacidad del FS para acumularse en el tejido deseado y generar eficientemente
oxígeno singulete u otras ROS mensajeros segundarios que promueven la trascripción
celular [37].
La absorción de la luz permite que el FS pase a un estado de mayor energía conocido
como singulete y decaiga a un estado intermedio estado triplete de menor energía para
después interaccionar con el oxígeno que se encuentra a su alrededor, cuando el FS
dona un electrón al oxígeno del agua u otras biomoléculas o capta un protón se le
denomina reacción tipo I, también puede ocurrir que el FS pase toda la energía al
oxígeno molecular y forme oxígeno singulete que modifica atómica mente al oxigeno
molecular a esta reacción se le conoce como reacción tipo II o que dañe directamente a
la célula liberando la energía en exceso (reacción tipo III) del FS esto se explica con el
diagrama de Jablosnki (Fig. 7) [39]. Las tres reacciones pueden ocurrir simultáneamente
y en competencia, sin embargo, la relación entre ellas depende del tipo de FS y la
naturaleza de las moléculas del sustrato [40].
35
La acción fotodinámica de cualquier FS en sistemas biológicos es un rompecabezas, ya
que puede verse afectada por varias variables, incluido el mecanismo fotoquímico, la
localización por FS, la reactividad de los objetivos biológicos y la red de señalización
celular [41]. La efectividad de los FSs está basada en la generación de ROS. Éstas
incluyen el radical hidroxilo, el ion radical superóxido, el radical hidroperoxilo (OOH) y
el peróxido de hidrógeno todos, producto de la reducción del oxígeno [39].
Figura 7 Diagrama de Jablonski en el que se observan los estados energéticos en los que se lleva lugar las reacciones de los electrones de los FSs una vez que absorben luz de determinada longitud de onda.
36
2.6.2 FS AM
El AM tiene características interesantes que confieren a esta molécula un gran potencial
para su aplicación en la PDT. Es una molécula heterocíclica con dos grupos
dimetilaminos (Fig. 8), que se presenta como cristales o polvo cristalino de color verde;
mientras que sus soluciones en agua son de color azul obscuro. Pertenece a la familia
química de las fenotiazinas.
Absorbe la luz intensamente en la ventana terapéutica en la región de 550 a 700 nm lo
que le da su color característico, tiene una fotoquímica bien caracterizada y efectiva que
activa los mecanismos de fotosensibilización tipo I y tipo II. Tiene una distribución en
varios compartimentos celulares, incluidos los lisosomas y las mitocondrias [41].
2.6.3 FS RB
El RB es un FS de la familia química del xanteno (Fig. 9) soluble en agua con un alto
coeficiente de absorción en la región visible de 550 nm a 650 nm del espectro [42].
Figura 8: Estructura molecular del AM
37
La producción de ROS por RB se logra tras la irradiación con luz verde visible, cuya
longitud de onda varía entre 530 y 560 nm. El limitado poder de penetración de la luz
verde hace que la RB sea particularmente útil en lesiones cutáneas y enfermedades
dermatológicas [43].
Figura 9 Estructura molecular de RB
38
Capítulo 3
3. Antecedentes
La exposición a la luz y la combinación de sustancias fotosensibles constituye uno de los
tratamientos más antiguos de la humanidad. La palabra "helioterapia" era utilizada
para referirse al uso de la luz del sol dosificada sobre los organismos vivos. Esta terapia
fue utilizada por los egipcios, indios, chinos y griegos varios siglos a.C., para curar
afecciones medicas como la psoriasis, vitíligo, raquitismo, cáncer de piel y psicosis [44]
[45].
Actualmente la LLLT y la PDT son una alternativa atractiva para mejorar la
cicatrización de heridas. A pesar del hecho de que el mecanismo molecular de estas
terapias aún no se conoce a profundidad ya hay estudios por varios grupos de
investigación; describiremos algunos de los casos relevantes para nuestra investigación
en este apartado.
Se ha comprobado la capacidad de la LLLT para mejorar la actividad de la cadena de
transporte de electrones y la producción de ATP en las mitocondrias [46] [47]. Además
de favorecer el proceso de curación de heridas a través de la proliferación celular, la
producción de ácidos nucleicos, la neoangiogénesis, la reducción de la inflamación, la
diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos e incluso la reducción del dolor
postoperatorio [48] [49] [50] [51]. Se ha demostrado que la LLLT puede regular la
liberación de citoquinas responsables de la proliferación de fibroblastos y la síntesis de
colágeno, como el factor de crecimiento de fibroblastos alfa (FGF-α) y el factor de
crecimiento transformante beta (TGF-β), respectivamente [52] [53] [54].
39
La LLLT se caracteriza por una serie de parámetros físicos como la longitud de onda, la
densidad de potencia, la densidad de energía y la duración de la irradiación.
Respecto a la PDT existen pocos estudios sobre el papel de la PDT en el proceso de
cicatrización de heridas. La PDT resulta de la combinación de un FS (AM y RB para
nuestro caso) el cual se une a las células objetivo; el FS al ser excitado con luz a una
longitud de onda adecuada, se activa y puede reaccionar con las moléculas vecinas, lo
que lleva a la producción de oxígeno singulete y ROS que reaccionan con componentes
celulares. Estimulando la proliferación y diferenciación en células sanas, pero causando
un daño especial en bacterias y células cancerosas [68].
Esto proporciona ciertas ventajas para la PDT, como su naturaleza mínimamente
invasiva, la facilidad de repetición y la acción antimicrobiana, ya que la presencia de
bacterias en la herida puede retrasar el proceso de curación [69].
Vasconcelos y colaboradoras diseñaron un experimento con el objetivo de evaluar los
efectos de la LLLT dentro del espectro del rojo, IR y verde, al igual que los efectos de la
PDT; en el proceso de curación de las quemaduras de la piel mediante el análisis clínico
e histopatológico en ratas. Para esto, 100 animales se dividieron aleatoriamente en cinco
grupos: G1: control no tratado, G2: LLLT-R, G3: LLLT-IR, G4: PDT con AM a 0.5 ug /
mL y G5: LLLT-V. Se produjo una quemadura en el dorso de la rata y se dividieron las
100 ratas aleatoriamente en grupos experimentales el tratamiento de los grupos
experimentales fueron LLLT-R (10 J / cm^2, 10 s, 40 mW y λ660 nm), LLLT-IR (10 J /
cm^2, 10 s, 40 mW y λ 780 nm), LLLT-V (60 J / cm^2,10 s, λ 520 y 550 nm) y PDT (10 J /
cm^2, 40 mW y λ 660 nm y AM a 0.5 ug / mL). El tratamiento se aplicó diariamente
hasta el día anterior al sacrificio del animal a los 3, 7, 14 y 21 días. Demostraron que los
animales tratados con láser rojo, láser IR, LED verde y PDT con AM, estimularon la
producción y la maduración del colágeno, aumentaron el consumo de alimentos y agua
40
en comparación con el control. El láser λ660 nm y λ780 nm mostraron las mayores
reducciones de heridas en todos los grupos [40].
Adamskaya y colaboradores compararon los efectos de la LLLT en longitudes de onda
dentro espectro azul y rojo, mediante diodos emisores de luz (LED) en la curación de
heridas en ratas. Crearon quirúrgicamente 2 heridas circular en el dorso de cada rata.
Después de la operación y en cinco días consecutivos irradiaron durante 10 minutos
mediante LED a 470 nm o 630 nm con una intensidad de 50 mW / cm^2. El día 7
después de la operación, se analizaron los parámetros planimétricos e histológicos, así
como la expresión de queratina-1, queratina-10 y queratina-17 en el nivel de ARNm. Sus
resultados mostraron que la luz azul disminuyó significativamente el tamaño de la
herida en el día 7, lo que se correlacionó con una mayor epitelización. Ambas
longitudes de onda disminuyeron el ARNm de queratina-1, mientras que el nivel de
ARNm de queratina-10 se elevó en ambos grupos tratados con luz en comparación con
el control. El ARNm de queratina-17 también se elevó en el grupo de luz roja, pero no se
modificó en el grupo de luz azul [55].
Kilik y colaboradores realizaron un estudio en el que investigaron los efectos de la
LLLT en la cicatrización de heridas en la piel de ratas normales y diabéticas. Realizaron
cuatro heridas cutáneas redondas en el dorso en ratas Sprague-Dawley adultas no
diabéticas (= 24) y diabéticas (n = 24). Se utilizó luz láser (AlGaInP 635 nm, longitud de
onda; 5 J / cm^2, dosis diaria) para administrar densidades de potencia de 1, 5 y 15 mW
/ cm^2 tres veces al día hasta la eutanasia. Los resultados demostraron que la
infiltración de leucocitos polimorfonucleares fue menor en los grupos irradiados (15
mW / cm^2). La síntesis y organización de las fibras de colágeno se mejoraron
consecutivamente en los grupos de 5 mW / cm^2 y 15 mW / cm^2 en comparación con
los otros en ratas no diabéticas. La diferencia significativa en el número de capilares
recién formados en el grupo irradiado (5, 15 mW / cm^2) se registró el día seis después
41
de la lesión. Concluyeron que la LLLT confiere un efecto protector contra la respuesta
excesiva del tejido inflamatorio; Estimula la neovascularización y la formación
temprana de fibras de colágeno [6].
Sperandio y colaboradores diseñaron un experimento para monitorear el proceso de
curación de heridas tratadas con la PDT-AM. Para el estudio utilizaron 100 ratas a las
que se les creó quirúrgicamente una herida circular en la espalda de 6 mm de diámetro.
Los animales se dividieron en cuatro grupos: control; FS (AM al 0.01%) ; láser (InGaAlP,
117.85 J / cm^2, 100 mW, 660 nm, punto único) y PDT-AM (InGaAlP, 117.85 J / cm^2,
100 mW, 660 nm, punto único y AM al 0.01%); las heridas cutáneas se fotografiaron y se
evaluaron con examen histopatológico mediante microscopio óptico los días 1, 3, 5, 7 y
14. En sus resultados del grupo de láser se observó el área de la herida más pequeña el
día 14 después del procedimiento quirúrgico y una reepitelización completa en los días
5-7 después de la cirugía, mientras que el grupo PDT y los otros grupos lo mostraron a
los 14 días [56].
