UV Vis Lehrbuch Deutsch
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Grundlagen der modernen UV-VisSpektroskopieEin Leitfaden
Tony Owen
Copyright Agilent Technologies 2000 Alle Rechte vorbehalten. Reproduktion, Adaption oder bersetzung ohne ausdrckliche schriftliche Genehmigung nicht gestattet. nderungen vorbehalten. Gedruckt in Deutschland 06/00 Publikationsnummer 5980-1397DE
Vorwort
Vorwort
1988 erschien bei Hewlett-Packard die Broschre Diodenarray-Technologie in der UV/Vis-Spektroskopie. Damals war das allgemeine Verstndnis fr die Eigenschaften und Vorteile der Diodenarray-Detektion, obwohl bereits 1979 eingefhrt, im Vergleich zu scannenden Spektralphotometern noch gering. Die Broschre sollte helfen, diese Situation zu verbessern. Sie wurde gut aufgenommen und mehrere tausend Exemplare wurden an Kunden verschickt. Seit dieser ersten Einfhrung hat sich vieles verndert und so ist es an der Zeit, eine Neuauflage der Broschre zu drukken. Computer werden zunehmend zur Datenauswertung eingesetzt, die Gute Laborpraxis gewinnt an Bedeutung und eine neue Generation von Diodenarray-Spektralphotometern mit noch besserer Leistung ist verfgbar. In dieser Einfhrung werden alle Aspekte der UV-Vis-Spektroskopie erlutert, die zum Erzielen optimaler Ergebnisse eine Rolle spielen. Mikroprozessoren und/oder Computersteuerung haben die Datenauswertung vereinfacht und zu einer Produktivittssteigerung gefhrt. Auerdem wurde die Bedienbarkeit der Gerte verbessert. Trotz dieser Vorteile ist eine gute Kenntnis der Grundlagen der UV-Vis-Spektroskopie, der gertetechnischen Grenzen und der Fehlerquellen bei der Probenhandhabung unabdingbar. In dieser Einfhrung wird gezeigt, da der konventionelle Ansatz der Einzelmessung bei einer Wellenlnge nicht zur Erzielung optimaler Ergebnisse ausreicht. Mehrfachmessungen bei mehrern Wellenlngen oder besser, mit vollen Spektren, sichern hchste Genauigkeit und Przision der Ergebnisse und liefern die Informationen zum Ausschlu von Fehlerquellen. An dieser Stelle mchte ich meine Kollegen von Agilent Technologies, denen ich viele meiner Kenntnisse verdanke, fr Ihre Untersttzung danken.
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InhaltKapitel 1 Grundlagen und Anwendungen der UV-VisSpektroskopieGrundlagen ........................................................................................................... 2 Das elektromagnetische Spektrum........................................................... 2 Wellenlnge und Frequenz....................................................................................................... 3 Entstehung von UV-Vis-Spektren .............................................................. 3 Transmission und Absorption ................................................................... 6 Abgeleitete Spektren .................................................................................. 7 Gewinnung abgeleiteter Spektren .................................................... 8 Anwendungen ..................................................................................... 9 Signal-Rausch-Verhltnis ................................................................. 10 Apparative Aspekte .......................................................................... 10 Qualitative Analyse............................................................................................ 10 IdentifizierungSpektrum und Struktur ............................................... 10 Besttigung der Moleklstruktur ............................................................ 12 Farbe........................................................................................................... 13 Andere qualitative Informationen ........................................................... 15 Schmelzpunkt von Proteinen und Nukleinsuren ....................... 15 Enzymaktivitt .................................................................................. 16 Apparative Aspekte................................................................................... 17 Quantitative Analyse................................................................................................................ 17 Das Beersche Gesetz ................................................................................ 17 Probenvorbereitung ......................................................................... 21 Mehrkomponentenanalysen .................................................................... 22 Das Prinzip der Additivitt .............................................................. 22 Einfache Methode simultaner Gleichungen .................................. 22 Methode der kleinsten Fehlerquadrate.......................................... 25 Andere Methoden ............................................................................. 27 Probenbeschaffenheit ...................................................................... 28 Anforderungen an das Megert............................................................. 28 Indirekte Quantifizierung ................................................................................. 29 Chemische Derivatisierung...................................................................... 29 Spektralphotometrische Titrationen ...................................................... 29 Untersuchung von Enzymkinetiken ....................................................... 29
Kapitel 2 Apparative AspekteGertedesign ...................................................................................................... 32 Komponenten ............................................................................................ 32
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Inhalt
Lichtquellen ....................................................................................... 33 Monochromatoren............................................................................ 34 Detektoren......................................................................................... 35 Optik................................................................................................... 38 Das herkmmliche Spektralphotometer................................................ 38 Das DiodenarraySpektralphotometer.................................................................................. 40 Konfigurationen......................................................................................... 41 Einstrahlgerte.................................................................................. 41 Zweistrahlgerte ............................................................................... 42 Design mit Strahlteiler ..................................................................... 44 Dual-Wellenlngen Design............................................................... 45 Messung eines Spektrums........................................................................ 45 Grundparameter der Megerte ...................................................................... 46 Spektrale Auflsung.................................................................................. 46 Wellenlngenrichtigkeit und -przision.................................................. 50 Photometrische Richtigkeit und Przision ............................................ 51 Streulicht ........................................................................................... 51 Rauschen ........................................................................................... 52 Linearer dynamischer Bereich ................................................................ 53 Drift............................................................................................................. 55
Kapitel 3 Probenhandhabung und MessungFlssige Proben ................................................................................................. 58 Kvetten ..................................................................................................... 58 Material .............................................................................................. 58 Kvettentypen................................................................................... 60 Fehlerquellen .................................................................................... 61 Pflege der Kvetten .......................................................................... 62 Wahl des Lsungsmittels.......................................................................... 62 Einflu von Lsungsmittel, Konzentration, pH und Temperatur........ 63 Feste Proben ...................................................................................................... 65 Fehlende Referenz .................................................................................... 65 Brechungsindex......................................................................................... 66 Probengeometrie....................................................................................... 66 Schwache Absorption ....................................................................................... 67 nderung der Spaltbreite ......................................................................... 67 Zeitliche Mittelwertbildung...................................................................... 68 Wellenlngenmittelung ............................................................................. 68 Starke Absorption.............................................................................................. 69 Interferenzen ...................................................................................................... 71 Arten von Interferenzen ........................................................................... 71 Andere absorbierende Stoffe .................................................................................................. 71
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Inhalt
Streuung............................................................................................. 71 Korrekturmglichkeiten........................................................................... 73 Isoabsorption .................................................................................... 73 Mehrkomponentenanalyse .............................................................. 74 Background-Modeling...................................................................... 75 Interne Referenz ............................................................................... 76 Dreipunktkorrektur.......................................................................... 77 Ableitungen von Spektren ............................................................... 78 Photochemische Effekte .................................................................................. 82 Fluoreszenz ................................................................................................ 82 Probenzersetzung .............................................................................................. 84
Kapitel 4 Methodenentwicklung und ValidierungMethodenentwicklung ...................................................................................... 86 Linearitt .................................................................................................... 87 Richtigkeit .................................................................................................. 91 Przision..................................................................................................... 93 Empfindlichkeit......................................................................................... 94 Mebereich ................................................................................................ 96 Selektivitt ................................................................................................. 97 Robustheit .................................................................................................. 98 Anforderungen an das Megert............................................................. 99 Methodenvalidierung ........................................................................................ 99
Kapitel 5 RoutinemebetriebLeistungsberprfung des Megertes......................................................... 102 Testparameter.......................................................................................... 102 Wellenlngenrichtigkeit und -przision ....................................... 103 Photometrische Richtigkeit und -przision................................. 104 Streulicht ......................................................................................... 104 Auflsung......................................................................................... 105 Rauschen ......................................................................................... 106 Gltte der Basislinie ....................................................................... 106 Stabilitt........................................................................................... 106 Linearitt.......................................................................................... 106 Standards ................................................................................................. 107 Emissionslinienstandards.............................................................. 107 Feste Absorptionsstandards ......................................................... 108 Flssige Absorptionsstandards..................................................... 109 Gesetzliche Auflagen .............................................................................. 110 GLP/GMP ......................................................................................... 111 Europische Pharmacopoeia ........................................................ 111
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Inhalt
Pharmacopoeia der USA................................................................ 112 Testmethoden des American Standard ........................................ 114 Empfehlungen ......................................................................................... 116 Selbsttest des Megertes .............................................................................. 120 Systemeignungstest......................................................................................... 121 Fehlerfreier Betrieb......................................................................................... 121 Elektronische Datenspeicherung.......................................................... 122 Standardarbeitsanweisungen ................................................................ 122 Ergnzungsdaten ............................................................................................. 122 Besttigungswellenlngen ..................................................................... 123 Vollstndige Spektren............................................................................. 124 Statistische Methoden ............................................................................ 125
Anhang A BegriffsdefinitionenBegriffsdefinitionen......................................................................................... 128 ................................................................................................................... 128
Anhang B Eigenschaften von DiodenarraySpektralphotometernVorteile der Diodenarray-Spektroskopie ...................................................... 130 Schnelle Aufnahme von Spektren............................................................................................ 130 Simultanmessungen bei mehreren Wellenlngen ............................... 131 Reproduzierbarkeit der Wellenlnge .................................................... 132 Empfindlichkeit....................................................................................... 133 Statistische Auswertung......................................................................... 133 Robustheit und Verllichkeit............................................................... 134 Offener Probenbereich........................................................................... 134 Nachteile der Diodenarray-Spektroskopie................................................... 135 Auflsung ................................................................................................. 135 Streulicht.................................................................................................. 135 Probenzersetzung.................................................................................... 136 Komplexitt ............................................................................................. 137 Fehler bei der Messung fluoreszierender Proben............................... 137
Anhang C Literaturverzeichnis
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Kapitel 1
Kapitel 1
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
In diesem Kapitel werden Theorie, Grundlagen, Anwendungsmglichkeiten und Grenzen der UV-Vis-Spektroskopie in der chemischen Analytik vorgestellt.
GrundlagenDas elektromagnetische Ultraviolette (UV) und sichtbare Strahlung stellen einen Spektrum kleinen Ausschnitt des gesamten elektromagnetischenSpektrums dar. Andere Bereiche sind u. a. Radio-, Infrarot(IR), kosmische und Rntgenstrahlung (siehe Abbildung 1).Frequenz [Hz] Ultraviolett Sichtbar Infrarot
Kosmischer Hintergrund
Gammastrahlen
Mikrowellen
Ultraviolett Sichtbar
Rntgenstr.
Fernsehen
Infrarot
Radar
Wellenlnge [m] Abbildung 1 Das elektromagnetische Spektrum
Der Energieinhalt elektromagnetischer Strahlung wird mit folgender Formel angegeben:
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Radio
NMR
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
E = hE ist die Energie (in Joule), h die Planck-Konstante (6,62 10-34 Js) und die Frequenz (in Sekunden).
