Simulation d'un système photovoltaïque alimentant une machine ...
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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR – STRASBOURG I
FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THÈSE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ STRASBOURG I
Discipline : Odontologie
présentée et soutenue publiquement
par
Olivier ETIENNE
DEVELOPPEMENT D’INTERFACES A PROPRIETES
ANTIMICROBIENNES PAR LA FONCTIONNALISATION
DE MULTICOUCHES DE POLYELECTROLYTES
Directeur de thèse : M. Christophe EGLES
JURY
M. H. TENENBAUM Rapporteur interne
M. HC. VAN DER MEI Rapporteur externe
M. P. MARIANI Rapporteur externe
M. H. PREISKEL Examinateur
M. C. EGLES Directeur de thèse
A Céline
A ma famille
A mon grand-père là-haut
A mes amis
Qu’ils me pardonnent mon manque de disponibilité, mes absences, mes « mots ».
Que ce travail soit une part de ma reconnaissance envers vous.
Remerciements
Ce travail a été effectué dans le laboratoire de l'unité INSERM 595, Biomatériaux : processus
biophysiques et biologiques aux interfaces à Strasbourg. Je tiens tout particulièrement à
remercier son directeur Monsieur Jean-Claude Voegel de m'y avoir accueilli, ainsi que le
Doyen de la Faculté d’Odontologie de Strasbourg auquel le laboratoire est rattaché, Monsieur
le Professeur Youssef Haikel.
Je remercie chaleureusement mon Directeur de thèse, Christophe Egles, Professeur associé en
Biologie à l'Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I), sans qui rien ne serait
là aujourd’hui. Il a su faire découvrir au clinicien que je suis, le plaisir et la patience
nécessaire dans la recherche. Il a été présent dans mes débuts incertains, dans mes moments
de découragements ; il a su gérer mon stress sans jamais me faire part du sien.
Je remercie Madame Joelle Ogier, Professeur en Biologie à l'Université Louis Pasteur (UFR
Odontologie, Strasbourg I), qui a assuré la co-direction de ce travail durant les deux premières
années. Je la remercie de m’avoir fait confiance en me confiant ce projet de thèse.
Je suis très sensible à l'honneur que me font Messieurs Henri Tenenbaum, Professeur à
l'Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I), Paul Mariani, Professeur à
l’Université de la Méditerranée (UFR Odontologie, Marseille II) et Heynie Van der Mei,
Professeur de Microbiologie à l'Université de Groningen (Laboratoire d’ingénierie
biomédicale, Hollande) en acceptant d'être les rapporteurs de ce travail. Je leur adresse mes
sincères remerciements.
Je remercie également Monsieur Harold Preiskel, Professeur à l’Université de Londres
(Grande-Bretagne) qui me fait le grand honneur de faire partie du jury de cette thèse. Je
l'assure de ma profonde gratitude, ainsi que de ma sincère reconnaissance.
J'aimerais témoigner ma profonde reconnaissance à Madame Corinne Taddéi, Maître de
Conférence à l’Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I) qui m’a soutenue
dans la réalisation de ce travail et qui me fait l’honneur de faire partie de ce jury de thèse.
Cette étude est l'aboutissement d'un travail d'équipe. Aussi, je souhaite remercier tous les
intervenants directs ou non et plus particulièrement ceux qui m'ont encouragée et soutenue
durant la réalisation de ce travail, ainsi que pour les moments de détentes que nous avons
partagés ensemble. Je tiens à remercier tous les membres du laboratoire :
Catherine P. qui reste un modèle de capacité et de rigueur de travail pour moi.
Ludovic R. qui a toujours fait preuve d’une grande disponibilité et d’une gentillesse à toute
épreuve.
Anne-laure B. même si ce fut bref, ce fut avec plaisir.
Bernard S. qui a su me rendre (presque) clairs les équations et autres tests statistiques durant
ce travail.
Constant V., Dominique V., Stéphanie M., Fouzia B., Pascale S., Vincent B., Philippe L.,
Nadia J., Csilla G. et Frédéric C., Christine A., Géraldine K., Eric H., Florent M., Marina K,
Youri A. Agi C., Amal N., Joseph H., René E., pour toutes vos attentions lors de mon travail,
vos réponses et votre aide.
Aurore, Géraldine, Marion, Monica, les dernières arrivées…pleines de bonne humeur
Sophie et peggy mes « supporters » de tous les jours au cabinet.
Pierre K., Céline K., Mélanie, Ludovic et tous les étudiants stagiaires pour les bons moments
que nous avons partagés.
Table des Matières
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS................................................................................................................. 2
TABLE DES MATIERES......................................................................................................... 7
ABREVIATIONS ET SYMBOLES .......................................................................................... 9
INTRODUCTION ................................................................................................................... 11
DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................................................... 15
Chapitre 1 : Les biofilms bactériens et fongiques .................................................................. 161.1 : Les biofilms bactériens ........................................................................................................... 16
1.1.1. Développement du biofilm bactérien................................................................................................. 171.1.2. Résistance aux antibiotiques.............................................................................................................. 18
1.2 : Les biofilms fongiques ............................................................................................................ 201.2.1. Développement du biofilm candidal.................................................................................................. 20
1.2.1.1. Une forme clinique : la stomatite sous-prothétique ................................................................... 221.2.2. La résistance aux antifongiques......................................................................................................... 24
Chapitre 2 : Les traitements antimicrobiens de surface des biomatériaux........................... 252.1 : Les traitements physico-chimiques ....................................................................................... 26
2.1.1. La mouillabilité de surface ................................................................................................................ 262.1.2. La charge de surface .......................................................................................................................... 272.1.3. La topographie et la rugosité de surface ............................................................................................ 28
2.2 : Les traitements par incorporation d’agents antimicrobiens .............................................. 282.2.1. Les recouvrements à l’héparine ......................................................................................................... 292.2.2. L’imprégnation par des antiseptiques ................................................................................................ 292.2.3. L’imprégnation par des agents antibiotiques ..................................................................................... 312.2.4. Les nouveaux axes de recherche........................................................................................................ 34
Chapitre 3 : Les films en multicouche de polyélectrolytes..................................................... 363.1 : Aspects physico-chimiques des films en multicouche .......................................................... 36
3.1.1. Principe du dépôt couche par couche ................................................................................................ 363.1.2. Nature du substrat.............................................................................................................................. 393.1.3. Croissance du film en multicouches .................................................................................................. 40
3.1.3.1. Les films à croissance linéaire ................................................................................................... 413.1.3.2. Les films à croissance exponentielle.......................................................................................... 41
3.2 : Fonctionnalisation des films en multicouche........................................................................ 433.2.1. Fonctionnalisation par insertion de peptides ou de molécules libres ................................................. 443.2.2. Fonctionnalisation par couplage de peptides ou de molécules .......................................................... 453.2.3. Fonctionnalisation par les propriétés propres des polyélectrolytes.................................................... 46
Chapitre 4 : Les peptides antimicrobiens ............................................................................... 494.1 : Deux systèmes de défense immunitaire................................................................................. 49
4.1.1. La reconnaissance de I’infection par le système immunitaire inné ................................................... 504.1.2. Les mécanismes effecteurs de la réponse innée................................................................................. 52
4.2 : Les peptides antimicrobiens................................................................................................... 534.2.1. Structure et diversité des peptides antimicrobiens............................................................................. 53
Table des Matières
4.2.2. Mécanismes d’action ......................................................................................................................... 554.2.2.1. Spécificité d’action .................................................................................................................... 554.2.2.2. Mode d’action ............................................................................................................................ 584.2.2.3. Mécanismes de la mort cellulaire............................................................................................... 654.2.2.4. La synergie d’action................................................................................................................... 66
4.2.3. Résistance des micro-organismes ...................................................................................................... 67
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................. 69
Chapitre 1 : Matériel ............................................................................................................... 701.1 : Polyélectrolytes ....................................................................................................................... 70
1.1.1. Construction des films multicouches de polyélectrolytes.................................................................. 71
1.2 : Peptides antimicrobiens ......................................................................................................... 721.2.1. La Défensine...................................................................................................................................... 721.2.2. La Chromofungine............................................................................................................................. 73
1.3 : Synthèse du copolymère de l'acide poly(L-glutamique) / poly(éthylène glycol)................ 73
Chapitre 2 : Méthodes ............................................................................................................. 762.1 : Analyses physico-chimiques................................................................................................... 76
2.1.1. Spectroscopie optique par guide d’onde............................................................................................ 762.1.1.1. Principe et description de la technique ...................................................................................... 762.1.1.2. Protocole expérimental .............................................................................................................. 782.1.1.3. Traitement du signal .................................................................................................................. 79
2.1.2. Microbalance à cristal de quartz ........................................................................................................ 802.1.2.1. Principe ...................................................................................................................................... 802.1.2.2. Protocole expérimental .............................................................................................................. 82
2.1.3. Mesure du potentiel d’écoulement..................................................................................................... 832.1.3.1. Dispositif expérimental.............................................................................................................. 852.1.3.2. Procédure de mesure.................................................................................................................. 86
2.1.4. Microscopie de fluorescence ............................................................................................................. 872.1.5. Microscopie à épi-fluorescence ......................................................................................................... 872.1.6. Microscopie confocale....................................................................................................................... 882.1.7. Microscopie électronique à balayage................................................................................................. 90
2.2 : Analyses Biologiques .............................................................................................................. 942.2.1. Cultures cellulaires ............................................................................................................................ 94
2.2.1.1. Cultures bactériennes................................................................................................................. 942.2.1.2. Culture de Candida albicans ...................................................................................................... 952.2.1.3. Culture des fibroblastes.............................................................................................................. 952.2.1.4. Culture des cellules épithéliales................................................................................................. 95
2.2.2. Modification génétique des souches E. coli....................................................................................... 962.2.3. Adhésion bactérienne ........................................................................................................................ 972.2.4. Dosage de l’activité anti-microbienne par microtitration .................................................................. 97
RESULTATS: FONCTIONNALISATION DES MULTICOUCHES .................................. 99
Fonctionnalisation par le poly(éthylène-glycol) .................................................................. 100
Fonctionnalisation par la Défensine .................................................................................... 103
Applications aux matériaux prothétiques oraux.................................................................. 107
Films de polysaccharides dégradables.................................................................................. 127
Fonctionnalisation par la Chromofungine .......................................................................... 156
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 178
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................ 186
Abréviations et symboles
ABREVIATIONS ET
SYMBOLES
Polymères:
CHI: chitosan
HA: hyaluronane ou acide hyaluronique
PAA acide poly(acrylique)
PAH: poly(allylamine hydrochloryde)
PDADMAC poly(diallyldimethylammonium)
PEG: poly(éthylène glycol)
PEI: poly(éthylène imine)
PGA: acide poly(L-glutamique)
PLL: poly(L-lysine)
PMMA polyméthacrylate de méthyle
PSS: poly(styrène sulfonate)
PTFE poly(tetra-fluoro-éthane)
PVS: polyvinyl siloxane ou silicone
Protéines et enzymes
α-MSH: α-mélanocortine : “alpha-melanocyte stimulating hormone”
BMP : protéine morphogénique osseuse : (bone morphogenic protein)
CL cardiolipine
GFP: protéine fluorescente verte : “ green fluorescence protein”
HSA: albumine sérique humaine : “ human serum albumin”
IgG: immunoglobuline G
Abréviations et symboles
PC phosphatidylcholine
PE phosphatidyléthanolamine
PG phosphatidylglycérol
PS phosphatidylsérine
SM sphyngomyéline
RGD : Arginine - Glycine - Asparagine
TNFα: facteur de nécrose de tumeurs : ” tumoral necrose factor “
Réactifs et solvants utilisés :
EDC: 1-Ethyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide
HCl acide chlorhydrique
NaOH Hypochlorite de sodium
FITC : fluorescéine isothiocyanate
Sulfo-NHS: N-hydroxysulfo succinimide
TR : rouge Texas
Molécules thérapeutiques :
Chx Chlorhexidine
Min Minocycline
Rif Rifampicine
SAg Sulfate d’argent
Appareils et techniques utilisés :
OWLS: spectroscopie optique par guide d'onde
QCM-D : microbalance à cristal de quartz avec étude de la dissipation
CLSM : microscopie confocale
FRAP : mesure de fluorescence après photo-blanchiment
AFM: microscopie à force atomique
FTIR: spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier
Introduction
Introduction
Les matériaux utilisés en odontologie ont évolué progressivement au gré des
connaissances technologiques et biologiques. Depuis les tout premiers temps et l’utilisation
« mimétique » de l’ivoire animal, l’amélioration et la maîtrise des procédés de fabrication ont
permis l’utilisation d’éléments synthétiques variés. La dernière génération de matériaux a
notamment pour but d’agir sur la réponse de l’hôte en cherchant à favoriser une intégration
maximum aux tissus environnants. Les diverses applications des hydroxyapatites, en
parodontologie comme en implantologie en sont la concrétisation clinique. Les protéines
morphogénétiques osseuses recombinées par génie génétique et associées à des matériaux de
comblement confirment également l’apport de la biologie moléculaire à l’élaboration des
biomatériaux de demain.
Ces interfaces nouvelles sont dites « bioactives ». Elles facilitent ou stimulent la
réponse de l’hôte. Parmi les axes de recherche engagés en matière de bioactivité à l’interface
matériau/tissu, la protection antimicrobienne répond à une attente dans de nombreux
domaines médicaux où l’infection post-opératoire est redoutée. Ainsi les systèmes
implantables temporaires tels les drains et les cathéters, ou permanents comme les stents
vasculaires ou les valves cardiaques sont des surfaces dont la colonisation par un biofilm
microbien peut avoir des conséquences catastrophiques. La constitution de ce biofilm à la
surface des matériaux se fait en trois temps bien définis: l'attachement, la colonisation et
l'accroissement. Une fois le biofilm constitué, la résistance de cette structure aux antibiotiques
explique la persistance des infections chroniques malgré les traitements systémiques déployés.
En odontologie, l’application d’une protection antimicrobienne à l’interface du
matériau trouve aussi de nombreuses indications potentielles. Parmi celles-ci, la protection
des résines acryliques, largement utilisées dans les domaines prothétiques, est une indication
de premier ordre. En effet, la surface de la résine acrylique est très rapidement envahie par la
flore commensale de la bouche. Les porosités de surface contribuent largement à créer ces
niches écologiques. Les dépôts bactériens et fongiques ainsi établis sont des réservoirs
infectieux alimentant en permanence les biofilms des surfaces dentaires et de la muqueuse
buccale.
Elles participent ainsi à l’aggravation des pathologies carieuses, parodontales, voire
parfois à l’établissement d’une stomatite candidosique sous-prothétique. Cette dernière
Introduction
constitue la forme de candidose la plus fréquente en bouche, impliquant principalement
Candida albicans associé à d’autres micro-organismes. Elle s’observe presque exclusivement
au maxillaire où la prothèse isole plus efficacement la muqueuse palatine de la salive et de ses
agents antimicrobiens. Les diverses études épidémiologiques rapportent des taux moyens
d’environ 50% des porteurs de prothèses amovibles présentant, à des stades d’évolution
divers, une stomatite sous-prothétique.
Le projet de cette thèse repose sur l’exploitation d’un procédé de recouvrement de
surface original : le film de polyélectrolytes en multicouches, et sur sa fonctionnalisation par
des peptides antimicrobiens. L’auto-assemblage de polyélectrolytes de charges alternées,
décrit par G. DECHER, permet la formation d’un film nanométrique au sein duquel peuvent
être incorporés divers éléments organiques ou inorganiques. Parmi les éléments
potentiellement incorporables, les peptides antimicrobiens constituent un axe de recherche
intéressant face à l’accroissement des phénomènes de résistance aux antibiotiques. On les
retrouve dans de nombreuses espèces comme les amphibiens, les insectes et les humains.
Cette particularité de conservation phylogénétique caractérise des mécanismes d’action
généralement basiques bien qu’essentiels. Leur mode d’action, encore mal connu, repose le
plus souvent sur une déstabilisation membranaire, ce qui leur confère des perspectives
médicales intéressantes dans la mesure où les risques de résistance sont faibles. Cette
immunité innée a été progressivement supplantée chez l’homme par l’immunité acquise, mais
la présence dans de nombreux fluides ou tissus organiques de peptides antimicrobiens
confirme leur rôle toujours actuel comme barrière de défense précoce de l’organisme. Cette
spécificité permet un traitement ciblé et limite les risques de déstabilisation de l’équilibre de
la flore buccale.
Deux axes d’activité antimicrobienne ont été envisagés : le premier consiste à conférer
des propriétés anti-adhésives purement physico-chimiques à ce film multicouches de
polyélectrolytes afin d’empêcher le stade initial de développement du biofilm; le deuxième
exploite les propriétés des peptides antimicrobiens incorporés dans le film.