Tarid y colaboradores diseñaron un estudio para evaluar la eficacia de la PDT en el
proceso de cicatrización de heridas utilizando RB como FS. Para este propósito, se
seleccionaron 20 conejos adultos sanos de ambos sexos. Se creó una herida de incisión
de espesor total (epidermis, dermis e hipodermis) en la línea media ventral en cada
conejo. En los animales del grupo A, las heridas incisas se expusieron a luz verde
monocromática (532 nm a 5 mW por 200s) después de la aplicación de un tinte (RB) en
la superficie de la herida, mientras que en el grupo B se vendó las heridas con seda 2/0 y
sutura por patrón de colchón horizontal interrumpido. La curación se verificó
diariamente mediante observación y mediciones. Se observó una diferencia significativa
en las áreas inflamadas de heridas suturadas con seda y curadas con PDT. Cuando se
utilizó el patrón de colchón horizontal, la hinchazón del área suturada fue
significativamente más prominente. Entre dos técnicas de cierre de heridas, se observó
42
un área más hinchada en las heridas suturadas con colchón horizontal que las heridas
cerradas con PDT-RB. El tiempo de cicatrización de las heridas tratadas con tejido
fotoquímico fue de 3 a 4 días, mientras que el tiempo de curación en suturas fue de 7
días. De acuerdo con la evaluación histopatológica de las fibras de colágeno, la unión
del tejido fotoquímico dio como resultado una fibra de colágeno significativamente más
densa en comparación con la sutura convencional para el cierre de heridas de la piel en
conejos. La unión de tejido fotoquímico dio lugar a un contenido de colágeno de 82,17 ±
1,8 % mientras que en la sutura convencional se observaron 78,50 ± 1,5 % contenidos de
colágeno. La unión del tejido fotoquímico dio como resultado un grosor de la epidermis
125.1 ± 6.5 % mientras que en la sutura convencional el grosor de la epidermis fue 116.2
± 3.1 %. La unión del tejido fotoquímico dio como resultado un grosor de la dermis de
120.9 ± 7.7 %, mientras que el grosor de la dermis en la sutura convencional fue de 113.7
± 5.6 % (los porcentajes se comparan tomando como referencia tejido sano [57].
43
Capítulo 4
4. Metodología
4.1 Prácticas con modelos murinos
El animal de laboratorio es una de las piezas fundamentales en las ciencias biomédicas.
Son usados como modelos para investigar y comprender las causas, diagnóstico y
tratamiento de enfermedades que afectan al humano y a otros animales, además de su
uso en el desarrollo, producción y control de medicamentos, alimentos y otros insumos.
El Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL
BUAP) establece las responsabilidades, detalla las normas y las recomendaciones
generales para el cuidado y uso de los animales en forma científica, técnica y
humanitariamente apropiada, así como sobre la planificación y conducción de la
experimentación con animales.
Esta investigación fue aprobada con la clave GASW-UALVIEP-17 por el CICUAL BUAP
para el cuidado y uso de animales de laboratorio y por la Vicerrectoría de Investigación
y Estudios de Posgrado de la BUAP. Todos los procedimientos se realizaron acorde a
las reglamentaciones vigentes en la NOM-062-ZOO-1999.
En el experimento se emplearon 41 ratas (Rattus norvegicus, mutante alopécica) alopécicas,
macho con un peso promedio de 120 g, como las que se observan en la Fig. 10. Este
modelo sobrevive en condiciones convencionales, la ausencia de pelo la postulan como
una herramienta de trabajo experimental en piel y dermatología [58].
44
4.2 Material biológico y condiciones ambientales
Previo a la experimentación se aprobó un curso de manejo y vías de administración en
rata de laboratorio impartido por el CICUAL BUAP. Las prácticas se realizaron en el
bioterio Claude Bernard de la BUAP.
Información taxonómica:
• Clase: mammalia
• Orden: rodentia
• Suborden: myomorpha
• Familia: muridae
• Género: Rattus
• Especie: norvegicus, rattus
Condiciones del medio ambiente requerido
• Temperatura 18-26°C. Ideal 21°C
• Humedad: 30-70%
• Cambios de aire: 15-20 h
Figura 10 Ratas Rattus norvegicus alopécicas
45
• Ruido. No más de 85 db
• Ciclos Luz obscuridad: 12/12 h
• Intensidad y tipo de luz 325 Lx (30 b)
• Espacio.150 cm^2 / 200 g
Parámetros generales para el manejo de animales
• Lavarse las manos antes y después de manipularlos.
• Uso de guantes, bata, cofia y cubrebocas.
• Desinfección del área de trabajo con detergente líquido aprobado por el CICUAL
BUAP.
Previo a la cirugía las ratas se marcaron con el número correspondiente en la parte
superior de la cola con marcador permanente (Sharpie) como se muestra en la Fig. 11.
Todas las prácticas y el monitoreo diario del animal inician con un pesaje de los
animales. Este paso brinda información para poder inferir las condiciones de salud del
animal. El peso de los animales puede variar significativamente si no tienen acceso
suficiente a comida y agua, por lo que se debe asegurar que el animal tenga un estilo de
vida óptimo hasta el día de su sacrificio para que los resultados sean confiables.
Figura 11 Marcaje en cola temporal con plumón de aceite
46
4.3 Generación de heridas
Cuando nuestros modelos animales llegaban al peso de 120 g se procedía a realizar la
práctica de generación de heridas descrita a continuación. Esta es la práctica inicial en
nuestro experimento, se consideró como el día 0 el día que se generaron las heridas. A
partir de ese día se inició el conteo de los días y el monitoreó hasta el día de sacrificio
determinado para cada animal.
Material
Tabla 2. Material necesario para la práctica de generación de heridas
Material Marca Fotografía
Anestésico Xilazaina al 10 % -
Ketamina al 10 % en solución
fisiológica
(Anestésico
proporcionado
por el bioterio
Claude Bernard
de la BUAP)
Jeringa de insulina con punta
cambiable de 1 mL
Sensi Medical
Pinza diente de ratón de 14 cm STAINLESS
Bisturí de 13 cm STAINLESS
47
Tijeras curvas de 14 cm STAINLESS
Solución esterilizante y
antiséptica para la piel
Microdacyn
Gasas esteriles simple de 10 x
10
Galia
Cojín para sellos de plástico y
tinta para foliador (para
marcar la herida)
Pelikan
Lagrima artificial de 15 mL
para lubricar el ojo seco
(Splash Tears)
Sophia
Regla metálica de 15 cm Office DEPOT
Cojín eléctrico con control de
temperaturas de 60 x 30 cm
Besmed
48
Mantel estéril de 60 x 40 cm
color azul
AMBIDERM
Procedimiento
1. Inicialmente se preparó la zona de la cirugía, el colchón térmico se mantenía a
una temperatura entre 18-26°C para conservar la temperatura del organismo
entre 35.9°C y 37.5°C y evitar un descenso o incremento de la temperatura.
2. Se anestesió al organismo vía intraperitoneal (Xilazaina al 10 % - Ketamina al 10
% en solución fisiológica) en dosis de 0.20 ml / 100 g de peso vivo del organismo.
3. Previo al corte, se limpió el área con Microdacyn y se marcó el contorno de la
herida. El contorno es un círculo con un diámetro de 1 cm, se marcó en el dorso
del animal justo después de la última costilla flotante, a una distancia de 5 mm
de la columna vertebral, y se realizó otra marca simétrica del lado opuesto de la
columna vertebral.
4. El corte se realizó con tijeras curvas (Fig. 12 A). Se levantó la piel con una pinza
diente de ratón, por la parte central de la marca para formar una especie de cono
y el corte se realizó de un solo tajo siguiendo el contorno marcado (Fig. 12 B). No
se utilizó ningún producto analgésico ni se cubrió a la herida después de la
cirugía.
49
4.4 Toma de fotografías
El seguimiento fotográfico se realizó todos los días, a partir de que se generaron las
heridas hasta el día del sacrificio. De las imágenes tomadas en esta práctica se obtuvo el
área de cada herida, mediante mapeo con el software ImageJ. Para realizar el análisis
planimétrico.
Material
Tabla 3. Material necesario para práctica de toma de fotografías
Material Marca Fotografía
Cámara fotográfica
(Alpha A6000)
Sony
Figura 12 A. Momento del corte de la piel con tijeras curvas este corte debe de realizarse de un solo tajo. 12 B Dorso de la rata después de cirugía.
50
Referencia con escala
milimétrica
No aplica
Procedimiento
1. Se configuró la cámara en modo automático.
2. Se posiciono la escala de referencia alrededor de la herida como se observa en la
Fig. 13.
3. Enfocó la cámara de forma perpendicular a la referencia a una distancia
aproximada de 25 cm.
4. Presionar levente el obturador para autoajustar y después tomar la fotografía.
4.5 Práctica de PDT y LLLT
En esta práctica se describen los pasos que se siguieron para realizar las técnicas de PDT
y LLLT. La terapia correspondiente se realizó los días 0, 1 y 2, en ambas heridas de cada
organismo. La fuente de luz que se utilizó en cada tratamiento y en el caso de la PDT el
FS que se empleó en cada proceso se describen en la Tabla 4. En el día 0 el tratamiento
Figura 13. Escala de referencia alrededor de la herida
51
se realizó justo después de la incisión de las heridas. Posteriormente en los días 1 y 2 la
hora de aplicación del tratamiento tuvo lugar dentro de un rango de (+-) 2 horas de la
hora de la cirugía.
