Unud-29-2059782213-Bab III Kerangka Pikir Dan Hipotesis Laporan Disertasi Terbuka
-
Upload
alfiyatus-sholikhah -
Category
Documents
-
view
40 -
download
18
description
Transcript of Unud-29-2059782213-Bab III Kerangka Pikir Dan Hipotesis Laporan Disertasi Terbuka
-
64
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka Konsep
Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh mengkonsumsi babi
guling terhadap penuaan pembuluh darah. Daging babi dapat mempercepat proses
penuaan tersebut sedangkan bumbu dapat menghambatnya. Terjadinya penuaan
diukur dari akibat dari penuaan pembuluh darah yaitu aterosklerosis yang diukur
dari pembentukan sel busa yang menjadi cikal bakal terbentuknya plak
aterosklerosis. Untuk mengetahui apakah penuaan dini tersebut berkaitan dengan
tingginya radikal bebas oleh karena konsumsi lemak dan daging babi yang terus
menerus, ukuran antara yang dipakai untuk mengukur proses penuaan pembuluh
darah dalam penelitian ini adalah perubahan kadar F2-isoprostan. Perubahan ini
merupakan tanda dari peroksidasi lemak akibat adanya Reactive Oxigen Species
(ROS), yang dapat merusak sel endotil sehingga lemak teroksidasi masuk ke
lapisan intima pembuluh darah. Disamping itu apakah tingginya konsumsi lemak
dan daging babi yang terus menerus disini dapat menimbulkan reaksi inflamasi
yang selanjutnya menunjang terjadinya plak aterosklerosis melalui kerusakan
endotil, dilakukan pengukuran terhadap cytokine proinflamasi yaitu IL-6. Bumbu
disebutkan dapat berfungsi sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Dalam
penelitian ini pengaruh mengkonsumsi bumbu akan dilihat dari kadar perubahan
aktivitas antioksidan total di dalam serum. Disamping itu, untuk mengetahui
-
65
apakah bumbu juga dapat meningkatkan kadar antioksidan primer yang
diproduksi oleh tubuh maka dalam penelitian ini diukur juga kadar GSH di dalam
serum. Konsep pikir dari penelitian ini dapat digambarkan sebagai berikut
Gambar 3.1: Kerangka Konsep Penelitian
Makanan yang diangkat adalah b (babi) guling yang berupa daging babi
dan lemaknya yang dicampur dengan bumbunya, dan sebagai pembanding adalah
babi guling yang dikonsumsi tanpa dengan bumbunya. Bumbu b guling terdiri
dari campuran berbagai bahan yang beraneka ragam yang secara teoritis,
Pembentukan
sel busa +++
Total anti-oksidan
GSH F2 isoprostan
IL-6
Total anti-oksidan GSH
F2 isoprostan IL-6
BABI GULING
Daging + lemak
dikonsumsi tanpa
bumbu
Daging + lemak
dikonsumsi
dengan bumbu
Pembentukan
sel busa -/+
-
66
mengandung antioksidan seperti terpene yang merupakan induk caroten, vitamin
C, Vitamin E, phenol yang berasal dari polyphenol dan flavonoid. Kesemua
kandungan di atas dapat dikatakan bersifat ateroprotektif karena kemampuannya
sebagai antioksidan dan antiflamasi. Beberapa flavonoid yang sudah dikenal dan
tampaknya menonjol di makanan bali antara lain quercetin, yang berasal dari
umbi-umbian seperti bawang merah dan bawang putih, kunyit dan lain sebagainya,
begitu juga polyphenol 1-acetoxycavichol acetate dan catechin yang berasal dari
lengkuas.
Jadi variabel interfensi yang dilihat adalah bumbu babi guling yang terdiri
dari campuran berbagai bahan di atas, dimasukkan ke dalam perut babi, dijahit
dan kemudian dipanggang di atas bara api. Setelah matang, kesemua bumbu yang
di dalam perut kemudian dikeluarkan, dibuat ekstrak bumbu dengan
melarutkannya dalam etanol kemudian disaring, dievaporasi sehingga diperoleh
ekstrak kentalnya. Daging babi dan lemaknya dicampur, digiling untuk dibuatkan
pellet dan diberikan dalam keadaan segar kepada hewan coba. Jumlah porsi babi
guling yang diberikan kepada tikus dibuat sama, yaitu disesuaikan dengan porsi
tikus (30 gram) perharinya. Pemberian bumbu diberikan secara paksa (force
feeding) dengan menggunakan dosis yang dihitung berdasarkan berat badan dan
konsentrasi.
