UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu...
Transcript of UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu...
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Domagoj Đikić
UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH
BIOMARKERA U MIŠA
Zagreb, 2006.
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Domagoj Đikić
UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH
BIOMARKERA U MIŠA
Doktorska disertacija predložena
Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu Radi stjecanja akademskog stupnja
doktora prirodnih znanosti
Zagreb, 2006.
Ova disertacija izrađena je u Zavodu za animalnu fiziologiju, Biološkog odsjeka,
Prirodoslovno matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom
Prof.dr.sc. Oskara P. Springera u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog studija
pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u
Zagrebu.
Zahvaljujem voditelju i svima koji su pomogli u izvedbi disertacije.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Doktorska disertacija Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek
UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE
SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH BIOMARKERA U MIŠA
Domagoj Đikić
Zavod za animalnu fiziologiju Biološki odsjek PMF
Rooseveltov trg 6 10 000 Zagreb
Sažetak: S-Triazinski herbicid prometrin relativno je postojan u okolišu i ljudskoj hrani u kojeg dolazi nakon zaštite nasada. Cilj disertacije je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo) mjereći najsuptilnije pokazatelje oštećenja stanica, te odrediti najranije pokazatelje smrti, dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) pojedinih stanica u vitalnim organima, nakon subkronične izloženosti različitim dozama. Proporcionalno s dozom povećava se serumska aktivnost LDH, y-GT, AlP, smanjuje se koncentracija kreatinina, a vrlo blago ali značajno raste aktivnost AST i nešto manje aktivnost ALT. De Ritiusov se koeficijent s dozom ne mijenja bitno. Rezultati analize komet testa pokazuju oštećenja integriteta stanične DNA, karakterizirane povećanom lomljivošću molekule sa porastom doze. Do hiperplazije i infiltracije imunokompetentnih stanica dolazi u tankom crijevu, poprečno-prugastom mišićju i slezeni. Protočna citometrija pokazuje da najmanje doze više podstiću apoptozu a najveće doze nekrozu u stanica limfnog čvora i u timocita. Zaključno moglo bi se govoriti o prometrinu kao o otrovu koji ima imunotoksični, hematotoksični, hepatotoksični, nefrotoksični, genotoksični i nadasve miotoksični učinak i mjenja metaboličnu ravnotežu u animalnom organizmu.
Stranica: 240, slika: 119, tablica 41 , literaturnih navoda: 160 , jezik izvornika: hrvatski Rad je pohranjen u Nacionalnoj sveučilišnoj biblioteci Mentor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Ocjenjivači: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić
Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc
Ključne riječi: prometrin, LDH, AlP, kreatinin, AST, ALT, klinička kemija, protočna citometrija, annexinV-FITC, komet-tehnika, enzimatska histopatologija, toksikologija. Tema prihvaćena;08. 02. 2006.
BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Doctoral thesis Faculty of Science Department of Biology
THE EFFECT OF PROMETRINE ON SERUM AND
TISSUE ENZYME BIOMARCERS IN MICE
Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju
Biološki odsjek PMF Rooseveltov trg 6
10 000 Zagreb
Abstract: Prometryn, an S-Triazine herbicide is relativly persistent in human food and enviroment after crop protection use. Thesis aim to demonstrate what toxic and pathophysiologic effects prometryn has on physiology of vital organ functions (in vivo) by mesurng the suptile changes of cell dammage and first signs of apoptotic and necrotic death. We demonstrated dynamic and strength of dammage after subchronic exposure to various doses of prometrye. LDH, y-GT, AlP activity rises in a dose dependent manner, creatinine contcentration lowers, AST and ALT rises rather slowly. De Ritis ratio is slaightly changed. Comet-assay analysis shows DNA dammage in peripheral blood cells. DNA is fragile as the doses are higher. Immune response is noted in gut, sceletal muscle and spleen. Flow cytometry shows that lower doses induce apoptotic changes and higher doses necrotic changes in lymph nodes and thymus. Prometryn could be characterized as a potentialy immunotoxic, haematotoxic, hepatotoxic, nephrotoxic, genotoxic and especially myotoxic pesticide that can change metabolic homeostasis in an animal organism.
Pages: 240, figures: 119 , tables 41 , references: 160, original in Croatian Thesis deposited in National University library Supervisor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Reviewers: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić
Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc
Key words: prometrine, LDH, AlP, creatinin, AST, ALT, clinical chemistry, flow cytometry, annexinV-FITC, comet assay, enzymatic histopathology, toxicology. Thesis accepted; 08. 02. 2006.
POPIS KRATICA: ADI – engl. Aceptable Daily Intake, dnevno prihvatljiva doza unosa tvari u organizam Alp – Alkalna fosfataza ALT – Alanil aminotransferaza AST – Aspartat aminotransferaza B6C3F1 - soj laboratorijskih miševa BALB/C – soj laboratorijskih miševa BSA – engl. Bovine Serum Albumin, Albumin iz goveđeg seruma C57BL - soj laboratorijskih miševa CBA T6T6 - soj laboratorijskih miševa CD1 - soj laboratorijskih miševa CNS – engl. Central Nervous System CK – Kreatinin fosfokinaza CRP – C reaktivni protein CYP450 – citokrom P 450 enzimi DAPI – fluorescencijska boja za mikroskopiju i protočnu citometriju DKS – diferencijalna krvna slika DMF – dimetil formaldehid DNA – DNK EDTA – etilene diamin tetraoctena kiselina ELISA- engl. Enzyme-linked Immunoasorbent Assay EPA – engl. Enviromental Protection Agency EST – esteraza FDA – engl. Food and Drug Administration FITC – fluorokromska boja u protočnoj citometriji FMO – flavin monooksigenaze GALT- engl. Gut Assotiated Lymphatic Tissue GGT – gama glutamil transferaza yGT – isto kao GGT GOT – sinonim za AST HE – hemalaun eozinsko bojenje HMGCoA – hidroksi-metil-glutaril-koenzim A, jako hipolipidemičko sredstvo HPLC – visokotlačna kromatografija ICR - soj laboratorijskih miševa kD – kilo Daltona KF- kisela fosfataza
LD 50 –doza otrova koja usmrćuje 50% ispitivne populacije LDH – laktat-dehidrogenaza LH – luteinizirajući hormon LOEL – engl. Lowest Observable Efecte Level MALT – engl. Mucose Assotiated Lymphatic Tissue NOAEL – engl. No Observed Effect Level OTM – engl. Olive Tail Moment P-450 – citokromatski enzim monooksigenaza u biotransformaciji otrova PAI-B3AG8I – soj stanica mišjeg mijeloma PAS – engl. Periodic Acid Schiff, bojenje PBS – engl. Phosphate Buffer Saline PI – propidij jodid ppm – engl. Parts Per Million RfD – engl. Reference Dose SD – standardna devijacija ScDH- Sukcinat dehidrogenaza Swiss – soj laboratorijskih miševa T3 – trijodtironin T4 – tiroksin TLC – tankoslojana kromatografija U/L – internacionalna jedinica aktivnosti enzima po litri Y59 – rijedak, gotovo izumrli laboratorijski soj štakora WHO – engl. World Health Organization
SADRŽAJ
1 UVOD.......................................................................................................1
2 LITERATURNI PREGLED....................................................................4
2.1 HERBICIDI...............................................................................................................5
2.2 TRIAZINSKI HERBICIDI...............................................................................................................6
2.3 OPĆA SVOJSTVA PROMERINA............................................................................................................8
2.3.1 PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU...............................................................................................................10
2.3.1.1 Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi......................................................................................................................10
2.3.1.2 Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za mikroorganizme...................................................................................................10
2.3.2 NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE...........................................................................................................11
2.4 TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA.............................................................................................................14
2.4.1 UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŠNJAKA I BESKRALJEŠNJAKA…………………………………………………………..…..……14
2.4.2 OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA.......................................................................................................15
2.4.3 IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETRINA……………………………..…… 16
2.4.4 UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA............................................................................................................17
2.4.5 UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST…………………………………………………………………....18
2.4.6 METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU)...........................................................................................................19
2.4.7 ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA...............................................................................................................22
2.4.7.1 Laktat dehidrogenaza (LDH)..................................................................................................................22
2.4.7.2 Gama glutamil transferaza (GGT)......................................................................35
2.4.7.3 Alkalna fosfataza (ALP)......................................................................................40
2.4.7.4 Kreatinin i kreatinin fosfokinaza (CK).....................................................................................................................45
2.4.7.5 Alanin aminotransferaza (ALT)...........................................................................49
2.4.7.6 Aspartat aminotransferaza (AST)........................................................................53
2.4.8 METODA KOMET TESTA U PROCJENI TOKSIČNOSTI NOKSI....................................................................................................................56
2.4.8.1 Apoptoza i nekroza..............................................................................................58
3 MATERIJALI I METODE
3.1 POKUSNE ŽIVOTINJE..........................................................................................62
3.2 PLAN POKUSA I NAČIN APLIKACIJE POJEDINIH DOZA PROMETRINA........................................................................................................64
3.3 ODREĐIVANJE TJELESNE TEŽINE POKUSNIH ŽIVOTINJA ..................................................................................................................................66
3.4 ANALIZA SERUMSKIH ENZIMA SPEKTROFOTOMETRIJOM.................................................................................66
3.5 ANALIZA PERIFERNE KRVI..............................................................................70
3.5.1 ODREĐIVANJE BROJA ERITROCITA I LEUKOCITA.........................................................................................................70
3.5.2 DIFERENCIJALNA KRVNA SLIKA (DKS)……………………………………………………………………….…….……....70
3.6 ANALIZA LIMFOHEMATOPOETSKIH ORGANA...........................................71
3.7 KOMET TEHNIKA LEUKOCITA PERIFERNE KRVI......................................71
3.8 METODA PROTOČNE CITOMETRIJE..............................................................73
3.9 STATISTIČKA OBRADA PODATAKA............................................................................................................74
3.10 HISTOPATOLOGIJA..............................................................................................75
3.11 ENZIMATSKOHISTOKEMIJSKE REAKCIJE NA TKIVA.....................................................................................................................80
3.12 GLICERIN ŽELATINA I UKLOP PREPARATA.................................................82
4 REZULTATI
4.1 PREŽIVLJAVANJE................................................................................................84
4.2 REZULTATI MJERENJA AKTIVNOSTI SERUMSKIH ENZIMA ..................................................................................................................................86
4.3 KORELACIJE I REGRESIJE ENZIMA...............................................................102
4.4 REZULTATI KOMET TEHNIKE........................................................................130
4.4.1 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 14. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU…………………………………………………………………….…...130
4.4.2 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 28. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU………………………….………………………………………….......140
4.5 UČINAK PROMETRINA NA BROJ ERITROCITA I LEUKOCITA U PERIFERNOJ KRVI..............................................................................................150
4.6 UČINAK PROMETRINA NA DIFERENCIJALNU KRVNU SLIKU (DKS).....................................................................................................................153
4.7 UČINAK PROMETRINA NA STANIČNOST KOŠTANE MOŽDINE.............................................................................................................156
4.8 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST TIMUSA.................................................................................................................156
4.8.1 UČINAK PROMETRINA NA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST TIMOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM.................................................................................................156
4.9 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU, BROJ STANICA I HISTOLOŠKE PROMJENE SLEZENE...............................................................................................................157
4.9.1 UČINAK PROMETRINA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST SPLENOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM................................................................................................161
4.10 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST LIMFNOG ČVORA (BRAHIJALNOG).................................................................................................161
4.11 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKE PROMJENE JETRE....................................................................................................................177
4.12 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKU SLIKU BUBREGA............................................................................................................186
4.13 UČINAK PROMETRINA NA PROBAVNI SUSTAV................................................................................................................187
4.14 UČINAK PROMETRINA NA MOZAK..............................................................190
4.15 UČINAK PROMETRINA NA POPREČNOPRUGASTO MIŠIĆNO TKIVO...................................................................................................................194
5 RASPRAVA..........................................................................................199
6 ZAKLJUČAK.......................................................................................219
7 CITIRANA LITERATURA......................................................................................222
8 ŽIVOTOPIS..........................................................................................237
1. UVOD
1. UVOD
Porast broja svjetskog stanovništva zahtjeva i razmjerno veću proizvodnju hrane stoga
se u modernoj poljoprivredi i dalje nužno koriste kemijska sredstva za zaštitu bilja nakon
čega mnogi njihovi ostaci završavaju u okolišu i hrani, štetno djelujući na ne ciljne vrste pa
i čovjeka (Beard 2005, Glavač 1999, Walker 2001, Wallace-Hayes i sur. 2000). Velika
skupina okolišnih kemikalija za zaštitu bilja su herbicidi. To su spojevi organskog ili
anorganskog porijekla koji služe za uništenje biljaka (lat. herba = biljka, caedere = uništiti).
S obzirom da je prometrin relativno postojan (sedamdeset i dva dana ali ponekad i do tri
godine ovisno o uvjetima okoliša), i može se detektirati u značajnijim koncentracijama u
okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije a kako se upotrebljava za suzbijanje
jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u nasadima pamuka, lana ali i celera,
graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni
konzument čovjek, smatrali smo potrebnim provesti toksikološki pokus s prometrinom na
animalnom modelu (Bardalaye i sur., 1985, Berg i Müller, 1995, Böcher i sur., 1992,
Böcher i Sorensen 1994, Gabrilevskaia i sur., 1972, Kamrin i sur., 2000, Raszyk 1986,
Svobodova i sur., 1995.).
Pregledom do danas nama dostupne literature, uočeno je da je publicirano relativno malo
toksikoloških i ekotoksikoloških radova o prometrinu vjerojatno stoga jer je većina
znanstvenika godinama naglasak u istraživanjima davala atrazinu i kloriranim triazinima
pretpostavljajući njihovu veću toksičnost u odnosu na tio-S-triazine. Također je objavljeno
samo nekoliko radova o utjecaju prometrina na imunološki sustav štakora (Giurgea i sur.,
1981, 1979, Messow i sur. 1990).Većina radova istražuje učinkovitost prometrina kao
herbicida u sklopu ispitivanja agrotehničkih postupaka,
Cilj rada je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju
odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo). Odabir metoda
istraživanja ukazuje kako je cilj ponajprije bio utvrditi najsuptilnije pokazatelje oštećenja
stanica i odrediti najranije pokazatelje smrti pojedinih stanica u vitalnim organima, te
dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) kao posljedicu djelovanja
prometrina.
Obrazloženje teme: dobar pokazatelj ranog toksičnog stresa na pojedine organe predstavlja
mjerenje aktivnosti serumskih enzima; naime, kao proteinske makromolekule, enzimi u
normalnoj fiziologiji ne mogu prolaziti kroz stanične membrane. Oštečuje li toksikant na
2
bilo koji način stanicu, u izvanstaničnoj tekućini i krvi nalazit će se male količine pojedinih
enzima koji potječu od stanica pod toksičnim stresom. Budući da razina aktivnosti enzima
ovisi o ulasku enzima iz stanica u krv, funkcija i stupanj razvoja stanica u kojima se neki
enzim eksprimira kao i intenzitet ekspresije određuje koliko će enzima odumiranjem tkivnih
stanica dospjeti u cirkulaciju. S obzirom na tkivnu specifičnost enzima moguće je
lokalizirati ranu pojavu patološkog procesa i stupanj oštećenja. Nadopunu ovih rezultata
izvršilo se uporabom metoda histopatološke i enzimskohistopatološke analize. Metode
protočne citometrije i komet tehnika također imaju za cilj pokazati rane apoptotične
(annexinV-FITC) i nekrotične (propidij jodid) smrti na membranama stanica imunološkog
sustava i organa. Nadopuna ovim dvjema tehnikama su određivanja celulariteta
imunohematopoetskih organa.
Svrha rada je, s obzirom na naprijed obrazloženo, nadopuna dosadašnjih spoznaja o
toksičnom djelovanju prometrina kao induktora oksidativnog stresa na ne ciljne organizme
što predstavlja novi doprinos u procjeni rizika njegove potencijalne opasnosti po dobrobit i
zdravlje čovjeka i drugih sisavaca. Očekujemo da će rezultati dati osnovnu sliku o
interferenciji u metabolizmu organizma sisavaca te procjenu kojom jačinom prometrin kao
herbicid oštećuje vitalne sustave životinja. Analizom dobivenih rezultata pokušat će se
utvrditi postoje li naročito osjetljiva tkiva ili fiziološki sustavi koji mogu potencijalno
uzrokovati opadanje vitalnosti životinja i/ili smrt, također u razmatranje će se uzeti postoje
li spolno uvjetovane razlike u toksičnosti izazvane prometrinom, te postoji li međuovisnost
doze i vremena tijekom kontakta s prometrinom. Usporedbom dobivenih rezultata s
podacima u literaturi pokušat će se zaključiti postoje li razlike ili sličnosti u toksičnim
učincima između vrsta, poglavito u usporedbi dvaju najčešćih laboratorijskih životinja
(usporedba štakor <=> miš), što predstavlja korak za ekstrapolaciju procjene rizika za
čovjeka. Također smatramo da bi dobiveni rezultati predstavljali početnu točku za daljnje
pokuse međudjelovanja prometrina u smjesama toksikanata koje nalazimo zaostale u
okolišu (toksični sinergizam, antagonizam, adicija i dr.).
3
2. LITERATURNI PREGLED
5
2. LITERATURNI PREGLED
2.1. HERBICIDI
U užem smislu pod pojmom herbicidi podrazumjevaju se spojevi namjenjeni uništenju
korovnih biljaka. Poznate su brojne podijele herbicida, a ovdje su navedene s obzirom na
kemijske, fizikalne i biološko-fiziološke osobine i svojstva (Janjić 1985):
Prema učinku najčešće se dijele na:
- totalne (uništavaju sve biljne vrste) i
- selektivne (uništavaju samo određene biljne vrste)
Prema načinu i mjestu djelovanja mogu biti:
- kontaktnog djelovanja (djeluju u neposrednom kontaktu s biljkom i uništavaju biljne
dijelove s kojima su u dodiru)
- translokacijskog djelovanja (apsorbiraju se i prenose u razne biljne organe dalje od mjesta
ulaska i izazivaju njihovo odumiranje)
Prema toksičnosti za životinje i čovjeka (testirano na standardnim laboratorijskim životinjama)
najčešće se dijele na:
- skupina I – LD 50 < 50 mg/kg
- skupina II – LD 50 50-250 mg/kg
- skupina III – LD 50 250-1000 mg/kg
- skupina IV – LD 50 > 1000-5000 mg/kg
S obzirom na njihovu stabilnost u okolišu možemo ih označiti kao:
- vrlo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja duže od 2 godine)
- stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja od 6 mjeseci do 2 godine)
- umjereno stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja 1 do 6 mjeseci) i
- slabo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja kraće od 1 mjeseca)
6
S obzirom na kemijsku strukturu dijelimo ih na:
- karbonske kiseline i njene derivate
- ariloksialilkarbonske kiseline i njene derivate
- derivate karbaminske kiseline
- derivati tio i ditiokarbaminske kiseline
- derivate karbamida
- derivati dipiridila
- nitrofenoli, nitroanilini i njihovi derivati
- heterociklički spojevi s dva atoma dušika u prstenu (diazini)
- heterociklički spojevi s tri atoma dušika u prstenu (triazini) 2.2. TRIAZINSKI HERBICIDI
Triazini su heterociklički spojevi s tri atoma dušika i tri atoma ugljika u šesteročlanom
prstenu. Triazinima pripadaju spojevi poput atrazina, simazina, terbutilazina, cijanazina i
prometrina. Triazini su još uvijek najčešće korišteni herbicidi u svijetu (Berg i sur. 1995,
Böcher i sur. 1994, Wallace-Hayes i sur. 2001).
Unutar ove skupine razlikujemo (sl. 1.) :
a) 1,2,3-triazin
b) 1,2,4-triazin
c) 1,3,5-triazin
NN
N
N
NN
N N
N
1,2,3-triazin 1,2,4-triazin 1,3,5-triazin
Slika 1.: Strukturalna građa molekula različitih tipova triazinskih spojeva
7
Posljednji se još naziva i simetrični triazin i pridružuju mu se oznake sym-triazin ili S-
triazin. Svaki od ova tri oblika ima brojne derivate. Daleko najvažniji su derivati 1,3,5-triazina
(Falbe i Regitz 1995) Imaju široku primjenu kao pesticidi, zatim u industriji boja i u
proizvodnji eksploziva (Falbe i Regitz 1995, Wackett i sur. 2001).
Triazini su kao organski herbicidi vrlo efikasni u različitim biljnim kulturama.
Selektivno djelovanje rezultira vrlo uspješnim suzbijanjem sjemenskih širokolisnih i nekih
uskolisnih korova. U nižim dozama nedovoljno djeluju na višegodišnje korove (Glasnik zaštite
bilja 2000).
U većim dozama djeluju kao totalni herbicidi pa se primjenjuju za uništavanje biljnog pokrova
na željezničkim nasipima, putovima, u industrijskim objektima.
Simetrični triazini mogu se podijeliti u tri skupine:
kloro-triazini
metoksi-triazini
metiltio-triazini
Kao herbicidi počeli su se intenzivno primjenjivati prije 40 godina za uništavanje korova kod
različitih usjeva i za kontrolu rasta korova na nepoljoprivrednom zemljištu (Kniewald 2001).
Triazini pripadaju malo otrovnim pesticidima (Srebočan 1992). Vrijednosti LD50 oralno
za štakora za neke od triazina su prikazani u tablici 1.
Tablica 1: Relativna toksičnost nekih triazina za šakora prikazana kao LD50
triazin LD50 oralno štakor (mg/kg)
ametrin 964
atrazin 3080
cijanazin 334
prometrin 3750
simazin 5000
propazin > 5000
8
2.3. OPĆA SVOJSTVA PROMETRINA
Metil-tio-S-triazinski spoj, molekulske formule: C10H19N5S, prometrin (N,N´-Bis (1-metiletil)-6-(metiltio)-1,3,5-triazine-2,4-diamine, sinonim: 2,4-bis (izopropilamino)-6-(metiltio)-S-triazin), malo je do umjereno toksičan spoj i seletivni pesticid opće namjene. Prometrin je aktivna tvar nekoliko herbicida u Republici Hrvatskoj (Glasnik zaštite bilja 2000) registriranih pod komercijalnim nazivima:
• Prometrex 50 SC, • Prohelan-T, • Gesagard 50 WP, • Gesagard 500 Fl.
U svijetu je registriran pod komercijalnim nazivima (Kamrin i sur. 2000, Maynard i sur. 1999):
• Caparol, • Caparol 80W, • Cotton-Pro, • N,N´-Diisopropyl-6-methylthio-1,3,5-triazine-2,4-diyldiamine, • G 34161, • Gesagard, Gesagard 50, Gesagard 500 • Merkazin, • 2-Methylmercapto-4,6-bis (isopropylamino)-S-Triazine, • 2- Methylthio- 4,6 bis (isopropylamino)-S-Triazine, • Polisin, • Primatol, • Primatol Q, • Prometrex, • Prometryn, • Prometryne, • Selektin, • Sesagard Prometrin se rabi za suzbijanje jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u
nasadima pamuka, lana ali i celera, graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, tj.
biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni konzument čovjek. Dokazano je da djeluje kao inhibitor
Hillove reakcije u fotosintezi (Kamrin i sur. 2000, Wallace-Hayes i sur. 2001). Dobro je topiv u
9
mastima i organskim otapalima. S obzirom na otrovnost za životinjske organizme svrstan je u
skupinu II ili III, ovisno o formulaciji (Glasnik zaštite bilja 2000, Kamrin i sur. 2000).
Oralno aplicirana LD 50 vrijednost za miša je 3750 – 3800 mg/kg tjelesne težine životinje
(EPA 1996, EPA-IRIS 2001, Extoxonet 1996, Kamrin i sur. 2000). Relativno je postojan u
okolišu (od sedamdesetdva dana a ponekad i do tri godine ovisno o uvjetima okoliša) i može se
detektirati u značajnijim koncentracijama u okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije
(Bardalaye i Wheeler 1985, Berg i sur. 1995, Böcher i sur. 1992, Böcher i Sørensen 1994,
Gabrilevskaia i Laskina 1972, Kamrin i Montgomery 2000, Raszyk 1986, Svobodova i sur.
1995).
Slika 2: Strukturna formula molekule prometrina
10
2.3.1. PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU
2.3.1.1. Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi
Triazini su naširoko prisutni u vodenim ekosustavima i pitkoj vodi. Posebice je istraživan
atrazin i njegovi metaboliti primjerice hidroksiatrazin i desetilatrazin, čija se visoka toksičnost
za čovjeka već duže vrijeme poznaje (Berg i sur. 1995). Međutim manje je podataka, ali ipak
postoje o prometrinu u vodi. Istraživanje njemačkih autora provedeno na uzorcima sedimenta
Njemačkog Wadden jezera, govori o detektiranim koncentracijama većim ili jednakim 500
ng/kg uzorka. Posebno visoke koncentracije bile su prisutne u estuariju rijeke Weser, što govori
o transportu rezidua herbicida s poljoprivrednih površina u more (Bester i Huenhnerfuss 1996).
ilustrativan primjer prave opasnosti od mogućeg toksičnog djelovanja prometrina na zdravlje
čovjeka predstavlja studija biomonitoringa pitke vode gradskog vodovoda u Ljubljani autorice
Leh i suradnika (2005), gdje se iznose podaci mjerenja rezidua pojedinih pesticida u gradskom
vodovodu od kojih prometrin doseže polovicu propisanih MAK vrijednosti za pitku vodu
odnosno 0.5 μg/L.
2.3.1.2. Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za
mikroorganizme Studije utjecaja na mikroorganizme okoliša ukazuju da prometrin ne predstavlja ekotoksičnu
noksu koja bi u većoj mjeri mogla narušiti populacijsku ravnotežu pojedinih komponenti
mikroflore tla koja bi uzrokovala veće promjene u ekosustavu. Mikroflora tla vrlo je bitna za
biodegradaciju prometrina koji se našao u okolišu. Bezgulov i sur. izvještavaju da prometrin
apliciran svake godine u proljeće, tijekom 8 godina u dozama od 1.5 kg/ha nije pokazao
značajan utjecaj na mikroorganizme tla. Amonificirajuće bakterije i gljive, aktinomiceti i
denitrifikacijske bakterije pokazale su se neosjetljive na sve pesticide testirane u ovoj studiji, a
tako i na prometrin (Bezuglov i sur., 1976). U okolišu osim abiotičkih čimbenika koji utječu na
degradaciju i razgradnju prometrina, važnu ulogu imaju i mikroorganizmi, najviše bakterije.
Brojni su dokazi ovoj tvrdnji. Istraživanje u kojem autoklavirani i nesterilizirani uzorci gline,
svaki tretiran s 4 ppm prometrina i inkubiran 60 dana, kao suhi, bezvodni na 4 °C ili sa
prisutnih 75 % vlage na 30 °C pokazuju da više prometrina ostaje u steriliziranom vlažnom
11
uzorku nego u nesteriliziranom. Također, uzgojem biljke krastavca u ovako pripremljenim,
nesteriliziranim uzorcima tla, nije bilo znakova fitotoksičnosti prometrinom nakon 47 dana. To
ukazuje na mikrobiološku razgradnju kao jedan od glavnih načina detoksikacije prometrina u
tlu. U istom radu autori opisuju pokus u kojem su uzorku tla tretiranog s prometrinom dodali 1
%-tnu otopinu glukoze i ekstrakte kvasca, nakon 30 dnevne inkubacije. Tako tretirani uzorak
tla sadržavao je manje prometrina u odnosu na kontrolu.
Dodatkom antibiotika, bakterijskog inhibitora kloramfenikola nakon 40 dnevne inkubacije
uzorak tla predtretiranog prometrinom sadrži više prometrina u odnosu na kontrolni uzorak.
Međutim, dodatkom cikloheksamida, gljivičnog inhibitora, uzorak nije pokazao statistički
bitnu razliku u koncentraciji prometrina u odnosu na kontrolu. Autori izvode zaključak da je
mikrobiološka degradacija prometrina uglavnom zasluga bakterijskih populacija u tlu (Hulin i
sur. 1973).
Bakterije tla degradiraju prometrin tijekom faze rasta. U kulturi bakterija selektiranih
predteretmanom prometrinom, identificirana su tri metabolita biorazgradnje. Autori ovog
pokusa utvrdili su da nakon bakterijske metabolizacije triazinski prsten ostaje intaktan. Rezultat
podržava hipotezu prema kojoj metiltio-S-triazini degradiraju u tlu procesom N-dealkilacije
bočnih ogranaka molekule. Intaktnost triazinskog prstena nakon bakterijskog djelovanja
ukazuje da bakteriološka degradacija rezidua prometrina u tlu ne znači nužno i potpunu
detoksikaciju tla (Giardina i sur. 1977).
2.3.2. NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE
Korjenasto bilje, poput mrkve, repe, krumpira najbolji je modelni organizam za
demonstraciju akumulacije ksenobiotika. Bioakumulacija prometrina u biljkama koje primarno
i/ili sekundarno koristi čovjek i životinje tema je brojnih studija. Rezultati ukazuju da
koncentracija rezidua u biljci rijetko prelazi 0.1 ppm. Također vremenski, rezidue ne ostaju u
biljci dulje od nekoliko mjeseci, što izravno ovisi o apliciranoj koncentraciji. U prilog tome
govore rezultati studije akumulacije prometrina provedene na biljkama mrkve koje su rasle na
tlu tretiranom s 3 kg/ha, 5 kg/ha i 10 kg/ha. Pri najnižoj apliciranoj dozi od 3 kg/ha, prosječna
koncentracija prometrina u tlu prvi dan nakon aplikacije bila je 0.5 mg/kg, što je, prema
autorima granična vrijednost dopuštena u to doba u SSSR-u.
12
Veće doze prometrina od 5 kg/ha i 10 kg/ha povećale su ostatke prometrina u tlu 7-13 puta više
od dopuštene granice (Gordienko 1977).
Autori Kavolyunayte i Shpokauksas (1974) izvještavaju da se koncentracija prometrina u
krumpiru uzgojenom na tlu tretiranom s 2 kg/ha i 4 kg/ha kreće između 0 i 0.08 mg/kg, a u
gornjim slojevima tla koncentracija se kretala između 0.01 mg/kg i 0.64 mg/kg.
Heinisch i Refenstein (1971) zabilježili su koncentracije od 0.02-0.05 ppm u mrkvi ubranoj
3-5 mjeseci nakonu tretirana od 2.5 kg/ha zemljišta za uzgoj.
U sličnom istraživanju nakon tretmana tla prometrinom koncentracijama 1.5 kg/ha, 2 kg/ha,
2.5 kg/ha i 3.5 kg/ha, 2 mjeseca nakon tretmana u korjenu mrkve utvrđene su koncentracije
0.22-0.27 mg/kg za dozu 1.5 kg/ha, 0.3-0.34 mg/kg za dozu 2 kg/ha, 0.08-0.11 mg/kg u lišću
mrkve i 0.22 mg/kg u tlu. Četiri mjeseca nakon aplikacije doza 1.5 i 2 kg/ha rezidue prometrina
nisu detektirane u korjenu, lišću i tlu.
Međutim, tri mjeseca od aplikacije utvrđene koncentracije u korjenu mrkve iznosile su 0.01-
0.02 mg/kg za dozu od 2.5 kg/ha i 0.03-0.05 mg/kg za dozu od 3.5 kg/ha. Kod ovih doza, čak i
6 mjeseci nakon aplikacije herbicida, tragovi prometrina bili su detektirani u lišću i korjenu
mrkve (Ivanova i sur. 1973).
Reifenstein i Heinisch (1973) utvrđuju da mrkva koja je rasla na tlu jednokratno tretiranom s
2-3 kg/ha sadrži prometrin u koncentraciji ispod 0.03 ppm, a vrijednost od 0.15 ppm, što je
iznad granične vrijednosti koja je iznosila 0.1 ppm u biljci, a prema tadašnjim propisima DDR-
a, izmjerena je samo u jednom uzorku od ukupno 46 izmjerenih. U gornjim slojevima tla autori
su nakon jednokratnog tretmana izmjerili koncentraciju prometrina ispod 0.02 ppm. Autori
zaključuju da aplikacija herbicida prometrina ne stvara problem s akumuliranim ostacima tog
herbicida
Studija Rumunjskih znanstvenika provedena na luku i mrkvi, s dozama 2-6 kg/ha
apliciranog prometrina, spominje koncetracije od 0.28-1.5 ppm u proljeće i 0.2-0.72 ppm u
jesen. Korijen luka je sadržavao koncentraciju od 0.008-0.018 ppm, a korijen mrkve 0.05-0.1
ppm. U lišću obaju biljaka izmjerena je koncentracija od 0.001-0.05 ppm (Rughinis i sur.
1977).
Norveški znanstvenik Fiveland proveo je sličan pokus na dva različita tipa tla (sjeverna
Norveška, tlo sa 6% humusnih tvari i tlo u južnoj Norveškoj s 9 % humusnih tvari). Aplicirane
doze prometrina bile su jednokratno 1.5 i 3 kg/ha i dvokratno (pre- i postemergentno) 1.5+1.5
13
kg/ha i 3+3 kg/ha. Osim mrkve, sađena je i repa, obje biljke su kasnije analizirane kao model
akumulacije. Rezultati pokazuju koncentracije prometrina ispod 0.1 ppm u svim opisanim
slučajevima na obje lokacije. Dvije godine nakon aplikacije herbicida nisu nađeni tragovi
rezidua (Fiveland 1977).
U istraživanju koje je za cilj imalo utvrditi koncentracije prometrina akumulirane u
medicinskim biljkama uzgojenim pod tretmanom s 0.8-1 kg/ha prometrina, pokazalo se da
kamilica (Matricaria chamomillla), menta (Mentha piperita) i timijan (Thymus vulgaris) sadrže
koncentracije manje od 0.02 ppm. Autori zaključuju da prometrin ne predstavlja opasnost pri
uporabi za uzgoj ljekovitog bilja (Reifenstein i sur. 1975).
Opaženo je da biljke tretirane prometrinom imaju donekle izmjenjenu koncentraciju mikro i
oligo elemenata. Biljke uzgojene u tlu tretiranom s 1 kg/ha prometrina pokazuju ove promjene:
mrkva sadrži 11-22% više željeza (Fe), a uzgojena u tlu s 2 kg/ha prometrina sadrži 22 % nižu
koncentraciju željeza, dok je aluminij (Al) povećan za 38% . Paprika (zelena) je sadržavala
44% više željeza i statistički značajno višu koncentraciju molibdena (Mo) i bakra (Cu).
Spomenute koncentracije opadaju proporcionalno s porastom aplicirane doze (1.5 i 2 kg/ha)
u odnosu na kontrolu. Rajčica međutim, nakon tretmana prometrinom sadržavala za 59 %
manju količinu aluminija (Al), a s porastom doze (1.5, 2 kg/ha) opadala je i koncentracija (84
% manje u odnosu na kontrolu), ali se koncentracija željeza (Fe), nikla (Ni) i mangana (Mn)
nije bitno mijenjala bez obzira na dozu. Patliđan pri dozi 1 kg /ha nije promjenio koncentraciju
željeza (Fe), i mangana (Mn), ali je koncentreacija bakra (Cu) pala za 30 % pri dozi od 1 kg/ha,
a za 60 % pri dozi od 1.5 kg/ha od vrijednosti kontrolnih uzoraka (Baratov 1979).
Grožđe i merelica proizvedeni na tlu tretiranom s prometrinom u koncentracijama 7 i 9
kg/ha nisu sadržavali rezidue prometrina, ali su pokazali povećanu koncentraciju željeza (Fe),
nikla (Ni) i molibdena (Mo) ali ne i mangana (Mn) (Baratov i sur. 1981).
Osim doze, načina aplikacije i vremena karence i kulinarska priprema jestivog bilja igra
značajnu ulogu na putu herbicida do čovjeka.
Nasadi mrkve tretirani prometrinom (1 i 1.5 kg/ha) 77 dana prije ubiranja biljaka za ljudsku
prehranu sadržavale su koncentraciju (0.011-0.013 ppm) prometrina nižu od propisane.
Kulinarskom obradom (čišćenje, guljenje, pranje, rezanje, kuhanje) koncentraciju rezidua
prometrina reducira se za 75-100 % (Bognar 1977).
14
2.4. TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA 2.4.1. UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŽNJAKA I
BESKRALJEŽNJAKA
U pokusu istraživača Jordana i sur. (1977) punoglavci vrste Rana temporaria u dva različita
razvojna stadija bili su izloženi djelovanju Mediazan 50 i Gesagard 50. Promjene uzrokovane
ovim tvarima nastale su na probavilu, mozgu i mišićima. Mediazan je uzrokovao djelomične
lezije crijevnog epitela i parenhima jetre. Gesagard 50 pokazao je jači toksični učinak,
uzrokujući jake degenerativne promjene u probavilu i mozgu. Uz navedene uočene su i
promjene poput inhibiranog rasta životinje i retardacije u procesu razvoja operkuluma. Mlađi
punoglavci bili su manje osjetljivi od starijih.
Učinak Gesagard 50 na regeneraciju stražnjeg mozga punoglavaca vrste Xenopus leavis,
ovisno o upotrebljenoj koncentraciji uzrokovao je inhibiciju (0.001 % koncentracija) i
poremećaje regeneracije (0.0005 % koncentracija). Najniža testirana koncentracija (0.0001 %
prometirna) imala je stimulirajući učinak na regenerativne procese (Maryanska-Nadachowska i
sur. 1980 (RECD. 1981)). U pokusu utjecaja S-triazinskih herbicida na oogenezu triju vrsta kukaca Pterostichus
cupreus, Pterostichus melanosarius i Agonium dorsale, red Coleoptera, porodica Carabidae,
Gesagard 50 (prometrin) pokazao manju kemosterilizirajuću sposobnost u odnosu na Gesatop
50 (simazin), te selektivno djelovanje 10 % koncentracije samo na vrstu Pterostichus
melanosarius u odnosu na druge dvije vrste.
Kod P. melanosarius uzrokovao je piknozu u jezgrama trofocita. Taj učinak odgovarao je
učinku 13 % otopine drugog ispitivanog pesticida Gesatop 50 (simazin) (Rozek 1978).
15
2.4.2. OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA
Nakon kroničnog tretmana Wistar štakora prometrinom, dozama 2 i 190 ppm, smanjivala se
apsorpcija glukoze i osjetljivost na inzulin izoliranih dijafragmi štakora, ovisno o dozi pesticida
(Madar i sur. 1982).
Analizom krvi štakora tretiranih dozom od 50 mg/kg tijekom 6 mjeseci pokazalo se da životinje
pate od hiperglikemije i hiperkolesteremije. Također, životinje su imale reduciranu aktivnost
peroksidaze i ugljikove anhidraze (Martynyuk i sur. 1970). Autori Dinerman i Levrenteva
(1969) provode pokus određivanja LD 50 na štakorima. U pokusu koriste ruski i švicarski
preparat prometrina. Pokus je proveden na 37 životinja koje su dnevno primale suspenzije
prometrina gastričkom kanilom. Probit analizom, autori dolaze do podatka da je LD50 za
štakora 2100 mg/kg tjelesne težine za sovjetsku preparat prometrina i 750 mg/kg tjelesne težine
za švicarski preparat (Dinerman i sur. 1969).
Vrijednost LD 50 za štakora od 2150-3750 mg/kg iznose Heinisch i Reifenstein u radu
publiciranom nešto kasnije (Heinisch i sur. 1971). Prema Agrochemical Pesticide-Desk
Reference, CRC net Base, Chapman & Hall, LD 50 za glodavce je 3750 mg/kg (Kamrin i sur.
1999).
Studija postnatalnog učinka kombinacije simazina i prometrina na mladunce štakora u fazi
laktacije pokazala je negativne učinke na tjelesnu težinu, neuro-muskularne veze i tjelesni
razvoj, kao i na povećanu količinu opsonizanta C-reaktivnih proteina i povećan broj leukocita
(Messow i sur. 1990). Testiran na pilećim i štakorskim embrijima prometrin nije pokazao
značajne embriotoksikološke osobine u pogledu preživljavanja embrija (Dinerman i sur. 1970).
16
2.4.3. IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETIRNA Tretmanom Whistar štakora tijekom 60 dana s dvostrukom dnevnom dozom 2 ppm i 190
prometrina inducira involutivne promjene timusa koje se očituju smanjenjem timusa,
smanjenjem količine ukupnih proteina i lezije DNA u timocitima (Giurgea 1979).
U radu u kojem je praćena citogenetička analiza stanica koštane moždine štakora nakon
djelovanja herbicida S-triazinske skupine, herbicid je injektiran jednokratno u dozama 1/10,
1/30 i 1/50 LD50 Analizom nakon 24 sata otkrivene su strukturalne promjene na stanicama
(fragmentacija) i kromosomska agregacija u kasnoj anafazi i ranoj telofazi (analizirano 200
stanica po životinji). Također je određivan mitotički indeks (analizirano je 300 stanica po
životinji). 1/10 i 1/30 doze imale su inhibicijski i supresijski učinak na mitozu stanica u
koštanoj moždini, a broj kromosomskih lomova u odnosu na kontrolu se povećao (Kulakov
1970).
Štakori tretirani 6 mjeseci dnevnim dozama od 50 mg/kg imali su morfološke promjene u
strukturi krvnih stanica uz pojačanu sedimentaciju eritrocita (SE) i redukciju protrombinskog
indeksa. S dnevnom dozom od 5 mg/kg apliciranu tijekom 3 mjeseca primjećena je samo
leukocitoza i redukcija protrombinskog indeksa (Martynyuk i sur. 1970).
Gzhegotskii (1968) izvještava o učincima akutnog i kroničnog izlaganja prometrinu na
perifernu krv štakora. Akutno izlaganje rezultiralo je u smanjenjem broja leukocita i limfocita,
te porastom eozinofila, neutrofila i monocita. Brzina koagulacije je povećana (592 sekundi u
akutno otrovanih životinja naprama 866 sekundi u kontrolnoj skupini). Ove promjene bile su
još jače izražene 10 i 12 sati nakon izlaganja u životinja koje su preživjele akutnu dozu.
Životinje u pokusu kronične izloženosti 50 mg/kg imale su iste promjene. Nakon četri i šest
mjeseci razvila se hipokromna anemija.
17
2.4.4. UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA
Nizom pokusa, brojni autori pokazali su da prometrin jako djeluje na endokrine funkcije
odnosno da djeluje kao endokrini ometač (prema engleskom pojmu: endocrine disruptor).
Istraživanja reproduktivne toksičnosti (faza I testova teratogenosti i reprodukcije) koja
uključuje analizu sposobnosti plodnosti i začeća nakon aplikacije toksikanta pokazala su da pri
dnevnoj aplikaciji doza 5 mg/kg tijekom tri mjeseca, spareni mužjaci i ženke štakora mogu dati
potomstvo. Međutim u istom radu autori opisuju i tretman dozom od 50 mg/kg tijekom 6
mjeseci nakon čega sparene životinje nisu dale potomstvo (Martynyuk i sur. 1970).
Muški albino štakori dnevno tretirani 20-kratno s dozom 1/20 LD 50 prometrina imali su
velike citološke alteracije u sjemenim kanalićima (tubuli seminiferi). Autori zaključuju da
prometrin ima jak gonadotoksični učinak. Također, dokazano je da utječe na morfologiju jezgre
spermija, na osobine primanja boja citoplazmatske RNA i afinitet pironina za citoplazmu
(Shtabskiy i sur. 1976).
Nadalje, u pokusu utjecaja S-triazinskih pesticida na metabolizam testosterona i stvaranje
kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosterona i 5-alfa-dihidroksitestosteronskog receptora u prostati
štakora, Kniewald i sur. pokazuju antiandrogenski učinak prometrina. Pokazano je da u in vitro
sustavu prometrin kao i mješavina prometrina i atrazina imaju statistički značajan negativan
utjecaj na stvaranje kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosteron-specifičnog receptora. Odnosno,
prometrin djeluje inhibirajuče na enzimske aktivnosti koje kataliziraju reakcije konverzije
prekursora u testosteron. Autori zaključuju da je inhibicija reverzibilna i nekompetitivna
(Kniewald i sur. 1995).
Isti autori dokazali su inhibirajuće djelovanje prometrina na osnovne enzimske sustave i
mogućnost vezanja androgena i njihovih receptora u hipofizama dvaju vrsta: štakora
(prometrin doziran in vivo) i teleta (hipofize tretirane in vitro) nakon izlaganja prometrinu. U
hipofizama ženske teladi utvrđeno je prevođenje testosterona u 5-alfa dihidroksitestosteron i 3-
alfa diol oblik što je isti mehanizam koji je utvrđen i kod mužjaka štakora u istom pokusu. U
muške teladi uglavnom je došlo do stvaranja androstendiona i androstandiona enzimima 17-
beta hidroksisteroid dehidrogenazom i 5-alfa reduktazom. Autori su jasno pokazali da
prometrin mijenja enzimske reakcije i utjeće na vezanje androgenih hormona na receptore u
18
hipofizi te napominju potrebu za jačom kontrolom ovih tvari u okolišu kako bi se izbjegli
nekontrolirani i nepoželjni učinci na sustav regulacije produkcije spolnih hormona (Kniewald i
sur. 1983).
U sličnom pokusu u kojem se istraživao učinak različitih pesticida (atrazin, lindan i prometrin)
na stvaranje kompleksa estradiola i estradiolnog receptora u uterusu ženki štakora in vivo i in
vitro. Dokazano je da pod utjecajem prometirna dolazi do smanjivanja broja slobodnih veznih
mjesta na receptoru iako se afinitet vezanja estradiola za estradiolni receptor nije mjenjao pod
utjecajem pesticida (Težak i sur. 1992).
Osim žlijezda spolnog sustava ispitivan je i učinak na štitnjaču (tiroideu) i stanice ljudske
štitnjače u staničnoj kulturi. Promatran je učinak prometrina na diobu stanica, sintezu proteina,
enzimsku aktivnost u stanicama i sintezu hormona štitnjače Dokazano je da koncentracije
prometrina od 0.001-1 mg/15 ml dozirana na stanične kulture stanica ljudske štitnjače,
stimuliraju sintezu trijodtironina (T3) i inhibiraju sintezu tiroksina (T4). U slično osmišljenom
pokusu ali na modelu in vivo, štakori tretirani akutno s 50 ppm prometrina dobiveni su slični
rezultati potaknutog lučenja T3 i inhibiranog lučenja T4. Isti autori izvještavaju da je također
smanjena i količina luteinizirajučeg hormona (LH) izlučenog u plazmu tako tretiranih životinja
(Ghinea i sur. 1980).
2.4.5. UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE, MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST Postoje indicije da prometrin i/ili neki njegovi derivati mogu biti inkorporirani u molekulu
RNA i DNA. Pretpostavlja se da djeluje kao bazni analog. Rezultati istraživanja na Eschericha
coli iz 1966. godine demonstriraju da prometrin djelomično nadomješta uracil u RNA i timin u
DNA (Temperli-Turler i Ercegovich 1966).
Raznovrsne kemikalije u okolišu, uključujući pesticide koji su nosioci sekundarnih i
tercijarnih amino grupa, predstavljaju opasnost po zdravlje životinja i ljudi zbog mogućnosti
stvaranja potencijalno kancerogenih nitrozospojeva u prisutstvu nitrita i uz pH 1 (uvjeti koji su
slični uvjetima u želucu čovjeka ). Egert i Greim proveli su pokus u kojem su u vremenu od 4
sata izložili prometrin HCl-u i octenoj kiselini pri pH 1, na 37 ° C. Produkt reakcije bili su N-
19
nitrozo spojevi (14 % od ukupnog prometrina). Ovi produkti per se, bili su slabo ili nikako
mutageni na sojevima E. coli K12 i Salmonella typhimurium TA 1538. Međutim, mutagenost
produkata reakcije značajno se povećala nakon metabolične aktivacije mikrosomima mišje
jetre. Zaključak je autora da osim spojeva koji sadrže metil i etil supstituirane amino skupine i
spojevi s izo-propilamino grupama mogu stvarati potencijalno kancerogene nitrozo derivate.