Wellenlnge und Elektromagnetische Strahlung kann als berlagerung oszilFrequenz lierender elektrischer und magnetischer Felder aufgefatwerden, die sich im Raum wellenartig ausbreiten. Da sich Strahlung wellenartig verhlt, kann sie sowohl ber ihre Wellenlnge als auch ber ihre Frequenz beschrieben werden. Diese sind ber folgende Beziehung miteinander verknpft:
= c ist die Frequenz (in Sekunden), c die Lichtgeschwindigkeit von (3 108 ms-1), und die Wellenlnge (in Metern). In der UV-Vis Spektroskopy wird die Wellenlnge normalerweise in Nanometern angegeben (1 nm = 10-9 m). Aus den oben vorgestellten Gleichungen folgt, da Strahlung mit krzerer Wellenlnge eine hhere Energie aufweist. In der UV-Vis-Spektroskopie hat das UV-Licht bei niedrigerer Wellenlnge die hchste Energie. In einigen Fllen reicht diese Energie aus, um photochemische Reaktionen auszulsen, whrend das Spektrum einer Substanz gemessen wird. Auch Sonnenbrand geht auf den UV-Anteil des Sonnenlichtes zurck.
Entstehung von Wenn Strahlung in Wechselwirkung mit Materie tritt, knUV-Vis-Spektren nen die Reflexion, Streuung, Absorption, Fluoreszenz, Phosphoreszenz (jeweils Absorption und Emission) oder photochemische Reaktionen (Absorption und Bindungsbruch) auftreten. Grundlage der UV-Vis-Spektroskopie bildet jedoch die Nutzung der Absorption. Weil Licht eine Energieform darstellt, fhrt die Absorption von Licht durch Materie zur Erhhung des Energieinhaltes der beteiligten Molekle bzw. Atome. Der Gesamtenergiein-
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
halt eines Molekls wird allgemein durch die Summe seiner elektronischen, Schwingungs-, und Rotationsenergie gegeben:
E Gesamt = E Elektronisch + E Schwingung + E RotationDie Beitrge der einzelnen Energieformen zur Gesamtenergie eines Molekls sind nicht kontinuierlich, sondern bestehen aus einer Serie diskreter Energiezustnde. Die Energiebeitrge der einzelnen Zustnde weisen folgende Reihenfolge auf:
E Elektronisch > ESchwingung > ERotationIn einigen Moleklen und Atomen knnen Photonen aufgrund ihres Energieinhaltes bergnge zwischen bestimmten elektronischen Zustnden induzieren. Der Wellenlnge des absorbierten Lichtes entspricht genau die Energiemenge, die zur Anhebung eines Elektrons aus einem niedrigeren in einen hheren Energeizustand erforderlich ist. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel fr elektronische bergnge im Formaldehyd und die hierfr erforderlichen Wellenlngen.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
bergang bergang
Abbildung 2 Elektronische bergnge im Formaldehyd
Diese bergnge sollten sehr schmale Absorptionsbanden bei Wellenlngen zur Folge haben, die fr die Energiedifferenzen der Energiezustnde der absorbierenden Spezies charakteristisch sind. Dies trifft auch auf Atome zu, wie in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3 Elektronische bergnge und Atomspektren
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Bei Moleklen sind allerdings die Energien der Schwingungs- und Rotationszustnde den elektronischen Zustnden berlagert. Da sehr viele bergnge zwischen den unterschiedlichen Energienniveaus auftreten knnen, entstehen breite Banden (siehe Abbildung 4). Die Bandenverbreiterung ist in Lsungen aufgrund der Wechselwirkung mit Lsungsmittelmoleklen noch grer.
Elektronische Energiezustnde Schwingungszustnde Rotationszustnde Elektronische bergnge
Abbildung 4 Elektronische bergnge und UV-Vis-Spektren von Moleklen
Transmission und Ab- Wenn Licht von einer Probe reflektiert oder durchgelassen sorption wird, ist die Menge des absorbierten Lichtes die Differenzzwischen der ursprnglichen Intensitt (Io) und der Intensitt (I) nach Wechselwirkung mit der Probe. Die Menge des absorbierten Lichtes kann als Transmission und Absorption ausgedrckt werden. Transmission wird normalerweise als ein Bruchteil von 1 oder Prozentwert ausgedrckt und ist wie folgt definiert:
T = I I o oder % T = ( I I o ) 100Die Absorption ist folgendermaen definiert:
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
A = log TFr die meisten Anwendungen wird die Absorption verwendet, weil der Zusammenhang zwischen Absorption, Konzentration und optischer Schichtdicke hufig linear ist.
Abgeleitete Spektren Wenn ein Spektrum als Auftragung der Absorption (A)gegen die Wellenlnge () angegeben ist, werden die abgeleiteten Spektren wie folgt errechnet:
Nullter Ordnung:
A = f( ) dA ------ = f ( ) d d A -------- = f ( ) 2 d2
Erster Ordnung:
Zweiter Ordnung:
Abbildung 5 auf der nchsten Seite zeigt die Wirkung einer Ableitung auf eine einfache gaussfrmige Absorptionsbande. Die abgeleiteten Spektren sind stets komplexer als das Spektrum nullter Ordnung. Die erste Ableitung gibt die nderungsrate der Absorption als Funktion der Wellenlnge an. Sie beginnt und endet bei Null, und durchluft die Nullinie bei der Wellenlnge, bei der die maximale Absorption max einer Absorptionsbande liegt. Die Ableitung hat einen positiven und eine negativen Anteil, deren Maximal- und Minimalwerte bei denselben Wellenlngen liegen, wie die Wendepunkte der Absorptionsbanden. Die herausragende Eigenschaft einer Ableitung zweiter Ordnung ist eine positive und eine negative Bande mit einem Minimum bei derselben Wellenlnge, an der das Maximum
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
der Bande nullter Ordnung liegt. Diese Ableitung weist zwei positive Satellitenbanden auf beiden Seiten der Hauptbande auf. Die vierte Ableitung weist eine positive Bande mit einem Maximum bei der Wellenlnge des Maximums der Bande nullter Ordnung auf. Geradzahlige Ableitungen weisen negative oder positive Banden mit Minima oder Maxima bei derselben Wellenlnge wie max der Absorptionsbande auf.
Absorption
Absorption
1. Ableitung
2. Ableitung
3. Ableitung
4. Ableitung
Abbildung 5 Abgeleitete Spektren einer gaussfrmigen Absorptionsbande
Gewinnung abgeleiteter Spektren
Zur Gewinnung abgeleiteter Spektren knnen optische, elektronische und mathematische Methoden eingesetzt werden. Obwohl optische und elektronische Methoden in
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
den Anfngen der UV-Vis-Spektroskopie weit verbreitet waren, werden sie nun von mathematischen Methoden nahezu vollstndig ersetzt. Zur Berechnung der Ableitung bei einer bestimmten Wellenlnge () wird ein Datenbereich von n Datenpunkten ausgewhlt und ein Polynom der Form
A = a 0 + a1 + + a l
l
an den Datenbereich nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate angepat. Die Koeffizienten a0 al stehen fr die abgeleiteten Werte bei einer Wellenlnge, wobei a1 den ersten, a2 den zweiten und hhere Koeffizienten hhere Ableitungen angeben. Auf der Methode von Savitzky und Golay basieren die meisten hocheffizienten Ableitungsalgorithmen in kommerziellen Megerten. Mit dieser Methoden werden Rohdaten auch geglttet. Wenn die Ordnung (l) des Polynoms kleiner ist als die Anzahl der Datenpunkte (2n+1) im Datenbereich, kann das Polynom nicht durch alle Datenpunkte verlaufen. Daher liefert die Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate eine geglttete Approximation der Rohdatenpunkte. Obwohl die Bildung der ersten oder einer hheren Ableitung eines UV-Vis-Spektrums zu einem, verglichen mit dem Spektrum Nullter Ordnung (siehe Abbildung 5), komplexeren Verlauf fhrt, nimmt der inhrente Informationswert dieser Spektren nicht zu. Er nimmt im Gegenteil durch Informationsverluste, z. B. ber einen Offset, ab. Anwendungen Abgeleitete Spektren knnen zur Verdeutlichung der Unterschiede zwischen Spektren und in der qualitativen Analyse zur Auflsung berlappender Banden genutzt werden (siehe Besttigung der Moleklstruktur auf Seite 12). Weitaus wichtiger ist ihr Nutzen in der quantitativen Analyse zum Erkennen von Einflssen wie Streuung, Matrix oder anderer absorbierender Verbindungen (siehe Ableitungen von Spektren auf Seite 78).
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Signal-Rausch-Verhltnis
Eine unerwnschte Folge der Bildung von Ableitungen ist die Zunahme des Signal-Rausch-Verhltnisses. Diese Zunahme ist eine Folge des Diskriminierungseffekts (siehe Ableitungen von Spektren auf Seite 78) sowie der Tatsache, da das Rauschen aus vergleichsweise scharfen Einzelpeaks besteht. Daher weisen Spektraldaten, die mit 2 nm Intervallen aufgenommen wurden, im Rauschen eine Bandbreite von 2 nm auf. Wenn die Bandbreite des Analyten 20 nm betrgt, ist das Signal-Rausch-Verhltnis der ersten Ableitung 10fach schlechter als im Spektrum Nullter Ordnung. Die Glttungseigenschaften der polynomialen Anpassung nach Savitzky-Golay fhren zur einer Milderung dieses Effektes im Signal-Rausch-Verhltnis. Bei zu starker Glttung wird jedoch eine Verzerrung der abgeleiteten Spektren erzeugt. Die hhere Auflsung abgeleiteter Spektren stellt hhere Anforderungen an die Reproduzierbarkeit der Wellenlngen des Spektralphotometers. Kleine Wellenlngenabweichungen in der Absorption knnen zu groen Fehlern in den Ableitungen fhren. Die negative Wirkung der Ableitungen auf das Signal-Rausch-Verhltnis stellt besonders hohe Anforderungen an ein Spektralphotometer hinsichtlich geringem Rauschen. Wenn mehrere Spektren aufgenommen und gemittelt werden knnen, wird hierdurch das Signal-Rausch-Verhltnis vor Bildung der Ableitungen nochmals verbessert.
Apparative Aspekte
Qualitative AnalyseIdentifizierungSpek- UV-Vis-Spektren weisen im Allgemeinen nur einige wenige trum und Struktur breite Absorptionsbanden auf. Im Vergleich zu Methoden,wie der Infrarotspektroskopie, die viele schmale Banden erzeugen, liefert die UV-Vis-Spektroskopie nur eine begrenzte Menge an qualitativer Information. In organischen Moleklen fhren meist -Bindungen (ungesttigte
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Bindungen) zur Absorption. Ein Chromophor ist eine Moleklgruppe, die normalerweise eine -Bindung enthlt. Die Einfhrung einer solchen Bindung in einen gesttigten Kohlenwasserstoff, der keine Absorption im UV zeigt, fhrt zu einer Substanz, die normalerweise zwischen 185 und 1000 nm absorbiert. In Tabelle 1 sind einige hufige Chromophore mit den zugehrigen Absorptionswellenlngen zusammengestellt.