Dans un premier temps, l’utilisation d’un polyanion (acide polyglutamique) couplé à
des molécules de poly(éthylène-glycol) dans l’assemblage du film en multicouches, nous a
permis d’obtenir une réduction de plus de 90% de l’adhésion à court terme de bactéries
Escherichia coli sur des surfaces de verre. (article 1)
Introduction
Dans un deuxième temps, nous avons cherché à caractériser l’incorporation d’un
peptide antimicrobien, la Défensine d’Anopheles gambiae, au sein de ce film en multicouches
de polyélectrolytes. Nous avons pu démontrer l’activité antimicrobienne de l’architecture
obtenue sur deux souches bactériennes (E. coli D22 et Micrococcus luteus). (article 2)
Dans l’optique d’une application orale, nous nous sommes alors intéressés à la
dégradation de ces films dans des conditions in vitro simulant l’environnement buccal et dans
des conditions in vivo sur un modèle animal. Deux catégories de films en multicouches ont été
étudiées, l’une construite à base de polyélectrolytes (l’acide poly(L-glutamique) et la poly(L-
lysine)), l’autre à base de polysaccharides naturels (le chitosan et l’acide hyaluronique). Ces
deux types de films ont montré des profils de dégradation très différents, laissant envisager
une exploitation comme outil de relargage contrôlé pour les films à base de polysaccharides et
une exploitation de protection à moyen terme pour les films à base de polyélectrolytes.
(articles 3&4)
Enfin, afin d’envisager une application à la protection de matériau contre l’infection
candidosique, nous avons étudié l’activité de films de polyélectrolytes incorporant un peptide
antimicrobien dont l’activité anti-candidale avait été démontrée : la Chromofungine. La
pénétration du peptide dans les C. albicans cultivés à la surface du film a été objectivée, et un
modèle de candidose orale chez le rat wistar nous a permis de confirmer l’interêt
antimicrobien de notre revêtement in vivo. (article 5)
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
1Chapitre 1 : Les biofilms bactériens et fongiques
1.1 : Les biofilms bactériens
La grande majorité des micro-organismes se développe préférentiellement à l’état
sessile, fixés sur un support, plutôt qu’à l’état planctonique, libres et isolés dans le milieu
environnemental. Ce mode de vie permet à la population microbienne de s’installer et de
coloniser un environnement. L’état sessile ne se réduit cependant pas à l’attachement sur
une surface, mais constitue une réelle stratégie de survie, par la mise en place et le
développement d’une communauté véritablement organisée, à laquelle W. Costerton a
donné le nom de « biofilm » dès 1978 (Costerton, Geesey et al. 1978). Ces biofilms ont
été décrits dans un premier temps à travers les conséquences macroscopiques qu’ils
pouvaient avoir sur le recouvrement et la corrosion des canalisations ou bien encore des
coques de bateaux. Depuis quelques années, leur importance dans le domaine de
l’infectiologie médicale apparaît capitale, puisqu’on estime à près de 65% le nombre
d’infections bactériennes chez l’homme impliquant un biofilm (Chicurel 2000). La
formation d’un biofilm a été décrite sur de nombreux biomatériaux (Silverstein and
Donatucci 2003) (cathéters, valves cardiaques, matériel orthopédique,…), à partir
desquels ils peuvent attaquer les tissus corporels environnants. Les conséquences de ces
infections peuvent être désastreuses, imposant souvent la dépose du matériel prothétique
et pouvant même mettre en jeu le pronostic vital du patient dans le cas d’une septicémie
généralisée. La gestion de ces complications constitue une prise en charge souvent
difficile et coûteuse.
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
1.1.1. Développement du biofilm bactérien
Le biofilm bactérien peut se définir comme une communauté bactérienne,
adhérente à une surface et enrobée d’une matrice exopolysaccharidique (Costerton,
Stewart et al. 1999). Son développement répond classiquement à trois étapes
successives : l’attachement, la colonisation et l’accroissement (Hall-Stoodley,
Costerton et al. 2004). L’étape initiale d’attachement fait intervenir, pour certaines
espèces, des appendices générateurs de mouvements, qui permettent l’approche de la
surface à coloniser (O'Toole and Kolter 1998). Cette approche permet, par le biais de
protéines spécifiques comme les adhésines, un attachement transitoire et une
évaluation de la surface à coloniser. Dans un
deuxième temps, une association plus stable
avec la surface elle-même ou avec d’autres
micro-organismes déjà présents peut alors
s’établir (Hinsa, Espinosa-Urgel et al. 2003).
Ces rassemblements conduisent à la formation
de micro-colonies, dont la différenciation
cellulaire mène à l’élaboration du biofilm
(Stoodley, Sauer et al. 2002; Webb, Givskov et
al. 2003). La matrice exopolysaccharidique,
dont le volume peut représenter jusqu’à 85% du
volume total du biofilm, renforce sa structure,
tout en lui conservant une grande plasticité.
L’organisation d’un réseau de canaux aqueux au
sein du biofilm permet l’acheminement de
l’oxygène et des nutriments entre les micro-
colonies et vers les régions les plus enfouies,
ainsi que l’évacuation des déchets. Toutefois,
u
d
a
d
K
F
D
igure 1-1 : Biofilm bactérien observé enmicroscopie électronique à transmission’après (Costerton, Stewart et al. 1999).
n gradient de nutriments et d’oxygène existe depuis la superficie vers la profondeur
u biofilm, où l’environnement devient plus propice aux organismes évoluant en
naérobiose. Ainsi, l’état métabolique d’une bactérie au sein du biofilm peut être
irectement dépendant de sa localisation à l’intérieur de la structure (O'Toole,
aplan et al. 2000; Tolker-Nielsen and Molin 2000; O'Toole 2003). La capacité des
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
bactéries à former des biofilms a été largement étudiée, sur de nombreuses espèces
différentes : Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Vibriae cholerae,
Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa. La détermination des modifications
d’expressions génétiques des différentes espèces, à la fois dans le but de leur
conférer des capacités à développer des organelles spécialisées dans les
déplacements (flagelles, pili, fimbriae,..) et dans l’organisation communautaire, fait
l’objet de nombreuses recherches. Prigent-Combaret et coll. (Prigent-Combaret and
Lejeune 1999) ont ainsi mis en évidence une modification dans l’expression de 38%
des gènes d’ E. coli lors de la formation d’un biofilm. Ces modifications dans
l’expression des gènes semblent coordonnées par un mode de régulation particulier,
correspondant à un mode de communication spécifique entre bactéries d’une même
espèce. Ce système, particulièrement étudié sur le modèle de biofilm développé par
P. aeruginosa, est appelé « quorum sensing » (Parsek and Greenberg 2000). Il est
basé sur la sécrétion de phéromones diffusibles, les acyl-homosérines lactones (acyl-
HSL), et leur réception par les récepteurs membranaires des bactéries de la même
espèce. Les HSL produits par une bactérie présentent des longueurs et des
substitutions différentes dans leurs chaînes d’acides gras. Elles donnent une
indication de la densité cellulaire dans un environnement donné, et conditionnent au-
delà d’un certain seuil la formation du biofilm, voire le déploiement de facteurs
toxiques pour certaines souches pathogènes (de Kievit and Iglewski 2000). Ces
systèmes de signalisations semblent aussi intervenir dans des interactions entre
bactéries d’espèces différentes, sans que ces mécanismes soient encore bien élucidés
(Chicurel 2000).
1.1.2. Résistance aux antibiotiques
L’éradication d’un biofilm bactérien pose de gros problèmes cliniques, car
l’antibiothérapie active habituellement sur les bactéries à l’état planctoniques se
révèle bien souvent moins efficace sur des structures organisées en biofilm (Brooun,
Liu et al. 2000; Stewart and Costerton 2001).
Les mécanismes de résistance habituels, basés sur des modifications
enzymatiques, des mutations ou des pompes membranaires d’efflux, ne semblent pas
entrer en jeu dans les résistances observées dans les biofilms bactériens (Mah and
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
O'Toole 2001). En revanche, la dispersion des bactéries d’un biofilm permet
généralement de constater l’efficacité des antibiotiques adaptés (Anwar, van Biesen
et al. 1989; Williams, Venables et al. 1997).
Trois hypothèses principales sont avancées afin d’expliciter les mécanismes de
résistance des biofilms aux antibiotiques (Stewart and Costerton 2001). La première
repose sur une notion de barrière physique qui expliquerait la pénétration lente et
incomplète de certains antibiotiques. La seconde hypothèse est liée à
l’environnement spécifique du biofilm, dont les zones les plus profondes, riches en
résidus acides et pauvres en oxygène et en nutriments, pourraient gêner l’action de
l’antibiotique. Enfin, la dernière hypothèse s’appuie sur les modifications
phénotypiques observées dans certains biofilms et dont les micro-organismes
constituants pourraient présenter des formes plus résistantes. Ces trois hypothèses
reposent sur la nature communautaire et multi-cellulaire du biofilm. La plupart des
spectres antibiotiques ont été étudiés sur des formes planctoniques, et doivent
maintenant être étudiés sur des
modèles de biofilms plus
complexes. Ainsi, de nouvelles
concentrations minimales
d’inhibition, ainsi que de
nouvelles associations
médicamenteuses doivent être
envisagées. Les recherches
actuelles essaient d’envisager
des molécules capables de
rompre ou d’empêcher la
formation de la matrice
polysaccharidique, voire d’agir
sur les signaux de
différentiation du « quorum
sensing ».
Pénétration en profondeur
La matriceexopolysaccharidique gênela diffusion du peptide enprofondeur.
Phénotype résistant
Certaines bactériesexpriment un phénotyperésistant lorsqu’elles sontdans le biofilm.
Micro-environnement
Les zones les plusprofondes sont unenvironnement enanaérobie et riche endéchets.
Figure 1-2 Les trois mécanismes de résistancedu biofilm aux antibiotiques.
D’après (Costerton, Stewart et al. 1999)
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
1.2 : Les biofilms fongiques
Les biofilms fongiques n’ont fait l’objet de travaux que depuis une vingtaine
d’années. Ces derniers sont pourtant de plus en plus souvent impliqués dans les
pathologies nosocomiales, lors de soins intensifs prolongés ou dans des populations à
risque comme les patients greffés ou séropositifs, qui sont immuno-déprimés. Parmi les
souches les plus souvent rencontrées lors de ces infections fongiques, le genre Candida, et
plus particulièrement l’espèce C. albicans, semble capable d’engendrer des complications
locales et générales. Ces candidoses sont généralement associées à des matériels médicaux
(Kojic and Darouiche 2004), implantés ou temporaires (cathéters, valves cardiaques,
lentilles, prothèses laryngées…), qui favorisent le développement du biofilm candidal à
leur surface.
1.2.1. Développement du biofilm candidal
La formation de ce biofilm répond aux mêmes étapes que celle d’un biofilm
bactérien, toutefois lors de la phase de colonisation une modification morphologique
est observable, caractérisée par l’apparition de filaments appellés hyphes. Le biofilm
mature est composé de morphotypes divers, spores, hyphes et pseudo-hyphes,
intégrés dans une matrice polysaccharidique. La nature chimique de la surface
influence la formation du biofilm: les surfaces comme le latex favorisent cette
formation, tandis qu’elle apparaît plus difficile sur des surfaces de polyuréthane ou
de silicone (Hawser and Douglas 1994) . L’architecture du biofilm candidal est aussi
influencée par le support sur lequel il se développe, laissant envisager des
mécanismes de régulation génétique hautement spécifiques, dépendants de la
réponse au contact avec la surface (Douglas 2003). L’hydrophobicité de la surface
semble positivement corrélée avec la formation du biofilm (Li, Yan et al. 2003), et
des conditions environnementales comme les turbulences rencontrées dans les
cathéters vasculaires ou urétraux favorisent la croissance de la levure (Hawser,
Baillie et al. 1998; Kojic and Darouiche 2004).
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
Figure 1-3 Biofilm candidal sur cathéter, dans la lumière interne (A) et sur la face externe (B).D’après (Lew and Kaveh 2000)
Les capacités de modification du phénotype, appelée « phenotypal switching »,
semblent aussi jouer un rôle prépondérant dans la formation de ce biofilm. Dans une
étude comparant le biofilm développé sur des cathéters par des souches C. albicans
sauvages et mutantes, incapables de polymorphisme, Baillie G. et Douglas LJ.
(Baillie and Douglas 1999) observent une architecture de biofilm totalement
différente et une adhérence à la surface du cathéter moindre pour les biofilms des
mutants. Ils suggèrent que le dimorphisme entre la forme sporulée et la forme avec
hyphes soit une condition nécessaire au développement du biofilm et par là même
une condition de la pathogénicité de C. albicans. Cette capacité de modification de
son phénotype permet à la levure de s’adapter aux conditions environnementales,
notamment lors de la croissance du biofilm, et explique aussi la grande diversité de
phénotypes selon sa localisation (orale, vaginale, urétrale, environnementale,…).
Des études récentes ont mis en évidence l’activation de gènes spécifiques lors
de cette phase de croissance, qui permettrait l’acquisition de ces phénotypes
particuliers (Garcia-Sanchez, Aubert et al. 2004). L’activation de ces gènes semble
sous la dépendance de molécules de signalisation de type « quorum sensing »,
certaines assurant un contrôle positif sur le passage à la forme hyphe comme le
tyrosol (Chen, Fujita et al. 2004), d’autres comme le farnesol un contrôle négatif
(Sato, Watanabe et al. 2004). Ces molécules constitueront certainement de nouvelles
voies thérapeutiques dans le futur.
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
1.2.1.1. Une forme clinique : la stomatite sous-prothétique
Dans le domaine odontologique, la pathologie la plus fréquente impliquant un
biofilm fongique est représenté par la stomatite sous-prothétique. Encore appellée
candidose sous-prothétique, c’est une forme de complication infectieuse impliquant
principalement C. albicans et qui peut affecter jusqu’à 65% des porteurs de prothèse
amovible complète (Budtz-Jorgensen 1990; 1990). La prévalence de cette candidose
est particulièrement forte dans les populations à risques que constituent les immuno-
déprimés, les diabétiques et plus généralement les patients âgés. Selon les études, la
proportion de patients hospitalisés et immuno-déprimés représente de 8 à 9% du
total des hospitalisés; de même le taux de prévalence du diabète dans l’union
européenne atteignait 4,1% en l’an 2000 (source OMS). Quant aux données
épidémiologiques concernant le vieillissement de la population, l’INSEE prévoit
qu’en 2050, en France, un tiers de la population (soit environ 22 millions de
personnes) sera âgée de plus de 60 ans. Ces données épidémiologiques confirment
que la candidose orale sous-prothétique sera certainement une préoccupation
croissante pour les années à venir.
Cette candidose, qui siège surtout au maxillaire et rarement à la mandibule
(Iacopino and Wathen 1992), est classiquement limitée, partiellement ou en totalité,
à la zone de muqueuse recouverte par la prothèse dentaire amovible. La muqueuse
présente alors un état inflammatoire chronique.
Figure 1-4 Candidose sous-prothétique : (A) forme modérée sous une prothèse amovible complète. (B) forme
sévère sous une prothèse amovible partielle. (Doc. Personnelle)
L’expérience montre que devant une stomatite prothétique, les praticiens
envisagent plus facilement soit une allergie à la résine acrylique qui reste très
exceptionnelle, soit un traumatisme prothétique. Or la nature candidosique de cette
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
stomatite est presque toujours retrouvée lorsqu’elle est recherchée. La présence de la
prothèse recouvrant la muqueuse palatine favorise la survenue d’une candidose. En
effet la muqueuse ne subit plus l’auto-nettoyage par la langue et par le brassage
alimentaire lors des repas, ce qui entraîne la stagnation de plaque dentaire sous la
prothèse et une légère diminution du pH buccal à ce niveau (Jeganathan and Lin
1992). Cette candidose, souvent asymptomatique, surtout au début, se décline selon
trois formes cliniques: un érythème punctiforme, ou diffus, ou bien encore une
hyperplasie épithéliale inflammatoire qui en constitue la forme la plus grave. La
porosité de l’intrados de la prothèse en résine acrylique permet à Candida et aux
autres germes saprophytes buccaux de trouver refuge. Ils sont toujours présents en
grand nombre sur la face muqueuse de la prothèse. Candida albicans, à l’état
parasitaire, présente des filaments à extrémités arrrondies, de 3 à 5 µm de diamètre,
et de longueur variable. Ces hyphes, résultent de l’alignement des blastospores
(forme commensale).
Figure 1-5 Biofilm prothétique. Observation en microscopie à balayage du biofilm à la surface d’une résineà prise retard après 21 jours de port.
En effet, les bourgeons ne se séparent pas de la cellule mère, prennent une
forme cylindrique réalisant un pseudomycélium (Samson 1990). L’analyse
ultrastructurale de ces formes parasitaires confirme la présence de nombreux noyaux
dans une masse cytoplasmique mobile (Walter and Frank 1985; Walter, Frank et al.
1986). Ce mycelium composé d’hyphes plus ou moins allongés et ramifiés envahit
les tissus épithélio-conjonctifs (Holmstrup and Axell 1990). Lorsque les hyphes sont
Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques
de grande taille, ils ne peuvent plus être phagocytés, des mécanismes comme la
prolifération et la desquamation de la barrière épithéliale sont alors nécessaires.
L’infection candidosique est sans doute l’élément inducteur ou déclenchant de la
stomatite, mais l’irritation traumatique par la prothèse qui occluse le palais, la prise
de certains psychotropes, le tabagisme, une mauvaise hygiène buccale et un mauvais
nettoyage de la prothèse sont sûrement des facteurs prédisposants ou aggravants non
négligeables (Lucas 1993).
