VALİDASYON DERS2017 [Uyumluluk Modu]
Transcript of VALİDASYON DERS2017 [Uyumluluk Modu]
26.12.2017
1
VALİDASYON
Prof. Dr. A. Olcay Sağırlı
Yöntemin Geçerliliği (Validasyon)
Geçerlilik, (Validasyon) cihazın, metodun veya ölçüm prosedürünün
belirlenen amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilerek yazılı
delillerle kanıtlanmasıdır.
ALETLİ ANALİZLERDE YAPILMASI GEREKLİ VALİDASYON TÜRLERİ
1. Cihazın kontrolü ve validasyonu, (tüm donanım ve yazılımlar için
geçerlidir)
2. Geliştirilen yöntemin geçerliliğini kanıtlamak için veya geliştirilmiş olan bir yöntemdeki parametre değişikliklerinden sonra yapılan validasyon
3. Sistem Uygunluk Testleri (SUT).
26.12.2017
2
Cihaz validasyonu cihaz sağlayıcı tarafından yapılmak zorundadır.
•İyi laboratuar uygulamaları (GLP),
•İyi imalat teknikleri (GMP) ve/veya
•ISO 9000
vb. standartlara göre valide edilmiş bir ortamda geliştirmek ve
üretmekle sorumludurlar.
Analitik Metot validasyonu, bir metodun performansını belirlemek
için yapılan bir takım değişkenlere göre test ve ölçme işlemleridir.
Çeşitli alanlarda verilen pek çok karar, yapılan ölçümlerin sonucuna
dayanılarak verilir. Doğru karar verebilmek için analitik ölçüm
sonucunun doğru ve tekrarlanabilir olması gerekir.
26.12.2017
3
Metot validasyonu hangi hallerde yapılır:
Standart bir metot bir laboratuvarda ilk defa uygulanacağı zaman
Bir analiz için yeni metot geliştirildiği zaman
Kullanılan metotta değişiklik yapıldığında
Geçerliliği belirlenmiş bir metot başka bir laboratuvarda kullanılacağı
zaman veya farklı bir kişi veya farklı bir cihazla kullanılacağı zaman
Metodun performansında zamanla bir değişme olduğu
anlaşıldığında metot geçerliliği (validasyonu) yapılır.
Uluslar arası kabul edilen çeşitli geçerlilik (validasyon) kriterleri
mevcuttur. ISO/IEC, ICH, US EPA, US FDA, USP, cGMP gibi
kurumlar tarafından belirlenmiş kriterler kullanılmaktadır.
USP ve ICH validasyon parametreleri
USP Bölüm 1225>,
ICH Q2A, Validasyon ve Analitik yöntemlerle ilgili belge (Mart 1995) ve
Q2B Analitik yöntemlerde validasyon (Mayıs 1997)
EMEA, The European Agency for the Evaluotion of Medicinal Products, 1998
USP ye göre; Seçicilik, Doğrusallık ve aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme
sınırı, Tayin alt sınırı, Sağlamlık ve Kararlılık
ICH e göre; Seçicilik, Doğrusallık, Aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme
sınırı, Tayin alt sınırı, Stabilite
26.12.2017
4
Yöntemin Kalibrasyonu:
Gravimetri ve kulometri hariç bütün Analitik yöntemler için kalibrasyon
gerekir. Yöntemin kalibrasyonu ölçülen analitik sinyal ile analit derişimi
arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. En çok kullanılan üç yöntem
a) Kalibrasyon grafiği yöntemi
b) Standart ekleme yöntemi
c) İç standart ekleme yöntemi
Geçerlilik (Validasyon) Parametreleri:
Performans karakteristikleri için öncelikle aşağıdaki temel geçerlilik
(validasyon) parametrelerinin belirlenmesi gerekir. Uygulanamayan
parametreler varsa “uygulanamaz” ifadesi kullanılır. Yönteme spesifik farklı
parametrelerin de değerlendirilmesi gerekiyorsa onlar da eklenir.
Doğruluk (Accuracy)
Kesinlik (Precision)
Özgünlük (Specifity)
Doğrusallık (Linearity)
Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection)
Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification)
Çalışma Aralığı (Range)
Tutarlılık (Ruggedness)
Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness)
Stabilite
26.12.2017
5
Özgünlük (Specifity)
veya Seçicilik
(Selectivity) Doğrusallk
(Linearity)
Çalışma Aralığı
(Range)
Doğruluk (Accuracy)
ve Geri kazanım
(Recovery)
Kesinlik (Precision) ya da
Tekrarlanabilirlik(Repeatibility) ve
Uyarlık (Reproducibility)Gözlenebilme
sınırı (LOD; Limit of
Detection)
Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification
)
Tutarlılık (Ruggednes)
Sağlamlık ya da Kararlılık
(Robustness)
Stabilite
Validasyon Parametreleri:
Özgünlük (Specificity):
Beklenen fiziksel/kimyasal girişimler/engelleyiciler (interferences)
varlığında analitik yöntemin sadece amaçlanan bileşen veya bileşenleri
doğru şekilde ölçülebilme yeteneğidir.
Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler standart üzerine
eklenerek girişime neden olup olmadığı kontrol edilir. Referans madde
geçerliliği belirlenen metotla analiz edilerek bulunan sonuçlar sertifika
değeri ile karşılaştırılır.
Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler elimizde yoksa
Diyod Sıralı Dedektör veya Kütle Dedektörü gibi özel donanımlarla
girişimler incelenebilir.
26.12.2017
6
Kromatografik Analizlerde Özgünlüğün Saptanması:
1) Tayini yapılan bileşik ile girişim yapması olasılığı bulunan maddelerin
“Ayırım gücü” (Rs) değerlerine bakılır. Bu değer (Rs)≥2.0 olmalıdır.
2) Spesifik bir dedektör seçilebilir. İncelenecek bileşiğe cevap verme
yeteneğine sahip olan dedektörler Elektrokimyasal veya Radyoaktivite
dedektörleridir. Bu dedektörler belirli maddelere karşı duyarlıdır.
3) LC-MS gibi duyarlı ve hassas tekniklerle, DAD dedektörü ile değişik
dalga boyunda deney anında taramalar yaparak herhangi ilave bir pik olup
olmadığı kontrol edilir.
Doğruluk (Accuracy) :
Ölçülen değerin doğru ya da doğru kabul edilen değere yakınlığını gösterir.
Mutlak hata ya da bağıl hata ile verilir. Uluslar arası bağımsız
laboratuvarlar tarafından tayin edilmiş değerleri doğru değer olarak kabul
edilen Standart Referans Maddelerin tayininden elde dilen sonuç ile aynı
maddenin kullanılan yöntemle elde edilen sonuçları karşılaştırılır.
Bir yöntem için doğruluk, geri kazanım çalışmaları ile belirlenir:
a) Referans standart bir yöntemle karşılaştırmak,
b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek,
c) Analizi yapılan maddeye bulunduğu ortamda standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesidir.
% Gerikazanım = (Cu / Cs) x 100
Cu= Çalışma sonucunda bulunan konsantrasyon
Cs= Bilinen ya da standart çalışma sonucunda elde edilen konsantrasyon
26.12.2017
7
a) Referans Standart İle Karşılaştırmak:
Üç farklı konsantrayonda hazırlanan çözeltilerden üçer ölçüm alınır,
hesaplanan konsantrasyon değerlerinden % geri kazanım değerleri bulunur,
sonra bu değerlerin ortalamaları alınır.
Sonuçlar referans olarak seçilen başka bir yöntemden elde edilen
sonuçlarla istatistiksel olarak karşılaştırılır (Student t, Fisher testleri gibi).
Ortalamalar yönünden Student t testi
Varyans yönünden Fisher testi
b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek:
Farmasötik dozaj formları gibi matriks etkisi olan numunelerle
çalışıldığı zaman kullanılan bir yöntemdir.
Analizi yapılacak madde boş matrikse değişik derişimlerde eklenir.
Bu matriks ilaç dozaj formları için (etken maddesiz) yardımcı maddelerden
oluşan karışımdır (Plasebo).
Genellikle ilaç etken maddesinin % 50, 75, 100, 125 ve 150
oranında madde ilavesi yapılır ve her seviyede en az üçer ölçüm yapılır.
Sonuçlar % geri kazanım olarak ifade edilir.
26.12.2017
8
c) Standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesi:
Analizi yapılacak maddenin bilinen ve değişik miktarları matriks
içerisinde yer alan ve miktarı aynı maddenin üzerine ilave edilir. Orijinal
numunedeki etken madde derişimi deney verilerinden matematiksel olarak
hesaplanır.
Genellikle % 25, 50, 100 ilave etmek iyi bir yaklaşımdır. Madde
ilave edilmiş ve ilave edilmemiş bütün numuneler en az üçer defa analiz
edilir.
Sonuçlar ilave edilen ve ölçülen madde miktarları verilerek ifade
edilir. Bu yöntem, matriksin numune sinyaline girişim yaptığı durumlarda,
katkı maddelerinin ve yardımcı maddelerin bilinmediği durumlarda tercih
edilir.
26.12.2017
9
Kesinlik
Ölçüm sonuçlarının birbirlerine yakınlığını (tekrarlanabilirliği) gösterir.
Standart sapma, Bağıl standart sapma, Varyans veya varyasyon katsayısı
ile verilir.
Kesinlik 3 gruba ayrılarak incelenmektedir
a) Tekrarlanabilirlik (Gün içi tekrarlanabilirlik),
b) Orta-Kesinlik (Günler arası tekrarlanabilirlik)
c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility)
26.12.2017
10
a) Tekrarlanabilirlik:
Aynı gün, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel tayin
2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır.
