Uvod Do Prietokovej Cytometriex
-
Upload
lubos-comor -
Category
Documents
-
view
11 -
download
2
description
Transcript of Uvod Do Prietokovej Cytometriex
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE
I. Pre astnkov pecializanho tdia v pecializanom odbore: Laboratrne a diagnostick metdy v klinickej imunolgii a alergolgii
II. Pre astnkov pecializanho tdia v pecializanom odbore: Klinick imunolgia a alergolgia pred pecializanou skkou
RNDr. Mira Horvthov, PhD.stav klinickej imunolgie, alergolgie a orgnovch transplantci
Lekrska fakultaSlovensk zdravotncka univerzita v Bratislave
Bratislava 2012
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Prietokov cytometria (flow cytometry, FC) je metda umoujca tdium jednotlivch buniek, prpadne inch astc v suspenzii, prostrednctvom analzy ich fyziklnych a/alebo chemickch vlastnost.
Prietokov cytometria je bioanalytick metda spjajca v sebe princpy fluorescennej mikroskopie a hematologickho analyztora.
Vyuva fluorescenne znaen monoklonov protiltky k detekcii komplementrnych antignov na povrchu aj vo vntrianalyzovanch buniek.
Vzhadom k vysokej senzitivite, rchlosti, irokej palete analytickch monost a relatvne nzkej cene za vyetrenie sa stala zlatm tandardom vo viacerch odboroch biomedicnskych analz.
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Historicky prv prietokov cytometer bol popsan v roku 1947 (Guckera spol.). Tento prstroj umooval potanie astc v aerosle.
Dleitou etapou vo vvoji FC bolo intenzvne tdium vyuitia fluorescennch farbv v ndorovej cytolgii v 50. rokoch 20. storoia. Fluorescenn farbiv boli pouvan najprv vo fluorescennej mikroskopii, neskr sa zaali uplatova aj v prietokovej cytometrii.
V mnohch oblastiach stanovenia presnej diagnzy bol fluorescenn mikroskop nahraden prietokovm cytometrom
http://www.nirrh.res.in/support/equip/flow_cytometer.htmhttp://www.cupath.com/
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
P
R
I
E
T
O
K
O
V
C
Y
T
OM
E
T
R
E
-
Schma systmu prietokovho cytometra
http://flow.csc.mrc.ac.uk/
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Hlavn komponenty prietokovho cytometra
Systm fluidiky - transportuje analyzovan astice do prietokovej (meracej) komory
Optick systm zahruje excitan zdroje (lasery) a zbern optickdrhy (oovky, zrkadl a optick filtre), ktor zachycujfluorescenn a rozptlen iarenie a privdzaj ho na opticky aktvnu vrstvu optoelektronickch detektorov (fotonsobiov a fotodid)
Elektronika digitalizcia snmanho optickho signlu na signly elektronick, ktor graficky reprezentuj jednotliv bunky na monitore riadiaceho potaa
Interpretcia spracovanie dt uvateskm softvrom a tatistickanalza
-
1. Zdroj svetelnho la (laser) emituje svetlo uritch vlnovch dok.
2. Laminrny prd nosnej kvapaliny una bunkovsuspenziu prstrojom a bunky jedna za druhou postupuj prietokovou komrkou, v ktorej pretnaj sveteln l, exponovan zvzkom laserovch lov.
3. Detektor (fotonsobi) zachycuje optick signly emitovan pri prechode buniek laserovm lom.
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/
sveteln l
detektor
nosn kvapalina
-
Hydrodynamick fokuscia
analyzovan astice prechdzajprietokovou komrkou jedna za druhou v zkom stredovom zvzku
http://flow.csc.mrc.ac.uk/
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
-
predn sveteln rozptyl (FCS, forward scatter) je mierou vekosti buniekhttp://flow.csc.mrc.ac.uk/
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
bon sveteln rozptyl(SSC, side scatter) je mierou granularity buniek
-
Imunofenotypizcia a monoklonov protiltky
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Imunofenotypizcia je analza heterognnej bunkovej populcie s cieom charakterizova prtomnos a zastpenie rznych populcibuniek.
