Validacija Kvalitativnih Metoda
-
Upload
kemijalove -
Category
Documents
-
view
236 -
download
2
Transcript of Validacija Kvalitativnih Metoda
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 1/24
Validacija kvalitativnih metodaSeminarski rad
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 2/24
Sadržaj
1. Uvod ............................................................................................................................... 1
2.
Validacija ...................................................................................................................... 2 2.1.Točnost………………………………………………………………………………..3
2.2.Selektivnost i specifičnost ............................................................................................ 6
2.3.Linearnost……………………………………………………………………………..7
2.4.Stabilnost analita i standardnih otopina……………………………………………….9
2.5.Učinak matice…………………………………………………………………………9
2.6.Otpornost i osjetljivost metode……………………………………………………....10
2.7.LD i LQ…………………………………………………………………………….....10
2.8.Radno područje……………………………………………………………………....12
2.9.Robusnost………………………………………………………................................12
3. Strategija validacije.................................................................................................... 13
4. ISO…………………………………………………………………………………....14
5. Kvalitativne metoda i njihova validacija………………………………………......15
6. Zaključak ………………………………………………………………………….....22
Literatura
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 3/24
1
1. Uvod
Kemija zadire u sve aspekte materijalnoga svijeta. Njezine discipline povezane su sa
svim područjima znanosti i tehnologije. To se posebice odnosi na analitičku kemiju, jer su
rezultati kemijske analize temelj prirodnih znanosti, a pomoć su i u donošenju važnihzaključaka u društvenim znanostima i umjetnosti. Neizostavni su i pri donošenju
zakonodavnih odluka, posebice onih vezanih uz zaštitu i očuvanje okoliša i ljudskoga
zdravlja. Bez analitičkih mjerenja ne može se ocjenjivati kvaliteta materijala i proizvoda, pa je
analitička kemija nedjeljiv dio tehničkih znanosti i disciplina [14]. Svatko od nas u svom
analitičkom laboratoriju teži postizanju brzih, točnih i vjerodostojnih rezultata analize.
Najbolji način izbjegavanja problema tijekom uporabe određenih metoda jest provođenje
validacija analitičkih metoda. Također, validacijom se mogu utvrditi uzroci mogućih problema tijekom izvođenja metode, čime se postiže veliki stupanj pouzdanosti i pogodnosti
metode. Vrednovanje metoda ključni je postupak u utvrđivanju referentnih metoda i procjeni
kompetencije laboratorija pri postizanju pouzdanih i dosljednih rezultata analize. Stoga je
značenje širine okvira ovog termina posebice važno jer valja imati na umu i ulogu osiguranja
kakvoće i kontrole kakvoće. Kemijska analiza znači kemijsko rastavljanje, raščlanjivanje
cjelovitog ili kompleksnog na sastavne dijelove (grčki analysis). Zadaci kemijske analize
temeljno se svode na dobavljanje analitičkih informacija o kvalitativnom i kvantitativnom
sastavu ispitivanog materijala. Kemijskom analizom ustanovljava se sastav neke tvari
(kemijskog spoja ili smjese). Ako se pri tome ustanovljava samo prisutnost pojedinih
sastojaka, bez obzira na njihov stehiometrijski odnos, govorimo o kvalitativnoj analizi, a ako
se radi o određivanju sadržaja (mase, količine, koncentracije) pojedine sastavnice govorimo o
kvantitativnoj analizi. Dakle, kvalitativna kemijska analiza prethodi kvantitativnoj. Za
utvrđivanje prisutnosti nekog sastojka (elementa, spoja, atomske skupine) u ispitivanoj tvari
odnosno materijalu obično se upotrebljava pojam "dokazivanje" ili "detekcija", dok se u
kvantitativnoj analizi koristi pojam "određivanje".
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 4/24
2
2. Validacija
Izbor optimalne metode vrlo je važan rad pojedinog laboratorija, pa se u skladu s
programom osiguravanja kvalitete on temelji na znanstvenim i stručnim informacijama, koje
treba prilagoditi praktičnim uvjetima, kao što su vrijeme i cijena analize, točnost, preciznost
instrumenata te iskustvo i vještina analitičara [1]. Vrednovanje metode (validacija) je
potvrđivanje metode ispitivanjem i pribavljanjem stvarnih dokaza, da su ispunjeni posebni
zahtjevi u pogledu specifične primjene.1 Kada bismo htjeli validirati određeni analitički
proces ili sustav (Slika 1.), trebamo provesti vrednovanje svih njegovih bitnih koraka.
