proteina, peptida, aminokarboksilnih kiselina, oligonukleotida i drugih molekula s

nabojem. 'Eluiranje se postie ponitavanjem jonskih interakcija promjenom jonske

jakosti ili promjenom pH proteina.

afirsitetna kromatografija - se zasniva na sposobnosti proteina da veu odreene

male molekule. Molekula supstrata odabranog enzima se vee kovalentno za odreeni

nosa (stacionarna faza), koji se stavi u kolonu. Tako se iz proteinske otopine koja se

proputa kroz kolonu sa odreenom stacionarnom fazom vee samo pripadni enzim.

kromatografija iskljuenjem - stacionarna faza je polisaharidni gel koji djeluje kao

molekulsko sito. Unutar estica gela nalaze se vodom ispunjene upljine u koje mogu

prodrijeti samo male molekule i one srednje veliine, a velike su iskljuene. Kada se gel

ispire otapalima, molekule koje su prodrle u upljine difuzijom opet mogu izai.

kiralna kromatografija - koristi se za odjeljivanje enantiomera na kiralnoj

stacionarnoj fazi u koloni. Kada se smjesa dva enantiomera propusti kroz kolonu jedan

enantiomer e bolje prijanjati (razliite interakcije koje nastaju zbog jedinstvene

prostorne orjentacije molekule enantiomera) od drugog na stacionarnu fazu te e se tako

odijeliti iz smjese.

3.5.1. Tankoslojrsa kromatografija

Odjeljivanje se kod TLC (engl. Thin Layer Chromatographv) temelji na adsorpciji ili

razdjeljenju. Najee se koristi adsorpcijska kromatografija na tankom sloju adsorbensa

(stacionarna faza) nanesenom na staklenu plou. Debljina sloja adsorbensa ovisi o namjeni

kromatografije. Kao adsorbensi preteno se upotrebljavaju silikagel, aluminijev oksid i dr.

Najjednostavnija izvedba je tzv. "uzlazna kromatografi ja", slike 25 i 26.

Tankoslojnom kromatografijom moe se doznati broj komponenti u smjesi. Upotrebljava

se i za praenje reakcije (nestajanje reaktanata i stvaranje produkata). Tankoslojnom

kromatografijom moe se pronai otapalo optimalne polamosti za razdvajanje komponenti

kromatografijom na stupcu. Moe se upotrebljavati i u preparativne svrhe, gdje se upotrebljavaju

preparativne ploe s debljim, slojem krutog adsorbensa. Nakon nanoenja, razvijanja i detekcije

zone s komponentama od interesa, slojevi na kojima se nalaze pojedine komponente se odijele s

ploe i ekstrahiraju pogodnim otapalom.

Osnovne faze rada kod tankoslojne kromatografije su:

(a) Nanoenje uzorka

Uzorak se otopi u otapalu s niskim vrelitem, otopina se tokasto nanese kapilarom na

startnu liniju koja je udaljena 1,5 - 2 em od ruba ploice i osui; mrlja treba biti to manja*

Startna linija ne smije biti uronjena u razvija kada se ploica stavi u kadu za kromatografiju.

(b) Razvijanje fcromatograma

Ploica se postavi u kadu za kromatografiju s pogodnim razvijaem (mobilna faza).

Pomou kapilarnih sila mobilna faza die se uz ploicu i eluira sastojke smjese; ova faza naziva

se razvijanje kromatograma. Korisno je prethodno uroniti komad filter-papira (veliine ploice) u

razvij a, kako hi se prostor u kadi za kromatografiju zasitio parama razvijaa (zbog dizanja

razvijaa kapilarnim silama uz papir). Nakon izvlaenja ploice iz kade olovkom se oznai

poloaj otapala (frontna linija) i zatim se ploica osui.

r

- front

. start

otapalo

Slika 25. Razvijanje kromatograma

(c) Obrada kromatograma

Mrlje obojenih tvari razdijeljene du ploice se mogu vidjeti na dnevnom svjetlu.

Bezbojne tvari se promatraju pod ultraljubiastim svjetlom (ukoliko sadre pogodne skupine) ili

se detektiraju pomou odreenih reagensa ("izazivanje kromatograma"). Osnovni kriterij za

i i t

identifikaciju pojedinog spoja je njegova pokretljivost na tankome sloju, to se izraava pomou

Rf vrijednosti; to -je omjer prijeenog puta tvari (x) i prijeenog puta otapala (y): Rp = x l y. Primjeri prorauna Rf vrijednosti (slika 26): Rf(1) = 34 / 60 = 0,57; Rf(2) = 22 i 60 = 0,37;

i = 54 / 60 = 0,9.

TLC ploica u

poetku razvijanja

TLC ploica nakon TLC ploica nakon

razvijanja razvijanja i suenja

odreivanje Rp

vrijednosti

Slika 26, Tankoslojna uzlazna kromatografija

Postupak radaiNa komercijalnoj ploici za tankoslojnu kromatografiju sa slojem silikagela pristupi se

nanoenju uzorka (a), razvijanju kromatograma (b), te obradi kromatograma (c).