1.2.2. La résistance aux antifongiques
La résistance des biofilms impliquant C. albicans a été étudiée par de
nombreux auteurs. Chandra et coll. (Chandra, Kuhn et al. 2001) ont étudié la
formation de tels biofilms sur des surfaces de polyméthacrylate de méthyle et ont
montré que leur résistance vis-à-vis des traitements antifongiques classiques que
sont l’amphothéricine B, la nystatine, le fluconazole et la chlorhexidine, s’accroît au
fur et à mesure de la formation du biofilm. Ces résultats sont concordants avec ceux
observés par d’autres équipes sur des biofilms développés à la surface de cathéters
(Hawser and Douglas 1995; Baillie and Douglas 1999). De nouvelles molécules,
telles les echinocandines et les formulations lipidiques de l’amphotéricine B,
semblent avoir une activité sur le biofilm candidal (Jabra-Rizk, Falkler et al. 2004;
Kuhn and Ghannoum 2004). Les recommandations actuelles imposent quasi-
systématiquement la dépose du matériel médical car malgré une thérapie
antifongique adaptée, le risque de développer une candidose généralisée est
important. Les études relevant les cas de candidémie observent une mortalité allant
jusqu’à 40% des cas (Colombo and Guimaraes 2003; Martin, Mannino et al. 2003).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
2Chapitre 2 : Les traitements antimicrobiens de surface
des biomatériaux
Depuis l’avènement de la notion de biofilm, beaucoup d’efforts ont été faits sur les
biomatériaux et sur leur capacité à ne pas laisser se constituer ce biofilm à leur surface. En
effet, tout processus de contact entre un biomatériau et un tissu engendre une cascade
d'évènements, conséquence de l'adsorption de protéines puis de l’adhésion (ou non) de
diverses cellules à la surface du solide. Ces phénomènes initiaux à l’interface sont
primordiaux car ils conditionnent l'adhésion de bactéries (Van Loosdrecht, Lyklema et al.
1990) mais aussi des éléments cellulaires nécessaires à l’intégration du matériel. Deux
stratégies de traitement de surface sont habituellement étudiées : la première consiste à
lutter contre l’adhésion bactérienne (Jansen, Peters et al. 1988), la seconde, à éliminer ces
agents pathogènes par l’incorporation de molécules antimicrobiennes (Pascual 2002). Ces
deux axes répondent aussi à deux indications cliniques différentes, la première s’adresse à
des matériaux destinés à être explantés ou à usage temporaire, tandis que la seconde
s’adresse à des matériaux implantés dans un tissu à long terme.
Dans le but de modifier la surface des biomatériaux, diverses approches peuvent être
utilisées :
• la modulation des propriétés physico-chimiques de surface telles que la
mouillabilité, la charge de surface ou la rugosité,
• le greffage de molécules en surface du matériau ou le dépôt par adsorption de
molécules qui assureront un relargage contrôlé,
Selon les applications recherchées, le recouvrement de surface devra être stable dans
le temps ou il pourra être dégradé rapidement, selon que la protection recherchée soit de
plusieurs mois ou de quelques heures.
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
2.1 : Les traitements physico-chimiques
De nombreux paramètres sont reconnus influencer l’adhésion bactérienne. Parmi
ceux-ci, on peut citer : le caractère hydrophile/hydrophobe de la surface, défini par sa
mouillabilité ; les forces électrostatiques en présence, caractérisées par les charges de
surface du biomatériau et de la membrane bactérienne ; la topographie et la rugosité de la
surface qui conditionnent la facilité d’adhésion bactérienne.
2.1.1. La mouillabilité de surface
Le caractère hydrophobe ou hydrophile d’une surface joue un rôle sur
l’adsorption des protéines, sur l’étalement cellulaire, et sur l’adhésion bactérienne.
Van Dijk et al. (van Dijk, Herkstroter et al. 1987) ont ainsi étudié in vitro chez le
chien beagle, la relation entre l’énergie de surface et l’adhésion de streptocoques sur
des échantillons de poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA), de poly(vinyl siloxane)
(PVS) et de poly(tétra-fluoro-éthane) (PTFE). Ces différents échantillons, fixés sur
des couronnes réalisées sur les molaires des chiens, sont récupérés 2 heures après
leur mise en place. Ils concluent qu’une forte énergie de surface est corrélée avec
une forte adhésion. Des travaux plus récents sur l’adhésion de C. albicans à des
surfaces de PVS confirment ces résultats (Waters, Williams et al. 1997). De façon
plus générale, il est souvent constaté que les surfaces très hydrophobes conduisent à
une faible adhésion (Olsson, van der Heijde et al. 1992; Everaert, Mahieu et al.
1999; Tsibouklis, Stone et al. 1999). Les caractéristiques d’énergie de surface du
matériau peuvent être modifiées en ce sens par greffage chimique, avec des
molécules de polyéthylène glycol (Park, Kim et al. 1998; Zhang, Desai et al. 1998),
ou des molécules de Téflon (Legeais, Werner et al. 1998). Enfin, des monocouches
auto-assemblées (SAMs) contenant des groupements fonctionnels différents peuvent
également contribuer à modifier le caractère hydrophile/hydrophobe de la surface
(Margel, Vogler et al. 1993).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
2.1.2. La charge de surface
Il est reconnu que la charge de surface influence l’adhésion cellulaire. Les
forces électrostatiques interviennent en effet dans l’adhésion de la bactérie sur la
surface lorsque la distance est suffisamment faible (moins de 20 nm) (Busscher and
Weerkamp 1987) .
Figure 2-1 Interactions à l'interface du matériau. Pour des distances > à 50 nm seules les forces de Van derWaals interviennent, entre 10-20 nm les répulsions électrostatiques entrent en jeu, à <5 nm des interactionsspécifiques interviennent et maintiennent l’adhésion bactérienne (interactions hydrophobes, électrostatiques
ou de type ligand/récepteur). D’après (Busscher and Weerkamp 1987).
Qiu et al. (Qiu, Sayer et al. 1998) ont montré, sur des surfaces d’oxyde
d’indium et d’étain dont la charge était électriquement modulée, que les cellules
adhèrent plus sur les surfaces positives. Hogt et al. (Hogt, Dankert et al. 1986) ont,
eux, observé l’adhésion de staphylocoques sur divers polymères et confirment la
diminution d’adhésion sur les surfaces chargées négativement. Des études
spécifiques à l’adhésion de C. albicans sur des surfaces de PMMA de charges
différentes ont corroboré ces résultats (Uyen, van der Mei et al. 1989; Harkes, Feijen
et al. 1991). Toutefois, pour Gottenbos et al., les surfaces de charge positive, bien
que favorisant l’adhésion, exerceraient une action antibactérienne sur les bactéries à
Gram négatif (Gottenbos, Grijpma et al. 2001; Gottenbos, van der Mei et al. 2003).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
2.1.3. La topographie et la rugosité de surface
La topographie de surface et en particulier sa rugosité ont une grande
importance vis-à-vis de l’adhésion bactérienne. En ce qui concerne la « micro-
rugosité », elle peut permettre une meilleure adhésion de certains types cellulaires
(Cooper 2000) mais peut aussi être à l’origine d’une forte adhésion bactérienne et
des macrophages (Salthouse 1984) avec le risque associé de réactions
inflammatoires chroniques. De nombreux travaux sur des échantillons de cobalt-
chrome, de PVS et de PMMA confirment que le polissage de la surface permet de
réduire l’adhérence de Candida albicans (Verran and Maryan 1997; Radford, Sweet
et al. 1998; Taylor, Maryan et al. 1998).
En conclusion, les résultats des différentes études apparaissent parfois
contradictoires, laissant perplexes certains auteurs sur la valeur des relations entre les
caractéristiques thermodynamiques d’une surface et sa capacité à influencer l’adhésion
bactérienne (Morra and Cassinelli 1997). Ainsi, le rôle de la pellicule salivaire dans la
diminution globale de l’impact de ces facteurs physico-chimiques est confirmé par de
nombreuses études (Vasilas, Molina et al. 1992; Radford, Sweet et al. 1998). Les modèles
étudiés in vitro diffèrent et ne peuvent rendre compte de la complexité des phénomènes de
l’adhésion bactérienne in vivo, où les interactions protéiques, cellulaires, l’incidence des
flux et des fluides physiologiques, sont autant de cofacteurs influençants.
2.2 : Les traitements par incorporation d’agents antimicrobiens
Divers types de molécules peuvent être déposés à la surface des matériaux. Les
cathéters en polyuréthane sont certainement les dispositifs médicaux ayant le plus
bénéficié de ces divers traitements de surface. Parmi les systèmes les plus répandus, on
peut citer : les recouvrements à l’héparine, les imprégnations aux antiseptiques ou aux
antibiotiques.
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
2.2.1. Les recouvrements à l’héparine
L’héparine est utilisée à la surface de certains cathéters, notamment ceux
destinés à l’artère pulmonaire (cathéters de Swan Ganz). L’héparine prévient la
thrombose en interagissant avec l’antithrombine, diminuant ainsi les dépôts de
fibronectine. Dans une récente méta-analyse (incluant cathéters imprégnés
d’héparine, héparine intraveineuse et sous cutanée), il a été montré que la
prophylaxie anti-thrombotique réduit significativement le risque de colonisation
bactérienne du cathéter, et tend fortement à réduire le risque de bactériémie
(Randolph, Cook et al. 1998). Chez l’enfant, 2 études, confirment ces résultats. Une
étude prospective consécutive a comparé les cathéters fémoraux standards aux
cathéters imprégnés d’héparine. Une hémoculture par le cathéter était réalisée tous
les 3 jours. Il existait un plus faible taux d’hémocultures positives prélevées sur le
cathéter imprégné (Krafte-Jacobs, Sivit et al. 1995). Plus récemment, une étude
randomisée en double aveugle a confirmé ces résultats (209 patients ont été inclus).
Les hémocultures positives étaient moins fréquentes chez les enfants avec un
cathéter imprégné d’héparine (Pierce, Wade et al. 2000). Certains auteurs expliquent
ces propriétés antibactériennes par la forte hydratation de la molécule d’héparine,
qui créerait ainsi une surface hydrophile et anti-adhésive (Arciola, Radin et al.
1993). D’autres auteurs attribuent plutôt ces propriétés antibactériennes au chlorure
de benzalkonium qui est un détergent cationique liant l’héparine à la surface du
matériau (Mermel, Stolz et al. 1993).
2.2.2. L’imprégnation par des antiseptiques
L’iode a été initialement utilisé, mais sans développement commercial
ultérieur malgré des résultats prometteurs in vitro (Jansen, Kristinsson et al. 1992).
Une approche ultérieure, validée par des travaux in vitro (Li, Zhang et al. 1999),
s’est concentrée sur l’imprégnation interne et externe par un ammonium quaternaire,
le chlorure de benzalkonium, et deux études cliniques récentes ont permis d’obtenir
une réduction significative de la colonisation bactérienne (Moss, Tebbs et al. 2000;
Jaeger, Osthaus et al. 2001). En pratique clinique, c’est l’ion argent qui est
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
actuellement le traitement de surface le plus répandu, en raison de sa large activité
sur de nombreux micro-organismes nosocomiaux, tels que les staphylocoques
(résistants ou non à la méticilline), les entérobactéries, P. aeruginosa et C. albicans
(Darouiche 1999). Dès 1979, Akiyama et al. ont rapporté de bons résultats cliniques
avec l’utilisation de cathéters urétraux imprégnés d’ions argent (Akiyama and
Okamoto 1979). En dépit de résultats contrastés et jugés parfois non significatifs
(Bach, Eberhardt et al. 1999) (peut-être liés à la seule imprégnation externe des
cathéters), des résultats prometteurs ont été récemment obtenus avec une technique
de dispersion de micro-particules d’argent dans la matrice même du polyuréthane
(Guggenbichler, Boswald et al. 1999), qui permet de prolonger l’activité anti-
adhésive et anti-colonisation pendant plus d’un mois in vitro. Boswald et al.
(Boswald, Lugauer et al. 1999) ont ainsi obtenu chez 263 malades porteurs de
cathéters de durée moyenne de 8-9 jours une réduction significative de la
colonisation de 23% à 14%.
Les recouvrements à base d’ions argent ont été testés aussi sur des valves
cardiaques, sans complications majeures. Les auteurs ont toutefois noté un pic
sanguin en ions argent juste après la mise en fonction de la valve, confirmant un
relargage partiel (Brutel de la Riviere, Dossche et al. 2000).
L'imprégnation par deux antiseptiques (chlorhexidine/sulfadiazine-argent)
(Chl-SAg), uniquement sur leur face externe, a été initialement proposée par Modak
et al. (Modak, Sampath et al. 1987) en raison de l’activité synergique de ces 2
composants envers un large spectre de micro-organismes. Maki et al. ont obtenu
ainsi une réduction du taux de colonisation (13,5 vs 24%) et de bactériémies liées
aux cathéters (1,0 vs 4,7%) (Maki, Stolz et al. 1997) dans une étude prospective
portant sur 403 cathéters insérés chez 158 malades de réanimation. D'autres études
ne montrent qu'une tendance, non significative, en faveur de tels cathéters (Ciresi,
Albrecht et al. 1996; Pemberton, Ross et al. 1996), voire une absence complète
d’efficacité pour les cathétérismes de durée supérieure à 20 jours en onco-
hématologie (Logghe, Van Ossel et al. 1997), sans doute en raison de la perte
progressive de l’activité antimicrobienne des antiseptiques, élués dans la circulation
au cours du temps, et du fait que l’imprégnation externe seule néglige le risque de
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
contamination endoluminale, qui augmente avec le temps et la multiplication des
manipulations de la ligne veineuse.
Une méta-analyse de la littérature, menée par Veenstra et al. (Veenstra, Saint
et al. 1999) a évalué les 12 études cliniques prospectives ayant comparé ce type de
cathéters imprégnés à des cathéters identiques non imprégnés, soit 2611 cathéters.
Elle conclut à l’efficacité anti-infectieuse de l’imprégnation par chlorhexidine et
sulfadiazine-argent, tant au plan de la colonisation bactérienne que des bactériémies.
Une autre méta-analyse, plus récente, confirme ces données (Marin, Lee et al. 2000).
D’autres recouvrements de surface associant la chlorhexidine et le
chloroxylenol ont démontré une activité antibactérienne forte sur des clous intra-
medullaires (Darouiche, Farmer et al. 1998).
Enfin, plus récemment, une technique de recouvrement de surface par un
complexe hydroxyapatite-chlorhexidine a été proposée en traumatologie, pour la
surface des vis associées aux fixateurs externes (Campbell, Song et al. 2000;
DeJong, DeBerardino et al. 2001). Ce type de traitement améliore à la fois
l’intégration osseuse et la résistance antibactérienne.
Toutefois, des réactions d'hypersensibilité à la chlorhexidine (dont un choc
anaphylactique mortel (Oda, Hamasaki et al. 1997)) auraient été rapportées, et
l’apparition d’une résistance secondaire à ces antiseptiques ne peut être écartée
(Tattawasart, Maillard et al. 1999).
2.2.3. L’imprégnation par des agents antibiotiques
L’imprégnation peut être réalisée industriellement, ou parfois manuellement
lorsque le matériau le permet (ciment à os). Le potentiel clinique de ce nouveau
concept a été évalué pour la première fois en 1991 par Kamal et al. dans une étude
prospective et randomisée, en service de réanimation (Kamal, Pfaller et al. 1991). En
comparant des cathéters veineux centraux imprégnés ou non par la céfazoline, les
auteurs ont montré que les cathéters imprégnés réduisaient de 12% l’incidence de
colonisation bactérienne. Un suivi à long terme a permis aux mêmes auteurs de
confirmer les avantages de ces cathéters imprégnés de céfazoline par rapport aux
cathéters traditionnels (Kamal, Divishek et al. 1998).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
L'imprégnation par deux antibiotiques (minocycline / rifampicine) a été
proposée par Raad et al. (Raad, Darouiche et al. 1996), sur la base d’une activité
anti-staphylococcique de cette combinaison équivalente à celle des glycopeptides, au
moins en application « topique ». Dans une première étude clinique multicentrique,
Raad et al. ont comparé les cathéters Min-Rif au même matériel non imprégné chez
201 malades pour lesquels un cathéter était mis en place pour une durée supérieure à
72 heures. La colonisation et l’incidence des bactériémies étaient significativement
réduites avec les cathéters Min-Rif (26% vs 8%).
Des études récentes ont comparé in vitro et ex vivo les propriétés anti-
adhésives et antibactériennes des cathéters imprégnés de Chl-SAg et de Min-Rif vis
à vis des staphylocoques, des entérobactéries et de Klebsiella pneumoniae. Si
l’activité ex vivo des cathéters Rif-Min envers Staphylococcus aureus minocycline
résistants, S. epidermidis et E. faecalis apparaît supérieure à celle des cathéters Chl-
SAg dans le travail de Marik et al. (Marik, Abraham et al. 1999), les résultats de
Yorganci et al. sont plus nuancés. Dans leur étude, d’une manière générale, les
propriétés anti-infectieuses des 2 types de cathéter étaient similaires et durables (21
jours) pour le staphylocoque (Yorganci, Krepel et al. 2002). De manière
intéressante, les agents antibactériens étaient relargués au cours du temps dans
l’environnement des cathéters, avec un effet bactéricide durable pour Chl-SAg et
bactériostatique pour Min-Rif (Yorganci, Krepel et al. 2002). Dans une étude
multicentrique prospective randomisée, Darouiche et al. ont comparé les cathéters
Min-Rif (avec des concentrations de rifampicine et de minocycline très supérieures à
celles des premières études) aux cathéters Chl-SAg (imprégnés d’antiseptiques
seulement sur leur face externe), chez 738 patients porteurs au total de 865 cathéters
(Darouiche, Raad et al. 1999). L’étude a conclu à la supériorité des premiers sur les
seconds, tant pour la réduction de la colonisation bactérienne que pour la diminution
du risque infectieux (3,4% vs 0,3%). Plus récemment, cette même association Min-
Rif a été validée in vitro et in vivo sur des valves cardiaques (Darouiche, Mansouri et
al. 2002).