Validacijom određujemo i dokumentiramo prikladnost analitičkog sustava za određenu
namjenu i ona utvrđena ISO2 standardima. Validacija metode mora biti popraćena vrlo
iscrpnom dokumentacijom. K ada se želi validirati neka metoda treba ponajprije odreditinjezine izvedbene značajke. Izvedbene značajke izražene su kao analitički parametri pa
metode koje se podnose na službeno odobrenje moraju uključivati ispitivanja tih analitičkih
parametara (engl. performance characteristics) Općenito, izvedbene značajke/parametri
analitičke metode obuhvaćaju točnost (odnosno razlika mjerene i prave vrijednost), preciznost
(ponovljivost i obnovljivost rezultata), linearnost, stabilnost analita i standardnih otopina
(sposobnost dobivanja istih mjerenih rezultata tijekom duljeg vremenskog razdoblja),
selektivnost (sposobnost određivanja skupine sličnih sastojaka uzorka) i specifičnost(mogućnost nedvosmislenost određivanja analita u prisutnosti drugih sastojaka), učinak
matice, granica kvantificiranja, granica dokazivanja, otpornost metode, radno područje,
osjetljivost metode i iskoristivost.
1
Definicija prema pravilniku o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata («Narodne novine», broj 2/05), poglavlje 1., članak 2.) 2 Međunarodne organizacije za normizaciju ( ISO)
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 5/24
3
Slika 1. Prikaz tijeka analitičkog procesa preuzeto iz M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza
u sustavu kvalit ete, Školska knjiga, Zagreb (2003) 285.
2.1. Točnost
Točnost je stupanj podudarnosti između rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne
vrijednosti. Dokazuje se utvrđivanjem istinitosti i preciznosti.
Točnost rezultata određene
analize zavisi i o upotrijebljenom priboru. Poznata je činjenica, da referencijske i standardne
metode traže baždareni pribor, kako bi se s te strane izvor pogrešaka smanjio na minimum [9]
( Slika 2. ).
Slika 2. Prikaz točnosti i preciznosti
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 6/24
4
Preciznost metode definiramo kao izraz slaganja između niza mjerenja provedenih iz istog
homogenog niza uzorka3 prema propisanom analitičkom postupku. Eksperimenti preciznosti
se rade u homogenim stvarnim uzorcima tj. u pripremljenim uzorcima. Ovisno o uvjetima u
kojima se određuje razlikujemo:
1. Ponovljivost je parametar kojom se izražava preciznost rezultata; analiza istog
uzorka kojega pod istim uvjetima analizira isti analitičar, na istoj opremi u
kratkom vremenskom razdoblju [8].
2. Međupreciznost je parametar koji nam opisuje rezultate ako smo radili neko duže
vrijeme u jednakom laboratoriju, no koji je bio podložan očekivanim promjenama
( različiti analitičari, instrumenti, reagensi iz različitih boca i različitih dobavljača)
3.
Obnovljivot je parametar koji nam opisuje rezultate ako smo radili neko duževrijeme u različitom laboratoriju, taj se parametar određuje u svrhu normiranja
metode i rijetko ga provodi sam laboratorij.
Rezultati (preciznosti) se mogu prikazati grafički kao odnos teorijske (očekivane) vrijednosti
prema izmjerenoj koncentraciji, ali obvezatno kao srednje iskorištenje. Te su najbolji
pokazatelji preciznosti standardno odstupanje4 (Jednadžba 1.) , varijanca ili srednje kvadratno
odstupanje 5 (Jednadžba 2.) ili r elativno standardno odstupanje (Jednadžba 3.).
3 Homogeni materijal je homogen u odnosu prema danom svojstvu ako su prosječne vrijednosti toga svojstva za
različite dijelove materijala unutar granice mjerne pogreške pri određivanju toga svojstva
Homogenizirani cjelokupni uzorak- skupljeni niz uzoraka homogeniziranih radi postizanja jednoličnosticjelokupnog uzorka (definicije prema M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga,Zagreb (2003) 324).4 Standardna devijacija ( s ili ) je prosječno odstupanje pojedinačnih vrijednosti numeričkog obilježja odaritmetičke sredine. 5
Varijanca (s2
ili 2
) je aritmetička sredina kvadrata odstupanja vrijednosti numeričkog obilježja od njihovearitmetičke sredine. Izražena je u istim jedinicama mjere kao i numeričko obilježje.
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 7/24
5
s= √ ∑ (− = )−1 (1)
2= ∑ (− = )−1 (2)
s - standardno odstupanje
s2 - varijanca
n - ograničeni broj mjerenja
- srednja vrijednost
- izmjerena vrijednost (i = 1 do n)
n-1 - stupanj slobode
RSO= ∙100 [%] (3)
RSO- relativno standardno odstupanje
Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja između stvarne, tj. prihvaćene
referencijske vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom određeni broj puta. Brojčani
pokazatelj istinitosti eksperimentalno je utvrđeno kao sustavna pogreška mjernog uređaja
( engl. bias ), računa se kao razlika aritmetičke sredine rezultata i referencijske vrijednosti
(Jednadžba 4.).
b= x - xref (4)
b- sustavna pogreška mjernog uređaja
- srednja vrijednost
xref - referentna vrijednost
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 8/24
6
ili sustavna pogreška mjernog uređaja, ali u postocima (Jednadžba 5.)
b(%)= − ref
∙100 % (5)
Također, istinitost možemo procijeniti usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima
dobivenim referencijskom metodom, te analizom uzorka poznate koncentracije i na kraju
nacjepljivanjem matice ili uzorka poznatom koncentracijom referencijskog materijala.