Sedangkan variabel tergantung yang ingin dilihat adalah munculnya sel
busa yang menjadi tanda awal munculnya fatty streak dan berlanjut kepada
aterosklerosis. Untuk melihat proses kerusakan endotel akibat terjadinya
-
67
peroksidasi lemak dan proses inflamasi kronis, dilihat konsentrasi F2-isoprostan
dan IL-6 di dalam darah dan ekspresinya di dinding pembuluh darah.
Penghambatan proses kerusakan endotel oleh antioksidan yang berasal
dari makanan ataupun berasal dari respon tubuh, diukur dari aktivitas antioksidan
total dan kadar GSH di dalam darah. Pengamatan dilakukan pada awal
percobaan, pada minggu III untuk melihat fase akut, minggu ke XII untuk melihat
mulai terbentuknya sel busa, dan pada akhir percobaan yaitu pada minggu XX
dimana diharapkan plak aterosklerosis sudah terbentuk.
3.2 Hipotesis:
Hipotesis utama yang akan dibuktikan adalah
1. Konsentrasi F2 isoprostan pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi
babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan dengan yang
mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.
2. Kadar IL-6 pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi babi guling
dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan dengan yang mengkonsumsi
babi guling diolah tanpa bumbu
3. Aktifitas antioksidan total pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi
babi guling dengan bumbu, lebih tinggi dibandingkan dengan yang
mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.
-
68
4. Kadar GSH pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi babi guling
dengan bumbu, lebih tinggi dibandingkan dengan yang mengkonsumsi
babi guling diolah tanpa bumbu
5. Jumlah sel busa pada dinding pembuluh darah tikus Wistar yang
mengkonsumsi babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan
dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu
Untuk memperjelas bagaimana kerusakan endotel di dinding pembuluh darah
akibat raddikal bebas yang ditunjukkan oleh tingginya kadar F2 isoprostan dan
inflamasi yang ditunjukkan oleh kadar IL-6, ekspresi dari kedua substrat tersebut
juga dilihat. Sehingga hypothesis tambahannya adalah
1. Ekspresi F2 isoprostane pada pembuluh darah tikus Wistar yang
mengkonsumsi babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan
dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.
2. Ekspresi IL-6 pada dinding pembuluh darah tikus Wistar yang
mengkonsumsi babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan
dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.
-
69
BAB IV
METODE PENELITIAN
Untuk menjawab permasalahan di atas, penelitian ini akan menggunakan
rancangan eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui dampak dari
mengkonsumsi bumbu yang dicampur dengan daging terhadap penuaan pembuluh
darah.
4.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian adalah penelitian eksperimental dengan rancangan pre-post test
with control design, dilaksanakan di laboratorium yaitu Laboratorium Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dan Bagian Ilmu Kedokteran
Komunitas dan Kedokteran Pecegahan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana,
dengan menggunakan percobaan binatang. Penelitian dilakukan selama 14 bulan
dengan rincian 12 minggu melakukan penelitian pendahuluan, 20 minggu untuk
pelaksanaan perlakuan, 12 minggu untuk mengumpulkan data, 12 minggu untuk
mengolah data dan membuat laporan.
4.2 Rancangan Penelitian
Eksperimentasi ini menggunakan tikus jenis Wistar (Rattus Novergicus
Wistar Race) untuk mengetahui bagaimana pengaruh dari asupan berbagai
makanan di bawah ini terhadap munculnya sel busa yang merupakan akibat dari
penuaan pembuluh darah. Sebagai faktor risiko dari aterosklerosis, dipelajari juga
-
70
kadar antioksidan total, GSH (glutation), F2 isoprostan, dan IL-6. Jenis makanan
tersebut adalah:
- Campuran lemak, daging dari babi guling yang dikonsumsi tanpa
bumbu
- Campuran lemak, daging dari babi guling yang dikonsumsi dengan
bumbunya.