Isti autori također zaključuju da tvari koje daju visoku koncentraciju nitrozo derivata
predstavljaju potencijalno opasanost jer u prisutnosti nitrita u ljudskom želucu mogu stvoriti
potencijalno kancerogene spojeve (Egert i sur. 1976).
Stevens i sur. izložili su soj-SD štakora tijekom cijelog životnog vijeka životinja utjecaju
prometrina dodajući ga u hrani i promatrali incidenciju nastanka mamilarnog tumora. Nakon
dvije godine, s dozama iznad maksimalne tolerabilne doze povećala se incidencija nastanka
tumora u odnosu na kontrolu (Stevens i sur. 1994).
Znanstvenici su razvili i neka molekularnobiološka oruđa za istraživanje prometrina, tako
postoje monoklonalna protutjela za prometrin. Skupina autora na Tehničkom Sveučilištu u
Münchenu 1990 godine proizveli su mišja monoklonalna protutjela za detekciju nekih S-
triazina, između ostalog i prometrina. Za detekciju enzimskim immunoassay-em. BALB/C
miševi imunizirani su derivatima herbicida (ametrin-sulfoksid i dikloratrazin) konjugiranim na
albumin iz goveđeg seruma (BSA).
Fuzijom stanica tako imunizirane slezene i mišjih mijeloma stanica PAI-B3AG8I stvorene su
hibridoma stanice. Nakon screening-a ELISA-om izolirana su četiri monoklonalna protutjela
na S-triazine i podvrgnuta daljnjoj karakterizaciji. Protutjela proizvedena protiv ametrin-
sulfoksida imala su jak afinitet prema prometrinu i terbutrinu. Detekcijski limit postignut je kod
vrijednosti od 0.3 mg/l (Giersch i sur. 1990).
2.4.6. METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU) Iako je toksikokinetika i biotrnsformacija kloro-S-triazina primjerice atrazina u štakora
poznata i detaljno opisana, vrlo je malo spoznaja o metaboličnim putevima prometrina i drugih
nekloriranih triazina u organizmu sisavaca. U publikaciji Maynarda i sur., predložen je model
detoksikacijskog mehanizma i metabolizma prometrina u štakora (Maynard i sur. 1999). Cilj
rada bio je utvrditi ukupnu razinu prometrina u tkivima, udio izlučen od aplicirane doze, kao i
20
identificirati glavne metabolite prometrina. Uspoređivani su utjecaj jakosti doze i spola na
metabolizam prometrina, kao i utjecaj predtretmana ponavljanih doza prometrina na
metaboličnu sudbinu spoja. Dodatno, je in vitro istraživana uključenost c-P-450
monoksigenaznog sustava i mikrosomalnih monoksigenaza koje sadržavaju flavin (FMO-
enzimski sustav) u detoksikacijskom putu te je uspoređivana s rezultatima dobivenim u
pokusima in vivo.
Studija je provedena na mužjacima i ženkama (5 u skupini). Radioaktivno obilježeni
prometrin apliciran je gastričkom kanilom u dozama od približno 0.5 i 500 mg/kg. Nakon 3 do
7 dana životinje su žrtvovane. Analiza prometrina i njegovih metabolita provedena je u urinu,
fecesu, krvi, mozgu, kosti (femur stražnje noge), masnom tkivu, ovarijima i testisima, srcu,
bubregu, jetri plućima, i slezeni. Analiza je provedena visokotlačnom kromatografijom (HPLC-
om), masenom spektrometrijom i tankoslojnom kromatografijom (TLC-om). Veći postotak
(90-98 %) aplicirane doze izlučeno je urinom (46.5-53.3 %) i fecesom (33.1-45.5 %) u roku 7
dana od aplikacije. Oko 0.4-0.6 % doze nađeno je u tkivima, a značajan dio (1.2-1.9 %) doze
detektiran je u krvi. Ostaci prometrina nakupljeni u tkivima prema količinama od najmanje do
najveće nakupljene koncentracije su: masno tkivo, mišić, bubreg, jetra.
Ovi tkivno akumulirani ostaci bili su proporcionalni apliciranim dozama. Rezultati
pokazuju da je razina prometrina bila značajno veća u tkivima ženki nego u tkivima mužjaka.
Identificirano je preko 30 metabolita (slika 3.). Prema toj studiji metabolični putevi uključuju
N-demetilaciju, S-oksidaciju, S-S dimerizaciju, OH supstituciju s NH2 i SCH3, kao i
konjugaciju s glutationom i glukuronskom kiselinom. Inkubacijom mikrosoma jetre u in vitro
modelu dobiveni su slični rezultati. Faza I metabolizma, kako in vivo tako i in vitro obuhvaćala
je uglavnom S-oksidaciju i N-dealkilaciju (Maynard i sur. 1999).
21
Slika 3: Predloženi putevi metabolične degradacije Prometrina u štakora, prilagođeno iz Maynard M.S., Brumback D., Itterly W., Capps T, Rose R. Metabolism of [(1)(4)C] prometryn in rats. Journal of Agricultural food and Chemistry, Vol. 47 (9), 3858-3865, 1999
22
2.4.7. ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA
Kemijske se reakcije u biološkim sustavima malokad zbivaju bez katalizatora tj.
specifičnih proteina-enzima. Bitne osobine svih enzima su njihova katalitička moć i
specifičnost. Neki enzimi sudjeluju u pretvorbi raznih oblika energije.
Cjelokupni metabolizam moguć je upravo zbog djelovanja enzima. Enzimi smanjuju energiju
aktivacije i time ubrzavaju reakcije barem 107 puta. Većina reakcija u biološkim sustavima ne
odvija se bez enzima zamjetljivom brzinom.
Enzimi su visokospecifični i po reakciji koju kataliziraju i po izboru reaktanata odnosno
supstrata, pa tako obično katalizira samo jednu kemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija.
Specifičnost za supstrat je visoka, a katkad i potpuna.
Izoenzimi kataliziraju istu reakciju i međusobno su vrlo slični, ali imaju različitu primarnu
strukturu. Razlikuju se po svojstvima koja su važna za regulaciju aktivnosti, a u tome je
vjerojatno biološka funkcija tih multiplih oblika. Prema vrsti katalitičke reakcije razlikujemo
šest glavnih skupina enzima. Unutar glavnih skupina podjela se provodi prema kemijskim
vezama koje se cijepaju ili nastaju.
Glavne skupine enzima (Karlson 1988):
1. OKSIDOREDUKTAZE
- enzimi biološke oksidacije i redukcije
2. TRANSFERAZE
- enzimi koji prenose grupe
3. HIDROLAZE
-enzimi koji kataliziraju hidrolitička cijepanja
4. LIAZE
- kataliziraju reakcije eliminacije uz stvaranje dvostruke veze ili adicije na dvostruku vezu
5. IZOMERAZE
- kataliziraju pregradnju unutar molekula
6. LIGAZE -stvaraju veze uz istovremeno cijepanje ATP
23
Neki su enzimi široko rasprostranjeni u raznim tkivima, a neki su specifični samo za neko tkivo
ili organ (tablica 2.). Prema rasprostranjenosti u organizmu, enzimi se mogu podijeliti u tri
skupine:
1. ORGANSKI NESPECIFIČNI ENZIMI
Većinom sudjeluju u energetskoj mijeni tvari. To su enzimi glikolize, oksidacije
glukoze i disanja, dakle enzimi koji sudjeluju u procesima u kojima se oslobađa energija.
Glikoliza se odvija na isti način u mišiću, srcu, bubregu i drugdje, što znači da su u svim tim
organima prisutni i enzimi potrebni za te procese, ali možda u različitim kvantitativnim
odnosima. Takvi su enzimi npr. laktat-dehidrogenaza, aldolaza i dr.
2. ORGANSKI SPECIFIČNI ENZIMI
Nalaze se samo u određenim organima i sudjeluju u metaboličnim procesima
koji se odvijaju samo u određenim organima. Npr. amilaza i lipaza.
3. ORGANSKI SPECIFIČNI IZOENZIMI
Mnogi enzimi se javljaju u više multimolekularnih oblika ili izoenzima. Pojedini
izoenzimi nekog enzima su specifični za određene organe. Tako je laktat-dehidrogenaza
prisutna u mnogim organima, ali su njeni izoenzimi specifični za neke organe. U miokardu
se laktat-dehidrogenaza nalazi u obliku svog izoenzima LDH1 i nešto LDH2, dok u jetri
dolazi kao izoenzim LDH5 i nešto LDH4.
Da bi se na osnovi promjene aktivnosti nekog enzima u serumu moglo zaključiti koji je organ
oštećen, treba znati koji su enzimi karakteristični za pojedini organ, odnosno tkivo (Štraus
1992).
24
Tablica 2: Organska specifičnost pojedinih enzima (Štraus 1992)
Organ Enzim Specifičnost
Gušterača Lipaza +++ Amilaza ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) +
Slinovnice Amilaza ++ Kosti Alkalna-fosfataza (AP) ++
Prostata Kisela fosfataza (KP) +++ Miokard LDH1 ++
Kreatin-kinaza (CK) ++ Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) +
Poprečnoprugasti mišići Kreatin-kinaza (CK) ++ Aldolaza (ALD) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +
Jetra Kolinesteraza (AchE) +++ LDH5 ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aldolaza +
Žučni vodovi Alkalna-fosfataza (AlP) ++ Pepsinogen +++
Želudac LDH1 ++ Eritrociti Kisela fosfataza (KP) ++
Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +
2.4.7.1. Laktat-dehidrogenaza (LDH, EC. 1.1.1.2.7.)
U kralježnjaka laktat-dehidrogenaza naziv je koji objedinjava skupinu tetramernih
citopalzmatskih izoenzima od otprilike 140 kD. LDH pripada u skupinu oksidoreduktaznih
enzima (EC klasifikacija). LDH katalizira reverzibilnu oksidaciju laktata u piruvat i obrnuto
redukcije piruvata u laktat. U toj reverzibilnoj reakciji ravnoteža je pomaknuta u smjeru
stvaranja laktat→piruvat. Reakcija teče optimalno pri pH 8.8 – 9.8 dok se reakcija u smjeru
piruvat→ laktat odvija optimalno kod pH 7.2 – 7.8
25
Ova grupa izoenzima prisutna je i u eukariota i prokariota u čijim stanicama sudjeluje u
reakcijama glikolize tj. u anaerobnoj razgradnji glukoze. U tim reakcijama molekule glukoze
nastale razgradnjom ugljikohidrata, glukoneogenezom ili glikogenolizom, razgrađuju se do
dvaju molekula pirogrožđane kiseline. U aerobnim uvjetima piruvat će se transportirati u
mitohondrij gdje će biti oksidacijski dekarboksiliran do acetil-CoA, zajedničkog
intermedijera razgradnje aminoksielina, glukoze i masnih kiselina.
Acetil-CoA je supstrat za ciklus limunske kiseline iz kojeg se stvaraju prekursori
biosinteze biomolekula a također služi da bi se reducirali u NADH i FADH2 koji u
oksidativnoj fosforilaciji oslobađaju energiju za resintezu ATP. Međutim jedini proces koji
u anaerobnim uvjetima može dati energiju je glikoliza. Proces glikolize može se odvijati
samo uz dovoljne količine NAD+. Stoga se redukcijom nastali NADH mora neprestano
reoksidirati u NAD+ (slika 4.).
Slika 4.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice M iz poprečnoprugastog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001) Naime, kada se stanica nađe u uvjetima
nedovoljne opskrbljenosti kisikom (npr. pri
jakoj mišićnoj aktivnosti), piruvat se reducira u L - laktat uz katalizu LDH, prilikom ćega se
NADH oksidira u NAD+. Ovo je put kojim se regenerira NAD+ potreban za glikolizu kada
stanice ne dobivaju dovoljno kisika. Anaerobnom glikolizom u mišićima nastali L - laktat
krvlju dospjeva u jetru. Laktat nastao pri kontrakciji mišića pretvara se u jetri u glukozu,
koja se ponovno može vratiti u mišić i pohraniti u obliku glikogena.
26
Slika 5.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice H iz srčanog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001)
U većini tkiva u organizmu tetramer LDH, odnosno njegove izoenzimske oblike, čine
dvije različite podjedinice koje se prema razini ekspresije u pojedinim organima označavaju
sa M (od engl. muscle) i H (od engl. heart) (slika 5.).
M i H podjedinice razlikuju se međusobno u naboju. Kod sisavaca podjedinica M je znatno
negativnija od podjedinice H, dok je kod većine ptica, gmazova i vodozemaca razlika u
naboju manja. Kod određenih vrsta riba H podjedinica je negativnija od M. Dijelovanjem 12
M otopinom ureje ili 5 M otopinom guanidina tetramer se može razgraditi na monomere. Da
se podjedinice, monomeri, spontano vežu međusobno stvarajući izoenzime LDH, pokazao je
već davno Nieland 1952. godine (Štraus 1992). Ovisno o sastavu podjedinica, biokemijskim
osobinama, elektroforetskoj pokretljivosti i rasporedu u stanicama različitih organa, u
čovjeka razlikujemo pet izoenzima:
LDH1 (H4) LDH2 (MH3) LDH3 (M2H2) LDH4 (M3H) LDH5 (M4)
Karakterističan je odnos frakcija koje se pojavljuju u svim tkivima čovjeka. LDH1 i LDH2
izoenzimi (ili α - HBDH izoenzimi) su najzastupljeniji oblici u srcu, a LDH3, LDH4 i LDH5 (ili
LDH - P izoenzimi) u poprečnoprugastim mišićima i jetri.
Različiti izoenzimi LDH pokazuju i različite enzimske osobine. LDH1 (H4) izoenzim ima
malu KM odnosno veliki afinitet za piruvat i inhibira ga visoka koncentracija ovog metabolita,
27
stoga on ima funkciju laktat-oksidaze. LDH5 (M4) izoenzim ima suprotna svojstva tj. veliki
KM odnosno niski afinitet za piruvat koji ga ne inhibira, stoga je on laktat-reduktaza. (Boyer i
sur 1963, Blake i sur. 1968, Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres
1979, Franković 1990, Strayer 1991, Kopperschlager i Kirchberger 1996, Kaneko 1997,
Schmidt 2000, Hakenberger - Kutuzović 2001)
LDH izoenzimski sustav jedan je od najčešće istraživanih modela za porjeko i evoluciju
izoenzima i multigenomski reguliranih enzimskih sustava. Podjedinice kodiraju geni ldha (za
podjedinicu M stoga je neki autori nazivaju LDH - A), ldhb za podjedinicu H koju neki atori
nazivaju LDH - B. U kralježnjaka LDH - A je najupotrebljavaniji za redukciju piruvata u
anaerobnim tkivima primjerice mišiću, a LDH - B za oksidaciju laktata u aerobnim tkivima
primjerice srčanom (Bengtsson i Karlsson 1980, Shoei - Lung Li 1998). U sisavaca i
kolumbidnih ptica postoje i geni tzv. ldhc koji se eksprimiraju u germinalnom epitelu testisa
tijekom spermatogeneze stvarajući treći oblik tetramera izoenzim LDH - C4 (slika 6.)
specifičan samo za testise, koji se po svojim karakteristikama razlikuje od ostalih izoenzima
LDH i prilagođen je jedinstvenim metaboličnim potrebama pripadajućeg tkiva (Li i sur. 1998).
Tetramer LDH - C4 poznat je i pod starijim nazivom LDH - X testikularnog tkiva. U štakora je
njegova molekularna masa 125 ± 4 kD (Schatz i Segal 1969).
Slika 6.: Prikaz molekularne strukture mišje laktat-dehidrogenaze, izoenzimskog tetramera C4 iz testisa Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Hogrefe, H. H., Griffith, J. P., Rossmann, M. G., Goldberg, E.: Characterization of the antigenic sites on the refined 3-A resolution structure of mouse testicular lactate dehydrogenase C4 J Biol Chem 262 pp. 13155 (1987)
U vodozemaca i gmazova dokazana je ekspresija samo LDH - A i LDH - B (Shoei - Lung Li
1998). Posebice je zanimljivo da je u očnoj leći nekih ptica i krokodila LDH - B strukturalni
28
protein poznat i pod nazivom epsilon - kristalin (PROSITE 1988). U naprednijih koštunjača
LDH-C eksprimira se jedino u oku dok se kod primitivnijih teleosta, ukoliko posjeduju gen,
LDH-C eksprimira ubikvitarno. Evolutivno gledano geni za LDH-C u ptica, vodozemaca
(Xenopus) i nekih riba nastaju duplikacijom iz gena za polipeptid LDH - B (srčani izoenzim) a
u sisavaca iz gena za polipeptid LDH-A (mišićni izoenzimi). U čovjeka geni za LDH - A i
LDH-C nalaze se na kraćem kraju 11-tog kromosoma, a u miša na 7 kromosomu što nadalje
potvrđuje filogenetsku vezu dvaju gena u sisavaca (Shoei - Lung Li 1998). U obje vrste, kao i u
štakora podjedinica A sačinjena je od 332 aminokiseline (Olsson 2003). Geni LDH - A, B i C u
sisavaca isprekidani su sa 6 introna u kralježnjaka, a postojanje samo dva introna u
beskralježnjaka pokazano je po prvi puta na jednoj vrsti nematoda (Shoei - Lung Li 1998).
Usporedbom sekvenci gena za LDH u različitih vrsta sugerira se visoka sličnost i očuvanost
strukture gena za LDH, primjerice usporedbom sekvence za LDH - A laboratorijskog miša Mus
musculus i čovjeka sličnost je 93.98 %, laboratorijskog štakora 96.69 %, Drosophile
melanogaster 61.45 %, C. elegans 58.84 % E. coli 24.60 % slijeda baza.
Budući da se LDH nalazi u citoplazmi, dovoljno je da se promijeni propusnost stanične
membrane pa da enzim iz citoplazme prijeđe u cirkulaciju i da se aktivnost u serumu povisi.
Zbog toga mu se aktivnost u serumu poveća već i kod lakših oštećenja tkiva u kojima se nalazi.
Stoga LDH izoenzimi imaju veliku važnost kako u dijagnostici veterinarske i humane kliničke
analitike, fundamentalnom znanstveno istraživačkom radu na poljima filogenije, ekologije i
evolucije (Çolak i sur. 2002), ali i temeljne fiziologije (npr. fiziologija stresa), toksikologije,
ekotoksikologije, biokemijske filogenije i dr.
Normalne serumske vrijednosti LDH ovise o dobi, vrsti organizma i fiziološkom stanju
(Matsuzawa i sur. 1993), primjerice za čovjeka:
Kruse - Jarres (1979): odrasle jedinke 120 - 140 U/L , novorođenčad 300 - 700 U/L
Jaeger i Hedegaard (2002):
Odrasli bez navedenog spola, optimum 125 U/L, Štraus (1992):
Odrasli bez navedenog spola 150 - 310 U/L na 30°C.
29
Za laboratorijskog miša vrijednosti vrlo varijabilne ovisno o soju miša.
Kaneko (1997): bez specificiranja soja, spola ili uzrasta 366 U/L,
Santos (2005): 25 - 35 g teške mužjake miševa soja Swiss 370.4 ± 77.4 U/L
Mady (2002): 22 - 25 g teške ženke soja Swiss 1714 ± 27.86 U/L
Za štakora prosjek aktivnosti LDH u serumu navode:
Kaneko (1997): 464 ± 22 U/L,
Anbarust (2005): mužjaci Wistar štakora, 100 - 120 g, 104.71 ± 7 U/L,
Franković (1990): 55.51 – 158.67 U/L (srednja vrijednost 100.33 ± 34.09 U/L).
Za ostale životinjske vrste nalazimo prema navodima autora naredne aktivnosti LDH u serumu.
Kaneko (1992):
1. Konj 162 - 412 U/L (252 ± 63 U/L) 2. Govedo 692 - 1445 U/L (1061 ± 222 U/L) 3. Ovca 238 - 440 U/L (352 ± 59 U/L) 4. Koza 123 - 392 U/L (281 ± 71 U/L) Svinja 380 - 634 U/L
(499 ± 75 U/L) 5. Pas 45 - 233 U/L (93 ± 50 U/L) 6. Mačka 63 - 273 U/L (137 ± 59 U/L)
Radman i Harapin (1998):
1. Konj do 400 U/L. 2. Govedo do 1500 U/L 3. Ovca do 530 U/L Svinja do 600 U/L 4. Pas do 100 U/L 5. Mačka do 7 U/L
30
Prema pojedinim organima aktivnost LDH također je različita. Za čovjeka primjerice aktivnost
LDH u pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima Štraus (1992) navodi:
1. poprečnoprugasti mišić 147 U/g, 2. jetra 145 U/g, 3. srce 124 U/g, 4. bubreg 106 U/g, 5. limfni čvorovi 83 U/g, 6. gušteraća 50 U/g, 7. eritrociti 36 U/g, 8. pluća 27 U/g.
Za mužjake Wistar štakora 100 - 120 grama Anbarust (2005) navodi aktivnost LDH u
pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima:
1. pluća 19.5 ± 1.17 U/mg proteina, 2. srce 18.42 ± 1.12 U/mg proteina 3. jetra 13.80 ± 2.10 U/mg proteina, 5. bubreg 9.75 ± 0.28 U/mg proteina, 6. mozak 8.20 ± 1.09 U/mg proteina
Slično, u tekstu Clinical chemistry (http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/2005.) iznešene su slijedeće vrijednosti LDH prema aktivnosti u organima štakora:
1. poprečnoprugasti mišić 453 U/g
2. srce 360 U/g
3. jetra 212 U/g
4. probavilo 185 U/g
5. bubreg 167 U/g
6. serum 109.5 ± 9.1 U/L
Značaj mjerenja aktivnosti LDH u toksikološkim i kliničkim istraživanjima je velik
pogotovu mjerenje aktivnosti u serumu i organima ili elektroforetska karakterizacija pojedinih
frakcija izoenzima. Najbitnije je napomenuti da se prilikom promatranja povećanja ili
smanjenja LDH u serumu, a u svrhu dijagnosticiranja bolesti ili tumačenja patološko -
toksikoloških ili farmakoloških učinaka noksi, uz LDH treba uspoređivati kretanje i drugih
kliničko fiziološko - biokemijskih (napose enzimskih) parametra.
31
Za svaki organski sustav za koji se postavlja ovakav tip dijagnostike setovi varijabli koji se
uspoređuju uglavnom su dugogodišnjim istraživanjima već standardizirani, stoga u slijedećem
pregledu literature napomenut će se i kretanje ostalih parametara karakterističnih za oštećenje
pojedinog organskog sustava. LDH je raširen u većini tkiva po cijelom organizmu. Iako među
tkivima zamjetne razine u ekspresiji enzima postoje, on najčešće indicira sistemsku toksičnost
ali i oštećenja onih organa koji ga sadrže najviše. Primjerice, izraženija promjena aktivnosti
LDH u serumu uočena je kod bolesti i oštećenja skeletne muskulature, srca (uglavnom infarkt i
perikarditis), jetre, pluća a u manjoj mjeri kod kancerogenih oboljenja i oboljenja gušteraće.
Mnogi autori spore informativnost LDH enzima u patološkoj dijagnostici upravo zbog njegove
ubikvitarnosti, a drugi pak iznose brojne dokaze o njegovoj dobroj dijagnostičkoj vrijednosti.
Dio tih korelacija razine LDH s toksičnim ili patofiziološkim noksama iznosimo u daljnjem
tekstu.
LDH i poprečnoprugasti mišić. Miozitis i polimiozitis, amputacije, pasaža parazita,
distrofije, miotoksične miopatije tipična su stanja kod kojih se aktivnost LDH mijenja (raste ili
opada), dok se primjerice kod miastenia gravis izmjerene vrijednosti ne mijenjaju osim ako se
istovremeno oštećuje jetra ili drugi organi koji sadrže puno LDH. Također uočeno je da
pojačana fizička aktivnost i učestalo vježbanje u čovjeka i svinja znatno povećava aktivnost
LDH u poprečnoprugastim mišićima, dok isti parametri kod konja umanjuju aktivnost LDH u
serumu, obrazloženje nije poznato. Mehanizmi koji uzrokuju miotoksičnost poprečnoprugastih
mišića uključuju promjene u staničnoj membrani mišića i promjene u energetskom i
metaboličnom statusu povezanom s mitohondrijima (Evans 1996, Capsoni 2000, Larsson i
Oldfors 2001).
Već blaža promjena propusnosti stanične membrane uzrokuje izlazak sadržaja iz sarkoplazme u
krv, što se mjerenjem aktivnosti očitava kao povećanje aktivnosti LDH u serumu. Kako
oštećenjem membrane ona biva sve jače propusna, proporcionalno raste i vrijednost aktivnosti
serumske LDH, a ukoliko dijelovanje noksa na poprečnoprugasti mišić traje kronično može se
zabilježiti i opadanje aktivnosti LDH, ovakva dinamika vrijedi i za ostale organe i enzime
(Bacci i sur. 1999).
Uz spomenute promjene aktivnosti serumske LDH za točnije dijagnosticiranje oštećenja
poprečnoprugastih mišića uz izravne enzimsko-histokemijske metode bojanja LDH na uzorku
poprečnoprugastog mišićnog tkiva, koje su ograničene semi-kvantitativnošću, moguće je pratiti
32
promjene aktivnost enzima aspartat aminotransferaze (AST), kreatin-kinazae (CK), aldolaze,
troponina (njihovo standardiziranje tek je u istraživačkoj fazi) ili kreatina i mioglobina. Iako se
promjene ovih enzima prate i kod oštećenja srčanog mišića uslijed infarkta miokarda, a metoda
razlikovnog testa je mjerenje promjena pojedinih izoenzima ili njihovo elektroforetsko
razlučivanje (CK - MP i LDH1 i LDH2 (tj. α - HBDH) najbolji su izoenzimski pokazatelji za
dijagnosticiranje miopatija skeletnog mišića). Kod infarkta miokarda, promjena aktivnosti teče
na slijedeći prepoznatljiv način. Prvo najviše poraste aktivnost CK, oko 20 - 40 puta, zatim
AST do 10 puta, sve unutar prvih 24 sata. LDH u serumu počinje rasti 8 - 10 sati nakon infarkta
miokarda, unutar 48 - 72 sata doseže povećanje 5 - 6 puta a normaliziranje vrijednosti uočava
se tek 8 - 14 dana nakon infarkta miokarda. U većine ostalih miokardijalnih oboljenja
aktivnosti enzima u serumu su normalne. Jedino kod perikarditisa mogu biti umjereno
povišene, a postoje i indicije da hipoksično - anoksična stanja nastala uslijed nekih toksikanata,
primjerice etanola mogu povistiti serumski LDH, CK i mioglobin, porijeklom iz srca, ili
promjeniti izoenzimsku elektroforetsku pokretljivost LDH mozga pri izoelektričnom
fokusiranju. Budući da su promjene spomenutih enzima na opisani način uglavnom uočene kod
infarkta miokarda, a u drugih se miokardijalnih miopatija vrlo rijetko mjenja enzimska slika
LDH i spomenutih enzima, njihova promjena najčešće se pripisuje uglavnom oštećenjima
poprečnoprugastih mišića (Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres
1979, Moses i Henderson 1987, Franković 1990, Štraus 1992, Evans 1996, Kaneko 1997,
Guppy i Littleton 1999, Schmidt 2000, Capsoni 2000, Larsson i Oldfors 2001, Rajab i sur.
2004, Park i sur. 2004, Vianna i sur. 2004).
Toksikološki gledano, brojni su primjeri miotoksičnog djelovanja različitih polutanata,
pesticida ili lijekova koji mijenjaju aktivnost LDH u serumu. U štakora klorpromazin apliciran
intramuskularno, ali ne i intraperitonealno podiže razinu aktivnosti enzima tipičnih za mišićje.
U pokusu provedenom na zečevima simvastatin, sredstvo za snižavanje lipida, izaziva lezije
poprečnoprugastog mišićja. Jedno drugo hipolipidemično sredstvo, 3-hidroksi-3-metil-glutaril-
koenzim A (HMGCoA) uzrokuje iste promjene u pokusu provedenom na marmozetu. Injekcije
diazepama, benzoktamina i petidina u pokusu provedenom na psima te diazepama, lidokaina i
digoksina u pokusu na zečevima uzrokuju nekroze mišića i povećanje razine enzima u serumu
(poglavito CK). Slična miotoksična svojstva sa relativno kratkotrajnim učinkom na povećanje
33
aktivnosti serumskih LDH i CK pokazali su u pokusima na štakorima i majmunima ketamin i
tetraciklin (Evans 1996).
U studiji utjecaja kadmija i terapije antioksidantom difenilselenidom (toksikološki
antagonist mnogih teških metala poput arsena i dr.) Santos i sur. (2005) pokazuju da zbog
lipidne peroksidacije koja je uslijedila nakon aplikacije kadmija subkronično, aktivnost LDH u
serumu naraste i do 1.99 puta više od normale. Hirano (1996) u studiji utjecaja inhalatorne
toksičnosti različitih teških metala bilježi znatno povišenje aktivnosti LDH u
branhioalveolarnoj tekućini i zaključuje da je linearna korelacija porasta aktivnosti ovog
enzima i polimorfonuklearnih leukocita s dozama teških metala pokazatelj da je aktivnost LDH
najbolji indeks za vrednovanje potencijala izazivanja pulmonarne upale uzrokovane
inhalacijom aerosola koji sadrže teške metale. U raspravi rezultata autor predlaže da takvo
mjerenje postane obavezni standard pri svim inhalatornim studijama toksičnosti.
U pogledu inhalatorne toksičnosti, postoje dokazi da i duhanski dim povećava razinu LDH u
serumu (Anbarasi i sur. 2005). Anbarasi i autori pokazuju utjecaj duhanskog dima cigareta na
LDH i izoenzimski elektroforetski uzorak. Nedvojbeno razina aktivnosti ukupne LDH u
štakora je povećana u svim analiziranim organima (mozak, pluća, srce, jetra, bubreg, serum) i
izoenzimskim frakcijama. Nije uvjek slučaj da toksikanti povećavaju razinu serumske LDH
aktivnosti, neki drugi otrovi koji imaju drugačije puteve farmakokinetike, distirbucije i
akumulacije, te ciljno pogađaju organe koji sadrže manje količine LDH ne uzrokuju takve
promjene. Primjerice Boscolo i sur. (1982) u kroničnoj studiji toksičnosti arsena prisutnog u
vodi za piće u koncentraciji od 50 μg/ml tijekom 320 dana, na štakorima ne bilježe znatnije
povećanje aktivnosti LDH u serumu. Autori uočavaju manje patološke promjene na
hepatocitima, ali velika patološka oštećenja na bubregu (Boscolo i sur. 1982). Bubreg sadrži
manje LDH nego jetra, poprečnoprugasti i srčani mišić, a u samom bubregu postoje razlike u
količini LDH, pri čemu distalni kanalići imaju više LDH nego proksimalni kanalići (Stonard
1997).
Izraženiji porast aktivnosti LDH u serumu uočen je kod šoka i trauma, što je posljedica
djelovanja stresa na srčani mišić, ali i djelovanja neurohormona koji se luče tijekom stresa na
poprečnoprugasti mišić. Sanchez i sur. (2002) u studiji utjecaja akutnog stresa na oštećenja
tkiva istražuju dijelovanje socijalnog i emotivnog stresa na miševima, a kao pokazatelje
oštećenja tkiva uspoređuju razinu serumske aktivnosti LDH, AST, CK, ALT, De Ritisov omjer,
34
α- HBDH, CK-MB enzima, razinu EGF i glikogena. Pri obje vrste ispitivanog stresa životinje
su pokazale razinu aktivnosti serumske LDH značajno višu od kontrolnih životinja i normalnih
referentnih vrjednosti. Rezultati pokazuju da osim srca i drugi organi doprinose povećanju
razine LDH i kod emotivnog i kod socijalnog stresa. Autori se napose osvrću i na
poprečnoprugasti mišić. LDH spada među enzime koji se standardno u medicinsko
biokemijskoj dijagnostici uspoređuju kako bi se otkrilo oštećenje jetre, iako najveći dio
dijagnostike u pogledu jetre odnosi se na aktivnosti AST i ALT te De Ritiusovog omjera.
Kolokvijalno, LDH AST, ALT (najčešće mjereni), SDH, GDH, ICDH, MDH¸ 5´nukleotidaza
(rjeđe korišteni) nazivaju se još i «jetrene probe», naime kod primjene većine ljekova, ali i pri
toksikološkim studijama u većine otrova, a zbog biotransformacijske i filtracijske uloge jetre,
dolazi do oštećenja hepatocita i/ili žučovodnog epitela. Ciroza, toksični hepatitis, virusni
hepatitis, naročito nekroza ali i apoptoza hepatocita koji slijede nakon nabrojanih stanja te kod
postojanja metastaza, osobito onih u jetri nalaze se visoke aktivnosti LDH. (Evans 1996,
Kaneko 1997, Radman i Harapin 1998, Štraus 1992). Franković primjerice (1990) dokazuje
porast aktivnosti LDH u plazmi nakon djelovanja 2,4-D na organizam štakora pri čemu se kao
glavni uzrok ovog porasta pokazao milijarni hepatitis u otrovanih životinja.
Kod oboljenja gušteraće, iako je najbolji pokazatelj patoloških promjena α - amilaza,
povećanje aktivnosti LDH u serumu daje sliku o tijeku bolesti a pogotovo usporedbom
promjena omjera aktivnosti LDH:AST govori o nekrotičnim promjenama u gušteraći (Isogai i
sur. 1998). Isogai objašnjava ulogu LDH kao osjetljivog indikatora nekroze gušteraće u razvoju
bilijarnog pankreatitisa. Autor napominje da je aktivnost tzv. jetrenih enzima u pacijenata koji
boluju od bilijarnog pankreatitisa u ranoj fazi bolesti povišena. Kao razlog navodi se akutna
upala jetrenog tkiva u najranijem tijeku bolesti. Nadalje autor govori da se pri kroničnom tijeku
bolesti, a ukoliko se u bolesnika pojavljuje nekroza gušteraće, aktivnost LDH održava na vrlo
viskoj razini. Kao potvrdu nekrotičnim promjenama autor napominje da omjer LDH:AST,
promatran tijekom tri tjedna, u pacijenata sa nekrozom gušteraće viši nego u onih koji nisu
imali taj simptom. Potvrdu postojanja nekrotičnih promjena gušteraće autor je dobio CT
skenerom abdomena pacijenata s bilijarnim pankratitisom. Isogai zaključno ističe ovaj indeks
omjera vrlo vrijednim (poput De Ritiusovog omjera za jetru) i naglašava njegovu dijagnostički
informativnu vrijednost te ga preporuča kao standardnog za spomenute bolesti gušteraće, uz
ostale pokazatelje pankrasnih oštećenja pr. α-amilaze, glukoze, inzulina.
35
2.4.7.2. Gama-glutamil-transferaza, γ-GT, GGT (EC. 2.3.2.2.)
γ-glutamil-transferaza dimerni je glikozilirani enzim (glikoprotein) lociran na vanjskoj strani
membrane epitelnih stanica, veličine 80 - 90 kD prema Štraus (1992) ili 90 - 350 kD prema
Kaneko (1997). Prema EC klasifikaciji svrstava se u skupinu hidrolaza, peptidaza (točnije
karboksipeptidaza). Peptidaze kataliziraju hidrolitičko cijepanje peptida do manjih peptida ili
aminokiselina.
γ-GT reverzibilno katalizira prijenos γ- glutamilne skupine s γ-glutamil-peptida na druge
polipeptide u L-aminokiselina, uz prisutstvo ATP. Prvotno je γ-GT nazvana transpeptidaza, ali
je termin kasnije promijenjen u prikladniji, transferaza. Fiziološka uloga povezana je sa
metabolizmom glutationa (ciklus sinteze glutationa, γ-glutamilski ili Meisterov ciklus) i
stvaranjem merkapturnih kiselina u krajnjim stupnjevima detoksikacije i biotransformacije
reakcija faze II u bubregu (Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). U daljnjem pregledu
literature biti će iznešene neke novije spoznaje o mogućim drugim različitim ulogama ovog
enzima.
γ-GT koji se koristi kao biomarker u toksikologiji tj. kao kliničko - dijagnostički marker,
dimer je sastavljen od dva glikolizirana monomera koji potječu od jednog polipeptida
(propeptid). Taj polipeptid je kodiran jednim genom sa višestrukim promotorskim mjestima i
vrlo kompliciranim procesom transkripcije, translacije te kasnijim proteolitičkom
transformacijom (splicing) u dva različita monomera. Monomeri se spajaju stvarajući
heterodimer koji se usidri na vanjskoj strani membrane stanica koje sadrže γ-GT. Manjim
dijelom (oko 10%), γ-GT može postojati u jetri, kao slobodna, topiva forma. Vezani γ - GT
prelazi u slobodni γ - GT enzimskim procesom, vjerojatno dijelovanjem proteaza ili
deterdžentskim djelovanjem žućnih kiselina.
U publikaciji Joyce - Brady i sur. (2000) demonstriralo se postojanje γ - GT enzima i na
membrani endoplazmatskog retikuluma, ali se nakon posttranskripcijske i translacijske obrade
ne događa spajanje monomera u heterodimer već su samo monomerne jedinice uklopljene u
strukturu membrane. Kao takve one su aktivne ali je primjetno da izostaje njihova transferazna
aktivnost. Označava se nazivom γ - GTΔ7, a veličine je 44 kD. Prisutnost monomera na
membrani uočena je u tkivima koja imaju visoku razinu ekspresije γ - GT, primjerice bubreg,
36
stoga autori zaključno navode vjerojatno postojanje novih funkcija vezanih uz endoplazmatski
retikulum, za razliku od same transaminacije koju vrši heterodimerni ektoenzim stanične
membrane. Predlažu da monomer služi kao receptorna signalna jedinica koja signalizira manjak
ekspresije γ - GT, i aktivira ER da proizvede dodatne transpeptidazne dimere.
Razni multipli oblici enzima razlikuju se u glikozidnom dijelu molekule. Glikozidni dio
sadrži šećere heksoze, heksamine i sijalinsku kiselinu. Prema tome «izoenzimi» γ - GT nisu
pravi izoenzimi nego multipli oblici (izoforme) nastali posttranslacijskim modifikacijama
(Joyce - Brady i sur. 2000, Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). Chikhi i sur. (1999) u
studiji organizacije i ekspresije gena za γ - GT u štakora, miša, svinje i čovjeka utvrđuju visoku
konzerviranost genoma tijekom evolucije a stoga i visoku sličnost γ-GT među spomenutim
vrstama, što potvrđuju i autori prethodno citirane publikacije Joyce-Brady i sur. (2000).
Nadalje, Chikhi i sur. (1999) u svojoj studiji zaključuju da se indukcija transkripcije gena za γ -
GT odvija s nekoliko promotorskih mjesta unutar jednog gena, upravo takva kompleksna
organizacija transkripcije omogućuje njenu indukciju nakon različitih vrsta oksidativnog
podražaja ksenobiotika koji ovisno o afinitetu za pojedino promotorsko mjesto pokreću
transkripciju s pripadajučih promotorskih mjesta. Zaključno, autori tumače da je upravo taj
komplicirani mehanizam zadužen za široku paletu stanične antioksidativne obrane preko
inducirane ekspresije γ-GT.
Elektroforezom serumskih proteina u zdravih ljudi nalaze se obično samo dvije izoforme.
Najveći dio aktivnosti otpada na izformu γ-GT1 Ostatak aktivnosti čini izoforma γ-GT 2 U
lipemičnim serumima koji sadrže hilomikrone na startu zaostaje dio koji se označuje kao γ-GT0
Dokazano je da ovaj «izoenzim» predstavlja kompleks γ-GT sa hilomikronima, i kad se uklone
hilomikroni nestaje i ova frakcija γ - GT iz seruma. Katkad se u serumu pojavljuju i γ- GT3 i γ-
GT4
Najviše γ - GT ima u bubrežnim tubulima, vezanog na četkasti obrub (engl. brush border)
epitelnih stanica proksimalnih tubula, te u Henleovoj petlji, žučovodu, stijenci tankog crijeva i
mozgu (horionskim pleksusima), dakle upravo na mjestima gdje se izvodi apsorpcija ili
prijenos aminokiselina kroz stanične membrane. Nešto manje, ali ipak znatne količine nalaze se
u hepatocitima, gušteraći i prostati. Ima ga vrlo malo, ali značajno u jajnicima, mlječnim
žlijezdama, placenti, slezeni, plućima, štitnjači, leukocitima i eritrocitima.
37
U tjelesnim tekućinama najveća aktivnost γ - GT je u sjemenoj tekućini, u žuči, urinu i krvnoj
plazmi. U čovjeka normalno povišena koncentracija je u novorođenčadi do dva mjeseca
starosti. U trudnoći je razina γ - GT snižena (Štraus 1992).
Serumske vrijednosti u zdravih odraslih ljudi iznose (prema autorima u zagradi):
1. muškarci : 7 - 40 U/L (Štraus 1992), do 28 U/L (Kruse - Jarres 1979) 0 - 65 U/L, optimum 32.5 U/L (Jeger i Hedegaard 2002)
2. žene: 4 - 25 U/L (Štraus 1992), do 18 U/L (Kruse - Jarres 1979) 0 - 45 U/L, optimum 22.5 U/L(Jeger i Hedegaard 2002)
3. novorođenčad: do 100 U/L (Kruse - Jarres 1979) 4. bez specificiranog spola 2 - 65 U/L (Deepak i Rosen 2000)
Serumska aktivnost γ - GT relativno je niska u pasa mačaka, miševa i štakora, a zamjetno je
viša u konja, preživača i zamoraca. Također je dokazano da kolostrum krave, ovce i koze ali ne
i kobile sadrže visoke razine vrijednosti γ - GT (Kaneko 1997).
Kaneko navodi slijedeće vrijednosti γ - GT u serumu životinja:
1. Konj 4.3 – 13.4 U/L (7.6 ± 1.5 U/L) 2. Govedo 6.1 – 17.4 U/L (157 ± 4 U/L) 3. Ovca 20 - 52U/L (33.5 ± 43 U/L) 4. Koza 20 - 56 U/L (38 ± 13 U/L) 5. Svinja 10 - 60 U/L (35 ± 21 U/L) 6. Pas U/L 1.2–6.4 U/L (3.5±1.8 U/L) 7. Mačka 1.3 – 5.1 U/L
Radman i Harapin (1998) navodi slijedeće vrijednosti aktivnosti γ - GT za slijedeće vrste životinja:
1. Govedo do 1500 U/L 2. Svinja do 600 U/L 3. Ovca do 530 U/L 4. Konj do 400 U/L 5. Pas do 100 U/L 6. Mačka do 7 U/L
38
Za miševe u literaturi se ovisno o soju navode slijedeče vrijednosti γ - GT aktivnosti u serumu:
1. Mady (2002): 12.50 ± 0.65 U/L za ženke, 22 - 25 g, Swiss albino
2. Silva i sur. (2004): 25.52 ± 3.71 U/L (serum) i 0.22 ± 0.03 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino
Porast aktivnosti γ - GT u serumu izuzetno je osjetljiv i pouzdan spram drugih enzima u
serumu. Kada se koristi uz transaminaze i GLDH, vrlo je dobar za diferencijalnu dijagnostiku u
medicinskoj biokemiji. Kod akutnog hepatitisa on se od svih enzima najsporije vraća u
normalu. Njegovo utvrđivanje nije toliko važno da se utvrdi početak bolesti koliko je važno da
se utvrdi tijek bolesti. Kod hepatobilijarnih bolesti porast aktivnosti primarno je uzrokovan
oštećenjem žučovoda a tek sekundarno zbog oštećenja hepatocita.
Dobar toksikološki model je tretiranje životinja s ANIT (α - naftil - izotijocijanat) koji
primarno oštećuje žučovodni epitel a kronično uzrokuje njegovu nemalignu hiperplaziju,
posljedica čega je povišenje vrijednosti γ - GT u serumu. Kod akutne intoksikacije s oštećenjem
jetre aktivnost γ - GT poraste najmanje dvostruko. Kod slabijeg otrovanja jetre GLDH poraste
više od γ - GT. Kod zamašćenja jetre netoksičnog porijeka γ - GT raste slično transaminazama.
Kod malignih promjena u jetri vrijednosti γ - GT su enormno povišene. Kod akutnog
pankreatitisa i kod upale žučnih kanala također raste vrijednosti γ - GT.
Vrijednosti γ - GT su povišene u krvi u slijedećim slučajevima: hepatobilijarne bolesti,
bolesti gušterače, u bolesnika koji uzimaju lijekove što induciraju enzime endoplazmatskog
retikuluma (npr. barbiturati, dilentin, pogotovu alkohol). Koncentracija γ - GT je povišena i
nekoliko dana nakon infarkta miokarda. Taj se test ne upotrebljava u dijagnostici infarkta
miokarda jer nije specifičan.
Određivanje razine ovog enzima ima vrijednost i u diferencijalnoj dijagnostici žutice. Kao
marker nefrotoksičnosti, koriste se vrijednosti γ - GT u kombinaciji s AP (Štraus 1992).
U toksikologiji je posebice zanimljiv pokus na ovcama koji ističe potencijal enzimske
dijagnostike kao bitnog diskriminatornog selekcijskog fenotipskog obilježja u fundamentalnoj
populacijskoj genetici toksičnosti. Naime, ovcama koje su prirodnim putem bile izložene
hepatotoksinu sporidezminu poveća se razina γ - GT u serumu kao izravna posljedica ligacije
39
žučovoda. Selektirajući one ovce sa minimalnom ili nikakvom promjenom aktivnosti γ - GT
tijekom nekoliko generacija dobiva se linija ovaca u potpunosti otpornih na ovaj hepatotoksin
(Kaneko 1997).
40
2.4.7.3. Alkalna-fosfataza, ALP, AP, AlP (EC. 3.1.3.1.)
Naziv obuhvaća grupu izoformi glikoproteinskih enzima. Prema EC klasifikaciji spadaju u
skupinu enzima hidrolaza mase 40-83 kD, koji pri alkalnom pH kataliziraju hidrolitičko
cijepanje fosfatnih monoestera, uključujući i ATP.
ortofosfatni monoester + H2O → alkohol + ortofosfat
U alkalnom dijelu pH skale, između 8.4 i 10.5 se nalazi optimalno područje djelovanja, po
čemu je enzim i dobio ime. Enzim je vezan na stanične membrane kao tetramer i prisutan je u
većini tkiva, upravo na sekretornim i apsorptivnim površinama. U serumu se nalazi otopljen
kao dimerna hidrofilna forma, manje molekularne mase (Slika 7.).
Tetramernih membranskih hidrofobnih formi, veće molekularne mase najviše ima u epitelu
tankog crijeva, bubrežnim tubulima (proksimalni tubuli), u kostima (primarno na
osteoblastima), jetri (na epiteli žućnih kanalića), placenti, plućima, slezeni i leukocitima.
(Štraus 1992).
Slika 7: Prikaz molekularne strukture ljudske alkaline fosfataze, Ec: 3.1.3.1., dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Le Du, M. H., Stigbrand, T., Taussig, M. J., Menez, A., Stura, E. A.: Crystal Structure of Alkaline Phosphatase from Human Placenta at 18 A Resolution. Implication for a Substrate Specificity. J.Biol.Chem. 276 pp. 9158 (2001)
41
ALP je jedan od enzima o kojem se danas podosta zna jer je od 1920-tih pa do danas često
upotrebljavan u medicinskoj i veterinarskoj dijagnostici, ali i fundamentalnim znanstvenim
istraživanjima kao oruđe u vizualizaciji imunohistokemijskih preparata, u ELISA assay-u,
Western bloting-u i mnogim drugim znanstvenoistraživačkim metodama.