Tabla 4. Parámetros de los tratamientos
Tratamiento Número de
animales
Dosis de luz Fuente de luz Dosis de
colorante
Control 5 No aplica No aplica No aplica
LLLT-R 5 10 J/cm^2 LED Rojo No aplica
LLLT-V 5 10 J/cm^2 LED Verde No aplica
LLLT-A 5 10 J/cm^2 LED Azul No aplica
LLLT-RVA 5 30 J/cm^2 LED rojo, LED azul
y LED verde (una
después de la otra)
No aplica
PDT-AM 5 10 J/cm^2 LED Rojo AM; 20 μM
PDT-RB 5 10 J/cm^2 LED Verde RB; 5 μM
4.5.1 Preparación FSs
Previo al tratamiento los FSs se diluyeron en agua destilada según las dosis establecidas
en la Tabla 4. Las concentraciones se calcularon en base al peso molecular de cada FSs
(AM=319.85 g/mol y RB=973.67 g/mol).
4.5.2 Fuentes de luz y dosis empleadas
Los dispositivos fueron diseñados y fabricados en el INAOE por el grupo de
biofotónica. Las fuentes de luz consisten en un LED de alta potencia montado en un
armazón metálico, con una placa de acrílico cuadrado de 3 x 3 cm situado a 1 cm de
52
distancia frente al LED, el acrílico de color negro obscuro con un orificio de 1.5 cm de
diámetro en la parte central (por donde se irradió la herida), la imagen del dispositivo
se muestra en la Tabla 5. La dosis de luz aplicada para cada tratamiento (Tabla 4) se
calculó usando la siguiente ecuación:
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑑𝑒𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 [𝐽
𝑐𝑚2] =
𝑃𝑜𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎[𝑊]𝑥𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜[𝑠𝑒𝑔]
𝐴𝑟𝑒𝑎[𝑐𝑚2]
Material
Tabla 5. Material necesario para práctica de PDT y LLLT
Material Marca Fotografía
FS (AM a 20 μM,y RB a 5
μM)
Omnichem, México
Fuente de luz (azul 0.1
W/cm^2, verde 0.1
W/cm^2 y rojo 0.1
W/cm^2)
Diseñados y fabricados
por el grupo de
biofotónica del INAOE
Caja de cartón obscura
de 30 cm^3
No aplica
Gasas Galia material de
curacion
53
Procedimiento
1. Se suministró de forma tópica el FS necesario para cubrir toda la herida, y se
mantuvo a la rata en oscuridad dentro de una caja de cartón por 5 minutos.
Después se retiró el exceso de FS con una gasa. (Este paso solo se realizó en los
grupos de PDT).
2. Se colocó la fuente de luz perpendicular a la herida y se dejó por 78 s hasta
alcanzar la dosis de 10 J/cm^2 como se muestra en la Fig. 15.
(Nota: no se anestesió a las ratas en la aplicación de la terapia los días 1 y 2)
4.6 Toma de biopsias
Esta práctica se realizó después de la toma de fotografías correspondientes para ese día.
Los sacrificios se realizaron para cada organismo en el día seleccionado (días 3, 5, 7, 14 o
21).
Figura 14 A En esta imagen se observa el método de la aplicación de la LLLT-R, 15 B En esta imagen se observa el método de la aplicación de la LLLT-V y 15 C En esta imagen se observa el método de la aplicación de la LLLT-A.
54
Material
Tabla 6 Material necesario para práctica de toma de biopsias
Material Marca Fotografía
Marcador Sharpie
Referencia con escala
milimétrica
No aplica
Bisturí STAINLESS
Frasco con tapón de
goma lleno hasta la mitad
con paraformaldehido al
4%
MACRON
Procedimiento
1. Se sacrificaron a las ratas en cámara de CO^2 (del bioterio Claude Bernard de la
BUAP) al 100% por 5 minutos; después de la toma de fotografías.
2. Se marcó el contorno de la escala de referencia alrededor de la herida como se
muestra en Fig. 15 A.
3. Se cortó la piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) marcada, con el
bisturí (Fig. 15 B) y se colocó en la parte del fondo del frasco con
paraformaldehido al 4%, procurando quedara lo más extendida posible (Fig. 15
C).
55
4.7 Deshidratación e inclusión de biopsias
Esta práctica se realizó después de que la biopsia llevaba 24 horas en paraformaldehido
al 4%. Fue necesario deshidratar la biopsia para poderla fijar en parafina. Esta práctica
consistió en pasar las biopsias de solvente en solvente mediante un tren de
deshidratación como se menciona en a continuación.
Material
Tabla 7. Material necesario para práctica de deshidratación e inclusión de biopsias
Material Marca Fotografías
Alcohol 70° HYCEL
Alcohol 96° HYCEL
Alcohol 100° MEYER
Figura 15 A Momento del marcaje de contorno de la biopsia, 16 B: corte de la biopsia, y 16 C: biopsia y frasco con paraformaldehido 4%.
56
Cloroformo MEYER
Parafina liquida
60°C
Estufa de
laboratorio a 60°C
(modelo. H-33)
RIOSSA
Molde de silicona
de 20 x 35 cm
Wilton
Procedimiento
1. Biopsia en alcohol al 70° por 24 horas.
2. Biopsia en alcohol al 96° por 24 horas.
3. Biopsia en alcohol al 96° nuevo por 24 horas.
4. Biopsia en alcohol al 100° por 24 horas.
5. Biopsia en cloroformo por 24 horas.
6. Biopsia en cloroformo nuevo por 1 hora.
7. Biopsia en parafina líquida a 60°C por 24 horas.
8. La biopsia se incluyó en parafina nueva; se colocó cada biopsia y parafina líquida
en el molde de inclusión y se dejó al menos un día antes de hacer los cortes.
4.8 Cortes histológicos
La práctica de cortes histológicos se realizó un día después de incluir la biopsia en
parafina (debido a que se requiere un día para que la parafina seque por completo).
57
Para esta práctica fue necesario mantener un ritmo de corte adecuado en el microtomo
(Fig. 16 B), tener una navaja afilada y haber realizado una buena fijación en parafina.
Material
Tabla 8. Material necesario para práctica de cortes histológicos
Material Marca Fotografías
Microtomo (modelo RM2125
RT)
Leica Fig. 17 A
Navaja para microtomo de
34°/80 mm modelo (MX35
PREMIER)
Thermo
SCIENTIFIC
Porta objetos de 1x 26 x 76 mm VELAR
Cubo de parafina con biopsia No aplica
Espátula flexible de 1 pulgada TRUPER
Baño maría
Diámetro total de 32 cm.
Diámetro de flotación de 22
cm.
LAB-LINE
58
Procedimiento
1. Se calentó el agua a una temperatura de 50°C.
2. Se moldeó el cubo hasta dejarlo de forma simétrica y con bordes lisos sin llegar
hasta la biopsia (Fig. 16 B).
3. El cubo se colocó de forma ajustada en el microtomo.
4. Se ajustó el microtomo para que realizara cortes de 20 micras de ancho.
5. Los cortes debían salir pegados el uno al otro como si fuera una tira continua.
6. Se corto la cinta de cortes histológicos lo suficiente para que cubra 2/3 del largo
del portaobjetos.
7. Se colocó la cinta de cortes histológicos suavemente en el agua a 50 °C de manera
que se quedara flotando en la superficie.
8. El portaobjetos se sumergió en el agua y se levantó hacia la superficie de forma
perpendicular a la cinta de cortes histológicos hasta capturarla.
9. Se dejó secar el portaobjetos con los cortes un día, para después proceder con la
tinción de HE.
Figura 16 A Microtomo en el que se realizaron los cortes histológicos con ancho de 20 μm y 16 B Cubos de parafina con biopsia ya moldeados e identificados.
59
4.9 Tinción de cortes histológicos
Los cortes histológicos se tiñen con el fin de delimitar, identificar y estudiar los
componentes del tejido. La tinción en este caso se realizó mediante dos colorantes,
primeramente, los cortes se tiñen con hematoxilina, un colorante básico con tonalidad
morada obscura, que se une a sustancias con grupos ácidos, tal es el caso de los ácidos
nucleicos en el AND, que presentan fosfato y a proteínas nucleares con carga negativa.
Posteriormente los cortes se tiñen con eosina un colorante acido con tonalidad rosada,
que se une a estructuras básicas, generalmente en el citoplasmáticas [59]. Esta práctica
consistió en pasar las biopsias de solvente en solvente por el tiempo requerido como se
menciona en a continuación. (Fig. 17 B).
Material
Tabla 9 Material necesario para práctica de tinción de cortes histológicos
Material Marca Fotografías
Portaobjetos con cortes
histológicos
No aplica
Cubreobjetos VELAR
Xilol MEYER
Alcohol 70° HYCEL
60
Alcohol 96° HYCEL
Alcohol absoluto MEYER
Agua destilada No aplica
Agua de la llave No aplica
Eosina HYCEL
Hematoxilina de Harris HYCEL
Carbol-xilol MEYER
Resina HYCEL
Procedimiento
1. Portaobjetos con cortes en xilol por 90 s.
2. Portaobjetos con cortes en xilol por 90 s.
3. Portaobjetos con cortes en alcohol 70° por 90 s.
4. Portaobjetos con cortes en alcohol 96° por 90 s.
5. Portaobjetos con cortes en agua destilada por 60 s.
61
6. Portaobjetos con cortes en eosina por 5 min.
7. Portaobjetos con cortes en agua de la llave por 15 min.
8. Portaobjetos con cortes en hematoxilina por 7 min.
9. Portaobjetos con cortes en agua de la llave por 5 min.
10. Portaobjetos con cortes en alcohol 96° por 90 s.
11. Portaobjetos con cortes en carbol-xilol por 90 s.
12. Portaobjetos con cortes en xilol por 90 s.
13. Los portaobjetos ya teñidos (Fig. 17 A) se cubrieron con cubreobjetos este se fijó
con resina, en este paso la resina se colocó en modo horizontal en un extremo del
cubre objetos y el cubreobjetos se dejó caer suavemente procurando no dejar
burbujas dentro.
4.10 Toma de fotografías de las histologías
El criterio de selección de los cortes histológicos; fue que la herida tuviera, una tinción
uniforme y piel sana en ambos lados de la herida.