Gambar 4.1: Rencana Kerja Perlakuan
Keterangan:
S : Sampel
SS : Subsampel (0)
PI : Perlakuan dengan memberikan makanan aterogenik
PII : Perlakuan daging babi plus bumbu dosis maksimum
PIII : Perlakukan daging babi plus bumbu dosis optimum
PIV : Perlakuan daging babi plus bumbu dosis minimum
PV : Perlakuan dengan daging babi saja tanpa bumbu
PVI : Perlakuan dengan makanan asli tikus
OI : Perlakuan selama 3 minggu
O II : Perlakuan selama 12 minggu
O III : Perlakuan selama 20 minggu
OI O III O II
PI
PII
PIII S
SS
PIV
PV
PVI
-
71
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan
melakukan pre-post test with control design. Tikus dengan umur, jenis kelamin
yang sama dan berat badan yang relatif sama dipisahkan secara random menjadi 6
(enam) kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan akan diberikan makanan
yang berbeda-beda, yaitu Perlakuan I mendapatkan diet makanan yang bersifat
aterogenik yang mana kemampuan aterogenitasnya sudah diketahui (Muliartha &
Mulyohadi, 2002), Perlakuan II mendapatkan diet makanan babi guling yang
diolah dengan bumbu, perlakuan III mendapatkan diet makanan babi guling yang
diberikan tanpa bumbu, dan perlakuan IV yang hanya mendapatkan makanan asli
tikus (Muliartha & Mulyohadi, 2002). Bumbu diberikan dalam bentuk 3 dosis
yaitu dosis maksimal, dosis optimal dan dosis minimal dan pemberiannya
disesuaikan dengan berat badan tikus. Jumlah makanan yang diberikan
disesuaikan dengan porsi makanan tikus dalam bentuk makanan segar (pelet segar)
dengan berat masing-masing 30 gram. Evaluasi awal (pretest) dilakukan pada
separate sample sebelum dilakukan intervesi dan selanjutnya post test dilakukan
pada minggu III, XII dan XX.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi penelitian untuk rancangan eksperimental adalah tikus tipe
kolesterol sensitif yaitu jenis Rattus Novergicus Wistar Race. Jumlah tikus yang
dipakai sebagai sampel dihitung berdasarkan rumus yang diambil dari Metode
Perancangan Percobaan oleh Ir. Vincent Gaspersz, sebagai berikut:
(t - 1) (n 1) > 15
-
72
t = jumlah perlakuan
n = jumlah ulangan
Dengan rumus di atas dan dengan perlakuan sebanyak 6 (enam) jenis perlakuan,
maka jumlah ulangan yang diperlukan minimal adalah 4 (empat) kali. Bila setiap
kali ulangan diwakili oleh satu sekor tikus maka jumlah tikus yang diperlukan
minimal 4 (empat) ekor di setiap kelompok perlakuan.
4.3.1 Kriteria Inklusi
Untuk menjaga homogenitas sampel maka diberlakukan kriteria inklusi sebagai
berikut:
Umur pada waktu pemilihan berada pada kisaran: 4-5 minggu,
Jenis kelamin jantan,
Berat berada pada kisaran : 80 120 gram
Hanya tikus yang sehat
4.3.2 Kriteria eksklusi
Untuk kriteria eksklusi adalah bila tikus itu menderita cacat bawaan akan diekslusi
dari penitian ini
4.3.3 Drop Out
Tikus yang mati selama percobaan di drop out dan dicarikan penggantinya
(substitusi), dengan kriteria yang sama dengan kriteria inklusi.
Dari 100 tikus yang memenuhi kriteria inklusi dan tidak tereleminasi
kemudian dipilih secara acak sederhana, untuk mendapatkan tikus-tikus yang akan
-
73
memperoleh kelompok perlakuan. Dan setiap kelompok perlakuan diwakili oleh 4
tikus sehat.
4.4 Variable Penelitian
4.4.1 Identifikasi dan Klasifikasi Variabel Penelitian
Variabel yang diukur adalah untuk rancangan eksperimental, diagramnya ada di
gambar 4.2
1. Variabel bebas : yaitu daging babi guling yang bersifat
aterogenik sehingga dapat meningkatkan Radikal
Bebas dan Inflamasi.