Tabelle 1
Ausgewhlte Chromophore und zugehrige Absorptionsmaxima Chromophore Carbonyl (Ketone) Carbonyl (Aldehyd) Carboxyl Amid Ethyl Acetylen Nitrile Nitro Struktur RRC=O RHC=O RCOOH RCONH2 RCH=CHR RC=CR RC=N RNO2 Beispiel Aceton Acetaldehyd Essigsure Acetamid Ethylen Acetylen Acetonitril Nitromethan max (nm) 271 293 204 208 193 173 < 160 271
Die Gegenwart einer Absorptionsbande bei einer bestimmten Wellenlnge ist ein guter Indikator fr die Gegenwart eines Chromophors. Die Lage des Absorptionsmaximums ist nicht festgelegt und hngt auch von den Nachbargruppen im Molekl und vom verwendeten Lsungsmittel ab. Andere Parameter, wie z. B. der pH-Wert und die Temperatur knnen ebenfalls zur Modifizierung von Intensitt und Lage des Absorptionsmaximums fhren. Konjugierte Doppelbindungen erhhen sowohl Intensitt als auch Lage der Absorptionsbande. Fr einige Molekle, wie z. B. Kohlenwasserstoffe mit konjugierten Doppelbindungen oder Karotine, wurde der Zusammenhang zwischen Intensitt und Wellenlnge systematisch untersucht.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Auch bergangsmetallionen verfgen ber elektronische Energieniveaus, die zur Absorption im sichtbaren Licht bei 400700 nm fhren
Besttigung der Mole- Obwohl UV-Vis-Spektren nicht zur eindeutigen Identifizieklstruktur rung einer unbekannten Substanz ausreichen, werden siehufig zur Besttigung der Struktur einer Substanz verwendet, indem das gemessene Spektrum mit einem Referenzspektrum verglichen wird. Im Falle hoher hnlichkeit der Spektren knnen zur Differenzierung auch abgeleitete Spektren verwendet werden. Wie in Abbildung 6 dargestellt, nimmt die Anzahl der Banden mit der Ordnung der Ableitung zu. Die erhhte Komplexitt der abgeleiteten Spektren kann in der qualitativen Analyse zur Charakterisierung von Substanzen oder zur Identifizierung genutzt werden. So zeigt z. B. das Absorptionsspektrum des Steroids Testosteron eine einzelne, breite und unstrukturierte Bande bei etwa 330 nm, die zweite Ableitung weist hingegen sechs klare Peaks auf. Die Erhhung der Auflsung kann auch zur Identifizierung unbekannter Substanzen eingesetzt werden. Abbildung 6 zeigt hierzu folgende Computersimulation: Zwei gaussfrmige Peaks mit einer natrlichen spektralen Bandbreite (Natural Spectral Bandwidth, NBW) mit 30-nm-Abstand werden so berlagert, da eine einzelne Bande mit einem Maximum in der Mitte zischen beiden Einzelbanden resultiert. Die beiden Komponenten werden nicht aufgelst. In der vierten Ableitung sind die beiden Banden jedoch klar mit Maxima in der Nhe der jeweiligen max der Einzelkomponenten sichtbar.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Absorption
4. Ableitung
Abbildung 6 Erhhung der Auflsung
Farbe Farbe ist eine wichtige Substanzeigenschaft. Die Farbe vonMaterie wird durch ihre Absorption bzw. Reflektivitt bestimmt. Das menschliche Auge sieht stets die zur Absorption komplementre Farbe. Dies ist in Abbildung 7 und Abbildung 8 zur Erluterung dargestellt.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Abbildung 7 Durchlssigkeit und Farbe
Wellenlnge [nm]
absorbierte und komplementre Farbe rot orange gelbgrn grn blaugrn blaugrn grnlich blau purpur rot-purpur rot orange gelb gelbgrn
grnlich blau blau violett
Abbildung 8 Absorption und Komplementrfarben
In der Realitt sind Erzeugung und Wahrnehmung von Farbe komplizierte Vorgnge, die von vielen Faktoren bestimmt werden, wie z. B. dem Spektrum des auffallenden Lichtes und, im Falle von Feststoffen, deren Oberflchen-
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
struktur. Zur Farbmessung stehen Farbmesysteme, wie z.B. CIE L*a*b und andere Gerte zur Verfgung. Auch die meisten Spektralphotometer knnen, zusammen mit geeigneter Software, Farben ermitteln. Ein detailliertere Diskussion der Entstehung und der Eigenschaften von Farben bersteigt jedoch Umfang und Ziel dieser Einfhrung. Zur weitergehenden Lektre stehen verschiedene Publikationen2,3 zur Verfgung, die die Eigenschaften und Messung von Farbe genau diskutieren.
Andere qualitative In- Die UV-Vis-Spektroskopie kann zur Bestimmung verschieformationen dener physikochemischer Eigenschaften von Substanzenund damit von Strukturinformationen verwendet werden. Hierfr folgen zwei Beispiele. Schmelzpunkt von Proteinen und Nukleinsuren Die Absorptionsspektren von Proteinen resultieren zum grten Teil aus der Gegenwart der aromatischen Aminosuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Proteine weisen bei Raumtemperatur eine spezifische rumliche Struktur bzw. Konformation auf, die in der Nhe der aromatischen Aminosuren eine spezielle elektronische Umgebung erzeugt. Bei Erwrmung wird bei einer bestimmten Temperatur diese Struktur aufgefaltet, das Protein schmilzt. Bei diesem Vorgang ndert sich die elektronische Umgebung der aromatischen Aminosuren mit der Folge, da sich die Spektren ndern und verschieben. Mehrkomponentenanalysen (siehe Mehrkomponentenanalysen auf Seite 22) knnen zur Bestimmung des Anteils jeder aromatischen Aminosure in einem intakten Protein verwendet werden4. Desoxyribonukleinsuren (DNA) besteht in ihrem Grundzustand aus zwei Strngen von Desoxyribosemoleklen, die sich helikal um eine Achse winden. Die Strnge sind durch Wasserstoffbrcken zwischen den Basen Purin und Pyrimidin (P-P), Adenin und Thymin (A-T) bzw. Guanin und Cytosin (G-C) miteinander verbunden. Diese Basen bilden die UV-Absorptionseigenschaften von DNA mit einem Peakma-
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
ximum bei 260 nm. Analog jedem anderen Mehrkomponentensystem setzt sich die Gesamtabsorption jedes DNA-Molekls als Summe aus den Beitrgen der Einzelabsorptionen zusammen:
A DNA = A Adenin + A Guanin + A Cytosin + A ThyminFast immer ist die beobachtete Absorption deutlich geringer als die erwartete, weil die Wasserstoffbrcken zwischen den Basenpaaren deren elektronische Eigenschaften modifizieren. Beim Erwrmen eines Molekls brechen die Wasserstoffbrcken auf und die Doppelhelix entfaltet sich, wodurch die Absorption auf den erwarteten Wert zunimmt. Dieser Denaturierungsproze wird auch als Schmelze bezeichnet. In einem Schmelzexperiment mit DNA wird die Temperatur schrittweise erhht. Dabei wird bei jeder Temperatur die Absorption bei 260nm gemessen und gegen die Schmelzkurve aufgetragen. Der Mittelpunkt des Temperaturbereiches, in dem die Schmelze auftritt, wird Tm-Wert genannt. Der Tm-Wert einer bestimmten DNA-Probe hngt primr vom Anteil der G-C-Paare, die je drei Wasserstoffbrcken ausbilden, in der Probe ab. Im Unterschied hierzu bilden die A-T-Paare nur zwei Wasserstoffbrcken aus. Je hher der prozentuale Anteil der G-C-Paare in der Probe ist, desto hher ist der beobachtete Wert fr Tm. Enzymaktivitt Die Enzymaktivitt stellt ein Ma zur Beschreibung der katalytischen Effizienz dar. Die Konzentration eines Enzyms in einer unreinen Zubereitung wird in Units pro Milliliter angegeben, die spezifische Aktivitt der Zubereitung wird in Units pro Milligramm Protein angegeben. Bei der Reinigung eines Enzyms erreicht die spezifische Aktivitt einen Grenzwert, der dem des reinen Enzyms entspricht. Die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit hngt von Faktoren, wie Substratkonzentration, pH-Wert, Ionenstrke und Temperatur ab. Die Bedingungen, unter denen die Aktivitt
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
bestimmt wird, mssen daher przise definiert werden. Gewhlt werden normalerweise die optimalen Prfbedingungen bei festgelegten Temperaturen (25-, 30-, oder 37 C) mit Sttigungskonzentrationen aller Substrate. Zur Bestimmung der Aktivitt wird ein System mit bekannten Substratund, wo erforderlich, Koenzymkonzentrationen erstellt. Dann wird eine eingewogene Enzymmenge hinzugefgt und der Reaktionsumsatz bestimmt. Aktivittsmessungen werden normalerweise in Forschungseinrichtungen durchgefhrt, wo Enzyme auch isoliert und gereinigt werden sowie in der Herstellung von Enzym Assay Kits, in welchen die Enzymaktivitt von Charge zu Charge konsistenz sein mu.
Apparative Aspekte Die Wellenlngen- und photometrische Genauigkeit sind frdie qualitative Analyse besonders wichtig, besonders bei der Identifizierung und Strukturbesttigung unbekannter Stoffe. Oft werden auf verschiedenen Gerten Spektren aufgenommen und miteinander verglichen. Deshalb sollten alle Spektren bei einer definierten spektralen Auflsung gemessen werden.
Quantitative AnalyseDas Beersche Gesetz Wenn 100 Photonen in eine Zelle ein- und nur 50 auf deranderen Seite wieder austreten, betrgt die Durchlssigkeit 0,5- oder 50%. Von diesen 50 Photonen treten auf der anderen Seite einer weiteren identischen Zelle nur 25 aus und so weiter. In Abbildung 9 ist eine Auftragung der Durchlssigkeit gegen die Konzentration dargestellt.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Optische Schichtdicke Abbildung 9 Zusammenhang von Durchgang und KonzentrationDas Bouguer-Lambertsche Gesetz
Lambert (1760) wird die erste mathematische Formulierung dieses Zusammenhanges zugeschrieben, obwohl es nach heutigem Wissen wahrscheinlich Bouguer bereits 1729 formulierte. Der Ausdruck lautet:
Durchgang
T = I Io = e
kb
Dabei ist Io die ursprngliche Lichtintensitt, I die Intensitt nach Durchgang, e die Basis des natrlichen Logarithmus, k eine Konstante und b die optische Schichtdicke (normalerweise in cm). Das Beersche Gesetz entspricht der Formulierung von Bouguer mit dem Unterschied, da es in Konzentrationseinheiten ausgedrckt ist. Die absorbierte Lichtmenge ist proportional zur Anzahl der absorbierenden Molekle, durch die der Lichtstrahl geht. Abbildung 10 zeigt eine Auftragung der Durchlssigkeit gegen die optische Schichtdicke.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Durchlssigkeit
Optische Schichtdicke Abbildung 10 Durchlssigkeit und optische SchichtdickeDas Beersche Gesetz
Aus der Kombination beider Gesetze entsteht das Gesetz nach Beer-Bouguer-Lambert:
T = I Io = e
kbc
Dabei ist c die Konzentration der absorbierenden Spezies. Diese Gleichung kann durch Bildung des Logarithmus in einen linearen Ausdruck umgeformt werden und wird normalerweise in der dekadischen Form angegeben.