Figura 17 A Caja con portaobjetos ya teñidos con HE. 18 B Tren de deshidratación y tinción.
62
Material
Tabla 10 Material necesario para la práctica de toma de fotografías en el microscopio
Material Marca Fotografías
Cámara fotográfica
(Alpha A6000)
Sony
Adaptador de cámara
a microscopio
Sony
Microscopio óptico
(modelo 25 ICS)
con objetivo 5x
Carl Zeiss
App PlayMemories
Mobile
Sony
Cable de conexión
celular-computadora
No aplica
Computadora No aplica
63
Procedimiento
1. Se colocó el porta objeto con los cortes histológicos en el microscopio.
2. Se ajustó el enfoque (utilizando los objetivos 5x y 40x) y la luz en el microscopio.
3. Se tomaron las fotografías de los cortes histológicos en la zona cicatricial la
herida con objetivo 40x.
4. Se tomaron las fotografías de los cortes histológicos en la zona cicatricial la
herida. Debido a que el campo de visión del objetivo 5x de microscopio no
alcanza a capturar la longitud total de la biopsia; la biopsia se va fotografiando
conforme se va moviendo la platina del microscopio para capturar el total de la
herida con 2 o más fotografías.
5. Las imágenes se trasfirieron a la computadora y se editaron con el programa
Paint para obtener una imagen panorámica del corte.
4.11 Análisis de imágenes de las heridas
En el análisis se hizo usó del software libre ImageJ (Fig. 18 A) para determinar el área de
la herida en cada día. Y se obtuvo un histograma de la herida para comparar la
tonalidad de la herida con respecto a la piel que la rodea. Los histogramas se obtuvieron
descomponiendo la imagen en los tres colores primarios (rojo, verde y azul). Se tomó la
imagen del verde, se pasó a escala de grises y posteriormente se graficó la intensidad de
cada píxel para obtener el histograma en 3D utilizando el software libre ImageJ. Y nos
aportan una escala en base a la tonalidad de la herida para poder inferir la calidad del
cicatrizado, será mejor entre más similitud tenga con el tejido circundante.
Material
64
Tabla 11 Material necesario para práctica de análisis imágenes
Material Marca Fotografías
Software libre ImageJ, ImageJ
Imágenes convencionales de
las heridas
No aplica
Software Origin 8 Origin 8
Procedimiento
1. Se seleccionó una fotografía con referencia clara y tonalidad uniforme.
2. Con base a la escala se ajustó la medida en mm en ImageJ.
3. Se realizó un mapeo a mano para seleccionar el contorno de la herida y se calculó
el área.
4. La imagen se descompuso en los tres canales primarios (rojo, verde y azul), se
tomó la imagen en el canal verde, se pasó a escala de grises (Fig. 18 B) y se extrajo
el histograma en 3D (Fig. 18 C) de la imagen en escala de grises. Con el fin de
alizar la textura de las imágenes.
65
Figura 18 A: Panel de control de software ImageJ, 19 B: fotografía de la herida en escala de grises y C: histograma de la imagen en escala de grises.
4.12 Análisis estadístico
Los resultados se analizaron con el análisis de varianza de dos factores (ANOVA 2 vía). Los
datos (las medias y la desviación estándar de todos los días) se normalizaron entre 1 y 0. Los
datos se normalizaron respecto la media del día 0 de cada grupo. Es decir, la media del día 0 de
cada grupo paso a ser el 1 y el resto de los datos de cada grupo se normalizaron respecto al
valor de la media del día 0. El utilizo el software Origin 8 para realizar las gráficas.
Material
Tabla 12 Material necesario para la práctica de análisis estadístico
Material Marca Fotografías
Áreas de las biopsias
obtenidas con el software
ImageJ
ImageJ
66
Software Origin 8 Origin 8
Procedimiento
1. Se obtuvo la media y la desviación estándar de las áreas de todas las heridas de
cada grupo para cada día.
2. Se normalizaron los datos y la desviación estándar de cada grupo con base a la
media del área correspondiente al día 0
3. Se graficaron los resultados en software Origin 8
4.13 Análisis de homogeneidad de las imágenes histológicas
Adicional a la valoración cualitativa de los cortes, se realizó un análisis del tejido en
base a un descriptor de homogeneidad usando el software Matlab. El descriptor de
homogeneidad brinda una referencia cuantitativa de que tan similar es el nivel de gris
en la región de una imagen y toma valores en el rango [0, 1]; a mayor valor, más
homogénea es la región y viceversa. En este análisis se evaluaron los cortes histológicos
en base el nivel de homogeneidad y heterogeneidad de cada grupo en el día 14. En cada
corte se determinó el nivel de homogeneidad de la piel nueva y el nivel de
homogeneidad de la piel sana que se observa en las fotografías de los cortes histológicos
en que se tomaron con el objetivo 5x. Estos valores de homogeneidad se analizaron
mediante un análisis de variación relativa. La variación relativa expresa el valor de
cambio que una cantidad presenta en dos períodos, en donde el primero sirve como
base y el segundo como período de estudio, la variación relativa se representa con la
letra t, y se calcula hallando el cociente entre la variación absoluta del cambio en dos
67
momentos determinados (T^t – T^0) y el valor inicial (T^0), con la siguiente ecuación
[60].
𝑡 =Tt − T0
𝑇0
Donde T^t representa le valor de homogeneidad del tejido cicatricial nuevo y T^0
representa el valor de homogeneidad la piel sana circundante. Los valores de t de todos
los grupos se graficaron en una gráfica de barras.
Este estudio se propone como un análisis cuantitativo respecto al nivel de
reestructuración de la piel (Fig. 19) en el proceso de cicatrización. Al comparar este
valor de t del nivel de homogeneidad podemos valorar de manera cuantitativa la
influencia que tienen los tratamientos en la reestructuración de la piel en el proceso de
cicatrización. Una t mayor indica una mayor diferencia en la similitud homogénea de la
piel nueva respecto a la piel sana, y viceversa; una t menor indica una similitud mayor
de la piel nueva respecto a la piel sana. En donde un cicatrizado ideal sería una t igual a
0.
Figura 19. Fotografía de las estructuras cutáneas de la piel tomada con objetivo 5x en la fotografía se observan las capas de piel (epidermis, dermis e hipodermis) y las estructuras principales (fólicos pilosos y glándulas). En la imagen se observa también fibras musculares en la parte final de la imagen después de la hipodermis.
68
Tabla 13. Material necesario para la práctica de análisis de homogeneidad de las imágenes histológicas
Material Marca Fotografías
Cortes histológicos del día 14
teñidos con HE
No aplica
Programa de análisis de
homogeneidad (diseñado por la
Dra. Hayde Peregrina Barreto
del departamento de
computación del INAOE)
Matlab
Procedimiento
1. Análisis cualitativo descriptivo de las imágenes histológicas
2. Se realizó el programa de análisis de homogeneidad en Matlab
3. Se evaluaron las imágenes en el programa de homogeneidad
4. Se calculó el valor de variación relativa de la homogeneidad de cada grupo
5. Se graficaron los datos de la variación relativa en una gráfica de barras
69
Capítulo 5 5. Resultados
5.1 Resultados LLLT
5.1.1 Fotografías convencionales de los grupos LLLT
Primeramente, se muestran los resultados de los grupos control, LLLT-R, LLLT-V
LLLT-A y LLLT-RVA. En las imágenes de la Fig. 20 se observan las fotografías en él
proceso de cicatrización para los días 0, 3, 5, 7 y 14. De los grupos tratados con LLLT
frente al grupo control. En los días 0 y 3 se apreció un diámetro similar para todas las
heridas, incluidas las de control. Sin embargo, para el día 3 se observó una costra más
abundante en todas las heridas con tratamientos en comparación con el grupo control,
en especial las tratadas con LLLT-R muestran una costra de tonalidad obscura. Para el
día 5, el tratamiento con LLLT-V mostró el diámetro menor de herida, seguido por el
grupo LLLT-RVA; la costra seguía siendo más abundante para todos los tratamientos
con respecto al control. En el día 7 el grupo control y el grupo LLLT-A presentaron los
diámetros de herida más grandes, mientras que el grupo LLLT-RVA, aparentemente
presentó una reepitelización más acelerada y un diámetro de la herida menor. En el día
14 todos los grupos a excepción del grupo control muestran un cierre total de la herida.
Con respecto a los grupos tratados con LLLT el grupo LLLT-R es el que tiene el
cicatrizado más evidente. En los grupos LLLT-V, LLLT-A y LLLT-RVA se observa una
reepitelización más estética, es decir que el tejido nuevo que cubre a la herida tiene una
similitud mayor respecto del tejido circundante sano.
70
Figura 20 Matriz de la evolución de las heridas en los días 0, 3, 5 7 y 14 del proceso de cicatrización para los grupos: control, LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A y LLLT-RVA. El grupo control no recibió ningún tratamiento, al grupo LLLT-R se le aplicó una dosis de 10 J/cm^2 con un LED de luz roja, al grupo LLLT-V se le aplicó una dosis de 10 J/cm^2 con un LED de luz verde, al grupo LLLT-A se le aplicó una dosis de 10 J/cm^2 con un LED de luz azul y al grupo LLLT-RVA se le aplicó una dosis de 30 J/cm^2 esta dosis se obtuvo de aplicar 10 J/cm^2 con LED rojo, 10 J/cm^2 con LED verde y 10 J/cm^2 con LED azul. Nótese que la terapia LLLT-RVA fue la que tuvo la cicatriz menos perceptible, seguidor por el grupo LLLT-V, en tercer lugar, tenesmos al grupo LLLT-A, en cuarto lugar, se encuentra el grupo LLLT-R y finalmente y con la herida más evidente se encuentra el grupo Control.