2. Variabel interfensi : adalah bumbu babi guling yang dapat
meningkatkan aktivitas antioksidan total termasuk
antioksidan primer atau interna. Bumbu ini
terbagi dalam tiga dosis yaitu dosis maksimum,
dosisi optimum dan dosis minimum.
3. Variabel tergantung : terbentuknya sel busa sampai dengan plak
aterosklerosis pada dinding pembuluh
darah tikus Wistar oleh karena tingginya radikal
bebas dan proses inflamasi
4. Variabel antara : kadar F2 isoprostan yang mengukur tingginya
Radikal Bebas dan IL-6 yang mengukur proses
inflamasi; Aktivitas Antioksidan total dan kadar
-
74
GSH yang dapat menekan munculnya Radikal
bebas dan proses inflamasi.
Gambar 4.2: Gambar Hubungan antar Variabel
4.4.2 Definisi Operasional Variabel
Untuk keseragaman penelitian maka variabel penelitian didefinisikan
seperti di bawah ini :
1. Babi guling: Babi guling yang diolah secara tradisional. Anak babi jenis
landrace yang telah dibunuh, dibersihkan dan isi perutnya
dikeluarkan. Babi kemudian dipanggang secara utuh sambil terus
diolesi dengan minyak dan kunyit sampai dianggap matang.
Dalam penyajiannya semua daging dan lemak disatukan, dicampur
merata, dihaluskan dan kemudian dibuat pelet dengan berat
V. bebas
Daging dan Lemak
Babi Guling F2 isoprostan
IL-6 SEL BUSA
V. tergantung V. antara
Bumbu Antioksidan total dan GSH
V. perlakuan
-
75
masing-masing 30 gram. Dan disimpan di dalam Freezer sampai
waktunya diberikan secara segar kepada hewan coba (Lampiran 11,
gambar 2.1 sd 3.2).
2. Makanan aterogenik: adalah makanan tikus yang sudah diketahui dapat
menimbulkan plak aterosklerosis pada tikus, yaitu yang terdiri dari:
2% kolesterol, 0.2% asam kolat (Cholic acid), dan 10% minyak
babi (Muliartha & Mulyohadi 2002, Arjuna R., 2008)
3. Makanan tikus: adalah makanan untuk tikus Wistar yang sebetulnya dipakai
untuk makanan ayam yaitu jenis Confeed PARS (Muliartha, 2006,
Arjuna R., 2008).
4. Bumbu babi guling : adalah bumbu khas untuk makanan olahan tradisional bali
yang digunakan untuk membuat babi guling yang berisi tiga
komponen campuran bahan yaitu base genep, base penyanggluh
dan base panglemes. Komposisi bumbu disesuaikan berdasarkan
bumbu yang umum digunakan untuk babi guling. Bumbu
kemudian dipanaskan dalam perut babi sehingga matang, diekstrak
kemudian dilarutkan untuk mendapatkan dosis yang diperlukan
sebelum diberikan secara paksa kepada hewan coba. Pemberian
diberikan berdasarkan dosis yaitu dosis maksimum, dosis optimum
dan dosis minimum. Bahan dan cara pembuatan bumbu dapat
dilihat di lampiran 9 dan lampiran 11, gambar 1.1 sd 1.3).
-
76
4.1. Bumbu Dosis maksimum (PII): adalah jumlah mililiter bumbu yang di
sondekan ke dalam lambung tikus untuk mendapatkan dosis 100%
test DPPH, yang diperoleh dari perhitungan. Dosis ditentukan per
100 gram berat tikus (lihat lampiran 10 menentukan dosis).
4.2. Bumbu Dosis optimum (PIII): adalah jumlah mililiter bumbu yang di
sondekan ke dalam lambung tikus untuk mendapatkan dosis 75%
test DPPH, yang diperoleh dari perhitungan. Dosis ditentukan per
100 gram berat tikus (lihat lampiran 10 menentukan dosis).
4.3. Bumbu Dosis minimum (PIV): adalah jumlah mililiter bumbu yang di
sondekan ke dalam lambung tikus untuk mendapatkan dosis 50%
test DPPH, yang diperoleh dari perhitungan. Dosis ditentukan per
100 gram berat tikus (lihat lampiran 10 menentukan dosis).