Uzorak za tankoslojnu kromatografiju je smjesa boja i to 10 mg sudan black

(Fluka) i 20 mg sudan red (Fluka) otopljenih u 1 m l smjese petro leter: etil-acetat = 7 :

3 (v/v). Stacionarna faza je silikagel nanesen u sloju (0,2 mm) na staklenu ili aluminijsku

ploicu (Merck), a mobilna faza je smjesa petroleter: etil-acetat = 7 : 3 (v/v).

3.5.2. Kromatografija na stupcu

Dok se tankoslojna kromatografija (TLC) upotrebljava preteno za identifikaciju sastojaka

smjese (analitika kromatografija), kromatografija na stupcu (CC, engl. Column

56

Chromatographv) rabi se za njihovo odjeljivanje (preparativna kromatografija). To je preteno

adsorpcijska kromatografija u kojoj se kao stacionarna faza upotrebljavaju najee silikagel ili

aluminijev oksid, a mobilna faza protjee kolonom utjecajem gravitacije ili razlike tlakova,

Kromatografija na stupcu moe biti i kiralna ukoliko se upotrijebi kiralna stacionarna faza, te

tada moe posluiti za odjeljivanje racemine smjese. Takoer i ostale vrste kromatografije (s

razliitim mehanizmima razdvajanja) se mogu provoditi kao kromatografija na stupcu.

Osnovni dio aparature za kromatografiju na stupcu je vertikalna staklena cijev (kolona, I)

odreenog promjera i visine (slika 27). Na dnu cijevi se nalazi ploica od sinteriranog stakla,

koja zadrava stupac sorbensa i pipac za reguliranje protoka razvijaa (mobilna faza). Lijevak za

dokapavanje (2) spojen je na gornji dio kolone, a slui za dodavanje razvijaa (mobilna faza).

Osim aktivnosti sorbensa, za uspjeno odjeljivanje, veoma je vana njegova granulacija, visina

stupca u koloni, protok i polamost razvijaa, temperatura i si.

Kod asorpcijske kromatografije na stupcu, nakon nanoenja uzorka na vrh stupca u

koloni, proputa se razvija odreenom brzinom. Tvari se asorbiraju na stacionarnu fazu

(sorbens), a razvija (eluens) otapa tvari i ispire ih (eluira) sa stupca sorbensa. Kapljevina koja

izlazi iz kolone .naziva se eluaf Tvar se .raspodjeljuje izmeu eluensa i sorbensa, to znai da se

dio tvari otopi, u razvij au, a dio tvari, ostane adsorbiran na stupcu. Kak o se razvij a kree, odnosi

otopljenu tvar, ravnotea se poremeti, i kako hi se ponovno uspostavila otapa se nova koliina

tvari u svjee pristiglom otapalu. S druge strane razvij a odnosi tvar u dio stupca sorbensa na

kojem jo nema adsorbirane tvari, pa se ravnotea uspostavlja adsorbiranjem dijela tvari na

stacionarnu fazu, Razliite tvari imaju razliite koeficijente razdiobe, putuju razliitim brzinama

stupcem i na tome se temelji razdvajanje komponenti. Brzina putovanja ovisi o jakosti vezivanja

tvari na sorbens i topljivosti te tvari u mobilnoj fazi.

Kruti sorbens je obino polaran (npr. silikagel) i zato utjecajem nepolame mobilne faze

nepolame tvari putuju bre, dok e polarne ostati vezane za stacionarni] fazu. Dakle sa stupca

polarnog sorbensa redovito se uklanjaju najprije nepolame tvari, tako eluiranje obino kree s

nepolarnim otapalom, a zatim se postepeno poveanjem polarnosti eluiraju polarne tvari (tablica

2). U "eluotropnom nizu1* su poredana uobiajena otapala po rastuoj polarnosti (tablica 1).

Tablica L Kratki eluotropni niz

Otapalo....................... Polarnost

petroleter

cikloheksan

tetraklorugljik

benzen

dietil-eter

etil-acetat

piri din

aceton

etanol

voda

Tablica 2 Brzina eluiranja nekih tvari

Tvar..............................Brzina eluiranja

ugljikovodici

olefini 4%

eteri

halogenalkani

aromatski spoj evi

ketoni

aldehidi

esteri

alkoholi

amini

karboksiIne kiseline

Osnovne faze rada za adsorpcijsku kromatografiju na stupcu su:

a) Priprema stupca u koloni

Na ploicu od sinteriranog stakla na dnu staklene kolone (ili ukoliko je nema) stavi se

tanki sloj vate ili samljevenog filtar-papira. U kolonu se najprije doda nekoliko mililitara

razvi jaa, a zatim se paljivo, kroz lijevak, dodaje sorbens (stacionarna faza) koji je prethodno

suspendiran u istom razvijau. Masa potrebnog sorbensa ovisi o koliini i sloenosti tvari u