71
5.1.2 Histogramas tridimensionales de los grupos LLLT
Es importante tener en cuenta que las heridas cierran por contracción en los primeros
días de cicatrización lo que nos facilita medir la reducción del contorno, sin embargo,
debido al proceso de reepitelización en los últimos días es difícil medir el contorno
mediante fotografías convencionales. Por esta razón se realizaron los histogramas en 3D
ya que son una herramienta de medición que nos ayuda a apreciar de mejor manera la
reepitelización de la herida con respecto al tejido sano periférico. En la Fig. 21
observamos la matriz de histogramas, correspondientes a los grupos control, LLLT-R,
LLLT-V LLLT-A y LLLT-RVA en el proceso de cicatrización para los días 0, 3, 5, 7 y 14.
Los histogramas aportaron información (la intensidad de luz reflejada de cada píxel) de
cada punto de la herida. En los histogramas observamos un cicatrizado más estético
para los grupos LLLT-V y LLLT-RVA los cuales se aprecian con un mayor parecido al
tejido sano circundante. El grupo de LLLT-A mostró resultados similares a los grupos
LLLT-V y LLLT-RVA, mientras que en el grupo control, se observó la mayor diferencia
en la tonalidad en la zona de la herida en comparación con el tejido circundante.
72
Figura 21 Matriz de histogramas tridimensionales de las fotografías de las heridas de los días 0, 3, 5 7 y 14 del proceso de cicatrización para los grupos: control, LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A y LLLT-RVA. Los histogramas se realizaron en el programa ImageJ.
73
5.1.3 Contracción de la herida de los grupos LLLT
Para evaluar la velocidad de reepitelización y el efecto que tuvo cada tratamiento se
realizó un análisis de varianza de dos factores. En el que se comparó las medias y
desviación estándar de las áreas de los distintos grupos experimentales para cada día.
En la gráfica 1 se muestra el área de cada herida, en el proceso de cicatrización desde el
día 0 al día 14, las medias se normalizaron entre 1 y 0. En la gráfica 1 se observó un
cierre de la herida tendencial para todos los grupos, mostrando una reducción del área
de la herida más acelerada los primeros 8 días para todos los casos.
Gráfica 1 Esta gráfica se realizo utilizando el software Origin 8 en ella se graficáron las medias y la desviación estándar de las áreas de las heridas en el proceso de cicatrización desde el día 0 hasta el día 14, para los grupos, control, LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A y LLLT-RVA. Los resultados de cada grupo se normalizaron con respecto de sí mismo para el día 0 es decir la media del área correspondiente al día 0 de cada grupo tomo él valor de 1, el resto de los días de cada grupo se normalizaron con el valor de su día 0, incluyendo la varianza.
74
Tabla 14 En esta tabla se muestran las medias y la desviación estándar (DE) de las áreas de las heridas en el proceso de cicatrización desde el día 0 hasta el día 14, para los grupos, control, LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A y LLLT-RVA. correspondientes a la Gráfica 1.
Días Control DE
Control
LLLT-R DE
LLLT-R
LLLT-V DE
LLLT-V
LLLT-A DE
LLLT-A
0 1.000 0.000 1.000 0.000 1.000 0.000 1.000 0.000
1 0.853 0.078 0.876 0.051 0.797 0.094 0.933 0.046
2 0.798 0.075 0.804 0.095 0.718 0.066 0.856 0.066
3 0.723 0.095 0.688 0.085 0.647 0.072 0.802 0.112
4 0.681 0.091 0.590 0.072 0.594 0.085 0.676 0.088
5 0.572 0.098 0.581 0.088 0.459 0.085 0.563 0.064
6 0.523 0.110 0.470 0.025 0.325 0.038 0.370 0.080
7 0.276 0.057 0.383 0.092 0.260 0.070 0.365 0.053
8 0.207 0.046 0.300 0.079 0.193 0.007 0.208 0.055
9 0.180 0.038 0.187 0.004 0.155 0.021 0.116 0.042
10 0.152 0.026 0.179 0.002 0.124 0.017 0.106 0.010
11 0.142 0.030 0.081 0.009 0.038 0.010 0.021 0.008
12 0.117 0.045 0.047 0.015 0.018 0.004 0.000 0.000
13 0.098 0.013 0.000 0.000 0.006 0.000 0.000 0.000
14 0.081 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
75
El grupo control mantuvo una reducción media de las heridas por debajo de los grupos
LLLT-A y LLLT-RVA los primeros 3 días. En el día 6 mostró una media mayor a todos
los grupos y finalmente se mantuvo con la media mayor a partir del día 11 hasta el día
14.
El grupo LLLT-R mantuvo una contracción de la herida promedio los primeros 5 días,
sin embargo, obtuvo la media del área mayor del día 7 al 10, y una reducción de la
herida con mayor velocidad a partir del día 10, cerrando por completo el día 13. El
grupo de LLLT-V mostró la media del área menor los primeros 5 días y un cierre total
de la herida al día 13. Tanto el grupo LLLT-A como el grupo LLLT-RVA muestran un
comportamiento similar. Obtuvieron las medias de área mayor los primeros 5 días, sin
embargo, a partir del día 6 la reducción del área de la herida fue más evidente, el grupo
LLLT-RVA obtuvo la media de área menor a partir del día 7. Seguido por el grupo de
LLLT-A, el cual presentó un cierre total de la herida el día 12 siendo el primero en
lograr una reepitelización completa.
5.1.4 Análisis histológico de los grupos LLLT
En la Fig. 22 se observan imágenes panorámicas tomadas con objetivo 5 x de los cortes
histológicos de los grupos control y LLLT-R en los días 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. Y como complementarias a estas imágenes en la Fig. 23 se observan
imágenes de cortes histológicos tomadas con objetivo 40 x de estos mismos grupos en
los días 7 y 14. En la imagen del día 5 de la Fig. 22 se observa en el grupo control un
tejido granuloso joven con poco infiltrado inflamatorio. En el grupo LLLT-R se observa
un tejido granuloso joven de igual manera, aparentemente con mayor infiltrado
inflamatorio lo que le da esta tonalidad más rojiza y no se observa epitelio epidérmico
en ninguno de los dos grupos.
76
Para el día 7 del grupo control en la Fig. 22 se observa un corte histológico con
tonalidad rojiza sin epitelio epidérmico lo que se confirma con la imagen de la Fig. 23 en
la que se observa un tejido granuloso joven con un abundante infiltrado inflamatorio lo
que le da la tonalidad más rojiza y no se observa epitelio epidérmico lo que indica que
está en fase inflamatorio con inicios en la fase proliferativa. Mientras que el grupo
LLLT-R en el día 7 en la Fig. 22 se observa un tejido epitelial epidérmico más maduro en
los extremos (flecha roja), con poca estratificación en la parte del centro. Esta
epitelización del grupo LLLT-R en el día 7 se confirma en la Fig. 23, en esta imagen
también se puede observar un tejido granuloso más laxo y orientado que el grupo
control con poco infiltrado inflamatorio lo que indica que está en una fase más
avanzada que la del control.
En la imagen del día 14 del grupo control en la Fig. 22 se observan las 3 capas de la piel
(epidermis, dermis e hipodermis) al igual que el grupo LLLT-R, sin embargo, este
presenta una contracción de la herida más avanzada desde los extremos a la parte
central en el grupo LLLT-R que en el grupo control. En la Fig. 23 se confirma con el
estrato corneo la estratificación epitelial epidérmica completa en ambos grupos; en el
grupo control se observa una matriz dérmica con infiltrado inflamatorio y fibras
orientadas; sin embargo, en el grupo LLLT-R se observa una matriz dérmica más laxa
que la del grupo control con fibras de colágeno mayormente orientadas con bajo
infiltrado inflamatorio, lo que indica que está en una fase proliferativa más avanzada
del proceso de cicatrización.
77
Figura 22 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y LLLT-R. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
78
Control LLLT-R
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Figura 23 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y LLLT-R.
79
En la Fig. 24 se observan imágenes panorámicas tomadas con objetivo 5 x de los cortes
histológicos de los grupos control y LLLT-V en los días 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. Y como complemento a estas imágenes en la Fig. 25 se observan imágenes
de cortes histológicos tomadas con objetivo 40 x correspondientes a estos mismos
grupos en los días 7 y 14. El grupo LLLT-V en el día 5, (Fig. 24) muestra un tejido
granuloso joven, con poco infiltrado inflamatorio, sin epitelio epidérmico; en una fase
de cicatrización similar al control.
En la Fig. 24 del grupo LLLT-V del día 7 se observa un corte histológico con tonalidad
rojiza sin epitelio epidérmico, se aprecia de mejor manera en la imagen en 40 x de la Fig.
25 en la que se observa un tejido granuloso joven con un abundante infiltrado
inflamatorio y de eritrocitos mismos que le dan la tonalidad rojiza; no se observa
epitelio dérmico, por lo que se puede decir que se encuentra en una fase de cicatrización
similar al control.
En la imagen del día 14 del grupo LLLT-V en la Fig. 24 se observan las 3 capas de la piel
(epidermis, dermis e hipodermis) de igual manera que el grupo control. En la Fig. 25 del
tratamiento LLLT-V de este mismo día 14 se observa una matriz dérmica con tejido
granuloso compacto, un alto infiltrado inflamatorio y abundantes eritrocitos lo que
indica un tejido de granulación en una etapa proliferativa-inflamatoria más joven que el
que se observa en el grupo control.
80
Figura 24 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y LLLT-V. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
81
Control LLLT-V
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Figura 25 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y LLLT-V.
82
En la Fig. 26 se muestran los resultados del procesamiento histológico de las biopsias
del grupo LLLT-A frente al grupo control en los días 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. En la Fig. 27 se observan imágenes de cortes histológicos tomadas con
objetivo 40 x de estos mismos grupos en los días 7 y 14. En la imagen del día 5 del
grupo LLLT-A en la Fig. 26 se observa infiltrado inflamatorio y tejido granuloso más
laxo que el grupo control, lo que sugiere que se encuentra en una etapa más avanzada
de cicatrización frente al grupo control.