5. Aktivitas total anti-oksidan: adalah Aktivitas anti-oksidan total dalam darah
tikus yang diukur pada awal pelaksanaan, pada minggu III, minggu
XII dan XX dengan menggunakan tehnik pengujian dengan ELISA
untuk kadarnya dalam plasma. Kadar dinyatakan dalam bentuk
angka kuantitatif (Cayman Chemical, 2009).
6. Kadar GSH: adalah kadar GSH dalam darah tikus yang diukur pada awal
pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX. Untuk mengukur kadar
dalam plasma digunakan reagen Cayman Chemical GSH assay kit.
Kadar dinyatakan dalam bentuk angka kuantitatif (Biovision, 2009).
-
77
7. Kadar F2-isoprostan: adalah kadar F2-isoprostan dalam darah tikus yang diukur
pada awal pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX. Untuk
mengukur kadar, digunakan enzym immunoassay kit (Cayman)
untuk 8-iso-PGF2. Kadar ditentukan dengan metode ELISA dan
dinyatakan dalam bentuk angka kuantitatif (Morrow etal., 1995;
Cell Biolabs, 2009).
8. Ekspresi F2-isoprostan : adalah jumlah sel endotel yang terekspresi terhadap
F2-isoprostan pada awal dengan pengecatan immunohistokimia,
minggu III, XII dan pada minggu ke XX. Pembacaan
menggunakan mikroskop dengan pembesaran 200, 400, 900 kali.
Penghitungan dilakukan dengan semikuantitatif yaitu dengan
menghitung sel endotel yang terekspresi pada lapangan pandang
(Muliartha, 2002, Pratic D. etal., 1997, Ika Fikriah, 2007).
9. Kadar IL-6: adalah aktivitas IL-6 dalam darah tikus yang diukur pada awal
pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX dengan menggunakan
tehnik elisa untuk kadarnya dalam plasma. Kadar dinyatakan
dalam bentuk angka kuantitatif (Bender MedSystem, 2009).
10. Ekspresi IL-6: adalah ekspresi sel endotel yang tercat dengan pengecatan
imunohistokimia untuk ekspresi IL-6. Pengukuran dilakukan pada
awal pelaksanaan, minggu III, XII dan XX. Pembacaan
menggunakan mikroskop dengan pembesaran 200, 400, 900 kali.
Penghitungan dilakukan dengan semikuantitatif yaitu dengan
-
78
menjumlahkan sel endotel yang terekspresi pada lapangan pandang
(Terebuh P.D. etal., 1992; Muliartha, 2002).
11. Sel busa: adalah sel yang berbentuk seperti busa, yang merupakan hasil dari
makrofag yang memakan LDL yang teroksidasi, dilihat di bawah
mikroskop dengan pewarnaan Oil Red O akan berwarna
merah.Yang dihitung adalah jumlah sel busa yang ada di cell
endotel perlapangan pandang pada pembesaran 100 kali. Sampel
diambil dari potongan melintang dinding pembuluh darah aorta
yang telah beku dengan alat microtome (Cryo-Cut) setipis 3-5
mikron dan telah diperlakukan untuk pewarnaan Oil Red O
( Schieffer B. etal., 2004; Ika Fikriah, 2007).
4.5. Bahan dan Alat Penelitian
4.5.1 Bahan penelitian
Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian ini berbentuk Kit, dan macam-
macam Kit tersebut adalah:
1. Kit untuk memeriksa aktivitas Antioksidan total dalam darah
2. Kit untuk memeriksa aktivitas GSH
3. Kit untuk memeriksa aktivitas F2-isoprostan
4. Kit untuk memeriksa ekspresi F2-isoprostan
5. Kit untuk memeriksa aktivitas IL-6
6. Kit untuk memeriksa ekspresi IL-6
7. Parafin, Oil Red O dan Haematoxylin Eosin untuk pemeriksaan Sel busa
-
79
4.5.2. Alat penelitian
Alat-alat yang dibutuhkan antara lain
1. Obyek glass
2. Alat vortex
3. Test tube
4. Microscoop
4.6 Protokol Penelitian
Pada penelitian eksperimen, persiapan meliputi pencarian tikus percobaan,
menghubungi laboratorium pelaksana dan mempersiapkan metode memelihara
binatang coba, tehnik pengambilan darah dan metode pengiriman sampel
khususnya sampel makanan dan sampel darah ke laboratorium.