A = log T = log ( I I o ) = log ( I o I ) = bcDabei ist der molare Absorptions- oder Extinktionskoeffizient. Dieser Ausdruck wird allgemein das Beersche Gesetz genannt. In Abbildung 11 ist eine Auftragung von Absorption gegen Konzentration dargestellt.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Absorption [AU]
Konzentration Abbildung 11 Auftragung nach dem Gesetz von BeerBouguer-Lambert
Der Extinktionskoeffizient () ist fr eine Substanz bei exakt definierten Bedingungen, wie z. B. Wellenlnge, Lsungsmittel und Temperatur, charakteristisch. In der Praxis ist der gemessene Extinktionskoeffizient teilweise von den Charakteristika der eingesetzten Megerte abhngig. Aus diesen Grnden werden die Literaturwerte der Extinktionskoeffizienten in der quantitativen Analyse nicht eingesetzt. An ihrer Stelle wird aus einer oder mehreren Standardlsungen mit bekannter Konzentration der Analysensubstanz eine Kalibrierkurve fr die zu analysierende Substanz aufgenommen. Bei elektronischen bergngen ist die Energiedifferenz zwischen dem Grund- und den angeregten Zustnden relativ gro. Aus diesem Grund sind bei Raumtemperatur wahrscheinlich alle Molekle im elektronischen Grundzustand. Absorption und Relaxation in den Grundzustand sind schnelle Prozesse, das Gleichgewicht stellt sich schnell ein. Aus diesem Grund sind quantitative Messungen mit UV-Vis-Spektroskopie sehr exakt. Der einfache lineare Zusammenhang zwischen Absorption und Konzentration
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
und die einfache Handhabung fhrten zur tausendfachen Anwendung der UV-Vis-Spektroskopie in der quantitativen Analytik. Unter der Annahme, da das Beersche Gesetz aus einem Spektrum Nullter Ordnung abgeleitet ist, wird zwischen der Konzentration und der Amplitude in allen hheren Ableitungen des Spektrums auch ein linearer Zusammenhang gefunden: Nullte Ordnung:
A = bc d dA -bc ------ = ----d d d d A -------- = ------- bc d dn n
Erste Ableitung:
n-te Ableitung:
ist die Mewellenlnge, A die Absorption, der Extinktionskoeffizient, b die optische Schichtdicke und c ist die Konzentration der Probe. Bei der Quantifizierung von Einzelkomponenten ist die Wahl einer Wellenlnge mit abgeleiteten Spektren schwieriger als mit dem Absorptionsspektrum, da sowohl positive als auch negative Peaks auftreten. Die geradzahligen Ableitungen weisen ein Peakmaximum bzw. -minimum bei der Wellenlnge max des Absorptionsspektrums auf. Bei ungeradzahligen Ableitungen ist diese Wellenlnge eine Nullstelle. Durch Bildung der Differenz zwischen hchstem Maximum und niedrigstem Minimum wird das beste Signal-Rausch-Verhltnis erreicht, jedoch nimmt die Querempfindlichkeit auf andere Substanzen zu. Probenvorbereitung Zur Erzielung exakter Ergebnisse sollte eine Probe nur die absorbierende Substanz erhalten, fr die eine Kalibrierung durchgefhrt wurde. Wenn die Probe als Lsung vorliegt,
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
wird eine Probe mit reinem Lsungsmittel als Blank vermessen. Es ist mglich, die Beitrge einer etwaigen strenden Substanz durch Messung bei einer zweiten Wellenlnge zu eliminieren.
Mehrkomponenten- Mehrkomponentenanalysen mit UV-Vis-Spektroskopie weranalysen den bereits genauso lange durchgefhrt, wie Einzelstoffanalysen. Da die Meergebnisse, wie unten ausgefhrt, oft fehlerhaft waren, fand keine breite Anwendung statt. Moderne Gerte liefern jedoch genauere Daten und die Anwendung moderner Kurvenanpassungsverfahren ermglicht exaktere Ergebnisse. Vielleicht ebenso wichtig ist die Tatsache, da mit diesen Methoden unrichtige Ergebnisse erkannt werden knnen. Aus den genannten Grnden nimmt heute die Mehrkomponentenanalyse mit UV-Vis-Spektroskopie zu. Das Prinzip der Additivitt Nach dem Beerschen Gesetz (siehe Das Beersche Gesetz auf Seite 17), ist die Absorption proportional zur Anzahl der Molekle, die bei einer spezifischen Wellenlnge Strahlung absorbieren. Dieses Prinzip gilt auch bei der Anwesenheit von zwei oder mehr absorbierenden Spezies. Alle quantitativen Mehrkomponentenanalysen basieren auf diesem Prinzip der Additivitt: Bei jeder Wellenlnge ist die Absorption einer Mischung gleich der Summe der Absorptionen aller Einzelkomponenten bei dieser Wellenlnge. Der einfachste Ansatz der Mehrkomponentenanalyse basiert auf der Messung bei so vielen verschiedenen Wellenlngen, wie unterschiedliche Substanzen in der Mischung vorliegen. Die gewhlten Wellenlngen liegen in den Absorptionsmaxima der einzelnen Stoffe. Zur Kalibrierung werden die Absorptionen reiner Standardlsungen bekannter Konzentrationen gemessen und daraus der Extinktionskoeffizient fr jede Substanz bei allen gewhlten Wellenlngen berechnet. Die Absorption der Mischung ist bei jeder Wellenlnge die Summe der Einzelabsorptionen, die jeweils auf dem Extink-
Einfache Methode simultaner Gleichungen
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
tionskoeffizienten und der Konzentration der Substanz beruhen. Fr zwei Stoffe x und y ergeben sich damit folgende Gleichungen:
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc yund
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc yA ist die Absorption bei der Wellenlnge, A bei der Wellenlnge. e ist die molare Absorption bei der Wellenlnge, e bei der Wellenlnge. c ist die Konzentration und b ist die optische Schichtdicke. Diese Gleichungen knnen zur Bestimmung der Konzentration jedes Stoffes leicht gelst werden. Wenn die Messungen immer exakt durchgefhrt werden, knnen auch fr komplexe Mehrkomponentenmischungen mit hnlichen Spektren exakte Ergebnisse ermittelt werden. In der Praxis treten jedoch stets Mefehler auf, die die Genauigkeit von Ergebnissen reduzieren, wenn die Spektren stark berlappen. Abbildung 12 zeigt eine simulierte Zweistoffmischung ohne berlappung der Spektren im Absorptionsmaximum.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Absorption [AU]
Wellenlnge [nm] Abbildung 12 Eine Zweikomponentenmischung geringer spektraler berlappung
Im Unterschied hierzu zeigt Abbildung 13 eine simulierte Zweikomponentenmischung mit deutlicher berlappung der Spektren im Absorptionsmaximum.
Absorption [AU]
Wellenlnge [nm] Abbildung 13 Eine Zweikomponentenmischung mit deutlicher spektraler berlappung
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Fr eine Mischung aus x und y mit cx = cy = 1 werden theoretisch folgende Absorptionen gefunden:Geringe spektrale berlappung A(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 Deutliche spektrale berlappung A(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1 A(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9
Ein Fehler von 10 % in der Messung von A(x + y) und A(x + y), so da A(x + y) = 0.99 (- 10 %) und A(x + y) = 0.99 (+ 10 %) ist, fhrt zu folgenden Ergebnissen in Tabelle 2 fr die quantitative Berechnung:
Tabelle 2
Vergleich der Ergebnisse von Mehrkomponentenanalysen mit Beispielen fr geringe und deutliche spektrale berlappung Geringe spektrale ber- Deutliche spektrale lappung berlappung Nominale Berechnete Fehler Konzentration Konzentration in % 1 1 0.9 1.1 - 10 % + 10 % Berechnete Fehler Konzentration in % 0 1.98 - 100 % + 98 %
Substanz x y
Methode der kleinsten Fehlerquadrate
Die Wirkung von statistischem Rauschen kann durch die Verwendung zustzlicher spektraler Informationen reduziert werden. Das heit, zur Quantifizierung wird anstelle eines Datenpunktes eine Serie von Datenpunkten verwendet. In diesem sogenannten berbestimmten System wird eine Kurvenanpassung der Standardspektren an die gemessenen Absorptionswerte zur quantitativen Bestimmung genutzt 5,6. Abbildung 14 zeigt das Spektrum des Zweikomponentengemisches aus Abbildung 13 mit einem statistische Fehler von 10 % an jedem Mepunkt.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Wahr Absorption [AU]
Gemessen
Wellenlnge [nm] Abbildung 14 Spektrum einer Zweikomponentenmischung mit 10 % statistischem Fehler bei jeder Wellen lnge
Bei 21 Datenpunkten (2-nm-Intervalle im Bereich 200240 nm) wird nach Anpassung mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate ein Fehler von < 1 % ermittelt. Der Fehler bei blichen Messungen bei zwei Wellenlngen betrug etwa 100 %, siehe Tabelle 3.
Tabelle 3
Vergleich der Ergebnisse von Mehrkomponentenanalysen aus der Lsung eines simultanen Gleichungssystems und der Methode der kleinsten Fehlerquadrate Verwendung von 210 und 230 nm Nominale Berechnete Kon- Fehler Substanz Konzentration zentration in % x y 1 1 0,0 1,98 - 10 % + 10 % Verwendung des Bereiches von 200240 nm Berechnete Fehler Konzentration in % 1,003 0,995 + 0,3 % - 0,5 %
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Mit dieser Methode wird die Vermessung von komplexeren Mischungen sowie von Mischungen von Substanzen hnlicher Spektren mglich. Die Restwerte der Berechnung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate sind ein guter Indikator der Qualitt der Anpassung der Standardspektren an die Probenspektren und damit auch ein guter Indikator fr die Qualitt der Quantifizierung. Als Beispiel einer Mehrkomponentenanalyse wird die Quantifizierung von fnf Hmoglobinen aus Blut mit minimaler Probenvorbereitung gezeigt.7 Abbildung 15 zeigt die Absorptionsspektren von Hmoglobinderivaten. Dieselbe Analyse wurde zuvor mit unterschiedlichen Methoden durchgefhrt, darunter Spektroskopie und Titration.
Absorption [AU]
Sulfhmoglobin Oxyhmoglobin Carboxyhmoglobin Hmoglobin (pH 7,07,4) Deoxyhmoglobin
Wellenlnge [nm] Abbildung 15 Absorptionsspektren verschiedener Hmoglobinderivate
Andere Methoden
Weitere statistische Methoden in der Mehrkomponentenanalyse umfassen Berechnung der Partiell kleinsten Quadrate (PLS), Analyse der Einzelbeitrge (PCR) und Mehrfache kleinste Fehlerquadrate (MLS).
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Theoretisch bieten diese Methoden einige Vorteile gegenber den oben beschriebenen Methoden, in der Praxis fhrt dies jedoch zu einer weitaus komplexeren Kalibrierungsprozedur. Probenbeschaffenheit Die einfachen gekoppelten Gleichungssysteme und die Methode der kleinsten Fehlerquadrate liefern nur dann exakte Ergebnisse, wenn die Kalibrierung mit reinen Standardlsungen oder Standardmischungen fr jede Substanz in der Probe durchgefhrt wird, die einen Beitrag zum UV-Spektrum liefert. Die unbekannte Probe darf nicht ber eine weitere absorbierende Verbindung verfgen.