En la Fig. 26 del grupo LLLT-A del día 7 se observa un tejido granuloso más laxo, que el
del grupo control al igual que se puede observar un frente del tejido epitelial (flecha
roja) avanzado en los extremos de la herida, pero inconcluso en la parte central (flecha
negra). En la imagen de la Fig. 27 del grupo LLLT-A del día 7 se aprecia de mejor
manera esta matriz dérmica con infiltrado inflamatorio, en la imagen se observa tejido
granuloso en la parte superior junto al epitelio (flecha roja) y una matriz laxa
translucida en la parte inferior (flecha negra) de la imagen lo que indica que está en una
fase de proliferación más avanzada con respecto a la que se observa en el grupo control.
En la imagen del día 14 del grupo LLLT-A en la Fig. 26 se observan un epitelio
epidérmico completamente estratificado y con invaginaciones en la matriz dérmica. En
la Fig. 27 del día 14 para este mismo grupo se observa tejido epitelial completamente
estratificado y una invaginación importante en la matriz dérmica para dar lugar a un
primordio de folículo en esta imagen se observa una matriz dérmica con infiltrado
inflamatorio; debajo del estrato basal del epitelio se observa tejido granuloso (flecha
roja) y por debajo de este tejido gránulos se observan fibras de colágeno orientadas
(flecha negra), lo que indica que está en una etapa de cicatrización más avanzada con
respecto al grupo control.
83
Figura 26 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y LLLT-A. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
84
Figura 27 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y LLLT-A.
85
En la Fig. 28 se observan imágenes panorámicas tomadas con objetivo 5 x de los cortes
histológicos de los grupos control y LLLT-RVA en los días 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. Y como complemento a estas imágenes en la Fig. 29 se observan imágenes
de cortes histológicos tomadas con objetivo 40 x correspondientes a estos mismos
grupos en los días 7 y 14. El grupo LLLT-RVA en el día 5, (Fig. 28) muestra un tejido
granuloso joven con tonalidad rojiza, esto debido a un abundante infiltrado
inflamatorio.
En la Fig. 28 del grupo LLLT-RVA del día 7 se observa un corte histológico con un
epitelio epidérmico completo en la parte central. Y una matriz dérmica con abundante
infiltrado inflamatorio. Esto se puede apreciar de mejor manera en la Fig. 29 en la que se
observa un tejido granuloso joven con un abundante infiltrado inflamatorio y tejido
granulo con fibras de colágeno poco organizadas.
En la imagen del día 14 del grupo LLLT-RVA en la Fig. 28 se observan las 3 capas de la
piel (epidermis, dermis e hipodermis). En la Fig. 29 se observa una matriz dérmica con
tejido granuloso compacto, con abundante infiltrado inflamatorio aun presente.
86
Figura 28 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y LLLT-RVA. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
87
Control LLLT-RVA
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Figura 29 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y LLLT-RVA.
88
5.2 Resultados PDT
5.2.1 Fotografías convencionales e histogramas tridimensionales de los grupos PDT
En la Fig. 30 se observan las fotografías (lado derecho) de los grupos control, PDT-AM y
PDT-RB en los días 0, 3, 5, 7 y 14 y el histograma de cada imagen a la izquierda de éstas.
En las imágenes se observó una longitud total similar de la herida los días 0 y 3 para
todos los grupos. En el día 5 el PDT-RB es el que mostró una longitud total de la herida
menor, manteniendo esta tendencia hasta el día 14 mostrando el cicatrizado más
estético con respecto a los otros 2 grupos, es decir, que el tejido cicatricial tiene mayor
similitud con el tejido periférico sano.
El grupo PDT-AM presentó una costra abundante el día 7 de cicatrizado incluso mayor
que el control. Sin embargo, para el día 14 el cicatrizado fue más estético que el del
grupo control, pero menos que el del grupo PDT-RB. Con la ayuda de los histogramas
se hizo más evidente la contracción de la herida. El grupo control fue el que mostró un
contrataste mayor con respecto a la tonalidad de la circunferencia, en el día 14 el grupo
PDT-AM mostró un diámetro total menor al control y una la tonalidad fue más
uniforme del tejido cicatricial nuevo, mientras que para el grupo PDT-RB la cicatriz fue
casi imperceptible. Mostrando una tonalidad más uniforme con respecto a los otros 2
grupos y un menor contraste en el relieve del histograma se traduce como un mejor
cierre de la herida y por lo tanto un cicatrizado más estético.
89
5.2.2 Contracción de la herida de los grupos PDT
En la gráfica 2 se observa una gráfica en la que se compara la media y la desviación
estándar del área de la herida normalizada del grupo control frente a los grupos de
PDT. En los primeros 5 días el control obtuvo las medias de área menores en
comparación con los grupos tratados con PDT en el día 6 los tres grupos muestran
resultados similares en el día 7 el grupo control vuelven a ser significativamente menor,
Figura 30 Matriz de la evolución de las heridas en los días 0, 3, 5 7 y 14 del proceso de cicatrización para los grupos: control, PDT-AM y PDT-RB. El grupo control no recibió ningún tratamiento, al grupo PDT-AM se le suministró de forma cutánea AM a 20 μM y se éxito con una dosis de 10 J/cm^2 con un LED de luz roja, mientras que al grupo PDT-RB se le suministró de forma cutánea RB a una concentración de 5 μM y se éxito con una dosis de 10 J/cm^2 con un LED de luz verde. El histograma tridimensional perteneciente a cada fotografía se encuentra a la derecha de esta. Los histogramas se realizaron en el programa ImageJ y son una herramienta que nos permite apreciar de mejor manera el proceso de reducción de las heridas, en especial en el día 14 cuando la herida es casi imperceptible.
90
sin embargo, a partir del día 8 los grupos obtienen de nuevo medias de área menores
con respecto del control, mostrando una diferencia en la media del área evidente los
últimos 3 y cerrando por completo ambos grupos de PDT en el día 14.
Gráfica 2 Esta gráfica se realizo utilizando el software Origin 8 en ella se graficáron las medias y la desviación estándar de las áreas de las heridas en el proceso de cicatrización desde el día 0 hasta el día 14, para los grupos, control, PDT-AM y PDT-RB. Los resultados de cada grupo se normalizaron con respecto de sí mismo para el día 0 es decir la media del área correspondiente al día 0 de cada grupo tomo él valor de 1, el resto de los días de cada grupo se normalizaron con el valor de su día 0, incluyendo la varianza.
91
Tabla 15 En esta tabla se muestran las medias y la desviación estándar (DE) de las áreas de las heridas en el proceso de cicatrización desde el día 0 hasta el día 14, para los grupos, control, PDT-AM y PDT-RB correspondientes a la Gráfica 2.
Días Control DE Control PDT-R DE PDT-R PDT-V DE PDT-V
0 1.000 0.000 1.000 0.000 1.000 0.066
1 0.853 0.078 0.907 0.084 0.934 0.090
2 0.798 0.075 0.839 0.087 0.900 0.077
3 0.723 0.095 0.798 0.081 0.890 0.057
4 0.681 0.091 0.698 0.052 0.800 0.102
5 0.572 0.098 0.660 0.086 0.757 0.113
6 0.523 0.110 0.531 0.070 0.486 0.094
7 0.276 0.057 0.420 0.097 0.393 0.086
8 0.207 0.046 0.225 0.005 0.173 0.063
9 0.180 0.038 0.161 0.009 0.172 0.086
10 0.152 0.026 0.140 0.002 0.167 0.070
11 0.142 0.030 0.083 0.017 0.130 0.058
12 0.117 0.045 0.042 0.007 0.031 0.011
13 0.098 0.013 0.000 0.000 0.018 0.003
14 0.081 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000
92
5.2.3 Análisis histológico de los grupos PDT
En la Fig. 31 se muestran los resultados del procesamiento histológico de las biopsias
del grupo PDT-AM frente al grupo control en los días 3, 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. En la Fig. 32 se observan imágenes de cortes histológicos tomadas con
objetivo 40 x de estos mismos grupos en los días 7 y 14. En la imagen del día 5 del
grupo PDT-AM en la Fig. 31 se observa tejido granuloso con infiltrado inflamatorio.
En la Fig. 31 del grupo PDT-AM del día 7 se observa una matriz dérmica más madura
en remodelación con fibras laxas, al igual que se puede observar un tejido epitelial
completamente estratificado en toda la superficie de la herida. Esto se aprecia de mejor
manera en la imagen de la Fig. 32 del grupo PDT-AM del día 7, donde se puede
observar más fácilmente la matriz dérmica, más madura y en remodelación con fibras
laxas, con poco infiltrado inflamatorio al igual que un epitelio completamente
estratificado desde el día 7 en toda la superficie de la herida (flecha roja). Lo que
evidentemente sugiere una fase de cicatrización mucho más avanzada con respecto a la
que se observa en el grupo control.
En la imagen del día 14 del grupo PDT-AM en la Fig. 31 se observa un epitelio
epidérmico completamente estratificado con abundantes folículos pilosos. En la Fig. 32
del día 14 para este mismo grupo se aprecia de mejor manera este tejido epitelial
completamente estratificado con abundantes folículos pilosos y glándulas sebáceas
(flecha roja). Y una matriz dérmica en remodelación, con fibras de colágeno orientadas
en formación más semejante al tejido normal.
93
Figura 31 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 3, 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y PDT-AM. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
94
Control PDT-AM
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Figura 32 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y PDT-AM.
95
En la Fig. 33 se muestran los resultados del procesamiento histológico de las biopsias
del grupo PDT-RB frente al grupo control en los días 3, 5, 7 y 14 del proceso de
cicatrización. En la Fig. 34 se observan imágenes de cortes histológicos tomadas con
objetivo 40 x de estos mismos grupos en los días 7 y 14, En la Fig. 33 en el día 3 se
observó una matriz dérmica abundante principalmente en la parte central de la herida.