2.1.Selektivnosti i specifičnost
Specifičnost je mogućnost nedvosmislenog određivanja analita u prisutnosti drugih
sastojaka uzorka ( nečistoće, sastojci matice, razgradni produkti i sl.), kojim primjenom
specifičnih metoda određivanja ne smetaju [1].
Selektivnost je svojstvo metode da identificira ili kvantificira željeni analit, ali se pri
tome za razliku od specifičnih reakcija, moraju ukloniti smetnje koje mogu utjecati na
rezultate analize. Rijetke su metode selektivne samo za željeni analit nužno je stoga pri izboru
metode prepoznati ili predvidjeti moguće interferencije, koje treba maskirati ili selektivno
ukloniti. U kvalitativnoj analizi selektivan je onaj reagens koji reagira s malim brojem sličnih
tvari, a specifičan onaj koji u danim uvjetima daje reakciju samo s jednim sastojkom [1].
Selektivnost i specifičnost metode uvelike ovise o matici i inteferencijama unutar određene
metode.
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 9/24
7
2.2. Linearnost
Linearnost (mjerno područje) je određena kao mogućnost metode da unutar određenog
područja daje ispitane rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku [7]. Test
linearnosti potvrđuje da su otopine uzorka ;u koncentracijskom području u kojemu je odgovor
detektora; linearno proporcionalne koncentraciji. Test se obično provodi na pet
koncentracijskih razina u željenome radnom području metode [6]. Procjenjuje se matematički
i grafički (umjerna krivulja ili kalibracijski pravac) prema jednadžbi 6.
y= ax + b (6)
y- mjereni parametar
a- odsječak na ordinati ili slijepa vrijednost
x- koncentracija
b-nagib pravca
Za koeficijent korelacije uobičajeno se postavlja kriterij k ≥ 0,99, smatra se dokazom
prihvatljivog uklapanja podataka u regresijski pravac. Za vrlo niske koncentracije prihvaća se
i kriterij k ≥ 0,98 [7].
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 10/24
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 11/24
9
2.3. Stabilnost analita i standardnih otopina
Tijekom validacijskih ispitivanja analitičar dobiva neke informacije o stabilnosti reagensa,
mobilnih faza, standarda i otopina uzorka. Za rutinska ispitivanja kada se dnevno pripravlja i
analizira puno uzoraka često je bitno da otopine budu dovoljno stabilne da omoguće odgodu
mjerenja, npr. kod kvara instrumenta ili analiza tijekom noći primjenom sustava za
samouzorkovanje. Uzorci i standardi trebaju se ispitati kroz najmanje 48 sati, a određivanje
sastavnica treba se obaviti usporedbom sa svježe pripravljenim standardima. Ako otopine nisu
stabilne kroz 48 sati treba stabilnost poboljšati pronalaženjem adekvatnih uvjeta čuvanja ili
aditivima [24]. Svrha standardizacije u svakoj metodi je činiti rezultate točnima i
obnovljivima s različitim reagensima u različito vrijeme i u različitim laboratorijima.
Standardna otopina je reagens poznate koncentracije te sadrži preciznu i točno poznatukoličinu pročišćenog homogenog analita, cijena je pristupačna, reagira vrlo brzo s analitom,
ima visoku čistoću, stabilna je na zraku, a ostale osobine ovise o prirodi ispitivanog analita .
Služi za izradu umjer ne krivulje kao i za izradu autentičnih kontrolnih uzoraka [1]. Standardni
analit je analit poznatog i potvrđenog sadržaja i čistoće koji se u analizi koristi kao referentni.
2.4. Učinak matice
Učinak matice uzorka, donosno interferencija ili smetnja [1]. Matica sadrži analit i
brojne druge sastojke koji na različite načine utječu na dobiveni rezultat, a interferencije se
razlikuju zavisno o promatranom uzorku.
Slika 4. Shematski prikaz odnosa matice, analita i uzorka.
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 12/24
10
2.5. Otpornost i osjetljivost metode
Analitička osjetljivost je svojstvo promjene odziva instrumenta koji odgovara
promjeni izmjerene veličine (npr. koncentracije analita) [12] tj. svojstvo metode ili
instrumenta da razlikuje uzorke različitih koncentracija analita uz definiranu razinu pouzdanosti [1]. Treba naglasiti da na osjetljivost možemo utjecati dodatkom pojačala
izlaznog signala instrumenta ili povećanjem optičkog puta pri spektrofotometrijskom
određivanju te osjetljivost je konstantna samo u jednom, određenom, koncentracijskom
području.