Dans le domaine orthopédique, le PMMA utilisé comme ciment pour les
prothèses, peut être mélangé à un autre antibiotique de la classe des aminosides, la
gentamicine. Les premières tentatives de mélange entre une résine de PMMA et
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
antibiotique datent des années 70 (Buchholz and Engelbrecht 1970). Le relargage de
l’antibiotique répond aux lois de la diffusion. Il est à la fois proportionnel au
potentiel hydrophile du ciment, et à sa surface. Les différents ciments disponibles
commercialement démontrent des taux de relargage différents, principalement
fonction des propriétés hydrophiles des composants polymères. Le relargage
antibiotique se fait essentiellement à partir de l’épaisseur superficielle du ciment.
Figure 2-2 Relargage de la Gentamicine à partir des ciments osseux. Processus en deux temps: 1) absorption d'eau, 2) relargage.
Cependant, plusieurs études montrent que la plus grande partie des
antibiotiques reste confinée dans le ciment (Powles, Spencer et al. 1998). Wahlig et
Dingeldein (Wahlig and Dingeldein 1980) observent des traces de gentamicine dans
les tissus environnant la prothèse après 5 ans et attribuent ce relargage tardif aux
craquelures et aux fêlures du ciment . De façon générale, les études portant sur la
cinétique de relargage démontrent un taux initial relativement élevé, puis une
réduction marquée pendant les jours suivants. Cette cinétique est typique à tous les
ciments PMMA (Kühn 2000). Les études démontrent que les formulations
commerciales donnent de meilleurs résultats que les mélanges manuels (Neut, van
de Belt et al. 2003). Toutefois, dans un souci de limitation des risques d’apparition
de souches résistantes, les aminosides en application locale permettant ces mélanges
manuels ont été interdits, et seules les formulations préparées industriellement sont
utilisées en France. Les études récentes se penchent sur l’association de plusieurs
antibiotiques, de divers adjuvants ou moyens physico-chimiques améliorant ce
système (Hendriks, van Horn et al. 2004).
En conclusion, parmi les critiques formulées envers ces imprégnations
antibiotiques figure leur durée d’action efficace limitée dans le temps, liée à un relargage
rapide et très partiel, de l’ordre de 15% seulement, de la quantité totale de produit
incorporé dans le matériau (van de Belt, Neut et al. 2000; Neut, van de Belt et al. 2003).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
Cette cinétique de relargage antibiotique qui se poursuit longuement à faible dose pose
cependant un problème bien plus crucial, qui est celui du risque de voir se développer des
souches résistantes à terme (Tunney, Ramage et al. 1998; van de Belt, Neut et al. 1999).
Enfin, bien que rarement décrites, des réactions anaphylactiques peuvent apparaître (Oda,
Hamasaki et al. 1997).
2.2.4. Les nouveaux axes de recherche
D’autres voies de recherche font actuellement l’objet d’intenses investigations
afin de pallier ces inconvénients, soit par la création de liaisons covalentes entre les
molécules actives et le matériau, soit en exploitant des propriétés physico-chimiques
nouvelles.
Parmi ces nouveaux axes, on peut citer:
- L’incorporation covalente d’héparine dans la matière des cathéters
(Appelgren, Ransjo et al. 1996).
- L’incorporation covalente d’ammonium quaternaire dans le silicone
(Darouiche, Mansouri et al. 2002)
- L’incorporation d’argent et de benzalkonium dans le polyuréthane,
l’ensemble donnant une activité antibactérienne similaire à celle de Chl-
SAg et plus durable (25 jours vs 14 jours) (Li, Zhang et al. 1999).
- L’incorporation d’argent, de platine et de micro-particules de carbone sous
la surface du polyuréthane. En contact avec les liquides biologiques, ces
métaux natifs provoquent in vitro la formation d’un flux constant d’ions
argent à proximité du cathéter, phénomène appelé « ionophorèse
oligodynamique ». Les auteurs avancent une activité anti-infectieuse in vitro
de 9 mois, qui ouvre d’intéressantes perspectives pour les matériels
implantés à long terme (Milder 1999).
Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface
- L’utilisation de courants positifs de faible voltage (10mA) pour supprimer
ou réduire l’implantation des micro-organismes qui sont habituellement
porteurs de charges négatives (Liu, Tebbs et al. 1993; Raad, Hachem et al.
1996). Cette technique a été appliquée avec succès in vitro à des cathéters
imprégnés de carbone ou d’argent : l’élution suivant les cas de peroxyde
d’hydrogène ou d’ions argent permet de prévenir toute colonisation par de
hautes concentrations de staphylocoque. Il est possible que la combinaison
de courants de faible ampérage avec divers agents anti-infectieux offre de
réelles perspectives cliniques.
L’avenir appartient sans doute aussi aux avancées de la biologie moléculaire et
de la biologie cellulaire. C’est ainsi que des recherches actuelles s’orientent vers le
développement de messagers susceptibles de s’opposer à la formation du biofilm
bactérien, tels que des anticorps bloquant l’adhésine de S. aureus qui médie sa
fixation à la fibronectine (Sun, Smith et al. 1997). Enfin, l’analyse structurale de la
signalisation inter-bactérienne (quorum-sensing) qui semble nécessaire à la
maturation du biofilm (Davies, Parsek et al. 1998), donnera peut être de nouveaux
moyens dans la lutte antimicrobienne.
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
3Chapitre 3 : Les films en multicouche de polyélectrolytes
3.1 : Aspects physico-chimiques des films en multicouche
La méthode de dépôt couche par couche (LbL de l'anglais "Layer-by-Layer") est
basée principalement sur les interactions électrostatiques qui existent entre des éléments
anioniques et cationiques adsorbés alternativement sur un support. Cette technique permet
de s'affranchir en grande partie de la nature, de la taille et de la topologie du substrat.
3.1.1. Principe du dépôt couche par couche
Plusieurs types de molécules chargées ou de nano-objets peuvent être
envisagés dans la méthode du dépôt couche par couche, les polyélectrolytes étant les
plus utilisés pour construire ce type d'architecture. Le principe de la méthode de
construction est décrit schématiquement dans la figure 3.1. Un substrat, chargé
négativement, est exposé à une solution de polycations pendant un temps variant de
5 à 20 min (Ramsden, Lvov et al. 1995; Advincula, Aust et al. 1996; Hoogeveen,
Cohen Stuart et al. 1996). Les polycations s'adsorbent à la surface du substrat et le
surplus est éliminé par simple rinçage (Caruso, Donath et al. 1998; Lvov, Ariga et
al. 1999). Après rinçage, la surface n'est pas neutre mais chargée positivement car il
y a surcompensation de charge lors de l'adsorption.
Exposé ensuite à une solution contenant des polyanions, le film peut se
construire car ces polyanions peuvent également interagir et s'adsorber. Cette
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
adsorption est à nouveau suivie d'une étape de rinçage et le signe de la charge de
surface, à l'issue du rinçage, est à nouveau inversé. Des cycles consécutifs, alternant
l'adsorption de polycations et de polyanions, permettent ainsi la croissance par
étapes de l'architecture du film de polyélectrolytes. Grâce aux multiples interactions
électrostatiques entre les polyélectrolytes et le substrat, les films présentent une
bonne uniformité et généralement une bonne adhésion sur le substrat.
Figure 3-1 Schéma simplifié de la construction d'une multicouche depolyélectrolytes par adsorptions successives de polycations et depolyanions et par répétition cyclique des deux étapes représentées.
D’après (Decher 1997).
La surcompensation de charge à chaque étape du dépôt a été clairement mise
en évidence par des mesures du potentiel électrocinétique (charge de surface)
(Hoogeveen, Cohen Stuart et al. 1996; Caruso, Lichtenfeld et al. 1999; Ladam,
Schaad et al. 2000) et constitue le principe de construction des multicouches de
polyélectrolytes. Outre les interactions électrostatiques, des forces secondaires à
courte distance, comme les interactions hydrogènes et hydrophobes, ont également
une influence sur l’épaisseur et la morphologie finales.
La méthode de dépôt par trempages successifs dans les différentes solutions est
la méthode la plus simple à mettre en œuvre. Elle peut être réalisée mécaniquement
par un automate et s’adapte à tous les substrats classiquement utilisés dans les
études. Toutefois, d’autres techniques de dépôt ont été étudiées en vue de changer la
structuration des films ou de les déposer plus rapidement. Ainsi, les polyélectrolytes
peuvent être déposés à l’aide d’un procédé aérosol, le spray, contenant
alternativement des polycations et polyanions. Schlenoff et al. (Schlenoff, Dubas et
al. 2000) ont ainsi construit des films à base de PSS/PDADMAC en présence de sel
(1M) en effectuant un rinçage entre chaque couche. Les auteurs ont comparé ces
films à ceux réalisés par immersion et montrent que les spectres infrarouges ainsi
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
que la perméabilité aux ions sont identiques. De même, pour des temps de contact
similaires, les épaisseurs mesurées par ellipsométrie sont similaires.
Une autre possibilité consiste à utiliser la méthode de « spin coating ». Il s’agit
de déposer une gouttelette de polyélectrolytes sur une surface en rotation qui est
étalée par force centrifuge lorsque la surface est mise en mouvement. Le temps de
dépôt d’une seule couche peut être ainsi réduit à quelques secondes (Chiarelli, Johal
et al. 2001). En utilisant des solvants très volatiles, il est donc possible de construire
des films sans rinçage entre les dépôts de polyélectrolytes. Les films déposés par
cette méthode présentent une stratification homogène.
Il est aussi possible de renforcer la cohésion du film une fois assemblé, afin de
moduler certaines de ses propriétés physico-chimiques. Ceci est obtenu par le biais
d’une réticulation entre les différents constituants du film (« cross-linking »).
Trois méthodes sont principalement utilisées pour réaliser cette réticulation :
- la réticulation thermique, qui consiste à placer le film à haute température
pendant un certain temps. Elle peut être appliquée à des polyélectrolytes
contenant des groupements amine et imine, qui en réagissant avec des
groupements carboxyliques vont former des liaisons amides ou imides (Lee
and Kunitake 1994; Harris, DeRose et al. 1999) .
- la réticulation chimique, qui utilise différentes molécules, appelées agents de
couplage, en vue de réaliser des ponts chimiques entre les polyélectrolytes.
Plusieurs agents de couplage, agissant sur des groupements réactifs différents,
ont été étudiés : le glutaraldéhyde (Brynda and Houska 1996), le tétraéthyl
orthosilicate, ou encore les carboiimides qui permettent la formation de
liaisons amides entre les groupements acide carboxylique et amine (Schuetz
and Caruso 2003).
- la photo-réticulation, qui fait intervenir un agent photo-sensible incorporé dans
le film ou couplé à un des polyélectrolytes. Son activation à la longueur d’onde
requise déclenche le processus de réticulation (Chen, Huang et al. 1999;
Vuillaume, Jonas et al. 2002). L’intérêt de cette méthode réside dans la
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
possibilité qu’elle offre de réaliser des motifs gravés, en utilisant des masques
limitant l’action de la source lumineuse.
Le choix des constituants du film en multicouche se fait en fonction des
applications envisagées. Les applications biomédicales devant évidemment répondre
à des principes de biocompatibilité et de non-toxicité, le respect de ces critères
impose le choix des composants. En revanche, la méthode d’assemblage doit être
choisie selon des critères liés au contexte industriel ou individuel de la construction.
3.1.2. Nature du substrat
Les supports les plus souvent utilisés dans la littérature sont des surfaces
planes ou des particules colloïdales, dont le matériau et les dimensions dépendent
des applications envisagées et/ou des techniques de caractérisation employées. Il
peut s’agir de substrats inorganiques tels que des lames de verre (Decher 1997), de
quartz (Lvov, Ariga et al. 1995), de mica (Kim, Han et al. 1999) ou de silicium
(Sukhorukov, Montrel et al. 1996; Thierry, Winnik et al. 2003) ou encore d'argent
(Yamada and Shiratori 2000). Des substrats inorganiques fréquemment utilisés dans
les matériaux odontologiques tels que l'or (Caruso, Niikura et al. 1997; Kurth and
Osterhout 1999) ou le titane fritté (Vautier, Hemmerle et al. 2003), l’acier (Tan, Ji et
al. 2003) ou les particules de calcium (Gao, Leporatti et al. 2001) peuvent être
recouvertes. On peut également utiliser des substrats organiques, en polymères,
comme des particules colloïdales de polystyrène (Donath, Walther et al. 1997), de
silicone (Ai, Meng et al. 2003) , de latex (Schuetz and Caruso 2002); mais aussi des
polymères greffés avec des groupements ioniques (Teflon) (Chen and McCarthy
1997) et même des polymères standards non chargés (polypropylène, polystyrène,
poly(éthylène-téréphtalate)) (Delcorte, Bertrand et al. 1997; Brynda and Houska
2000).
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
Figure 3-2 Observation en polyélectrolytes (PG
Dans ce dern
hydrophobe qui as
générale, comme l’
taille ou de forme
structures bi et tri
exemple, de diriger
vue de construire d
Jiang and Hammo
D'autres formes pe
assemblant des mu
dissoutes sélectivem
Mohwald 1999; 19
3.1.3. Croissance du
Au fur et
polyélectrolytes, sa
croissance des film
croissance linéaire
a b
microscopie environnementale à balayage d’un film (a) en multicouche deA-PLL)20 sur une surface de PMMA polie (b). (Doc. personnelle)
ier cas, ce sont des interactions de type Van der Waals et/ou
surent l'adsorption du polyélectrolyte sur le support. De façon
auto-assemblage en multicouches n'impose aucune restriction de
aux supports, il est même possible de concevoir également des
-dimensionnelles (Hammond 1999). Il est devenu possible, par
la formation de films selon des motifs imposés par le substrat en
es microstructures complexes régulières (Chen, Jiang et al. 2000;
nd 2000; Zheng, Rubner et al. 2002; Berg, Choi et al. 2003).
uvent également être envisagées comme des sphères creuses en
lticouches sur des particules de latex qui sont ensuite calcinées ou
ent avec un acide ou un solvant organique adéquat (Caruso and
99).
film en multicouches
à mesure de la construction du film en multicouche de
masse et son épaisseur augmentent. L’étude de la cinétique de
s fait apparaître deux types de films différents: les films à
de ceux à croissance exponentielle.
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
3.1.3.1. Les films à croissance linéaire
Les films à croissance linéaire sont construits dans des conditions telles que,
lors de chaque dépôt, les polyélectrolytes de la solution n’interagissent qu’avec les
polyélectrolytes de charge opposée constituant la surface externe du film (Decher
1997). De telles conditions sont remplies lorsque les polyélectrolytes ne peuvent pas
diffuser vers l'intérieur du film, par exemple à cause de sa trop forte densité. Le
système poly(allylamine)/poly(styrène sulfonate) (PSS/PAH) constitue l’un des
exemples les plus étudiés de ce type de multicouche. Il existe un désordre local et un
degré élevé d'interpénétration entre couches adjacentes, ce qui confère au film une
certaine homogénéité de structure et de distribution de charge (Decher, Lvov et al.
1994; Korneev, Lvov et al. 1995). De leurs études, ces auteurs ont également déduit
que les multicouches de polyélectrolytes doivent présenter une stoechiométrie 1:1
entre les groupes anioniques et cationiques.
L'épaisseur, la densité, la rugosité et la structure des films à croissance linéaire
peuvent être contrôlées quasiment à volonté en changeant les paramètres physico-
chimiques lors de la construction. En utilisant des polyacides et des polybases
faibles, il est possible de faire varier l’épaisseur de chaque nouveau dépôt de moins
d'un nanomètre à quelques dizaines de nanomètres en ajustant de manière adéquate
le pH de la solution de polyélectrolytes (Shiratori and Rubner 2000). Ainsi, lorsque
l'un au moins des deux polyélectrolytes est faiblement chargé, il interagit avec le
polyélectrolyte de charge opposée en formant des boucles. L'épaisseur d'une
bicouche (polyanion/polycation) devient alors plus importante. De tels films sont
généralement très hydratés.
3.1.3.2. Les films à croissance exponentielle
En augmentant le taux de sel en solution, certains auteurs ont observé une
croissance plus rapide que la croissance linéaire, qu’ils ont appelée « super linéaire »
(Ruths, Essler et al. 2000; McAloney, Sinyor et al. 2001). Ils ont relié cette
augmentation d’épaisseur à une augmentation de la rugosité du film. En effet,
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
l’augmentation de la rugosité entraîne une augmentation de l’aire de la surface
d’adsorption et, par conséquent, de la quantité de matière déposée.