Anforderungen an das Die Quantifizierung von Einzelsubstanzen wird normalerMegert weise durchgefhrt, indem auf einem Gert ein oder mehrere Standards, gefolgt von der eigentlichen Probe, vermessen werden. Diese Kalibrierung dient der Eliminierung instrumentell bedingter Fehler, wodurch die absolute Wellenlngen- und photometrische Genauigkeit an Bedeutung verlieren. Auf der anderen Seite ist die photometrische Reproduzierbarkeit zur Erzielung prziser Ergebnisse essentiell. Wenn Messungen nur beim Absorptionsmaximum ausgefhrt werden, ist die Wellenlngenreproduzierbarkeit von geringer Bedeutung, weil die Abweichungen in der Absorption dort gering sind. Wenn jedoch eine Wellenlnge auf einer Flanke genutzt wird, ist die Wellenlngenreproduzierbarkeit entscheidend. Schlielich ist das Linearittsverhalten des Gertes kritisch, weil die Kalibrierung Linearitt voraussetzt. Genaue Analysen von Mehrkomponentenmischungen erfordern ein hervorragendes Signal-Rausch-Verhltnis, besonders wenn die Quantifizierung mit gekoppelten Gleichungen erfolgt. Bei Verwendung der Methode der kleinsten Fehlerquadrate, werden Daten von den Flanken der Absorptionsbanden in der Rechnung bercksichtigt, so da auch hier eine hervorragende Wellenlngenreproduzierbarkeit erforderlich ist. Darberhinaus sind schnelle Scanvorgnge erforderlich, da mehr Daten erfat werden
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Indirekte QuantifizierungChemische Derivatisie- Viele Substanzen zeigen entweder nur schwache oder keine rung Absorption im UV oder im sichtbaren Bereich. Hier kanneine chemische Derivatisierung durchgefhrt werden, wofr bereits viele Methoden entwickelt wurden. Hierbei werden organische Reagenzien eingesetzt, die mit der Analysensubstanz einen Komplex bilden, welcher eine starke Absorption aufweist. Die eigentliche Analyse erfolgt analog der direkten Messung. Bei dieser Methode kann die Wahl eines geeigneten Derivatisierungsreagenzes sowohl die Empfindlichkeit, als auch die Selektivitt erheblich verbessern.
Spektralphoto- Bei volumetrischen Analysen wird die Farbvernderung, die metrische Titrationen den Endpunkt einer Titration definiert, meistens durchBeobachten festgelegt. Eine Beurteilung ist sehr subjektiv und stellt damit eine Fehlerquelle dar. Der Einsatz eines Spektralphotometers zur Endpunkterkennung fhrt in diese Analysen die gewnschte Objektivitt ein und ermglicht die Automatisierung.
Untersuchung von En- Die direkte UV-Vis Analyse einer Substanz in biologischen zymkinetiken Matrizes, z. B. Blut oder Nahrungsmitteln, ist schwierig.Interferenzen durch andere Substanzen machen die direkte Messung einer Substanzeigenschaft, z.B. der Absorption, oft unmglich. Die Abtrennung der interessierenden Substanz kann zeit- und kostenintensiv sein und ist in der Routineanalyse daher unpraktisch. Hier knnen enzymatische Methoden zur indirekten Analytik einer Substanz oder Substanzgruppe aus einer komplexen Matrix eingesetzt werden. Bei sorgfltiger Wahl eines Enzyms kann jede nderung nach Hinzufgen des Enzyms auf die spezifische Reaktion zwischen der Substanz bzw.
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Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie
Substanzgruppe mit dem Enzym zurckgefhrt werden. Diese Selektivitt bildet die Grundlage von Enzymmethoden. Enzymatische Methoden knnen grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die Bestimmung von Reaktionsraten und Endpunktbestimmungen. Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hngt von vielen Faktoren ab, darunter Temperatur, pH, Enzymaktivitt, Enzym- und Substratkonzentration. Wenn alle Parameter auf einem konstanten Level gehalten werden knnen, ist die Reaktionsgeschwindigkeit der Substratkonzentration direkt proportional. In Endpunktbestimmungen werden die Bedingungen so gewhlt, da die Konvertierung von Substrat zu Produkt innerhalb einer bestimmten Zeit abgeschlossen ist (ca. 520 min). Die Differenz aus ursprnglicher und spterer Absorption ist dann der Substratmenge direkt proportional.
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Kapitel 2
Kapitel 2
Apparative Aspekte
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Apparative Aspekte
Im Idealfall liefern analytische Gerte stets korrekte Messungen chemischer oder physikochemischer Parameter. In der Praxis treten, wie berall, Mefehler auf. In diesem Kapitel werden die Grundkomponenten eines Spektralphotometers sowie verschiedene Konfigurationen vorgestellt. Die wichtigsten apparativen Parameter und ihre Bedeutung bei Messungen werden diskutiert.
GertedesignKomponenten Ein Spektralphotometer ist ein Gert zur Messung derTransmission oder der Absorption einer Probe als Funktion der Wellenlnge elektromagnetischer Strahlung. Es besteht aus folgenden Grundkomponenten:8 Eine Lichtquelle zur Erzeugung breitbandiger elektromagnetischer Strahlung Ein Dispersionselement, das aus der breitbandigen Strahlung eine bestimmte Wellenlnge (oder richtiger ein Wellenband) auswhlt Eine Probenzone Ein oder mehrere Detektoren zur Messung von Strahlung
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Apparative Aspekte
Weitere optische Bauteile, wie z. B. Linsen oder Spiegel, leiten das Licht durch das Megert. Lichtquellen Die ideale Lichtquelle emittiert eine konstante Intensitt ber alle Wellenlngen bei geringem Rauschen und hoher Langzeitstabilitt. Eine Lichtquelle mit diesen idealen Eigenschaften existiert nicht. In der UV-Vis-Spektroskopie werden normalerweise folgende zwei Lichtquellen verwendet: Die erste Lichtquelle ist die Deuteriumbogenlampe mit einer guten kontinuierlichen Intensitt im UV- und einer ausreichenden Intensitt im sichtbaren Bereich (siehe Abbildung 16). Obwohl moderne Deuteriumbogenlampen nur geringes Rauschen produzieren, ist das Lampenrauschen meist der limitierende Faktor fr die Leistungsfhigkeit von Gerten hinsichtlich Rauschen. Im Laufe der Zeit nimmt die Intensitt einer Deuteriumbogenlampe stetig ab. Eine solche Lampe hat eine Halbwertzeit (die Zeit, die vergeht, bis die Lampe nur noch die halbe ursprngliche Intensitt aufweist) von ca. 1000h. Die zweite Lichtquelle ist die Wolframhalogenlampe (siehe Abbildung 17) mit guter Intensitt ber Teile des UV-Spektrums und im gesamten sichtbaren Bereich. Dieser Lampentyp weist sehr geringes Rauschen bei geringer Drift auf und verfgt ber eine nutzbare Lebensdauer von 10000h. Die meisten Spektralphotometer nutzen fr Messungen im UV und sichtbaren Bereich beide Lampentypen. Dabei wird entweder zwischen beiden Lichtquellen umgeschaltet oder das Licht beider Lichtquellen so gemischt, da eine breitbandige Lichtquelle entsteht.
Strahlungsintensitt
Wellenlnge [nm] Abbildung 16 Intensittsspektrum der Deuteriumbogenlampe
Strahlungsintensitt
Wellenlnge [nm] Abbildung 17 Intensittsspektrum der Wolframhalogenlampe
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Apparative Aspekte
Strahlungsintensitt
Eine weitere Lichtquelle ist die Xenonlampe (Abbildung 18) mit einem guten Kontinuum ber den gesamten UV und sichtbaren Bereich. Da die gegenwrtig verfgbaren Xenonlampen ein weit hheres Rauschen als Deuterium- oder Wolframlampen erzeugen, werden sie nur fr Anwendungen eingesetzt, die primr eine hohe Intensitt erfordern, wie z.B. fr bestimmte Reflektionsmessungen mit diffuser Strahlung.Wellenlnge [nm]
Abbildung 18 Intensittsspektrum der Xenonlampe
Monochromatoren(a) Prisma
Dispersionselemente spalten die verschiedenen Wellenlngen des Lichtes winkelabhngig auf. In Kombination mit einem Austrittsspalt dienen sie zur Auswahl einer bestimmten Wellenlnge bzw. eines schmalen Wellenbandes aus dem Lichtkontinuum der Quelle. In Spektralphotometern werden dazu hufig Prismen und holografische Gitter eingesetzt. Ein Prisma kann aus dem Sonnenlicht alle Regenbogenfarben erzeugen. Dasselbe Prinzip wird in Spektralphotometern genutzt. Prismen sind einfach und kostengnstig mit dem Nachteil, da die Winkelabhngigkeit der Dispersion nichtlinear ist (siehe Abbildung 19a). Zustzlich ist die Winkelabhngigkeit temperaturabhngig. Aus diesen Grnden werden in den meisten modernen Spektralphotometern holografische Gitter anstelle von Prismen eingesetzt. Sie werden aus Glasrohlingen durch Eingravieren sehr schmaler Vertiefungen hergestellt. Ursprnglich wurde dies mechanisch durchgefhrt, mit modernen Verfahren erfolgt dies in einem optisch-holografischen Proze. Die Dimensionen der Gravuren sind der aufzuspaltenden
(b)
Gitter
Erster ordnung Zweiter Ordnung Abbildung 19 Dispersionselemente
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Apparative Aspekte
Wellenlnge vergleichbar. Schlielich wird eine Aluminiumbeschichtung fr eine hohe Reflexion aufgebracht. Licht wird auf dem Gitter wellenlngenabhngig in unterschiedlichen Winkeln reflektiert. Holografische Gitter zeigen eine lineare Winkelabhngigkeit der Wellenlngen und sind temperaturunabhngig. Sie reflektieren Licht allerdings in verschiedenen Ordnungen, die berlagern knnen (siehe Abbildung 19b). Daher werden Filter eingesetzt, damit nur Licht der gewnschten Reflexionsordnung den Detektor erreicht. Ein konkaves Gitter kann das Licht gleichzeitig aufspalten und fokussieren. Ein Monochromator besteht aus einem Eintrittsspalt, einem Dispersionselement und einem Austrittsspalt. Im Idealfall tritt aus dem Austrittsspalt monochromatisches Licht aus. In der Realitt tritt ein Wellenlngenband aus, das im gnstigen Fall symmetrisch aufgebaut ist. Die Breite dieses Bandes in halber Hhe wird spektrale Gertebandbreite genannt (Instrumental Bandwidth, IBW). Detektoren Ein Detektor ist ein Gert, das ein Lichtsignal in ein elektrisches Signal konvertiert. Im Idealfall soll er eine lineare Response ber einen weiten Bereich, niedriges Rauschen und hohe Empfindlichkeit aufweisen. Spektralphotometer verfgen als Detektor entweder ber einen Photomultiplier oder ber Photodioden. Die Photomultiplierrhre (siehe Abbildung 20) kombiniert eine Signalumwandlung mit mehreren Verstrkungsstufen innerhalb der Rhre. Die natrlichen Eigenschaften des Kathodenmaterials bestimmen die spektrale Intensitt. Ein Photomultiplier zeigt meist eine gute Empfindlichkeit im gesamten UV-Bereich. Solche Detektoren weisen eine hohe Empfindlichkeit bei niedrigen Lichtstrken auf. Bei Anwendungen der analytischen Chemie ist dagegen eine hohe Empfindlichkeit bei niedrigen Konzentrationen, also niedrige Absorption bei hohen Lichtintensitten erforderlich. Zur Detektion geringer Abweichungen zwischen Blank und
Kathode
Anode
Abbildung 20 Die Photomultiplier-Rhre
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Apparative Aspekte
Probe mu ein Detektor daher bei hoher Intensitt ein besonders niedriges Rauschen aufweisen. In wachsendem Umfang werden Photodioden als Detektoren in Spektralphotometern eingesetzt (siehe Abbildung 21). Photodiodendetektoren haben einen greren dynamischen Bereich und sind als Festkrper weitaus robuster als ein Photomultiplier. In einer Photodiode trifft das Licht auf den Halbleiter und macht ihn leitfhig fr Elektronen, wodurch ein der Diode parallel geschalteter Kondensator entladen wird. Die in festen Intervallen zur Nachladung des Kondensators erforderliche Ladungsmenge ist proportional zur eingefallenen Lichtintensitt. ltere Photodioden hatten eine nur geringe Empfindlichkeit im unteren UV-Bereich, aber dieser Nachteil ist in modernen Detektoren ausgerumt. In Siliciumdetektoren liegen die Detektionsgrenzen zwischen 170 und 1100nm.