4.6.1 Pemeliharaan Binatang Coba (Tikus Wistar)
Alur pelaksanaan eksperimen dari awal hingga akhir dapat dilihat pada gambar
4.3. Pada awal penelitian, sebelum dilakukan eksperimen, tikus yang termasuk
dalam kriteria inklusi dipilih secara acak sederhana untuk dijadikan sampel. Dari
100 ekor tikus yang memenuhi syarat, akan dipilih masing-masing 24 (dua puluh
empat) ekor untuk penelitian 3, 12 dan 20 minggu dan 4 (empat) ekor tambahan
untuk memperoleh data awal (separate sampel).
Untuk mendapatkan waktu pembedahan yang bersamaan maka waktu
pemilihan tikus dibuat berbeda, yang pertama dipilih yang akan dipelihara selama
20 minggu, kemudian 12 minggu dan yang terkahir dipilih yang akan dipelihara
selama 3 minggu. Tikus-tikus kemudian dipisahkan menjadi 6 kelompok
-
80
perlakuan, setiap tikus akan diberi tanda sesuai dengan kelompoknya dan
ditempatkan pada kandang yang telah dilengkapi dengan tempat pemberian makan
dan minum dan sekam untuk tidur. Setiap 2 ekor tikus ditempatkan dalam satu
kandang. Pemberian makan dilakukan secara ad libutum dimana makanan tikus
disiapkan sebanyak 30 gram perhari dan tikus dapat makan dan minum sesuai
dengan kemauannya. Sisa makanan dan minuman diukur setiap hari sebelum
diberikan makanan dan minum yang baru. Selanjutnya dilakukan adaptasi untuk
tikus dapat mengkonsumsi makanan yang harus dikonsumsinya (Lampiran 11,
gambar 3.3 sd 4.6).
Gambar 4.3: Rencana Alur Kerja Penelitian
TIKUS COBA
TIKUS COBA
Minggu III
B guling - bumbu
B guling + bumbu
TIKUS COBA
Minggu XII
B guling - bumbu
B guling, bumbu +
Antioksidan, GSH, F2 -
isoprostan, IL-6,
Sel busa
TIKUS COBA
Minggu XX
Antioksidan, GSH, F2 -
isoprostan, IL-6, Sel busa
Antioksidan, GSH, F2 -
isoprostan, IL-6, Sel busa
Antioksidan, GSH, F2 -
isoprostan, IL-6, Sel busa
B guling bumbu -
B guling, bumbu +
-
81
Untuk data awal, 4 ekor tikus (separate sample) dengan berat dan usia
yang sama dengan usia tikus waktu pemilihan sebelum dipelihara diambil
darahnya untuk memperoleh data awal (normal) tentang kadar IL-6, kadar F2-
isoprostan, aktifitas anti-oksidan total dan GSH; dan pembuluh darahnya untuk
mendapatkan data tentang jumlah sel busa, ekspresi IL-6, ekspresi F2-isoprostan.
Selanjutnya, di tiap kelompok perlakuan, untuk mendapatkan 4 (empat) kali
ulangan, masing-masing kelompok terdiri dari 4 (empat) ekor tikus.
Pada masa eksperimen, semua tikus mendapat makanan sesuai dengan
kelompok perlakuannya masing-masing, yaitu babi guling tanpa bumbu, babi
guling plus bumbu, makanan aterogenik tikus dan makanan tikus asli. Pemberian
makan akan dilakukan setiap hari dengan jumlah 30 gram dan bila ada sisa pada
keesokan harinya, maka sisa akan ditimbang sebelum diberikan makanan yang
baru, sehingga dapat diketahui dengan pasti berapa jumlah makanan yang
dikonsumsi.
Selama masa eksperimen, tikus percobaan dipelihara oleh petugas khusus
pemelihara tikus (lihat lampiran 8) yang bertugas memelihara dan mengawasi
kesehatan tikus, memberi makan dan menyonde. Selama waktu ini tidak
ditemukan tikus yang sakit, tetapi ditemukan seekor tikus mati di awal penelitian
dan sudah disubstitusi dengan tikus yang sejenis dan dapat dikatakan sama.