2.6. Granica kvantificiranja LQ6 i granica dokazivanja LD
Granica dokazivanja je najmanja količina analita koja se može kvalitativno dokazivati,
dok je granica kvantificiranja je najmanja količina analita koja se može, dovoljno pouzdano,
odrediti [1]. Procjena može biti vizualna ili statistička. Vizualna se procjena može primijeniti i
kod neinstrumentalnih i instrumentalnih metoda, uglavnom samo za granicu detekcije
( svojstvo instrumenta da razlikuje signal od šuma instrumenta ), a procjenjuje se najmanji
signal koji se nedvojben može prepoznati.
Omjer signal/šum može se primijeniti samo na
analitičke postupke s baznom linijom, a prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu dokazivanja i
10 :1 za granicu kvantifikacije. Statistički se granice dokazivanja i kvantifikacije
mogu odrediti na bazi standardnog odstupanja signala i nagiba prema jednadž bi 7.
LD = 3.3 s/a (7)
odnosno
LQ = 10 s/a (8)
pri čemu je a nagib, a s standardno odstupanje regresijskog pravca.
Rabimo li metodu koja zahtjeva zadanu preciznost na granici kvantifikacije, pripremi se više
uzoraka poznate koncentracije u području oko moguće granice kvantifikacije, svaki se izmjeri
5 do 6 puta i izračuna se relativna standardna odstupanja za svaku koncentraciju. Zatim se
grafički prikaže odnos RSO-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na granici
6Granica kvantificiranja ( engl. limit of quantification) i granica dokazivanja (engl. limit of detection); kratice LQ
i LD prema M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga, Zagreb (2003)
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 13/24
11
kvantifikacije s točno određenom preciznošću kako se vidi na 4. slici. U praksi se obično
pripremi uzorak tako određene koncentracije i potvrdi preciznost višekratnim mjerenjem [7].
Parametar granice kvantifikacije iznimno je važan kod metoda kojima se određuju analiti u
tragovima koji i u vrlo niskim koncentracijama mogu štetno djelovati na zdravlje ljudi i okoliš
[7].
Slika 4. Određivanje granice kvantifikacije(na slici označena kao GK) sa zadanom
preciznošću , ilustrira kako se preciznost mijenja u funkciji koncentracije analita. Tako
RSO (na slici RSD) vrijednosti značajno rastu uz pad koncentracije analita. Veća
varijabilnost se očekuje
kada se razina analita pribl ižava granici dokazivanja. Analitičar mora prosuditi kod
koje koncentracije nepreciznost postaje prevelika za primjenu metode.
(slika preuzeta iz K.Lazarić, Validacija analitičkih metoda , Laboratorij, stranica 63.)
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 14/24
12
2.7. Radno područje
R adno područje je raspon između gornje i donje koncentracije analita unutar kojega
analitička metoda ima prihvatljivu točnost, preciznosti i linearnosti ( preporučeno radno
područje je 80-120 % koncentracije ispitivanog uzorka ). Za određivanje tog parametra nije potrebno provoditi zasebne eksperimente, nego se zaključci izvode iz studije linearnosti.
2.8. Robusnost
Robusnost se određuje kao mjera otpornosti analitičkog postupka na male, namjerne
promjene radnih uvjeta metode [7], te ako promjena nekog radnog uvjeta ne utječe bitno na
rezultat kažemo da je on u području robusnosti metode. Važno je naznačiti da kada se mijenja
jedan parametar ili uvjet drugi uvjeti ili parametri moraju ostati nepromijenjeni. Robusnost se
mora ispitivati na standardnim metodama, tzv. „in-house“ metodama te metodama koje su
standardizirane no mi smo pr omijenili jedan od parametra zbog učinkovitosti našeg
istraživanja. Tipični parametri kod ispitivanja robusnosti metode su stabilnost mjernih
otopina, duljina trajanja ekstrakcije, ispitivanje utjecaja različitih filtera, provjera preciznosti i
linearnosti metode uz rad nekog drugog tehničara i uz korištenje drugih instrumenata i
kemikalija u laboratoriju. Kod instrumentalnih metoda tipični parametri su variranje pH
vrijednosti mobilne faze i variranje sastava mobilne faze (HPLC) te korištenje različitih
kolona, rad kod različitih temperatura i brzine protoka (HPLC i GC) i sl.