Metallkontakt
Photon
p-Schicht n-Schicht Abbildung 21 Die Photodiode
Innenzone Goldblock
Einige moderne Spektralphotometer enthalten anstelle eines einzelnen Detektors eine Diodenzeile. Eine Diodenzeile (englisch Diode Array) besteht aus einer Reihe von
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Apparative Aspekte
Photodiodendetektoren, die auf einem Siliciumkristall nebeneinander angeordnet sind. Jede Diode hat einen eigenen Kondensator und ist ber je einen Transistorschalter mit einem Ausgangskabel verbunden (siehe Abbildung 22). Die Transistorschalter werden dabei von einem Schieberegister gesteuert. Alle Kondensatoren sind zu Beginn definiert aufgeladen. Wenn Photonen in das Silicium eintreten, werden freie elektrische Ladungstrger erzeugt, die die Kondensatoren entladen. Alle Kondensatoren werden in regelmigen Intervallen neu geladen, wobei der erforderliche Ladungsstrom fr einen Scanzyklus das Ma fr die Lichtintensitt darstellt.Licht
Photodiode Kondensator Schieberegister Transistor schalter Videoanschlu Auslesereihenfolge Abbildung 22 Schematische Darstellung eines Diodenarrays
Die zur Nachladung eines Kondensators erforderliche Ladungsmenge ist proportional zur Anzahl der Photonen, die auf eine Diode trafen und damit zur Lichtintensitt. Ein Absorptionsspektrum wird durch Messung der Lichtintensitt im gesamten Wellenlngenbereich erhalten. Ein Diodenarray besteht normalerweise aus 200 bis 1000 Elementen. Die genaue Zahl hngt vom Megert und dem vorgesehenen Einsatzzweck ab. So besteht z. B. der
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Apparative Aspekte
Diodenarray des Spektralphotometers Agilent 8453 aus 1024 Elementen, die lichtempfindliche Flche ist ca. 25 0,5 mm gro. Die Auslesezeit betrgt ca. 100ms und entspricht der Belichtungszeit. Die Fertigungstechnik fr Diodenarrays hnelt der fr hochintegrierte Schaltungen. Diodenarrays haben komplexe Strukturen, sind aber, da es sich um Festkrperstrukturen handelt, sehr zuverlssig. Optik Zur Streuung und Bndelung von Licht werden in Megerten sowohl Linsen als auch konkave Spiegel eingesetzt. Linsen sind kostengnstige Bauteile mit dem Nachteil ihrer chromatischen Aberration. Darunter versteht man, da Licht unterschiedlicher Wellenlngen nicht am gleichen Brennpunkt fokussiert wird. Durch sorgfltige Konstruktion und Kombination in ein optisches System kann die chromatische Aberration einzelner Linsen kompensiert werden und aus einfachen und kostengnstigen Bauteilen ein leistungsstarkes System aufgebaut werden. Achromatische Linsen bestehen aus mehreren Linsen verschiedener Glassorten mit unterschiedlichen Refraktionsindices und sind weitgehend frei von chromatischer Aberration. Sie bieten eine hohe Leistungsfhigkeit, sind jedoch relativ teuer. Konkave Spiegel sind in der Herstellung kostengnstiger als achromatische Linsen und weisen keine chromatische Aberration auf. Ihre Aluminiumoberflche korrodiert allerdings leicht, wodurch die Leistungsfhigkeit abnimmt. Jede optische Oberflche, einschlielich der Nahtstellen einer achromatischen Linse, fhrt durch Absorption und Reflexion zu einem 510 %igen Verlust der Lichtintensitt. Spektralphotometer sollten aus diesem Grund mit einem Minimum optischer Oberflchen ausgestattet sein.
Das herkmmliche Abbildung 23 zeigt die Schemazeichnung eines herkmmliSpektralphotometer chen Einstrahlphotometers. Polychromatisches Licht der
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Apparative Aspekte
Lampe wird auf den Eintrittsspalt eines Monochromators fokussiert, der nur ein schmales Lichtband passieren lt. Dieser Lichtstrahl passiert den Probenbereich und gelangt zum Detektor. Die Absorption einer Probe wird bestimmt, indem die Lichtintensitt im Detektor mit und ohne Probe (Blank) gemessen und miteinander verglichen wird. Wie oben ausgefhrt enthalten die meisten Spektralphotometer zwei Lampen als Lichtquellen, eine Deuterium- und eine Wolframlampe, und als Detektoren entweder einen Photomultiplier oder, besonders modernere Gerte, Photodioden.
Probe Monochromator Detektor
Austrittspalt DispersionsElement
Quelle
Eintrittsspalt
Abbildung 23 Schemazeichnung eines herkmmlichen Spektralphotometers
Diese Konstruktion ist zur Absorptionsmessung bei einer einzelnen Wellenlnge des Spektrums gut geeignet. Zur Vermessung verschiedener Stoffe bei unterschiedlichen Wellenlnge oder zur Aufnahme von Spektren ist sie jedoch weniger geeignet. Zur Durchfhrung solcher Aufgaben mit einem herkmmlichen Spektralphotometer mssen Teile des Monochromators gedreht werden. Die erforderliche Mechanik reduziert die Reproduzierbarkeit und die fortlaufende Datenaufnahme ist langsam.
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Apparative Aspekte
Das Diodenarray- In Abbildung 24 ist eine Schemazeichnung eines DiodenarSpektralphotometer ray-Spektralphotometers dargestellt. Das polychromatische Licht aus der Quelle wird durch den Probenbereich geleitet und im Eintrittsspalt eines Polychromators fokussiert. Der Polychromator spaltet den Lichtstrahl auf und leitet ihn auf den Diodenarray. Dort mit jede Diode die Intensitt in einem bestimmten engen Band des Spektrums. Die Bandbreite des von einer Diode detektierten Lichtes hngt von den Dimensionen des Eintrittsspaltes und der Gre der Diode ab. Jede Diode hat diesselbe Funktion wie der Austrittsspalt eines Monochromators.
Diodenarray
Polychromator
Probe
DispersionsElement Eintrittsspalt
Quelle
Abbildung 24 Schemazeichnung eines Diodenarray-Spektralphotometers
Der Polychromator (Eintrittsspalt und Dispersionselement) und der Diodenarray sind baulich in einer Einheit zusammengefat, die als Spektrograph bezeichnet wird. Aufgrund der Vertauschung der Anordnung von Probe und Dispersionselement im Vergleich zu einem konventionellen Gert, wird diese Anordnung oft inverse Optik genannt. Zur Minimierung mglicher photochemischer Reaktionen wird eine Blende (Shutter) eingesetzt, die eine Probe
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Apparative Aspekte
solange vor dem Licht der Lampe schtzt, bis eine Messung ausgefhrt wird. Zur Messung wird die Blende automatisch geffnet, so da der Lichtstrahl durch die Probe auf den Diodenarray fllt. Der Intensittsunterschied zwischen den Messungen mit und ohne Probe wird gem der Erluterungen in Das herkmmliche Spektralphotometer auf Seite 38 gemessen. Ein Diodenarray-Spektralphotometer ist durch seinen Aufbau, der eine parallele Datenaufnahme und elektronisches Auslesen ermglicht, sehr schnell; es weist eine hervorragende Wellenlngenreproduzierbarkeit und eine hohe Zuverlssigkeit auf.
Konfigurationen Kommerziell sind unterschiedliche Konfigurationen vonSpektralphotometern, jeweils mit spezifischen Vor- und Nachteilen erhltlich. Einstrahlgerte Sowohl herkmmliche als auch Diodenarray-Spektralphotometer werden als Einstrahlgerte gebaut. Einstrahlgerte sind kostengnstig; das einfachere optische System mit geringen Intensittsverlusten liefert eine hohe Empfindlichkeit. Referenzspektralphotometer, die von Normungsinstituten, wie z. B. dem National Institute of Standards and Technology (NIST) in den USA oder dem National Physical Laboratory (NPL) in Grobritannien eingesetzt werden, sind Einstrahlgerte. Besonders Diodenarray-Spektralphotometer sind fr die Einstrahlauslegung gut geeignet, weil Spektren sehr schnell erfat werden und das Zeitintervall zwischen der Vermessung von Blank und Probe sehr kurz ist. Zustzlich knnen interne Referenzmessungen vorgesehen werden, um die Folgen einer Lampendrift zu reduzieren (siehe Interne Referenz auf Seite 76). In Abbildung 25 ist das optische System eines modernen Diodenarray-Spektralphotometers, dem Agilent 8453, dargestellt. Die Einstrahlauslegung sorgt fr eine minimale Zahl optischer Komponenten mit einer hervorragenden Durchlssigkeit. Der Diodenarray mit 1024 Elementen ermglicht
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Apparative Aspekte
die Messung im Wellenlngenbereich von 190 bis 1100nm bei guter Auflsung.
Blende Linse Probe Linse Spalt Gitter 1024-ElementDiodenarray Wolframlampe
Deuteriumlampe
Abbildung 25 Aufbau der Optik im Diodenarray-Spektralphotometer Agilent 8453
Zweistrahlgerte
In einem konventionellen Einstrahlspektralphotometer werden Probe und Blank bei einer Wellenlnge nacheinander mit einigen Sekunden Verzgerung gemessen. Die Verzgerung bei der Aufnahme eines Spektrums kann mehrere Minuten betragen. Whrend dieser langen Zeitintervalle kann die Lampendrift zu erheblichen Fehlern fhren. Zweistrahl-Spektralphotometer wurden zur Kompensation dieser Intensittsnderungen der Lampe zwischen Blankund Probenmessungen entwickelt. In dieser Konfiguration wird in der Nhe der Lichtquelle ein Chopper im Lichtweg angeordnet, der zwischen Proben- und Referenzlichtweg umschaltet. Er dreht sich mit einer solchen Geschwindigkeit, da mehrmals pro Sekunde zwischen Blank- und Probemessung umgeschaltet wird. Damit knnen mittel- und langfristige Schwankungen der Lampenintensitt (Drift) kompensiert werden.
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Apparative Aspekte
In Abbildung 26 ist eine Schemazeichnung eines Zweistrahlspektralphotometers dargestellt. Im Vergleich mit Einstrahlgerten weisen Zweistrahlgerte mehr optische Komponenten auf, die den Lichtdurchsatz und die Empfindlichkeit reduzieren. Zur Erzielung hoher Empfindlichkeit sind daher lange Mezeiten erforderlich. Zustzlich kann der kompliziertere mechanische Aufbau zu einer geringeren Zuverlssigkeit fhren.