ALP je grupno specifični enzim; hidrolizira najrazličitije estere ortofosfata s primarnim i
sekundarnih alkoholima, šećerima, cikličkim alkoholima, fenolima, aminima kao akceptorskim
molekulama za oslobođeni fosfat. Ne djeluje na difosfatne estere. Niska specifičnost se očituje i
u tome što hidrolizira i pirofosfat.
Kako je već spomenuto membranski ALP je tetramer, serumski ALP je dimer, a svaka
podjedinica (monomer) sadrži atom cinka (Zn), dakle dva atoma Zn po molekuli za serumke
hidrofilne oblike i četiri za transmembranske. Zn atomi imaju ulogu u održavanju nativne
konformacije i sudjeluju u katalitičkom procesu. Nalazi se u organizmu u multimolekularnim
oblicima od kojih su neki izoenzimi, a drugi izoforme nastale nakon sinteze enzima, te se
govori o jetrenoj, koštanoj, crijevnoj, bubrežnoj i placentarnoj alkalnoj fosfatazi.
Danas znamo da svi ovi oblici nisu pravi izoenzimi. Tri su prava izoenzima ALP koje
kodiraju tri razna gena u čovjeka i majmuna primata. To su intestinalni, placentarni i tkivni
nespecifični izoenzim. Tkivni nespecifični gen izražen je u jetri, kostima i bubregu. Stoga su
intestinalna i placentarna ALP pravi izoenzimi, dok su jetrena, koštana i bubrežna ALP
izoforme jednog tkivno nespecifičnog izoenzima. Za razliku od spomenuta tri gena kod čovjeka
i primata u drugih sisavaca, nalaze se samo dva gena za ALP. Jedan koji u pravilu kodira za
intestinalnu ALP i drugi koji kodira ostale oblike ALP koji su antigenski slični budući da ih
kodira jedan gen.
Postoje rjetke iznimke, primjerice zec, kod kojeg su oba gena eksprimirana u jetri, probavilu
i bubregu ili konj kod kojeg se i intestinalna ALP eksprimira još i u bubregu. Serumska ALP
upravo zbog navedenih interspecijskih razlika potiječe u različitih vrsta u većoj mjeri od
različitih organskih sustava. U štakora primjerice glavninu aktivnosti serumske ALP
obuhvaćaju izoforme porijeklom iz probavila i kosti, kod psa glavnina aktivnosti pripisana
hepatičkoj izoformi. U pokusima na štakorima uočilo se da aktivnost ALP i serumu raste nakon
obilnog obroka dok kod drugih laboratorijskih životinja to nije slučaj. Slično u psa injiciranjem
glukokortikoida raste aktivnost ALP u serumu za koji je uočeno da je nakon takvog tretmana
42
hiperglikoziliran. Vrlo niske aktivnosti serumske ALP poznate su u pasa i mačaka (Evans 1996,
Jeger i Hedegaard 2002).
Vrijednosti aktivnosti serumske ALP za laboratorijskog miša i štakora dane su s obzirom na
navode različitih autora u slijedećem popisu:
Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999):
C57BL; 94 - 99 U/L Albino CD-1; 22.2 U/L
Cruz i sur. (2004):
B6C3F1; 82 ± 10 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):
Soj nije specificiran 35 - 96 U/L Kaneko (1997):
Soj nije specificiran 66 ± 19 U/L Khan i sur (2005):
Balb/c (9 - 14 tj.); 20 U/L
Za laboratorijskog štakora: Mc Clure (1999):
Soj nije specificiran; 39 - 216 U/L Franković. (1990): Y59; 44.03 ± 2.94 U/L (39.5 – 44.9 U/L) Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):
Soj nije specificiran 16 - 50 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 133 ± 134 U/L
Kemijski sastav ALP varira ovisno o mjestu sinteze te se tako može locirati izvor povišenja
koncentracije u krvi. Općenito govoreći u većine vrsta standardnih pokusnih životinja
bubrežna ALP nije prisutna u serumu već se glavnina aktivnosti pripisuje jetrenom
porijeklu (tj. iz epitela žućnih kanalića).
Vrijednosti serumskih ALP u pojedinih životinja prema različitim autorima su navedene u
slijedečem popisu:
43
Kaneko (1997):
1. Konj 143 - 395 U/L (244 ± 101 U/L) 2. Govedo 0 - 488 U/L (194 ± 126 U/L) 3. Ovca 68 - 387 U/L (178 ± 102 U/L) 4. Koza 93 - 387 U/L ( 219 ± 76 U/L) 5. Svinja 118 - 395 U/L (104 ± 84 U/L) 6. Pas 20 - 156 U/L (66 ± 36 U/L) 7. Mačka 25 - 93 U/L (50 ± 35 U/L)
Radman i Harapin (1998):
1. Konj do 190 U/L 2. Govedo do 105 U/L 3. Ovca 24 - 124 U/L 4. Svinja 74 - 157 U/L 5. Pas do 100 U/L 6. Mačka do 37 U/L
ALP je organospecifični enzim, za razliku od laktat-dehidrogenaze gdje je krakterističan
odnos frakcija koje se pojavljuju u svim tkivima. U serumu zdravih osoba potječe obično iz
jetre, u djece iz kosti, u trudnica povišena je koncentracija i u trećem tromjesečju trudnoće,
dok je bubreg izvor urinarne ALP (Štraus 1992).
U ljudskim organima nalazimo na slijedeće vrijednosti aktivnosti ALP :
Štraus (1992): 1. probavilo (duodenum) 51.1 U/g 2. kosti 42.5 U/g 3. jetra 33.1 U/g 4. bubreg 28.8 U/g 5. prostata 72 U/g
Kao normalne serumske vrijednosti bez specificiranog spola aktivnosti ALP autori navode:
Štraus (1992): 1. ljudi (odrasli) 50 - 200 U/L DEA pufer, 2. ljudi (odrasli) 30 - 90 U/L AMP pufer, 3. djeca do 3. god. 120 - 280, 4. djeca od 3. – 15. god. 100 - 300 U/L, 5. djeca od 15. – 20. god. 40 - 165 U/L.
44
Kruse - Jarres (1979): 1. ljudi (odrasli) 40 - 190 U/L, 2. djeca od 1. – 10. dana 40 - 190 U/L, 3. djeca od 10. – 30. dana 110 - 600 U/L, 4. djeca od 2. – 12. mjeseca 140 - 700 U/L, 5. djeca od 2. – 8. god 110 - 600 U/L, 6. djeca od 8. god života 130 - 700 U/L
Jeger i Hedegaard (2002): odrasli : 20 - 125 U/L , optimum odrasli 72.5 U/L djeca: 40 - 400 U/L , optimum djeca 220 U/L
Koncentracija u ALP krvi povišena je u razdoblju intenzivnog rasta kostiju jer je ALP tipičan
enzim osteoblasta. Visoke koncentracije u osteoblastima sudjeluju u nagomilavanju velikih
koncentracija ortofosfata zbog čega se u konačnici omogućuje mineralizacija koštanog
matriksa. Stoga se tijekom infantilnog i juvenilnog rasta kostura uočava povišena koncentracije
ALP u krvi. Do povišenja dolazi i nakon fraktura velikih kostiju. Prilikom stvaranja kalusa
povečava se aktivnost ALP u serumu
Osobito je velika dijagnostička vrijednost određivanja ALP u koštanim bolestima i
bolestima jetre i žučnih vodova. Porast vrijednosti ALP javlja se i kod oboljenja koja su
popraćena pojačanim pregrađivanjem koštane tvari – osteitis deformans. Rahitis, osteomalacija,
hiperparatireodizam te tumori kostiju – uz približnu proporcionalnost razine ALP u serumu s
veličinom tumora; su stanja karakterizirana povišenjem koncentracije ALP u krvi.
Kod jetrenih bolesti također nailazimo na porast ALP aktivnosti, primjerice neinfektivni
hepatitis je jedno od takvih patoloških stanja. Žučne kiseline induciraju sintezu ALP, stoga je
razina ALP u krvi povišena u svakom tipu bilijarne opstrukcije, primjerice u infiltracijskih
bolesti jetre kao što su granulomi, apscesi i tumori, te u primarnoj bilijarnoj cirozi.
Blago povišenje, koje nema veze ni s jetrom niti s kostima se javlja zbog, abdominalne
bakterijske infekcije, a ponekad zbog nekih stanja miokarda. Razina ALP snižena je ispod
normalne u samo nekoliko bolesti, naročito u hipoparatireozi (Brain i Davenport 1927, Štraus
1992).
45
2.4.7.4. Kreatin, kreatinin i kreatin-fosfokinaza, kretin-kinaza (CK, CPK,
EC. 2.7.3.2.)
Kreatin je po kemijskoj strukturi metilguanidooctena kiselina. Gubitkom molekule vode iz
njega nastaje kreatinin, koji je prema tome anhidrid kreatina. Metabolizam kreatina i kreatinina
odvija se u mišićima, jetri bubrezima i gušteraći. Prvo u bubrezima iz arginina i glicina nastaju
ornitin i guanidooctena kiselina. Guanidinooctena kiselina prelazi u jetru (manjim dijelom u
gušteraću), gdje se pomoću metionina metilira i nastaje kreatin.
Kreatin krvlju dospjeva u bubreg, gdje se u odraslih osoba filtrira u glomerularni filtrat i
tubulima gotovo sav reapsorbira. Iz krvne plazme ga aktivnim transportom preuzimaju mišične
stanice, u kojima se fosforilira te nastaje energetski bogati kreatin–fosfat. Prilikom kontrakcije
mišića kreatin fosfat služi kao donor energije, pri čemu se ponovno oslobađa kreatin. Kreatin-
fosfat se u mišićnim stanicama i spontano raspada pri čemu nastaje kreatinin. Tako nastali
kreatinin se krvlju prenosi do bubrega, gdje se glomerularnom filtracijom izlučuje iz
organizma. Kreatin-kinaza (CK, CPK, EC 2732) enzim je koji katalizira reakciju prijenosa
fosfata između kreatin fosfata i ADP, tj između kreatina i ATP. Iz ovih se reakcija stvara ATP
potreban za rad mišića. CK je enzim od 85 kD. Enzim je dimer koji se sastoji od monomera s
masom od 413 kD (slika 8.).
Slika 8.: Prikaz molekularne strukture ljudske kreatin-kinazae, podjedinice M iz ljudskog poprečnoprugastog mišića, Ec: 2.7.3.2 dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Shen, Y.-Q., Tang, L., Zhou, H.-M., Lin, Z.-J.: Structure of Human Muscle Creatine Kinase Acta Crystallogr., Sect.D 57 pp. 1196 (2001)
46
Poput prethodno opisane LDH i kod CK postoje monomerni oblici mišićni M (od engl. muscle)
i moždani B (od engl. brain) koji se spajaju u tri izoenzimska oblika (MM, MB, BB).
Enzim je najrasprostranjeniji u poprečnoprugastim mišićima i mozgu. Prema zastupljenosti
CK u pojedinim organima čovjeka navodi se:
Štraus (1992): 1. poprečnoprugasti mišić 2030 U/g 2. mozak 670 U/g 3. glatki mišić 12 U/g 4. bubreg 2 U/g 5. jetra 0.7 U/g 6. serum odrasli muški 20-110 U/L
odrasli ženski 10-80 U/L
Kreatina ima u serumu, eritrocitima, gastrointestinalnoj tekućini, žući, znoju i likvoru.
Koncentracija kreatina u serumu rezultat je fiziološke ravnoteže njegova nastajnja, prelaska u
mišiće i u kreatinin te izlučivanja bubrezima (Štraus 1992). Punch (2005) navodi primjere
koncentracije kreatinina koja je u novorođenčadi poradi male mišićne mase relativno niska (0,2
puta manja od odraslih ljudi), a u ljudi koji prakticiraju body building visoka. Autor također
opisuje dinamiku koncentracije serumskog kreatinina ovisno o funkciji bubrega. Navodi da
otklanjanjem jednog bubrega i neposrednim mjerenjem koncentracije kreatinina ona je još
uvijek normalna, ali se već slijedeći dan koncentracija raste za otprilike 18 puta viša od
početnog stanja i kao takva ostaje za ostatka života pacijenta, ukoliko se oba bubrega odstrane
primjerice kod tumora, koncentracija serumskog kreatinina neprekidno raste iz dana u dan do
dijalize.
Brzina porasta serumskog kreatinina biti će direktno proporcionalan mišičnoj masi jedinke. U
odraslih ljudi koncetracija kreatinina vrlo je malena te se jedva može dokazati. Normalne
vrijednosti kreatinina u čovjeka prema različitim autorima dana je u slijedećem popisu:
Štraus (1992): Odrasli, serum, muški 0.6 - 12 mg/dL, urin 0.8 - 2 g Odrasli, serum, ženski 0.5 – 1.1 mg/dL, urin 0.6 – 1.8 g
Kruse - Jarres (1979): odrasli do 1.2 mg/dL u serumu i
1 – 1.5 g/24 h u urinu http//:www.rnceus.com/renal/renalcreat.html (2004):
odrasli muški 0.8 – 1.4 mg/dL u serumu i
47
ženski 0.6 – 1.1 mg/dL u serumu djeca 0.2 – 1.0 mg/dL
Prema navodima autora referentne koncentracije za laboratorijske glodavce navedene su u
slijedećem popisu:
Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999): C57BL 0.88 – 1.01 mg/dL Albino CD m-0.74mg/L; f-0.66 mg/dL Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 0.24 ± 0.06 mg/dL Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 0.2 – 0.9 mg/dL Kaneko (1997): Soj nije specificiran 0.5 ± 1.4 mg/dL Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 0.2 mg/dL
Za laboratorijskog štakora:
Mc Clure (1999):
Soj nije specificiran 0.2 – 0.8 mg/dL Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):
Soj nije specificiran 0.5 - 1 mg/dL Kaneko (1997): Soj nije specificiran 0.40 ± 3.75 mg/dL
48
Koncentracija kreatina povišena je kod atrofije i distrofije mišića te nakon amputacija.
Određivanje serumskog kreatina dijagnostički je važno samo pri atrofiji i regeneraciji mišića u
miopatijama.
Porast kreatinina u serumu izravno je povezan s oštećenjem više od polovice ukupnog broja
nefrona u oba bubrega, pri kroničnom nefritisu, miopatijama uslijed gigantizma, akromegalije i
miastenia gravis.
Smanjene serumskog kreatinina, i kod ljudi i kod laboratorijskih životinja najčešće je
povezano s sa smanjenjem ukupne mišične mase (pr. u starijih jedinki ili fizički premalo
aktivnih) neadekvatnom prehranom s premalo proteina, miotoksičnošću, i različitim mišićnim
atrofijama. Klirens kreatinina tijekom 24 sata odnosnom promjena koncentracije kreatinina u
urinu bitna je dijagnostička odrednica bubrežnih funkcija jer za razliku od BUN testa kreatinin
nije posebno osjetljiv na hepatička oštećenja, a promjene nastaju pri većem oštećenju nefrona
(http//:www.rnceus.com/renal/renalcreat.html 2004, Kruse Jarres 1979, Štraus 1992, Kaneko
1997).
49
2.4.7.5. Alanin-aminotransferaza, ALT ili AAT (EC. 2.6.1.2.)
ALT katalizira reverzibilnu reakciju transaminacije između L - alanina i 2 - oksoglutarne
kiseline. Enzim je poznat i pod sinonimima alanin-trasferaza, glutamat-piruvat-transaminaza
(od tog naziva ranije uporabljana kratica-GPT). Enzim spada u veliku skupinu
aminotransferaza tj transaminaza, koji kataliziraju reverzibilni prijenos amino skupine između
aminokiselina i ketokiselina. Većina aminokiselina u prvom koraku razgradnje i posljednjem
koraku sinteze de novo podliježu reakciji transaminacije.
U prvom koraku razgradnje aminokiselina njihove amino skupine prenose se na α -
ketokiseline pri čemu α - ketokiselina koja je akceptor aminoskupine najčešće je α -
ketoglutarat iz kojeg nastaje aminokiselina glutamat. Aminokiseline koje se na ovaj način
nakupljaju u obliku glutamata mogu biti prenošene na oksaloacetat pri čemu se regenerira α -
ketoglutarat (koji sad opet služi kao akceptor aminoskupine) i nastaje aspartat ili reducirane u
amonijak u reakciji koju katalizira glutamat dehidrogenaza.
Za reakciju transferacije amino-transferazama neophodno je prisutstvo kovalentno vezanog
koenzima piridoksal-5-fosfata (PLP). Ovaj derivat piridoksina tijekom reakcije prolazno se
aminira primitkom amino skupine određene aminokiseline te prelazi u piridoksamin-5-fosfat
(PMP). Piridoksal-5-fosfata (PLP) je kovalentno vezan za enzim tvoreći Schiffovu bazu (imin)
koja nastaje kondenzacijom aldehidne skupine grupe PLP sa ε-amino skupinom lizinskog
ostatka enzima.
Aminokiseline koje najčešće u organizmu ulaze u ovakve reacije su alanin i aspartat, a nešto
rijeđe leucin i tirozin. U skladu s time AST i ALT su dva enzima koji su najaktivnije
aminotransferaze. Iako je omjer AST i ALT specifičan za pojedino tkivo, vrstu i fiziološko
stanje najčešće AST pokazuje višu aktivnost od ALT a indeks njihovog međusobnog omjera
(AST:ALT) poznat je kao De Ritisov omjer i ima veliku dijagnostičku vrijednost.
AST i ALT homologni su ali je preklapanje svega u 15 - 25% od ukupno 400-tinjak
aminokiselina. Geni za ALT nalaze se u miša na kromosomu 15 i kodiraju za 495
aminokiselina stvarajući polipeptidni monomer od 55.011 kD (http://marvester 2005).
ALT ima važnu ulogu u interrelacijskom smislu između metabolizma ugljikohidrata i
dušikovih spojeva. ALT je lokaliziran u većine organa i tkiva, a u stanicama tih tkiva je u
citoplazmi te ga poput LDH smatramo unilokularnim enzimom. Postoji i mitohondrijska
50
frakcija ovog enzima ali za razliku od AST-a mitohondrijska frakcija je nestabilna i nema
široku dijagnostičku vrijednost (Evans 1997, Kaneko 1997, Radman i Harapin 1998, Štraus
1992).
Najviše ALT ima u jetri i mjerenje serumske aktivnosti direktno govori o stanju hepatocita
iako u dijagnostičkim tumačenjima rezultata treba promatrati nekoliko enzima (AST, ALT,
LDH, AP, GLDH, GGT i dr. za jetru i bilijarne opstrukcije).
Prema aktivnostima u pojedinim tkivima autori bilježe ove vrijednosti za čovjeka:
Štraus (1992): 1. jetra 35 U/g 2. poprečnoprugasti mišić 3.4 U/g 3. srčani mišić 2.9 U/g 4. bubreg 1.3 U/g 5. gušteraća 0.7 U/g 6. eritrociti 0.1 U/g 7. serum odrasli muški 10-35 U/L
odrasli ženski 5-24 U/L
U tjelesnim tekućinama većine sisavaca normalno nalazimo ALT u serumu i
cerebrospinalnoj tekućini ali ne i u urinu. Ako usporedimo aktivnosti ALT i AST (naredni
odlomak) uočava se da je jetra nešto bogatija AST iako se ALT smatra specifičnim enzimom
jetre jer ga u ostalim organima ima puno manje nego AST. S obzirom da je ALT tipičan
citoplazmatski enzim već i kod manjih oštećenja ili promjeni propusnosti citoplazmatske
membrane enzim izlazi u krv.
U nekih nestandardnih laboratorijskih životinja serumski ALT je izuzetno nizak te nema
dijagnostičku vrjednost. Takve životinje su primjerice marmozet, goveda, svinje ovce i koze.
Vrijednosti serumske ALT za neke životinje prikazane su u daljnjem popisu prema
pripadajućim navodima autora:
Kaneko (1992):
1. Konj 3 – 23 U/L (14 ± 11 U/L) 2. Govedo 11 - 40 U/L (27 ± 14 U/L) 3. Ovca (30 ± 4 U/L) 4. Koza 6 - 19 U/L 5. Svinja 31 - 58 U/L (45 ± 14 U/L) 6. Pas 21 - 102 U/L (47 ± 26 U/L) 7. Mačka 6 - 83 U/L (26 ± 16 U/L)
51
(Radman i Harapin 1998):
1. Konj do 15 U/L 2. Govedo 3 - 15 U/L 3. Ovca 2 - 10 U/L 4. Svinja 8 - 10 U/L 5. Pas do 50 U/L 6. Mačka do 50 U/L
U pasa, mačaka, čovjeka i standardnih laboratorijskih životinja štakora, miševa, zečeva ALT je
standardni parametar koji dobro pokazuje patološke promjene nastale djelovnjem noksi.
Aktivnost serumskog ALT-a u miševa prema navodima autora prikazuje slijedeći popis:
Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999): C57BL 68 – 85 U/L Albino CD m-70 U/L; ž-77 U/L Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 46 ± 25 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 17-77 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 19.0 U/L Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 30.4 ± 9.3 U/L Mady i sur. (2002): Swiss albuno mužjaci (22-25 g); 51.80 ± 1.53 U/L Silva i sur. (2004): 74 ± 10.58 U/L (serum) i 287.28 ± 0.29 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino Kawagoe i sur. (2005): 56 ± 12.09 U/L (serum) mužjaci, mjesec dana, ICR mice
52
Povišene vrijednosti serumske aktivnosti koje prelaze preko 50 puta normalnu vrijednosti
ALT najčešće su uzrokovane jakom viralnom infekcijom jetre ili se javlja kod toksičnog
hepatitisa uzrokovanog ljekovima ili drugim kemijskim toksičnim tvarima najčešće popračenu
nekrotičnim promjenama. Blaže do umjereno povećanje aktivnosti ALT, uz visoke vrijednosti
AST, ukazuju na akutne hepatocelularne ozljede poput aktivne ciroze uzrokovane alkoholom.
53
2.4.7.6. Aspartat-aminotransferaza, AST, GOT (EC. 2.6.1.1.)
Ovaj enzim katalizira reverzibilnu reakciju transaminacije između L-asparaginske kiseline i
2-oksoglutarne kiseline. Kako je već opisano ranije ovom reakcijom ketokiseline prelaze u
aminokiseline a spaja se i metabolizam ugljikohidrata s metabolizmom dušikovih spojeva. Kao
i prethodni enzim ALT, AST spada u veliku grupu enzima aminotransferaza. Sinonimi za ovaj
enzim su L-aspartat-2-oksoglutarat-aminotransferaza i glutamat-oksaloacetat-transaminaza
(nekada korištena kratica-GOT) (slika 9.).
Slika 9: Prikaz molekularne strukture svinjske aspartat aminotransferaze iz citosola poprečnoprugastog mišića, Ec: 2.6.1.1. dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Rhee, S., Silva, M. M., Hyde, C. C., Rogers, P. H., Metzler, C. M., Metzler, D. E., Arnone, A.: Refinement and comparisons of the crystal structures of pig cytosolic aspartate aminotransferase and its complex with 2-methylaspartate. J Biol Chem 272 pp. 17293 (1997)
Enzim je bilokularan tj. smješten je jednako u citoplazmi (40 %) i u mitohondrijma (60 %). Ta
dva enzima razlikuju se po elektroforetskoj pokretljivosti (citoplazmatski se zaustavi bliže
anodi), osjetljivosti prema pH i termostabilnosti. Geni za ALT nalaze se u miša na kromosomu
19 i kodiraju za 412 aminokiselina stvarajući polipeptidni monomer od 461 kD
(http://marvester 2005), dok Kaneko (1997) spominje 92 kD kao masu homodimernog enzima
AST. Za razliku od nekih prethodnih enzima AST ima samo jedan monomer koji se spaja u
homodimer AST (http://marvester 2005). AST ima najviše u jetri, srčanom mišiću sadrže ga
poprečnoprugasti mišići, pri čemu su u dijagnostičkim tumačenjima rezultata treba promatrati
nekoliko enzima (AST, ALT, LDH, CK, kreatinin za poprečnoprugaste mišiće i AST, ALT,
LDH, AP, GLDH, GGT i dr. za jetru i bilijarne opstrukcije), kako je u večoj mjeri opisano u
prethodnim odlomcima.
54
Prema aktivnostima u pojedinim tkivima autori bilježe ove vrijednosti za čovjeka:
Štraus (1992): 1. jetra 59 U/g 2. srčani mišić 52 U/g 3 poprečno-prug. mišić 36 U/g 4. mozak 15 U/L 5. bubreg 10 U/g 6. gušteraća 3 U/g 7. pluća 1 U/L 7. eritrociti 0.8 U/g 8. serum odrasli muški 10-35 U/L odrasli ženski 4-22 U/L
Iako AST nije specifičan enzim samo za jetru, od velike je važnosti i za dijagnostiku oštećenja
srčanog mišića. Njegova količina u serumu mijenja se kod ozljeda poprečnoprugaste
muskulature i kod mijopatija. Klinički se hepatopatije od mijopatija klinički razluće tijekom
bolesti i drugim dijagnostičkim postupcima. Kod akutnog hepatitisa vrijednosti obje
transaminaze se povisuju, a kod razvoja kronične upale jetre i kod ciroze taj rast je umjereniji.
Kod akutne opstruktivne žutice njihov je rast također umjereniji. Kod otrovanja
organofosfatima toksični hepatitis uzrokuje veliko povećanje aktivnosti transaminaza u serumu.
U životinja poznato je da je u konja normalna razina serumske aktivnosti relativno visoka u
odnosu na druge vrste.
S obzirom na serumsku aktivnost AST autori navode:
Kaneko (1997):
1. Konj 226 -366 U/L (296 ± 70 U/L/ 2. Govedo 78 - 132 U/L (105 ± 27 U/L) 3. Ovca 60 – 280 U/L (307 ± 43 U/L) 4. Koza 167 - 513 U/L 5. Svinja 32 - 84 U/L (61 ± 26 U/L) 6. Pas 23 – 66 U/L (33 ± 12 U/L) 7. Mačka 26 - 43 U/L, (35 ± 9 U/L)
Radman i Harapin (1998):
1. Konj do 240 U/L 2. Govedo do 60 U/L 3. Ovca do 60 U/L 4. Svinja 8 - 25 U/L 5. Pas do 40 U/L
55
6. Mačka do 40 U/L
Razina aktivnosti serumske AST dobar je pokazatelj stanične nekroze pripadajućih tkiva
upravo zbog svoje bilokularne naravi tj. kad se stanice nekrotički raspadaju, oštećenje je toliko
da se i mitohondrijski AST otpušta u krv. Upravo stoga razine AST privremeno ili vrlo malo se
povećavaju u početku bolesti, a u kroničnom tijeku one poprimaju visoke vrijednosti. Deficit
vitamina B ili trudnoća primjerice neka su stanja u kojima je primjetno opadanje AST
aktivnosti u serumu (Jaeger i Hedegaard 2002).
U laboratorijskih životinja kao i kod prethodno spomenutih enzima vrijednosti ovise o soju, fiziološkom stanju, starosti i vrsti životinje. Za laboratorijskog miša:
Mc Clure (1999): C57BL 298 – 405 U/L Albino CD m-242 U/L; f-269 U/L Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 86 ± 60 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 54-278 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 37.0 U/L Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 271.4 ± 63.4 U/L Mady i sur. (2002): Swiss albuno mužjaci (22-25 g); 219.8 ± 3.86U/L Silva i sur. (2004):
95.41 ± 6.13 U/L (serum) i 234.10 ± 6.13 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino Kawagoe i sur. (2005):
77 ± 18.9 U/L (serum) mužjaci, mjesec dana, ICR mice
56
2.4.8. METODA KOMET TESTA U PROCJENI TOKSIČNOSTI NOKSI
Komet-test ili mikrogel elektroforeza vrlo je aktualna, suvremena, učinkovita, brza, jeftina i
informativna metoda u toksikološkom i znanstveno-istraživačkom radu kojom se procjenjuje
oštećenje molekule DNA u pojedinim stanicama različitih tkiva. Metoda i na neizravan način
ukazuje na koji se način raspada DNA u pojedinim tkivima tj. neizravno možemo procjeniti
radi li se o apoptotičnoj ili nekrotičnoj smrti stanica. Prvu mikrogel elektroforezu u svrhu
procjene oštećenje DNA u pojedinim stanicama uklopljenim u agarozni gel izveli su 1984.
godine Östlin i Johanson. Metoda je dobila naziv prema obliku kometa kojeg su imale oštećene
florescirajuće stanice (Singh i sur. 1988, Rojas i sur. 1999, Singh 2000).
Komet tehnika vrlo je osjetljiva i reproduktibilna metoda (Tice i sur. 2000). Za dobivanje
rezultata ovom tehnikom dovoljno je analizirati 50 stanica. Sobzirom da se pomoću ove tehnike
procjenjuju oštečenja genoma i apoptoza i/ili nekroza pojedinih stanica, komet test daje
učinkovite rezultate na biljnim i animalnim
Slika 10: Izgled stanice čiji se genetski materijal uslijed djelovanja nokse raspao i putuje u električnom polju elektroforetski stvarajući sliku koja liči na komet koji se sastoji od glave kometa i repa kometa kojeg sačinjavaju fragmenti DNA iz jezgre.
57
stanicama bilo da dolaze iz kulture ili uzravno iz živog organizma (Olive 1999, Piperakis i sur
1999, Tice i sur 2000). Neke od komparativnih prednosti ove tehnike su: (i) procjena oštećenja
u pojedinim stanicama (ii) dovoljno mali broj uzorka za analizu (iii) može se koristiti bilo koja
vrsta stanica (iv) test je dovoljno osjetljiv, jednostava, ponovljiv, brz (v) rezultati se mogu
dobiti već unutar neoliko sati na velikom broju uzoraka (Rojas i sur. 1999).
Princip tehnike komet-testa je slijedeći, preparat za analizu priprema se tako da su
suspenzija istraživanih stanica uklapa između dvaju slojeva agaroznog gela. Pomoću otopine s
visokom koncentracijom EDTA (etilen-diamin-tetraoctene kiseline) i detergenta za lizu razore
se stanična i jezgrina membrna, pri čemu se oslobađa ukupna stanična DNA. Ta se DNA
denaturira u lužnatom ili neutralnom puferom i podvrgne se elektroforezi. Zbog velike
molekularne mase najveći dio DNA ne može putovati kroz pore gela prema anodi.
Putovati mogu samo fragmenti DNA nastali jednolančanim ili dvolančanim lomovima. Što
su kraći, oni putuju brže kroz gel. Zbog razlike u brzini kretanja, fragmenti se razdvajaju prema
veličini, kraći fragmenti putuju brže dok duži fragmenti koji se teže provlaće kroz pore
agaroznog gela putuju sporije (Plappert i sur. 1995). Nakon bojenja s fluorescirajučom bojom
(najčešće etidij bromid) pod mikroskopom su vidljivi obrasci putovanja u gelu koji kod
oštećenih stanica izgledaju poput kometa. Osim etidij bromide ostale boje u uporabi su DAPI,
propidij jodid, acridin orange i HOECHST 33342. Oštećenje DNA procjenjuje se na osnovi
postotnog udjela DNA u repu kometa te također dužine repa kometa u mikrometrima (μm) i
njegovog optičkog intenziteta fluorescencije izraženog u luxima (lux) te izračunate vrijednosti
tzv. Repnog momenta ili engl. Olive tail moment (OTM), indeksa koji se smatra
najinformativnijim pokazateljem analize komet testa jer se računa iz nekoliko izmjerenih
parametara analize komet testa prema formuli:
OTM= (srednja vrijednost % DNA repa - srednja vrijednost %DNAglave) X % DNA u repu
Postoje dvije izvedbe komet-testa koje su danas najčešće u uporabi. Prva pod neutralnim
uvjetima i omogućuje specifičnu detekciju dvolančanih lomova DNA. Originalno su je razvili
Olive i sur. (1990), a kasnije je modificirana (Plappert i sur. 1995). Drugi i najčešće
58
primjenjivani način izvedbe je komet-test u alkalnim uvjetima (pH 13). Ta izvedba smatra se
optimalnom za otkrivanje učinaka različitih genotoksičnih agensa, a omogućuje specifičnu
detekciju jednolančanih lomova i ukriženog povezivanja DNA-DNA i DNA-proteini. Mjesta
loma nakon djelovanja lužine nastaju na dijelovima DNA gdje postoje apurinska i
apirimidinska mjesta. Ta su mjesta podložnija oštećenjima (Singh i sur. 1988, Olive 1999,
Rojas i sur. 1999, Singh 2000). Oblik repa nastao kao trag elektroforetske pokretljivosti
fragmenata ukazuje na mehanizme i vrstu oštećenja noksi koji ih uzrokuju, naime mogu se
razlikovati stanice u apoptozi i/ili nekrozi (Fairbairn i sur. 1995, Olive 1999). Osim toga pri
uporabi komet tehnike može se pratiti i enzimski popravak DNA lomova, dakle indirektno
status enzima i drugih sustava koji upravljaju popravkom oštećenog genetičkog materijala u
stanici.
Stanice u kojih se prati popravak drže se na 37 °C. Ukoliko je popravak uspješan, u
tretiranom uzorku dobiti će se vrijednosti kometa slične kao i u kontrolnom uzorku za razliku
od istih tretiranih stanica koje su čitavo vrijeme držane na 0 °C (Miller i sur. 1994).
2.4.8.1 Apoptoza i nekroza
Dvije su vrste stanične smrti. Jasno su odvojene morfološki i biokemijski: 1) apoptoza
(fiziološka, prirodna ili programirana smrt stanice) i 2) nekroza (slučajna, sporedna ili toksična
smrt stanice).
Apoptoza.
Apotoza (grč. apoptosis = opadanje) je oblik programirane stanične smrti koja se javlja tijekom
normalnih fizioloških procesa u cilju održanja homeostaze. Apoptozu obilježavaju mnoge
morfološke, funkcionalne i biokemijske promjene unutar stanica. Uočeno je smanjenje
volumena stanica, promjene cjelovitosti citoplazmatskih organela, posebice mitohondrija i
otpuštanje citokroma C, fragmentacija DNA, te pojava novih antigena na površini stanice
(fosfatidilserin) (Galati i sur. 2000).
Prve vidljive promjene nastaju na staničnoj membrani. Volumen stanica se smanjuje i
nastaje niz morfoloških i biokemijskih promjena u jezgri što dovodi do nastanka apoptotičnih
tjelešaca koja sadrže nedirnute citoplazmatske organele i dijelove jezgre. Proces cijepanja
59
stanica događa se vrlo brzo, što otežava proučavanje apoptoze. U apoptozi ne dolazi do
oslobađanja staničnog sadržaja, a apoptotična tjelešca fagocitiraju stanice mononuklearno-
fagocitnog sustava, epitelne stanice i dr. te stoga, za razliku od nekroze, ne dolazi do upalnih
reakcija (Wyllie 1993).
Biokemijske promjene i molekularni mehanizmi apoptoze malo su poznati. Mogući
unutrašnji signalni mehanizam u pokretanju apoptoze jest porast koncentracije unutarstaničnog
Ca2+ i izmjena ekspresije mRNA što uključuje onkogene i sintezu serije proteina. Štetan učinak
kalcija temelji se na aktivaciji Ca2+-ovisnih endonukleaza, proteaza, fosfolipaza i protein kinaza
što indirektno ili direktno dovodi do pucanja DNA (Galati i sur 2000). Nastali dijelovi DNA
višekratnici su od 180-200 parova baza i mogu se analizirati elektroforezom na agaroznom gelu
(Wyllie 1980). S druge strane opisani su slučajevi cijepanja DNA bez povećanja koncentracije
iona kalcija što ukazuje na postojanje Ca2+ neovisnih endonukleaza (Alnemri i Litwac 1989).
DNA topoizomeraza II uključena je u replikaciju, rekombinaciju i kromosomsku
segregaciju. ATP vezujuća mjesta na topoizomerazi II mogu služiti kao vezna mjesta za
kvercetin, što dovodi do inhibicije ATP-azne komponente i inhibicije funkcije topoizomeraze II
(Constantinou i sur. 1995).
Protein kinaze (kalmodulin-kinaze, mitogenom aktivirane protein-kinaze i dr.) važne su u
aktiviranju protoonkogena c-fos, c-myc, c-jun koji imaju važnu ulogu u proliferaciji i
diferencijaciji stanica i sudjeluju u apoptozi.
Apoptoza u tumorskim stanicama može biti posredovana mitohondrijskim toksinima.
Mitohondrijska toksičnost uključuje gubitak membranskog potencijala, otpuštanje citokroma C
i stvaranje slobodnih radikala (Wang i sur. 1999). Apoptoza može biti pobuđena oksidativnim
stresom (Chandra i sur. 2000). Mnogi pesticidi mogu biti induktori ili izvori slobodnih radikala,
glavnih uzročnika oksidativnog stresa
Nekroza
Nekroza je smrt stanice koja se nikada ne javlja unutar fizioloških uvjeta već je
posljedica letalnih i patoloških oštećenja stanica. Kod stanica u nekrozi dolazi do poremećaja
aktivnosti ionskih pumpi što dovodi do bubrenja citoplazme i organela, gubitka cjelokupnosti
membrane, poremećaja osmotskog tlaka i oštećenja stanica. Stanični sadržaj izlazi u okolno
tkivo i ovi procesi izazivaju upalni odgovor (Wyllie 1993). Ubrzani raspad stanice u kasnom
60
stadiju nekroze pospješuje oslobađanje hidrolaza iz lizosoma. Tijekom procesa nekroze stanični
kromatin formira male nakupine na jezgrinoj membrani i dolazi do smanjenja ukupne količine
proteina, RNA i DNA. Oštećenje DNA u nekrozi kasniji je fenomen i kromatinski je sadržaj
izložen proteolitičkom i nukleolitičkom djelovanju. Nekroza traje satima i danima te zahvaća
veću skupinu stanica u tkivu.
Zbog ograničenih mogućnosti praćenja apoptoze pomoću morfoloških kriterija,
najčešće se koriste metode u kojima se prati cijepanje DNA. Otkrivanja apoptoze i nekroze
moguće je analizom fragmenata DNA na agaroznom gelu (Wyllie 1993). Propadanje
kromatina, smanjenje staničnog volumena i druge promjene vezane uz apoptozu i nekrozu
mogu se brzo i jednostavno pratiti na protočnom citometru.
Cijepanje DNA može se pratiti nakon što se DNA obilježi fluorescentnim DNA-
vezujućim spojevima kao što su: propidijski jodid, etidijski bromid,
7-aminoaktinomicin, akridin oranž i dr. Apoptotične stanice s pocijepanom DNA mogu se
odrediti na histogramu DNA. Postotak stanica u apoptozi može se odrediti i TUNEL metodom
na tkivnim rezovima (Wyllie 1993).
3. MATERIJALI I METODE
3. MATERIJALI I METODE
3.1. POKUSNE ŽIVOTINJE
Pokus je proveden na singeničnim miševima soja CBA T6T6, uzgojenima u uzgajalištu
laboratorijskih životinja Zavoda za animalnu fiziologiju, Prirodoslovno matematičkog
fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Životinje korištene za pokus bile su u dobi od 60 ± 5 dana
na početku apliciranja herbicida. Životinje su okoćene i uzgojene u standardnim uvjetima
propisanim za uzgoj laboratorijskih životinja (glodavaca), odnosno pri temperaturi od 25
˚C, dnevni ritam svjetla i tame 12/12 sati, s ponuđenom hranom i vodom ad libitum.
Kontrolne i tretirane životinje držane su pod istim uvjetima. Životinje su, nasumičnim
uzorkovanjem raspoređene u četiri skupine, s obzirom na apliciranu dozu preparata čija se
toksičnost određuje, sa po dvije podskupine s obzirom na spol životinja. U svakoj skupini
bilo je četrnaest životinja, odnosno sedam u podskupini (m-mužjaci, ž-ženke) (Springer i
sur. 1976, 1983, 1986.a, 1986.b, Franković 1990, Pavelić 1977, Thiruchelvam i sur. 2000a,
2000b, Ulm 1994, Walace-Hayes 2001, Williams 1999).
Radi praćenja svake pojedine životinje i bilježenja mase, životinje treba označiti.
Grickalicom za uške se prema navedenom crtežu označe uške.
Slika 11: Označavanje uški miševa
Svakom je mišu unutar skupine pridružen broj od 1 do 12. Na taj se način prati
pojedina životinja i lakše se uočava potencijalno ekstremno odstupanje od ostatka skupine u
62
praćenim parametrima.Ovakvo označavanje omogućilo je praćenje pojedinih jedinki
tijekom čitavog pokusa i podjelu skupina prema pripadajućim dozama:
K=kontrolna skupina=0 mg/kg prometrina,
A=skupina koja je primila 185 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana,
B=skupina koja je primila 375 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana,
C=skupina koja je primila 555 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana.
Ovakave oznake zadržale su se u poglavlju Rezultati i ponegdje u poglavlju Rasprava, u
svrhu pojednostavljenja tabličnih i grafičkih prikaza i jasnoće rećenica gdje je to bilo
svrsishodno. Nadalje, unutar svake skupine životinji je pripisan redni broj jedinke. Također
prema spolu skupine su podjeljene na podskupine označavane sa M za muške jedinke i Ž za
ženske jedinke (u pojedinim dijagramima u poglavlju rezultati radi svojstava programa koji
ne sadrži neke znakove hrvatske abecede Š,Ž,Đ,Ć,Č skupina Ž je pisana znakom Z) . Tako
bi svaka jedinka dobivala jedinstvenu šiftu s obzirom na raspored u pokusu primjerice KŽ4,
KM4, MA4, ŽA4 …….itd.
63
3.2. PLAN POKUSA I NAČIN APLIKACIJE I POJEDINIH DOZA ISPITIVANOG HERBICIDA PROMETRINA
Pojedinačne opetovane doze herbicida po skupinama bile su : 0 mg/kg životinje (označeno
kao skupina K-kontrola), 185 mg/kg životinje (označeno kao skupina A-niska doza), 375
mg/kg životinje (označeno kao skupina B-srednja doza), 555 mg/kg životinje (označeno
skupina C-visoka doza).
Srednja doza je 1/10 LD 50 doze, što se u brojnim istraživanjima pokazalo kao izvrstan
model u kojem tretirane životinje preživljavaju do kraja trajanja subkronične izloženosti
toksikantu (Springer i sur. 1983, 1986, 1986, Franković 1990, Pavelić 1977, Ulm 1994).
Prije davanja otopina gastričnom kanilom, životinje su blago omamljivane dietileterom u
trajanju 7-30 sekundi. Praškasti tehnički prometrin (95%) suspendiran je u kukuruznom ulju
(proizvođač Zvijezda) otopinom na potrebni volumen (0.2 ml, tj. optimalni volumen za
želudac miša i aplikaciju per os) planirane doze. Ovakav način aplikacije najbolje simulira
ekspoziciju organizama okolišno prisutnom prometrinu, a također toksikokinetički tvar ne
zaobilazi želudac i crijeva (pH) i jetru s jetrenim detoksikacijskim enzimima koji bi
potencijalno mogli detoksicirati otrov, odnosno toksicirati otrov stvorivši još toksičnije
metabolite prometrina. Također bi se u slučaju smanjenja populacije crijevne mikroflore
mogle pojaviti druge kliničko-patološke promjene (Timbrell 2001, Walace-Hayes 2001).
Svaki puta prije aplikacije suspenzije, životinjama se izmjerila težina, radi praćenja
kliničkog stanja i korekcije volumena suspenzije da svaka životinja dobije jednaku
predviđenu dozu (u mg/kg životinje) koju se odredilo za svaku skupinu životinja. Kontrolna
skupina dobivala je uvijek jednak volumen (0.2 ml) ulja bez prometrina.
Pokus je postavljen temeljem literaturnih podataka o kinetici prometrina u organizmu
glodavca. Iz njih je vidljivo da se u tijeku 48 sati prometrin (ali i većina metabolita
prometrina nastalih u procesima detoksifikacije) uglavnom izluči iz tijela, stoga su pojedine
doze prometrina aplicirane svakih 48 sati, radi održanja konstantne koncentracije u
organizmu (Extoxonet 1996, Kamrin i sur. 2000).
Pojedinačne doze prometrina bile su aplicirane trinaest puta, svakih četrdesetosam sati
tijekom dvadesetšest dana, a razudba životinja izvršena je četrdesetosam sati nakon zadnje
aplikacije, tj. dvadesetosmog dana pokusa (tablica 1.). Ovakav plan pokusa u skladu je s
odredbom 407 OECD-a /OECD Guideline 407/ i US EPA preporukama o trajanju
64
kratkoročnog imunotoksikološkog i toksikološkog testiranja (Descotes 1999., Walace-
Hayes 2001.). Potrebno je napomenuti da je C skupina tretirana najvišom dozom (555
mg/kg) počela naglo ugibati zbog posljedica otrovanja prometrinom, stoga se žrtvovanje i
razudba obavila prije spomenutog termina za ostale skupine sa ciljem da se patološkom
analizom utvrdi mehanizam kojom noksa narušava fiziološko-metaboličku ravnotežu i
izaziva smrt.
Tablica 3: Tabelarni prikaz plana pokusa.
DAN POKUSA TRETMAN
PROMETRINOM
ANALIZA KRVI VAGANJE ŽRTVOVANJE I
ANALIZA ORGANA
1. 1.
1.
3. 2.
2.
5. 3.
3.
7. 4.
4.
9. 5.
5.
11. 6.
6.
13. 7. 1.(14.dan)
7.
8. 15. 8.
17. 9.
9.
19. 10.
10.
1.(C)
21. 11.
11.
23. 12.
12.
25. 13.
13.
27.
2.(28.dan)
29. 2. (K,A,B)
*brojke označavaju redni broj pojedinog tretmana, dana pokusa, analize krvi, vaganja i žrtvovanja kronološkim redoslijedom Skupina C je radi iznenadnog ugibanja žrtvovana prije isteka pokusnog razdoblja od 28 dana.
65
3.3. ODREĐIVANJE TJELESNE TEŽINE POKUSNIH ŽIVOTINJA
Tjelesna težina životinja određivana je prije svake aplikacije herbicida na digitalnoj
elektroničkoj tehničkoj vagi Sartorius koja važe s točnošću ± 0.01 g.
3.4. ANALIZA SERUMSKIH ENZIMA SPEKTROFOTOMETRIJOM
Spektrofotometrijski su određivane vrijednosti određenih ezima jetre pomoću
komercijalnih kitova proizvođača Herbos dijagnostika d.o.o. Korišten je SHIMADZU UV –
VIS RECORDING SPECTROPHOTOMETER UV – 160.
Kivete s plazmom su držane u vodenoj kupelji na 37°C, da se zadovolje navedeni
uvjeti određivanja. Korištene su plastične kivete širine 10 mm.
Određivanje enzima laktat-dehidrogenaze (LDH-P)
Sastav reagensa
Fosfatni pufer pH 7,5 ± 0,1 (25°C) 55 mmol/L
Natrij piruvat 0,6 mmol/L
NADH 0,23 mmol/L
Princip reakcije
Piruvat + NADH + H+ LDH Laktat + NAD+
Postupak
Mjeri se nestanak NADH spektrofotometrijski pri 340 nm, 37°C. Pomiješa se 1ml reagensa
sa 20 μl uzorka. Nakon 60 sekundi se izmjeri A1 i nakon daljnjih 60 sekundi A2. Izračuna se
∆A/min.
Račun
LDH, U/L= ∆A/min x 8095
66
Određivanje enzima gama-glutamiltransferaze (γ-GT)
Sastav reagensa
TRIS puffer 100 mmol/L
Glicilglicin 100 mmol/L
L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid 2,9 mmol/L
pH = 8,2 ± 0,1 na 20°C
Metoda
Kao supstrat za određivanje katalitičke koncentracije γ-GT koristi se glukan (γ–glutamil-3-
karboksi-4-nitroanilid). γ-GT prisutan u uzorku katalizira prijenos γ-glutamilne skupine sa
supstrata na glicilglicin tvoreći glutamilglicin i 5-amino-2-nitrobenzoat. Stvoreni 5-amino-
2-nitrobenzoat proporcijalan je katalitičkoj koncentraciji γ-GT i kinetički se mjeri na 405
nm.