Nije potrebno za svaku uporabu analitičke metode ispitati sve izvedbene značajke, već
samo one koje su bitne. Odabir parametara validacije radi se prema vrsti i namjeni metode
( Tablica 1. ). Laboratorijima u praksi ipak najviše problema predstavlja postavljanje kriterija
prihvaćanja na radne značajke metode, a ne njihov odabir. Razumijevanje značenje pojedinih
parametara i načina na koji se izvode u laboratoriju, poznavanje značajka metode i
regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija prihvatljivosti za svaki parametar, što
je također neizostavni dio validacije. Postavljeni kriteriji uspoređuju se s dobivenim
rezultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje izvješća. Validaciju trebamo
provoditi kada se radi o prilikom uvođenja nove metode, nakon svake promjene ili većeg
servisa instrumenta, za nenormirane metode, za metode razvijene u vlastitom laboratoriju,
nakon zamjene reagensa, ako analitičar primjenjuje prvi puta metodu. Ne postoji određeno
pravilo o opsežnosti validacije, jer je normom propisano samo da se ona provodi u onom
opsegu koji je dovoljan da metoda udovoljava potrebama za zadanu uporabu. Opseg
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 15/24
13
validacije određuju tehničke mogućnosti, troškovi, rizici, starost metode i učestalost njezine
uporabe [1].
Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitičkih metoda različitih
namjena Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline – Validation Of Analytical Procedures: Text
And Methodology
3. Strategija validacije
Validacijske izvedbene značajke ili parametri definiraju se prije početka samoga procesa, te
moraju odgovoriti na sljedeća pitanja:
a)
Kakvi će se analiti detektirati?
b) Kakav je učinak matice uzorka, odnosno interferencija?
c) Koje su očekivane koncentracijske razine i rasponi?
d) Koje su granice detekcije i kvantifikacije?
e) Koja je očekivana preciznost i točnost?
f) Kolika je postojanost metoda? Može li se koristiti slična oprema različitih proizvođača
ili je nužan specifičan instrument?
g)
Koja znanja i vještine pretpostavljeni korisnici moraju imati? h)
Koje specifične regulatorne zahtjeve potrebno zadovoljiti? [15]
Identifikacijski
testovi
Analiza tragova Sadržaj
kvantitativna Limit test
točnost ne da ne da
preciznost ne da ne da
ponovljivost
selektivnost da da ne da
LD* ne ne da ne
LQ* ne ne da ne
linearnost ne da ne da
područje ne da ne da
*LD- granica detekcije, LQ-granica kvantificiranja
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 16/24
14
4. ISO[1]
Normizacija je rad na sastavljanju odredaba i norma za opću i višekratnu uporabu radi
postizanja optimalne uređenosti i sukladnosti u određenom području, a sastoji se od izradbe,
prihvaćanja i primjene norme. Prema kodeksu normizacijske prakse iz 1994.godine, koji je
donesen radi osiguravanja kvalitete donošenja i primjene normi te njihova međusobnog
usklađivanja, normizacijski proces na međunarodnoj razini dragovoljan je i koordiniran pod
pokroviteljstvom Međunarodne organizacije za normizaciju ( ISO), Međunarodnog
elektrotehničkog povjerenstva ( IEC ) i Međunarodne unije za telekomunikacije ( ITU ).
Norma je dokument koji sadržava pravila uputa ili obilježja procesa proizvoda ili proizvodnih
metoda. Norme se mogu karakterizirati prema razini, subjektu i as pektu. Razina određuje je li
norma međunarodna, višenacionalna, nacionalna ili se odnosi na neko industrijsko ili
gospodarsko područje. Područje ili subjekt mogu biti različiti ( kemija, informatika, hrana,
tekstil itd.).
Prema ISO ciljevi normizacije su:
- smanjenje raznolikosti proizvoda i postupaka
- bolja komunikacija
-
razvoj svekolikog gospodarstva
- zaštita potrošača i interes zajednice
- uklanjanje tržišnih barijera
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 17/24
15
5. Kvalitativne metode i njihova validacija
Istraživači rasvjetljavaju područje koje ih zanima na različite načine, provođenjem
različitih vrsta istraživanja. S obzirom na metodološki pristup, dakle korištene metode
istraživanja, istraživanja se dijele na kvantitativna, kvalitativna i istraživanja kombiniranom
metodologijom [2]. Kvantitativna kemijska analiza ima zadaću odrediti količinu spojeva ili
elemenata koji se nalaze u ispitivanom materijalu (analitu). Važnost kvantitativne analize je
vrlo velika jer su na njenim rezultatima pronađeni osnovni kemijski zakoni. Rezultati tipične
kvantitativne analize proizlaze iz dva različita mjerenja. Jedno je mjerenje mase ili volumena
uzorka za analizu, a drugo je mjerenje nekog svojstva razmjerno količini analita u tom
uzorku.[13] Kvantitativne metode možemo svrstati na gravimetrijske metode ( određuje se
masa analita ili nekog spoja koji je u poznatom kemijskom odnosu s analitom ), volumetrijskemetode ( mjeri se volumen otopine reagensa potrebnoga za potpunu reakciju s analitom ),
elektroanalitičkim metodama ( mjere se električna svojstva ), spektroskopske metode ( mjere
interakciju između elektomagnetskog zračenja i atoma ili molekula analita, ili mjere zračenja
koje analit emitira) te metode koje se temelje na mjerenju svojstava kao što je odnos mase
prema naboju, brzina radioaktivnog raspada, toplina reakcije, termička vodljivost, optička
aktivnost i indeks loma.