4.6.2 Pengambilan Darah dan Pembuluh Darah
Pada minggu ke III, XII dan XX dilakukan pemeriksaan aktivitas total
antioksidan, GSH, kadar F2-isoprostan dan kadar IL-6 dalam serum darah dan
-
82
jumlah sel busa di dinding pembuluh darah. Untuk ini, darah diambil seluruhnya
dari jantung tikus yang teranastesi. Disamping itu pembuluh darah aorta dan arteri
carotis diambil untuk memeriksa jumlah sel busa yang terbentuk dengan metode
Oil Red O, dan pewarnaan imunohistokimia untuk ekspresi dari F2-isoprostan dan
IL-6 .
4.6.3 Menghitung Jumlah Sel Busa
Setelah pembuluh darah dibuatkan dalam slide preparat dengan ketebalan
3 mikron dan dicat dengan Oil Red O (cara dapat dilihat dalam lampiran 6)
dilakukan pemeriksaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100, 400 dan 900
kali.
Dengan pembesaran 100 dapat dihitung jumlah sel busa secara umum di
sekeliling penampang melintang pembuluh darah dan zona-zona yang akan
menjadi tempat lokasi penghitungan. Keliling pembuluh darah kemudian dibagi
menjadi 8 (delapan) zona seperti arah jarum jam yaitu daerah jam 12.00, 13.30,
15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00 dan 22.30 secara membuta (Ariana Y., 2006,
Ika Fikriah, 2007). Dengan pembesaran 400 penghitungan dilakukan di tiap
bagian zona potongan melintang tersebut. Yang dihitung adalah sel busa yang
sudah bermigrasi ke endotel (LDL yang terokisdasi) yang berbentuk bulatan
berwarna merah sampai dengan sel busa yang sudah membentuk fatty streak.
Jumlah Sel busa di tiap bagian kemudian dijumlahkan untuk mendapatkan jumlah
sel busa di sekeliling potongan melintang tersebut. Bila dalam satu slide ada lebih
dari satu pembuluh darah, dengan cara yang sama, sel busa dihitung di setiap
pembuluh darah. Jumlahnya di masing-masing pembuluh darah dijumlahkan
-
83
untuk kemudian diambil rata-ratanya. Pembesaran 900 kali hanya dilakukan untuk
memastikan apakah itu sel busa atau bagian lemak yang lain.
4.6.4 Menghitung Ekspresi F2-isoprostan
Setelah dibuatkan slide dengan ketebalan 3 mikron dan dilakukan
pengencatan dengan menggunakan Pengecaan untuk F2-isoptostan, sel yang
terekspresi bervariasi dari berwarna coklat tua sampai dengan dinding selnya
rusak dan F2 isoprostan terpancar keluar. Yang dihitung adalah jumlah sel endotel
yang terekspresi di lingkaran melintang pembuluh darah. Cara penghitungan
dengan menggunakan metode seperti menghitung sel busa, yaitu keliling
pembuluh darah kemudian dibagi menjadi 8 (delapan) zona seperti arah jarum jam
yaitu daerah jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00 dan 22.30.
Dengan pembesaran 400 penghitungan dilakukan di tiap bagian zona potongan
melintang tersebut.
4.6.5 Menghitung Ekspresi IL-6 di Dinding Pembuluh Darah
Setelah dibuatkan slide dengan ketebalan 3 mikron dan dilakukan
pengencatan dengan menggunakan Pengecaan untuk IL-6, sel yang terekspresi
bervariasi dari berwarna coklat tua sampai dengan dinding selnya rusak dan IL-6
nya terpancar keluar. Yang dihitung adalah jumlah sel endotel yang terekspresi di
lingkarang melintang pembuluh darah. Cara penghitungan dengan menggunakan
metode seperti menghitung sel busa.
4.7 Analisis Data
Dalam penelitian ini data yang diperoleh dianalisis seperti di bawah ini
-
84
4.7.1 Analisis Deskriptif
Analisis deskriptif untuk mengetahui simpang baku, rerata dan median
kadar total anti-oksidan, GSH, F2-isoprstan, IL-6, jumlah sel busa, pada semua
perlakuan binatang coba maupun di setiap kelompok perlakuan (ulangannya).