Princip reakcije
L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid + glicilglicin
γ-GT
L- γ-glutamilglicilglicin + 5-amino-2-nitrobenzoat
Postupak
Određivanje se vrši pri 405 nm, na 37°C. 1,0 ml reagensa se pomiješa sa 100 μl uzorka.
Očita se porast apsorbancije nakon 1, 2 i 3 minute. Izračuna se srednja vrijednost ∆A/min
Račun:
∆A/min x TV x 1000
U/L = -------------------------- = ∆A/min x 1158
EF x SV x P
TV = ukupni volumen reakcijske smjese (ml)
SV = volumen uzorka (ml)
EF = molarna apsorbancija 5-amino-2-nitrobenzena na 405 nm = 9,5
P = duljina puta svjetlosti kroz kivetu (cm)
67
Određivanje enzima alkalne fosfataze (ALP)
Sastav reagensa
Supstrat:
4-nitrofenilfosfat 16,3 mmol/L
Pufer:
2-amino-2-metil-1-propanol 0,42 mmol/L
Mg-acetat 2,4 mmol/L
ZnSO4 1,2 mmol/L
EDTA 2,2 mmol/L
pH = 10,4 na 30°C
Metoda:
Kao supstrat koristi se 4-nitrofenilfosfat. Pri uvjetima optimirane metode ALP katalizira
reakciju transfosforiliranja. Kod radnog pH 4-nitrofenoksid ima izrazito žutu boju. Reagens
sadrži metalno ionski pufer koji održava stalnu poželjnu koncentraciju metalnih iona cinka i
magnezija. Reakcija se prati mjerenjem porasta apsorbancije na 405 nm što je
proporcionalno katalitičkoj koncentraciji alkalne fosfataze.
Princip reakcije
ALP
4-nitrofenilfosfat + H2O 4-nitrofenoksid + fosfat Mg2+/alkalni pH
Postupak
Određivanje se vrši pri 405 nm, na 37°C. Instrument je izbaždaren na 0 destiliranom
vodom.
1,0 ml reagensa se pomiješa sa 20 μl uzorka. Očitava se porast apsorbancije svakih 30
sekundi kroz 2 minute. Izračuna se srednja vrijednost ∆A/min.
Račun
∆A/min x TV x 1000
U/L = ----------------------------- = ∆A/min x 2713
EF x SV x P
68
TV = ukupni volumen reakcijske smjese (ml)
SV = volumen uzorka (ml)
EF = molarna apsorbancija 4-nitrofenoksida na 405 nm = 18,8
P = duljina puta svjetlosti kroz kivetu (cm)
Određivanje aktivnosti kinetičkog kratinina u serumu periferne krvi
Princip metode
Kreatinin reagira s alkalnim pikratom stvarajući narančasto-crveni kompleks. Mjeri se
reakcija tijekom jedne minute. Čime je izbjegnuta interferencija s drugim spojevima koji
mogu reagirati s pikratom ali sporije od kreatinina. U ovom testu korišten je komercijalni
kit Herbos Dijagnostika Sisak. Mjerenje je izvedeno prema protokolu priloženom uz kit pri
492 nm u kivetama od kvarcnog stakla. Mjerenje je izvedeno UV/VIS spektrofotometrom
Shimadzu u Zavodu za animalnu fiziologiju, PMF, Zagreb.
Određivanje aktivnosti aspartat aminotransferaze (AST) i alanil aminotransferaze
(ALT)
Za analizu je upotrebljen uzorak svježeg nehemoliziranog seruma. U testu je korišten kit
Herbos Dijagnostika Sisak. Mjerenje je izvedeno u Zavodu za animalnu fiziologiju PMF,
Zagreb korištenjem UV/VIS Shimadzu pri 340 nm u kivetama od kvarcnog stakla, istog
proizvođaća.
69
3.5. ANALIZA PERIFERNE KRVI
Analiza periferne krvi izvršena je 14. i 28. dana od početka pokusa, osim u skupini
tretiranoj najvišom dozom, kojoj nije izvršena analiza krvi 28 dan pokusa zbog visokog
stupnja smrtnosti.
3.5.1. Određivanje broja eritrocita i leukocita
Uzorke periferne krvi dobilo se zasijecanjem repne vene prethodno ugrijanih životinja pod
IR lampom. Za određivanje broja eritrocita uzeta je krv u eritrocitni melanžer do oznake 0.5
te je razrijeđena Hayem-ovom (Kemika, Zagreb) otopinom 1:200.
Za određivanje broja leukocita uzeta je krv u leukocitni melanžer do oznake 0.5 i
razrijeđena Türkovom otopinom (Kemika, Zagreb) 1:20. Eritrociti i leukociti brojani su u
hemocitometru po Bürker-Türku pod svjetlosnim mikroskopom Carl-Zeiss Jena, Njemačka.
3.5.2. Diferencijalna krvna slika (DKS)
Diferencijalna krvna slika (DKS) određena je kao postotni udjel pojedinih vrsta leukocita,
granulocita odnosno polimorfonuklearnih neutrofilnih, eozinofilnih i bazofilnih leukocita,
monocita i malih i velikih limfocita.
Osušeni preparat krvnog razmaza boja se metodom po Pappenheimu (May-Grünwald-
Giemsa (Kemika, Zagreb)) i analizira pod svjetlosnim mikroskopom. Na 100 izbrojanih
krvnih stanica određen je postotni udio pojedine vrste leukocita, a njihova se apsolutna
vrijednost dobila računanjem iz ukupnog broja stanica leukocita.
70
3.6. ANALIZA LIMFOHEMATOPOETSKIH ORGANA
Analizirana je težina i ukupna staničnost timusa, slezene, limfnih čvorova, kao i staničnost
koštane moždine femura. Težinu tih organa (osim koštane moždine) određena je na
torzionoj vagi Torsion Balance, SAD, koja važe točnošću od ± 0.2 mg.
Određivanje ukupne staničnosti timusa, aksilarnog limfnog čvora i slezene
Od timusa i slezene odvojen je mali komadić tkiva, posebno izvagan i usitnjen metalnom
spatulom na mrežici mlinarske svile u volumenu 0.1 ml Hanks-ove otopine(Kemika,
Zagreb). Isti postupak ponovljen je s limfnim čvorom. Suspenziju stanica razrijedilo se u
leukocitnom melanžeru Hanksovom otopinom. Suspenzije stanica slezene, razrijedilo se
Türkovom otopinom zbog hemolize eritrocita. Stanice su izbrojane u Bürker-Türkovom
hemocitometru pod svjetlosnim mikroskopom. Tijekom obrade podataka staničnost
pojedinih organa preračunata je na njihovu ukupnu težinu.
Određivanje ukupne staničnosti koštane moždine
Femur, očišćen od mišićnog tkiva, prerezan je na oba kraja kosti. Štrcaljkom napunjenom s
5 ml Hanksove otopine (Kemika, Zagreb) istisnuo se sadržaj koštane moždine u epruvetu.
Suspenziju stanica koštane moždine u Hanksovoj otopini centrifugiralo se 10 minuta na
2000 okretaja (Centrifuga Tehtnica Železniki Slovenija). Nakon centrifugiranja odlio se
supernatant, a preostali talog resuspendira se u 1 ml Hanksove otopine. Stanice koštane
moždine također su brojane hemocitometrom po Bürker-Türku pod svjetlosnim
mikroskopom.
3.7. KOMET TEHNIKA LEUKOCITA PERIFERNE KRVI
U istraživanju je primijenjena standardna izvedba komet-testa koju su predložili Singh
i sur. (1988) (Slika 2).
Priprema uzorka za elektroforezu u komet tehnici
71
Na brušeno predmetno stakalce pasteurovom pipetom nakapali smo svježe priređenu
otopina 1% agaroze normalnoga tališta (NMP, Sigma) i pokrili pokrovnicom. Nakon
polimerizacije agaroze na sobnoj temperaturi, sa stakla smo uklonili pokrovnicu i sloj gela.
Na osušeno staklo pomoću mikropipete nakapali smo 300 μl 0,6% NMP agaroze i pokrili
pokrovnicom. Stakalce smo ostavili 10 minuta na ledu. Nakon polimerizacije agaroze
postavili smo sljedeći sloj: 100 μl 0,5% agaroze niskoga tališta (LMP, Sigma) pomiješane s
2 μl uzorka krvi. Nakon 10 minuta stajanja na ledu, taj sloj gela prekrili smo sa 100 μl 0,5%
LMP agaroze i preparat ponovo držali na ledu 10 minuta.
Liza staničnih struktura
Nakon uklanjanja pokrovnice, priređene preparate uronili smo u pufer za lizu (NaCl,
Na-laurilsarkozinat, Tris-HCl, DMSO, Triton X-100, Sigma), pH=10 u kojem su stajali
jedan sat na 4˚C.
Denaturacija
Preparate smo iz pufera za lizu prebacili u pufer za denaturaciju (NaOH, Na2EDTA,
Sigma), pH=13. Denaturacija je provedena na sobnoj temperaturi, a trajala je 20 minuta.
Elektroforeza
Nakon denaturacije, preparate smo prenijeli u aparat za elektroforezu. Elektroforezu
smo sproveli u istom puferu kao i denaturaciju, pri jakosti struje od 300 mA i naponu od 25
V, a trajala je 20 minuta.
Neutralizacija
Nakon elektroforeze, preparate smo ispirali tri puta po 5 minuta u neutralizacijskom
Tris-HCl puferu, pH=7,5.
Bojanje preparata
Nakon zadnjeg ispiranja, preparate smo bojali sa 100 μl etidij-bromida u trajanju od
10 minuta. Obojene gelove kratko smo isprali u Tris-HCl puferu, pH=7,5 i pokrili ih
72
pokrovnicom. Radi stabilizacije boje, preparate smo prije početka analize držali u mraku
najmanje 15 minuta.
Mikroskopska analiza
Analizu preparata sproveli smo pomoću epifluorescencijskog mikroskopa s
ekscitacijskim filterom od 515 ─ 560 nm. Mjerenja duljine repa, % DNA u repu i momenta
repa sproveli smo pomoću programa za analizu slike Comet Assay II (Perceptive
Instruments Ltd). Za svaki uzorak izmjerili smo po 50 do 100 kometa. Duljinu repa mjerili
smo od središta jezgre, a izmjerene vrijednosti izrazili smo u mikrometrima. Moment repa
izračunali smo prema formuli:
Momentrepa = (dužina repa x % DNA u repu) / 100
Prekrivanje brušenog stakalca s 1% agarozom normalnoga tališta ↓
Nanošenje sloja 0,6% NMP agaroze ↓
Miješanje uzorka krvi s 0,5% agarozom niskoga tališta i nanošenje na stakalca ↓
Nanošenje sloja 0,5% LMP agaroze ↓
Liza stanica i oslobađanje DNA ↓
Odmatanje DNA u lužnatim uvjetima ↓
Elektroforeza ↓
Neutralizacija ↓
Bojanje ↓
Mikroskopija
Slika 2 - Shematski prikaz komet tehnike
3.8. METODA PROTOČNE CITOMETRIJE Određivanje udjela apoptotičnih, nekrotičnih i vitalnih stanica leukocita periferne krvi,
timusa, slezene i limfnih čvorova
73
Pri analizi udjela apoptotičnih, nekrotičnih i vitalnih stanica leukocita, timusa, slezene i
limfnih čvorova koristilo se annexinVFITC reagens kit tvrtke BioVision® za 400 testova.
Organe se protisnulo kroz mrežicu od tila. Perifernu krv se liziralo buferom za lizu i
odvojilo leukocite. Stanice smo isprali 2X u hladnom PBS-u prema naputku proizvođača.
Stanični talog (1 X 105 stanica) resuspendiralo se u 100 mikrolitara vezujućeg pufera i
dodalo 10 mikrolitara FITC-konjugiranog aneksina V i isto toliko propidijskog jodida.
Nakon inkubacije od 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku dodalo se 400 mikrolitara
vezujučeg pufera i propustilo na protočnom citometru laserom (EX=488 nm;EM=530 nm)
pri tome se FL1 kanal koristio za detekciju vezanog aneksinaV-FITC kompleksa, FL2 kanal
za detekciju propidij jodida.
3.9. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA
Statistička obrada dobivenih numeričkih podataka obavljena je metodama (Zar 1999)
deskriptivne statistike, t-testa, analize varijance-ANOVA, korištenjem programa Statistica,
Excel i SPSS for Windows. Također istim programima izračunati su i uspoređivani
koeficijenti korelacije i regresije aktivnosti enzima po skupinama kako bi se ukazalo na
njihove međuodnose i moguću povezanost. Podaci komet testa prije analize varijance,
ANOVA, transformirani su logaritmiranjem a u post hoc testiranju razlike su uspoređene
Scheffeovim testom. U svih mjerenih parametara statističkom je analizom utvrđeno
postojanje razlika doza prometrina u odnosu na kontrolnu skupinu i razlike između spolova
unutar svake skupine i između skupina doza mužjaka i ženki.
74
3.10. HISTOPATOLOGIJA
Odabrani organi herbicidom per os tretiranih skupina miševa analizirani su histopatološkim
metodama radi utvrđivanja nastalih lezija i fiziološko biokemijskih promjena u tkivima i
stanicama organa.
Metode bojenja u pokusu izvedene su prema protokolima opisanim u Arnold 1968., Lee i
Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.
Organi za analizu odabrani su s obzirom na njihovo sudjelovanje u mehanizmima
detoksikacije ksenobiotika, fiziološke povezanosti s imunohematopoetskim sustavom ili s
obzirom na njihovu pretpostavljenu osjetljivost i moguće ciljno djelovanje ispitivanog
herbicida.
Analizirani su: slezena, jetra, bubreg, probavilo (duodenum, tanko crijevo, želudac samo za
makropatologiju), gušterača, poprečnoprugasti mišić i mozak.
Hemalaun eozinom bojeni su mikroskopski preparati ovih organa: jetra, bubreg, tanko
crijevo s komadićem gušterače, slezena, mozak i mišić.
Histokemijskim selektivnim bojenjem PAS, PAS+AB i PAS+αAmilaza obrađeni su bubreg,
tanko crijevo i jetra.
Jetra je dodatno obojena histokemijskom reakcijom za dokazivanje glutationa u tkivima te
Sudan Black i Sudan III metodama dokazivanje masti te enzimsko histokemijskom
reakcijom na laktat-dehidrogenazu (LDH), sukcinat-dehidrogenazu (SDH) i kiselu
fosfatazu. Tkivo poprečnoprugastog mišića obojeno je reakcijom na laktat-dehidrogenazu
(LDH) i sukcinat-dehidrogenazu (ScDH).
Tablični prikaz metoda diferencijalne histopatologije i organa koji su njima obrađeni
prikazuje tablica 4.
75
Tablica 4.: Tablični prikaz metoda diferencijalnog histopatološkog bojenja koje su primjenjene (označeno znakom: +) na pojedinim odabranim organima tretiranih životinja u pokusu; kratice: HE-hemalaun eozinsko bojenje, PAS-perjodna kiselina-Šifova baza bojenje, PAS+AB-periodic acid Schiff base s alcian blue bojenjem, PAS+α-AM - bojenje periodic acid Schiff base s enzimom amilazom, SUD B-sudan black, SUD III-sudan tri, LDH-reakcija na laktatdehidrogenazu, SDH- reakcija nasukcinat dehidrogenazu, AlF-reakcija na alkalnu fosfatazu, KF-reakcija na kiselu fosfatazu, EST-reakcija na nespecifičnu esterazu
ANALIZA TKIVA / ORGANAMETODA
SLEZENA JETRA BUBREG PROBAVILO MOZAK MIŠIĆ
HE + + + + + +
PAS - + + + - -
PAS+AB - + + + - -
PAS+α-AM - + + + - -
SUD B - + - - - -
SUD III - + - - - -
LDH - + - - - +
SDH - + - - - +
AlF - + - - - +
KF - + - - - +
EST - + - - - +
76
3.10.1. Fiksacija
Na kraju pokusnog razdoblja tretiranja pokusnih životinja herbicidom prometrinom tj.
dvadesetosmog dana, uzorci organa (dimenzija 1x1x1 cm) ili cijeli organ (bubreg, slezena,
mozak, mišić) fiksirani su 4 % paraformaldehidu s fosfatnim puferom PBS-om (od engl.:
phosphat buffer saline), Kemika, Zagreb, pH 7,4 i 25° C tijekom 24 sata.
Dijelovi tkiva namijenjeni hemalauneozinskom bojenju dehidrirani su u sve koncentriranijem
etilnom alkoholu (koncentracija 50 %, 75 %, 90 % i 100 %), a oni namijenjeni rezanju
kriostatom prebačeni su u krioprotektorske nizove saharoze, (Kemika, Zagreb) (10 %, 20 % i
30 %), 24 sata, pri +8 °C. Potom su smrznuti uranjanjem u ohlađeni izopentan (Sigma) na –
80°C te napokon pohranjeni u zamrzivaču na –80°C.
Jedan dio jetre i mišić, namijenjeni bojenju enzimskohistokemijskim metodama i metodom
za dokazivanje glutationa u tkivima, uronjeni su u tekući dušik na – 175°C bez prethodne
fiksacije (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.10.2. Hemalaun-eozinsko bojenje preparata
Nakon fiksacije i dehidracije nizovima alkohola, kloroformom i mješavinom kloroforma i
paraplasta (1:1, 37°C) tkivni preparati su uklopljeni u parafinske blokove (Paraplast,
Sigma®).
Blokovi su rezani na mikrotomu na 6 μm debljine. Nakon pričvršćivanja na predmetnicu
premazanu bjelanjkom jajeta sa zrncem timola, preparati su prošli slijedeći niz u kadicama
za bojenje:
Ksilol, Kemika, Zagreb 2 x 15 minuta (deparafiniranje),
rastući koncentracijski niz etilnog alkohola (100 %, 96%, 80 % i 75 % ) 1 x 5 minuta,
destilirana voda 2 x 5 minuta,
Mayerova otopina, (Kemika, Zagreb) 1 x 3 minuta,
eozin, (Kemika, Zagreb) 1x 3 minuta (0.1 g boje na 100 ml 75 % alkohola),
destilirana voda 2 x 5 minuta,
rastući koncentracijski niz etilnog alkohola (100 %, 96%, 80 %, 75 % ) 1 x 5 minuta,,
ksilol 2 x 15 minuta (deparafiniranje),
uklapanje u kanada balzam (Kemika, Zagreb) s pokrovnim stakalcem (Arnold 1968., Lee i
Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
77
3.10.3. Reakcija na glikokonjugatne spojeve, PAS (engl. periodic acid Schiff base),
PAS+AB (engl. periodic acid Schiff base+alcian blue), PAS+α A (periodic acid Schiff
base+alfa amilase)
Ovim histokemijsko dijagnostičkim testovima za dokazivanje ugljikohidrata, tj. polisaharida
u tkivima obrađeni su bubreg, jetra i tanko crijevo. Fiksirani uzorci narezani su kriostatom.
Predmetnice s rezovima isparne su u 70 % etilnom alkoholu i uronjeni u perjodnu otopinu
sastava 1 ml 50 % perjodne kiseline (HIO4) u 100 ml destilirane vode, takvoj otopini
dodano je 135 mg kristalnog natrijeva acetata otopljenog u 35 ml apsolutnog etilnog
alkohola. Preparati su držani pri sobnoj temperaturi u trajanju od 5 minuta, u otopini
natrijevog acetata te su prebačeni u reducirajuću otopinu sastava 1 g natrijevog jodida, 1g
natrijevog tiosulfata u 20 ml vode. Nakon otapanja soli dodano je 30 ml etanola i 0,5 ml 2
M klorovodične kiseline.
Slijedi ispiranje u 70 % alkoholu i uranjanje 30 minuta u Schiffov reagens (1g bazičnog
fuksina, (Sigma) otopi se u 200 ml kipuće destilirane vode. Promiješa se i ohladi na 50°C.
Nakon filtriranja doda se 30 ml 1 M klorovodične kiseline, (Kemika, Zagreb) i 3 mg
natrijeva metabisulfata. Prije uporabe ostavi se stajati 24 sata u zatamljenoj boci kako bi
došlo do reakcije stvaranja SO2-parasoanilinskog kompleksa. Preparate se ispralo u vodi,
osušilo i uklopilo s pokrovnicom.
Crvenkasto purpurno obojene strukture ukazuju na pozitivnu PAS reakciju (tj. jasno vidimo
mjesta na kojima je najviše kompleksnih ugljikohidrata, polisaharida, glikokonjugata,
mukopolisaharida, glikana i sl.).
Njihovom razlučivanju služe druge dvije upotrebljene metode, PAS+AB i PAS+α amilaza.
Mukopolisaharidi (glikozaminoglikani) zbog negativnog naboja snažno vežu kationske
(pozitivno nabijene) boje poput toluidinskog modrila, Azura A i Alcian blue (AB).
Predmetnice s rezovima ostavimo 30 minuta na sobnoj temperaturi u otopini Alcian Blue
boje pH 2,5 (1 g, AB boja 8 GX, Sigma® i 100 ml 3% ledene octene kiseline s dodatkom
nekoliko kristalića timola). Rezultat je plavkasto do crvenkasto obojenje svih polisaharida i
mukoznih struktura koje sadrže heksoze ili deoksiheksoze sa glikolnim skupinama.
Hijaluronska kiselina, sijalomucini, i svi osim najkiselijih sulfoniranih mukoznih spojeva
boje se plavo.
78
Pozitivna PAS reakcija pokazuje tkivni raspored kompleksnih polisaharida. Dokaz da takva
područja sadrže glikogen ili škrob je taj da nakon djelovanja amilaze (PAS+α amilaza) na
tim mjestima više nema pozitivne PAS reakcije. Preparati tretirani po istom protokolu gore
opisanom za PAS reakciju prije početka PAS bojenja tretirani su 3 sata na 37°C sa 0.5 %
otopinom α-amilaze (α-amilaza Asperygilus ryze, Serva) u 0.004 % acetatnom puferu pri pH
5,5. Rezultat je gubitak pozitivne PAS reakcije na mjestima koja su sadržavala glikogen
(Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.10.4. Histokemijsko dokazivanje glutationa
Nefiksirani i kriostatom izrezani rezovi jetre osušeni su u potpunosti u sobnim uvjetima.
Predmetnice s preparatima uronjene su oko 20 sekundi u otopinu za bojenje (33 % (w/v)
otopinu željeznog klorida, (Kemika, Zagreb) u destiliranoj vodi, a neposredno prije upotrebe
pomiješati s 30 % (w/v) natrijeva fericijanida u destiliranoj vodi), potom su predmetnice
isperane kratko u destiliranoj vodi, osušene i uklopljene s pokrovnim stakalcem. Rezultat je
jako plavo obojenje tkiva na mjestima gdje je koncentriran glutation (Arnold 1968, Lee i
Luna 1961 i Chayen i Bittensky 1991).
3.10.5. Histokemijsko bojenje lipida - Sudan black B i Sudan III
Sudan B je metoda kojom dokazujemo lipidne uklopine u tkivima i stanicama organa.
Nefiksirana jetra narezana je na kriostatu. Napravljena je zasićena otopina Sudan Black B,
Sigma® u 70% etilnom alkoholu te profiltrirana. Predmetnice s rezovima ostavljene su 30
minuta u takvoj otopini a zatim su isprane od viška otopine u 70 % etilnom alkoholu, a
potom u 50 % etilnom alkoholu i na kraju u destiliranoj vodi. Nakon sušenja pokriveni su
pokrovnicom i uklopljeni u glicerin želatinu. Svi lipidi u stanici ovom metodom oboje se
sivkasto do crno-plavo.
Sudan III metoda provedena je tako da se otopi 1 g Sudan III, Sigma® reagensa u 100 ml
75 % etilnog alkohola. Kriostatski rezovi na predmetnicama provuku se kroz niz etilnog
alkohola koncentracija 100 %, 96%, 80 % i 75 % te urone u pripravljenu Sudan III otopinu
10-20 minuta. Ponovno se provuku kroz niz etilnog alkohola i uklope u glicerin želatinu.
Pozitivna reakcija lipide boji crvenkasto i narančasto (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i
Chayen i Bittensky 1991.).
79
3.11. ENZIMATSKOHISTOKEMIJSKE REAKCIJE NA TKIVA
3.11.1. Sukcinat-dehidrogenaza (ScDH)
Enzim ScDH katalizira reakciju oksidacije sukcinata u fumarat i ubikvinol. Po sastavu je
flavoprotein (FAD) koji sadrži željezo-sumporni kompleks. Enzim je dio Krebsovog
ciklusa, vezan za unutarnju membranu mitohondrija, gdje je glavni dio kompleksa II u
respiratornom lancu (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry 2001.).
Svježi, nefiksirani kriostatski rezovi jetre i mišića inkubirani su 30 minuta na 37°C u
reakcijskom mediju pripremljenom otapanjem 0.1 M neotetrazolijeva klorida (2,2´5,5´-
tetrafenil-3,3´difenilen tetrazolijev klorid, Sigma®, USA) u 100 ml 0,1 M fosfatnog pufera
(PBS) čija je pH vrijednost 7,8. Na 50 ml takve otopine dodano je 0,68 g natrijeva
sukcinata, Sigma® što predstavlja 0,05 M otopinu.. Nakon tako provedenog inkubiranja
preparati su isprani u destiliranoj vodi osušeni i uklopljeni. Rezultat je crvenkasto do
purpurno obojenje na mjestima aktivnosti sukcinat dehidrogenaze (Arnold 1968., Lee i
Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.11.2. Laktat-dehidrogenaza (LDH)
Enzim LDH katalizira reverzibilnu reakciju prelaska mliječne kiseline (laktata) u
pirogrožđanu kiselinu (piruvat), koja ima ključnu ulogu u glikolizi. Stvaranje laktata iz
piruvata omogućava stanici da energetski izdrži smanjenu količinu (hipoksija) ili privremeni
nedostatak kisika (anoksija), tj. anaerobne uvjete (Oxford Dictionary of Molecular Biology
and Biochemistry 2001.). Preparati su inkubirani u reakcijskom mediju (1 mg/ml nitroblue
tetrazolija otopljeno je u 0,05 M PBS-u pri pH 8.0 a zatim je dodano 0,2 g natrijeva laktata
na 25 ml ove otopine. Nakon provjere pH dodano je 5 mg NAD) cca 30 minuta na 37°C, a
zatim isprani, osušeni i uklopljeni kao polutrajni preparati. Rezultat je stvaranje crvenkastih,
plavih i ljubičastih mjesta gdje je aktivnost enzima pojačana (Arnold 1968., Lee i Luna
1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
80
3.11..3. Alkalna fosfataza (AlP)
Enzim ALF katalizira reakciju hidrolize ortofosfatnog monoestera u alkohol i ortofosfat tj.
reakciju otcjepljivanja fosfata sa različitih fosfatnih estera. Optimum reakcijske aktivnosti je
pri pH 8 ili više. Nalazimo ga u bakterija, gljiva, životinja ali ne i u viših biljaka. Kofaktori
su mu cink i magnezij (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry 2001.).
Kriostatski rezovi inkubiraju se 1 sat na sobnoj temperaturi u inkubacijskoj otopini koja se
sastoji od: 20 ml 0,2 M Tris-pufera, Sigma®, pH=8,7, u kojeg se doda 24 mg 1-diazo-4
benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast blue BB-diazonijeva sol), Sigma® zajedno sa 4 mg
naftol AS bifosfata, Sigma® koji služi kao supstrat. Nakon inkubacije i ispiranja preparati
se uklapaju u glicerin želatinu. Rezultat je crvenkasti produkt na mjestima najjače aktivnosti
enzima alkalne fosfataze (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.11..4. Kisela fosfataza (KP)
Enzim KP katalizira reakciju otcijepljivanja anorganskog fosfata sa različitih supstrata.
Kofaktori su mu cink i magnezij. Optimum njegove reakcijske aktivnosti nalazi se u
kiselom pH područaju. Kisela fosfataza nalazi se posebice unutar lizosoma i sekretornih
vezikula te je stoga najčešći marker lizosoma. Od svih tkiva najveću koncentraciju ima u
prostati, ali i u jetri i slezeni (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry
2001.). Svježi kriostatski rezovi inkubiraju se 1 sat pri 37 ° C u inkubacijskom mediju koji
sadrži 10 ml, 0,2 M acetatnog pufera pH=5,2 u kojem je otopljeno 2 mg supstrata naftoltol
AS bifosfata, (Sigma®), i 13 mg boje 5-kloro-4-benzamido-2-metilbenzendiazonijev
klorida (fast red-violet salt LB), Sigma®. Supstrat je netopiv u puferu pa ga se treba otopiti
najprije u par kapi acetona. Nakon inkubacije rezovi se isperu u destiliranoj vodi i uklope u
glicerin želatinu (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.11.5. Nespecifična Esteraza (EST)
Svježi kriostatski rezovi inkubiraju se 30 minuta na sobnoj temperaturi u inkubacijskoj
otopini koja sadrži 3 mg supstrata, naftilacetata najprije otopljenog s par kapi
dimetilformaldehida (DMF-a), na koje se dodaje 10 ml 0,2M Tris- pufera, 1-diazo-4
81
benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast blue BB-diazonijeva sol), Sigma®, pH vrijednosti
7,2, a potom se u tu otopinu doda 12 mg 1-diazo-4-benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast
blue BB-diazonijeva sol), Sigma®. Nakon ispiranja u destiliranoj vodi uklapa se u glicerin
želatinu. Rezultat na mjestima aktivnosti nespecifične esteraze je plava boja (Arnold 1968.,
Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
3.12. GLICERIN ŽELATINA I UKLOP PREPARATA
30 g želatine otopi se u 200 ml destilirane vode uz blago zagrijavanje. Dodaje se 200 ml
glicerina uz blago zagrijavanje 45-50°C u vodenoj kupelji. Nakon što otopina postane
homogena i tekuća filtrira se kroz sintetsku (perlonsku) vatu (Arnold 1968., Lee i Luna
1961. i Chayen i Bittensky 1991.).
82
4. REZULTATI
4. REZULTATI 4.1 PREŽIVLJAVANJE Rezultati preživljavanja mužjaka i ženki i pripadnika oba spola prikazani sun a slikama 12, 13,
14. U kontrolnoj skupini mužjaka i ženki miševa soja CBA T6T6 skupina do kraja planiranog
pokusa Slika 12: Preživljavanje mužjaka tijekom pokusa (%)
0
20
40
60
80
100
120
1/1 2/4 3/6 4/8 5/10
6/12
7/14
8/16
9/18
10/20
11/22
12/24
13/26
TRETMAN / DAN
Prež
ivlja
vanj
e (%
)
0mg/kg
185mg/kg
375mg/kg
555mg/kg
nije zabilježeno uginuće niti jedne jedinke kao posljedica stresa, djelovanja dietilnog etera
Slika 13.: Preživljavanje ženki tijekom pokusa (%)
0
20
40
60
80
100
120
1/1 2/4 3/6 4/85/10 6/1
27/14 8/1
69/18
10/20
11/22
12/24
13/26
TRETMAN / DAN
Prež
ivlja
vanj
e (%
)
0mg/kg
185mg/kg
375mg/kg
555mg/kg
84
prilikom
narkotiziranja životinja ili ulja apliciranog gastričkom kanilom. Preživljavanje kontrolnih
životinja je 100 % tijekom pokusnog razdoblja (slike 12., 13., 14.).
Preživljavanje jedinki tretiranih skupina koja je primila dozu od 185 mg/kg tijekom pokusnog
razdoblja bilo je potpuno (100 % preživljavanje). U skupini koja je primila dozu od 375 mg/kg,
kod ženskih jedinki preživljavanje je 100 % do kraja pokusnog razdoblja. Međutim, među
mužjacima te skupine nakon petog tretmana preživjelo je 85,71 % jedinki, a nakon jedanaestog
dana pa do kraja pokusa 71,42 %.
Slika 14.: Preživljavanje mužjaka i ženki
0
20
40
60
80
100
120
1/1 2/4 3/6 4/8 5/10 6/12 7/14 8/16 9/18 10/20 11/22 12/24 13/26
TRETMAN/DAN
Prež
ivlja
vanj
e (%
)
0mg/kg
185mg/kg
375mg/kg
555mg/kg
U skupini tretiranoj s 555 mg/kg, među mužjacima nakon drugog tretmana preživjelo je 85,71 %,
a nakon šestog 57,14 %.
Među ženkama skupine te skupine, nakon drugog tretmana, preživjelo je 85,71 % jedinki. Nakon
petog tretmana 71,42 % a nakon šestog 57,14 % jedinki.
85
4.2. REZULTATI MJERENJA AKTIVNOSTI SERUMSKIH ENZIMA Rezultati biokemijske analize krvi koji pokazuju aktivnost pojedinih enzima kao dijagnostičkih
pokazatelja toksičnog oštećenja pojedinih organskih sustava prometrinom prikazani su tablično
(tablice 5.-11.) i grafički (slike 15.-28.). Statistički značajne razlike prikazane su u tablicama
pored osnovne deskriptivne statistike pojedinog mjerenog parametra.
Aktivnosti laktat-dehidrogenaze (LDH U/L) prikazane su tablično (tablica 5.) i grafički
slikama 15. i 16. Uočene su statistički značajne razlike porasta aktivnosti LDH (p ≤ 0.01) između
mužjaka kontrolne skupine i mužjaka skupina tretiranih s 185 mg/kg i 375 mg/L. Nadalje
usporedbom pokusne skupine zbirno s obzirom na spol utvrđene su statistički značajne razlike
porasta aktivnosti LDH na istoj razini značajnosti (p ≤ 0.01) samo između kontrolne skupine i
skupine tretirane s 375 mg/kg, dok skupina tretirana s 185 mg/kg pokazuje različitost porasta
aktivnosti LDH u odnosu na kontrolnu skupinu na razini značajnosti p ≤ 0.05. Unutar skupina
značajna razlika uočava se jedino u skupini 185 mg/kg gdje ženke imaju manju aktivnost LDH
nego mužjaci.
Tablica 6. i slike 17. i 18. prikazuju aktivnosti γ- GT (U/L). Između spolova svih tretiranih
skupina nema statistički značajanih razlika. Mužjaci kontrolne skupine razlikuju se porastom
aktivnosti (p ≤ 0.01) od skupine tretirane s 375 mg/kg prometrina. Kontrolna skupina promatramo
li združeno mužjake i ženke razlikuje se aktivnosti na istoj razini značajnosti jedino od skupine
555 mg/kg.
Tablica 7. i slike 19. i 20. prikazuju aktivnosti alkalne-fosfataze (ALP) između tretiranih
skupina. Uočava se statistički značajna razlika porasta aktivnosti (p ≤ 0.05) u aktivnosti mužjaka
kontrolne skupine i mužjaka svih ostalih skupina tretiranih prometrinom. Ženke kontrolne
skupine razlikuju se na istoj razini značajnosti jačim porastom aktivnosti (p ≤ 0.01) od ženki
skupina tretiranih s 185 i 375 mg/kg. Promatramo li pokusne skupine ujedinjene s obzirom na
spol uočene su statistički značajne razlike porasta aktivnosti na istoj razini značajnosti (p ≤ 0.05)
između kontrolne skupine i skupina tretiranih s 185 i 375 mg/kg. Unutar pokusnih skupina
uočene su statistički značajne razlike između mužjaka i ženki svih skupina osim one koja je
primila najveću dozu prometrina, gdje u svim skupinama ženke imaju pojačanu aktivnost ALP
nego mužjaci.
Tablica 8. i slike 21. i 22. prikazuju koncentraciju kreatinina (μmol/dL) u krvi miševa
pokusnih skupina. Statistički značajne razlike na razini značajnosti (p ≤ 0.05) očituju se
opadanjem koncentracije kreatinina između kontrolne i svih ostalih skupina uočene su s obzirom
86
na dozu (mužjaci i ženke objedinjeni zajedno unutar skupine) i pri usporedbi tretiranih skupina s
obzirom na spol. Iznimka je razlika između mužjaka kontrolne i skupine koja je tretirana s 185
mg/kg prometrina gdje je razina značajnosti p ≤ 0.01, ali se očituje opadanjem koncentracije
kreatinina. Između mužjaka i ženki u svih pokusnih skupina nisu uočene statistički značajne
razlike.
Aktivnost Apartat transaminaze (AST U/L) značajno se ralikuju (p ≤ 0.01) između mužjaka i
ženki, gdje ženke imaju povišenu aktivnost enzima unutar svih skupina osim one koja je primala
najveću dozu od 555 mg/kg, gdje se uočava obrnuta situacija smanjenja aktivnosti u ženki.
Daljnje razlike vrlo blagog porasta aktivnosti (p ≤ 0.05) uočene su između mužjaka kontrolne
skupine i skupina 185 i 555 mg/kg, dok se jedino ženke skupine 375 mg/kg razlikuju vrlo blagim
padom (p ≤ 0.01) od kontrole kako je prikazano u tablici 9. i grafički slikama 23. i 24.
Tablica 10. i slike 25. i 26. prikazuju razlike u aktivnosti alanil-transaminaze u pokusnih
skupina. Statistički značajno, ali izuzetno blagim porastom aktivnost (p ≤ 0.01, p ≤ 0.05) od
ostalih skupina odstupa jedino skupina s najvećom dozom 555mg/kg, dok između spolova nisu
uočene značajne razlike.
Izračunati indeks De Ritiusovog omjera između gore spomenuta dva enzima (AST/ALT)
statistički se jedino razlikuje blagim opadanjem koeficijenta (p ≤ 0.05) između mužjaka
kontrolne skupine i doza 185 i 375mg/kg. Nadalje, razlike između spolova (p ≤ 0.01) uočavaju se
jedino u kontrolne skupine, gdje ženke imaju manji koeficijent od mužjaka, dok u drugih skupina
ne postoje statistički značajne razlike kako je to prikazano u tablici 11. i slikama 27. i 28.
87
Tablica 5. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina
LDH U/L
Značajne razlike Doza Spol N Srednja vrijednost
St. devijacija Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 343.22 93.26 232.32 463.00 NS A,B ž 7 351.88 76.53 267.94 463.84 NS NS
K 0 mg/kg
m + ž 14 388.43 145.15 232.32 751.22 a,B m 7 582.05 127.73 404.75 752.83 K,C ž 7 412.72 76.77 266.30 485.70 * NS
A 185 mg/kg
m + ž 14 497.38 134.05 266.30 752.83 k m 5 531.34 160.86 306.80 724.50 NS NS ž 7 497.40 162.49 216.13 641.90 NS C
B 375 mg/kg
m + ž 12 511.54 155.30 216.13 724.50 K m 4 495.35 320.01 148.10 857.20 NS NS ž 4 288.45 90.72 184.10 392.60 NS B
C 555 mg/kg
m + ž 8 391.90 244.23 148.10 857.20 A
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
200,00
400,00
600,00
800,00
ldh
Slika 15. Korelativni odnos izmjerene aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
88
Mean+SDMean-SDMean
Laktat dehidrogenaza
Doza
LDH
(U/L
)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
a,B
kK
A
Mean+SDMean-SDMeanOutliers
Laktat dehidrogenaza
Doza
LDH
(U/L
)
0
200
400
600
800
1000
m 0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg
A,B
*
*
K,C K
c
A
B
Slika 16: Srednje vrijednosti aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
89
Tablica 6. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina
yGT U/L Značajne razlike doza spol N Srednja
vrijednost Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 0.64 .4803 0.12 1.39 NS B ž 7 1.22 .5333 0.58 2.08 NS NS
K 0 mg/kg
m + ž 14 0.93 .5719 0.12 2.08 m 7 2.48 3.1110 0.00 8.68 NS NS ž 7 1.27 .6375 0.23 2.32 NS NS
A 185 mg/kg
m + ž 14 1.87 2.2461 0.00 8.68 m 5 3.60 1.9507 1.27 6.36 NS K ž 7 2.41 2.7265 0.57 8.28 NS NS
B 375 mg/kg
m + ž 12 2.91 2.4116 0.57 8.28 m 4 2.87 3.6838 0.11 8.30 NS NS ž 4 3.82 2.9880 0.00 6.71 NS NS
C 555 mg/kg
m + ž 8 3.35 3.1465 0.00 8.30
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
YGT
U/L
Slika 17. Korelativni odnos izmjerene gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
90
Mean+SEMean-SEMean
gama glutamil transferaza
Doza
GG
T(U
/L)
0
1
2
3
4
5
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
C
K
NS
NS
Mean+SEMean-SEMean
Gama glutamil transferaza
Doza
GG
T (U
/L)
0
1
2
3
4
5
6
m 0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg
B
K
NS NS
NS
NS
Slika 18: Srednje vrijednosti aktivnosti gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
91
Tablica 7. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina
AP U/L
Značajne razlike Doza Spol N Srednja vrijednost
Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 63.17 6.2253 52.36 72.71 ** a,b,c ž 7 75.32 6.4252 65.11 86.27 ** a,b
K 0 mg/kg
m + ž 14 69.25 8.7591 52.36 86.27 a,b m 7 82.74 11.7224 73.25 108.52 * k ž 7 111.50 6.8632 103.17 120.72 * k,B,c
A 185 mg/kg
m + ž 14 97.12 17.5470 73.25 120.72 k,c m 5 81.11 8.7605 71.89 92.24 * k ž 7 109.92 5.0373 105.80 119.37 * A,c
B 375 mg/kg
m + ž 12 97.91 16.1802 71.89 119.37 k,c m 4 80.32 12.7005 67.80 94.90 NS k ž 4 68.49 9.4258 59.68 77.30 NS a,b
C 555 mg/kg
m + ž 8 74.41 12.1323 59.68 94.90� a,b
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
60,00
80,00
100,00
120,00
AP
U/L
Slika 19. Korelativni odnos izmjerene alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
92
Mean+SDMean-SDMean
Alkalna fosfataza
Doza
AP
(U/L
)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
a,ba,b
k k
Mean+SDMean-SDMean
Alkalna fosfataza
Doza
AP
(U/L
)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z
**
**,a,b,c
*,k
*,B
*,k
*,A
k
a,b
Slika 20: Srednje vrijednosti aktivnosti alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
93
Tablica 8. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike koncentracije (µmol/L) kreatinina u serumu kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.
KREATININ µmol/dL Značajne razlike Doza Spol N Srednja
vrijednost Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
unutar skupine
m 7 102.56 23.5905 61.31 131.90 NS A,b,c ž 7 91.12 18.2540 63.21 120.24 NS a,b,c
K 0 mg/kg
m + ž 14 96.84 21.1153 61.31 131.90 - a,b,c m 7 82.40 11.8191 60.77 93.92 NS K,c ž 7 64.08 18.0640 40.33 96.13 NS k
A 185 mg/kg
m + ž 14 73.24 17.4763 40.33 96.13 - k m 5 71.79 26.0844 43.64 107.70 NS k ž 7 61.91 9.0357 50.80 70.16 NS k
B 375 mg/kg
m + ž 12 66.03 17.8276 43.64 107.70 - k m 4 49.56 3.7766 44.20 53.04 NS k,a ž 4 63.60 19.0287 46.90 82.30 NS k
C 555 mg/kg
m + ž 8 56.58 14.7525 44.20 82.30� - k
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
KR
EATI
NIN
um
ol/d
l
Slika 21. Korelativni odnos izmjerene kreatinina u serumu (µmol/dL) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
94
Mean+SDMean-SDMean
Kreatinin
Doza
KR
EA
T (m
ikro
mol
/dl)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg kg
a,b,c
k k
k
Mean+SDMean-SDMean
Kreatinin
Doza
KR
EA
T(m
ikro
mol
/dl)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z
kk
k
k
A,b,C
a,b,cK,c
k,a
Slika 22: Srednje vrijednosti koncentracije kreatinina u serumu (µmol/dL) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
95
Tablica 9. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.
AST U/L Značajne razlike doza spol N Srednja
vrijednost Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 36.63 6.35 26.19 42.25 ** b,c ž 7 67.33 12.05 52.80 85.80 ** B
K 0 mg/kg
m + ž 14 51.98 18.42 26.19 85.80 NS m 7 44.52 4.72 36.52 52.80 ** b,c ž 7 59.86 5.70 51.48 70.40 ** NS
A 185 mg/kg
m + ž 14 52.19 9.41 36.52 70.40 NS m 5 69.74 16.95 49.72 92.40 ** k,a ž 7 51.54 10.45 33.00 63.36 ** K
B 375 mg/kg
m + ž 12 59.12 15.87 33.00 92.40 NS m 4 71.42 24.71 47.96 105.60 NS k,a ž 4 56.02 16.38 44.44 79.20 NS NS
C 555 mg/kg
m + ž 8 63.72 21.08 44.44 105.60 NS
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
25,00
50,00
75,00
100,00
AST
U/L
Slika 23. Korelativni odnos aktivnosti aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
96
Mean+SDMean-SDMean
Aspartat transferaza
Doza
AS
T (U
/L)
0
20
40
60
80
100
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
NS
Mean+SDMean-SDMean
Aspartat aminotransferaza
Doza
AS
T (U
/L)
0
20
40
60
80
100
0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg /kg z 555 mg /kg m 555 mg/kg z
**,b,c
**,B
**,b,c
**
**,k
**,K
k k,a
Slika 24. Srednje vrijednosti koncentracije aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
97
Tablica 10. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti alani- transaminaze (U/L) u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.
ALT U/L Značajne razlike Doza Spol N Srednja
vrijednost Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 17.53 4.65 12.76 26.40 NS C ž 7 17.52 3.33 13.20 22.00 NS
K 0 mg/kg
m + ž 14 17.53 3.88 12.76 26.40 m 7 14.49 1.55 13.20 17.60 NS c ž 7 18.04 2.05 14.08 19.80 NS
A 185 mg/kg
m + ž 14 16.26 2.53 13.20 19.80 m 5 16.61 1.97 13.20 18.04 NS C ž 7 14.89 4.22 8.80 18.48 NS
B 375 mg/kg
m + ž 12 15.61 3.45 8.80 18.48 m 4 22.69 8.92 16.28 35.20 NS K,a,B ž 4 17.45 3.60 13.20 22.00 NS
C 555 mg/kg
m + ž 8 20.07 6.89 13.20 35.20
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
10,00
20,00
30,00
ALT
U/L
Slika 25. Korelativni odnos aktivnosti alani- transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
98
Mean+SDMean-SDMean
Alanil aminotransferaza
Doza
ALT
(U/L
)
0
5
10
15
20
25
30
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
NS
Mean+SDMean-SDMean
Alanil aminotransferaza
Doza i spol
ALT
(U/L
)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg7kg z
C
C
K,a,B
c
NSNS NS
NS
Slika 26. Srednje vrijednosti koncentracije alanil-transaminaze (U/L) u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
99
Tablica 11. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike izračunate vrijednosti De Ritisovog indeksa (omjera aktivnosti (U/L) aspartat transaminaze i alanil transaminaze) u serumu kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrin
De Ritis omjer AST/ALT Značajne razlike Doza Spol N Srednja
vrijednost Standardna devijacija
Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 7 0.51 0.24 0.30 1.01 ** a,b ž 7 0.27 8.09E-02 0.18 0.42 *
K 0 mg/kg
m + ž 14 0.39 0.21 0.18 1.01 m 7 0.32 4.28E-02 0.30 0.42 NS k ž 7 0.30 5.9E-02 0.20 0.38 NS
A 185 mg/kg
m + ž 14 0.31 5.1E-02 0.20 0.42 m 5 0.25 7.9E-02 0.17 0.35 NS k ž 7 0.30 0.16 0.15 0.51 NS
B 375 mg/kg
m + ž 12 0.28 0.10 0.15 0.51 m 4 0.31 3.2E-02 0.27 0.34 NS ž 4 0.34 0.13 0.17 0.50 NS
C 555 mg/kg
m + ž 8 0.32 9.4E-02 0.17 0.50
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
doza
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
AST
/ALT
Slika 27. Korelativni odnos aktivnosti Alanil-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama
100
Mean+SDMean-SDMean
Omjer AST/ALT, De Ritis-ov omjer
Doza
De
Riti
s om
jer
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg
NS
Mean+SDMean-SDMean
Omejr AST/ALT, De Ritis-ov omjer
Doza
De
Riti
s-ov
om
jer
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z
**
** NS
NS NS
Slika 28. Srednje vrijednosti De Ritiusovog omjera kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
101
4.3. Korelacije i regresije enzima Tablice 12.-23. i slike 29.-58. prikazuju korelativne i regresijske odnose između pojedinih
mjerenih enzima. Statistički značajne razlike korelacijskog koeficijenta “r” prikazane su u
tablicama 12.-23. regresijske jednadžbe s koeficijentom regresije “b” prikazane su u pojedinom
dijagramu (slike 29.-58.) linearno regresijskog odnosa pojedinih enzima promatranih s obzirom
na dozu te dozu i spol.