Monochromator Austrittsspalt Dispersive Einheit Quelle Eintrittsspalt Chopper Detektor
Referenz
Probe
Abbildung 26 Optisches System eines Zweistrahl-Spektralphotometers
Bisher war die hhere Driftstabilitt der Zweistrahlgerte ein Hauptfaktor fr die Konstruktion solcher Hochleistungs-Spektralphotometern. Die neuesten Fortschritte in der Konstruktion von Lampen und Elektronik konnten die Driftstabilitt von Einstrahlgerten steigern und fhrten zu einer Wiederentdeckung dieser Konstruktion. Einstrahlgerte bieten eine hhere Empfindlichkeit und eine leichtere Bedienung, wobei die Drift normalerweise nur noch um einen Faktor zwei schlechter ist, als bei Zweistrahlgerten. Das erste kommerziell erhltliche Diodenarray-Spektralphotometer, das HP 8450A war ein Mehrstrahlgert (siehe Abbildung 27). Ein Strahlenleiter wurde zur wechselweisen
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Apparative Aspekte
Ausrichtung des Strahls in eine Referenz und vier Probenpositionen verwendet, aus Grnden der bersichtlichkeit ist in der Abbildung nur eine eingezeichnet.
Lampe, sichtbares Licht UV-Lampe Elliptischer spiegel Referenzkvette
Umlenkspiegel
Umlenkspiegel
UV
ElliptischeSpiegel
Oberer Strahlleitspiegel Probenkvette
Sichtbar Holographisches Spektrographspalt und Gitter Diodenarrays Umlenkspiegel Unterer Strahlleitspiegel
Abbildung 27 Optisches System des Diodenarray-Spektralphotometers HP 8450A
Design mit Strahlteiler
Spektralphotometer mit einem Strahlteiler (siehe Abbildung 28) hneln dem Zweistrahlphotometer, wobei anstelle des Choppers ein Strahlteiler eingesetzt wird, der das Licht simultan durch Blank und Probe auf zwei identische Detektoren leitet. Diese Konstruktion erlaubt die zeitgleiche Vermessung von Blank und Probe. Obwohl die Konstruktion mit Strahlenteiler einfacher als bei echten Zweistrahlgerten ist und weniger optische Baugruppen erforderlich sind, wird durch die Verwendung zweier unabhngiger Detektoren eine neue potentielle Quelle fr Drift eingefhrt.
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Apparative Aspekte
Monochromator Austrittsspalt Dispersionselement Quelle Eintrittsspalt
Referenz
Detektor
Probe
Detektor
Abbildung 28 Optisches System eines Spektralphotometers mit Strahlteiler
Mit dieser Konstruktion kann eine hohe Stabilitt erreicht werden. Aufgrund der zwei Detektoren ist sie im Vergleich zu einem Zweistrahlgert jedoch schlechter, da jeder Detektor unabhngig driften kann. Das Rauschen ist gering, jedoch grer als bei einem Einstrahlgert, da der Strahl aufgeteilt wird und weniger als 100% der Lichtintensitt die Probe passieren. Dual-Wellenlngen Design Zweiwellenlngen-Spektralphotometer ermglichen die simultane Messung bei zwei Wellenlngen, wobei z. B. gleichzeitig zwei Reaktionen in Lsung verfolgt werden knnen. Der Monochromator enthlt zwei Dispersionselemente (er wird damit zum Duochromator), dessen Ausgang in einem einzigen Lichtstrahl vereinigt wird. Solch komplexe Megerte sind normalerweise sehr viel kostspieliger als herkmmliche Spektralphotometer und wurden fast vollstndig von Diodenarray-Spektralphotometer ersetzt, die echte Multi-Wellenlngegerte darstellen.
Messung eines Spek- Die quantitative Interaktion einer Probe mit Strahlung wird trums durch die Messung der ursprnglichen Intensitt ohne
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Apparative Aspekte
Probe und der Intensitt hinter der Probe bestimmt und zwar sowohl in Transmission als auch in Absorption. Diese Intensitten werden in den Gleichungen Transmission und Absorption auf Seite 6 Io und I genannt. In der UV-Vis-Spektroskopie werden die meisten Proben in Lsung vermessen. Dabei ist ein Blank in einer Kvette zu messen, die nur das reine Lsungsmittel enthlt, das auch fr die Probenzubereitung verwendet wurde. In Einstrahlgerten wird die Kvette mit dem Lsungsmittel ins Spektralphotometer eingesetzt und ein Blank gemessen. Die Probenlsung wird danach in derselben Kvette vermessen. Moderne Megerte speichern dabei die IoReferenzwerte automatisch, die zur Berechnung des Absorptionswertes der Probe bentigt werden. In Zweistrahlgerten oder solchen mit Strahlenteiler werden zwei Kvetten eingesetzt. Beide Kvetten werden zunchst mit reinem Lsungsmittel befllt und eine sogenannte Balance-Messung durchgefhrt. Mit dieser Messung wird der Absorptionsunterschied in den beiden Lichtwegen ermittelt. Die Probenkvette wird dann mit Probenlsung befllt und Io und I werden praktisch gleichzeitig gemessen. Das dabei gewonnene Spektrum wird dann mit dem Balance-Spektrum korrigiert.
Grundparameter der Megerte
In diesem Abschnitt werden wir einige Gerteparameter diskutieren, die sich auf Genauigkeit und Przision der gemessenen Absorptionswerte auswirken (in Anhang A finden Sie die Definitionen von Richtigkeit und Przision). Fehlerquellen aus dem Bereich der Probenhandhabung werden in Kapitel 3 Probenhandhabung und Messung besprochen.
Spektrale Auflsung Die Spektrale Auflsung ist das Ma fr die Fhigkeit desMegertes zwischen zwei benachbarten Wellenlngen zu unterscheiden. Zwei Wellenlngen werden normalerweise
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Apparative Aspekte
dann als aufgelst bezeichnet, wenn das Minimum zwischen zwei Peaks im Ausgangssignal des Detektors weniger als 80% des Maximalwertes betrgt. Diese Bedingung ist unter der Bezeichnung Rayleigh-Kriterium bekannt. In Abbildung 29 wird schematisch dargestellt, wie sich zwei eng benachbarte Emissionslinien im Gerteeingang und der Signalausgang des Detektors unterscheiden.Detektorausgangssignal
Intensitt
Wellenlnge Abbildung 29 Zur Definition der spektralen Auflsung
Wellenlnge
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Apparative Aspekte
Absorption I
Die Auflsung ist eng an die spektrale Gertebandbreite gekoppelt (Instrumental Spectral Bandwidth, SBW). SBW ist als die Breite in halber Hhe der maximalen Intensitt des Lichtbandes definiert, das den Monochromator verlt (siehe Abbildung 30).
0.5 I
SBW
Wellenlnge
Abbildung 30 Spektrale Gertebandbreite (Instrumental spectral bandwidth, SBW)
Absorption
Die Genauigkeit jeder gemessenen Absorption hngt vom Verhltnis der SBW zur Natrlichen Bandbreite (Natural Bandwidth, NBW) der absorbierenden Substanz ab. Mit NBW wird die Breite einer Absorptionsbande in halber Hhe der Gesamthhe der Absorptionsbande verstanden (siehe Abbildung 31).
NBW
Wellenlnge
Abbildung 31 Natrliche spektrale Bandbreite (Natural Bandwidth, NBW)
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Apparative Aspekte
Ein Verhltnis von SBW/NBW von 0,1 oder weniger ermglicht Absorptionsmessungen mit einer Genauigkeit von 99,5% oder besser 8,9. Bei einem Verhltnis von SBW/NBW hher als 0,1 wird das gemessene Spektrum zunehmend verzerrt, wie in Abbildung 32 dargestellt. Banden werden nicht richtig aufgelst und in der Absorptionsmessung entstehen bei den meisten Wellenlngen erhebliche Fehler. Die SBW ist primr eine Funktion der Eintritts- und Austrittsspaltbreiten des Monochromators und der Aufspaltung am Gitter. Auflsungen von 0,5, 0,2 und 0,1nm sind nicht ungewhnlich. Aber hhere Auflsungen fhren zu einer merklichen Verschlechterung des Signal-Rausch-Verhltnisses 10.Wellenlnge
Abbildung 32 Einflu verschiedener SBW auf die gemessene Bandenform
Absorption
Originalspektrum
Datenaufnahme Absorption Digitalisiertes Spektrum
In modernen Spektralphotometern wirkt sich das Abtastintervall zur Digitalisierung des Spektrums, erforderlich zur Speicherung und Auswertung im Computer, ebenfalls auf die Auflsung aus. In Diodenarray-Spektralphotometern erfolgt die Digitalisierung jedoch direkt auf den Diodenarray. Dieser Effekt wird in Abbildung 33 dargestellt. Wenn die Abtastintervalle im Vergleich zur SBW lang sind, wir die Auflsung des Megertes nicht ausgenutzt. Kleinere Abtastintervalle verbessern die Auflsung, erzeugen aber grere Datendateien, die viel unhandlicher sind. In der Praxis ist eine Abtastintervallrate gleich oder ein wenig kleiner als die SBW am besten. Bei der Formulierung von Anforderungen an ein Megert ist die erforderliche Auflsung besonders wichtig. Wie in Kapitel 1 Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie erlutert, sind die Absorptionsbanden im UV-Vis-Bereich in der Regel ziemlich breit, besonders bei Proben in Lsung. Fr ca. 99% aller Routinemessungen ist
Absorption
Wellenlnge Abbildung 33 Einflu der digitalen Datenaufnahme
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Apparative Aspekte
eine SBW von 2 nm mehr als ausreichend fr die Durchfhrung von Absorptionsmessungen mit Banden einer NBW von 20 nm oder mehr. Wenn ein Megert mit einer SBW von 2 nm zur Messung von Proben mit einer NBW von weniger als 20 nm verwendet wird (Beispiel Benzol) entsteht ein Fehler bei der Bestimmug der absoluten Absorption. Mit abnehmender NBW nimmt dieser Fehler zu (siehe Abbildung 32). Fr Absolutmessungen der Absorption ist daher ein Megert mit einer schmaleren SBW erforderlich. Die meisten UV-Vis-Anwendungen dienen der quantitativen Bestimmung, die im allgemeinen auf Relativmessungen beruhen, z.B. von der Absorption einer unbekannten Konzentration und der eines Standards. Eine Kalibrierung unter Verwendung von Standardlsungen, die die Konzentration der unbekannten Probe umschliet, liefert daher genaue quantitative Ergebnisse, auch fr sehr schmale Bandbreiten.
Wellenlngenrichtig- Der Unterschied zwischen der Wellenlngenrichtigkeit und keit und -przision der Wellenlngenprzision fhrt oft zu Unklarheiten. InAnhang A wird der Unterschied zwischen Richtigkeit und Przision erklrt. Die Wellenlngenrichtigkeit ist beim Vergleich von Meergebnissen von verschiedenen Megerten entscheidend. Beim Vergleich von UV-Vis Analysen desselben Megertes ist die Wellenlngenprzision, ein Ma fr die Qualitt von Wiederholungsmessungen, am wichtigsten. In Abbildung 34 wird die Wirkung einer schlechten Reproduzierbarkeit der Wellenlnge erlutert. Wenn fr quantitative Messungen eine Wellenlnge im Absorptionsmaximum gewhlt wird, hat die Reproduzierbarkeit bei dieser Wellenlnge einen nur geringen Einflu auf die gemessene Absorption. Mit dieser Methode werden die am besten reprodzierbaren Ergebnisse erzielt. Auf der anderen Seite fhrt die Wahl einer Wellenlnge auf der Flanke einer Absorptionsbande mit derselben Reproduzierbarkeit zu erheblichen Fehlern in der Absorptionsmessung. In diesem
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Apparative Aspekte
Fall knnen quantitative Meergebnisse unzuverlssig ausfallen.