Prv pokusy charakterizova T- a B-lymfocyty pecifickmi antisraminamierenmi proti povrchovm znakom a pomocou tvorby roziet s ovmi erytrocytmi prebehli v 60. a 70. rokoch minulho storoia.
Prevratn objav nositeov Nobelovej ceny Khlera a Milsteina z roku 1975 znamenal zsadn obrat v experimentlnom pouit pecifickch imunoglobulnov, tzv. monoklonovch protiltok.
-
Fluorescencia
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Fluorescencia je kvantovo mechanick jav, ktor spova v uvonenasti excitanej energie elektrnu vo forme fotnu.
Elektrny fluorochrmu s v prpade prietokovej cytometrie excitovanlaserovm iarenm pecifickej vlnovej dky, ktor zodpovedabsorpnmu maximu pouitho fluorochrmu. Tm djde k prechodu elektrnu na vyiu energetick hladinu.
as excitanej energie je spotrebovan na zmeny rotane vibranho stavu molekuly, a vina tejto energie je pri nvrate elektrnu na pvodn energetick hladinu vyiaren do okolia vo forme fotnov s niou energiou, teda vou vlnovou dkou, ne maj fotny excitujce. Rozdiel medzi vlnovou dkou excitujceho a emitovanho iarenia nazvame Stokesov posun.
-
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
Tabuka niektorch fluorochrmov pouvanch v prietokovej cytometrii
FITC; pH sensitive389519495Fluorescein
587520494FluorX
PerCP-Cy5.5 conjugate695490,675TruRed
Peridinin chlorphyll protein675490PerCP
PE-Texas Red613480;565Red 613
767480;565;743PE-Cy7 conjugates
aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red670480;565;650PE-Cy5 conjugates
240 k578480;565R-Phycoerythrin (PE)
NBD-X294539466NBD
528425Lucifer yellow
551403Pacific Orange
Maleimide406455403Pacific Blue
Hydrazide596423(375);401Cascade Blue
PharRed767650; 755APC-Cy7 conjugates
104k660650Allophycocyanin (APC)
Sulfonyl chloride625615589Texas Red
Reactive and conjugated probes
NotesMWEm (nm)Ex (nm)Probe
http://flowcyt.salk.edu/fluo.html
-
Druhy histogramov
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
jednoparametrov
dvojparametrov - bodov diagram (Dot Plot)
denzitn (Density Plot)
kontrov
-
Niektor aplikcie prietokovej cytometrie
objem a morfolgia buniek
povrchov markery buniek
intracelulrne antigny
analza DNA
apoptza a ivotnos buniek
sortovanie buniek
ADCC (Antibody Dependent Cytotoxicity Assay)
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
-
http://www.abcam.com/
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
krv v protizranlivom roztoku (napr. EDTA) inkubcia krvi s monoklonovou protiltkou znaenou
fluorochrmom
Metodika imunofenotypizcie leukocytov v udskej perifrnej krvi
lza ervench krviniek lyzanm roztokom
zastavenie reakcie fosftovm roztokom
meranie a analza vzorky prietokovm cytometrom
-
Zkladn panel na imunofenotypizciu lymfocytov
leukocyty: CD45+ (Leukocyte Common Antigen)
monocyty/makorofgy: CD14+
T-lymfocyty: CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+
B-lymfocyty: CD19+
NK bunky: CD3-CD(56+16)+
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
-
Imunofenotypizcia subpopulci T-lymfocytov
http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
-
Dvojparametrov dot plot histogramy pri analze CD4 a CD8 T-lymfocytov
VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________
http://www.bio.umass.edu/micro/immunology/lymfocyty monocyty granulocyty