Uočava se statistički značajna pozitivna povezanost između odnosa AP i GGT, AP i AST kao i
GGT i AST u kontrolnih jedinki promatramo li objedinjene spolove (tablica 12.). Takav se odnos
u kontrolne skupine zadržava jedino u ženki između enzima AP i GGT (tablica 14.), dok su kod
mužjaka pozitivno statistički značajno povezani samo ALT i AST (tablica 15.). Već najmanja
doza pesticide u 28 dnevnoj izloženosti pokazuje statistički značajniju pozitivnu korelaciju
enzima LDH i serumskog kreatinina u združeno promatranih spolova, takav se odnos uočava
jedino u mužjaka promatrane (tablica 16.) skupine dok kod ženki nema statistički značajne
korelacije dvaju varijabli.
Pozitivna korelacija AP i AST i dalje ostaje statistički značajna kao i u kontrole, a ostali prije
nabrojeni enzimi koji su bili statistički značajno pozitivno korelirani gube značajnu statističku
vezu u ženki promatrane skupine, dok kod mužjaka te korelacije i dalje ostaju slične kontroli.
Nadalje posebice je uočljiva pojava statistički značajne negativne korelacije AST i ALT u ženki
promatrane skupine (tablica 17.). Skupina koja je primala dozu 375 mg/kg (tablice 18.-20.)
pokazuje statistički značajnu negativnu povezanost kreatinina i AP u združeno promatranim
spolovima u odnosu na primljenu dozu, dok u mužjaka te skupine negativno koreliran a satistički
značajan odnos pojavljuje se između LDH i GGT, a u ženki iste skupine pozitivno vezani, sa
statistički značajem LDH i AST
U skupine tretirane najvećom dozom korelitivni odnosi ne pokazuju statistički značajnu
povezanost osim u mužjaka kod enzima AST i ALT (tablica 22.).
102
Tablica 12. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,243 -0,212 0,101 -0,172 -0,234
GGT -0,243 1,000 0,680 -0,370 0,582 -0,327
AP -0,212 0,680 1,000 -0,130 0,803 -0,232
KREAT 0,101 -0,370 -0,130 1,000 -0,164 -0,010
AST -0,172 0,582 0,803 -0,164 1,000 -0,244
ALT -0,234 -0,327 -0,232 -0,010 -0,244 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 13. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,182 -0,137 0,118 0,434 -0,326
GGT -0,182 1,000 0,125 0,037 0,011 -0,193
AP -0,137 0,125 1,000 0,616 0,294 -0,205
KREAT 0,118 0,037 0,616 1,000 0,170 -0,283
AST 0,434 0,011 0,294 0,170 1,000 -0,939
ALT -0,326 -0,193 -0,205 -0,283 -0,939 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05. Tablica 14. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,058 0,196 -0,251 -0,254 0,010
GGT -0,058 1,000 0,853 -0,643 0,460 -0,638
AP 0,196 0,853 1,000 -0,523 0,668 -0,513
KREAT -0,251 -0,643 -0,523 1,000 0,179 0,477
AST -0,254 0,460 0,668 0,179 1,000 -0,216
ALT 0,010 -0,638 -0,513 0,477 -0,216 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.
103
Tablica 15. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,530 -0,457 0,615 -0,499 -0,341
GGT 0,530 1,000 0,082 0,490 -0,363 -0,211
AP -0,457 0,082 1,000 -0,444 0,687 0,522
KREAT 0,615 0,490 -0,444 1,000 -0,379 -0,491
AST -0,499 -0,363 0,687 -0,379 1,000 0,332
ALT -0,341 -0,211 0,522 -0,491 0,332 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05. Tablica 16. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,562 0,249 0,926 0,119 0,607
GGT 0,562 1,000 0,800 0,623 -0,359 -0,200
AP 0,249 0,800 1,000 0,362 0,067 -0,297
KREAT 0,926 0,623 0,362 1,000 0,125 0,366
AST 0,119 -0,359 0,067 0,125 1,000 0,444
ALT 0,607 -0,200 -0,297 0,366 0,444 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 17. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,061 0,265 -0,063 0,142 -0,229
GGT 0,061 1,000 -0,453 0,513 -0,308 0,336
AP 0,265 -0,453 1,000 -0,307 -0,278 0,083
KREAT -0,063 0,513 -0,307 1,000 0,181 -0,429
AST 0,142 -0,308 -0,278 0,181 1,000 -0,899
ALT -0,229 0,336 0,083 -0,429 -0,899 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05.
104
Tablica 18. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,085 -0,090 0,308 0,525 0,018
GGT -0,085 1,000 -0,175 0,155 0,108 0,135
AP -0,090 -0,175 1,000 -0,724 -0,441 -0,234
KREAT 0,308 0,155 -0,724 1,000 0,250 0,113
AST 0,525 0,108 -0,441 0,250 1,000 0,076
ALT 0,018 0,135 -0,234 0,113 0,076 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 19. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,802 0,313 0,284 0,286 -0,304
GGT -0,802 1,000 -0,171 -0,316 -0,336 0,406
AP 0,313 -0,171 1,000 -0,081 0,297 0,044
KREAT 0,284 -0,316 -0,081 1,000 -0,698 0,374
AST 0,286 -0,336 0,297 -0,698 1,000 -0,297
ALT -0,304 0,406 0,044 0,374 -0,297 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 20. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,430 0,167 0,172 0,988 0,121
GGT 0,430 1,000 -0,188 0,480 0,552 0,002
AP 0,167 -0,188 1,000 0,106 0,146 -0,160
KREAT 0,172 0,480 0,106 1,000 0,251 -0,458
AST 0,988 0,552 0,146 0,251 1,000 0,104
ALT 0,121 0,002 -0,160 -0,458 0,104 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.
105
Tablica 21. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,703 -0,096 -0,195 0,246 0,265
GGT -0,703 1,000 0,208 0,444 0,143 -0,110
AP -0,096 0,208 1,000 -0,358 0,610 0,473
KREAT -0,195 0,444 -0,358 1,000 0,167 -0,368
AST 0,246 0,143 0,610 0,167 1,000 0,644
ALT 0,265 -0,110 0,473 -0,368 0,644 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 22. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL:mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,834 -0,580 0,759 0,239 0,080
GGT -0,834 1,000 0,803 -0,927 0,003 0,066
AP -0,580 0,803 1,000 -0,532 0,589 0,648
KREAT 0,759 -0,927 -0,532 1,000 0,324 0,296
AST 0,239 0,003 0,589 0,324 1,000 0,977
ALT 0,080 0,066 0,648 0,296 0,977 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.
Tablica 23. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,542 0,074 -0,362 -0,713 0,272
GGT -0,542 1,000 -0,410 0,915 0,646 -0,408
AP 0,074 -0,410 1,000 -0,073 0,374 -0,659
KREAT -0,362 0,915 -0,073 1,000 0,755 -0,700
AST -0,713 0,646 0,374 0,755 1,000 -0,863
ALT 0,272 -0,408 -0,659 -0,700 -0,863 1,000
Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05.
106
-250,00
0,00
250,00
500,00
750,00
ldh
ldh = 360.50 + -13.84 * ggtR-Square = 0.01
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ldh = 438.04 + 31.60 * ggtR-Square = 0.28
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt
-250,00
0,00
250,00
500,00
750,00
ldh
ldh = 548.38 + -6.27 * ggtR-Square = 0.01
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt
ldh = 574.87 + -54.58 * ggtR-Square = 0.49
Slika 29.: Linearna regresija enzima LDH:GGT
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 179.87 + 2.42 * apR-Square = 0.07
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ldh = 836.49 + -3.49 * apR-Square = 0.21
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 612.00 + -0.85 * apR-Square = 0.01
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ldh = 535.84 + -1.93 * apR-Square = 0.01
Slika 30: Linearna regresija enzima LDH:AP
107
-1000,00
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 283.36 + 0.66 * ckR-Square = 0.03
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ldh = 152.04 + 4.72 * ckR-Square = 0.38
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
-1000,00
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 289.89 + 3.27 * ckR-Square = 0.10
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ldh = 575.00 + -3.24 * ckR-Square = 0.04
Slika 31.: Linearna regresija enzima LDH:kreatinin
0,00
250,00
500,00
750,00
1000,00
ldh
ldh = 329.16 + 0.22 * astR-Square = 0.00
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ldh = 835.62 + -6.39 * astR-Square = 0.25
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
0,00
250,00
500,00
750,00
1000,00
ldh
ldh = 226.94 + 4.95 * astR-Square = 0.28
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ldh = 210.56 + 2.85 * astR-Square = 0.06
Slika 32.: Linearna regresija enzima LDH:AST
108
0,00
400,00
800,00
1200,00
ldh
ldh = 504.28 + -8.94 * altR-Square = 0.18
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ldh = 760.52 + -16.17 * altR-Square = 0.11
10,0 20,0 30,0
alt
0,00
400,00
800,00
1200,00
ldh
ldh = 509.41 + 1.41 * altR-Square = 0.00
10,0 20,0 30,0
alt
ldh = 203.74 + 9.38 * altR-Square = 0.07
Slika 33.: Linearna regresija enzima LDH:ALT
-5,00
0,00
5,00
10,00
15,00
ggt
ggt = -2.14 + 0.04 * apR-Square = 0.46
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ggt = 0.86 + 0.01 * apR-Square = 0.01
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
-5,00
0,00
5,00
10,00
15,00
ggt
ggt = 4.82 + -0.02 * apR-Square = 0.03
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ggt = -0.66 + 0.05 * apR-Square = 0.04
Slika 34.: Linearna regresija enzima:GGT:AP
109
0,00
10,00
20,00
ggt
ggt = 1.91 + -0.01 * ckR-Square = 0.14
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ggt = -2.73 + 0.06 * ckR-Square = 0.24
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
0,00
10,00
20,00
ggt
ggt = 1.03 + 0.02 * ckR-Square = 0.02
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ggt = -2.00 + 0.09 * ckR-Square = 0.20
Slika 35.: Linearna regresija enzima GGT:kreatinin
-5,00
0,00
5,00
10,00
ggt
ggt = -0.09 + 0.02 * astR-Square = 0.40
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ggt = 6.00 + -0.08 * astR-Square = 0.13
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
-5,00
0,00
5,00
10,00
ggt
ggt = 1.83 + 0.01 * astR-Square = 0.01
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ggt = 1.99 + 0.02 * astR-Square = 0.02
Slika 36.: Linearna regresija enzima GGT:AST
110
-10,00
-5,00
0,00
5,00
10,00
ggt
ggt = 1.77 + -0.05 * altR-Square = 0.11
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ggt = 4.61 + -0.17 * altR-Square = 0.04
10,0 20,0 30,0
alt
-10,00
-5,00
0,00
5,00
10,00
ggt
ggt = 1.30 + 0.09 * altR-Square = 0.02
10,0 20,0 30,0
alt
ggt = 4.35 + -0.05 * altR-Square = 0.01
Slika 37.: Linearna regresija enzima GGT:ALT
0,00
40,00
80,00
120,00
ap
ap = 74.47 + -0.05 * ckR-Square = 0.02
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ap = 129.80 + -0.45 * ckR-Square = 0.20
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
0,00
40,00
80,00
120,00
ap
ap = 153.89 + -0.81 * ckR-Square = 0.52
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ap = 91.06 + -0.29 * ckR-Square = 0.13
Slika 38.: Linearna regresija enzima AP:kreatinin
111
50,00
100,00
150,00
200,00
ap
ap = 48.97 + 0.39 * astR-Square = 0.63
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ap = 36.21 + 1.15 * astR-Square = 0.47
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
50,00
100,00
150,00
200,00
ap
ap = 121.10 + -0.44 * astR-Square = 0.19
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ap = 52.04 + 0.35 * astR-Square = 0.37
Slika 39.: Linearna regresija enzima AP:AST
50,00
100,00
150,00
200,00
ap
ap = 78.36 + -0.52 * altR-Square = 0.05
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ap = 44.20 + 3.25 * altR-Square = 0.27
10,0 20,0 30,0
alt
50,00
100,00
150,00
200,00
ap
ap = 114.04 + -1.26 * altR-Square = 0.06
10,0 20,0 30,0
alt
ap = 57.68 + 0.83 * altR-Square = 0.22
Slika 40.: Linearna regresija enzima AP:ALT
112
-50,00
0,00
50,00
100,00
150,00
ck
ck = 97.97 + -0.06 * altR-Square = 0.00
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ck = 122.76 + -3.04 * altR-Square = 0.24
10,0 20,0 30,0
alt
-50,00
0,00
50,00
100,00
150,00
ck
ck = 63.90 + 0.64 * altR-Square = 0.02
10,0 20,0 30,0
alt
ck = 72.35 + -0.79 * altR-Square = 0.13
Slika 41.: Linearna regresija enzima Kreatinin:ALT
0,00
40,00
80,00
120,00
ck
ck = 106.76 + -0.19 * astR-Square = 0.02
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ck = 106.73 + -0.63 * astR-Square = 0.14
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
0,00
40,00
80,00
120,00
ck
ck = 60.32 + 0.22 * astR-Square = 0.06
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ck = 49.12 + 0.12 * astR-Square = 0.03
Slika 42.: Linearna regresija enzima Kreatinin:AST
113
0,00
40,00
80,00
120,00
ast
ast = 69.75 + -1.11 * altR-Square = 0.06
0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola
375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola
ast = 32.98 + 1.23 * altR-Square = 0.11
10,0 20,0 30,0
alt
0,00
40,00
80,00
120,00
ast
ast = 55.82 + 0.36 * altR-Square = 0.00
10,0 20,0 30,0
alt
ast = 24.20 + 1.97 * altR-Square = 0.41
Slika 43.: Linearna regresija enzim AST:ALT
114
-1000,00
0,00
1000,00
ldh
ldh = 372.27 + -44.88 * ggtR-Square = 0.05
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ldh = 362.05 + -8.31 * ggtR-Square = 0.00
ldh = 524.78 + 23.09 * ggtR-Square = 0.32 ldh = 403.41 + 7.30 * ggt
R-Square = 0.00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt-1000,00
0,00
1000,00
ldh
ldh = 785.27 + -74.46 * ggtR-Square = 0.64
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt
ldh = 435.50 + 25.63 * ggtR-Square = 0.18
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt
ldh = 703.74 + -72.42 * ggtR-Square = 0.69
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
ggt
ldh = 351.43 + -16.45 * ggtR-Square = 0.29
Slika 44.: Linearna regresija enzim LDH:GGT, promatranih s obzirom na spol
115
-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
ldh
ldh = -55.41 + 6.31 * apR-Square = 0.18
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ldh = 175.70 + 2.34 * apR-Square = 0.04
ldh = 357.97 + 2.71 * apR-Square = 0.06 ldh = 81.70 + 2.97 * ap
R-Square = 0.07
60,00 80,00 100,00 120,00
ap-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
ldh
ldh = 86.64 + 6.09 * apR-Square = 0.10
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ldh = -96.10 + 5.40 * apR-Square = 0.03
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ldh = 1670.10 + -14.62 * apR-Square = 0.34
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ldh = 239.95 + 0.71 * apR-Square = 0.01
Slika 45.: Linearna regresija enzim LDH:AP, promatranih s obzirom na spol
116
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 149.93 + 1.88 * ckR-Square = 0.23
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ldh = 447.81 + -1.05 * ckR-Square = 0.06
ldh = -242.81 + 10.01 * ckR-Square = 0.86
ldh = 429.93 + -0.27 * ckR-Square = 0.00
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
-500,00
0,00
500,00
1000,00
ldh
ldh = 176.45 + 4.52 * ckR-Square = 0.08
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ldh = 305.40 + 3.10 * ckR-Square = 0.03
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ldh = -2693.94 + 64.35 * ckR-Square = 0.58
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ldh = 398.10 + -1.72 * ckR-Square = 0.13
Slika 46.: Linearna regresija enzim LDH:kreatinin, promatranih s obzirom na spol
117
-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
ldh
ldh = -87.93 + 11.77 * astR-Square = 0.64
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ldh = 448.49 + -1.69 * astR-Square = 0.09
ldh = 438.30 + 3.23 * astR-Square = 0.01 ldh = 317.36 + 1.55 * ast
R-Square = 0.02
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
ldh
ldh = 369.53 + 2.75 * astR-Square = 0.08
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ldh = -294.25 + 15.36 * astR-Square = 0.98
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ldh = 274.51 + 3.09 * astR-Square = 0.06
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ldh = 509.72 + -3.95 * astR-Square = 0.51
Slika 47.: Linearna regresija enzim LDH:AST, promatranih s obzirom na spol
118
-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
ldh
ldh = 582.88 + -13.67 * altR-Square = 0.46
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ldh = 347.36 + 0.26 * altR-Square = 0.00
ldh = -142.48 + 49.98 * altR-Square = 0.37 ldh = 528.17 + -6.40 * alt
R-Square = 0.05
10,0 20,0 30,0
alt
-1000,00
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
ldh
ldh = 924.83 + -21.81 * altR-Square = 0.07
10,0 20,0 30,0
alt
ldh = 429.54 + 4.56 * altR-Square = 0.01
10,0 20,0 30,0
alt
ldh = 430.42 + 2.86 * altR-Square = 0.01
10,0 20,0 30,0
alt
ldh = 168.83 + 6.85 * altR-Square = 0.07
Slika 48.: Linearna regresija enzim LDH:ALT, promatranih s obzirom na spol
119
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = 0.62 + 0.00 * astR-Square = 0.00
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ggt = -0.09 + 0.02 * astR-Square = 0.27
ggt = 13.02 + -0.24 * astR-Square = 0.13 ggt = 2.99 + -0.03 * ast
R-Square = 0.09
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = 5.43 + -0.03 * astR-Square = 0.11
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ggt = -5.01 + 0.14 * astR-Square = 0.30
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ggt = 2.84 + 0.00 * astR-Square = 0.00
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ggt = -2.77 + 0.12 * astR-Square = 0.42
Slika 49.: Linearna regresija enzim GGT:AST, promatranih s obzirom na spol
120
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = 0.04 + 0.01 * apR-Square = 0.02
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ggt = -4.11 + 0.07 * apR-Square = 0.73
ggt = -15.09 + 0.21 * apR-Square = 0.64
ggt = 5.97 + -0.04 * apR-Square = 0.21
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = 5.78 + -0.04 * apR-Square = 0.03
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ggt = 13.62 + -0.10 * apR-Square = 0.04
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ggt = -15.82 + 0.23 * apR-Square = 0.64
60,00 80,00 100,00 120,00
ap
ggt = 12.74 + -0.13 * apR-Square = 0.17
Slika 51.: Linearna regresija enzim GGT:AP, promatranih s obzirom na spol
121
-150,00
-100,00
-50,00
0,00
ggt
ggt = 0.57 + 0.00 * ckR-Square = 0.00
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ggt = 2.94 + -0.02 * ckR-Square = 0.41 ggt = -11.02 + 0.16 * ck
R-Square = 0.39
ggt = 0.12 + 0.02 * ckR-Square = 0.26
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
-150,00
-100,00
-50,00
0,00
ggt
ggt = 7.62 + -0.05 * ckR-Square = 0.10
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ggt = -6.55 + 0.14 * ckR-Square = 0.23
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ggt = 47.68 + -0.90 * ckR-Square = 0.86
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ggt = -5.31 + 0.14 * ckR-Square = 0.84
Slika 51.: Linearna regresija enzim GGT:Kreatinin, promatranih s obzirom na spol
122
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = 0.99 + -0.02 * altR-Square = 0.04
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ggt = 3.01 + -0.10 * altR-Square = 0.41
ggt = 8.25 + -0.40 * altR-Square = 0.04 ggt = -0.15 + 0.08 * alt
R-Square = 0.11
10,0 20,0 30,0
alt
-50,00
-25,00
0,00
25,00
ggt
ggt = -2.35 + 0.32 * altR-Square = 0.14
10,0 20,0 30,0
alt
ggt = 2.39 + 0.00 * altR-Square = 0.00
10,0 20,0 30,0
alt
ggt = 2.25 + 0.03 * altR-Square = 0.00
10,0 20,0 30,0
alt
ggt = 9.72 + -0.34 * altR-Square = 0.17
Slika 52.: Linearna regresija enzim GGT:ALT, promatranih s obzirom na spol
123
-300,00
-200,00
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 46.51 + 0.16 * ckR-Square = 0.38
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ap = 92.11 + -0.18 * ckR-Square = 0.27
ap = 53.14 + 0.36 * ckR-Square = 0.13
ap = 118.99 + -0.12 * ckR-Square = 0.09
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
-300,00
-200,00
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 84.36 + -0.07 * ckR-Square = 0.01
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ap = 106.25 + 0.06 * ckR-Square = 0.01
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ap = 169.02 + -1.79 * ckR-Square = 0.28
40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
ck
ap = 70.80 + -0.04 * ckR-Square = 0.01
Slika 53.: Linearna regresija enzim AP:kreatinin, promatranih s obzirom na spol
124
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 52.62 + 0.29 * astR-Square = 0.09
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ap = 51.03 + 0.37 * astR-Square = 0.45
ap = 75.30 + 0.17 * astR-Square = 0.00
ap = 128.20 + -0.27 * astR-Square = 0.08
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 68.22 + 0.15 * astR-Square = 0.09
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ap = 106.30 + 0.07 * astR-Square = 0.02
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ap = 58.70 + 0.30 * astR-Square = 0.35
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ap = 56.44 + 0.22 * astR-Square = 0.14
Slika 54: Linearna regresija enzim AP:AST, promatranih s obzirom na spol
125
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 67.98 + -0.27 * altR-Square = 0.04
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ap = 92.63 + -0.99 * altR-Square = 0.26
ap = 115.19 + -2.24 * altR-Square = 0.09
ap = 107.69 + 0.21 * altR-Square = 0.01
10,0 20,0 30,0
alt
-100,00
0,00
100,00
200,00
ap
ap = 73.78 + 0.30 * altR-Square = 0.01
10,0 20,0 30,0
alt
ap = 112.80 + -0.19 * altR-Square = 0.03
10,0 20,0 30,0
alt
ap = 59.38 + 0.92 * altR-Square = 0.42
10,0 20,0 30,0
alt
ap = 98.55 + -1.72 * altR-Square = 0.43
Slika 55.: Linearna regresija enzim AP:ALT, promatranih s obzirom na spol
126
-100,00
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
ck
ck = 79.47 + 0.63 * astR-Square = 0.03
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ck = 72.24 + 0.28 * astR-Square = 0.03
ck = 68.44 + 0.31 * astR-Square = 0.02
ck = 35.42 + 0.47 * astR-Square = 0.03
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
-100,00
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
ck
ck = 116.15 + -0.42 * astR-Square = 0.49
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ck = 50.72 + 0.22 * astR-Square = 0.06
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ck = 46.02 + 0.05 * astR-Square = 0.11
25,00 50,00 75,00 100,00
ast
ck = 14.49 + 0.88 * astR-Square = 0.57
Slika 56.: Linearna regresija enzim kreatinin:AST, promatranih s obzirom na spol
127
-200,00
-100,00
0,00
100,00
200,00
300,00
ck
ck = 127.84 + -1.44 * altR-Square = 0.08
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ck = 45.48 + 2.61 * altR-Square = 0.23
ck = 42.12 + 2.78 * altR-Square = 0.13
ck = 115.25 + -2.84 * altR-Square = 0.18
10,0 20,0 30,0
alt
-200,00
-100,00
0,00
100,00
200,00
300,00
ck
ck = 50.17 + 2.18 * altR-Square = 0.18
10,0 20,0 30,0
alt
ck = 76.49 + -0.98 * altR-Square = 0.21
10,0 20,0 30,0
alt
ck = 46.73 + 0.12 * altR-Square = 0.09
10,0 20,0 30,0
alt
ck = 128.07 + -3.69 * altR-Square = 0.49
Slika 57.: Linearna regresija enzim kreatinin:ALT, promatranih s obzirom na spol
128
-100,00
0,00
100,00
ast
ast = 59.10 + -1.28 * altR-Square = 0.88
kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski
375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski
ast = 79.56 + -0.76 * altR-Square = 0.05
ast = 24.99 + 1.35 * altR-Square = 0.20
ast = 103.50 + -2.33 * altR-Square = 0.81
10,0 20,0 30,0
alt
-100,00
0,00
100,00
ast
ast = 117.19 + -2.78 * altR-Square = 0.11
10,0 20,0 30,0
alt
ast = 47.79 + 0.25 * altR-Square = 0.01
10,0 20,0 30,0
alt
ast = 9.98 + 2.71 * altR-Square = 0.96
10,0 20,0 30,0
alt
ast = 124.46 + -3.92 * altR-Square = 0.74
Slika 58: Linearna regresija enzim AST:ALT, promatranih s obzirom na
129
4.4. Rezultati komet-tehnike 4.4.1. Nakon 14. dana izloženosti prometrinu
U tablicama 24.-28. i grafikonima (slike 59.-68.) prikazani su rezultati analize komet-
tehnike leukocita periferne krvi miševa kontrolnih i pokusnih skupina nakon 14 dana
tretiranja prometrinom. Statistički značajne razlike između skupina i podskupina prikazani
su tablično uz pripadajuću deskriptivnu statistiku.
Slike 59-68 prikazane su uobičajenom standardnom metodom prikaza rezultata komet testa.
unutar grupe podaci su raspoređeni u slici unutar percentila od 25 %, sa prikazom medijana
i whiskers-ima koji obuhvaćaju minimum i maksimum mjerenih vrijednosti u populaciji
stanica (Singh i sur. 1988, Olive 1999, Rojas i sur. 1999, Singh 2000, Alnemri i Litwac
1989,Chandra i sur. 2000, Wang i sur. 1999, Wyllie 1993).
Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi prikazan je tablicom 24. i
slikama 59. i 60. Uočava se statistički značajna razlika opadanja proporcionalno porastu
doze između ženki kontrolne i mužjaka kontrolne skupine i ženki skupine koja je tretirana s
555 mg/kg prometrina. Promatra li se ukupan broj mužjaka i ženki objedinjenih u skupinu s
pripadajučom dozom, sve tretirane skupine pokazuju statistički značajno opadanje s
porastom doze u odnosu na kontrolnu skupinu (slika 60.). Sve navedene razlike na razini
su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u svih skupina nisu uočene razlike.
Tablica 25. i slike 61. i 62. prikazuju postotak DNA u repu kometa. Između mužjaka i
ženki svih skupina kao i između doza raspoređenih po spolu nisu uočene statistički značajne
razlike. Porast postotka DNA u repu (p ≤ 0.01) postoje između kontrolne skupine
objedinjenih spolova i skupina koje su primile 185 i 555 mg/kg prometrina.
Repni moment odnosno OTM tretiranih skupina prikazan je tablicom 26. i slikama 63. i
64. Postoje statistički značajne razlike porasta OTM koeficijenta (p ≤ 0.01) između
kontrolne skupine objedinjenih spolova i svih ostalih tretiranih skupina. Između spolova
unutar svih skupina ne postoje značajne razlike. Nadalje, značajni se porast uočava između
skupina mužjaka kontrolne skupine tretiranih skupina mužjaka (p ≤ 0.05) i ženki kontrolne
skupine i ženki koje su primile najveću dozu (p ≤ 0.01).
Dužina repa prikazana tablicom 27. i slikama 65. i 66. statistički značajno raste (p ≤
0.01) u ženki skupine koja je primala najveću dozu u odnosu na ženke kontrole, a između
ostalih skupina nema statistički značajnijih razlika.
130
U optičkom intenzitetu repa (tablica 28. i slike 67. i 68.) postoji statistički značajna
razlika porasta intenziteta između ženki kontrolne skupine i skupina A i B i ženki skupine
koja je tretirana s 555 mg/kg prometrina. Promatra li se ukupano mužjake i ženke
objedinjene u skupinu s pripadajučom dozom, sve tretirane skupine pokazuju statistički
značajan porast intenziteta fluorescencije u odnosu na kontrolnu skupinu. Sve navedene
razlike na razini su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u svih skupina nisu uočene
razlike.
131
Tablica 24. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina
% DNA u glavi kometa 14. dan Značajne razlike Doza
Spol
Srednja
vrijednost St.
devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 96,52 7,86 96,81 35,36 100,00 NS C ž 96,68 7,13 96,20 64,93 100,00 NS C K
0 mg/kg m + ž 96,60 7,44 96,51 35,36 100,00 A,B,C
m 92,07 8,62 94,06 54,46 100,00 NS ž 91,26 9,73 94,59 48,23 100,00 NS A
185 mg/kg m + ž 91,54 9,35 94,42 48,23 100,00 K
m 94,28 9,85 98,74 39,84 100,00 NS ž 92,45 8,17 95,57 56,29 100,00 NS B
375 mg/kg m + ž 93,29 9,01 96,65 39,84 100,00 K,
m 91,22 11,37 94,67 37,61 100,00 NS ž 90,64 11,25 94,47 21,57 100,00 NS K, C
555 mg/kg m + ž 90,84 11,28 94,59 21,57 100,00 K,
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u glavi kometa 14. dan pokusa
Doza
% D
NA
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k
ABC
K
K K
Slika 59. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
132
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u glavi kometa 14. dan pokusa
DOZA
% D
NA
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
A,B,C
K
K K
K
A,B,C
K
K,
Slika 60. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
Tablica 25. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganja pripadajućim dozama prometrina
% DNA u repu kometa Značajne razlike Doza
Spol
Srednja
vrijednost St.
devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 5,99 7,86 3,19 0,00 64,64 NS C ž 6,25 7,13 3,80 0,00 35,07 NS C K
0 mg/kg m + ž 6,14 7,44 3,50 0,00 64,64 A,C
m 7,93 8,62 5,94 0,00 45,54 NS ž 8,74 9,73 5,41 0,00 51,77 NS A
185 mg/kg m + ž 8,46 9,35 5,58 0,00 51,77 K
m 5,72 9,85 1,26 0,00 60,16 NS ž 7,55 8,17 4,43 0,00 43,71 NS B
375 mg/kg m + ž 6,71 9,01 3,36 0,00 60,16 C
m 8,78 11,37 5,33 0,00 62,39 NS K ž 9,36 11,25 5,53 0,00 78,43 NS K C
555 mg/kg m + ž 9,16 11,28 5,41 0,00 78,43 K,B
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
133
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u repu kometa 14. dan
Doza
% D
NA
-10
10
30
50
70
90
0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k
A,C
K
C
KB
Slika 61. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u repu kometa 14. dan pokusa
Doza
% D
NA
-10
10
30
50
70
90
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
C
C
K
K
Slika 62. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
134
Tablica 26. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u repnom momentu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina
repni moment kometa (OTM-Olive tail moment) Značajne razlike Doza
Spol
Srednja
vrijednost St.
devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 1,84 3,24 1,01 0,00 34,59 NS a ž 3,09 4,76 1,86 0,00 48,04 NS C K
0 mg/kg m + ž 2,56 4,22 1,34 0,00 48,04 A,B,C
m 3,46 4,23 2,42 0,00 22,62 NS k ž 5,12 7,16 2,58 0,00 49,25 NS A
185 mg/kg m + ž 4,54 6,34 2,51 0,00 49,25 K,C
m 3,56 5,64 1,15 0,00 36,84 NS k ž 3,55 4,08 2,29 0,00 24,98 NS B
375 mg/kg m + ž 3,55 4,85 2,03 0,00 36,84 K,C
m 9,45 18,44 3,98 0,00 173,83 NS b ž 6,82 13,52 3,10 0,00 155,30 NS K C
555 mg/kg m + ž 7,72 15,42 3,24 0,00 173,83 K,A,B
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
MaxMinMedian; 75%25%
Koeficijent repnog momenta OTM (Olive tail moment) 14. dana pokusa
Doza
OTM
-20
20
60
100
140
180
0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k
ABCKC KC
KAB
Slika 63. Repni moment (OTM) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
135
MaxMinMedian; 75%25%
Repni moment OTM (Olive tail moment) 14. dana pokusa
Doza
OTM
-20
20
60
100
140
180
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
C
a
k,C k,C
K b
Slika 64. Repni moment (OTM) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
Tablica 27. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike dužini repa (μm) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina
dužina repa kometa (μm) Značajne razlike Doza
Spol
Srednja
vrijednost St.
devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine
između skupina
m 17,95 24,75 9,00 0,00 230,00 NS C ž 30,88 37,74 19,00 0,00 239,00 NS C K
0 mg/kg m + ž 25,35 33,40 14,00 0,00 239,00 C
m 42,20 53,03 18,50 0,00 234,00 NS C ž 40,10 50,34 26,00 0,00 251,00 NS C A
185 mg/kg m + ž 41,46 51,23 22,00 0,00 251,00 C
m 23,77 29,37 16,00 0,00 144,00 NS C ž 35,69 29,16 30,00 0,00 205,00 NS C B
375 mg/kg m + ž 30,24 29,81 25,00 0,00 205,00 C
m 61,73 81,75 32,00 0,00 585,00 NS K,A,B ž 58,37 70,26 30,00 0,00 428,00 NS K,A,B C
555 mg/kg m + ž 59,52 74,34 31,00 0,00 585,00 K,A,B
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
136
MaxMinMedian; 75%25%
Duzina repa kometa 14. dan pokusa
Doza
duzi
na re
pa/m
ikro
met
ri
-50
50
150
250
350
450
550
650
0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k
C C C
KAB
Slika 65. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Duzina repa kometa 14. dan pokusa
Doza
duži
na re
pa k
omet
a/m
ikro
met
ri
-50
50
150
250
350
450
550
650
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
K,A,B
C
K,A,B
C C C C C
Slika 66. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
137
Tablica 28. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u intenzitetu fluorescencije repa kometa (lux) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina
intenzitet fluorescencije repa kometa (lux)
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 14208,78 22097,22 5327,42 0,00 136206,99 NS C ž 30607,65 39206,77 18161,84 0,00 226600,47 NS C
K 0 mg/kg
m + ž 23597,14 33947,13 9330,90 0,00 226600,47 A,B,C m 44334,99 48436,45 30382,03 0,00 208873,44 NS C ž 47817,99 58113,77 26931,20 0,00 343152,04 NS C
A 185 mg/kg
m + ž 46600,01 54873,25 27078,24 0,00 343152,04 K,C m 68986,72 109224,10 21109,40 0,00 687671,57 NS C ž 40990,72 44219,38 24770,40 0,00 194434,22 NS
B 375 mg/kg
m + ž 53807,07 81809,66 24205,69 0,00 687671,57 K,C m 161647,44
23637,48
74669,2
0 1449695,0 NS K,A
ž 60799,118
89916,25
34439,115
0
816044,73 NS K,A
C 555 mg/kg
m + ž 95601,68
163713,86
40461,92
0,00
1449695,0 K,A,B
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Opticki intenzitet repa 14. dan
Doza
inte
nzite
t flu
ores
cenc
ije (l
ux)
-2e5
0
2e5
4e5
6e5
8e5
1e6
1,2e6
1,4e6
1,6e6
0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k
ABC KC
KC
KC
Slika 67. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
138
MaxMinMedian; 75%25%
Opticki intenzitet repa 14 dan pokusa
Doza
inte
nzite
t flu
ores
cenc
ije (l
ux)
-2e5
0
2e5
4e5
6e5
8e5
1e6
1,2e6
1,4e6
1,6e6
0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
C
K,A
C
K,A
C C C
Slika 68. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
139
4.4.2. Rezultati komet-testa nakon 28. dana izloženosti prometrinu
U tablicama 29.-33. i grafikonima (slike 69.-78.) prikazani su rezultati analize komet-
tehnike leukocita periferne krvi miševa pokusnih skupina nakon 28. dana tretiranja
prometrinom. Statistički značajne razlike između skupina i podskupina prikazani su tablično
uz pripadajuću deskriptivnu statistiku.
Postotak DNA u glavi kometa prikazan je tablicom 29. i slikama 69. i 70. uočava se,
slično kao i u krvi analiziranoj 14. tog dana pokusa da sve tretirane skupine (objedinjene po
skupinama) pokazuju statistički značajnu razliku smanjenja postotka DNA glave u odnosu
na kontrolnu skupinu. Statistički značajna razlika koja se očituje smanjenjenjem % DNA
između mužjaka kontrolne skupine i mužjaka skupine koja je tretirana s 185 mg/kg
prometrina. Sve navedene razlike na razini su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u
svih skupina nisu uočene razlike.
Tablica 30. i slike 71. i 72. prikazuju postotak DNA u repu kometa. Između mužjaka i
ženki svih skupina kao i između doza raspoređenih po spolu uočene su statistički značajne
razlike koje se očituju povećanjem DNA u repu kometa ovisno o dozi (p ≤ 0.01). Između
spolova svih skupina ne postoje značajne razlike.
OTM odnosno repni moment tretiranih skupina prikazan je tablicom 31. i slikama 73. i
74. Postoje statistički značajne razlike (p ≤ 0.05) između mužjaka kontrolne skupine i
tretirane skupine 185 mg/kg, koji se očituje povećanjem koeficijenta OTM u otrovanih
životinja. Između spolova svih skupina ne postoje značajne razlike. Nadalje, značajne se
razlike koje se očituju povećanjem koeficijenta OTM u otrovanih životinja, uočavaju se
između skupina mužjaka kontrolne skupine i one koja je primila 185 mg/kg (p ≤ 0.01).
Prema dozi združene skupine mužjaka i ženki kontrolne skupine i ostalih skupina pokazuju
statistički značajne razlike povećanja koeficijenta na razini značajnosti p ≤ 0.01.
Dužina repa prikazana tablicom 32. i slikom 75. i 76. statistički se značajno razlikuje (p ≤
0.01) između kontrolne skupine i svih tretiranih skupina kod kojih se dužina repa povećava,
te između ženki kontrole i ženki skupine 185 mg/kg dok se kod mužjaka značajno razlikuju
kontrolna skupina i skupina koja je primala 185 mg/kg i najveću dozu 555 mg/kg, što se
također oćituje povećanjem dužine repa u otrovanih životinja. Između ostalih skupina nema
statistički značajnijih razlika.
140
U optičkom intenzitetu repa (tablica 33. i slike 77. i 78.) postoji statistički značajna
razlika (p ≤ 0.01) između svih tretiranih skupina i kontrole, bilo združenih ili odvojeno
promatranih s obzirom na spol, koja se očituje kao povećanje intenziteta fluorescencije u
otrovanih životinja.
141
Tablica 29. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina
% DNA u glavi kometa
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 94,38 6,72 96,69 72,17 100,00 NS A ž 93,51 8,02 97,12 52,34 100,00 NS
K 0 mg/kg
m + ž 93,84 7,57 96,92 52,34 100,00 A,B,c m 85,91 15,02 90,42 23,39 100,00 NS K,B,c ž 89,81 11,82 93,44 36,50 100,00 NS
A 185 mg/kg
m + ž 87,72 13,75 92,31 23,39 100,00 K,C m 92,02 8,45 95,11 59,88 100,00 NS A ž 89,59 14,11 93,52 1,67 100,00 NS
B 375 mg/kg
m + ž 90,74 11,84 94,25 1,67 100,00 K m 91,22 8,77 93,97 55,05 100,00 NS a ž 92,67 8,86 95,50 50,38 100,00 NS
C 555 mg/kg
m + ž 91,80 8,83 94,78 50,38 100,00 k,A
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u glavi kometa 28. dan pokusa
Doza
% D
NA
-10
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
ABc KC K kA
Slika 69. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
142
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u glavi kometa 28. dan pokusa
Doza
%D
NA
-10
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
A
K,B,c
Aa
Slika 70. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
Tablica 30. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina
% DNA u repu kometa
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 5,62 6,72 3,31 0,00 27,83 NS A,B,C ž 6,49 8,02 2,88 0,00 47,66 NS
K 0 mg/kg
m + ž 6,16 7,57 3,08 0,00 47,66 A,B,C m 14,09 15,02 9,58 0,00 76,61 NS K,B ž 10,19 11,82 6,56 0,00 63,50 NS
A 185 mg/kg
m + ž 12,28 13,75 7,69 0,00 76,61 K,b m 7,98 8,45 4,89 0,00 40,12 NS K,A ž 10,41 14,11 6,48 0,00 98,33 NS
B 375 mg/kg
m + ž 9,26 11,84 5,75 0,00 98,33 K,a,C m 8,78 8,77 6,04 0,00 44,95 NS K ž 7,33 8,86 4,50 0,00 49,62 NS
C 555 mg/kg
m + ž 8,20 8,83 5,23 0,00 49,62 K,A,b
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
143
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u repu kometa 28. dan pokusa
Doza
% D
NA
-10
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
ABC Kb KaC KAb
Slika 71. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
MaxMinMedian; 75%25%
Postotak DNA u repu kometa 28. dan
Doza
% D
NA
-10
10
30
50
70
90
110
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185vm 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
ABC
KB
KAK
Slika 72. % DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
144
Tablica 31. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u repnom momentu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina.
repni moment kometa (OTM-Olive tail moment)
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 3,35 5,04 1,79 0,00 33,15 NS A ž 3,05 6,36 1,49 0,00 79,81 NS b
K 0 mg/kg
m + ž 3,15 5,91 1,56 0,00 79,81 A,B,C m 10,49 17,21 4,71 0,00 131,64 NS K,B,C ž 7,10 13,05 3,16 0,00 88,69 NS
A 185 mg/kg
m + ž 8,92 15,50 3,90 0,00 131,64 K,b,c m 4,73 6,38 2,60 0,00 46,92 NS A ž 8,23 16,85 3,81 0,00 159,73 NS k
B 375 mg/kg
m + ž 6,58 13,12 3,05 0,00 159,73 K,A m 5,31 6,23 3,65 0,00 50,76 NS A ž 4,60 7,46 2,46 0,00 60,49 NS
C 555 mg/kg
m + ž 5,03 6,75 3,04 0,00 60,49 K,A
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Koeficijent repnog momenta OTM (Olive tail moment)28. dana pokusa
Doza
OTM
-20
20
60
100
140
180
0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
ABC KbC KA KA
Slika 73. Repni moment kometa (OTM) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
145
MaxMinMedian; 75%25%
Koeficijent repnog momenta OTM 28. dan pokusa
Doza
OTM
-20
20
60
100
140
180
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
b
A
KBCk
AA
Slika 74. Repni moment (OTM) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
Tablica 32. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike dužini repa (μm) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina
dužina repa kometa (μm)
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 41,81 61,97 18,50 0,00 303,00 NS A,C ž 23,41 29,85 15,50 0,00 192,00 NS A,B
K 0 mg/kg
m + ž 29,96 44,81 17,00 0,00 303,00 A,B,C m 53,89 59,29 35,50 0,00 270,00 NS K ž 48,72 67,70 27,00 0,00 361,00 NS K
A 185 mg/kg
m + ž 51,49 63,32 30,00 0,00 361,00 K m 45,20 52,23 20,00 0,00 244,00 NS ž 54,77 69,00 28,00 0,00 424,00 NS K
B 375 mg/kg
m + ž 50,26 61,79 24,00 0,00 424,00 K m 49,07 48,39 35,00 0,00 244,00 NS K ž 48,33 51,47 31,00 0,00 282,00 NS K
C 555 mg/kg
m + ž 48,77 49,58 33,50 0,00 282,00 K
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
146
MaxMinMedian; 75%25%
Duzina repa kometa 28 dan pokusa
Doza
Duz
ina
repa
/mik
rom
etri
-50
50
150
250
350
450
550
0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
ABC
KK K
Slika 75. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
MaxMinMedian; 75%25%
Dužina repa kometa 28. dan pokusa
Doza
duzi
na re
pa/m
ikro
met
ri
-50
50
150
250
350
450
550
0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m
AB
ACK K
K
K K
Slika 76. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
147
Tablica 33. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u intenzitetu fluorescencije repa kometa (lux) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina
intenzitet fluorescencije repa kometa (lux)
Značajne razlike Doza Spol
Srednja vrijednost
St. devijacija
Median Minimum Maksimum
unutar skupine
između skupina
m 32757,73 41575,58 18415,04 0,00 174137,37 NS A,B,C ž 32115,32 45422,71 14105,82 0,00 383823,91 NS A,B,C
K 0 mg/kg
m + ž 32252,83 43973,26 15796,36 0,00 383823,91 A,B,C m 98682,62 154739,45 49739,69 0,00 1522693,3 NS K ž 85230,36 120615,59 47218,18 0,00 865738,66 NS K
A 185 mg/kg
m + ž 92436,93 139961,74 49269,81 0,00 1522693,3 K m 75757,54 91552,95 41115,75 0,00 566409,20 NS K ž 81581,48 118417,98 47556,13 0,00 880082,10 NS K
B 375 mg/kg
m + ž 78838,51 106535,63 44380,61 0,00 880082,10 K m 75081,12 81941,80 47833,48 0,00 606556,38 NS K ž 72909,12 104889,01 43935,74 0,00 763580,68 NS K
C 555 mg/kg
m + ž 74209,99 91707,11 45556,42 0,00 763580,68 K
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
MaxMinMedian; 75%25%
Opticki intenzitet repa 28. dan pokusa
Doza
Opt
icki
inte
nzite
t rep
a (lu
x)
-2e5
2e5
6e5
1e6
1,4e6
1,8e6
0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
ABC
KK K
Slika 77. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
148
MaxMinMedian; 75%25%
Opticki intenzitet repa 28 dan pokusa
Doza
Inte
nzite
t flu
ores
cenc
ije (l
ux)
-2e5
2e5
6e5
1e6
1,4e6
1,8e6
0 mg/ kg z 0 mg/ kg m 185 mg/ kg z 185 mg/ kg m 375 mg/ kg z 375 mg/ kg m 555 mg/ kg z 555m
ABC ABC
K
K
K K K K
Slika 78. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
149
150
4.5. UČINAK PROMETRINA NA BROJ ERITROCITA I LEUKOCITA U PERIFERNOJ KRVI Tablica 34. prikazuje promjene i statistički značajne razlike u broju eritrocita u perifernoj
krvi između kontrolnih i pokusnih skupina miševa 14. i 28. dan pokusa.
Vrijednosti su izražene kao broj stanica x 1012 /L krvi. U mužjaka skupine K broj
eritrocita je 9,58 ± 1,37 x 1012 /L četrnaestog dana pokusa. Dvadesetosmog dana slijedi
porast broja eritrocita (10,11 ± 1,15 x 1012 /L). U ženki kontrolne skupine broj eritrocita
od četrnaestog dana (8,62 ± 1,02 x 1012 /L) blago raste do dvadesetosmog (10,20 ± 1,69
x 1012 /L) dana. Zbirno promatrajaći prosječne vrjednosti broja eritrocita muških i ženskih
jedinki u kontrolnoj skupini možemo govoriti o početnom blagom opadanju broja
eritrocita od početka do sredine pokusa te oporavku ka početnoj vrijednosti koja se
dosegne do kraja pokusa. U odnosu na kontrolnu skupinu, i skupina A i skupina B
(zbirno gledano mužjake i ženke) pokazuje blagi, ali statistički značajan pad broja
eritrocita. Promjene broja eritrocita u skupine A i B od 14.do 28. dana blaže su nego u
kontrolne skupine životinja. Skupina C pokazuje sličnu dinamiku promjena kao i
kontrolna skupina i 14. dana pokusa zamjećuje se vrlo velik i statistički značajan pad
broja eritrocita.