smjesi, a obino mora biti 25 - 30 puta vea od mase smjese. Kolona treba biti jednoliko

napunjena, bez mjehuria zraka, kako hi protok razvijaa bio svugdje jednak. Pipao na dnu

kolone tijekom pripreme stupca mora biti otvoren, kako bi stalan protok razvi jaa osigurao

homogeniziranje i zbijanje sloja sorbensa. Ukoliko je potrebno staklena kolona se moe lagano

potresati kako bi se izdvojili mjehurii zraka. Stupac u koloni je formiran kada vie nema

promjene u njegovoj visini tijekom prolaza razvijaa, a gornji sloj sorbensa je homogen i

kompaktan. Tijekom formiranja stupca u koloni, stupac nikada ne smije ostati suh (bez razvij aa)

zbog ulaska zraka u stupac.

b) Nanoenje uzorka.

Uzorak otopljen u 1 - 2 ml, razvij aa se dodaje na vrh kolone uz pomo duge kapilare ili

pipete. Pri tome treba paziti da se to manje uzorka zaostane na stijenkama staklene kolone.

Ukoliko nije mogue nai pogodno otapalo za uzorak (koje nee smetati kromatografskom

procesu), tada se uzorak moe otopiti u malom volumenu metanola ili etanola, te mu se doda

nekoliko grama silikagela. Zatim se otapalo upari na rotacijskom vakuum uparivau i tako se

uzorak adsorbira na silikagel. Tako adsorbirani uzorak se doda preko suhog lijevka na vrh

pripremljenog stupca sorbensa u koloni. Pri tome gornji dio kolone treba potresati, kako bi se

uklonili mjehurii zraka. Uzorak mora biti homogeno rasporeen na vrhu kolone. Nakon

nanoenja uzorka, doda se malo razvij aa, te se iznad uzorka sta vi tanki sloj inertnog materijala

(npr, pijesak, komadi vate) kako daljni dodatak razvijaa ne bi poremetio homogenost

nanesenog uzorka.

ej Eluiranje

Nakon nanoenja uzorka kolona se do vrha ispuni razvijaem (eluens), te se lijevak za

dokapavanje s razvijaem postavi iznad kolone. Podeavanjem pipca na dnu kolone regulira se

59

- r

protok razvijaa, koji obino iznosi 1 - 2 inL u minuti. Eiuat se hvata u malim volumenima (5 -

10 mL) u razliitim predlocima (epruvete ili Erlenmeverove tikvice) ili preko kolektora frakcija.

Stupac u koloni nikad nesmije ostati suh to se osigurava dovoljnim volumenom razvijaa iznad

stupca u koloni. Svaka sakupljena frakcija se moe analizirati tankoslojnom kromatografijom

(TLC) kako bi se odabrala frakcija ili frakcije s interesantnim spojem. Kroniatografija na stupcu

uvijek se koristi samo za preparativne svrhe.

PostMBK rada:Priprema stupca u koloni (a) se vri do homogene i kompaktne visine stupca silikagela

od 1 5 - 2 0 cm, pazei pritom da iznad stupca silikagela uvijek postoji odreeni volumen

razvijaa. Koristi se kolona promjera 0,7 cm i visine 40 cm. Zatim se paljivo pipetom

doda 0,1 mL uzorka na vrh stupca silikagela (nanoenje uzorka (b)). Sada se na vrh

staklene kolone postavi lijevak sa razvijaem i podesi protok razvijaa (0,5 - 1 mL/min)

otvaranjem pipca na dnu kolone (eluiranje (c)). Frakcije se hvataju u Erlenmayerovim

tikvicama, kao odijeljeni spojevi to ukazuje razliito obojenje frakcija.

Uzorak: smjesa 10 mg sudan black i 20 mg sudan red otopljenih u 1 mL

razvijaa (petroleter : etil-acetat = 7 : 3 (v/v)). Uzorak je tamno modro obojen.

Stacionarna faza je silikagel granulacije 0,2 - 0,5 mm, prethodno aktiviran 15 min na

110 C u suioniku.

3,5.3. Plinska kromatografija

Plinska kromatografija (engl. Gas Chromatographv, GC) je najee koritena tehnika

odjeljivanja smjesa hlapljivih spojeva. Uzorci za plinsko-kromatografsku analizu moraju biti

hlapljivi (kako bi trenutno isparili u injektoru) i stabilni na temperaturi zagrijavanja

kromatografske kolone. Inertni plin nositelj (mobilna faza) eluira sastojke smjese koji se

odjeljuju na koloni i odlaze do detektora. Plinski kromatograf (slika 28) se sastoji od:

plina nositelja (inertni plin, obino Me. Ar i N2) s regulatorom tlaka i mjeraem protoka

injekcijskog bloka (injektor - sustav za utrcavanje uzorka najee pomou

mikrolitarske trcaljke),

kromatografske kolone sa stacionarnom fazom u termostatiranom prostoru,

60