En el día 5 el proceso de cicatrización fue similar al del control, se observó un tejido
dérmico delgado y con una longitud total similar de la herida, con mayor infiltrado
inflamatorio. En el día 7 se observó una matriz dérmica con abundante infiltrado
inflamatorio y eritrocitos; de igual manera se observa un frente de migración epitelial
(flecha roja). Estas observaciones se aprecian de mejor manera en la Fig. 34 en donde se
observa un tejido gránulos con abundante infiltrado inflamatorio y un tejido epitelial
despegado de la dermis esto probablemente debido a la manipulación histológica. En
el día 14 se observa un tejido dérmico en fase de remodelado y un tejido epitelial bien
estratificado con abundantes invaginaciones y folículos pilosos.
96
Figura 33 Fotografía tomadas con un objetivo 5x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el área de las heridas con respecto a los días 3, 5, 7 y 14 del proceso de cicatrización respectivamente de los grupos control y PDT-RB. Nótese que se observa piel completa (epidermis, dermis e hipodermis) a cada extremo de la herida esto como una referencia control del cicatrizado ideal de cada corte.
97
Control PDT-RB
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Día 7 (40 x)
Día 14 (40 x)
Figura 34 Fotografía tomadas con un objetivo 40x de cortes histológicos con un grosor de 20 μm teñidos con HE. En los cortes histológicos se observa el proceso de cicatrización de los días 7 y 14 de los grupos control y PDT-RB.
98
5.3 Resultados del análisis de homogeneidad
En las siguientes graficas (grafica 3-9) se muestra el mapeo de homogeneidad de los
cortes histológicos del día 14 de cada grupo. En las gráficas se observa una escala que
va de 0 a 0.5 en valores de homogeneidad representados en una paleta de color. En la
imagen se observa el corte histológico evaluado bajo esta métrica. A cada píxel del corte
histológico se le asignó un color asociado al nivel de homogeneidad de esa zona. Los
dos valores que se muestran en la imagen representan el valor promedio y la varianza
del nivel de homogeneidad del tejido sano (H.T.S) y del tejido cicatricial (H.T.C).
Gráfica 3. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo control en el día 14.
99
Gráfica 5. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo LLLT-V en el día 14.
Gráfica 4. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo LLLT-R en el día 14.
100
Gráfica 7. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo LLLT-RVA en el día 14.
Gráfica 6. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo LLLT-A en el día 14.
101
Gráfica 8. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo PDT-RB en el día 14.
Gráfica 9. Mapeo de homogeneidad del corte histológico del grupo PDT-AM en el día 14.
102
En las gráficas anteriores (gráfica 3 a gráfica 9) se observa el análisis de homogeneidad
de los cortes histológicos de todos los grupos en el día 14. Debido a que varianza todos
los grupos es relativamente similar (entre 0.0907 y 1222) en la tabla 14 se presentan los
datos de H.T.S, H.T.C correspondientes a cada grupo y la diferencia del promedio de
homogeneidad para estas dos secciones de cada corte histológico. En la tabla 14 se
observa que el grupo que tuvo mayor similitud del tejido sano respecto del tejido
cicatricial fue el grupo LLLT-A, seguido por el grupo PDT-AM, en tercer lugar se
encuentra el grupo LLLT-RVA, en cuarto lugar el grupo PDT-RB, el grupo LLLT-V se
encuentra en el quinto lugar de similitud, el grupo LLLT-R se encuentra solo por debajo
del control y finalmente el control demostró ser el que tiene mayor diferencia del tejido
cicatricial respecto del tejido sano.
Tabla 16. Datos del análisis de homogeneidad del tejido sano y el tejido cicatricial para todos los grupos en el día 14 y la diferencia de las dos secciones
Tratamiento H.T.S. (T^0) H.T.C. (T^t) t
Control 0.2057 0.3304 0.6062
LLLT-R 0.2213 0.3033 0.370
LLLT-V 0.2446 0.3255 0.3307
LLLT-A 0.2326 0.2733 0.1749
LLLT-RVA 0.2287 0.2927 0.2798
PDT-AM 0.2208 0.2675 0.2115
PDT-RB 0.2213 0.2902 0.3113
103
Control LLLT-R LLLT-V LLLT-A LLLT-RVA PDT-AM PDT-RB
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Va
ria
cio
n r
ela
tiv
a d
e h
om
og
en
eid
ad
A
Variacion relativa de homogeneidad
Gráfica 10 Grafica de barras de la variación relativa de cada grupo. En esta grafica se compara el valor de variación relativa de la homogeneidad de cada grupo. En donde se entiende que un valor menor de variación relativa indica una similitud mayor del tejido cicatricial nuevo frente a una piel sana sin herida.
104
Capítulo 6
6. Discusión
En este capítulo discutiremos acerca de los resultados obtenidos en nuestro
investigación a la vez que analizaremos y compararemos nuestros resultados, con los
resultados obtenidos en investigaciones consultadas [6] [40] [46] [55] [56] [57] [61] [62]
[63] [64].
Los resultados obtenidos al contrastar la media de las áreas en el proceso de
cicatrización en las gráficas 1 y 2 muestran que todos los grupos excepto el grupo
control tenían una contracción de la herida completa en el día 14; a excepción del grupo
control, en el que se observó un centro con tono rojizo oscuro en el día 14, lo que indica
que la reepitelización no había concluido. Esto permite validar la idea de que tanto la
LLLT como la PDT mejoran el proceso de la contracción de la herida probablemente
como resultado de un proceso de migración epitelial acelerado y una formación más
temprana de tejido granuloso lo que se confirma con los resultados histológicos.
Los histogramas en 3D permiten apreciar de mejor manera la capacidad de
reepitelización de los tejidos con tratamientos especialmente en el día 14, en los
histogramas en 3D se observa que todos los tratamientos.
Hasta ahora, la mayoría de los estudios de regeneración de tejidos con LLLT se han
realizado con la radiación del espectro electromagnético que se encuentra dentro del
rojo e IR. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que la luz de longitudes de
onda más pequeñas sin llegar al UV pueden influir significativamente en los sistemas
biológicos [40] [46] [55] [65]. En este estudio se compararon los efectos de la LLLT con
105
LED azul, verde y rojo en la cicatrización de heridas In vivo en un modelo de heridas en
ratas.
Las longitudes de onda largas tienen la ventaja de penetrar profundamente en el tejido,
pero no transmiten tanta potencia de energía como las longitudes de onda más cortas.
Sin embargo, la menor profundidad de penetración puede ser compensada con otros
beneficios cuando se trata de heridas superficiales. Las profundidades de penetración
de los tres LED utilizados son suficientes para estimular las células en la superficie de la
herida [65].
Nuestro estudio con la LLLT-R representan una aportación más a los ya tan reportados
efectos fotoestimulantes positivos que se llevan a cabo al irradiar al tejido biológico
dentro de estas longitudes de onda (dentro del rojo e IR) [6] [40] [61] [66] [67] [68]. Los
resultados que se obtuvieron mediante el análisis histológico de tinción con HE nos
muestran un panorama general de la reestructuración cutánea que se lleva a cabo en la
cicatrización bajo la influencia de los distintos tratamientos. Sin embargo, es importante
resaltar que, en este estudio, a diferencia de los trabajos reportados anteriormente, se
muestran imágenes panorámicas de la herida en donde el principal control de
comparación es el tejido sano de ambos lados de la herida. Estas fotografías
panorámicas de los cortes histológicos permiten analizar y comparar de manera más
sencilla la reestructuración cutánea que se llevó a cabo bajo los distintos tratamientos
aplicados (LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A, LLLT-RVA, PDT-AM y PDT-RB), y compararlos
con el proceso de cicatrización sin tratamiento del grupo control.
En el caso de los tratamientos LLLT-V y LLLT-A se encuentra en la literatura un grupo
mucho menor de estudios con los cuales comparar nuestros resultados, sin embargo
Fushimi y colaboradores [65] realizaron un estudio comparativo entre las técnicas de
aplicación LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A en el proceso de cicatrización utilizando un
modelo murino, en dicho estudio reportaron una mayor eficiencia y reducción de la
106
herida en menor tiempo con la técnica LLLT-V, seguido por la técnica LLLT-R,
descartando casi por completo la técnica LLLT-A. Estos resultados tienen un grado de
discrepancia con nuestro estudio ya que al comparar nuestros grupos entre sí, la LLLT-
A mostró un proceso de cicatrización más avanzado que los LLLT-V y LLLT-R. Fushimi
y colaboradores concluyeron que la LLLT-V promueve la cicatrización de heridas
induciendo mediadores migratorios y proliferativos, lo que sugiere que no solo la
LLLT-R sino también la LLLT-V puede ser una nueva y poderosa estrategia terapéutica
para la curación de heridas [65].
Probablemente, esta diferencia en la eficiencia de la interacción luz-tejido sea
consecuencia de la falta de estandarización en la elección de la densidad de potencia, la
densidad de energía y la duración de la irradiación asociada a las propiedades ópticas
del tejido irradiado [69].
En contrataste los estudios realizados por Adamskaya, Dungel y Figurová confirman la
eficiencia de la LLLT-A en el proceso de curación de heridas reportando que esta
técnica puede desempeñar un papel importante en la curación de heridas al afectar la
expresión de queratina [55], y como consecuencia disminuir significativamente el
tamaño de la herida [46], acelerando el proceso de reepitelización y formación de fibras
de colágeno entrecruzadas [63].
Nuestros resultados con la PDT usando AM a 20 μM y excitado con 10 J/ cm^2 de luz
roja muestran un proceso de cicatrización noblemente más avanzado que el resto de los
grupos desde el día 7 en el que se observa un epitelio completamente estratificada y un
tejido dérmico laxo más maduro que el del resto de los grupos. En el día 14 se apreció la
formación abundante de folículos pilosebáceos en la parte superior de la herida, una
matriz dérmica con fibras de colágeno orientadas similares a la piel sana. Las dosis de
luz con los que se excitó al FS son las mismas que se aplicaron con la LLL-R, sin
embargo, la adición de AM en esta técnica tuvo un gran peso en la diferencia de los
107
resultados haciendo más eficiente la PDT-AM que la LLLT-R al mostrar una
diferenciación mayor, especialmente en la zona dérmica.