Ista tablica prikazuje broj leukocita 14. i 28. dana. Uočljiva je dinamika promjene
broja leukocita, izmjerena 14. i 28. dana, a izražena kao broj leukocita x 109 /L krvi. U
mužjaka skupine K utvrđeno je da dolazi do smanjenja broja stanica od četrnaestog (9,14
± 1,78 x 109 /l krvi.) do dvadesetosmog dana (7,32 ± 1,47 x 109 /l krvi). U ženki kontrolne
skupine također uočava se porast broja leukocita od četrnaestog (5,9 ± 3,26 x 109 /l krvi)
do dvadesetosmog dana (9,42 ± 4,56 x 109 /l krvi). Za razliku od mužjaka u kontrolnoj
skupini ženke su na kraju pokusa imale jači porast broja stanica leukocita u perifernoj
krvi. Sumarno u kontrolnoj skupini možemo govoriti o vrlo blagom porastu broja
stanica leukocita. Ove blage oscilacije leukocita i prije opisanih eritrocita u kontrole
mogu se pripisati pokusnom stresu. Četrnaestog dana pokusa sve doze uzrokuju
statistički značajno veliko povećanje broja leukocita u odnosu na kontrolnu skupinu.
Tretirane skupine pokazuju značajan porast broja leukocita u skupinama A i B. Takve
vrijednosti odskaču i od literaturnih podataka o varijacijama unutar mjerenog parametra i
vrlo vjerojatno predstavljaju rezultat direktnog imunostimulirajućeg učinka doze
151
ispitivane nokse na mjereni parametar. Skupina C pokazuje dinamiku sličnu kontrolnoj
skupini životinja, tj. porast broja leukocita s početka aplikacije otrova i obrušavanje
broja leukocita do završetka pokusa.
152
Tablica 34.: Broj eritrocita i leukocita periferne krvi pokusnih životinja nakon 14. i 28. dana izloženosti prometrinu
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
DOZA (Oznaka skupine)
0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)
Stanice dan broj/l
SPOL
n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.
raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.
raz.
m 7 9.58 1.37 C 7 8.39 1.32 C 5 8.08 0.67 C 4 5.93 2.52 K,A,B
ž 7 8.62 1.02 A,B,C 7 7.66 1.07 K 7 7.32 0.78 K 4 6.48 2.78 K eritrocitii 14.dan x 1012/l
m + ž 14 9.10 1.54 A,B 14 8.03 1.21 K,C 12 7.70 0.80 K,C 8 6.20 2.57 K,A,B
m 7 10.11 1.15 A,B 7 7.94 1.09 K 5 8.70 1.29 K 4
ž 7 10.20 1.69 A 7 8.40 0.64 K 7 8.11 0.66 K 4 eritrocitii 28.dan x 1012/l
m + ž 14 10.15 1.41 A,B 14 8.17 0.89 K 12 8.40 1.01 K 8
m 7 9.14 1.78 A,B 7 14.65 4.04 K 5 15.33 1.81 k,C 4 10.65 3.94 B
ž 7 5.90 3.26 b 7 8.37 1.23 b 7 14.73 3.16 k,a,c 4 8.14 3.16 b
leukociti 14.dan x 109/l
m + ž 14 7.43 3.14 A,B 14 12.07 4.42 K 12 15.03 2.49 K,c 8 9.30 3.30 b
m 7 7.33 1.47 a 7 7.18 2.26 k,B 5 4.51 1.70 A 4 ž 7 9.42 4.56 A 7 5.64 1.81 K, B 7 8.27 2.26 A 4
leukociti 28.dan x 109/l
m + ž 14 8.46 3.53 A 14 6.41 2.75 K 12 9.30 3.30 8
153
4.6. UČINAK PROMETRINA NA DIFERENCIJALNU KRVNU SLIKU (DKS) PERIFERNE KRVI Rezultati analize sastavnica diferencijalne krvne slike nalaze se tablično prikazani u
tablicama 35. i 36. Među granulocitima najzastupljeniji tip stanica, polimorfonuklearni
neutrofilni leukociti ne pokazuju veće oscilacije promjene brojnosti u netretiranih
životinja (skupina K). Međutim, u otrovanih životinja nakon četrnaestog dana pa do kraja
pokusa u spomenutih skupina brojnost neutrofila u perifernoj krvi naglo opada dosežući
vrijednosti daleko niže od netretirane skupine. Statistički značajne razlike (p<0,01) u
broju neutrofila utvrđene između kontrolne skupine i skupine B četrnaesti dan i A i B
dvadesetosmi dan. Također značajno veći broj neutrofila (p<0,01) utvrđen je u skupine B
u odnosu na skupinu A. i C. Iako inače prisutni u relativno malom udjelu među
granulocitima, broj polimorfonuklearnih bazofilnih leukocita u perifernoj krvi u svih
tretiranih skupina tijekom pokusa, pokazuje izrazito kontinuirano povećanje, moglo bi
se reći gotovo proporcionalno u odnosu na dozu primljene nokse. Utvrđeni rezultati u
muških i ženskih jedinki kao i u oba spola ukupno skupine A i B u odnosu na kontrolnu
skupinu pokazuju statistički značajno (p<0,01) opadanje u broja stanica bazofila 14.
dana i obratno povećanje u 28. dana. Polimorfonuklearni eozinofilni leukociti do 14. dana
pokusa jedino doza B pokazuje porast broja u odnosu na kontrolu, a 28. dana i skupina A
pokazuje veći broj eozinofila stvorenih u drugoj polovici pokusa. Monociti, stanice koje
su predodređene da prodru u tkiva i diferenciraju se u makrofage, u perifernoj krvi
pokusnih skupina, usporedimo li vrijednosti četrnaestog i dvadesetosmog dana,
tendenciju porasta pokazuju jedino u skupine B. Također utvrđene su statistički značajne
razlike (p ≤ 0.01) između kontrolne skupine i skupina A i B. Limfociti, najzastupljenije
stanice među leukocitima, tijekom pokusa najveće promjene su u skupina A (u mužjaka
jače) i skupine B. Također se javlja tendencija pada od četrnaestog do dvadesetosmog
dana.
154
Tablica 35: Broj stanica DKS-a periferne krvi pokusnih životinja nakon 14. dana izloženosti prometrinu
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
DOZA (Oznaka skupine)
14. dan
0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)
DKS x 109/l
SPOL
n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz. n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz.
m 7 0.400 0.307 A,C 7 0.020 0.054 K,B,C 5 0.102 0.179 A, 4 0.125 0.126 K,A
ž 7 0.083 0.095 7 0.094 0.130 7 0.000 0.000 4 0.106 0.084 bazofili
m + ž 14 0.242 0.284 A,B,C 14 0.057 0.109 K 12 0.051 0.132 K,C 8 0.116 0.101 K,A,B
m 7 0.079 0.110 B 7 0.048 0.083 B,c 5 0.376 0.266 K,A 4 0.109 0.142 b
ž 7 0.032 0.059 B 7 0.042 0.048 B 7 0.302 0.163 K,A,B 4 0.072 0.085 B eozinofili
m + ž 14 0.056 0.089 B,C 14 0.045 0.067 B 12 0.339 0.216 K,A 8 0.091 0.110 B
m 7 6.028 1.164 A,B,C 7 11.055 2.921 K 5 10.628 0.925 K 4 8.615 3.294 K
ž 7 4.435 2.901 B 7 6.316 0.534 B 7 10.874 2.209 K,A,C 4 6.215 1.799 B limfociti
m + ž 14 5.232 2.340 A,B 14 8.686 3.260 K 12 10.751 1.630 K,C 8 7.415 2.770 K,B
m 7 0.524 0.183 B,C 7 0.553 0.406 B,C 5 0.265 0.123 K,A 4 0.233 0.227 K,A ž 7 0.120 0.048 A,B,C 7 0.316 0.320 K 7 0.442 0.496 K 4 0.564 0.190 K monociti
m + ž 14 0.322 0.246 14 0.435 0.378 12 0.354 0.350 8 0.399 0.260
m 7 2.110 0.745 B 7 2.980 1.653 C 5 3.955 0.907 K,C 4 1.566 0.484 A,B
ž 7 1.228 0.565 B 7 1.606 0.399 B 7 3.108 1.326 K,A,C 4 1.185 0.408 B neutrofili
m + ž 14 1.669 0.814 B 14 2.293 1.410 b,C 12 3.532 1.170 K,a,B 8 1.376 0.469 A,B
155
Tablica 36: Broj stanica DKS-a periferne krvi pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika
DOZA (Oznaka skupine)
28. dan
0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)
DKS x 109/l
SPOL
n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz. n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz.
m 7 0.000 0.000 7 0.266 0.384 B 5 0.178 0.120 A 4
ž 7 0.132 0.223 B 7 0.141 0.148 B 7 0.352 0.329 K,A 4 bazofili
m + ž 14 0.066 0.172 14 0.204 0.280 12 0.265 0.250 K 8
m 7 0.210 0.076 A,B 7 0.030 0.040 K 5 0.042 0.045 K 4
ž 7 0.100 0.111 a 7 0.014 0.025 k 7 0.050 0.056 4 eozinofili
m + ž 14 0.155 0.108 A 14 0.022 0.033 K 12 0.046 0.048 K 8
m 7 5.350 1.310 b,a 7 4.870 1.420 b 5 3.440 1.290 k,a 4
ž 7 7.610 3.730 7 4.770 1.490 k 7 6.360 2.010 4 limfociti
m + ž 14 6.480 3.000 a 14 4.820 1.400 k 12 4.900 2.220 8
m 7 0.163 0.158 A 7 0.432 0.254 K 5 0.321 0.164 K 4
ž 7 0.265 0.143 B 7 0.268 0.175 B 7 0.588 0.257 K,A 4 monociti
m + ž 14 0.214 0.153 B 14 0.350 0.226 12 0.455 0.248 K 8
m 7 1.602 0.292 A,B 7 0.731 0.404 K 5 0.530 0.247 K 4
ž 7 1.312 0.709 A 7 0.445 0.230 K,B 7 0.914 0.271 A 4 neutrofili
m + ž 14 1.457 0.556 A,B 14 0.588 0.350 K 12 0.722 0.310 K 8
156
4.7. UČINAK PROMETRINA NA STANIČNOST KOŠTANE MOŽDINE Celularitet koštane moždine jednog femura prikazana je u tablici 38. Tako se primjerice,
u mužjaka uočava ekstremno smanjenje broja stanica u koštanoj moždini između
netretirane (skupina K) i tretireane skupine A. Nasuprot tome ženke skupina K i A ne
pokazuju značajne razlike, dok ženke skupine B pokazuju statistički značajan porast, a
ženke skupina C povećanje ukupnog broja stanica koštane moždine u odnosu na skupinu
A, a nešto manje ali još uvijek statistički značajno u odnosu na skupinu B. Također, s
obzirom na postojanje statistički značajne razlike (p<0,01) između tretiranih skupina,
uočava se da je skupina A imala najveće opadanje broja stanica, a skupina B najmanje.
4.8. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST TIMUSA Masa timusa tretiranih životinja, izražena u miligramima (mg) i predstavljena tablicom
37. signifikantno opada (p<0,01) jedino u mužjaka tretiranih skupina A (0,022 ± 0,0003
g) i B (0,020 ± 0,0003 g) u odnosu na netretiranu skupinu K (0,027 ± 0,0003 g).
Podskupina ženki ne pokazuje značajne razlike u promjeni težine timusa, što je također
slučaj ukoliko se sumarno promatra mužjake i ženke objedinjene u skupine s obzirom na
primljenu dozu. U tablici 38. prikazana je promjena staničnosti timusa gdje se statistički
značajnu promjenu (p<0,01) u odnosu na kontrolu, uočava tek u ženki skupine C i
između skupina A i C, ukoliko promatramo zajedno muške i ženske jedinke s obzirom na
primljenu dozu nokse.
4.8.1 Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost timocita ispitivan protočnom citometrijom U tablici 39 i slikama 79-83 i 92-95 prikazan je postotak timocita u apoptozi, nekrozi,
mješovitih apoptotično/nekrotičnih i vitalnih stanica timusa. Uočava se statistički
značajno povećanje nekrotičnih stanica, a paralelno s time statistički značajno opada
broj odnosno postotak živih timocita. Također rastuća vrijednost postotka apoptotičnih
stanica prati povećanje doze, jedino se u skupine B ne uočava statistički značajan porast
apoptotičnih stanica.
157
4.9. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU, BROJ STANICA I HISTOLOŠKE PROMJENE SLEZENE Masa slezene, izražena u gramima (g), značajno (p<0,01) se povećava samo u mužjaka
skupine A, dok se u ženki iste skupine značajno smanjuje u odnosu na netretiranu
skupinu, također ženke skupine C pokazuju isti trend smanjenja težine slezene (p<0,01)
u odnosu na skupine K i B, što je prikazano tablicom 37. Zajedničkom usporedbom
mužjaka i ženki sjedinjenih po skupinama s obzirom na primljenu dozu značajano
(p<0,01) smanjenje težine slezene u odnosu na sve ostale skupine uočava se jedino u
skupini C koja je primila najvišu dozu pesticida. Ukupan broj stanica cijele slezene
(tablica 38.), statistički se značajno (p<0,01) razlikuje između skupina K i B i B i C u
mužjaka, te između C skupine i svih ostalih skupina u ženki. Sumarno promatrajući sve
skupine moglo bi se se govoriti da u skupini C (3,28 ± 1.61 g) postoji statistički značajna
(p<0,01) tendencija smanjenja ukupnog celulariteta slezene u odnosu na sve ostale
tretirane skupine. Histopatološkom analizom hemalun-eozinskih preparata slezene (slika
79) uočavaju se jače promjene na jedinkama tretiranih skupina u odnosu na kontrolnu
skupinu. Ovojnica (kapsula) slezene ne pokazuje nikakve lezije niti u jedne od tretiranih
životinja, međutim proporcionalno porastu primljene doze kako u mužjaka tako i u
ženki, uočava se gubitak sferoidnog oblika limfatičkih nodula, gubi se njihov pravilan
raspored oko centralnih arterija i nestaje njihovo međusobno jasno razgraničenje. Sada
tako spojeni poprimaju nepravilne oblike zauzimajući veći dio organa. Gotovo je
nemoguće strukturalno jasno rasproznati marginalnu od germinativne zone nodula.
Uočava se povremeno pojavljivanje disperzno raspoređenih megakariocita i povećanje
volumena pojedinih stanica slezene. Ovako narušen strukturalni integritet organa mogao
bi se opisati kao vrlo jaka patološka promjena. Prikazane i opisane promjene na slezeni
potvrdio je histopatolog veterinarske medicine. Nalaz opisuje kao: “Hyperplasia
lymphofollicularis partim gravis et hyperaemia partialis atque megacaryocytosis
disissemnata et gigantocellulare disisseminatae”. Promjene ukazuju na jači podražaj
imunokompetitivnog tkiva slezene što rezultira jačom limfoidnocitarnom i nodularnom
hiperplazijom i povremenom pojavom megakariocitnih stanica (Sabočanac 2002). Ove
nalaze patologa potvrdio je i histolog Lacković-Venturin (2003).
158
Tablica 37: Težina organa pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
DOZA (Oznaka skupine)
0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C) Organ težina SPOL
n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.
raz.
m 7 0.500 0.026 B,c 7 0.481 0.024 b 5 0.458 0.013 K,a 4 0.460 0.018 k
ž 7 0.460 0.013 C 7 0.440 0.029 C 7 0.448 0.027 C 4 0.383 0.017 K,A,B mozak (g)
m + ž 14 0.474 0.017 b,C 14 0.461 0.269 c 12 0.453 0.227 c 8 0.421 0.018 K,a,b
m 7 27,740 3,04 A,B 7 21,900 4,75 K 5 20,320 3,45 K,c 4 26,100 3,66 b
ž 7 31,220 4,09 7 32,000 7,41 7 29,920 7,19 4 32,520 2,97 timus (mg)
m + ž 14 29,480 3,91 14 27,000 7,9 12 25,920 7,5 8 29,310 3,34
m 7 0.087 7,55-3 A 7 0.100 0.012 K 5 0.092 0.020 4 0.083 0.020
ž 7 0.085 0.011 A,C 7 0.070 8,16-3 K,B 7 0.080 9,51-3 B,C 4 0.067 9,57-3 K,B
slezena
(g) m + ž 14 0.086 9,6-3 k 14 0.085 0.010 12 0.089 0.010 8 0.075 0.017 k
m 7 0.187 0.012 C 7 0.191 0.027 C 5 0.188 0.031 c 4 0.148 9,570-3 K,A,b
ž 7 0.139 6,900-3 B,C 7 0.122 0.012 7 0.129 0.017 K 4 0.113 5,000-3 K bubreg (g)
m + ž 14 0.163 0.010 C 14 0.157 0.021 12 0.153 0.024 8 0.130 7,637-3 K
m 7 10.10 6.49 7 9.61 4.61 5 8.92 2.86 4 8.10 1.91
ž 7 10.40 3.33 a 7 6.91 9.63 k,C 7 7.86 2.34 C 4 14.20 3.84 A,B limfni čvor(mg)
m + ž 14 10.25 4.96 14 8.26 3.49 12 8.30 2.50 8 11.16 4.29
m 7 1.320 0.077 C 7 1.360 0.163 c 5 1.422 0.123 c 4 1.158 0.134 K,a,b
ž 7 1.105 0.191 7 1.090 0.131 c 7 1.148 0.139 4 1.080 0.066 a jetra (g)
m + ž 14 1.210 0.145 14 1.230 0.148 12 1.263 0.133 8 1.120 0.106
159
Tablica 38.: Staničnost organa pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu
Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i* za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.
DOZA (Oznaka skupine)
0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)
Organ
staničnostSPOL
n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.
raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.
raz.
m 7 0.91 0.302 A 7 0.53 0.076 K,B,C 5 0.95 0.415 A,C 4 0.85 0.480 A,B
ž 7 0.57 0.110 B 7 0.49 0.124 B,C 7 0.89 0.304 K,A,C 4 0.62 0.570 B koštana srž
br.st x107
m + ž 14 0.74 0.319 a 14 0.51 0.103 B 12 0.91 0.353 A, 8 0.73 0.350 A,B
m 7 3.87 2.71 a 7 1.82 0.64 k 5 4.24 2.32 4 2.65 1.14
ž 7 2.17 1.26 c 6 4.24 2.32 7 3.78 2.54 4 5.44 0.91 k
timus br.st x107
m + ž 14 2.96 2.15 14 2.47 2.43 12 3.98 2.46 8 4.04 1.03
m 7 5.77 2.84 B 7 5.37 3.77 5 5.78 1.41 K 4 5.09 1.16
ž 7 6.59 1.12 C 7 7.07 2.98 C 7 6.30 1.80 C 4 2.55 0.66 K,A,B
slezena br.st x107
m + ž 14 6.22 2.09 C 14 6.16 3.41 c 12 6.08 1.66 C 8 3.28 1.61 K,a,B
m 7 2.440 1.085 7 2.400 1.640 B,C 5 1.520 0.274 A 4 1.575 0.316 A
ž 7 2.880 1.300 C 7 3.360 1.200 7 2.770 1.140 4 4.950 3.760 K brahijalni
limfni čvorbr.st X106
m + ž 14 2.676 1.179 14 2.840 1.487 12 3.262 3.060 8 3.460 3.370
160
Slika 79: Slezena tretiranih skupina životinja, Hemalaun-eozinsko bojenje, Hiperproliferacija limfoidocitarnih stanica: A1 slezena životinje skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 35 X; B1 slezena životinje skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 35 X; C1 slezena životinje skupine C (555 mg/kg prometrina), povečanje 35 X; A2, B2, C2 isto kao i A1, B1, C1, samo tamnim strelicama i linijama istaknute patološke promjene
161
4.9.1. Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost splenocita istraživan protočnom citometrijom Tablica 40. i slike 84-87 i 96-99. prikazuju odnose apoptoze, nekroze, živih i mješovitih
apoptotično/nekrotičnih splenocita u slezeni. Nisu zabilježene nikakve statistički značajne
razlike između tretiranih skupina i kontrolnih životinja.
4.10. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST LIMFNOG ČVORA (BRAHIJALNOG)
Tablica 38. prikazuje promjenu staničnosti brahijalnog limfnog čvora, a tablica 37.
težinu. Analizom rezultata promjene težine uočava se smanjenje mase aksilarnog
limfnog čvora u mužjaka skupina A i C u odnosu na netretiranu skupinu. U ženskih
jedinki masa brahijalnog limfnog čvora tretiranih skupina A i B značajno je manja, a
masa limfnog čvora skupine C značajno je viša u odnosu na kontrolnu skupinu. Broj
stanica brahijalnog limfnog čvora u mužjaka opada u skupinama B i C, dok u ženskih
jedinki skupine C osjetno raste u odnosu na sve tretirane skupine. Sumarnom analizom
obaju spolova po skupinama uočava se, porast broja stanica u limfnom čvoru u skupini
C. Sumarno, moglo bi se govoriti o značajnom smanjenju mase aksilarnog limfnog
čvora tretiranih skupina u odnosu na netretirane skupine i značajnim razlikama između
skupina A i B u odnosu na skupinu C s obzirom na masu brahijalnog limfnog čvora.
4.10.1. Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost stanica limfnog čvora istraživan protočnom citometrijom Tablica 41. i slike 88-91 i 100-103 prikazuju odnose apoptoze, nekroze, živih i mješovitih
apoptotično/nekrotičnih splenocita u limfnom čvoru. Uočava se statistički značajan
porast postotka nekrotičnih ali ne i apoptotičnih stanica u limfnom čvoru u odnosu na
porast doze. Također se jedino u ovog ispitivanog organa zamjetno i statistički značajno
mijenja omjer stanica mješovitog karaktera, onih koje pokazuju karakteristike apoptoze i
nekroze u skupine A. On statistički opada u odnosu na kontrolu.
162
Tablica 39.:Timociti pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina životinja
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 83,706 79,316 85,544 70,364
St. devijacija 5,126 7,151 6,903 9,329 Median 82,965 81,945 83,125 74,260
Minimum 78,770 62,660 76,770 54,270 Maksimum 95,900 86,190 96,540 77,360
p ≤ 0.05 c c c k,a,b
% vitalnih timocita
Značajne razlike
p ≤ 0.01 C C C K,A,B
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 5,156 6,841 5,954 10,772
St. devijacija 2,382 3,373 3,642 1,875 Median 5,500 6,500 7,205 10,280
Minimum 0,000 3,670 0,070 9,100 Maksimum 8,580 17,570 10,580 13,920
p ≤ 0.05 c c c k,a,b
% nekrotičnih timocita
Značajne razlike
p ≤ 0.01 C C C K,A,B
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 8,371 11,889 6,731 16,188
St. devijacija 3,576 5,467 4,187 5,941 Median 8,630 11,370 8,305 13,640
Minimum 0,510 5,330 0,000 10,930 Maksimum 11,820 22,350 11,650 25,570
p ≤ 0.05 c b a,c k,b
% apoptotičnih timocita
Značajne razlike
p ≤ 0.01 C B A,C K,B
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 2,771 1,957 1,770 2,678
St. devijacija 0,955 1,007 0,925 2,143 Median 3,085 1,835 1,550 2,500
Minimum 1,160 0,670 0,790 0,770 Maksimum 3,850 4,560 3,390 6,240
p ≤ 0.05 NS NS NS NS
% timocita mješovitih
apoptotićnih i nekrotićnih
svojstava koji vežu anneksinV-
FITC i propidij jodid Značajne
razlike p ≤ 0.01 NS NS NS NS
163
Tablica 40.: Splenociti pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina životinja
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 77,136 78,195 79,128 76,666
St. devijacija 7,919 3,357 1,791 5,471 Median 78,580 79,210 78,880 74,200
Minimum 60,000 69,670 77,530 71,950 Maksimum 86,730 82,110 81,890 85,060
unutar skupine NS NS NS NS
% vitalnih splenocita
Značajne razlike između
skupina NS NS NS NS
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 10,002 9,047 9,674 10,718
St. devijacija 6,781 2,776 1,221 3,608 Median 8,480 8,655 9,650 11,490
Minimum 2,460 4,630 7,830 6,100 Maksimum 24,810 15,920 11,170 15,490
p ≤ 0.05 NS NS NS NS
% nekrotičnih splenocita
Značajne razlike
p ≤ 0.01 NS NS NS NS
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 6,666 6,686 5,016 8,832
St. devijacija 2,853 2,115 1,896 2,059 Median 6,355 6,645 4,850 9,780
Minimum 1,780 3,330 2,210 6,010 Maksimum 13,460 10,610 7,430 10,910
p ≤ 0.05 NS NS NS NS
% apoptotičnih splenocita
Značajne razlike
p ≤ 0.01 NS NS NS NS
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 6,198 6,076 5,738 3,782
St. devijacija 2,211 2,272 0,546 0,961 Median 6,930 5,755 5,860 4,080
Minimum 3,510 3,060 5,100 2,780 Maksimum 9,070 10,390 6,450 5,010
p ≤ 0.05 NS NS NS NS
% splenocita mješovitih
apoptotićnih i nekrotićnih
svojstava koji vežu anneksinV-
FITC i propidij jodid Značajne
razlike p ≤ 0.01 NS NS NS NS
164
Tablica 41.: Stanice limfnog čvora pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 82,006 83,200 77,700 64,598
St. devijacija 7,370 3,337 5,924 13,457 Median 80,700 82,840 79,810 69,610
Minimum 64,980 77,460 71,010 44,200 Maksimum 94,690 88,420 82,280 75,720
p ≤ 0.05 c c c k,a,b
% vitalnih stanica limfnog čvora
Značajne razlike
p ≤ 0.01 C C C K,A,B
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 7,310 5,373 13,647 12,274
St. devijacija 4,601 1,225 5,849 9,098 Median 7,800 5,930 11,480 11,450
Minimum 1,090 2,270 9,190 0,450 Maksimum 19,490 6,410 20,270 25,360
p ≤ 0.05 b b,c k,a b
% nekrotičnih stanica limfnog
čvora
Značajne razlike
p ≤ 0.01 B B,C K,A B
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 8,823 10,729 7,357 10,928
St. devijacija 3,748 3,265 0,584 6,041 Median 9,335 10,420 7,240 12,650
Minimum 1,420 5,980 6,840 0,340 Maksimum 14,730 15,610 7,990 14,830
p ≤ 0.05 NS NS NS NS
% apoptotičnih stanica limfnog
čvora
Značajne razlike
p ≤ 0.01 NS NS NS NS
doza 0 mg/kg (K)
185 mg/kg
(A)
375 mg/kg
(B)
555 mg/kg
(C) Srednja vrijednost 1,881 0,698 1,297 1,596
St. devijacija 1,090 0,321 0,510 0,816 Median 1,770 0,600 1,480 1,880
Minimum 0,310 0,320 0,720 0,510 Maksimum 3,980 1,510 1,690 2,570
p ≤ 0.05 a k,c NS a
% stanica limfnog čvora mješovitih
apoptotićnih i nekrotićnih
svojstava koji vežu anneksinV-
FITC i propidij jodid Značajne
razlike p ≤ 0.01 A K,C NS A
165
Slika 80: Timociti mužjaka i ženki kontrolne skupine (0 mg/kg prometrina) pokusnih životinja obilježenih annexinomV-FITC i propidij-jodidom analiziranih protočnim
citometrom
mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
166
Slika 81: Timociti mužjaka i ženki skupine pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg
prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
167
Slika 82: Timociti skupine pokusnih životinja skupine 375 mg/kg obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
Slika 83: Timociti skupine pokusnih životinja skupine 555 mg/kg obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
168
Slika 84: Splenociti kontrolne skupina 0 mg/kg pokusnih životinja obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
169
Slika 85: Splenociti mužjaka i ženki skupine tretirane s 185 mg/kg pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom
analiziranih protočnim citometrom
mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
170
Slika 86: Splenociti skupine pokusnih životinja tretiranih s 375 mg/kg s obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
Slika 87: Splenociti skupine pokusnih životinja tretiranih s 555 mg/kg prometrina obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom.
ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke skupine tretirane s 555 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
171
mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
Slika 88: Stanice limfnih čvorova skupina pokusnih životinja tretiranih s 0 mg/kg prometrina obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
172
Slika 89: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupine pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih
protočnim citometrometrijom
mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
173
Slika 90: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupina pokusnih životinja tretiranih s 375 mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom
91: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupina pokusnih životinja tretiranih s 555 mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom.
ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3
ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4
174
Mean; MaxMin
Timociti nekroticnih i apoptoticnih osobina
Doza
% ti
moc
ita P
I/ann
VFI
TC
0
1
2
3
4
5
6
7
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS
NS
NSNS
Slika 92: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Timociti u nekrozi
Doza
% ti
moc
ita u
nek
rozi
0
5
10
15
20
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
C C C
K,A,B
Slika 93: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Vitalni timociti
Doza
% v
italn
ih ti
moc
ita
0
20
40
60
80
100
120
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
C
C
C
K,A,B
Slika 94: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Timociti u apoptozi
Doza%
tim
ocita
u a
popt
ozi
0
5
10
15
20
25
30
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
CB
A,C
K,B
Slika 95: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
175
Mean; MaxMin
Splenocita apoptoticnih i nekroticnih osobina
Doza
% s
plen
ocita
boj
anih
PI i
ann
eksi
nom
VFI
TC
0
2
4
6
8
10
12
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS
NS
NSNS
Slika 96: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Splenociti u nekrozi
Doza
% s
plen
ocita
u n
ekro
zi
0
5
10
15
20
25
30
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS
NS
NS
NS
Slika 97: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Vitalni splenociti
Doza
% v
italn
ih s
plen
ocita
0
20
40
60
80
100
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS NS NS NS
Slika 98: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Splenociti u apoptozi
Doza
% s
plen
ocita
u a
popt
ozi
0
2
4
6
8
10
12
14
16
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS
NS
NS
NS
Slika 99: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
176
Mean; MaxMin
Stanice limfnog cvora mjesovitih karakteristika
Doza
% s
tani
ca li
m.c
vora
boj
anih
PJ
i ann
eksi
nom
VFI
TC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
AK,C
NS
A
Slika 100: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Stanice limfnog cvora u nekrozi
Doza
% s
tani
ca li
mf.c
vora
u n
ekro
zi
0
5
10
15
20
25
30
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
B
B,C
K,A
B
Slika 101: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean+SDMean-SDMean
Stanice limfnog cvora u apoptozi
Doza
% s
tani
ca li
mf.
cvor
a u
apop
tozi
0
5
10
15
20
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
NS
Slika 102: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije
Mean; MaxMin
Vitalne stanice u limfnom cvoru
Doza%
vita
lnih
sta
nica
u li
mfn
om c
voru
0
20
40
60
80
100
120
kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k
CC
CK,A,B
Slika 103: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrij
177
4.11. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKE PROMJENE JETRE
Rezultati analize masa jetre pokusnih životinja, izraženi u gramima prikazani su tablica
37. Iz prikaza je vidljivo da kod muških životinja skupina B pokazuje blagi porast mase
jetre u odnosu na sve ostale skupine, dok skupina C pokazuje tendenciju smanjenja
(p<0,01) vrijednosti mase organa u odnosu na ostale skupine.
Takva se tendencija primjećuje i pri zajedničkoj analizi muških i ženskih jedinki
objedinjenih po skupinama s obzirom na dozu prometrina tj. jedino skupina B odskače od
ostalih po porastu mase jetre dok C skupina bilježi značajno smanjenje mase organa u
odnosu na ostale pokusne skupine. Histopatološkom analizom hemalun-eozinskih, PAS,
PAS+AB, PAS+D, sudan black B, sudan III, glutation, SDH, LDH, alkalna i kisela
fosfataza i nespecifična esteraza preparata jetre (slike 104-110 ) tretiranih životinja mogu
se uočiti slijedeće promjene koje bi mogle ukazivati na djelovanje nokse:
U netretiranoj skupini, kako u muških tako i u ženskih jedinki, makropatološkom
analizom jetra se čini nepromjenjena, uobičajene konzistencije i čvrstoće te boje koja
odgovara statusu potpuno zdravih životinja. Isto se može reći i za diferencijalno bojene
mikroskopske preparate. Međutim, jetra životinja pod djelovanjem ispitivane tvari,
makroskopski pogotovu u skupini C, naizgled je moglo bi se reći manja, vodenastija i
rahla tj. relativno se brzo raspada primimo li ju pincetom.
Mikroskopskom analizom hemalun-eozinskih rezova u skupina K i A ne vidi se bitno
narušena lobularna arhitektura, možemo reći da je jetra u patološkom smislu bez
osobitosti. U skupini B i C (slike 104, 105) uočava se da su ponegdje, stanice povećane, s
povremenim manjim ili većim mjestima u citoplazmi stanice koja djeluju vakuolizirano
(promjenu bismo mogli označiti kao hidropičnu vakuolizaciju jer prema Sudan bojenjima
(slika 107) velike vakuole se ne boje dok međutim disperzno u citoplazmi hepatocita
vidimo jaku prožetost mikrovezikularnim masnim infiltracijama (stanje koje se može
označiti kao mikrovezikularna steatoza), s rijetkim raspršenim pojavljivanjem
megakariocita i glomaznih stanica. Također se nazire djelomična nekroza organa,
najjasnije izražena u skupini B (Hemalun-eozinski preparati, slika 104, 105). Bojenje
preparata histokemijskom metodom za dokazivanje glutationa (slika 108) u tkivima vrlo
jasno je pokazalo da intenzitet plavog obojenja raste proporcionalno s primljenom dozom
178
(K < A < B < C/najjače/). Nazire se bitne dijelove lobularne hepatičke arhitekture i moglo
bi se reći da je pozitivnija reakcija dobivena oko krvnih žila (kojima noksa i njeni
metaboliti pristižu i napuštaju jetru) i žućnih izvodnih kanalića. Ne može se reći da je
plava reakcija dobivena u nekom granuloznom obliku u stanicama i/ili tkivu (poput
primjerice Sudana B ili III), već da je plavkasto obojenje gotovo jednoliko proželo cijelo
tkivo. Zanimljivo je usporediti PAS i PAS+alfa amilaza bojenje (slike 106), na kojima se
posebno ističe intenzitet učinka proporcionalan primljenoj dozi. Tako je u kontrolne
skupine reakcija blagog intenziteta, u skupine A pojedini hepatociti pokazuju jaču
osjetljivost na noksu pa cijeli organ ima “leopardast” uzorak, u skupini B zahvaćen je
cijeli organ, a u skupini C intenzitet reakcije je najjači. Slika 110 prikazuje pripadajuća
histokemijska bojenja koja nisu dala zadovoljavajuće rezultate zbog pokidanog tkiva
uslijed krio-obrade (primjerice Sudan III i dr.), iako se i dalje mogu naslutiti određene
indikativne promjene.
179
Slika 104: Hemalaun-eozinsko bojenje jetre pokusnih životinja: A jetra mužjaka kontrolne skupine K, povećanje 200 X; B jetra mužjaka kontrolne skupine K, povećanje 400 X; C jetra mužjaka skupine tretirane sa 185 mg/kg prometrina, (skupina A, povećanje) 100 X; D jetra mužjaka skupine tretirane sa 185 mg/kg prometrina (skupina A), povećanje 400 X
180
Slika 105: Hemalaun-eozinsko bojenje tkiva jetre pokusnih skupina životinja: A mužjak tretiran sa 185 mg/kg prometrina (skupina A), povećanje 200 X; B mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 200 X; C mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B),povećanje 200 X; D mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 400 X; E mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 400 X; F mužjak skupine C, 555 mg/kg prometrina (največa aplicirana doza), povećanje 200 X
181
Slika 106: PAS-histokemijsko diferencijalno bojenje tkiva jetre pokusnih skupina životinja: A mužjak kontrolne skupine, povećanje 50 X; B mužjak kontrolne skupine, povećanje 100 X; C mužjak tretiran sa 185 mg/kg prometrina (skupine A), povećanje 100 X; D mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 50 X; E mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 100 X; F mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 400 X
182
Slika 107: Sudan Black histokemijsko diferencijalno bojenje jetrenog tkiva pokusnih skupina životinja: A ženka kontrolne skupine, povećanje 200 X; B ženka skupine B (tretiran sa 375 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; C ženka skupine C (največa aplicirana doza), povećanje 100 X; D ženka skupine C (največa aplicirana doza, tretiran sa 555 mg/kg prometrina), ista životinja kao i na slici C, povećanje 400 X
183
Slika 108: Histopatološko dokazivanje glutationa u jetri pokusnih životinja: A jetra ženke netretirane, kontrolne skupine skupine, povećanje 200 X, blaga do gotovo nikakva reakcija;
B jetra ženke skupine B (doza 1/10 LD 50), povećanje 200 X, pojačana indukcija glutationa kao molekule detoksifikacije;
C jetra ženke skupine C (največa aplicirana doza), povećanje 200 X, tigrasti uzorak otkriva pojačanu akumulaciju glutationa u tkivu; D jetra ženke skupine C (ista kao i slika C), povećanje 400 X, pod većim povećanjem otkriva se i granulozna struktura obojene tvari
184
Slika 109: Enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje jetre pokusnih skupina životinja: A Nespecifična esteraza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B Nespecifična esteraza, mužjak skupineB tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 200 X; C SukcinatDH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X;; D SukcinatDH, mužjak skupine B tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 200 X;
185
Slika 110: Različite enzimatsko histokemijske reakcije jetre pokusnih skupina životinja: A Alkalna fosfataza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B Alkalna fosfataza, mužjak skupine B, povećanje 200 X; C Sudan III, mužjak kontrolne skupine, povećanje 400 X; D Sudan III, mužjak skupine B tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; E NADPH2, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; F Kisela fosfataza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; G Kisela fosfataza, mužjak skupine B, povećanje 200 X; H LDH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; I LDH, mužjak skupine B, povećanje 200 X; J beta-NADPH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; K beta-NADPH, mužjak skupine B, povećanje 200 X
186
4.12. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKU SLIKU BUBREGA
Značajna promjena u masi bubrega (tablica 37.) zabilježena je u mužjaka u skupini C,
gdje je vrijednost mase organa izražena u g, osjetno smanjena u odnosu na ostale
pokusne skupine. U ženskih jedinki, međutim, osim smanjenjenja mase bubrega u
skupini C, bilježimo značajano smanjenje težine bubrega i u skupini A. Analizirajući
zajedno mužjake i ženke po tretiranim skupinama može se govoriti o smanjenju težine
bubrega u skupini C u odnosu na ostale skupine. Histopatološkom analizom Hemalun-
eozinskih, preparata bubrega uočava se zamjetan gubitak broja glomerula tj.
glomerularnu atrofiju u svih tretiranih skupina a pogotovu u životinja skupine B.
Primjećuje se hiperemija tj. punokrvnost, zapunjenost krvnih žila krvlju
187
4.13. UČINAK PROMETRINA NA PROBAVNI SUSTAV
Tijekom trajanja pokusa nisu primjećeni proljevi ili krvarenja ni u jedne od tretiranih
skupina. Tijekom razudbe životinja pri kraju pokusa uočeno je izrazito, gotovo
dvostruko, vrečasto povećanje želuca u skupina B i C u odnosu na skupine K i A. Radi
otkrivanja učinka ispitivanog pesticida na probavni sustav, kao mjesta ciljnog ulaska
nokse u organizam pristupilo se analizi rezultata dobivenih diferencijalnim
dijagnostičkim bejenjem dijelova tankog crijeva. Histopatološkom analizom serijskih
rezova tankog crijeva (slika 111), obojenog hemalun-eozinskim bojenjem možemo
govoriti o vrlo jakoj reakciji i pobudi tkiva zaduženog za imunosni odgovor. GALT (Gut
Associated Limphatic Tissue) tj. limfoidocitarne nodularne strukture doživljavaju
histološko-morfološke tj. u ovom slučaju nakon djelovanja nokse patološke promjene, pri
kojima je došlo do snažne mobilizacije, akumulacije, proliferacije i agregacije limfatičnih
stanica. Promjene navedene vrste poglavito su naglašene u životinja skupine B (od kojih
pak ženke imaju najjači intenzitet). Iako je rezultat lako vidljiv, prepoznatljiv i vizualno
gotovo ekstreman usporedi li se odnos velićine promjera samog crijeva i patološke
promjene, koja se očituje u povećanom rastu limftičkih čvorića u crijevu, ipak se uočava
da još nije narušena sama anatomska struktura ovih dijelova crijeva tj. još uvijek postoji
neoštećena ovojnica (kapsula) koja imunokompetentno tkivo, iako snažno podstaknuto na
reaktivni proces drži lokaliziranim. Noksa također uzrokuje ljuštenje i odumiranje
crijevnog epitela koje se može okarakterizirati kao rijetko, pojedinačno u skupini A, i
nešto jače frekvencije pojavljivanja u skupina B i C. Moglo bi se govoriti o naznakama
apoptotičnog odumiranja, sa pojedinim rijetkim nalazima takvog stanja zajedno s
promjenama koje bi se moglo opisati kao piknoza u skupini A, nešto jačeg intenziteta u
skupini B i relativno snažnijeg intenziteta ovog tipa promjena u skupini C sa
lokaliziranim slabim i povremenim naznakama promjena koje bi mogle odgovarati
nekrotizaciji. Ponegdje se, proporcionalno jačini nokse (jače u skupina B i C), pojavljuje i
niz degenerativnih promjena crijevnih resica. Nalaz je potvrdio i histopatolog
veterinarske medicine, opisujući ga kao “Hyperplasio nodularis lymphoidocytaria
mucosae intestini et desquamatio partiallis”, te nalaz potkrepljuje mišljenjem:
“…promjene, posebice u crijevima ukazuju na jači podražaj imunokompetentnog tkiva
188
što rezultira jačom limfoidnocitarnom i nodularnom hiperplazijom.” (Sabočanac, 2002),
ove nalaze također je potvrdio histolog Lacković-Venturin (2003). Duodenum ne
pokazuje anatomsko morfološke promjene u patološkom smjeru, a lučenje duodenalnih
žlijezda (Brunnerovih žlijezda) neometano je, što pokazuje PAS bojenje. Diferencijalno
bejenje PAS, PAS+AB, PAS+D na tankom crijevu pokazalo je značajnije lučenje
glikokonjugiranih produkata sluznice u tretiranih skupina. Poglavito bismo mogli
ocijeniti takvo lučenje najjačim u skupina B i C. Primjerice u skupini C, u
Lieberkühnovim kriptama vidimo većinu pozitivnih reakcija bojenja (veči broj granula) u
znatno većoj mjeri nego ostalih skupina .
189
Slika 111: Hemalaun-eozinski preparati crijeva pokusnih skupina životinja, prikaz jake aktivacije imunokompetentnih struktura; A mužjak skupine B, povećanje 50 X; B ženka skupine C (največa aplicirana doza 555 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; C mužjak skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50, 375 mg/kg prometrina, povećanje 150 X; D mužjak skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; E mužjak skupine C (555 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; F ženka skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 200 X
190
4.14. UČINAK PROMETRINA NA MOZAK
Tablica 37. prikazuje promjene mase mozga u pokusnih skupina. Zamjećuje se razlika u
masi mozga mužjaka skupina B i C u odnosu na skupinu K, masa je smanjena. U ženki
samo skupina C u odnosu na netretirane skupine životinja pokazuje statistički značajno
smanjene mase. Promotrimo li zajedno muške i ženske jedinke ujedinjene s obzirom na
dozu primljene nokse, smanjenje mase mozga može se uočiti u skupine B i C, dok je
skupina A nepromjenjena s obzirom na netretiranu skupinu. Makropatološkom analizom
tijekom razudbe životinja nisu utvrđene nikakve vidljive promjene u vanjskoj strukturi
mozga, krvnih žila, moždanih ovojnica i dr. niti u jedne od tretiranih skupina.
Histopatološki nalaz hemalun-eozinom bojanih preparata (slike 112-114), skupina A i B,
ne ukazuje na vidljive patološke promjene koje bi mogle ukazivati na bilo kakve lezije,
krvarenja, nekroze, nakupljanja tekućine i dr. Također na staničnoj razini u skupina A i
B, koliko metoda to dopušta nisu nađene promjene u relativnom omjeru stanica (glija-
neuroni), ili promjene na samim stanicama (vakuolizacija, promjene na jezgri, promjene
u velićini stanica i sl.). Međutim, slika koja prikazuje mozak jedne od životinja skupine C
ukazuje na poremećenu morfološko histološku arhitekturu mozga (strelica na slici).
Takva teža patohistološka promjena možda bi mogla bi biti izravno uzrokovana
ispitivanom tvari i najvjerojatnije uzrok ugibanja životinja prije isteka pokusnog
razdoblja od dvadesetosam dana.
191
Slika 112: Hemalaun-eoznsko bojenje mozga mužjaka kontrolne skupine:tretiranih samo fiziološkom otopinom tijekom pokusnog razdoblja od 28 dana: A povećanje 50x; B povećanje 100 X
192
Slika 113: Hemalaun-eozinsko bojenje mozga mužjaka tretiranih skupina: A mužjak skupine A (najmanja aplicirana doza ispitivane tvari), povećanje100 X; B mužjak skupine tretirane najmanjom dozom (ista životinja kao i na slici A ali druga cerebralna regija), povećanje100 X;
C mužjak skupine B (doza 1/10 LD 50), povećanje50 X; D ista životinja kao i na slici C, povećanje100 X, strelice indiciraju moguće patološke promjene iako se sa sigurnošću ne mogu pripisati djelovanju nokse; E mozak mužjaka skupine C (najveća aplicirana doza), povećanje50 X; F ista životinja kao i na slici E ali druga cerebralna regija, povećanje50 X
193
Slika 114: Mozak, hemalaon-eozinsko bojanje: A mozak ženske jedinke netretirane skupine, povećanje 50 X; B mozak ženske jedinke skupine A (najmanja aplicirana doza), povećanje 50
X;
C mozak ženske jedinke skupine B (srednja doza, 1/10 LD 50), povećanje 50 X, strelice indiciraju na postojanje narušene strukture tkiva i promjenu normalnog rasporeda stanica iako se ovaj tip promjene ne može sa sigurnošću pripisati učinku nokse; D mozak ženske jedinke skupine C (najveća aplicirana doza)
194
4.15. UČINAK PROMETRINA NA POPREČNOPRUGASTO MIŠIĆNO TKIVO
Makropataloškom analizom prilikom razudbe životinja, mišić noge u svih skupina
tretiranih životinja čini se normalne velićine, građe, boje, konzistencije i čvrstoće.
Mikroskopskpom analizom hemalun-eozinskih preparata poprečnoprugastog mišićnog
tkiva noge, mogli bismo reći da se u tretiranih skupina vidi jaka inflamatorna infiltracija
najvjerojatnije pobuđenih imunoreaktivnih/imunokompetentnih stanica, što upućuje na
inflamatorni polimiozitis. Ovo zaključujemo na osnovu mnogobrojnih jezgara stanica u
periplazmatskom prostoru mišića što bi moglo ukazivati na dijapedezu monocitno-tkivno-
makrofagnog tipa stanica koji kapilarama dolazi do i ameboidnim gibanjem prodire
dublje u tkivo (slika 115-118). Čini se da je relativna brojnost tih stanica proporcionalna
primljenoj dozi, iako se ne može sa sigurnošću tvrditi bez detaljnije analize (sugeriramo
da bi možda program Image analiser mogli točnije potvrditi ovu pretpostavku). Također
hemalun-eozinski preparati svih tretiranih skupina, u odnosu na kontrolu pokazuju
intenzivnije ljubičastocrveno obojenje sarkoplazme. Predlažemo da je ovaj nalaz na neki
način nastao zbog direktnog i/ili indirektnog učinka toksikanta tako da je promjenjen pH
sarkoplazme, vjerojatno se radi o nastanku anaerobnih uvjeta pri promjenjenim
metaboličkim putevima, najvjerojatnije se radi ili o smanjenju količine glikogena
(Sandritter 1968.) ili o nekom hipoksičnom anaerobnom procesu. Promjenu boje
tumačimo tako da pretpostavljamo jače vezanje bazofilne boje inače karakteristična za
bojenje jezgara, a procijenjeno je u našim uvjetima, da bi jačina ove potaknute reakcije
također mogla biti u korelaciji s visinom primljene doze. Od enzimsko-histokemijskih
reakcija LDH, ScDH (slika 117 i 118) provedenih na ovim uzorcima, najjasnije se uočava
promjena intenziteta obojenja (K < A < B < C/najjače/) u reakciji na laktat-
dehidrogenazu LDH, što također ukazuje na pojačani metabolizam unutar tih (tretiranih)
tkiva. Za ScDH ne može se sa sigurnošću reći da se uočavaju bitnije različitosti između
skupina.