Tijekom prošlog desetljeća uporaba kvalitativnih metoda se povećala, no njihova primjena je još uvijek manja nego kvantitativne metode te se terminologija unutar kvalitativnih metoda
još usavršava. Uglavnom se koriste kao rutinske laboratorijske metode [23]. Kvalitativnom
kemijskom analizom određuje se kemijski sastav tvari, tj. utvrđuje se od kojih je kemijskih
elemenata ili kemijskih spojeva sastavljena ispitivana tvar. Osim sastava, kvalitativnom se
analizom ispituju osobine raznih kemijskih elemenata i spojeva, primjenjuju kemijski zakoni i
prati tok kemijskih reakcija. U kvalitativnoj kemijskoj analizi primjenjuju se različite tehnike
rada: makrotehnika i semimikrotehnika. Najčešće se koristi semimikrotehnika zbog male potrošnje kemikalija i brzine postupka. Iako nema opće prihvaćene podjele kvalitativnih
metoda jedna od češće korištenih je ona koja se temelji na otkrivanju analita u određenom
uzorku koje može biti vizualno ili instrumentalno [3]. Vizualne metode se temelje na
opažanju osjetilom vida, okom promatrane reakcije između analita u uzorku i specifičnih
reagensa. Ono što vidimo nakon reakcije je promjena boje otopine ( npr. titracijske metode ) ,
boje testne trake ( npr. pH traka ), zamućenost otopine itd. [3]. Točnost određivanja, ove
metode, ovisi o iskustvu analitičara koji ju izvodi te je isto tako upitna njena primjenjivostkod složenijih sustava. Za razliku od vizualnih metoda kod instrumentalnih metoda postoje
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 18/24
16
značajne razlike kada se one primjenjuju u kvalitativnim, a kada u kvantitativ nim analizama.
Ova metoda se temelji na razlici u koncentracijama promatranog i kontrolnog uzorka, ako je
koncentracija promatranog uzorka veća od koncentracije kontrolnog uzorka možemo
zaključiti da je koncentracija analita veća od one u kontrolnom uzorku i obrnuto. Ta razlika
odnosno odziv uređaja prevodi se u binarni signal DA /NE ( prisutan/odsutan ili znad/ispod )
[3].
Razlikuju se četiri tipa kontrolnog uzorka :
a) negativni kontrolni uzorak u kojem nema traženog analita
b) pozitivni kontrolni uzorak koji sadrži točno određenu količinu analita
c) granični kontrolni uzorak onaj koji sadrži količinu analita koja odgovara graničnoj
vrijednosti
d ) „intermediate“ kontrolni uzorak je onaj koji sadrži analit, no ne u nekim značajnimvrijednostima.[23]
U okvirima kvalitativne analize osjetljivost i specifičnost predstavljaju sposobnost
testa za razlikovanje stvarno pozitivnih (osjetljivost) od stvarno negativnih (specifičnost)
uzoraka, poznatiji kao „ screening test “, te ih možemo iskazati prema jednadžbama 9 i 10 .
Broj lažno (+) pozitivnih i lažno (-) negativnih rezultata možemo procijeniti modificiranjem
COV, tj. smanjiti broj lažno (-) negativnih rezultata smanjenjem COV, odnosno smanjiti broj
lažno (+) pozitivnih povećanjem COV. COV ( engl. cut off value ) definiramo kao područje
granične vrijednosti u uzorcima poznatih koncentracija [22]. Lažno pozitivan rezultat znači da
je određena metoda prikazala da u testnom uzorku ima promatranog analita iako ga zapravo
nema. Visoka osjetljivost i specifičnost nekog testa osigurava izbjegavanje lažnog rezultata te
dobivenim parametrima možemo definirati pouzdanost metode. U slučaju utjecaja reagensa i
matice uzorka govorimo o slaboj selektivnosti samog testa: što je viša selektivnost to je veća
vjerojatnost identificiranja analita u uzorku [19]. F. Feigl 7 je definirao pojmove "selektivan" i
"specifičan" s gledišta kvalitativne kemijske analize. Pod pojmom specifičnosti (reakcije ili
reagensa) on shvaća indikativnost za samo jednu supstanciju, a pod pojmom selektivnosti
indikativnost za mali broj supstancija. Prema tome reakcije ili reagensi mogu biti više ili
manje selektivni dok reagens ili reakcija jest ili nije specifična. Specifičnost je najviši stupanj
7 Fritz Feigl (1891.-1971) ,kemičar, rođen u Austriji, nakon rada u Brazilu dobio njihovo državljanstvo, tvorac
tzv. „spot analysis“, dugo proučavao i kvalitativnu analizu
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 19/24
17
selektivnosti. Kako specifičnih reagensa ima daleko premalo zbog toga se odabiru oni sa što
većim stupnjem selektivnosti [20].