Fehler = 0.0 AU Absorption [AU]
Fehler = 0.1 AU (10 %)
Wellenlnge [nm] Abbildung 34 Folgen einer schlechten Reproduzierbarkeit der Wellenlnge
Viele Lehrbcher der UV-Vis-Spektroskopie betonen, da zur Erzielung einer exakten Quantifizierung die Mewellenlnge im Absorptionsmaximum liegen sollte, obwohl bei anderen Wellenlngen eine hher Selektivitt erzielbar sein kann. Diese Lehrbcher beziehen sich jedoch meist auf konventionelle mechanisch scannende Gerte und nicht auf Diodenarray-Gerte, die praktisch eine exakte Wellenlngenreproduzierbarkeit aufweisen.
Photometrische Rich- Unter der Voraussetzung eines guten optischen und elektrotigkeit und Przision nischen Designs, werden die photometrische Richtigkeitund Przision nur von den beiden Faktoren Streulicht und Rauschen beeintrchtigt. Streulicht Streulicht ist als das detektierte Licht einer beliebigen Wellenlnge definiert, das auerhalb der Bandbreite der gewhlten Wellenlnge liegt. Die Formel zur Berechnung von Transmission und Absorption dafr lautet:
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Apparative Aspekte
T = ( I + Is ) ( Io + Is )Dabei ist T die Transmission, Io die Intensitt des einfallenden, I die des durchgelassenen Lichtes und Is die des Streulichtes. Die Intensitt des Streulichtes hngt normalerweise nicht von der durchgelassenen Lichtmenge ab. Wenn Is annhrend konstant ist, wird es dann dominant, wenn I klein wird. Bei hohen Absorptionen fhrt Streulicht zu einem negativen Einflu auf die Response des Megertes und stellt eventuell den begrenzenden Faktor fr die Absorption und folglich fr die mebare Konzentration dar. Die photometrische Richtigkeit des Megertes wird beeintrchtigt. In Abbildung 35 wird die Wirkung verschieden intensiven Streulichtes auf die Absorption mit der tatschlichen Absorption verglichen.
Gemessene Absorption [AU]
0.00 % Streulicht 0.01 % Streulicht 0.10 % Streulicht 1.00 % Streulicht
Wahre Absorption [AU] Abbildung 35 Wirkung von Streulicht auf die gemessene Absorption einer Probe
Rauschen
In einem Spektralphotometer finden sich typischerweise zwei Rauschquellen. Die erste ist der Beitrag statistisch emittierter Photonen aus der Lichtquelle (Photonen- oder
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Apparative Aspekte
Schottrauschen). Es ist proportional der Quadratwurzel der Lichtintensitt. Bei der Messung niedrig konzentrierter Proben mit geringer Absorption kann damit eine genaue Messung kleiner Differenzen zwischen zwei hohen Intensitten verhindert werden. Die zweite Quelle ist das Eigenrauschen der Elektronik des Megertes (Detektorverstrker, Analog-Digital Konverter usw.) und hngt von der gemessenen Intensitt ab. Diese Quelle wird bei hohen Absorptionen entscheidend, wo das Signal hinter der Probe klein ist. Sie kann durch gutes Gertedesign minimiert werden. Rauschen wirkt sich auf die Przision der Messungen negativ aus und reduziert bei Einzelmessungen die Richtigkeit. Der Einflu des Rauschens kann jedoch durch lngere Mezeiten reduziert werden (siehe Zeitliche Mittelwertbildung auf Seite 68).
Linearer dynamischer Eine hufig zitierte und oft falsch verstandene GertespeziBereich fikation ist der Mebereich. In den meisten Fllen ist dernumerische Bereich, den ein Megert anzeigen kann, gemeint. Eine weit ntzlichere Definition ist der lineare dynamische Mebereich. Er nennt bei einer festgelegten maximalen Abweichung von der Linearitt (prozentual oder in Absorptionswerten) die minimal und maximal erzielbaren Absorptionswerte. Mgliche Fehler bei verschiedenen Absorptionswerten knnen aus Streulicht und Rauschen berechnet werden. Damit entspricht der Fehler durch Streulicht (in %)
( A t A m ) ( A t 100 )Dabei ist At die wahre Absorption und Am die gemessene Absorption.
At = log ( I I o ) Am = log [ ( I + I s ) ( I o + I s ) ]
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Apparative Aspekte
Dabei ist Io die ursprngliche Lichtintensitt, I die durchgelassene Intensitt und Is die Streulichtintensitt. In Abbildung 35 wird eine auf Streulicht zurckgehende Fehlerkurve dargestellt. Zustzlich kann die gemessene Absorption durch das Gerterauschen fehlerbehaftet sein. Damit entspricht der Fehler (in %):
( A t A m ) ( A t 100 )mit und oder
A t = log ( l l o ) A m = A t + T 100 A pn + A en Am = T 100 A pn A en,
wobei Apn das Photonenrauschen in AU (Absorptionseinheiten), Aen das elektronische Rauschen in AU und T die prozentuale Transmission ist. Der Gesamtfehler besteht bei jeder Absorption aus der Summe der Fehler von Streulicht und Rauschen. In Abbildung 36 wird der Gesamtfehler bei einem Photonenrauschen von 0.0004 AU und einem Elektronikrauschen von 0.0001 AU dargestellt. Die Auftragung verdeutlicht, da Absorptionsmessungen im Bereich von ca. 0,3 bis 1,0 AU die hchste Richtigkeit und Przision aufweisen. Der dynamische Bereich des Megertes kann aus dem maximal zulssigen Mefehler errechnet werden.
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Apparative Aspekte
Fehler in %
Fehlerkurve durch Streulicht Fehlerkurve durch Streulicht + Rauschen Fehlerkurve durch Streulicht Rauschen
Absorption [AU] Abbildung 36 Theoretische Fehler der Absorption gegen die Absorption
Drift Eine weitere potentielle Fehlerquelle in der Photometrie istdie Drift. Drift entsteht normalerweise durch schwankende Lampenintensitten whrend der Messung von Io und I. Auch die Meelektronik kann Drift erzeugen. Ein gutes Gertedesign minimiert die Drift, doch kann hierdurch die Richtigkeit der Ergebnisse reduziert werden, besonders bei zeitaufwendigen Messungen (siehe Abbildung 37). Bei Multiwellenlngendaten kann das Problem der Drift durch Einsatz von Verfahren wie der Internen Referenzmessung (siehe Interne Referenz auf Seite 76) minimiert werden.
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Apparative Aspekte
Error Absorption [AU]
Wellenlnge [nm] Abbildung 37 Wirkung von Drift auf gemessene Absorptionswerte
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Kapitel 3
Kapitel 3
Probenhandhabung und Messung
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Probenhandhabung und Messung
Bei guter Vorbereitung und richtiger Bedienung eines Spektralphotometer bleibt als grte Fehlerquelle der UV-Vis-Spektroskopie die Probenhandhabung einschlielich chemischer Reaktionen der Probe. In diesem Kapitel werden verschiedene Fehlerquellen und deren Vermeidung diskutiert.
Flssige ProbenKvetten UV-Vis-Spektroskopie wird berwiegend zur Vermessungvon Flssigkeiten oder Lsungen eingesetzt. Dies ist einfacher und erzielt genauere quantitative Ergebnisse, als Reflektionsmessungen auf Festkrperoberflchen. Bei dieser Technik mu eine Kvette die Flssigkeit oder Lsung im Probenbereich des Spektralphotometers enthalten. Material Im Idealfall ist eine Kvette bei allen Wellenlngen total transparent. Jede Absorption der Kvette selbst reduziert den nutzbaren linearen dynamischen Mebereich. Wenn z. B. die Obergrenze des linearen Mebereichs bei einem Megert 2,5AU ist und die Kvette eine Eigenabsorption von 1AU aufweist, liegt der verbleibende nutzbare Mebereich zwischen 1,0 und 2,5AU und betrgt somit nur noch 1,5AU. Die billigsten Kvetten werden aus Polymerwerkstoffen hergestellt, meist aus Acryl. Diese Kvetten sind nicht gegenber allen Lsungsmitteln bestndig und weisen unterhalb von 300nm eine starke Absorption auf, womit sie
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Probenhandhabung und Messung
in diesem Bereich nicht genutzt werden knnen. Von Kvette zu Kvette knnen, je nach Hersteller, Unterschiede in der optischen Schichtdicke und der Eigenabsorption auftreten. Glaskvetten sind ein wenig teurer als Kunststoffkvetten, jedoch dauerhafter und knnen bei pfleglicher Behandlung ber Jahre verwendet werden. Glas absorbiert unterhalb von 320 nm und eignet sich daher nicht fr Messungen in diesem Bereich. Quarzkvetten sind bis zu Wellenlngen von 210nm ausreichend transparent. Die besten Kvetten werden aus hochreinem synthetischem Silizium gewonnen und sind bis 190nm ausreichend durchlssig. In Abbildung 38 sind die Absorptionscharakteristika fr verschiedene Materialien dargestellt, die fr optische Kvetten verwendet werden. Bitte beachten Sie, da alle Materialien bei allen Wellenlngen mindestens ca. 10% Verlust an Transmission aufweisen.
Silizium Transmission [%]
Quarz
Acrylkunststoff
Glas
Optisches Glas Wellenlnge [nm] Abbildung 38 Transmissionseigenschaften verschiedener Kvettenmaterialien
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Probenhandhabung und Messung
Kvettentypen
Von der Vielzahl verfgbarer Kvetten werden hier nur die wichtigsten beschrieben. Die meistgenutzte Kvette ist die oben offene rechteckige Kvette (siehe Abbildung 39a). Sie sind mit optischen Schichtdicken von 1 bis 100mm erhltlich, die meist genutzte Schichtdicke ist 10mm. Fast alle rechteckigen Kvetten weisen eine Auenbreite von 12,5mm auf. Bei knappem Probenvolumen kommen auch verengte Kvetten zum Einsatz (siehe Abbildung 39b). Bei sehr knappem Probenvolumen knnen Mikrokvetten eingesetzt werden, die sehr kleine Querschnitte im Probenbereich von 2 bis 2,5mm aufweisen, siehe Abbildung 40a. Hier sind oft nur ca. 60l Probe fr eine Messung erforderlich. In speziellen Ultramikrokvetten knnen Probenvolumina von nur 5l vermessen werden. Fr automatisierte Messungen werden Durchfluzellen gem Abbildung 40b) verwendet. Moderne Zellen weisen Probenzuleitungen mit Schraubfittings auf. Durchfluzellen sind ebenfalls mit verschiedenen Aperturgren, Geometrien und optischen Schichtdicken verfgbar. Bei Kvetten mit Apertur und Mikrokvetten treten Lichtverluste auf, die Tranmission wird reduziert und die Empfindlichkeit wird beeintrchtigt. Der Verlust an