195
Slika 115: Poprečnoprugasti mišić mužjaka pokusnih skupina, hemalaun-eozinsko bojanje: A mužjak kontrolne skupine, povećanje 400 X; B mužjak kontrolne skupine skupine, povećanje 400 X; C mužjak skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; D mužjak skupine C(555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X
196
Slika 116: Poprečnoprugasti mišić ženki pokusnih skupina, hemalaun-eozinsko bojenje: A ženka kontrolne skupine, povećanje 400 X; B ženka kontrolne skupine skupine, povećanje 400 X; C ženka skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; D ženka skupine B (375 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; E ženka skupine C (555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; F ženka skupine C (555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X
197
Slika 117: LDH-enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje poprečnoprugastog mišića pokusnih skupina životinja; A mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B mužjak skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; C mišić muške jedinke skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 150 X; D mužjak skupine C (555 mg/kg prometrina), povećanje 200 X
198
Slika 118: ScDH-enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje poprečnoprugastog mišićnog tkiva pokusnih skupina životinja: A mužjak netretirane kontrolne skupine, povećanje 100 X; B mužjak skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50), povećanje100 X; C mišić ženske jedinke netretirane kontrolne skupine, povećanje100 X; D ženka skupine skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50), povećanje 100 X
199
5. RASPRAVA
5. RASPRAVA
U provedenom pokusu planirani broj životinja po skupinama (četrnaest jedinki),
odnosno s obzrom na spol (sedam jedinki) i dozu apliciranog herbicida (osim kontrolne
skupine koja je primila samo uljnu otopinu), čini se opravdanim stoga jer pregledom
publiciranih toksikoloških radova slično osmišljenih toksikoloških pokusa (Springer i sur.
1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994, Franković 1990, Pavelić 1977, Maynard i sur. 1999,
Tiruchevlam i sur. 2000a, 2000b, ), kao i usporedbom preporuka, smjernica i standarda za
izradu toksikoloških studija ovog tipa (Descotes 1988), upotrebljen je sličan ili isti broj
životinja/uzoraka a dobiveni su vrlo pouzdani pokazatelji učinka nokse na fiziološke i
anatomske osobine organizma.
Kako je prilikom odabira načina aplikacije tj. puta ulaska pesticida u organizam u
toksikološkom pokusu bitno što bolje oponašati prirodni način ekspozicije organizma
ispitivanoj noksi u nesimuliranim/prirodnim uvjetima (Timbrell i sur. 2000, Wallace-
Hayes i sur. 2001, Walker i sur. 2001, Descotes 1999, 1988 ), tako se i u ovom pokusu
činilo najboljim odabrati oralnu aplikaciju mekanom gastričkom kanilom (“per os”) iz
nekoliko razloga.
Naime, spomenutim se načinom aplikacije pouzdano može odrediti točna doza, tj.
količina otrova koja se može korigirati s obzirom na tjelesnu težinu organizama tako da je
primljena doza nokse među jedinkama ujednačena, za razliku kada su životinje pesticidu
izložene u hrani i/ili piću, pri čemu se ne zna pouzdano koliko je pojedina jedinka pojela
i/ili popila odnosno koliku je dozu otrova u određenom vremenu unjela u tijelo.
Također, pri eksponiranju u hrani i/ili piću pokusne životinje radi promjenjenih
organoleptičnih svojstava ponuđeno katkad i odbijaju, pa mogu nastati velike promjene u
primjerice težini, razini elektrolita u tjelesnim tekućinama i drugim fiziološkim
varijablama, a za koje se ne može sa sigurnošću tvrditi da su u vezi s izravnim učinkom
nokse, već proizlaze iz pothranjenosti tj. nutritivne deficijencije. Iako, može se spekulirati,
pri načinu aplikacije koji je primjenjen u provedenom pokusu treba biti oprezan prilikom
tumačenja rezultata, stoga jer je iz literature vidljivo da se relativno mali postotak ukupne
doze preko crijevnog epitela apsorbira u organizam, a tada je to ona količina nokse koja
zapravo djeluje na molekule, substanične strukture, stanice, tkiva, organe i fiziološke
sustave uzrokujući sistemsku toksičnost.
200
Međutim, očito je da način aplikacije primjenjen u ovoj studiji najbolje simulira
ekspoziciju organizama okolišno prisutnom prometrinu, jer kronična izloženost prometrinu
i njegovim okolišnim reziduima nastaje preko probavila, a najčešća jednokratna, akutna
izloženost, dermalno i respirativno (pri prskanju kultura). Također, toksikokinetički tvar ne
zaobilazi crijevnu mikrofloru i jetru s jetrenim detoksifikacijskim enzimima koji bi
potencijalno mogli stvoriti još toksičnije metabolite Prometrina, ili u slučaju pada
populacije crijevne mikroflore uzrokovati druge kliničko-patološke promjene.
Poznati su putevi ulaska nokse (slika 91.) u organizam dermalno (koža),
gastrointestinalno (oralno), dišnim sustavom (plućima, trahejama ili škrgama),
intraperitonealno (i.p.), intramuskularno (i.m), subkutano (s.c) i intravenski (i.v) kako to
prikazuje slika 103. iz koje je najbolje vidljivo da noksa odmah nakon unosa probavilom,
portalnom venom dolazi i prolazi kroz jetru (organ bitan za proces detoksifikacije koji
može producirati još toksičnije tvari od primarno aplicirane), a to je još jedino u slučaju pri
intraperitonealnoj aplikaciji (na slici oznaka i.p.). Intraperitonealno aplicirana otrovna tvar,
iako kao i oralno aplicirana, portalnom venom ulazi u jetru kao prvi ciljni organ pri
prolasku u tijelu, ipak zaobilazi mikrofloru probavila. U tom slučaju na mikrofloru crijeva
djelovat će samo već pregrađeni/konjuigirani metaboliti i najvjerojatnije vrlo mala do
gotovo nikakva količina neprerađenog ispitivanog toksikanta koja se putem žući vratila u
probavilo.
Time se u potpunosti izuzimaju vrlo bitni faktori koji mogu utjecati na toksičnost, poput
primjerice mikrobne pregradnje ksenobiotika u probavilu, promjena sastava crijevne
mikroflore ili njen potpuni nestanak, što je bitno za normalno funkcioniranje organizma.
Zadnji argument za način aplikacije ispitivane tvari leži u činjenici spomenutoj u uvodnom
dijelu, pregledu literature i dosadašnjih spoznaja o prometrinu iz kojeg se vidi da se koristi
kao sredstvo za zaštitu jestivog bilja, određeno vrijeme je prisutan u okolišu (voda, biljke,
zemlja) pa i nije nevjerojatno da će upravo tako rezidue otrova biti unešene u organizam
(Timbrell i sur. 2001; Wallace-Hayes i sur. 2001).
201
202
Slika 119: Putevi prolaska ksenobiotika kroz tijelo ovisno o načinu aplikacije; s. c.- subkutano; i. m.– intramuskularno; i. v. – intravenski; i.p. – intraperitonealno; prilagođeno iz: Principles of Biochemical Toxicology (Timbrell, 2000.)
Nadalje, prema preporukama o odabiru doza prilikom dizajniranja
toksikološkog/imunotoksikološkog pokusa preporuča se uz netretiranu, kontrolnu skupinu
životinja, odrediti i tri doze kako bi se ukazalo na moguću proporcionalnu ovisnost doze i
učinka (od eng. dose-dependent response).
Između ostalih smjernica o odabiru doze, navodi se: “… The lower dose level is similar to
the lower dose used in conventional short-term repeated administration toxicity studies.
The next higher dose should not induce systemic toxicity and a decrise in body weight,
less then 10 percent is usually considered adequate….” Odnosno, najniža upotrebljena
doza mora biti slična uobičajenim najnižim dozama u toksikološkim pokusima, a prva
iduća veća doza ne smije inducirati sistemsku toksičnost i opadanje tjelesne težine za više
od 10% (Descotes 1999).
Prema tim smjernicama i literaturi (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994,
Franković 1990) odabrane su i doze u provedenom pokusu. Srednje jaka doza aplicirana
skupini B jest 1/10 LD50 za miša (Kamrin i sur. 2000.) tj. 375 mg/kg i predstavljala je
središnju okosnicu za odabir drugih dvaju doza.
Iz brojnih pokusa koji su također kao srednju dozu upotrebljavali 1/10 LD50 doze
apliciranu tijekom određenog radoblja (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994,
Franković 1990) vidljivo je da je upravo takav model optimum između postizanja učinka
koji se prati i preživljavanja jedinki tijekom pokusa.
Iako bi se primjenjene doze u ovom istraživanju moglo komentirati kao visoke s obzirom
na količinu nokse po jedinki tj. takve da ne odgovaraju vrijednostima potencijalne
ekspozicije ksenobiotiku okoliša, potrebito je skrenuti pozornost da je provedena studija
toksikološkog a ne ekotoksikološkog tipa. Odnosno, doze u ekotoksikološkom pokusu
najčešće su takve da se njima imitira količina ispitivanog ksenobiotika u okolišu, vodi ili
hrani ili se one određuju u granicama dopuštenih vrijednosti (ADI, MDK, NOAEL i sl.)
propisanih (zakonskih) standarda za rezidue ispitivane tvari. Toksikološka studija ciljno
oštećuje organizam kako bi pokazala način na koji organski, fiziološki i biokemijski
sustavi reagiraju na djelovanje nokse (kao u provedenoj studiji) ili je pokus temeljen na
određivanju najmanje granične vrijednosti doze nokse koja bi izazvala bilo kakav toksični
učinak (LD50, ADI, RfD, MDK, NOAEL i Procjena rizika/engl.-Risk estimation/).
203
Sve su životinje skupina K, A i B preživjele do kraja planiranog pokusa (do razudbe
dvadesetosmog dana), a sama količina nokse bila je dovoljna da bi u kratkoročnim
testovima toksičnosti pokazala vidljive učinke na ciljne organe i organske sustave.
Međutim, količina 1.48 X veća od 1/10 LD50 doze (skupina C) izazivala je smrt jedinki
na drugoj trećini planiranog trajanja pokusa.
Usporedba promjene aktivnost serumskih enzima i diferencijalni enzimatski
histopatološki preparati najbolji su pokazatelj ciljnih vitalnih organa koje prometin svojim
djelovanjem oštećuje. Uz enzimske biomarkere također je izrađena i rutinska
diferencijalna histopatološka analiza najbitnijih ciljnih organa toksičnosti, radi lakšeg i
jasnijeg tumačenja i potvrde rezultata biokemijske analize seruma i prikaza mehanizma i
tijeka sistemske toksičnosti, ali i stoga jer je to neodvojiv dio svake ispravno provedene
toksikološke studije ovog tipa.
Tumačenje histopatoloških preparata izvršeno je prema shematskim i slikovnim
ključevima za determinaciju udžbenika i atlasa histologije i histopatologije (Sandritter i
sur. 1989, De Fiore 1967) uz naknadnu potrvrdu nalaza od strane stručnjaka patologa
veterinarske medicine (Sabočanac 2002) i potvrde histologa (Lacković-Venturin 2003).
Aktivnost serumske LDH statistički se značajno povećava s porastom doze prometrina
(rezultati tablica 5. i slike 15. i 16.). U uvodu je detaljno opisano koji organi i na koji način
pridonose ukupnoj aktivnosti LDH u serumu, to su u najvećoj mjeri srce, jetra i
poprečnoprugasti mišić (Kaneko i sur. 1997, Fudge 2000, Wallace-Hayes 2001, Schmidt
1968). Histopatološka slika LDH u mišićju pokazuje povećanje aktivnosti, ali i ekspresije u
odnosu na kontrolu (slika 117). Istovremeno razina ekspresije i aktivnosti LDH smanjena
je u jetri životinja izloženih prometrinu (slika 110). To znači da postoji povezanost
povećanja aktivnosti LDH između seruma i mišića. Tijekom ovog pokusa povećanju
serumske aktivnosti LDH u manjoj mjeri pridonosi propadanje hepatocita i najvjerojatnije
je izvor serumske LDH porijeklom iz mišića. Dokaz je i pozitivna korelacija LDH i
kreatinina (tablica 15) u skupine A gdje se može pretpostaviti da i jedan i drugi pri toj
najmanjoj dozi potjeću od mišića. Usporedimo li slike regresije enzima LDH i kreatinina
(slika 31) uočava se nulti odnos, tj. nema rasta niti pada odnosa u kontrole, za razliku od
skupine A gdje je prisutno pozitivno povećanje povezanosti koja se još zadržava i u skupini
B a pri najvećoj dozi postoji jako negativan odnos obaju faktora. Biološki mogli bismo
204
tumačiti izneseno na način da je došlo do metaboličnih promjena u mišićnom tkivu koje
iziskuju dodatne izvore stvaranja ATP-a jer njegova koncentracija nije više u otrovanih
životinja dovoljna. Pa se u mišićju zbiva pojačana glikogenoliza (otud i višak LDH koji
curi van jer su membrane sarkoplazme oštećene) a kreatinina nema dovoljno jer se sav
zadržava u ciklusu kreatinin fosfokinaze i generira ATP iz ADP-a. Takvo kretanje
korelacijskih i regresijskih odnosa tumačimo tako da jedino u skupine A doza prometrina
nije dovoljno jaka da napravi prije opisanu patofiziološku situaciju, ali je dovoljna da
uzrokuje oštećenje membrane te obe varijable odlaze u krv što uzrokuje njihovu pozitivnu
koreliranost. Čini se da je osim oštećenja membrane koje ispušta LDH iz sarkoplazme
patološki s porastom doze povećana razina ekspresije i sinteze enzima zbog djelovanja
prometrina. Povećanje aktivnosti LDH u samom mišićju kako smo već opisali, govori o
povećanju metabolizmu glukoze odnosno glikolitičkog puta kako bi se generirao ATP pri
tome nakupljanje laktata, krajnjeg proizvoda LDH, vjerojatno snižava pH u mišićju. Iz toga
možemo zaključiti da ga u otrovanih životinja ima puno jer i hemalauneozinsko bojenje
mišića otrovanih životinja ukazuje na jače crvenkasto obojenje unutar sarkoplazme u
odnosu na kontrolu. Ako znamo da je eozin histološka boja koja boji kisele strukture
unutar stanice, jača reakcija u otrovanih životinja ukazuje na acidozu unutar mišića (slika
115 i 116). Na takvim preparatima uočava se povećana aktivnost makrofaga oko
sarkoplazme, što najvjerojatnije ukazuje na njenu veću propusnost i potrebu za
fagocitiranjem sadržaja koji se ispuštau krv i međustaničnu tekućinu. Nadalje s
povećanjem doze smanjuje se koncentracija kreatinina u krvi, što može značiti da ga manje
izlazi iz mišića kao što smo već opisali ali to može znaćiti i da ga bubrezi u većoj mjeri
propuštaju iz krvi u mokraću. Bubrezi na histopatološkim preparatima pokazuju naznake
glomerularnih promjena, a da li su te glomerularne promjene takve (primjerice fenestralne
lezije) da pogoduju jačem propuštanju kreatinina trebalo bi utvrditi dokazom proteinurije,
glikozurije, aminozurije ili samim utvrđivanjem koeficijenta kreatinina (24-satna količina
izlučenog kreatinina/kg tjelesne težine). Iako je koeficijent kratinina ujedno i pokazatelj
mase mišića (2% ukupnog kratinina u tijelu=konstanta(Kaneko i sur. 1997., Fudge 2000,
Wallace-Hayes 2001, Schmidt 1968)) ovdje se radi o umjetnom patološkom stanju u kojem
oštećenje bubrega sudjeluje u mjenjanju tog koeficijenta, odnosno da je bubreg u
potpunosti zdrav (histološki preparati pokazuju suprotno) tada bi sa 100 % sigurnosti mogli
govoriti o miotoksičnosti prometrina. Ovako, uz razmatrani LDH, gore opisanu
205
histopatologiju i kreatinin, mora se u razmatranje uzeti i aktivnost serumskog ALT i AST,
također markera oštećenja mišića ali i jetre. Normalno u poprečnoprugastom mišićju AST
je zastupljen gotovo u jednakoj U/g kao i LDH (od ta dva enzima jedino CK ima višu U/g).
Rezultati pokazuju da u serumu životinja otrovanih prometrinom oba enzima pokazuju
relativno mali porast aktivnosti ali je AST povišen zamjetno više od ALT koji je jedva na
pragu statistički značajnih razlika (porasta) u odnosu na kontrolu. Iako AST ima više u
jetri nego u mišićju pa taj porast isprva upućuje na oštećenje jetre (jetra sadrži gotovo
jednaku visoku koncentraciju oba enzima), ALT u mišićju ima puno manje nego u jetri pa
ako koncentracija AST raste on bi morao dolaziti iz oštećenih poprečnoprugastih mišića.
Analiza De Ritiusovog indeksa govori o jedva značajnim, sporadičnim, o dozi ovisnim
promjenama od normalnog indeksa (tj. kontrolnih životinja), a on govori o stupnju
oštećenosti hepatocita. Iako histološka slika jetre otrovanih životinja ukazuje na postojeće
atrofične ili nekrotične promjene (i u slučaju najveće doze hiperproliferaciju), toksičnost
prometrina u ovom stadiju otrovanja uglavnom se može opisati kao bilijarnom
opstrukcijom uzrokovana hepatotoksičnost. Osim slabe promjene De Ritiusova indeksa, u
prilog bilijarne opstrukcije i kolestaze ide status aktivnosti y–GT i AlP u serumu koji
pokazuju statistički značajno povećanje s obzirom na porast doze. Ako uspoređujemo
pozitivnu povezanost korelacijskih i regresijskih faktora (tablica 12) u kontrole uočavamo
da jedan i drugi dolaze u krv u jednakoj mjeri iz pripadajučih izvorišnih organa. Ta
korelacijsko regresijska veza slabi ali je još povezana u najslabije doze A (tablica 15), a
odlazi prema negativnoj vezi pri srednjoj dozi B (tablica 18). Budući da znamo da iz
korelacijskih odnosa izmjerenih vrijednosti aktivnosti i doze (slike 17 i 19) obje aktivnosti
rastu s dozom, a korelacije odlaze u negativnu povezanost, to tumačimo na način da s
porastom doze jedan od enzima raste brže, a drugi sporije (ali oba rastu). Iz tablica 17 i 19
korelativne povezanosti aktivnosti vidi se da AlP raste brže nego GGT. Biološki to znači
da AlP s porastom doze dolazi iz dugih izvora koji ne sadrže onaj prvi. Također poznato je
da u akutnom hepatičkom oštećenju jetre ALT i AST su uglavnom jako povišeni a AlP
status je nizak, dok u kroničnom tijeku bolesti jetre sa kolestazom AlP i GGT u serumu
imaju povišenu aktivnsot, a ALT i AST su samo neznatno povišeni. Rezultati ovog rada
pokazuju upravo opisanu situaciju. Aktivnost AlP (histopatološki rezultati) u hepatocitima
je relativno blago povišena, a u serumu vrlo visoka. Uz prethodno spomenuto povišenje y-
GT, to AlP potvrđuje nefrotoksično djelovanje prometrina jer povećanje oba enzima
206
najvjerojatnije je posljedica oštećenja bubrega. Višoj aktivnosti AlP ovisno o porastu doze,
osim lezija bubrega i opstrukcije žučnih kanalića vjerojatno pripomažu i oštećenja
probavila koja su utvrđena histopatološkim pretragama. Metode diferencijalnog bojanja
kompleksnih ugljikohidrata, glikokonjugata (PAS, PAS+AB, PAS+D) u probavilu
izvedeno je stoga jer se pretpostavljalo da se nakon aplikacije Prometrina u kiselim
uvjetima želuca, događa reakcija s HCL-om određenog broja molekula originalnog spoja.
Iz formule prometrina vidljivo je da bi teoretski od heksanskog prstena i bočnih skupina
mogli nastati brojni spojevi bazičnog ili kiselog karaktera. Kako glikokonjugatne
molekule tj. kompleksni polisaharidi prekrivaju stanice, pa tako i epitelne stanice crijeva, i
pri tome imaju ulogu prve fronte zaštite od okolišnih uvjeta, a po karakteru mogu biti
različite pH reakcije, pretpostavilo se da će prilikom pasaže ksenobiotika i njegovih
rezidua različitog pH zaštitni “šećeri” biti “otplavljeni”. Drugim riječima ukoliko
prometrin raspadom u želucu stvori više spojeva alkalnog karaktera trebali bi biti
“otplavljeni” kiseli mukopolisaharidi (najčešće sijalinizirani proteoglikani, ali i ostali
sijaloglikokonjugati) i obratno, stvori li se više rezidua kiselog karaktera biti će otplavljeni
polisaharidi alkalnije reakcije otkrivajući sluznicu i stvarajući podlogu za razvoj stanja kao
što je čir i sl. Rezultati analize su takvi da ne možemo sa sigurnošću (zapravo gotovo
nikako) tvrditi da postoje jasne razlike između kontrole i tretiranih skupina. Možda je
razlog taj što prilikom fiksacije u 4% paraformaldehidu s PBS ti spojevi bivaju uklonjeni
iz lumena crijeva. Možda bi bilo bolje koristiti svježe smrznute kriostatske rezove bez
fiksativa. Međutim, dobro je vidljivo da žljezdasti dijelovi crijeva bez obzira na dozu i
tretman i dalje luče glikozilirane produkte, iako bismo možda ustvrdili (poglavito u
skupinama B i C) da je brojnost žlijezda povećana s obzirom na dozu te da proporcionalno
dozi postoje brojne “klasične” histopatološke promjene (apoptoza, nekroza, morfološka
promjena resica, prodiranje leukocitnog tipa stanica unutar resice, kontrakcija resica,
ljuštenje epitela i sl.). S obzirom da tijekom cijelog pokusa ipak nije došlo do drastičnog
pada tjelesne težine, ali isto tako da nije uočen proljev ili krvarenja, pretpostavljamo da je
promet hranjivih tvari, iako možda otežan (na što ukazuje pojava glikogenolize,
razmotrena dalje u raspravi), ostao stalan, a crijevo iako narušene anatomsko-morfološke
arhitekture i dalje donekle obavlja propisane fiziološke zadaće, iako rezultati
histopatologije govore da možda sistemski dolazi do hipoksije i pojave “fiziološke gladi
stanica” izravno ili neizravno uzrokovane noksom. S druge pak strane jetra pokazuje jasne
207
znakove reakcije na direktno djelovanje ispitivane tvari, koji se očituju u narušenoj
biokemijsko-fiziološkoj i morfološko-anatomskoj cjelovitosti. Aktivacija i
hiperproliferacija lizosoma u hepatocita proporcionalno raste s dozama a na to ukazuju sva
provedena enzimsko histokemijska bojanja (alkalna i kisela fosfataza, nespecifične
esteraze, ScDH, LDH, NADPH). Nedvojbeno se uočava ovisno o dozi proporcionalno
povećana koncentracija glutationa (diferencijalno histopatološko bojanje na glutation) u
tkivima što se preklapa s rezultatima Maynard-ove studije o detoksifikacijskim
mehanizmima prometrina u štakora, koja govori da se u fazi II detoksifikacije glutation i
glukuronidna kiselina najviše induciraju i sudjeluju u izbacivanju metabolita prometrina
(Maynard i sur. 2000). S obzirom na gore spomenuti podatak o nemijenjanju tjelesne
težine tretiranih skupina, može se razjasniti ako se uoći da pogotovu PAS, PAS+D, LDH
bojanja jetre i LDH, i HE bojanje mišića (mišić, hemalaun-eozinsko bojenje, prima više
ljubičaste boje. To može ukazati na smanjivanje količine glikogena u stanicama
(Sandritter 1989.). Ti podaci ukazuju da se glukoza sada mobilizira iz zaliha organizma,
pa se može pretpostaviti da se jedan dio troši kao energent, zbog čega ne dolazi do pada
tjelesne težine a jedan dio te glukoze morao je biti stavljen u metabolički put sinteze
glukuronidne kiseline (konjuganta faze II detoksifikacije čiji je prekursor glukoza) jer, kao
što je prije napomenuto to je, uz glutation glavni spoj za izbacivanje metaboliziranog
prometrina iz tijela. Ako usporedimo podatak spomenut u uvodnom dijelu također iz
Maynardove studije, o vremenu izlučivanja od 48 sati (što je relativno kratko), a s obzirom
da su životinje bile izložene vrlo visokim dozama, može se zamisliti vrlo velika količina
spojeva faze II detoksifikacije koja je u stvari potrebna za tu zadaću. Zasigurno mora
postojati neki “signalni put”, metabolički induciran prometrinom, koji fiziološko
biokemijsku ravnotežu metabolizma okreće u opisanom smjeru. Jači intenzitet bojanja
Sudan B metodom ukazuje na pojačano uskladištenje masti u jetri. U citoplazmu
hepatocita uložene, crno obojane uklopine, sitnog su i dispergiranog karaktera,
raspoređene jednoliko po stanici (bez neke posebne lokacijske polarizacije), te bi se to
stanje moglo označiti kao mikrovezikularna steatoza (nisu poput one u kroničnih
alkoholičara kada su to krupne “kuglice” masti tj. klasična steatoza jetre /tzv.
makrovezikularna/). Pojavu mikrovezikularne steatoze možda bi se moglo objasniti
također pokušajem organizma da se zaštiti od toksikanta na način da liposolubilni,
nemetabolizirani originalni spoj (noksu), ali i liposolubilne metabolite nastale u
208
enzimatskoj pregradnji, a koje ne može brzo izlučiti iz tijela, privremeno pokušava
uskladištiti u mastima u organizmu, između ostalog i ovdje u jetri. Odnosno, mogli bismo
predložiti sljedeći patofiziološki model metabolične okosnice jetra-mišić s porastom doze
prometrina: Metabolični putevi glukoneogeneze iz laktata, koji u većoj mjeri pristiže iz
mišića u jetru poremećeni s porastom doze u smjeru stvaranja glukoze glikogenolizom jer
glukoza iz glukoneogeneze više ne dolazi u mišić u većoj mjeri. Laktat u jetri preko
koenzima A biva preusmjereni ka stvaranju lipida (nalaz steatoze na histopatologiji)
(Kaneko i sur. 1997., Fudge 2000, Wallace-Hayes 2001, Schmidt 1968). Usporedno s
time, pogotovo na hemalaun-eozin prerezima jetre skupine A, ali i na ponekim mjestima u
jetri skupine B primjećuju se velike, kuglaste uklopine koje se ne boje Sudan B bojom, pa
rezultat ukazuje da se u tih hepatpocita javlja hidropična vakualizacija, što između ostalog
govori o poremećenom radu transportnih proteina u membrani, oštečenju Na-K pumpe i
nemogućnosti stanice da se riješi suviška vode, što je sve direktna posljedica učinka
nokse. Hidropična vakuolizacija primjećena je još i u tubularnom epitelu bubrega, također
jačine proporcionalne primljenoj dozi. Zanimljivo je da se broj Kupfferovih stanica u
skupina A i B, smanjio proporcionalno s dozom. Možemo samo pretpostavljati da li su
stradale zbog direktnog učinka nokse ili u obrani organizma.
U skupina A i B hepatociti su povećani (“napuhnuti”) čime vidno smanjuju sinusoidalne
puteve, primjetno su eozinofilniji, jezgre su piknotičke, a pogotovu u skupine B
primjećuje se na nekim mjestima «rupast» izgled tkiva. Sve to ukazuje na subakutnu
hepatičku nekrozu u skupine uzrokovanu noksom. Ovo stanje početka narušavanja
hepatičke parenhimske arhitekture moglo bi se označiti kao (pred-) ciroza.
Prema opisanim i razmotrenim rezultatima provedenog pokusa, međutim, teško bi se sa
sigurnošću moglo reći, s obzirom na mehanizam hepatotoksičnosti, u koju skupinu
hepatotoksina spada prometrin. Odnosno, da li se može svrstati u skupinu izravnih
hepatotoksičnih tvari koji uzrokuje direktne lezije hepatocita i ostalih jetrenih stanica
(poput primjerice fosforne kiseline), ili spada u drugi tip indirektnih hepatotoksina koji
interferiraju sa staničnim mehanizmom pa tako indirektno narušavaju integritet stanice
(poput anaboličkih steroida ili nekih kolestatičnih toksina, iako se iz rezultata ne vidi
kolestatični učinak nokse) ili pak djeluje prema trećem mehanizmu tako da uzrokuje
hepatocelularne nekroze preko imunološke reakcije tj. da uzrokuje tzv. imunotoksični
209
“autoimuni” hepatitis (kao primjerice diuretik tienilna kiselina, antihipertenzik
dihidralazin, anestetik halotan i antidepresant iproniazid) (Descotes 1999.).
Međutim, kako Hemalaon-eozin bojenjem nije uočena inkluzija, pojačana aktivnost i/ili
nadolazak bilo kakva imunoreaktivnih stanica u jetru tj. nema izrazitog pojavljivanja
stanica imunohematopoetskog sustava, osim povremeno eritrocita na mjestima gdje su
lezije relativno jake pa je došlo do blažeg krvarenja u organu i rijetkog dispergiranog
nalaza pojedinačnih megakariocita. Prema navedenim rezultatima moglo bi se isključiti
treće navedeni model autoimune-hepatotoksičnosti nokse, jer nema vidljivog napada
stanica imunološkog sustava poput primjerice u mišićju. Pretpostavlja se da prometrin nije
hepatotoksin koji djeluje poput primjerice dihidralazina, čiji metaboliti koje stvara
citokrom P450 1A2 enzim, konjugiraju s tim enzimom, stvarajući antigen na koji
organizam reagira protutjelima. Takva protutjela u jetri vežu se i na nekonjugirani
citokrom P450 1A2, u hepatocitima uzrokujući hepatocelularne nekroze. Sličan je i
primjer tienilne kiselina, samo što metabolit konjugira s citokromom P450 2C9 (Descotes
1999.).
Naglašava se još jednom da je upravo jaka infiltracija pobuđenih imunoreaktivnih stanica
u samo tkivo, koja nalikuje upalnoj reakciji, slučaj kod hemalaun-eozinskih preparata
poprečnoprugastog mišića.
U skupini C opisane pojave hemalaun-eozin bojanja jetre manje su izražene morfološko-
anatomski, ali sva biokemijska bojanja pokazala su uvijek najizraženiju reakciju upravo u
C skupini. Kako i večina drugih, mjerenih varijabli u C skupine, rezultati izgledaju više
slični rezultatima kontrolne skupine, moglo bi se pretpostaviti na osnovu rezultata
histopatologije mozga da je za smrt jedinki skupine C uglavnom najodgovornije izravno
oštećenje mozga prometrinom koji kao liposolubilna tvar prolazi krvno-moždanu barijeru.
Uz ovu pretpostavku najbitniji drugi razlog smrti u skupini C je i jako izravno oštećenje
bubrega zbog čije disfunkcije vjerojatno dolazi do uremije, proteinurije i sličnih
poremećaja. Hemalaun-eozin preparati bubrega skupina A i B ukazuju na potencijalnu
oštećenost i morfološke promjene glomerula u skupine A i smanjen ukupan broj
glomerula u skupine B. U obje skupine uočena, s dozom proporcionalna hidropična
degeneracija/vakuolizacija stanica bubrega karakterizirana je ovdje nakupljanjem vode.
Ovo stanje moglo bi ukazivati na potencijalnu hipoksiju, toksičnu enzimatsku inhibiciju,
ili inhibiciju oksidativne fosforilacije što su najkarakterističniji poremećaji koji rezultiraju
210
hidropičnom degeneracijom stanica jer uglavnom uzrokuju deficijenciju ATP, čime dolazi
do disfunkcije natrijske pumpe (Sandritter 1989. Schmidt i sur. 1997, Koolman i sur.
1996). Masa bubrega, osim u skupine C gdje rapidno opada, nepromjenjena je, čime
bismo samo mogli potvrditi naprijed iznešenu pretpostavku o glavnim uzrocima smrti u
skupini C. Karakteristično također za skupinu B je i nedostatak i/ili narušeni raspored
pojedinih stanica tubularnog epitela, ponegdje s naznakom piknoze, vjerojatno uzrokovan
odumiranjem stanica uslijed aktivne pasaže nokse i njenih metabolita.
Kako se broj uzoraka u skupini C smanjivao, odlučeno je žrtvovati preostale životinje
onda kada je smrtnost unutar skupina bila blizu 50 %, prvo kako bi se pokušalo utvrditi
koji je vitalni dio fiziologije oštećen i zašto uopće dolazi do smrti životinje i drugo jer je
procijenjeno da do kraja planiranog pokusa ne bi preživjela niti jedna životinja skupine C
pa bi bilo kakva analiza bila nemoguća. Smrću životinja u skupini C i preživljavanjem
životinja u skupini B (ali i A) još se jednom pokazalo da doza 1/10 LD 50 predstavlja
relativno dobar model u toksikološkim studijama kratkotrajne kronične izloženosti
ispitivanoj noksi, i da u kronično provedenom pokusu životinje koje primaju doze veće od
1/10 LD 50 najčešće ugibaju već nakon nekoliko tretmana.
Uočava se mobilizacija stanica imunohematopoetskog sustava ka: (1) prvo napadnutim
mjestima tj. mjestima prvog susreta s ksenobiotikom (poglavito probavilo ali i organi koji
su po funkciji prvi u klirensu otpada iz krvi kao što je to npr. slezena), ali i ka (2) mjestima
na kojima su sekundarno promijenjeni biokemijsko-fiziološki uvjeti (najjasnije se to vidi
na diferencijalnim patološko-histološkim bojanjima mišića).
Takva mobilizacija stanica imunohematopoetskog sustava možda je i glavni uzrok
naizgled supresivnom i/ili lizirajućem djelovanju preparata (s obzirom na pojedine organe)
što bi se olako moglo zaključiti, jer u pojedinim tjelesnim kompartimentima broj stanica
opada a one su možda zapravo samo translocirane na druga reakcijska žarišta, a ne i
uništene.
Tako primjerice eritrociti tretiranih skupina u odnosu na kontrolu ne doživljavaju
depresiju brojnosti, najjače izraženu u kontrolnoj skupini. Može se pretpostaviti da je šok
uzrokovan ulaskom u intenzivne, stresne postupke pokusa glavni čimbenik opadanja broja
eritrocita u kontrole. Naime, nepostojanje spomenute depresije ali i nepostojanje bitne
oscilacije u broju eritrocita u skupina A i B možda bi se moglo objasniti nastankom
hipoksičnih stanja u tkivima, i označiti kao sekundarna policitemija zbog mogućeg
211
hipoksičnog stanja tkiva na koje indirektno ukazuju rezultati poput diferencijalnih
histokemijskih bojanja, poglavito mišića i jetre ali i bubrega. Hipoksija nastaje zbog
promjenjenih biokemijskih uvjeta uslijed detoksifikacije (enzimska pregradnja otrova,
konjugacije otrova i metabolita, dodatna sinteza proteina poglavito enzima koji sudjeluju u
navedenim procesima), pri čemu organizam troši dosta kisika. Također moguće je da na
neki način prometrin interferira s procesom stvaranja hemoglobina, i/ili se konjugira na
već prisutni, sintetizirani hemoglobin (ili njegove prekursore) onemogućujući njegovo
pakiranje u eritrocite. U svakom slučaju, ukoliko postoji nedostatak kisika uzrokovan bilo
kojim opisanim, predloženim modelom (a potvrdu za postojanje manjka kisika dokazuje i
naprijed opisano povečanje aktivnosti glikogenolitičkih anaerobnih metaboličnih puteva i
enzima), receptori u tijelu najvjerojatnije signaliziraju njegov manjak uzrokujući možda
kaskadnu signalnu reakciju otpuštanja faktora koji djeluju na proliferaciju i otpuštanje
eritrocita u koštanoj srži. Drugi mogući scenarij, iako manje vjerojatan, jest da ispitivana
tvar ima direktan mitogeni, proliferativni učinak na proeritroblaste i/ili stimulirajuće
djelovanje na koštanu srž na način da pomaže/olakšava otpuštanje eritrocita (jer ukupni
broj stanica koštane srži skupina A, B i C opada), premda to i nije vjerojatno jer, treba
napomenuti da prilikom analize krvi u tretiranih skupina nije uočena povećana količina
nezrelih eritrocita u krvi. Učinak prometrina na signalni put eritropoetina i/ili faktora
stimuliranja kolonija, kao tvari koja utječe na eritropoezu, ipak bismo mogli izostaviti jer
histopatološkom analizom bubrega vidi se da je bubreg jako opterećen i oštećen pa je
proizvodnja eritropoetina i faktora stimuliranja kolonija najvjerojatnije smanjena.
Iznesene pretpostavke bilo bi dobro ispitati pokusima/mjerenjima koji bi se koncentrirali
na spomenute fiziološke biomarkere.
Postoji još jedna pretpostavka, do koje dolazimo na osnovu naših rezultata analize slezene.
Naime ako slezena između ostalih funkcija služi kao deponij eritrocita a histopatološka
analiza slezene pokazuje povećanje područja u kojima prevladavaju leukocitni tipovi
stanica (plava/bijela pulpa) na uštrb područja crvene pulpe (gdje prevladavaju eritrocitni
tipovi stanica), a masa slezene u skupinama K, A i B kao i ukupna staničnost ostaje
nepromjenjena (znači da se promjenio samo omjer stanica eritrociti/leukociti), to navodi
na zaključak da su eritrociti, pod pretpostavkom da nisu lizirani, možda mobilizirani
(“istisnuti”) u krvotok pa tako njihov broj u perifernoj krvi tretiranih skupina ne opada.
212
Predložemo to kao najsigurniji zaključak za broj eritrocita u skupina A i B, do kojeg se
može doći na osnovi dobivenih rezultata pokusa.
Depresiju/oscilaciju broja eritrocita u skupini C (koja ovdje možda naizgled više sliči
kontroli) moglo bi se možda objasniti direktnim lizirajućim učinkom nokse zbog
promjenjenih fizikalnih, kemijskih, fizioloških i biokemijskih uvjeta u krvi (izotoničnost,
pH i sl.), koji su promjenjeni zbog prisutstva ksenobiotika i njegovih rezidua (Maynardova
studija (Maynard i sur. 1999) ukazuje da najveća količina neizlučenog prometrina ostaje
akumulirana upravo u plazmi). Druga mogućnost je poremećaj u metabolizmu
aminokiselina koje se možda mobiliziraju na puteve za sintezu detoksifikacijskih proteina
(konjugatnih molekula i enzima) kao i strukturalnih proteina za popravak oštećenih stanica
tkiva a možda se i jedan dio eritrocita zadržava u nekrotiziranim lakunama u teško
oštećenim organima (poput bubrega i jetre) i unutarnjim krvarenjima, što je vrlo često
patološko stanje pri djelovanju toksina.
Prema OECD (Organization for Economic Development and Cooperation) Guideline
407 (usvojena 27. 06. 1995., revidirana 1996.) preporučuje se u ispitivanju
imunotoksičnosti, vrijeme trajanja pokusa od 28 dana, s naglasakom na makronekroskopiju
i histološku analizu limfoidnih organa (navode se: timus, slezena, limfni čvorovi, kako oni
na putu administracije, tako i oni distalni radi analize sistemske toksičnosti). Ovoj OECD-
ovoj preporuci prethodila je ona EU iz 1983, koja je također naglasak u analizi
imunitoksičnosti davala biometrijskim svojstvima i histopatološkoj analizi limfatičnih
organa (Descotes 1999, 1988).
US EPA predlaže tzv. Tier-1 i Tier-2 approach, gdje decidirano navodi elemente analize
Tier-1 za početak ispitivanja ksenobiotika. To su: imunopatologija: hematologija (broj
stanica); ukupna težina slezene, timusa, jetre; ukupni staničnost slezene, timusa, limfnih
čvorova; histopatologija slezene, timusa, limfnih čvorova (Descotes 1999, 1988).
Povećan broj leukocita periferne krvi u svih tretiranih skupina, od kojih poglavito
(najviše) u B skupini i u mužjaka skupine A, kao i smanjenje ukupnog celulariteta
koštane srži, ukazuje na stimulativno djelovanje nokse na leukocite. Tako dobiveni
rezultati slažu se sa literaturnim podacima o imunostimulirajućem djelovanju prometrina
na imunokompetentne organe i leukocite u štakora (Giurgea i sur. 1980., 1981., Messow i
sur. 1990.,). Iako rezultati analize komet testa leukocita (tablice 24-28 i slikama 92-98)
pokazuju statistički značajna oštećenja integriteta stanične DNA sa porastom doze. Iz
213
izvedenoga se vidi da prometrin ima potencijalnu mutagene sposobnosti ako na ovakvom
mišjem modelu in vivo pokazuje porast dužine repa. 14. dana pokusa uočava se značajna
razlika u jačem intenzitetu florescencije repa skupine B iC, ali dužina repa u B nije toliko
velika kao u C. Biološki bismo mogli objasniti ovu pojavu sa sitnijim i večim brojem
fragmenata DNA u repu skupiune C najveće doze 14. dana. U svih ostalih skupina 14 dana
primječuje se fragmentacija DNA. Sve vrijednosti se još više povećavaju do 28. dana.
Biološki bismo to mogli obrazložiti kao interkcijsku međuovisnost doze i vremena.
Odnosno zaključuje se da dužim izaganjem višim dozama prometrina nastaje više lomova
DNA tj baze na molekuli DNA su na više mjesta oslabljene i podložne lomovima.
Narušenim DNA integritetom očito je da su leukociti u fazi nekroze i apoptoze u većoj
mjeri nego životinje koje nisu izložene otrovu, drugim rijećima povećan broj leukocita, ali
komet metodom dokazano oštećenih, najvjerojatnije dolazi iz imunohematopoetskih
organa kako bi nadomjestio one koje su narušenog DNA integriteta i predodređene
mutaciji ili nekrotičnoj ili apoptotičnoj smrti.
Na ovom mjestu vrijedi istaknuti kako je uočeno tijekom pokusa da je večina učinaka
nokse (pogotovu smrt jedinki u ovom ali i u prethodno provedenom preliminarnom
pokusu) selektivno jače oštetila i/ili izazvala reakciju u ženskih jedinki (“otrov za ženke”).
S obzirom na rezultate o broju i DNA integritetu leukocita (čija je brojnost pri najmanjoj
dozi A, veća u mužjaka nego u ženki), mogli bismo spekulirati da je između ostalih
mehanizama detoksifikacije, povećan broj leukocita zaslužan u prevladavanju štete
uzrokovane ksenobiotikom i da utjeće na bolje šanse preživljavanja mužjaka.
Iako se teoretski predloženi scenarij o leukocitima i preživljavanju mužjaka pri
selektivnoj toksičnosti među spolovima možda može i ozbiljnije razmatrati, treba se
prisjetiti dvije čvrsto dokazane činjenice: (1) Timbrell u Principima biokemijske
toksikologije u poglavlju Imunotoksikologija u kojem raspravlja o ovisnosti jačine doze
ispitivanog ksenobiotika i jakosti imunološkog odgovora naglašava da u pravilu, zbog
prirode imunološke reakcije ne postoji korelacija jačine imunog odgovora i doze
(“…There is usually no dose-response relationship for immune responses, as the
magnitude of the response is dependent on the type of reaction of the endogenous immune
system, not on the concentration of the foreign compound…” Odnosno u slobodnom
prevodu jačina imunog odgovora ne ovisi o dozi i koncentraciji strane tvari (Timbrell
2001.); Mada, Timbrell u toj svojoj tvrdnji nije u potpunosti isključiv, stoga pretpostavka
214
predložena s naše strane možda i ima logike. S druge pak strane, nasuprot tvrdnji
Timbrell-a, rezultati imunotoksikoloških studija Springer i sur. (Springer i sur. 1986a,
1986b, 1983) (! Na mišu, ali različite vrste pesticida) kao i Messow (Messow i sur. 1990)
(! prometrin, ali na štakoru) pokazuju proporcionalnu ovisnost doza toksikanta naprama
broj leukocita i odgovora na poznate mitogene ili ovisnost doza toksikanta (prometrin)
naprama broj leukocita i količina opsonizanta CRP (C-reaktivnih proteina.) u radu
drugospomenutog autora; (ii) nadalje ne smijemo zaboraviti na interakciju biokemijskih
činilaca (receptora, hormona, prekursora hormona itd) spolnog endokrinog sustava koja se
najbolje vidi u brojnim radovima naših autora Kniewaldovih i njihovih suradnika (Težak i
sur. 1992, Kniewald i sur. 1983, 1979, 1995), iz kojih proizlazi da je prometrin jedan od
ometača endokrinog sustava/“endokrini disruptor”.
Poremećaji i pad vitatliteta koji slijedi do kraja pokusa, potencijalno se objašnjava općom
sistemskom poremećenošću i oštečenjima cijelog organizma, pri čemu kondicioni pad, a
ne ksenobiotik direktno, uzrokuje nemogućnost kompenzacije meatabolizma ali i
leukocitnih i stanica imunohematopoetskih stanica uz istovremeno odumiranje starih
leukocitnih i drugih stanica.
Najzanimljivija je činjenica pri analizi pojedinog tipa leukocita (DKS) kontinuirani
porast broja bazofila do kraja pokusa u svih tretiranih skupina kao i zamjena omjera malih
i velikih limfiocita u skupini C u odnosu na ostale tretirane skupine.
Vjerojatno se radi ili o sporijoj dinamici oscilacije bazofila tako da je kretanje njihove
brojnosti jednako ostalim tipovima stanica leukocita ali se “pik” postiže sporije (sa sedam
dana pomaka) pa uslijed kraja pokusa ne vidimo pad k/ili ispod početnih vrijednosti
sedmog dana pokusa a on bi možda također uslijedio kao i u ostalih tipova stanica da se
pokus produljio ili se možda ipak radi o specifičnoj reakciji na stimulaciju proizvodnje
bazofila uzrokovanog noksom.
Ukoliko je drugo spomenuti slučaj istinit a s obzirom na ulogu bazofila u lučenju
poglavito heparina ali i histamina, bradikinina, serotonina, lizosomskih enzima i
anafilaksijskih tvari sporog djelovanja, možemo pretpostaviti da dolazi do jakih tkivnih
reakcija obostrano uzrokovanih noksom i izlučevinama bazofila pa bi se takav novonastali
učinak možda mogao označiti kao sličan pseudo-alergijskoj manifestaciji, koji se pojačava
s vremenom trajanja pokusa. Odnosno, želi se reći, ukoliko povećanje broja bazofila
215
nazovemo kao pseudo-alergijskoj reakciji sličnom učinku, onda je ona najjače izraženija
sekundarno u drugoj polovini pokusa (14.-28. dan).
Dakako treba istaknuti istovremeno izrazito snažno pojavljivanje imunokompetentnih
stanica u tkivima (hemalaun-eozina mišića i probavila), što je definitivno učinak sličan
vrlo jakoj upalnoj reakciji.
Drugi primarni limfoidni organ, timus, u uvjetima provedenog pokusa nije ukazao na vrlo
jaku promjenu mjerenih varijabli koje bi se mogle pripisati djelovanju ksenobiotika, iako
neke toksikološke studije ukazuju na česte promjene biometrijskih osobina timusa uslijed
djelovanja različitih pesticida najčešće kao kompenzacijskog mehanizma za nadoknadu
funkcije koštane srži (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994).