Osjetljivost možemo izračunati prema jednadžbi 10[3], a specifičnost prema jednadžbi 11[3]:
osjetljivost ( engl. sensitivity rate) =sp ()
sp ()+ ln() (10)
sp- stvarno pozitivan ( engl. true positive -tp)
ln- lažno negativan ( engl. false negative-fn )
specifičnost ( engl. specificity rate ) = sn ()sn(t)+ lp() (11)
sn- stvarno negativan ( engl. true negative -tn)
lp- lažno pozitivan ( engl. false positive-fp )
Tablica 2. Relacija između lažno pozit ivnih i negativnih te stvarno pozitivnih i negativnih
odziva( preuzeto iz S.L.R. Ellison, T. Fearn, Charasteristing the performance od qualitative
analytical methods: statistic and terminology, Terends in Analytical Chemistry, 24 (6) (2005)
469).
Kod kvalitativnih ispitivanja postoji granica ispod koje specifičnost postaje upitna. Da bi se
procijenio LD kod kvalitativnih mjerenja slijepi uzorci se obogaćuju analitom pri nekoliko
koncentracija i pri svakoj provodi 10 neovisnih mjerenja. Ponovljena mjerenja na raznim
razinama su randomizirana. Tada se konstruira krivulja % pozitivnih (% negativnih) rezultata
Promatrani sustav
Stvarni rezultat negativno pozitivno
negativno SN LP
pozitivno LN SP
ukupno nN,promatrano nP,promatrano
SP-broj stvarno pozitivnih, LN- broj lažno negativnih, LP-
lažno pozitivan, SN-stvarno negativan
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 20/24
18
u odnosu na koncentraciju pa se procjen juje granična koncentracija kod koje ispitivanje
postaje nesigurno [25].
Procjena LD vrijednosti ovisi da li se radi o instrumentalnoj ili ne-instrumentalnoj metodi. Za
instrumentalne postupke koriste se različite tehnike; npr., određuje se odnos signal/šumusporedbom rezultata ispitivanja uzoraka poznate koncentracije analita s rezultatima za slijepe
uzorke te se ustanovljava minimalna razina kod koje se analit pouzdano dade detektirati.
Prihvaća se odnos signal/šum bazne linije od 2:1 ili 3:1
Kod vizualnih neinstrumentalnih metoda LQ se obično određuje analizom uzoraka poznate
koncentracije i ustanovljavanjem minimalne razine pri kojoj analit može biti određen s
prihvatljivom istinitošću i preciznošću [22].
Najveći značaj za odabiranje neke analitičke reakcije imaju granične vrijednosti utvrđivanja
tj. mogućnost sigurnog dokazivanja što manje količine (mase) analita pomoću odabranog
analitičkog postupka. Granična vrijednost analita jest najmanja količina (apsolutna vrijednost)
ili najmanja koncentracija (relativna vrijednost) analita koja se još može signifikantno
razlikovati od slijepe vrijednosti koju daje mjerenje slijepog uzorka u kojem analit nije
prisutan; dakle to je onaj najmanji udio analita koji još izaziva specifični signal. Granična
vrijednost može se izraziti u kvalitativnom smislu kao granica identifikacije.
Robusnost je osnovno analitičko svojstvo kojim je opisana postojanost binarnog rezultata u
odnosu na neznatne promjene eksperimentalnih uv jeta (promjena količine uzorka, pH,
vremena izvođenja, temperature, postotka otapala i slično) [19].
Kvalitativni validacijski parametri se moraju pažljivo prepoznati i odabrati prema zahtjevima
metode [19]. Oni su uključeni u pojedinosti koje su povezane s informacijama koje želimo
dobiti, a ponajprije određujemo s obzirom na metodu i istraživani uzorak.
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 21/24
19
Tablica 3. Neki od najčešće korištenih parametara za kvalitativnu i kvantitativnu metodu
(preuzeto iz E. Trullols Soler , Validation of Analytical Methods , doctoral tehnsis (2006) 130)
Kvantitativne metode Kvalitativne metode
~parametri~
točnost: istinitost i preciznost lažno pozitivni i negativni rezultati
mjerna nesigurnost osjetljivost i specifičnost
osjetljivost i specifičnost selektivnost: interferencija
selektivnost: interferencija LD
raspon i linearnost granična vrijednost
robusnost robusnost
LD nepouzdanost
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 22/24
20
Zaključak
Validacijom analitičke metode dobit će se obavijesti o njezinoj točnosti i preciznosti, o
odnosu između koncentracije uzorka i odziva metode, o mogućim interferencijama iz matice
uzorka, o najmanjim koncentracijama koje će se moći utvrditi ili kvantificirati tom metodom i
doznat će se njezine najslabije, ali i najjače strane [7]. Kao kod svake metode moramo biti
pažljivi pri odabiru validacijskih parametara pa tako i kod kvalitativnih metoda. Kada je riječ
o kvalitativnoj analizi ili identifikaciji analita, nužna je potvrda indetiteta, tj. sigurnost da
odziv instrumenta potječe od analita, a ne od neke kemijske ili fizikalno slične tvari [1]. Zbog
toga treba odrediti specifičnost i selektivnost odabrane metode te i granicu dokazivanja do
koje je neka metoda pouzdana, na kraju odrediti i robusnost metode jer je njime opisana
postojanost binarnog rezultata svojstvenog za kvalitativnu metodu.