Esto contrasta con los resultados obtenidos por Vasconcelos y colaboradores los cuales
realizaron un estudio para evaluar ambas técnicas LLLT-R con una dosis de 10 J/ cm^2 y
la PDT con usando AM a 0.5 ug/mL excitado con 10 J/ cm^2, de luz roja en el proceso de
cicatrización de quemaduras. Sin embargo, reportaron mejores resultados con la técnica
LLLT-R al reportar niveles más altos de diferenciación miofibroblástica y una
reepitelización más acelerada.
Sperandio y colaboradores al igual implementaron ambas técnicas en la cicatrización de
heridas en un modelo murino. LLLT-R (117.85 J / cm^2, 100 mW) y PDT-AM (117.85 J /
cm^2, 100 mW de luz roja y AM al 0.01%) donde concluyeron que la PDT mediada por
AM no fue perjudicial para la cicatrización de heridas, ya que no se produjo demora en
comparación con el grupo de control. Sin embargo, la PDT no mostró mejores
resultados en comparación con el grupo LLLT-R. Lo que de igual manera contrasta con
nuestros resultados esto puede deberse a las dosis tan altas de luz que utilizaron en la
PDT. Respecto a la costra de las heridas, describen resultados similares a los nuestros a
pesar de la gran diferencia con de la dosis de energía implementada. Describen que los
grupos de láser o PDT tuvieron una apariencia clínica similar, mostrando costras más
oscuras y gruesas que las presentadas por el grupo control [56].
El grupo de investigación de Carneiro y colaboradores experimentaron la cicatrización
de heridas implementando la PDT-AM (120 J/cm^2 de luz roja y AM 10 ug / mL) sin
embargo sus resultados muestran reacciones de necrosis en la mitad de las heridas. Lo
que dificultó la reepitelización en el séptimo día e interfirió en la curación estándar [64].
Esto puede ser debido a sus dosis tan altas de luz.
108
Respecto a nuestros resultados obtenidos con el grupo PDT-RB (10 J / cm^2 de luz verde
y RB a 5 μM) en el que obtuvimos una especial estratificación del epitelio epidérmico
con abundante invaginaciones y primordios de folículos pilosebáceos en el día 14. En la
literatura no existen muchos trabajos relacionados con estos parámetros de luz verde y
RB, sin embargo, Tariq y colaboradores [57] realizaron un estudio para evaluar la
eficiencia de la PDT-RB (RB y 5 mW de luz vede por 200s) en la cicatrización de una
herida de incisión de espesor total en la línea media ventral en conejos. En dicho estudio
reportaron que la unión del tejido tratado con PDT-RB dio como resultado una
puntuación de curación significativamente mejor en comparación con la sutura
convencional para el cierre de heridas, tiempo de curación significativamente más
rápido, fibras de colágeno más densas y al menor espacio entre las fibras de colágeno y
al aumento del grosor de la dermis y una epidermis significativamente engrosada [57].
Lo que respalda nuestros resultados obtenidos con nuestro grupo de PDT-RB.
En los resultados obtenidos en el grupo de LLLT-RVA, se observó una contracción de la
herida acelerada con respecto a los otros grupos en el análisis planimétrico, se resalta la
importancia de este estudio, ya que dicha combinación no se he reportado con
anterioridad en los trabajos consultados [6] [46] [70] [71]. Es posible que el tratamiento
combinado pueda estimular a más de un blanco intracelular involucrado en la respuesta
de regeneración de tejidos, como los complejos proteicos de la cadena transportadora de
electrones, haciendo más eficiente este proceso que tiene como finalidad la síntesis de
ATP.
Con respecto al análisis de homogeneidad y heterogeneidad, que realizamos en esta
investigación, es importante mencionar que no se ha realizado en los estudios
previamente consultados [6] [40] [46] [55] [56] [57] [61] [63] [64] [67] [72]. Este análisis
aporta un valor cuantitativo para poder medir y comparar la reestructuración de la piel
en el proceso de cicatrización. Un valor de homogeneidad mayor indica una
109
reestructuración cutánea menor y un valor de homogeneidad menor infiere un proceso
de reestructuración cutánea mayor. Como se observó en los resultados, el proceso de
cicatrización del grupo control en el día 14 se observó matriz dérmica con fibas de
colágeno orientadas y las tres capas características de la piel (epidermis, dermis e
hipodermis), sin embargo, no se logró apreciar las estructuras cutáneas características
de una piel sana. En contraste con los grupos tratados con las técnicas de PDT y LLLT
en donde se logró apreciar una reestructuración cutánea mayor frente a el grupo control
en el proceso de cicatrización para el día 14. Este análisis aporta un valor numérico con
el cual podemos determinar que el proceso de reestructuración cutánea fue mejorado al
aplicar las técnicas LLLT y PDT. De acuerdo con el análisis de homogeneidad los
grupos con mayor reestructuración cutánea fueron el grupo LLLT-A y el grupo de PDT-
AM, por el contrario, dentro de los grupos tratados, los grupos que presentan una
diferenciación menor fueron los grupos LLLT-R y LLLT-V. Estos resultados son
interesantes ya que la LLLT en el espectro de luz roja junto con el IR son presentadas en
la literatura como las longitudes de onda ideales para esta terapia. Y la LLLT en el
espectro de luz azul ha sido casi completamente ignorada por los grupos de
investigación, esto debido probablemente a su poca capacidad de penetración. Sin
embargo, en este estudio se comprobó que la terapia con luz azul tiene la capacidad de
acelerar el proceso de cicatrización, especialmente en el tejido epitelial esto
probablemente debido a la poca capacidad de penetración y a su mayor cantidad de
energía. Respecto a los grupos con PDT el grupo de PDT-AM mostró resultados
favorables en el análisis de homogeneidad, este grupo mostro un avance considerable
en el proceso de cicatrización desde el día 7. El grupo de LLLT-RVA se encuentra en el
tercer lugar de diferenciación, esto sugiere que es una técnica efectiva, sin embargo, la
reestructuración cutánea fue menor al compararla con el grupo LLLT-A esto
probablemente a que la dosis más alta de luz (20 J/cm^2 más alta) pudo influir de
manera contraproducente en el proceso inflamatorio.
110
En el grupo PDT-RB se mostró resultados numéricos similares al grupo LLLT-RVA, no
obstante, la diferenciación se dio lugar especialmente en la epidermis, como se observa
en los cortes histológicos.
Cabe resaltar que el uso de la rata alopécica que se empleó en nuestra investigación, no
se ha reportado con anterioridad y presenta características beneficiosas para el tipo de
estudio propuesto, como la docilidad de la cepa que facilita la aplicación de los
tratamientos, evitando la necesidad de anestesiar o recurrir a sistemas de sujeción del
organismo en los momentos de aplicación de tratamientos en los días 1 y 2. Pero sobre
todo, debido a que su estructura epitelial es más parecida a la de los humanos por su
baja presencia de vello, evitando que se tenga que rasurar a la rata antes de la cirugía y
su proceso de reepitelización de la herida de forma circular similar a la del humano.
A continuación, se muestra una tabla comparativa en la que se sintetizan los resultados
encontrados en esta investigación respecto al día 14.
111
Tabla 17 Tabla comparativa en la que se sintetizan los resultados de los grupos Control, LLLT-R, LLLT-V, LLLT-A, LLLT-RVA, PDT-AM y PDT-RB en el día 14 respecto al estado del epitelio epidérmico y la matriz dérmica.
Grupos Epitelio epidérmico Matriz dérmica Fase de
cicatrizado
Control Completo y
estratificado
Fibras de colágeno
orientadas con infiltrado
inflamatorio
Inflamatoria-
proliferativa
LLLT-R Completo y
estratificado
Fibras de colágeno
orientadas con poco
infiltrado inflamatorio
Proliferativa
LLLT-V Completo y
estratificado
Tejido de granulación
maduro con infiltrado
inflamatorio
Inflamatoria-
proliferativa
LLLT-A Completo,
estratificado, con
numerosas
invaginaciones y
folículos pilosos
Fibras de colágeno
orientadas y laxas
Proliferativa-
remodelación
LLLT-RVA Completo y
estratificado
Tejido de granulación
maduro con infiltrado
inflamatorio
Inflamatoria-
proliferativa
PDT-AM Completo,
estratificado, con
numerosas
invaginaciones,
folículos pilosos y
glándulas sebáceas
Tejido en remodelado
con fibras de colágeno
orientadas y laxas, en
formación similar a piel
normal
Proliferativa-
remodelación
PDT-RB Completo y
estratificado
Tejido en remodelado Proliferativa-
remodelación
112
Capítulo 7
7. Conclusión
De acuerdo con los resultados obtenidos en nuestra investigación podemos concluir que
la LLLT y la PDT mejoran el proceso de formación de estructuras cutáneas y la
reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas.
La implementación de distintas longitudes de ondas en la LLLT pueda estimular
mecanismos celulares distintos en el proceso de cicatrización en heridas cutáneas.
La aplicación de la PDT con AM excitado con luz roja tiene especial influencia en la
formación de reestructuración cutánea en el proceso de cicatrización.
La aplicación de la PDT con RB excitado con luz verde tiene especial influencia en la
formación y diferenciación de los estratos epidérmicos.
Tomando como referencia los resultados del análisis histológico de los cortes, y los
resultados en el análisis de homogeneidad podemos concluir que los tratamientos con
LLLT-A y PDT-AM fueron los más eficientes en la mejora de la reestructuración de la
piel en el proceso de cicatrización.
Los resultados obtenidos en este estudio aportan información adicional que ayudará a
superar los obstáculos clínicos que se tienen respecto a encontrar la dosis ideal en la
aplicación de estas técnicas biofotónicas para tratar heridas crónicas. Demostrando que
la LLLT y la PDT ofrecen una modalidad mínimamente invasiva y de aplicación sencilla
para tratar este tipo de afecciones médicas.
113
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