Les films construits à base de polypeptides comme les systèmes PLL/PGA
(Lavalle, Gergely et al. 2002) et à base d’un polypeptide et d’un polysaccharide, le
hyaluronane (PLL/HA) (Picart, Lavalle et al. 2001) en sont deux exemples types.
L’épaisseur des films peut atteindre un à plusieurs micromètres après le dépôt d’une
vingtaine de paires de couches. Ces épaisseurs permettent de visualiser la
structuration en z du film, après marquage fluorescent d’un des polyélectrolytes, par
le biais de la microscopie confocale. Il a été mis en évidence que la croissance
exponentielle du film est liée à la diffusion d’au moins l’un des deux
polyélectrolytes constituant le film, à chaque étape de dépôt (Picart, Mutterer et al.
2002). Le mécanisme de construction associé à la diffusion est schématisé sur la
Figure 3-3 pour le système PLL/HA dans lequel le PLL diffuse.
HAPotentiel
électrostatique
A
potentiel chimique
B
PLLPotentiel
électrostatique
C
PLL potentiel chimique
Potentielélectrostatique
Formation de complexes
PLL/HA potentiel chimique
PotentielélectrostatiqueHA
E
D
Rinçagepotentiel chimique
Potentielélectrostatique
HA
F
potentiel chimique
Potentielélectrostatique
Réservoir de PLL
potentiel chimique
HAPotentiel
électrostatique
A
potentiel chimique
B
PLLPotentiel
électrostatique
C
PLL potentiel chimique
Potentielélectrostatique
C
PLL potentiel chimique
Potentielélectrostatique
Formation de complexes
PLL/HA potentiel chimique
PotentielélectrostatiqueHA
E
Formation de complexes
PLL/HA potentiel chimiquepotentiel chimique
PotentielélectrostatiqueHA
E
PotentielélectrostatiqueHA
E
D
Rinçagepotentiel chimique
Potentielélectrostatique
potentiel chimique
Potentielélectrostatique
HA
F
potentiel chimique
Potentielélectrostatique
HA
F
potentiel chimique
Potentielélectrostatique
Réservoir de PLL
potentiel chimique
Figure 3-3 Schéma du mécanisme de construction d’un film multicouche (PLL/HA), basée sur la diffusiondu polycation: (A) le mécanisme proposé débute par un film s’achevant par une couche de HA chargée
négativement, (B,C) le film est mis en contact avec la solution de polycation (PLL) ; la majeure partie desmolécules de PLL diffuse dans le film; quelques chaînes s’adsorbent sur le film, rendant sa charge de
surface positive; (D) après le rinçage, quelques chaînes de PLL polycations libres restent dans le film; (E)Lors de l’adsorption de HA, les molécules de PLL libres diffusent à l’interface et se complexent avec le HA
présent en solution qui s’adsorbe sur le film; (F) En fin d'étape E, la surface est de nouveau chargéenégativement et une grande partie des molécules de PLL libres a été utilisée pour complexer le HA. Le cycle
d'adsorption peut alors recommencer (Picart, Lavalle et al. 2001)
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
Dans un premier temps, les molécules de PLL diffusent dans le film au
moment du dépôt de la solution de PLL (Fig. 3-3, B et C). Lors du rinçage, ces
molécules de PLL « libres » ne seront que partiellement éliminées car une partie
seulement diffuse vers la surface du film et sort du film (Fig. 3-3, D). En effet, toutes
les molécules ne sortent pas en raison de l’existence d’une barrière de potentiel en
surface du film. Lors de l’addition de HA, ces molécules de PLL peuvent à nouveau
diffuser hors du film mais au contact de la solution de HA, elles vont complexer et
s’adsorber en surface du film pour en constituer la couche supérieure (Fig. 3-3, E).
Le nombre de molécules de PLL piégées dans le film est en première approximation
proportionnel à l’épaisseur du film. Cela entraîne une augmentation de l’épaisseur de
la couche de HA en fonction du nombre de couches déposées et conduit ainsi à un
régime de croissance exponentielle (Lavalle, Picart et al. 2004). De tels films
possèdent des caractéristiques physico-chimiques proches de celles d’un hydrogel
notamment en raison de leur forte teneur en eau.
3.2 : Fonctionnalisation des films en multicouche
Une interface est définie comme "fonctionnalisée" dès lors qu'on lui confére une
ou des propriété(s) spécifique(s) en la modifiant chimiquement ou physiquement. Ainsi,
des matériaux adhérents vis-à-vis de cellules ou rendus non adhérents par dépôt d'un film
sont dits "fonctionnalisés". Conférer à des matériaux des propriétés anti-inflammatoires,
antibactériennes ou les rendre capables de libérer dans le temps des substances actives
constituent d'autres exemples de fonctionnalisation. Les films en multicouche peuvent être
fonctionnalisés, soit par insertion de protéines (identiques ou différentes) à un ou plusieurs
niveaux de l’édifice, soit par couplage d’un peptide à un polyélectrolyte suivi de
l’insertion au sein ou en surface du film (Figure 3-4). Ces multicouches peuvent aussi être
constituées exclusivement de protéines. Les architectures peuvent aussi être
fonctionnalisées par insertion de médicaments. Enfin, les multicouches peuvent posséder
des propriétés anti-adhérentes ou antibactériennes par la nature chimique des
polyélectrolytes employés.
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
Figure 3-4: Schéma des deux modes de fonctionnalisation des films en multicouche de polyélectrolytes : soit
par l’intégration dans le film d’une protéine active(A) (Lvov, Katsuhiko et al. 1996), soit par l’utilisationd’un polyélectrolyte couplé à un principe actif (B) (Chluba, Voegel et al. 2001).
3.2.1. Fonctionnalisation par insertion de peptides ou de molécules libres
Afin que les protéines puissent rester actives dans le film, il est important
d’éviter leur dénaturation. Des analyses par spectroscopie infrarouge à transformée
de Fourier ont montré la conservation de la structure secondaire des protéines
insérées dans les architectures de polyélectrolytes (Schwinté, Voegel et al. 2001;
Schwinté, Ball et al. 2002). L’enfouissement des protéines présente même
l’avantage de les stabiliser thermiquement en empêchant la formation de feuillets β
intermoléculaires.
L’activité potentielle d’un film fonctionnalisé est aussi liée au comportement
de la molécule active au sein du film. Szyk et al. (Szyk, Schaaf et al. 2001; Szyk,
Schwinte et al. 2002) ont montré qu'une fraction importante des protéines comme la
HSA, adsorbées ou insérées, diffuse latéralement dans des films de type PAH/PSS.
Les coefficients de diffusion latérale sont de l'ordre de 10-10 à 6 × 10-11 cm2/s selon
la nature des polyélectrolytes qui entourent les molécules de HSA dans
l'architecture.
Enfin, les études biologiques confirmant le maintien de la structure et de
l’activité des molécules incorporées dans le film sont nombreuses. Ainsi, par
exemple, sur le plan structurel, Caruso et al. (Caruso, Niikura et al. 1997) ont
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
montré que des immunoglobulines (IgG) enfouies sous un petit nombre de couches
de polyélectrolytes continuent à interagir avec leurs antigènes. Sur le plan
fonctionnel, il a été montré que des enzymes, comme la glucose-oxydase, la
peroxydase et la glucose-amylase, inclues dans les films, conservent toute leur
activité enzymatique (Onda, Lvov et al. 1996).
Plus récemment, il a été démontré que des cellules peuvent communiquer avec
une protéine, la protéine A, enfouie au sein des films multicouches. Jessel et al.
(Jessel, Atalar et al. 2003) ont ainsi inséré la protéine A (à activité anti-tumorale)
dans des films multicouches de type (PLL/PGA) puis ont déposé des myocytes à sa
surface. La réponse cellulaire a été analysée en mesurant la production d’une
cytokine pro-inflammatoire, le TNFα (facteur de nécrose tumorale) en réponse à
l’interaction cellule/protéine A. Quand la protéine A est recouverte de dix paires de
couches, la production de TNFα est maximale après une durée de contact de 2H et
atteint un plateau après cette durée. Ces auteurs ont pu visualiser un film constitué
de vingt paires de couches en co-marquant la protéine A en rouge et la PLL-FITC en
vert : ils ont montré que la protéine reste localisée dans le film. Ils ont pu également
observer des dégradations locales du film par les macrophages ainsi que le
développement de pseudopodes. Ces pseudopodes permettraient à la cellule
d’atteindre la protéine A enfouie.
Ces différentes observations confirment i) le maintien de la molécule active
insérée au sein du film en multicouches, dans lequel elle semble toutefois capable de
se déplacer, ii) le maintien de la structure secondaire garante de son activité, iii) les
interactions cellulaires rendues possibles par l’enfouissement ou la pénétration par
pseudopodes de celles-ci.
3.2.2. Fonctionnalisation par couplage de peptides ou de molécules
Une autre voie de fonctionnalisation consiste à inclure dans l’architecture un
polyélectrolyte modifié par couplage covalent à un peptide ou à une autre molécule.
Les premiers travaux dans ce domaine sont ceux de Chluba et al. (Chluba, Voegel et
al. 2001) qui ont évalué la réponse de mélanocytes (cellules de mélanomes) mises au
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
contact de films (PLL/PGA) dont certaines couches de PLL étaient remplacées par
de la PLL couplée à l’hormone α-mélanocortine (α-MSH). Cette hormone
peptidique est un stimulateur potentiel de la mélanogénèse. Ces auteurs ont tout
d’abord vérifié que le peptide couplé (PLL-α-MSH) déposé en couche terminale du
film conserve une activité similaire à celle de l’hormone libre. Ils ont montré que la
profondeur d’enfouissement du peptide (peptide enfoui sous une à trente paires de
couches) joue un rôle sur l’activité cellulaire surtout aux temps courts. La réponse
aux temps longs n’est que peu affectée par la profondeur d’enfouissement. Une
explication possible à cette observation est que la communication puisse être établie
grâce à la diffusion de la PLL-α-MSH à travers tout le film, de façon similaire à ce
qui a été montré pour les films (PLL/HA). Une autre origine pourrait être la
dégradation du film par les cellules, mais l’insertion de couches de (PSS/PAH) non
dégradables par les enzymes n’empêche pas totalement la communication cellulaire.
3.2.3. Fonctionnalisation par les propriétés propres des polyélectrolytes
L’étude des propriétés propres aux composants des films a porté
essentiellement sur la modulation des propriétés d’adhésion, protéiques ou
cellulaires.
L’utilisation de polyélectrolytes naturels tels que le chitosan et le dextrane
sulfate (Serizawa, Yamaguchi et al. 2000; Serizawa, Yamaguchi et al. 2002) pour la
construction des films permet de moduler des propriétés pro ou anticoagulantes vis-
à-vis du milieu sanguin. La force ionique des solutions de polyélectrolytes lors de la
construction des films joue un rôle primordial sur ses propriétés. L'augmentation de
la concentration saline conduit à une augmentation de l’épaisseur par couche
déposée, ainsi qu'à une augmentation de l'excès de charges négatives observé après
chaque dépôt de dextran. Ainsi, à partir de la troisième bicouche, et pour une teneur
en sel supérieure à 0.5 M, un comportement procoagulant est obtenu lorsque le film
s'achève par le chitosan et un comportement anti-coagulant lorsque la structure se
termine par le dextran. Les propriétés anticoagulantes sont expliquées par l'excès de
charges introduit par la couche externe de dextran. Pour les autres conditions (taux
de sel plus faibles et films plus minces), un comportement procoagulant est obtenu.
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
Des constructions identiques réalisées par dépôts successifs de chitosan et
d'héparine à partir de solutions à 1 M en NaCl possèdent de fortes propriétés
anticoagulantes, quelle que soit la nature de la couche extérieure. En 1999, Elbert et
al. (Elbert, Herbert et al. 1999) ont déposé des multicouches de type poly(L-lysine)
/alginate sur des supports solides de gélatine, de matrice extracellulaire produite par
des fibroblastes et de collagène de type I. Ces films constituaient un premier
exemple de multicouches à croissance exponentielle possédant des propriétés de bio-
inertie vis-à-vis de fibroblastes humains.
En effet, la construction de ces multicouches sur une surface initialement
"adhésive" permet d'obtenir une surface inerte vis-à-vis des cellules. D'autres
multicouches à base de polysaccharides comme le système PLL/HA et chitosan/HA
se sont depuis également révélées non adhérentes vis-à-vis des cellules de
chondrosarcomes (Richert, Lavalle et al. 2002) ou d'ostéoblastes.
Récemment, Mendelsohn et al. (Mendelsohn, Yang et al. 2003) ont démontré
que des multicouches réalisées à partir de poly(allylamine hypochloride) (PAH) et
d’acide poly(acrylique) (PAA) possèdent des propriétés d'adhérence modulable vis-
à-vis d'une lignée de fibroblastes. En effet, en faisant varier les conditions de pH lors
de la construction des films, ils parviennent à modifier les propriétés des
multicouches vis-à-vis de l'adhérence cellulaire. De façon surprenante, lorsque le
polyanion et le polycation sont tous les deux déposés à pH 2.0, ces films se montrent
très résistants vis-à-vis de l'adhésion cellulaire, que le film s'achève par une couche
de polycations ou de polyanions. Un comportement similaire était noté vis-à-vis de
ces mêmes cellules lorsque le PAA était remplacé par l'acide poly(méthacrylique) ou
le poly(styrène sulfonate) (PSS) et pour le système chlorure de poly(diallyldimethyl
ammonium) et PSS. Ces auteurs ont de plus mis en évidence une corrélation directe
entre le caractère non adhérent des films et leur capacité, une fois séchés, à gonfler
lorsqu'ils sont remis au contact d'une solution aqueuse. L'ensemble de ces résultats
suggère fortement que le caractère non adhérent d'une multicouche est directement
lié à son degré d'hydratation. D'autre part, ces auteurs démontrent également
l'absence de corrélation directe entre l'adsorption de protéines sur un film et sa non-
adhérence vis-à-vis des cellules. En effet, bien que les films multicouches soient
modulables en ce qui concerne l'adhérence cellulaire, les protéines (lysozyme et
fibrinogène) s'adsorbent en quantité égale sur tous les films multicouches testés. Ce
résultat remet fortement en cause le postulat sur lequel étaient fondées toutes les
Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes
études d'adsorption de protéines durant des dizaines d'années. Il était entendu que
des surfaces non adhérentes vis-à-vis des cellules devaient également être non
adsorbantes vis-à-vis des protéines.
Richert et al. (Richert, Lavalle et al. 2002) ont utilisé la technique de
micromanipulation pour évaluer quantitativement des forces d’adhésion entre des
cellules de chondrosarcome et des films de PLL/PGA construits à pH 7.4 se
terminant par PGA ou PLL. Alors que pour des films s'achevant par PGA les forces
d'adhésion sont très faibles, voire nulles, elles sont beaucoup plus importantes sur les
films se terminant par PLL. Sur ces derniers, la force d'adhésion décroît avec le
nombre de bicouches. Par ailleurs, une forte adsorption protéique a été observée sur
les films se terminant par PLL, alors que les films se terminant par PGA semblent
prévenir totalement l’adsorption protéique, du moins au pH 7.4 auquel le film a été
construit.
L'équipe de Kotov [Grant et al. 2001] a construit des films en utilisant du collagène
de type-I alterné avec du PSS. Les films contenant un nombre variable de couches
de collagène conduisent à une bonne adhérence de cellules telles que les cellules
musculaires (myoblastes).
L'élaboration de multicouches anti-adhésives constitue non seulement un
objectif en soi mais s'inscrit aussi dans une démarche visant à rendre certaines
surfaces sélectivement non adhérentes à certains types cellulaires. Pour cela, la voie
envisagée consiste à fonctionnaliser des couches non adhérentes par des peptides
d'adhésion spécifiques de certains types cellulaires (ex : RGD, IKVAV,…).
Enfin, certaines équipes ont étudié les propriétés biologiques de multicouches
composées exclusivement de protéines. Leur construction est cependant plus
complexe. Dans un premier temps, des assemblages constitués par une alternance de
protéines et de polyélectrolytes, suivie par une réticulation du film multicouche par
le glutaraldéhyde, ont été réalisés [Brynda et al. 1996; Houska et al. 1997]. Des
constructions constituées uniquement de protéines ont également été obtenues après
élimination des polyélectrolytes non couplés, mais servant lors de la construction de
l'édifice [Gölander et al. 1990]. Ainsi, des assemblages constitués uniquement
d'albumine [Brynda et al. 2000] ou d'albumine et d'héparine ont été employés pour
le recouvrement d’équipements médicaux utilisés au contact de plasma.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
4Chapitre 4 : Les peptides antimicrobiens
4.1 : Deux systèmes de défense immunitaire
Au cours de l’évolution, deux systèmes de défense immunitaire ont été
sélectionnés: l’immunité innée et l’immunité acquise ou adaptative (Hoffmann, Kafatos et
al. 1999). La réponse acquise est apparue il y a environ 400 millions d’années. Elle
n’existe que chez les vertébrés et présente deux caractéristiques essentielles, la spécificité
de reconnaissance et la mémoire. La différence entre les réponses immunitaires innées et
acquises est principalement liée aux mécanismes de reconnaissance des micro-
organismes.