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 23/24
21
Literatura
[1] M. Kaštelan- Macan, Kemijska analiza u sustavu kvalitete, Školska knjiga, Zagreb 2003. [2] A. Tkalac Verčič, D. Sinčić Ćorić, N. Pološki Vokić, Priručnik za metodologijuistraživačkog rada, M.E.P. d.o.o., Zagreb ( 2010) 12
[3] E. Trullols, I. Ruisachez, F. Xavier Rius, Validation of qualitative analytical methods,
Trends in analytical chemistry, 23 (2) ( 2004)
[4] V. Gašljević,Validacija i mjerna nesigurnost, Biochemia Medica 20(1) (2010) 57-63
[5]
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Ste p4/Q2_R1__Guideline.pdf ( 27.12.2014.)
[6] http://www.svijet-kvalitete.com/index.php/ispitivanje/2387-validacija-analitickih-metoda-
prakticni-aspekt (27.12.2014.)
[7] K. Lazarić, Validacija analitičkih metoda, Laboratorij, 61-64
[8] N. Mikulec, D. Samaržija, N. Antunac, Š. Zamberlin, Z. Kuliš, I. Horvat, Parametri
validacije instrumentalne metode za utvrđivanje ukupnog broja bakterija u mlijeku Mljekarstvo 54 (4) (2004) 299-314
[9] T. Slanovec, Utjecaj pipeta na točnost rezultata u analitičkoj praksi, Mljekarstvo, 22(1)
(1972) 20-22
[10] E. Generalić, S. Krka, Analitička kemija-vježbe, Split (2011) 12
[11] Z. Dragun, B. Raspor, Validacija određivanja metala atomskom apsorpcijskomspektrometrijom, 9. stručni sastanak laboratorija ovlaštenih za ispitivanje voda, 196810(2005)
[12] Eurachem, The fitness for purpose of analytical methods a laboratory guide to methodvalidation and related topics, second edition (2004) 7-44
[13] D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitičke kemije, Školska knjiga, Zagreb(1999) 2
[14] M. Kaštelan-Macan, Hrvatsko nazivlje u analitičkoj kemiji, 57 (4) (2008) 175-188
[15] L. Huber, Validation of analytical methods, Agilent Technologies, Njemačka (2010)31-32
[16] H. F. de Brabander, P. Batjoens, K. de Wasch, D. Courtheyn, G. Pottie, F. Smets,Qualitative or quantitative for residue analysis, Trend sin Anal. Chem., 16 (1997) 485
7/21/2019 Validacija Kvalitativnih Metoda
http://slidepdf.com/reader/full/validacija-kvalitativnih-metoda 24/24
[17] D. L. Massart, B. G. M. Vandeginste, L. M. C. Buydens, S. de Jong, P. J. Lewi, J.
Smeyers-Verbeke, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Elsevier science B. V.
(1997)
[18] M. Sak- Bosnar, Uvod i podjela analitičke kemije, prezentacija, Odjel za kemiju, Osijek
[19] K. Samošćanec, Validacija kvalitativnih kromatografskih metoda, Biochemia Medica
19(l1) (2009) 85-86
[20] S. Luterotti, Uvod u kemijsku analizu, sedmo izdanje, Farmaceutsko-biokemijski
fakultet sveučilišta u Zagrebu (2014)
[21] E. Trullols, I. Ruisachez, F. Xavier Rius , J. Huguel, Validation of qualitative methods of
analysis that use control samples, Trend sin Anal. Chem., 24 (2005) 516
[22] S. Luterotti, D. Bicanic, Odabrane teme iz bioanalitike, četvrto izdanje, Zagreb, (2013)1-18
[23] J. M. Green, A practical guide to analytical method validation, Anal. Chem. News Feat.
(1996) 305-309
[24] S.L.R. Ellison, T. Fearn, Charasteristing the performance od qualitative analytical
methods: statistic and terminology, Terends in Analytical Chemistry, 24 (6) (2005) 468-476
[25] J. M. Green, A practical guide to analytical method validation, Anal. Chem. News Feat.
(1996) 305-309