Analisis perkembangan rerata variabel pada minggu III sampai dengan XX
disajikan dalam bentuk grafik.
4.7.2 Uji Normalitas
Normalitas disribusi data anti-oksidan, GSH, F2-isoprstan, IL-6 dan
jumlah sel busa, diuji dengan uji Saphiro Wilk dengan tingkatn kemaknaan ( <
0,05), dimana distribusi data akan dianggap normal bila p > 0,05
4.7.3 Analisis Inferensial
Analisis inferensial dilakukan untuk menguji perbedaan kemaknaan rerata
kadar anti-oksidan total, GSH, F2-isoprostan, IL-6 dan jumlah sel busa pada awal,
minggu III, XII dan XX dari antara kelompok perlakuan dan perubahan rerata
kadar antioksidan total, GSH, F2-isoprostan, IL-6 dan jumlah sel busa di setiap
perlakuan pada minggu-minggu perlakuan yang berbeda. Pada data yang
terdistribusi normal, dilakukan uji statistik komparasi dengan One way ANOVA
dengan tingkat kemaknaan ( < 0.05), sedangkan data yang tidak terdistribusi
normal dilakukan uji statistik non parametrik dengan Kruskal Wallis. Hipotesis
statistik akan dinyatakan sebagai berikut:
H0 : 1 = 2 = 3 = 4 = 5 = 6
Ha : paling tidak ada kelompok yang berbeda
-
85
POST HOC test
Uji Post Hoc (LSD atau Temhanes T2) dilakukan pada uji ANOVA yang
terbukti signifikan, untuk mengetahui kelompok yang berbeda dengan hipotesis
statistik
1. Membandingkan kelompok perlakuan makanan asli tikus (PVI) dengan
perlakuan makanan babi guling yang diolah dengan bumbu dosis
maksimum (PII)
H0 : 2 = 6 Ha : 2 6
Bumbu dosis optimum (PIII)
H0 : 3 = 6 Ha : 3 6
Bumbu dosis minimum (PIV)
H0 : 4 = 6 Ha : 4 6
2. Membandingkan antara kelompok babi guling yang diolah tanpa bumbu
(PV) dengan kelompok perlakuan makanan asli tikus (PVI)
H0 : 5 = 6 Ha : 5 6
3. Membandingkan antara kelompok yang mendapatkan makanan asli tikus
(PVI) dengan kelompok yang memperoleh makanan yang bersifat
aterogenik (PI)
-
86
H0 : 1 = 6 Ha : 1 6
4. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan yang diberi
bumbu (PII-PIV) dengan yang memperoleh makanan aterogenik (PI)
Bumbu dosis maksimum (PII)
H0 : 2 = 1 Ha : 2 1
Bumbu dosis optimum (PIII)
H0 : 3 = 1 Ha : 3 1
Bumbu dosis minimum (PIV)
H0 : 3 = 1 Ha : 3 1
5. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan tanpa
bumbu (PV) dengan yang memperoleh makanan aterogenik (PI)
H0 : 5 = 1 Ha : 5 1
6. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan yang diolah
tanpa bumbu (PV) dengan yang memperoleh makanan diolah dengan
bumbu (PII-PIV)
Bumbu dosis maksimum (PII)
H0 : 5 = 2 Ha : 5 2
-
87
Bumbu dosis optimum (PIII)
H0 : 5 = 3 Ha : 5 3
Bumbu dosis minimum (PIV)
H0 : 5 = 4 Ha : 5 4
Korelasi antara kadar kemaknaan rerata kadar anti-oksidan total, GSH
termasuk rasio GSH:GSSG, F2- isoprostan, IL-6, dan jumlah sel busa yang
terbentuk akan dilakukan dengan
- Uji Pearson bila persyaratan korelasi dipenuhi
- Uji korelasi Spearman bila data tidak memenuhi persyaratan.
Hipotesis statistik akan dinyatakan sebagai berikut
H0 : = 0 Ha : 0
Perbedaan semua variabel penelitian antara pengukuran minggu III dengan
minggu XX pada masing-masing perlakuan akan diuji dengan uji T-pair dengan
tingkat kemaknaan ( < 0,05) dan hipotesis statistik adalah sebagai berikut
H0 : III = XX Ha : III XX