Dans le processus d’immunité innée, la reconnaissance est médiée par des
récepteurs dont la spécificité est génétiquement déterminée dès la naissance (d’où le terme
« inné »), et n’est pas modifiable. Ces récepteurs sont exprimés sur de nombreux types
cellulaires susceptibles de rencontrer des micro-organismes qui envahissent l’hôte:
certaines cellules épithéliales et endothéliales, les cellules dentritiques, les monocytes et
les macrophages. Au nombre d’une ou de deux centaines par espèce, leur spectre de
reconnaissance est dirigé vers des motifs structuraux microbiens largement répandus chez
ces organismes, mais absents des cellules de l’hôte. Ce sont, par exemple, les
lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram-négatif, les peptidoglycanes bactériens
(Dziarski 2003), les mannanes et β-(1,3)-glucanes des champignons et des levures. Toutes
les structures reconnues par les récepteurs de l’immunité innée sont communes à de très
nombreux micro-organismes car elles jouent un rôle essentiel dans la physiologie et la
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
survie de ces micro-organismes. Ce caractère «universel» et indispensable, rend peu
probable des mutations importantes et par conséquent une résistance au système
immunitaire inné (Gura 2001).
Le problème inhérent à la réponse immunitaire adaptative est celui de la durée de
la réaction de défense, en particulier lors de l’expansion clonale des lymphocytes naïfs en
cellules effectrices en réponse à une infection. Il faut en effet entre 3 et 5 jours pour que le
système acquière sa pleine efficacité pour combattre une infection, ce qui donne largement
le temps aux pathogènes de nuire à l’hôte. Là encore, la réponse immunitaire innée joue
un rôle crucial par ses mécanismes effecteurs (phagocytose, peptides antimicrobiens,
voies alterne et lectine du complément, par exemple) qui sont activés dès le début de
l’infection et contrôlent de façon quasi-immédiate la prolifération de pathogènes qui
envahissent l’hôte. Au bout de cette période, la réponse adaptative est en mesure de
prendre le relais chez les vertébrés.
Tous les métazoaires font appel à la réponse immunitaire innée pour combattre les
infections par les micro-organismes (bactéries, champignons, virus, parasites). Seuls les
vertébrés utilisent, en plus de la réponse innée, une réponse adaptative.
4.1.1. La reconnaissance de I’infection par le système immunitaire inné
Les micro-organismes se heurtent en premier lieu à des épithélia qui forment
une barrière ininterrompue au niveau de la peau, des muqueuses orales et
respiratoires, du tractus gastro-intestinal et du système uro-génital. Certaines cellules
de ces épithélia produisent rapidement des peptides antimicrobiens qui s’opposent
directement aux bactéries. Des cellules sanguines, essentiellement des
polynucléaires neutrophiles et des monocytes/macrophages, s’accumulent aux sites
où les micro-organismes ont réussi une pénétration et participent activement à la
défense en phagocytant les envahisseurs activant la réponse adaptative des
lymphocytes. Toutes ces réactions, pour rapides qu’elles soient, requièrent une
première étape de reconnaissance de l’agresseur microbien, qui est médiée par les
récepteurs de l’immunité innée et reconnaissent des motifs structuraux présents
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
uniquement sur des micro-organismes. Les Toll-like receptors (TLRs) ont des rôles
particuliers en ce sens qu’ils activent l’expression de très nombreux gènes de la
réponse immunitaire par le biais du NF-κB. A côté des TLRs, d’autres récepteurs
jouent un rôle important dans la lutte contre les infections, et ont fait l’objet de
travaux approfondis depuis de nombreuses décennies. Ce sont les récepteurs
sécrétés, présents dans la circulation (ex : mannose binding lectin (MBL)), et les
récepteurs de l’endocytose/phagocytose présents sur les phagocytes.
La découverte des Toll-like receptors est toute récente, puisqu’elle remonte
aux années 1997-1998. On sait de longue date que le lipopolysaccharide bactérien
est un puissant inducteur de réponses immunitaires et peut, dans certaines
conditions, être à l’origine d’un choc septique (Abreu and Arditi 2004). En 1990, il a
été montré qu’une protéine caractérisée par la richesse en domaines riches en résidus
leucine (LRR pour leucine rich repeats) appelée CD14 (Cluster Determinant), fixe le
LPS (Wright, Ramos et al. 1990). CD14 peut être circulante, mais est surtout fixée
sur de nombreuses cellules du système immunitaire par une ancre membranaire GPI
(glycosylphosphoinositide). Cependant, la simple présence de GPI ne permet au
récepteur CD14 d’activer des cascades de signalisation intracellulaire conduisant à
l’expression de gènes de la réponse immunitaire. L’interaction de CD14 avec les
récepteurs transmembranaires Toll-like permet le déclenchement de cette cascade.
On sait aujourd’hui que l’homme a dix gènes codant pour les TLR et que les
différents TLR de mammifères reconnaissent des motifs structuraux très divers, mais
essentiellement d’origine microbienne. Ainsi, TLR3 reconnaît l’ARN double brin
d’origine virale, TLR4 reconnaît le LPS, TLR5 la flagelline, TLR9 des séquences
d’ADN CpG non-méthylées propres à certains micro-organismes. TLR2 peut
s’associer à TLR1 ou TLR6 pour reconnaître différents lipopeptides bactériens.
TLR2 est en outre impliqué dans la réponse au peptidoglycane des bactéries Gram
positif.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Figure 4-1 Les différents récepteurs TLR reconnaissent des motifs microbiens spécifiques et participent àl'activation des réponses immunitaires innées et adaptatives.D’après (Hoffmann, Kafatos et al. 1999)
4.1.2. Les mécanismes effecteurs de la réponse innée
La reconnaissance des micro-organismes par les récepteurs de la réponse innée
déclenche selon le cas, des réactions différentes et complémentaires. Un premier cas
de figure est la reconnaissance par un récepteur phagocytaire, qui va induire une
série complexe de modifications au niveau de la membrane et du cytosquelette de la
cellule phagocytaire, suivie de l’internationalisation du micro-organisme, et sa mort.
Là encore, plusieurs mécanismes concourent à tuer le micro-organisme: peptides
antimicrobiens relargués à haute concentration dans la vacuole de phagocytose,
synthèse d’oxyde nitrique hautement bactéricide, production d’anions superoxydes
et de radicaux libres, protéases lysosomales. De plus, la présentation de fragments
peptidiques par les lymphocytes ayant ingéré des micro-organismes permet
l’activation de la réponse adaptative. La reconnaissance par le complément
déclenche une cascade de réactions qui toutes concourent à l’élimination de micro-
organismes. Quelques-uns des produits de clivage protéolytique des protéines du
complément jouent le rôle de chémoattractants pour les neutrophiles et les
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
monocytes/macrophages, favorisant l’inflammation au site de l’activation primaire
du complément. Par ailleurs, un complexe multimérique de protéines de complément
peut s’insérer dans la membrane microbienne et conduire à leur lyse. Enfin,
l’interaction entre des patterns microbiens et les TLRs déclenche une cascade de
signalisation intracellulaire aboutissant, entre autre, à la synthèse des peptides
antimicrobiens.
4.2 : Les peptides antimicrobiens
La synthèse de peptides antimicrobiens est partie constituante de la réponse
humorale innée aux infections microbiennes. Elle est commune aux mammifères comme
aux insectes et aux plantes, confirmant là son rôle fondamental dans l’évolution. A l’heure
actuelle, plus de 500 peptides à activité antimicrobienne ont été isolés (Bulet, Hetru et al.
1999; Zasloff 2002).
4.2.1. Structure et diversité des peptides antimicrobiens
Cette grande diversité rend leur classement difficile si ce n’est par le biais de
leur conformation structurale secondaire. Ce sont principalement des peptides
cationiques et de petite taille (2-5 kDa) qui présentent un caractère fortement
basique. Le caractère commun à presque tous les peptides antimicrobiens est la
faculté qu’ils ont de constituer, dans une structure secondaire, une conformation
amphipatique. Celle-ci se définit par l’existence de domaines hydrophobes et
cationiques distincts.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Figure 4-2 Structure secondaire schématisée d’un peptide linéaire (magainine 2) et d’un peptide cyclique àponts disulfures (défensine alpha humaine). Dans les deux cas, la structure secondaire permet la
constitution de domaines hydrophobes (vert) et cationiques (rouge).D’après (Zasloff 2002)
Ces molécules peuvent se regrouper en quatre familles sur la base de leurs
séquences et de leurs caractéristiques structurales : les peptides à hélice alpha
amphipatique, les peptides à pont disulfure, les peptides riches en proline et les
peptides riches en glycine (Dimarcq and Hoffman 1998).
- les peptides à hélice alpha amphipatique :
Ce sont en général des peptides linéaires dépourvus de résidus cystéine, comme les
cécropines (Steiner, Hultmark et al. 1981) ou les magainines (Zasloff 1987), qui
adoptent une structure à hélice alpha uniquement lors de la pénétration
membranaire (Bechinger, Zasloff et al. 1993).
- les peptides à pont disulfure :
Ils sont représentés par les bacténécines (Romeo, Skerlavaj et al. 1988) et les
défensines (Selsted, Harwig et al. 1985) et se caractérisent par la présence d’un
feuillet beta rigide, maintenu par un pont disulfure.
- les peptides riches en proline :
Ce sont en général des peptides linéaires, riches en résidus proline, dont les
domaines cationique et hydrophobe occupent les extrémités de la chaîne.
- les peptides riches en glycine :
Ils sont organisés en chaîne linéaire et comme leurs homologues riches en proline,
se caractérisent par la prédominance dans leur séquence de résidus glycine.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Ces peptides antimicrobiens sont, pour la plupart, représentés chez les êtres
multicellulaires. Ils sont tous dérivés de précurseurs, qui subissent des modifications
post-transcriptionelles. Si une parfaite concordance des séquences d’acides aminés
ne peut pas être rencontrée entre les différentes espèces et même au sein d’une
même espèce, il n’en reste pas moins que de nombreux motifs sont conservés et
retrouvés dans les précurseurs.
4.2.2. Mécanismes d’action
Les peptides antimicrobiens présentent une grande diversité de structures et de
spectres d’activité (Tossi and Sandri 2002). La plupart d’entre eux semblent agir sur
la membrane des micro-organismes, tandis que d’autres agissent après
internalisation sur des éléments intra-cytoplasmiques comme l’ADN et l’ARN pour
la Buforine (Park, Kim et al. 1998).
4.2.2.1. Spécificité d’action
Les peptides antimicrobiens présentent une grande diversité et sont présents
dans presque tous les tissus. Les mécanismes permettant à ces peptides de faire la
distinction entre les agents pathogènes et les cellules de l’hôte sont particulièrement
importants à définir, surtout en terme de toxicité pour l’hôte. Cette reconnaissance
spécifique repose sur plusieurs facteurs de reconnaissance, basés sur les différences
entre membranes eucaryotes et procaryotes, que nous évoquons ci-après.
Toutes les membranes biologiques sont constituées d’une mosaïque fluide de
protéines et de phospholipides. Pour certains organismes, des stérols (cholestérol,
ergostérol) et des glycérides peuvent compléter cette architecture. Cependant des
différences fondamentales existent entre les membranes plasmiques microbiennes et
les membranes plasmiques des organismes pluricellulaires, qui constituent autant de
critères de reconnaissance spécifique pour les peptides antimicrobiens.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
♦ Composition , hydrophobicité et charge
La structure élémentaire, commune à presque toutes les membranes
biologiques, est la double couche phospholipidique. Les principaux phospholipides
entrant dans la composition de ces membranes sont la phosphatidylcholine (PC), la
phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et la sphingomyéline
(SM). Outre ces phospholipides, les membranes animales contiennent aussi des
glycolipides et du cholestérol, dont sont dépourvues la plupart des cellules
procaryotes.
Figure 4-3 La membrane plasmique des cellules animales. Composition et Charge.(Cooper)
Les stérols, comme la PC, la PE et la SM ont des charges électriquement
neutres, tandis que les phospholipides hydroxylés, comme le phosphatidylglycérol
(PG) et son dimère la cardiolipine (CL), ou la PS présentent des charges négatives
nettes. La répartition entre les feuillets interne et externe, de même que la proportion
de ces composants diffère entre les cellules procaryotes et eucaryotes (figure 4-4).
Ainsi, dans de nombreuses membranes de pathogènes, la composition du feuillet
externe en PG, CL et PS, rend la charge de surface très négative (Matsuzaki 1999).
Au contraire, les membranes eucaryotes, riches en phospholipides dits
zwitterioniques (PE, PC, SM) ont une charge de surface globalement neutre.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Figure 4-4 Comparaison de lacomposition de la membranemicrobienne et animale. E. coli(blanc) ; S. aureus (hachureshorizontales) ; B. subtilis (gris) ;C.albicans (carrés) ; érythrocytehumain (noir).D’après (Yeaman and Yount 2003).
♦ Asymétrie m e mbranaire
La membrane est une structure asymétrique, tant dans la répartition des
composants au sein d’un feuillet, qu’entre les deux feuillets de la membrane. Cette
asymétrie est différente entre les cellules procaryotes et eucaryotes, et peut expliquer
la réponse spécifique lors de l’interaction avec un peptide antimicrobien cationique.
Lasch et al. ont ainsi observé une redistribution en secteurs totalement distincts, des
PE et des lipolysaccharides (LPS) après interaction de la membrane avec des
peptides cationiques (Lasch, Schultz et al. 1998). Ces exagérations dissymétriques
au sein de la membrane peuvent être responsables d’une dissociation membranaire,
et constituent une voie de discrimination sélective entre les cellules pathogènes et les
cellules de l’hôte.
♦ Ligands mem branaires microbiens
Si les phospholipides chargés négativement peuvent être considérés comme
des sites récepteurs privilégiés, des interactions autres, de type ligand-récepteur, ont
aussi été envisagées pour expliquer la spécificité de reconnaissance des peptides
antimicrobiens. Ainsi, Edgerton et al. ont observé la fixation d’histatine radioactive
sur la membrane de C.albicans (Edgerton, Koshlukova et al. 1998). La quantité
d’histatine fixée à la membrane varie d’un facteur dix entre la cellule et le
sphéroblaste. Cette observation permet aux auteurs de conclure à l’inexistence
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
d’interactions de type électrostatique ou hydrophobe, mais plutôt à l’acquisition par
la cellule d’un ligand spécifique.
♦ Potentiel tran smembranaire
Une autre différence fondamentale entre les cellules eucaryotes et procaryotes
réside dans le potentiel de charge transmembranaire. Les cellules animales
présentent habituellement une différence de potentiel de l’ordre de -90 à -110 mV,
tandis que les bactéries en phase exponentielle de croissance ont une différence de
potentiel variant entre -130 et -150mV. Cette caractéristique a aussi été avancée dans
le mécanisme de la reconnaissance spécifique (Hancock 1997).
En conclusion, ces aspects biophysico-chimiques expliquent en partie la spécificité
de reconnaissance des peptides antimicrobiens. Cependant, d’autres phénomènes semblent
entrer en jeu. Ainsi, les travaux in vivo de Welling et al. montrent, après injection
intraveineuse d’ ubiquicidine et de lactoferrine marquées, une affinité et une spécificité de
ces peptides antimicrobiens pour des zones infectées par S. aureus, K. pneumoniae ou C.
albicans, par rapport à des zones inflammatoires stériles (Welling, Paulusma-Annema et
al. 2000). Les auteurs concluent, dans une deuxième étude, à la capacité des peptides
antimicrobiens circulants à reconnaître une zone infectée d’une zone saine (Welling,
Lupetti et al. 2001). Ces résultats indiquent que les peptides antimicrobiens sont capables
de localiser rapidement les sites infectés et de s’y accumuler.
4.2.2.2. Mode d’action
Les caractéristiques principales permettant de déterminer l’action d’un peptide
antimicrobien sont liées à sa conformation, sa charge, son amphipathie, son
hydrophobicité et son angle de polarisation. Une charge cationique minimum est
ainsi nécessaire, afin de permettre l’attraction électrostatique initiale et l’intégration
ou la translocation du peptide dans la membrane (Yeaman and Yount 2003). Mais
aucun de ces paramètres ne doit être excessif sans quoi le risque de cytotoxicité par
perte de la spécificité de reconnaissance est augmenté. Le mode d’action des
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
peptides antimicrobiens peut se diviser en trois temps : la fixation initiale,
l’intégration dans la membrane, la mort cellulaire.
♦ La fixation in i tiale du peptide
La fixation initiale du peptide antimicrobien est sous l’influence de facteurs
biophysiques et biochimiques.
Figure 4-5 Schéma des relations spécifiques entre le peptide antimicrobien et les membranes d’organismespluricellulaires et pathogènes. D’après (Zasloff 2002)
Parmi ceux-ci, l’attraction électrostatique est certainement le facteur le plus
important dans cette étape initiale. De nombreuses études ont ainsi montré la relation
directe entre la charge du peptide et sa capacité à se fixer sur une membrane
(Bessalle, Haas et al. 1992; Vaz Gomes, de Waal et al. 1993; Matsuzaki, Nakamura
et al. 1997; Dathe, Nikolenko et al. 2001). De même, la différence de potentiel
membranaire est nécessaire à cette étape initiale, comme l’ont montré les travaux de
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Matsuzki (Matsuzaki, Sugishita et al. 1997) ou de Breukink et Kruijff (Breukink and
de Kruijff 1999).