*Enjeksiyonun tekrarlanabilirliği,
Analizi yapılacak maddenin çalışma ortamındaki çözeltisi hazırlanır ve bu
çözeltiden en az 10 enjeksiyon yapılır. Sonuçta, kesinlik elde edilen
değerlerin % RSD’si verilerek ifade edilir ve % RSD ≤ 1.0 olmalıdır.
b) Orta-Kesinlik:
Farklı günlerde, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel
tayin 2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır.
c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility):
Çok ortaklı çalışmalarda laboratuarlar arası kesinliğin tayini için istenen bir
parametredir.
26.12.2017
11
26.12.2017
12
Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection):
Analizi yapılan örneğin belirdiği fakat kantitatif sınırlar içerisine girmeyen en düşük derişimdir.
Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir. Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek hesaplamada HPLC’de Sinyal/Gürültü oranı 3 olarak kullanılır.
Hesaplama yolu ile Teşhis Sınırı saptanmasında;
LOD= 3.3 x SD/ m eşitliği kullanılır.
SD= Boş çözeltinin; çok az derişimdeki madde çözeltisinin veya kesişimdeğerinin standart sapması,
m= Kullanılan kalibrasyon eşitliğinin eğim değeridir.
Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification):
Analizi yapılan örneğin kabul edilebilir düzeyde kesin ve doğru olarak miktarının tayin edilebileceği doğrusallık sınırları içerisine girmeyen veya doğrusallığın en alt derişimini oluşturan düzeyidir. Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir.
Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek LOQ tespiti için Sinyal/Gürültüoranı 10 olarak alınır.
Hesaplama yolu ile TAS saptanmasında
LOQ= 10 x SD/ m eşitliği kullanılır.
SD ve m değerleri LOD eşitliği ile aynıdır.
26.12.2017
13
Doğrusallık (Linearity):
Analit derişime karşı dedektör cevabın doğru orantılı olarak artması ve çizilen grafikte noktaların doğru üzerinde veya yakın olarak yer almasıdır.
Eğim, kesişim ve korrelasyon katsayısı (R2) doğrusallığı veren parametrelerdir. R2 = 0.999 ve üzerinde olmalı ve değerler çizilen doğrunun üzerinde yer almalıdır.
y = 0,4678x + 0,0022
R2 = 0,9999
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Derişim
Sin
yal
26.12.2017
14
Çalışma Aralığı (Range):
Kalibrasyon eğrisinde tayin edilebilen en düşük derişimden, doğrusallıktansapma gösterdiği derişime kadar olan derişim aralığını kapsar.
Hedef miktarın % 50, 75, 100, 125 ve 150 olacak şekilde aralıkdüzenlenebilir.
LOD: Limit of Detection; Gözlenebilmesınırı
LOQ: Limit of Quantification; Tayin altsınırı
LOL: Limit of Linearity; Doğrusallık Limiti
Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness):
Yöntemin, parametrelerdeki ufak değişimlerden etkilenmeden kalabilmekapasitesidir.
Bu parametreler organik çözücü yüzdesi, pH, iyonik güç, sıcaklık gibietkenlerdir.
Kararlılık yöntem geliştirilirken değerlendirilmesi gereken bir aşamadır.
Örneğin pH 3 de ± 0.1 kadar bir değişim gösteren bir madde pH 4.5 dadeğişmeden aynı sonucu veriyorsa pH 4.5 ortam olarak seçilmelidir.
26.12.2017
15
Tutarlılık (Ruggedness):
Yöntemin gerçek kullanım koşulları altında tekrar edilebilirliğininsaptanmasıdır. Bunun için çalışmanın:
a) Aynı laboratuvarda farklı analizciler tarafından,
b) Aynı laboratuvarda farklı cihazlar tarafından,
c) Farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi,
d) Reaktif ve çözücülerin markalarının değiştirilmesi,
e) Aynı marka ve modele sahip yeni bir kolon kullanaraktekrarlanması gereklidir.
Tutarlılık; Orta kesinlikle de benzeşmektedir. % RSD ile ifade edilir. ICH(Uluslar arası uyum konferansı) bunu yapılması kesin olarak zorunluişlemler grubuna dahil etmemiştir.
26.12.2017
16
Stabilite:
Zorunlu bir validasyon parametresi olmamakla beraber yapılması tavsiye
edilir.
Tekrar edilebilir ve güvenilir sonuçlar elde edebilmek için numunelerin,
standart maddelerin ve kullanılan çözücülerin uygun bir süre (örneğin 1
gün, 1 hafta, 1 ay veya ne kadar süreye ihtiyaç duyuluyorsa o kadar süre)
stabilitesini koruması gereklidir.