Moglo bi se reći da je u uvjetima ovog pokusa prometrin djelovao na timus stimulirajuće u
skupina A i B (iako se staničnost povećava a masa smanjuje, koje bi bilo pravo
objašnjenje ove pojave, neznam, iako mogu spekulirati da se radi o kombiniranoj pojavi
hiperplazije s istovremenom volumnom atrofijom svih prisutnih stanica).
Analiza rezultata protočne citometrije timocita anexinom V-FITC i PI pokazuje da u
skupini C dolazi do značajne promjene omjera vitalnih, nekrotizirajućih i apoptotičnih
stanica stanica ali ne dolazi do ikakvih promjena u težini ili celularitetu timocita. Naime
sve opisane stanice su još uvijek žive ali se povečao broj onih koje se spremaju ući u
nekrozu ali i oni koje namjeravaju ući u apoptozu. Dakle, duža izloženost visokim dozama
prometrina mogla uništavati timusne stanice u mladih jedinki uzrokujući dalekosežne
posljedice na buduću spremnost imunološkog sustava za susret sa patogenima. Analiza
protočne citometrije dala je posebno zanimljive rezultate na splenocitima. Naime u slezeni
je održan status vitalnosti stanica kao i u kontrole što znaći da u usporedbi s
histopatološkim rezultatima najvjerojatnije dolazi do repopulacije slezene ili
hiperproliferacije novim stanicama koje održavaju omjer apoptotičnih, nekrotićnih i
vitalnih u razini sa neotrovanim životinjama dakle sa normalnim stanjem.
Sekundarni limfatični organi limfni čvorovi, pokazuju reakciju, što bi moglo značiti da se
ksenobiotik i njegovi metaboliti (najvjerojatnije prisutni kao hapteni) šire i limfom.
Iako postoji preporuka (!ali ne i pravilo) da se pri oralnoj administraciji za analizu uzmu
neki limfni čvorovi koji se nalaze na direktnom putu prolaska otrova (primjerice
mesenterički limfni čvorovi) (Descotes 2001.), za analizu u ovom pokusu namjerno su
uzeti periferni, dormantni limfni čvorovi, daleko od direktnog puta širenja otrova, kako bi
216
se otkrila sistemska toksična priroda ispitivanog spoja, dakako histopatološki analizirana
su i limfatička tkiva probavila (GALT, MALT), koja se nalaze izravno na putu prodiranja
otrova, pri čemu je pokazano da je reakcija na ksenobiotik jaka poglavito u crijevu, što je
već spominjano u raspravi.
U analiziranim aksilarnom i brahijalnom limfnom čvoru, dolazi do povećanja, kako mase
tako i celulariteta, tj. zaključuje se da je također potaknuta imunološka reakcija.
S obzirom na to koliki je ukupni maseni udio retikuloendotelnog tkiva, odnosno samo
limfnih čvorova u pojedinoj jedinki, dolazimo do zaključka da je takva promjena izuzetno
značajna i spada u teže patofiziološke lezije uzrokovane prometrinom. Protočna
citometrija pokazuje u stanica limfnog čvora isti trend kao i u timocita, tj da najmanje
doze više podstiću apoptozu a najveće doze nekrozu. Biološko značenje ovih podataka je
takvo da je prometrin potencijalni signalni faktor ili podstrekać lučenja mnogih
apoptotičnih signalnih molekula za ulazak stanica imunološkog sustava u apoptozu.
Ekotoksikološki je ova spoznaja vrlo bitna za zdravlje čovjeka, jer je on tijekom duže
vremena izložen manjim dozama koje onda bez vidljivih patoloških promjena (kao što to
rade nekrotične smrti stanica), potiho desetkuje obrambene elemente imunološkog sustava
apoptozom-programiranom smrću.
S obzirom na ispred navedenu raspravu o rezultatima analize učinaka prometrina na
kvantitativne i kvalitativne sastavnice imunohematopoetskog sustava (uglavnom
biometrijske, a ne funkcijske biomarkere), te s obzirom da se radilo o visokosrodnim,
singeničnim životinjama istog soja i istovrsne dobi, sumarno bi se ukratko moglo reći da
prometrin potstiče reakciju imunokompetentnih struktura (imunostimulant), indirektnim
mehanizmom ubijanja stanica, tjerajući imunohematopoetske organe i tkiva da
repopuliraju održavanjem homeostaze, narušavajući s vremenom njihov ustroj,
funkcionalnu morfologiju, a time i fiziološku ulogu (imunosupresor). i stoga (indirektno, u
kasnijim fazama kronične izloženosti), iscrpljuje organizam i umanjuje mu
imunokompetencije.
U buduću analizu također obvezno treba uključiti i druge organe poput primjerice kože,
pluća ili srca i njihove specifične biokemijske krvne parametre.
Interesantno bi bilo većinu budućih pokusa provesti na neuronima, perifernom i
centralnom živčanom sustavu. Također treba provesti još neka diferencijalno-
217
histokemijska bojenja, poput primjerice amiloidnog bojanja (dokaz amiloidoze, pogovu
primjerice u mozgu, radi mogućih implikacija Alzheimerovoj bolesti sličnog učinka) ili
primjerice lipofuscinskog bojenja (pogotovu na srcu i/ili mišićima).
Guilyanovim bojenjem primjerice trebalo bi pokazati intenzitet oštećenosti živčanih
vlakana, jer prema kemijskim svojstvima, ali i prema Hemalaon-eozinskim preparatima
mozga skupine C, očito je da prometrin prolazi krvno-moždanu barijeru uzrokujući lezije i
najvjerojatnije nekrotične smrti neurona.
Posebnu pozornost također u budućim pokusima trebalo bi posvetiti poprečnoprugastim
mišićima na način da se elektroforezom mišićnih proteina, elektroforetskom i
imunokemijskom analizom kliničke enzimologije, monoklonalnim protutjelima na
kriostatskim rezovima ili nekom od imuno blot-metoda pokažu točnije i pobliže
biokemijske promjene na koje ukazuju rezultati ove studije.
218
6. ZAKLJUČAK
219
6. ZAKLJUČAK
Temeljem rezultata pokusa subkronične izloženosti mužjaka i ženki miševa prometrinu,
iznosimo slijedeće zaključke:
Prometrin, apliciran per os u dozama od 185 mg/kg, 375 mg/kg i 555 mg/kg, tijekom 28
dana svakih 48 utječe na metabolizam. Proporcionalno s dozom povećava se serumska
aktivnost LDH, y-GT, AlP, smanjuje se koncentracija kreatinina, a vrlo blago ali značajno
raste aktivnost AST i nešto manje aktivnost ALT. De Ritiusov se koeficijent s dozom
bitno ne mijenja.
Status istih enzima u organima mijenja se sa rastućom dozom, proporcionalno za LDH
u poprečnoprugastom mišićju a obrnuto proporcionalno u jetri. S porastom doze u jetri
proporcionalno raste aktivnost sukcinat-dehidrogenaze, esteraze i kisele-fosfataze i
umjereno AlP. Proporcionalno s dozom raste i koncentracija glutationa. U jetri narušava
biokemijsku ravnotežu uzrokujući promjene u metabolizmu ugljikohidrata, te nastaje
mikrosteatozna masna degeneracija i hidropična vakuolizacija unutar hepatocita. Također
unutar jetre narušena je lobularna strukturalna uređenost uzrokovana nekrotičnim
propadanjem hepatocita, a najvjerojatnije nastaje i bilijarna opstrukcija. U bubregu
prometrin uzrokuje lezije pojedinih glomerula i ispunjenost pojedinih glomerula krvlju. U
tankom crijevu uzrokuje propadanje crijevnog epitela i morfološke promjene crijevnih
resica. U mišićju narušava biokemijsku ravnotežu.
Prometrin naročito u prva dva tjedna izloženosti uzrokuje smanjenje broja eritrocita i
povećanje broja leukocita u perifernoj krvi. Među leukocitima mjenja se omjer pojedinih
tipova stanica od kojih se najveće povećanje broja bilježi među bazofilima, a najveće
smanjenje broja među limfocitima. Rezultati analize komet testa leukocita pokazuju
statistički značajna oštećenja integriteta stanične DNA, karakterizirana povećanom
lomljivošću DNA molekule sa porastom doze. Iz navedenoga se vidi da prometrin ima
potencijalne genotoksične sposobnosti proporcionalno porastu doze i vremenu izloženosti,
iako u nijedne životinje nisu nađene neoplastične tvorbe.
220
Nadalje, povećava se broj limfocitnih stanica u različitim tkivima. Do hiperplazije i
infiltracije imunokompetentnih stanica dolazi u tankom crijevu, poprečnoprugastom
mišićju i slezeni gdje je naročito narušena histološka građa, iako je u njoj broj stanica
nepromjenjen, a prisutne stanice nisu u apoptotičnim ili nekrotičnim fazama. Najmanje
doze više podstiću apoptozu, a najveće doze nekrozu u stanica limfnog čvora i u timocita.
Zaključno moglo bi se govoriti o prometrinu kao o otrovu koji ima imunotoksični,
hematotoksični, hepatotoksični, nefrotoksični, genotoksični i nadasve miotoksični učinak.
221
7. LITERATURNI IZVORI
LITERATURNI IZVORI Alnemri ES, Litwack G(1989) Glucocorticoid - induced lymphocytolysis is not mediated by an induced endonuclease. J. Biol. Chem. 264: 4104-4111.
Arnold M (1968) Histochemie-Einführung in Grundlagen und Prinzipien der Methoden. Springer-Verlag (ed) Berlin, Heidelberg, New York. Bacci G, Ferrari S, Longhi A (1999) Prognostic significance of serum LDH in Ewing Sarcoma of bone. Oncologic reports 6: (4), 807-811. Baratov KB (1979) Dependence of some trace element levels in vegetable products on the application of herbicides in the Tadzhik SSR. Gig. Sanit. 44: (8), 77-78. Baratov KB, Redler IO, Danilova RV, Usmanov UM, Makhmudov DM, Rasulov A, Ergashev AE, Osmanov U (1981) Zavisimost' soderzhaniya nekotorykh mikroelementov v vinograde i abrikosakh ot vida, dozirovki gerbitsidov. [Relationship between the type and dose of herbicide and the content of certain trace elements in grapes and apricots.] Vopr. Pitan. 2: 66-68.
Bardalaye PC, Wheeler WB (1985) Capillary gas chromatographic determination of prometryn and its degradation products in parsley. J. Assoc. off Analytical Chemistry: 68: (4), 750-753. Beard J (2005) DDT and human health. Science of the total enviroment. In press.1-12. Bengtsson GB, Karlsson BW (1980) Ontogenetic Changes in lactate dehydrogenase and malate dehidrogenase isozyme patterns of the mongolian gerbil as compared with the rat mouse and rabbit. Comparative Biochemistry and Physiology: Part B: 32-34. Berg M, Müller SR, Schwarzenbach RP (1995) Simultaneous determination of triazines including atrazine and their major metabolites hydroxyatrazine, desethylatrazine, and deisopropylatrazi-ne in natural waters. Analytical Chemistry 67: (11), 1860 -1865. Berlin A, Dean J, Draper MH, Smith EMB, Spreafico F (1987) Immunotoxicology-Proceedings of the international seminar on the immunological system as a target for toxic damage, present status, open problems and future perspectives. UNEP, ILO, WHO-IPCS, Commission of the EC, Martinus Nijhoff Publishers, Int. 267
223
Bester K, Huehnerfuss H (1996) Triazine herbicide concentrations in the German Wadden Sea. Chemosphere 32: (10), 1919-1928.
Bezuglov VG, Minenko AK, Postoeva RA (1976) Herbicides in crop rotation and soil microflora. Khim. Sel. Khoz 14: (12), 45-49. Blake NM, Kirk RL, Pryke E, Sinnett P (1968) Lactate dehydrogenase Electrophoretic Variant in a New Guinea highland population. Science 207: 701-702. Böcher M, Giersch T, Schmid RD (1992) Dextran, a heptan carrier in immunoassays for s-triazines, a comparison with ELISAs based on hapten-protein conjugates. Journal of Immunological Methods 151: 1-8. Böcher M, Sorensen K (1994) Direct couplingof an atrazine analogue to microtiter plates for a competitive immunoassays for s-triazines. Food and Agricultural Immunology 6: 155-161. Bognar A (1977) Culinary reduction or elimination of pesticide residues from edible plant products. Dtsch. Lebensmittel-Rundschau 73: (5) 149-157. Boscolo P, Carmignani M, Sacchettoni-Logroscino G, Carelli G, Bernardini P (1982) Chronic exposure to arsenic in rats: morphological and functional findings. Giornale Ital. Med. Lav. 4 (4-5): 169-174. Boyer SH, Feiner DC, Watson-Wiliams EJ (1963) Lactate dehydrogenase variant from human blood: evidence for molecular subunits. Science 141: 642-643. Brain RT, Davenport-Kay H (1927) Kidney phosphatase.II the enzyme in disease. Biochemical Journal 21: 1104-1108. Burkhart JG, Benziger J, Svensson K, Malling HV (1985) An evaluation of heterologous antibodies to lactate dehydrogenase-C in the detection of mutation. Mutat Res 148 (1-2): 135-149. Capsoni S, Ruberti F, Daniel ED, Cattaneo A (2000) Muscular dystrophy in adult and aged anti-NGF transgenic mouse resembles an inclusion body myopathy. Journal of Neuroscience research 59: 533-560. Chandra J, Samali A, Orrenius S (2000) Trrigering and modulation of apoptosis by oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 29: 323-333
Chayen J, Bitensky L (1991) Practical Histochemistry, John Wiley & Sons, (ed) Chichester England. 258.
224
Chiba M, Maley MA, Klein-Szanto AJ (2005) Sequental study of gamma-glutamyltransferase during complete and two-stage mouse skin carcinogenesis. Cancer Research 46: (1), 259-263. Chikhi N, Holic N, Guellaen N, Lapareche Y (1999) Gamma-glutamyl transpeptidase gene organisation and expression: a comparative analysis in rat, mouse, pig and human species. Comp. Biochm. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 122: (4) 367-380. Clampitt RB, Hart RJ (1978) The tissue activityes of some diagnostic enzymes in ten mammalian species. Journal of Comparative Pathology 88: (4), 607-621. Cruz OOJD, Waurzyniac B, Uckun FM (2004) A13-week subchronic intravaginal toxicity study of Pokeweed antiviral protein in mice. Phytomedicine 11: 342-351. Constantinou A, Mehta R, Runyan C, Rao K, Vaughan A, Moon R (1995) Flavonoids as DNA topoisomerase antagonists and poisons: structure-actyvity relationships. J. Nat. Prod. 58: 217-225.
Dawson J, Smith GD, Boak J, Peters TJ (1979) y-glutammyltransferase in human and mouse breast tumors. Clin. Chem. Acta 96: (1-2) 37-42. Descotes J (1988) Immunotoxicology of drugs and chemicals. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), Int. 189.
Descotes J (1999) An Introduction to Immunotoxicology. Taylor and Francis Int. (ed) 211. Di Fiore MSH (1967) An Atlas of Human Histology. Lea & Febriger (ed) Philadelphia 346. Dinerman AAJR, Lavrent'eva NAJR, Ill'inskaia NAJR (1970) The embryotoxic action of some pesticides. Gigiena and Sanit. 35: (7): 39-42. Dinerman Lavrent'eva NA AA (1969) The toxicity of the herbicides propazine and prometryn. Gigiena i Sanit 34: (3) 94-96.
Doening CB, Parker ET, Nicholas EC, Lollar P (2003) Decreased factor VIII levels during acetaminophen-induced murine fulminant hepatic failure. Blood, 102: (5) 1743-1745.
225
Egert G, Greim H (1976) Formation of mutagenic nitroso-compounds from ephedrine and from the pesticides carbaryl, dodin, and prometryn in the presence of nitrite at pH 1. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 293 (Suppl.): R66. Egert G, Greim H (1976) Formation of mutagenic N-nitroso compounds from the pesticides prometryne, dodine and carbaryl in the presence of nitrite at pH 1. Mutat Res. Nov; 37: (23) 179-186. EPA-Health effects test guidelines OPPTS 870.7800. Immunotoxicity. Public Draft EPA 712-C-96-351, USA; 1996.
EPA-IRIS (Integrated Risk Information System)-Prometryn. CASRN 7287-19-6. http://www.epa.gov/ngispgm3/irissubst/0258; 2001.
Fairbain DW, Olive PL, O`Neill KL (1995) The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research 339: 37-59. Ferrandina G, Almadori G, Maggiano N, Lanza P, Ferlini C, Cattani P, Piantelli M, Scambia G, Ranelletti FO (1998) Growth-inhibitory effect of tamoxifen and presence of tipe II estrogen binding sites in human laryngeal cancer cell lines and primary laryngeal tumors. Int. J. Cancer. 77: 747-754.
Fiveland TJ (1977) Residues of linuron and prometryne in carrots and decom position in soil in Southern and Northern Norway. Forsk. Fors. Landbruket 28: (4) 345-363. Franković M (1990) Učinak hormonskog herbicida 2,4-D (2,4-diklorfenoksioctena kiselina) na enzimatsku aktivnost u štakora. Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. 63 Fudge AM (2000) Laboratory Medicine, Avian and Exotic Pets. W. B. Saunders Company International. 295. Gabrilevskaia LN, Laskina VP (1972) Conditions for disposal of effluents from prometryne production into bodies of water. Gig Sanit 37: (3) 18-21. Gammon DW, Aldous CN, Carr WC, Snaborn JR, Pfeifer KF (2005) A risk assesment of atratine use in California: human health and ecological aspects. Pest management science 61: (4) 331-335.
226
Galati G, Teng S, Moridani MY, Chan TS, O'Brien PJ (2000) Cancer chemoprevention and apoptosis mehanisms induced by dietary polyphenolics. Drug. Metabol. Drug. Interact. 17: 311-349.
Ghinea E, Simionescu L, Oprescu M (1980) Studies on the action of pesticides upon the endocrines using in vitro human thyroid cells culture and in vivo animal models. II. Herbicides-prometrin and terbutrin. Endocrinologie 18: (3) 167-173. Giardina MC, Buffone R (1977) Pathway of initial prometryn degradation by a soil bacteria. Chemosphere 6: (9) 589-594.
Giersch T, Hock B (1990) Production of monoclonal antibodies for the determination of s-triazines with enzyme immunoassays Food Agric Immunol 2: (2). 85-98. Giurgea R (1979) Reaction to atrazine and prometryne in the thymus of white Wistar rats. Stud Cercet Biol; 31: (2) (RECD. 1980). 119-122. Giurgea R, Borsa M, Bucur N (1981) Immunological reactions of Wistar rats following administration of atrazine and prometryne. Arch Exp Veterinarmed 35: (6) 811-815. Glasnik zaštite bilja-glasilo sekcije za biljnu zaštitu Hrvatskog agronomskog društva 2-3, 2000. 123-125. Zadružna štampa d.d., Zagreb. 2000. Glavač V (2001) Uvod u globalnu ekologiju. Hrv. Sveučilišna naklada, Zagreb. 163. Gopal DV, Rosen HR (2000) Abnormal findings on liver function tests-Interpreting results to narrow the diagnosis and establish a prognosis. The Practical Peer-reviewed Journal for Primary Care Physicians 107: (2) 1-12. Gordienko NI (1977) [Hygienic establishment of the maximum permissible concentration of the herbicide, prometryne, in soil] Gig Sanit. (1): 22-25. Greim H, Bimboes D, Egert G, Goggelmann W, Kramer M (1977) Mutagenicity and chromosomal aberrations as an analytical tool for in vitro detection of mammalian enzyme-mediated formation of reactive metabolites. Arch Toxicol. 39: (1-2):159-169. Guppy LJ, Littleton JM (1999) Incrsed sensitivity to dammging effects of hypoxia and anoxia of isolated hearts from rats after prolonged exposure to ethanol: apparent protection by nitrendipine. Journal of cardiovascular Pharmacology 34: (5) 628-634.
227
Gzhegotskii MI (1968) Changes in the peripheral blood under the acute and chronic action of anti-Gramineae herbicides which act via the roots. Gigiena Truda i Prof. Zabolevaniya 12: (12) 42-43. Hakenberger - Kutuzović (2001) Optimizacija praćenja modela onečišćenja voda pomoću molekularnih biljega u riba. Doktorska disertacija. Poslijediplomski studij prirodnih znanosti. Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. 169. Handy RD, Abd El- Samei HA, Bayomy MFF, Mahran AM, Abdeen AM, El-Elamy EA (2002) Chronic diazinon exposure: pathologies of spleen, thymus, blood cells and lymph nodes are modulated by dietary protein or lipid in the mouse. Toxicology 172: 13-34. Haukić S, Kosuta D, Muminhodžić K (2005) Comparison of postoperative hepatic funcion between laparoscopic and open cholecystoctomy. Med. Princ. Pract. 14: (3) 147-150. Haussler MR, Nagode LA, Rasmussen H (1970) Induction of intestinal brush border alcaline phosphatase by vitamin D and identity with Ca-ATP-ase. Nature 28: (19) 1199-1201. Heinisch E, Reifenstein H (1971) Herbicide residues in foods of vegetable origin. Ernaehrungsforschung 16: (4) 605-615. Hirano S (1996) Evolution of pulmonary toxicity of heavy metal componds. Nippon Eiseigaku Zasshi 50: (6), 1013-025. Howard J, Worman MD (2005) Common laboratory tests in liver diseases. http://cpmcnet.columbia.edu/dept/gi/labtests.htm/. 1-3. http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/Webpacages/assytxt.htmlClinicalchemistry2005 The significance of creatinine in renal desease (2004) http://rnceus.com/renal/renalcreat.html 2004 Clinical chemistry of LDH, GGT, ALP, AST, ALT(2005) http://marvester 2005 Hulin N, Henis Y, Horowitz M (1973) Microbial degradation of prometryne in soil. Phytoparasitica1 (1) 65. Inui T, Nakashima H, Habu Y, Nakagawa R, Fukasawa M, Kinoshita M, Shinomya N, Seki S (2005) Neutralization of tumor necrosis factor abrogates hepatic failure induced by α-galactosylceramide without attenuating its antitumor effect in aged mice. Journal of Hepatology in press. 1-10.
228
Ivanova Ye P, Nekrasova AS, Bakanov Sh A, Mayorova R I (1973) The efficacy of prometryne for weed control in carrot cultivation and its residues occurring in the crop and soil. Khim. Sel. Khoz. 11: (7) 541-543. Iwangoff P Armabruster R, Enz A, Meier-Ruge W (1980) Glycolitic enzyms from human autoptyc brain cortex: normal aged and demented cases. Mech. Ageing. Dev. 14: (1-2) 203-209. Jaeger JJ, Hedegaard H (2002) About blood tests. The Danish Hepatitis C web site. http://home3.inet.tele.dk/omni/attest.htm/. 1-15. James RW (1993) The relevance of clinical pathology to toxicology studies. Comparative haematology int. 3, 190-195. James RW (1999) Preclinical testing of antibodies safty aspects. In: Biotechnology, ed. Rehm HJ, Reed G in cooperation with Puhler A and Stadler P. Wiley-VCH, WeinheimFR Germany, 5a, 304-309. Kalender S, Ogutcu A, Uzunhisarcikli M, Acikgoz F, Durak D, Ulusoy Y, Kalender Y (2005) Diazinon-induced hepatotoxicity and protective effect of vitamin E on some biochemical indices and ultrastructural changes. Toxicology in press, 1-10. Kamrin MA, Montgomery JH (2000) Agrochemical and pesticide desk reference. CD-ROM, Chapman & Hall CRC net BASE, Int. Kaneko JJ, Harvey JW, Bruss M L (1997) Clinical Biochemistry of Domestic Animals; Academic Press Int. 789. Kavolyunayte IA, Shpokauksas AK (1974) Prometryn residues in potatoes and soil. Khim. Sel. Khoz. 12 (1): 54-57. Kawagoe M, Hirasawa F, Wang CS, Liu Y, Ueno Y, Sugiyama T (2005) Orally administrated rare earth element cerium induces metallothionein synthesys and increases glutathione in the mouse liver. Life Sciences in press. 1-16. Khan MS, Sobti RC, Kataria L (2005) Pesticide induced alteration in mice hepato-oxidative status and protective effects of black tea extract. Clinica Chimica Acta in press. 1-8. Kniewald J, Kniewald Z (1983) Effects Of S-Triazine Herbicides On The Mode Of Androgen Action On Calf Pituitary. Periodicum Biologorum 85 Supplement 1: 115-121.
229
Kniewald J, Mildner P, Kniewald Z (1979) Effects of s-triazine herbicides on hormone-receptor complex formation, 5 alpha-reductase and 3 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase activity at the anterior pituitary level. J Steroid Biochem. 11: (1C) :833-838. Kniewald J, Osredecki V, Gojmerac T, Zechner V, Kniewald Z (1995) Effect of s-triazine compounds on testosterone metabolism in the rat prostate. J Appl Toxicol. 15: (3) 215-218. Koolman J, Röhm KH (1996) Color Atlas of Biochemistry. Thieme International. Kopperschlager G, Kirchberger J (1996) Methods for the separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme.Journal of chromatography B. Biomed Appl. 20: 684 (1-2), 25-49. Kruse - Jarres J (1979) Klinische chemie,Band II, Yspezielle klinish-chemishe analytik. Moderne Laborpraxis, Gustav Fisher Verlag. Stuttgart. 288. Kulakov AE (1970) Cytogenetic analysis of bone marrow cells in rats under the action of herbicides from the s-triazine group. Farmakol. and Toksikol. 33: (2), 224-227. Larsson NG, Oldfors A (2001) Mitochondrial myopathies. Acta Physiology Scandinavica 171: 385-393. Lee G, Luna H T (1970) Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. McGrow-Hill book Company, Int.(ed) Leh B, Žinko B, Narat M, Marinšek-Logar R (2005) Monitoring of genotoxicity in drinking water using in vitro comet assay and Ames test. Food Technology and Biotechnology 43: (2) 139-146. Li S, Zhou W, Dogilo L, Goldberg E (1998) Transgenic mice demonstrate a testis specific promoter for lactate dehydrogense, LDHC, The Journal of Biological Chemisty 273: (47) 31191-31194. Li Shoei - Lung S (1998) Structure, regulation and evolution of vertebrate lactate dehydrogenase genes. Zoological studies 37: (1) 1-6. Li Shoei - Lung S, Feldmann RJ, Okabe M, Pan YCE (1983) Molecular features and imunological properties of lactate dehydrogenase C4 isozymes from mouse and rat testes. The Journal of Biological Chemstry 258: (11) 7017-7028.
230
Madar I, Giurgea R (1981) The effect of Atrazine and Prometryne on the glucose consumption and the insulin-sensitivity of diaphragms of white rats. Stud Cercet Biol Ser Biol Anim; 33: (2). (RECD. 1982). ) Mady EA (2002) Antitumor and biochemical effect of Echis coloratus crude venom on Ehrlich ascites carcinoma cells in vivo. Journal of Venomous Animals and Toxins 8: (2) 1-8. Martynyuk VZ, Gzhegotskii MI, Shtabskii BM (1970) A sanitary-toxicological characterization of the herbicide Prometryne. FAKT VNESHN SREDY ZNACHENIE ZDOROV'YA NASE (2): 64-69.
Maryanska-Nadachowska A (1980) The effect of a pesticide, Gesagard 50, on regeneration of the endbrain of Xenopus laevis (Daud.) Tadpoles. Folia Biol (Krakow) 28: (4) 375-389.
Masatoshi I, Akihiro Y, Akihiro H, Kaneoka Y (1998) LDH to AST ratio in biliary pancreatitis-a posible indicator in pancreatic necrosis: preliminary results. The American Journal of Gastroenterology 93: (3), 363-367. Matsusawa T, Nomura M, Unno T (1993)Clinical pathology reference ranges of laboratory animals. Working group II, nonclinical safty ealuation subcomittee of the Japan Pharmaceutical manufactures assotiation. J. Vet. Med. Sci. 55: (3)351-362. Maynard M S, Brumback D, Itterly W, Capps T, Rose R (1999) Metabolism of [(1)(4)C] prometryn in rats. Journal of Agricultural food and Chemistry 47: (9): 3858-3865. Mays ET (1975) Physiologic consequences of hepatic lobectomy in man. South Medical Journal 68: (4), 399-406. McClure D (1999) Clinical pathology and sample collection in the laboratory rodent. Vetrinary Clinics of North America: Exotic Animal Praxis 2: 3, 565-589. Messow A, Benkwitz F, Hellwig A (1990) Studies on the toxicity of a prometryne and simazine combination in lactating rats. z gesamte hyg grenzgeb 36: (3) 170-173. Moses GC, Henderson AR (1987) Incrised serum lactate dehydrogenase isoenzyme 1 and «flipped» LD-1/LD-2 ratio in myopathy associated with partial carnitine palmytoyltransferaze deficiency. Clinical Chemistry 33 (11), 2111-2113.
231
Naz RK, Vanek MC (1998) Testis-specific proteins and their role in contraceptive vaccine development. Frontiers in bioscience 3, 39-48. Niida S, Kwahara M, Ishizuka Y, Ikeda Y, Konodo T, Hibi T, Suzuki Y, Ikeda K, Taniguchi N (2004) y-glutamyltranspeptidase stimulates receptor activator of nuclear factor κB ligand expression independent of its enzymatic activity and serves as pathological bone-resorbing factor. The Journal of Biological Chemistry 279: (7) 5752-5756. Olive PL. (1999) DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology. International Journal of Radiation Biology 75: (4) 395-405.
Olsson PG, Tsjuioka H, Narisawa S, Goldberg E, Millan JL (2003) An abundance of repetitive sequence elements in the mouse testis specific lactate dehydroenase gene. Journal of andrology, 24: (6) 918. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. (2001.) Ur.: Smith A. D. Butler and Tanner Ltd., Great Britain. Park B, Jeong SK, Lee WS, Seong JK, Palk YK (2004) A simple pattern clasification method for alcohol responsive proteins that a differentialy expressed in mouse brain. Proteomics 4: 3369-3375. Pavelić J, (1977) Kvantitetne i kvalitetne promjene hematopoetskih stanica miševa s aplastičnim karcinomom. Magistarski rad, Zavod za animalnu fiziologiju, Zagreb. 73. Perez DO, Krutzik PO, Nolan PG (2004) Flow cytometric analysis of kinaze signaling cascades. In: Methods in Molecular Biology: Flow cytometry Protocols 2nd edition. ed. Hawly TS & Hawly RG. Humana Press Inc., Totowa, NY. 67-93. Pratt DS, Kaplan MM (2000) Evaluation of abnormal liver enzyme results in asymptomatic patients. The New England Journal of Medicine. 342: (17), 1266-1271. Piperakis SM, Visvardis EE, Tassiou AM. (1999) Comet assay for nuclear DNA damage. Methods in Enzymology 300: 184-194.
Radman P, Harapin I (1998) Interna klinička propedeutika domaćih životinja, izd. Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb. ISBN 953-6062-08-9. Rajab P, Fox J, Rijaz S, Tomlinson D, Ball D, Greenhaff L (2000) Sceletal muscle myosin havy chain isoforms and energy metabolsim after clenbuterol treatment in the rat. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 279: R1076-R1081.
232
Raszyk J (1986) Physical, chemical and biological study of dust from large-scale pig farms. Vet. Med. (Praha) 31: (4) 233-244. Reifenstein H, Pank F (1975) Triazine residues in medicinal plants. Pharmazie. 30: (6) 391-3. Rozek M (1978) The effect of the S-triazine herbicides Gesatop 50 and Gesagard 50 on oogenesis of Pterostichus cupreus L., Pterostichus melanarius Ill., and Agonum dorsale Pnt. (Coleoptera : Carabidae). Folia Biol (Krakow) 26: (3) 171-179. Rughinis D, Caramete A, Rus V, Diaconu E (1977) Herbicide residues in vegetables and soil. An. Inst. Cercet. Prot. Plant., Acad. Stint. Agric. Silvice 12: 449-455. Sanchez O, Arnau A, Pareja M, Poch E, Ramirez I, Soley M (2002) Acute stress-induced tissue injury in mice: differences between emotional and social stress. Cell Stress and Chaperons 7: (1) 36-46. Santos FW, Zeni G, Roscha JBT, Weis SN, Fachinetto JM, Favero AM, Nougueira CW (2005) Diphenyl diselenide reverses cadmium –induced oxidative damage on mice tissues. Chemico-Biological Interactions 151: 159-165. Sauviat MP, Pages N (2002) Cardiotoxicity of lindane, a gamma isomere of hexachlorocyclohexane. J. Soc. Biol. 196: (4) 339-348. Schatz L Segal H (1969) Reduction of α- ketoglutarate by homogenous lactic dehydrogenase X of testicular tissue. Journal Biological Chemistry 244: (16) 4393-4397. Schmidt E, Schmidt F W (1968) Fundamentals of Diagnostic Enzymology; Medizinische Hochschule Hannover and Boehringer & Soehne GmbH Boehringer Mannheim GmbH, Biochemical Department Germany. 52.
Schmidt RF, Willis WD, Reuss L (2000) Memorix Physiology. Chapman & Hall Medical, Int. 281. Shtabskiy B M (1976) Cumulative properties and gonadotoxic effects of chemical substances. Gig. Sanit. 41 (1): 82-84. Silva LP, Miyasaka CK, Martins EF, Leite YRSA, Lacava ZGM, Curi R, Azevedo RB (2004) effect of bullfrog (Rana catesbeiana) oil administrated by gavage on the fatty acid composition and oxidative stress on mouse liver. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 37: 1491-1496.
233
Singh M, Rishi S (2005) Plasma acetylcholinesterase as a biomarcer of trazophos neurotoxicity in young and adult rats. Enviromental Toxicology and Pharmacology 19: 471-476. Singh NP, Stephens RE, Schneider EL. (1994) Modifications of alkaline microgel electrophoresis for sensitive detection of DNA damage. International Journal of Radiation Biology 66; 23-28.
Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider LL. (1988) A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research 175: 184-191.
Springer O, Rožić M, Košuta-Špoljar D (1986) Effects of s-Triazine herbicide atrazine on immunohematopoietic organs in CBA mice. Periodicum Biologorum 88: (Supp. 1) 137-138 a. Springer O, Rožić M, Škrinjar Lj, Grgić Z (1986) Comparative response of mice to insecticide lindane, dinitrobutyl-phenol and parathion. Periodicum Biologorum 88: (Supp. 1) 139-140 b. Springer O, Škrinjar Lj, Grgić Z (1983) The Effect of pesticide lindane on hematopoietic tissue. Periodicum Biologorum 85: (Supp. 3) 123-125. Stevens JT, Breckenridge CB, Wetzel LT, Gillis JH, Luempert LG, Eldridge JC (1994) Hypothesis for Mammary Tumorigenesis in Sprague-Dawley Rats Exposed to Certain Triazine Herbicides Journal of Toxicology and Environmental Health 43: (2) 139-153. Stout RL (2005) Serum chemistries, cotinine, blood alcohol and carbohydrate deficient transferin. CRL News & Views 5: 1. Strayer L (1991) Biokemija. Školska knjiga, Zagreb. 876. Suggitt M, Fearnley J, Swaine DJ, Volpato M, Phillops RM, Bibby MC, Loadman PM, Anderson D (2003) Comet assay and flow cytometry of DNA repair in normal and cancer cells treated with known mutagens with different mechanisms of action. Teratogenesis, Carcinogenesis and Mutagenesis, Supplment 2, 13-29.
234
Suri A (2004) Sperm specific proteins –potential candidate moleculs for fertility control. Reproductive biology and endocrinology 2 (10), 1-16. Svobodova Z, Piačka V, Vykusova B, Machova J, Hejtmanek M, Hrbakova M, Bastl J (1995) Residues of pollutants in siluriformes from various localities of the Czech Republic. Acta Vet. Brno 64x: 195-208. Štraus B (1992) Medicinska biokemija-drugo dopunjeno i obnovljeno izdanje. Medicinska naklada. Zagreb. 1209. Temperli K, Turler H, Ercegovich CD A Mode of Action of Pesticides I. Incorporation of S Triazines ( Cyanuric Acid and Prometryne ) into Bacterial Nucleic Acid , Z Naturforsch; 21b:903-4, 1966 ). Tezak Z, Simic B, Kniewald J (1992) Effect of pesticides on oestradiol-receptor complex formation in rat uterus cytosol. Food Chem Toxicol. 30: (10) 879-885. Thiruchelvam M, Brockel B J, Richfield E K, Baggs R B, Cory-Slechta D A (2000) Potentiated and preferential effects of combined paraquat and maneb on nigrostiatal dopamine systems: environmental risk factors for Parkinson disease. Brain Research 873: 225-234 a. Thiruchelvam M, Richfield E K, Baggs R B, Tank A W (2000) Cory-Slechta D.A. The nigrostriatal dopaminergic system as a preferential target of repeated exposures to combined Paraquat and Maneb: Implications for Parkinson´s disease. The Journal of Neuroscience 20: (24) 9207-9214 b. Timbrell J (2000) Principles of Biochemical Toxicology. Taylor & Francis, Int.ed. Tuschl H, Landsteiner HT, Kovac R (2002) Application of the poplitheal lymph node assay in immunotoxicity testing: complemantion of direct popliteal lymph node assay with flow cytometric analyses. Toxicology 172: 35-48. Ulm L (1994) Učinak prenatalne i postnatalne ekspozicije herbicida 2,4-D na imunohematopoetski sustav miša. Magistarski rad, Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. Vianna MA, Vianna AG, Borges CTL, Borba FE, Calerio MTC, Bonfa E, Marie SKN (2004) Myositis in mixed connective tissue disease. Arq. Neuropsiquiatr 62: (4) 923-934.
235
Villarini M, Scassellati-Sforzolini G, Moretti M, Pasquini R (2000) In vitro genotoxicity of terutryn evaluated by the alcaline single-cell microgel-electorforesis «comet assay». Cell Biology and Toxicology 16: (5) 285-292. Walker CH, Hopkins S P, Sibly R M, Peakall D B (2001) Principles of Ecotoxicology. Taylor & Francis, Int. 197. Wallace-Hayes A (2001) Principles and Methods of Toxicology. Taylor & Francis, Int. (ed) 77-137, 243-285, 285-365, 917-959, 1415-1451. Wilem van der Laan J, Lovren H, . Vos J G, Dean J H , Hastings K L (1997) Immunotoxicity of pharmaceuticals: current knowledge, testing strategies, risk evaluation & consequences for human health. Drug Information Journal 33. 1301-1305. Williams KD, Maneke J D, AbdelHameed M, Hall R, Palmer T E, Kitano M, Hidaka T (1999) 52-week oral gavage chronic toxicity study with ubiquinone in rats with 4 week recovery. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 3756-3763. Wang IK, Lin-Shiau SY, Lin JK (1999) Induction of apoptosis by apigenin and related flavonoids trought cytochrome c release and activation of caspase-9 and caspase-3 in leucemia HL-60 cells. Eur. J. Cancer 35: 1517-1525.
Wuntch T, Vesell ES, Chen FR (1969) Studies on rats of abortive ternary complex formation of lactate dehydrogenase isozymes 244: (22) 6100-6104. Wyllie AH(1980)Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555- 556.
Wyllie AH(1993)Apoptosis. Br. J. Cancer 67: 205-208.
Zandbergen EG, de Haan RJ, Hijdra A (2001) Systematic review of prediction of poor in anoxic-ischaemic coma with biochemical markers of brain damage. Intensive Care Medicine 27: (10) 1661-7. Zar H J (1999) Biostatistical Analysis, Prentice Hall, New Jersey. 368.
236
ŽIVOTOPIS
DOMAGOJ ĐIKIĆ
Osobni podaci datum i mjesto rođenja: 31. 08. 1975., Zagreb
Obrazovanje 1989. – 1993. XII Gimnazija,Zagreb 1993. – 1999. Dodiplomski studij Biologije-Ekologije, Prirodoslovno-
matematički Fakultet 18.03.1999. Diplomirao u Zavodu za animalnu fiziologiju, na temu
Infracrvena i ultraljubičasta fotografija u biologiji sa odličnim uspjehom stekao zvanje
Dipl. Ing. Biologije smjer Ekologija
Svibanj, 1999. Upisuje poslijediplomski studij Toksikologija na PMF-u
25. 09. 2003. u Zavodu za animalnu fiziologiju obranjen magistarski rad naslovljen
«Imunohematotoksični učinci subtoksičnih doza herbicida prometrina u miša»
Radno iskustvo 01. 12. 2000. - danas Prirodoslovno-matematički fakultet. Biološki odsjek Zavoda za animalnu fiziologiju. Asistent na katedrama Ekotoksikologija, Neurofiziologija, Animalna Fiziologija, Osnove patofiziologije.
17. 05. 1999 –– 01. 12. 2000. Zoološki vrt Zagreb. Dipl. Ing. Biologije, u svojstvu Zoolog zoološkog vrta
Ostale aktivnosti radnog iskustva
11.– 19. 09. 2004. Instruktor na međunarodnom znanstvenom tećaju: EMBO, Practical Course-Anatomy and Embriology of the Laboratory Mouse. Zagreb University School of Medicine
Svibanj, 2004. Član Državnog povjerenstva Ministarstva znanosti
i tehnologije za Državno natjecanje škola iz biologije, polje-Fiziologija čovjeka
Studeni, 2004.-danas Voditelj sekcije Pauci, Studentske udruge
BIUS studenata biologije PMF-a,
Publikacije i znanstveni skupovi
Znanstveni radovi u znanstvenim časopisima Cvetinić Ž., Margaletić J., Đikić M., Glavaš M., Đikic D., Špičić S., Jurić I., Salajpal K. (2002) Rodents as posible reservoirs of leptospirosis in extensive swine breeding systems. Acta Agr. Kapos. Vol 6 No 2: 77-82 Sabočanec R., Đikic D., Čuljak K., Robić M., Kostelić A., Jurić I., Jerković I., Đikić M. (2002) Pathological changes in organs of clinically healthy Turopolje breed hogs. Acta Agr. Kapos. Vol 6 No 2: 83-91 Sažeci u zbornicima znanstvenih skupova Đikić D., Kemfelja S., Springer O. (2005) Hemocyte classification of the spider Geolycosa vultuosa (Araneae, Lycosidae), by giemsa, Pappenheim and acridine orange staining. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 63. Kemfelja S., Katušić L., Meštrović O., Kelava I., Jurić I., Majer M., Jurkas Ž., Zec M., Đikić D. (2005) Sekcija za pauke-udruga studenata BIUS. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 64. Kemfelja S., Katušić L., Meštrović O., Kelava I., Jurić I., Majer M., Đikić D. (2005) Usporedba rezultata višegodišnjeg istraživanja pauka na području JUPP Papuk. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 65. Heffer-Lauc M., Mojsović A., Đikić D., Biruš I., Schnaar R. I. (2004) Changes in the distribution of major brain gangliosides during vertebrate evolution. US/Japan Glyco 2004, Joint meeting of the Society for Glycobiology and Japanese Society of Carbohydrate Research. Honolulu, HI, USA, November 17.-20. 2004. Mojsović A., Heffer-Lauc M., Đikić D., Biruš I., Peternel H., Schnaar R. I., Lauc G. (2004) Changes in the distribution of major brain gangliosides during vertebrate evolution. Book of Abstracts. Congress of the Croatian Society of Biochemistry and Molecular Biology-with international participation. 30 th September-2nd October, Bjelolasica Croatia. P 107. Đikić D., Mojsović A., Biruš I., Peternel H., Schnaar R. I., Heffer-Lauc M. (2004) Comparative study of ganglioside expression in vertebrate central nervous system. Zbornik radova-1. hrvatsko-slovenski simpozij o egzotičnim i divljim životinjama. 25.-27. Studeni, Studeni, Zagreb. ISBN: 953-99864-0-0. P 59. Tadić Z., Lisičić D., Đikić D., Oršolić N., Horvat-Knežević A. (2004) Blood cell types and some plasma biochemical values in sand viper (Vipera ammodytes). Zbornik radova-1. hrvatsko-slovenski simpozij o egzotičnim i divljim životinjama. 25-27. Studeni, Zagreb. ISBN: 953-99864-0-0. P 60. Mojsović A., Peternel H., Đikić D., Schnaar R. I., Heffer-Lauc M. (2002) Evolutional pattern of gangliosides expression in spinal cord. 1st Croatian Congress on Molecular Life Sciences with international participation. Opatija, Croatia. Book of Abstracts. P 152 Đikić M., Jurić I., Rupić I., Gomerčić H., Djikic D. (2002) Turopolje pig tissue composition and proportion in carcass. Session 25. Developing sustainable breeding strategies in medium to low input systems. 7th World Congress on Genetics Applied to livestock Production. Montpellier, France. Congress papers. P 25-32.
Knjige i poglavlja u knjizi Đikić D. i sur. Ekološki leksikon, ur: Springer O. P. Barbat i ministarstvo zaštite okoliša, Zagreb 2001. Đikić D. Recenzija prevoda knjige: Neil Carter. Strategije zaštite okoliša-ideje, aktivizam, djelovanje. Ur. Oskar P. Springer. Barbat, Zagreb 2004. ISBN 953-181-056-7. Đikić M., Jurić I., Rupić V., Gomerčić H., Đikić D. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji-Turopoljska svinja, sastav trupa i masnih kiselina tkiva, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 143-148 Sabočanec R., Đikić D., Čuljak K., Robić M., Kostelić A., Jurić I., Jerković I., Đikić M. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji.Patološke promjene u organima klinički zdravih svinja, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 159-164 Cvetinić Ž., Margaletić J., Đikić M., Glavaš M., Đikić D., Špičić S., Juirić I., Salajpal K. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji-Glodavci kao mogući rezervoari leptospiroze u otvorenim sustavima držanja svinja, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 165-172
Dodatno usavršavanje tijekom poslijediplomskog magistarskog studija
FEBS Advanced Course on Glycoconjugates. Versatile Structures and Intriguing Functions, Dubrovnik, Croatia, 24-27 Rujan 2001. A training course: Microsatellites , mitohondrial DNA and conservation genetics. Principles and applications, Zagreb, Croatia 25-27 veljače 2002. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. DNA i RNA, Institut Ruđer Bošković, 12-16 Svibanj 2003. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. Stanice i proteini, Institut Ruđer Bošković, 26-30 Svibanj 2003. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. Konfokalna i fluorescencijska mikroskopija, Institut Ruđer Bošković, 2004.
Van nastavne aktivnosti tijekom dodiplomskog studija
01.07.– 31.08.1998. Institut für die Biologie Landwirtschaftliches Nutztiere, Rostock, Deutschland. U svojstvu razmjenski student. Samostalno vođenje pokusa utjecaja selekcije i autotreninga na motoričke sposobnosti miševa i rad na populacijskoj genetici miševa kao model organizama
1996. –1998. sudjelovao u istraživanju utjecaja sukcesije vlažnih livada reda Deschampsietalia u šumu reda Populetalia albae na Entomofaunu u Turopoljskom lugu, pod vodstvom Mr. Perovića, HRVATSKI PRIRODOSLOVNI MUZEJ
1998., Ožujak. Sudionik međunarodnog edukativnog Ekološkog kampa u Turopoljskom lugu, u sklopu međunarodne godine zaštite
vodozemaca, u organizaciji udruge Hyla
1998., Svibanj: Sudionik međunarodnog edukativnog ekološkog kampa u Nacionalnom parku Paklenica, u organizaciji udruge Hyla
1999. u LABOROTORIJU ZA KONTROLU KVALITETE VODE I ZAŠTITE OKOLIŠA JARUN stječe znanje o biološkom i kemijskom monitoringu vodenih ekosustava pod vodstvom mr. Počuća
1999 Sudjeluje u istraživanju utjecaja neionizirajučeg zračenja na INSTITUTU ZA MEDICINSKA ISTRAŽIVANJA pod vodstvom dr.sc. Trošić
Volonterski rad 1997.-1998. Rad u IAESTE-u, organizaciji za međunarodnu razmjenu studenata prirodoslovnih i tehničkih fakulteta