D’autres interactions de type ligand-récepteur, ont aussi été envisagées dans
cette étape initiale. L’hypothèse d’une interaction spécifique, médiée par un
récepteur, a été proposée pour la nisine, après avoir observé son activité à des
concentrations nanomolaires, là où d’ordinaire les concentrations nécessaires aux
autres peptides antimicrobiens sont micromolaires. Breukink et Kruijff (Breukink
and de Kruijff 1999) ont montré que l’affinité de la nisine est 1000 fois plus
importante pour des vésicules intégrant le lipide II (composant de la membrane
bactérienne) que pour des vésicules en étant dépourvues. Ils concluent que cette
spécificité d’activité de la nisine est liée à une interaction de type récepteur-ligand
avec le lipide II. D’autres travaux récents, en démontrant une activité différente pour
des isoformes d’un même peptide, semblent confirmer cette voie d’interaction
spécifique pour certains peptides antimicrobiens (Vunnam, Juvvadi et al. 1997).
♦ Les interacti ons avec la membrane
Aucun mécanisme universel n’est clairement démontré, et tout porte à croire
que plusieurs mécanismes existent selon les différents peptides. Plusieurs modèles
d’action membranaire ont été étudiés, sur la base d’observations en spectroscopie à
dichroïsme circulaire (CD)(Stark, Liu et al. 2002), en spectroscopie à infra-rouge
(FTIR)(Sal-Man, Oren et al. 2002), en résonance magnétique nucléaire (NMR)
(Bechinger 1999), ou plus récemment à l’aide de la diffraction à rayons X (Ding,
Yang et al. 2003). Les mécanismes, de même que les spectres d’activité, sont à
l’évidence dépendants des méthodes et des conditions expérimentales (pH, forces
ioniques, température,…) utilisées (Vogt and Bechinger 1999). Toutefois, la
concordance des résultats permet de dégager les principales étapes de l’interaction
des peptides avec les membranes.
Trois facteurs conditionnent l’interaction peptide/membrane :
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
- le seuil d’activité: il est dépendant de la concentration du peptide, de sa
capacité à s’auto-assembler, de la composition et de la fluidité de la membrane
cellulaire (Yang, Weiss et al. 2000),
- la conformation: le changement de conformation après la fixation du peptide à
la membrane a été largement décrit pour les peptides à hélice alpha. De
nombreux travaux ont ainsi démontré le changement de conformation, de
linéaire à hélicoïdale, des magainines au contact de la membrane cellulaire
(Matsuzaki, Harada et al. 1991; Bechinger, Zasloff et al. 1993). Au contraire,
les structures secondaires à feuillet β, que l’on retrouve dans les peptides à
pont disulfure, présentent une grande stabilité de conformation au contact des
phospholipides membranaires. Leur activité pourrait être conditionnée à une
modification de leur structure quaternaire, ou à une monomérisation (Yeaman
and Yount 2003),
- l’auto-assemblage : de nombreux travaux ont démontré l’existence
d’interactions entre peptides et phospholipides membranaires, dans le but de
former des structures plus complexes. Ce potentiel, propre à chaque peptide,
est fonction de la composition et de la conformation du peptide monomérique.
Ainsi, par exemple, les peptides à domaines hydrophobes et hydrophiles bien
définis, peuvent s’auto-assembler par la simple orientation favorable de ces
domaines, entre eux et avec les constituants membranaires. De tels
assemblages permettent la création de pores comme nous le décrivons ci-après.
Ces trois facteurs, variables pour chaque peptide étudié, expliquent la diversité
des modèles proposés pour expliquer le mode d’action des peptides anti-microbiens.
La plupart des modèles décrits dans la littérature, considèrent que la phase de
fixation à la membrane se poursuit par une perméabilisation de cette dernière, qui
peut à elle seule engendrer la mort cellulaire ou n’être qu’une étape intermédiaire.
De façon très schématique, la perméabilisation de la membrane serait le résultat
d’une interaction des peptides avec les bicouches lipidiques membranaires, soit par
la formation de structures de type pores ou canaux suivie de la fuite extracellulaire
du cytoplasme (Yang, Weiss et al. 2000) ou de la dépolarisation membranaire
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
(Westerhoff, Juretic et al. 1989), soit encore par rupture membranaire par excès
d’incorporation de peptides (Tossi, Sandri et al. 2000). Plusieurs modèles sont ainsi
décrits :
Le modèle des pores transmembranaires (Barrel-stave model)
Dans ce modèle, après fixation à la membrane, les peptides changent de
conformation puis insèrent leurs domaines hydrophobes dans la membrane en
repoussant les têtes hydrophiles des phospholipides. Lorsqu’un certain seuil est
atteint, les peptides s’internalisent et se regroupent dans la membrane en créant des
pores, dont la face externe est représentée par les domaines hydrophobes des
peptides monomériques, et la face interne par leurs domaines hydrophiles. Ainsi, ces
pores sont constitués de plusieurs monomères peptidiques orientés comme les
planches d’un tonneau (barrel stave).
Figure 4-6 Modèle des pores transmembranaires.Schéma décrivant le pore formé par les peptides
(rouge)et la membrane phospholipidique(bleu).(Doc. personnelle)
L’exemple type de peptide répondant à ce modèle est l’alaméthicine (Yang,
Harroun et al. 2001; Chen, Lee et al. 2003), cependant il semble ne convenir qu’à
très peu d’autres peptides.
Le modèle des pores toroïdaux (Toroidal pore, wormhole model)
La différence principale de ce modèle avec le précédent réside dans
l’organisation du pore, dont les lipides membranaires sont une partie constituante.
Ce modèle a été particulièrement bien décrit pour la magainine 2 par. Matsuzaki et
al. (Matsuzaki, Mitani et al. 1998) qui ont estimé le diamètre des pores formés par la
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
magainine à 2 ou 3 nanomètres. Ce modèle a été confirmé avec de nombreux autres
peptides, dont le PGLa (Wieprecht, Apostolov et al. 2000), la mellitine (Yang,
Harroun et al. 2001) et les protégrines (Yang, Weiss et al. 2000).
Après fixation à la membrane par les forces électrostatiques en présence, les
peptides prennent une conformation en hélice alpha, mais restent parallèles à la
surface membranaire (Hara, Mitani et al. 2001). Puis les domaines hydrophobes
s’enfouissent dans la membrane en déplaçant les têtes phospholipidiques, et
induisent une courbure positive de la membrane. Cette tension dans la membrane
permet, une fois le ratio peptide/lipide atteint, l’orientation perpendiculaire des
peptides et la formation du pore.
Figure 4-7 Modèle des pores toroïdaux. Le pore estformé par un assemblage composite fait depeptides_et de têtes phospholipidiques.(Doc
personnelle)
Le modèle « carpet-like »
Le « carpet model » est souvent décrit comme un mécanisme de type
détergent. Cependant, les peptides présentant ce mode d’action ne sont en aucun cas
des détergents. Le mécanisme repose sur l’accumulation d’un très grand nombre de
peptides à la surface membranaire. Cet enfouissement superficiel induit des
désordres et des limitations de fluidité dans la membrane qui finissent par entraîner
la rupture de celle-ci. L’exemple type est donné par la cécropine P1, dont les études
en spectroscopie infra-rouge (FTIR) menées par Sitaram et Nagaraj (Sitaram and
Nagaraj 1999) confirment l’orientation strictement parallèle sans atteinte de la
couche hydrophobe, avant la rupture membranaire.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Figure 4-8 Le modèle « carpet-like ». L’insertion et l’accumulation des peptides à la surface de la membraneentraînent des déplacements et des contraintes dans la fluidité qui aboutissent à une rupture de la
membrane. (figure droite d’après (Bechinger 1999))
Le modèle de Shai-Matsuzaki-Yang
Le modèle proposé par Shai-Matsuzaki-Yang (Matsuzaki 1999; Shai 1999;
Yang, Weiss et al. 2000) reprend ces différentes propositions, en les associant
chronologiquement. Après interactions électrostatiques entre les phospholipides
chargés négativement de la membrane et les acides aminés cationiques des peptides,
ces derniers s’étalent (« carpet model ») puis s’intègrent à la membrane créant alors
une déstabilisation générale. Si cette déstabilisation ne suffit pas à entraîner la
rupture de la membrane, le mécanisme peut alors se poursuivre par l’enfouissement
des hélices alpha et la formation de pores entraînant soit une osmolyse, soit la
diffusion de fragments peptidiques à cible intra-cellulaire.
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Figure 4-9 Modèle de Shai-Matsuzaki-Yang expliquant le mode d’action des peptides antimicrobiens(d’après (Zasloff 2002))
4.2.2.3. Mécanismes de la mort cellulaire
♦ La perméabi l isation membranaire
La perméabilisation membranaire est l’effet principal des peptides
antimicrobiens, entraînant la mort cellulaire (Lehrer and Ganz 1996). Celle-ci peut
être rapide (2 à 3 min (Lehrer, Barton et al. 1989)), laissant supposer une
dépolarisation membranaire rapide, associée à une fuite d’ions et de métabolites et la
perte des fonctions essentielles comme la respiration (Blondelle, Lohner et al. 1999).
La perméabilisation de la membrane a été démontrée sur des bactéries à Gram-
négatif comme E. coli dont les deux membranes sont successivement perméabilisées
par les défensines humaines (Lehrer, Barton et al. 1989). Elle a aussi été mise en
évidence sur des Gram-positif (Ohta, Ito et al. 1992). Cependant, plusieurs études
ont pu montrer que ce mécanisme ne pouvait pas être systématiquement envisagé
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
comme seul responsable de la mort cellulaire (Zhang, Dhillon et al. 2000; Koo,
Bayer et al. 2001).
♦ L’inhibition des fonctions cellulaires vitales
Certaines études, comme celles de Park et al. (Park, Kim et al. 1998) sur la
Buforine II confirment l’existence de récepteurs intra-cytoplasmiques au niveau des
acides nucléiques intra-cellulaires. D’autres études sur C. albicans démontrent
l’existence d’une action de l’histatine-5 au niveau des mitochondries de cette levure
(Helmerhorst, Troxler et al. 2001). La perméabilisation membranaire, lorsqu’elle
existe, n’est pas responsable directement de la mort cellulaire, mais elle permet
l’internalisation du peptide.
D’autres mécanismes d’internalisation peuvent aussi entrer en jeu, sans pour
autant engendrer la formation de pores. C’est le cas de la Buforine II dont la
translocation à travers la membrane cellulaire est favorisée par sa structure
secondaire (Kobayashi, Takeshima et al. 2000).
4.2.2.4. La synergie d’action
Plusieurs études relatent une considérable diminution des concentrations
d’activité de certains peptides lorsqu’ils agissent en synergie. Kieffer et al. (Kieffer,
Goumon et al. 2003) montrent ainsi une synergie entre l’Ubiquitine et la
Chromogranine sur l’inhibition de la croissance de Neurospora crassa et de C.
albicans, la concentration minimale d’inhibition étant réduite respectivement d’un
facteur 5 et d’un facteur 2. Cette synergie peut s’expliquer par le rôle respectif de
chaque peptide, l’un formant les pores et l’autre s’internalisant. Cependant cette
synergie peut aussi se traduire par la formation de pores composés d’hétérodimères,
comme l’ont montré Hara et al. (Hara, Mitani et al. 2001), qui se révèlent plus
stables que ceux composés des mêmes monomères.
En conclusion, il semble donc que la mort cellulaire soit le résultat de plusieurs
mécanismes d’action indépendants ou coopérants. La réponse innée étant non-spécifique,
la réponse à l’infection se traduit systématiquement par la synthèse de très nombreux
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
peptides antimicrobiens utiles ou inutiles. Cette diversité de production et d’action permet
aux peptides antimicrobiens de s’adapter aux conditions physiologiques variables, tout en
restant actifs sur une grande variété de micro-organismes.
4.2.3. Résistance des micro-organismes
Ces mécanismes d’action très basiques pour la plupart des peptides
antimicrobiens, confèrent une grande sérénité face au risque d’apparition de
résistance. Cependant, plusieurs études rapportent des résistances, que l’on peut
globalement distinguer en résistances constitutives et résistances adaptatives.
Les résistances de type constitutives, sont liées à la composition en
phospholipides de la membrane et par conséquent à sa charge de surface. La
présence de molécules de cholestérol dans la membrane bactérienne semble réduire
l’activité des peptides antimicrobiens, par l’augmentation de la stabilité
membranaire mais aussi par certaines interactions spécifiques entre le peptide et le
cholestérol (Matsuzaki 1999). Certains genres bactériens, tels Morganella et
Serratia, présentent des membranes externes pauvres en phospholipides acides et
offrent par conséquent moins de sites de fixation pour les peptides cationiques
(Yeaman and Yount 2003). Nahaie et al. (Nahaie, Goodfellow et al. 1984) ont
examiné la composition de plusieurs espèces de Staphylocoques. Si la plupart
d’entre eux présentaient une structure riche en phospatidylglicérol (PG) et
cardiolipine (CL), S. aureus incluait dans sa membrane des ménaquinones insaturées
et des formes dérivées de PG nettement moins électronégatives. Cette configuration
diminue la charge négative de surface de la membrane et limite les interactions
électrostatiques. Une autre hypothèse de résistance constitutive est avancée par la
présence de glycocalyx à la surface de certaines capsules bactériennes. Celui-ci, très
anionique, emprisonnerait les peptides cationiques et limiterait ainsi leur contact
avec la membrane. Cette résistance a été démontrée pour les acides alginiques du
glycocalyx de P. aeruginosa par Friedrich et al. (Friedrich, Scott et al. 1999). Enfin,
le micro-environnement physiologique (forces ioniques, pH, …) dans lequel
certaines espèces évoluent in vivo, semble être à l’origine de leur résistance aux
peptides antimicrobiens (Dhawan, Yeaman et al. 1997).
Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens
Les résistances adaptatives correspondent à une réponse spécifique du micro-
organisme lors du contact avec le peptide antimicrobien. Ces mécanismes ont pu être
étudiés récemment, grâce notamment à des travaux sur des souches mutantes
génétiquement modifiées. Cette réponse peut se traduire par la sécrétion de protéases
capables de cliver certains peptides, ou par la modification de certains composants
membranaires en réponse à l’agression par les peptides antimicrobiens. Par exemple,
Guina et al. (Guina, Yi et al. 2000) ont démontré à la surface de Salmonella, la
présence d’une endopeptidase, PgtE, proche de la protéase VII d’E.coli, capable de
cliver des peptides cationiques. De même, la résistance aux défensines et aux
protégrines de S. aureus a été associée à la modification de ses composants
membranaires, notamment la production de lysyl-PG dérivé nettement moins
électronégatif (Peschel, Jack et al. 2001).
Ces mécanismes de résistance doivent faire l’objet de travaux complémentaires
afin de mieux comprendre leur fonctionnement. De même, l’étude de la résistance
naturelle de certains peptides antimicrobiens aux processus de dégradation des
micro-organismes permettra l’élaboration de nouvelles molécules.
Matériels et Méthodes
Chapitre 1 : Matériel
1.1 : Polyélectrolytes
Les polyélectrolytes sont préparés en solution aqueuse, à une concentration de 1
mg/mL. Le pH est ajusté avec des solutions d’acide chlorhydrique et de soude. Plusieurs
types de polyanions et polycations ont été utilisés. Leurs caractéristiques sont données
respectivement dans les tableaux 2-1 et 2-2.
Tableau 2-1 : Tableau récapitulatif des polyanions utilisés dans les multicouches.
Nom despolypeptides Notation Nature pKa Formule développée Fournisseur
Massemolaire
(Mw)
(103
g.mol-1)
Acide Poly(L-glutamique) PGA
Polypeptidesynthétiquedégradable
4.3 (Kyte 1995) Sigma ~55
Poly(4-styrènesulfonate) PSS Synthétique
non dégradable
2(Ahrens,
Baekmark et al.2000).
Aldrich 70
Acidehyaluronique HA
Polysaccharidenaturel
dégradable
2.9(Lapcík, Lapcík
et al. 1998)Bioiberica 400
.CH2
CH.
S
O
O O-
n
Na+
O
O
HH
HH
OOH
H OH
O
OH
OO
HH
HH
H NH
O
OH
CH3
O
OH
n
CH-CH2
-
C
O-O
n
Matériels et Méthodes
Tableau 2-2 : Tableau récapitulatif des polycations utilisés dans les multicouches.
1.1.1. Construction des films multicouches de polyélectrolytes
Les substrats utilisés pour les études sont généralement à base de silice qui est
chargée négativement et présente une faible rugosité. De plus, sa transparence
facilite les observations optiques. Ces différentes caractéristiques font donc du verre
un bon support d’étude. Les résultats obtenus sur le verre sont facilement
transposables, car les films multicouches de polyélectrolytes possèdent rapidement
Nom despolypeptides Notation Nature pKa Formule développée Fournisseur
Masse molaire(Mw)
(103 g.mol-1)
Poly(L-lysine) PLLPolypeptidesynthétiquedégradable
10.5(Kyte 1995) Sigma 30
Poly(éthylèneimine) PEI Synthétique
non dégradablePolybase forte Aldrich 750
Poly(allylamine)hydrochloride PAH Synthétique
non dégradable
9(Mendelsohn,
Yang et al.2003)
Aldrich 70
Chitosan CHIPolysaccharide
natureldégradable
6.5(Denuziere,Ferrier et al.
1996)
FMCBiopolymer
110/128272/460
H2C
C
CH2
CH
O
NH
H2C
NH3+
. .
CH2
Br-
n
Cl-
CH-CH2
-
H2C
NH3+
n
O
O
HH
HH
OOH
H NH
O
OH
O
HH
HH
OH
H NH2
O
OH
O
CH3
H
DA 1-DA
Matériels et Méthodes
au cours de leur construction des caractéristiques indépendantes du substrat (Ladam,
Schaad et al. 2000).
Pour les études en microscopie confocale, les films multicouches de
polyélectrolytes sont construits sur des lamelles de borosilicate de diamètre 12 ou 14
mm (VWR). Les lamelles sont préalablement nettoyées dans du SDS 0.01 M (10
min, au bain-marie), puis dans du HCl 0.1 N (10 min, au bain-marie) et enfin,
rincées abondamment à l’eau et séchées sous flux d’azote. Les lamelles sont ensuite
immergées dans la solution de polycations (à 1 mg/mL), la surface des lamelles de
verre étant chargée négativement, pendant 10 min. Puis les lamelles sont rincées
avec une solution saline de concentration identique à la solution de polyélectrolytes.
Le temps de rinçage est compris entre 5 et 10 min selon les études. L’ensemble est
enfin plongé dans une solution de polyanions et rincé suivant le même protocole que
pour le dépôt du polycation. L’opération d’immersion successive dans le polycation
et dans le polyanion est répétée jusqu’à l’obtention du nombre de couches
souhaitées.
Pour la réalisation de films contenant un nombre élevé de couches, l’opération
de dépôt est programmée à l’aide d’un bras automatisé (Dipping Robot DR3,
Kriestein) déplaçant séquentiellement les portoirs à lamelles dans les différents bains
de polyélectrolytes et de rinçage.
1.2 : Peptides antimicrobiens
1.2.1. La Défensine
La Défensine utilisée dans nos expériences est issue de l’hémolymphe du
moustique Anopheles gambiae (Richman, Bulet et al. 1996). Elle a été fournie
gracieusement par le Dr J-L. DIMARCQ (Société Entomed SA) dans le cadre d’une
coopération. Elle a été stockée en alicots à -30°C après dissolution de sa forme
déshydratée dans du NaCl 0,15 M à 1 mM, pH 6,3. Pour nos expériences, elle a été
utilisée à 10µM ou 20µM, concentrations supérieures à la concentration minimale
d’inhibition (mic) pour les deux souches bactériennes testées (Cociancich, Ghazi et
al. 1993; Vizioli, Richman et al. 2001). Son pHi étant de 8,58 elle présente donc à
Matériels et Méthodes
pH 6,3 une charge cationique de +4,18 mV. Son insertion s’envisage, par
conséquent, après une couche anionique de PGA.
1.2.2. La Chromofungine
La chromofungine nous a été fournie gracieusement par le Dr M-H METZ-
BOUTIGUES (UMR-S575). Ce peptide a été synthétisé dans le laboratoire de
l’UMR et fourni sous forme lyophilisée. Il correspond à la fraction 47-66 de la
chromogranine A (CGA) bovine, et répond une séquence de 20 acides aminés
RILSILRHQNLLKELQDLAL. Pour les expériences de fluorescence, le peptide
nous a été fourni greffé à de la rhodamine. Son spectre antifongique est large et sa
mic envers C. albicans est de 50µM (Lugardon, Chasserot-Golaz et al. 2001). Nous
avons inséré la chromofungine entre le PGA et le PLL, avec une concentration en
solution de 500 µM.
1.3 : Synthèse du copolymère de l'acide poly(L-glutamique) /
poly(éthylène glycol)
Le mono-méthoxy-poly(éthylène-glycol), noté PEG, a été fourni par Sigma
(N° cat : M 7143 / M 7268). Sa masse molaire varie de 2000 à 5000 g/mol.
La synthèse du copolymère PGA-PEG a été réalisée par les Dr B. Fritsh et F.
Boulmedais. Elle suit une séquence chimique qui confère tout d’abord une fonction
amine au PEG afin de permettre le couplage des deux polymères par des liaisons de
type amide (figure ci-après)
Matériels et Méthodes
Shéma du couplage PGA / PEG réalisé par les Dr FRITSCH et BOULMEDAIS
Le couplage du PGA et du PEG amine s’effectue en milieu tamponné
tétraborate de sodium à pH 8.5. Le taux de couplage entre le PGA et le PEG est
calculé en supposant un rendement de 100%. Il y a formation de liaisons amides
entre les deux polymères. 20 mg (soit 0.13 mmol de fonction acide) de PGA, 23.8
mg (soit 0.012 mmol de fonction amine, 9% de greffage espéré) de PEG 2000, et 1
mg (0.005 mmol) de Sulfo NHS sont dissous dans 1 mL de tampon, 50 mM de
sodium tétraborate à pH 8.5. 3.6 mg (0.019 mmol) d'EDC sont ajoutés au mélange
sous agitation et à température ambiante. Le système est maintenu sous agitation
pendant 6 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est trouble. Après
filtration, le milieu réactionnel est dialysé pendant 24 heures contre 2L de tampon
phosphate ( 0.1 M, pH = 7.4, Na2HPO4 / NaH2PO4 ), puis 24 heures contre 2L d’eau
(membrane cut off 10 000). Un solide jaune translucide (17.2 mg) est récupéré après
Matériels et Méthodes
passage au Speed Vack. Le rendement est de 44%. La RMN 1H donne un
pourcentage de greffage de 7.4%. Aucune autre technique de purification n’est
utilisée. Au-delà de 30% de couplage, le PGA-g-PEG se comporte comme un
hydrogel, c'est à- dire qu'il absorbe l'eau et ne se dissout pas.
Matériels et Méthodes
Chapitre 2 : Méthodes
2.1 : Analyses physico-chimiques
L’étude physico-chimique des films multicouches de polyélectrolytes a été réalisée
à l’aide de différentes techniques complémentaires (Figure 2-1). Elle a porté
principalement sur la caractérisation d’épaisseur (OWLS, QCM-D, Microscope
confocale), l’indice de réfraction (OWLS), et le potentiel électrocinétique de surface
(potentiel d’écoulement).
Haut du film
QC
M-D
OWLS
≈400 nm
Substrat
Microscopie
Confocale
Potentiel Zeta Haut du film
QC
M-D
OWLS
≈400 nm
Substrat
Microscopie
Confocale
Potentiel Zeta
Figure 2-1 Ensemble des méthodes utilisées pour caractériser le film. La spectroscopie optique par guided’onde (OWLS) permet de mesurer l’indice de réfraction et l’épaisseur de films multicouches jusqu’àenviron 400 nm. La microbalance à cristal de quartz (QCM) informe sur la masse des films. Enfin, la
mesure du potentiel zêta informe sur la charge de surface des films multicouches.
2.1.1. Spectroscopie optique par guide d’onde
2.1.1.1. Principe et description de la technique
La spectroscopie optique par guide d'onde (ou OWLS Optical Waveguide
Lightmode Spectroscopy) est une technique optique permettant d’étudier in situ
l’adsorption de macromolécules sur un substrat (Tiefenthaler and Lukosz 1989). La
Matériels et Méthodes
technique utilise les propriétés de réflexion de la lumière à l’interface guide/couche
adsorbée pour déterminer l’épaisseur et l’indice de réfraction de cette couche. Un
faisceau laser est dirigé sur le guide d’onde (généralement en oxyde métallique
transparent de ~200 nm d’épaisseur et d’indice de réfraction supérieur à 1.7) sur
lequel est gravé un réseau de diffraction. Pour un angle donné, appelé angle de
couplage, le faisceau laser reste confiné au sein du guide d’onde par réflexion totale
interne et se propage dans le guide (dans la direction x) jusqu’aux photodiodes
disposées aux extrémités latérales du guide d’onde.
Figure 2-2 Schéma de principe de la spectroscopie par guide d'onde.
. Dispositif expérimental
Le dispositif expérimental, mis au point au sein de l’unité par le Dr Frédéric
Cuisinier, est schématisé sur la figure 2-3. Un laser Hélium-Néon de 5 mW (Melles-
Griot), de longueur d'onde 632.8 nm, est réfléchi par un miroir sur un guide d'onde
en Si0.8Ti0.2O2 (Micro Vacuum Ltd) mono-mode (m=0) permettant uniquement une
réflexion du premier ordre (l=1). Le guide est monté dans une cellule de mesure,
deux photodiodes (Hamamatsu) sont disposées à chaque extrémité du guide. Un
ordinateur pilote le déplacement d’un moteur (M-UTM Newport) permettant la
rotation du guide sur une plage angulaire de –8° à +8° avec une précision angulaire
de 3.10-4 degré. La résolution en indice de réfraction effective (∆N) est alors de 10-5.
solution C (nc)
réseau
Substrat S
Guide F
Couche adsorbée A
α
γs
θi θf ns
nf
na
Phot
oDio
de
PhotoDiode
Matériels et Méthodes
Les guides d’onde ASI 2400 (MicroVacuum Ltd) sont en Si0.8Ti0.2O2, ils sont
déposés sur un substrat en silice pure.
Figure 2-3 Schéma de principe du spectroscope par guide d'onde comprenant un laser polarisé, un guided’onde, deux photodiodes qui mesurent les intensités de couplage et un moteur qui permet d'effectuer un
balayage angulaire (schéma repris de [234])
Lorsque les conditions de couplage sont vérifiées, le faisceau diffracté par le
réseau se propage jusqu’aux photodiodes où l’intensité est mesurée. Deux angles de
couplage sont ainsi obtenus pour chaque photodiode. Le temps d’acquisition d’un
point étant d'environ 1min 30s, il est ainsi possible de suivre la construction du film
multicouche.
2.1.1.2. Protocole expérimental
Les solutions sont préalablement dégazées pendant 30 minutes. Cette opération
est nécessaire pour éviter la formation de bulle d’air dans le montage. L'indice de
réfraction de la solution tampon (nc) est mesuré dans les conditions expérimentales
avec un réfractomètre RFM 340 (Bellingham-Stanley).
Matériels et Méthodes
Après réglage du laser pour avoir des pics symétriques et d’intensité maximale,
la cellule de mesure est mise à l’équilibration pendant 30 min. Les guides d’ondes
utilisés étant chargés négativement, la construction du film débute par l’injection de
la solution de polycations (100µL) dans la cellule de mesure (37µL). L’ensemble est
laissé au repos durant 10 min. Après le dépôt de la couche de polycations, la cellule
est rincée sous flux (10mL/h) pendant 10 min avec la solution de rinçage. Les étapes
d’injection et de rinçage des différents polyélectrolytes sont ensuite répétées selon le
même schéma avec une alternance entre les polyélectrolytes chargés négativement et
positivement. La construction de la multicouche est ainsi suivie in situ.
2.1.1.3. Traitement du signal
Les indices effectifs (NTE et NTM) sont mesurés en fonction du temps. Avant le
calcul de l’indice de réfraction du film (nA) et de son épaisseur (dA), il faut
auparavant caractériser les propriétés optiques du guide d’onde : indice de réfraction
(nF) et épaisseur (dF).
Un programme de résolution numérique des équations a été développé au sein
du laboratoire. L’ensemble des équations nécessaires au traitement du signal a été
décrit par Picart et al. (Picart, Gergely et al. 2004). Pour l’analyse numérique, le film
multicouche de polyélectrolytes est défini comme un film homogène et uniforme.
A partir des grandeurs nA et dA, une formule approchée donnant la masse
adsorbée (qA) a été proposée par DeFeyter et al. (De Feijter, Benjamins et al. 1978):
dcdnQq
/1.0A
A
×= où dn/dc (en mL/g) est la variation d’indice de réfraction
par rapport à la variation de concentration en polyélectrolyte dans le film avec :
dn/dc = 0.197 mL/g pour les polyélectrolytes (Huglin 1972)
dn/dc = 0.18 mL/g pour les protéines (Huglin 1972)
La précision de l’appareil (10-5 sur les indices effectifs) limite l’épaisseur
maximale réellement mesurable à environ 400 nm d’épaisseur pour les films
d’indice 1.5 (Picart, Gergely et al.).
Matériels et Méthodes
2.1.2. Microbalance à cristal de quartz
La microbalance à cristal de quartz permet de suivre in situ la construction
d’un film en multicouches, ainsi que le dépôt d’un peptide lors cette construction.
Toutefois, la résolution actuelle de l’appareillage rend difficile l’interprétation des
résultats pour de petits poids moléculaires.
2.1.2.1. Principe
La microbalance à cristal de quartz (ou QCM pour Quartz Crystal
Microbalance) développée dans les années 60 (Sauerbrey 1959), est une technique
utilisant les propriétés piézo-électriques d’un cristal pour mesurer la masse adsorbée
sur ce cristal. La fréquence caractéristique de vibration d’un matériel piézo-
électrique (cristal de quartz) est en effet reliée à la masse de l’objet déposée sur ce
cristal. Des impulsions de courant alternatif sur les deux faces du cristal induisent
des contraintes de cisaillement sur le cristal perpendiculairement au champ
électrique. Inversement, les oscillations du cristal génèrent aux électrodes un signal
électrique qui est collecté par l’appareil.
Figure 2-4 Photographie (a) et schéma (b) des cristaux de quartz sur lesquels se trouvent deux électrodes enor et éventuellement une couche superficielle de SiO2 (QSX 303; Q-Sense)
Le cristal entre en résonance quand la relation qt
nvf2
= est vérifiée avec n un
nombre entier impair, tq l’épaisseur du cristal, v la vélocité de l’onde d’extension et
v/f est la longueur d’onde. L’adsorption de molécules sur le cristal augmente la
masse oscillante et induit un changement de fréquence de résonance du cristal. Ce
phénomène s’observe également aux harmoniques impaires. Pour ces fréquences, la
Matériels et Méthodes
sensibilité de la technique est augmentée. Toutefois leur longueur de pénétration
diminue avec l’augmentation de la fréquence étudiée. Le changement de fréquence
dû à l’adsorption peut être corrélé à la variation de masse pour des films fins, rigides
et uniformes au contact de l’air ou sous vide grâce à la relation de Sauerbrey (ci-
dessous). Il est ainsi possible de convertir la variation de fréquence en masse.
où ρq, tq et f0 sont respectivement la densité, l’épaisseur et la fréquence de
résonance fondamentale et n le rapport entre la fréquence de l’harmonique et la
fréquence fondamentale. Cette relation a été développée pour un dépôt au contact
avec le vide. Muramatsu et al. (Muramatsu, Tamiya et al. 1988) ont montré que la
mesure en solution liquide génère une résistance sur l’oscillation du cristal. Il a été
récemment démontré que la relation de Sauerbrey s'applique également, mais de
façon approchée, à un dépôt solide au contact d'un liquide (Rodahl and Kasemo
1996), mais toujours pour des films fins, rigides et uniformes.
Or, les films multicouches étudiés sont très hydratés et possèdent généralement
un comportement de gel lorsqu’ils deviennent épais. La relation de Sauerbrey n’est
alors plus applicable. Les récentes évolutions techniques ont permis l’étude d’un
nouveau paramètre : la dissipation. Le facteur de dissipation (D) est inversement
propositionnel au temps de vibration du cristal après son excitation. (Figure 2-5).
Tem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation (f’= ( -
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
(f’= (f-∆ f)υ M H z; D )
to t
(f= fυ M H z)
Tem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation (f’= ( -
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
to tiTem ps
Am
plit
ude
Excitation R elaxation
(f’= (f-∆ f)υ M H z; D )
to t
(f= fυ M H z)
Figure 2-5 Amplitude d'oscillation du cristal en fonction du temps A(t) lors d'une expérience en QCM :Première phase (jusqu'à t0), excitation du cristal à sa fréquence de résonance. Seconde phase, étude de la
relaxation du cristal avec obtention de la nouvelle fréquence de résonance (f’=f-∆f) et de la dissipation (D) àl’aide des formules : τπ teftAtA −××= )'2sin()( 0 et
0
1fD τπ=
Hzcmngft
C qq 2
0
7.17≈=ρ
nfC
nfft
m qq ∆−=
∆−=∆
0
ρ avec
Matériels et Méthodes
Le facteur de dissipation est lié aux propriétés viscoélastiques (module
d’Young, et viscosité) du dépôt. Une analyse de l’évolution des fréquences et de la
dissipation a été réalisée à partir du modèle proposé par Voinova et al. (Voinova,
Rodahl et al. 1999). Ce modèle a été étendu par le Dr B. Senger (Inserm U 595) aux
données obtenues à l’aide de la QCM-D (Q-Sense). Le programme détermine ainsi
l’évolution de l’épaisseur sur plusieurs centaines de nanomètres ainsi que les
propriétés mécaniques des films telles que la viscosité et le module élastique pour
des multicouches de polyélectrolytes (Zhang, Senger et al. 2004).
La technique est sensible à la masse totale mise en mouvement lors de
l’oscillation et notamment à l’eau emprisonnée dans le film. Ces deux phénomènes
rendent une analyse quantitative du dépôt délicate et plus particulièrement pour la
caractérisation mécanique du film.
Les cristaux utilisés sont de type QSX 303 (cristaux de cristal Quartz recouvert
d’un film de SiO2 de 100 nm (Q-Sense)) et ils possèdent une fréquence de résonance
fondamentale à 5 MHz et des fréquences harmoniques à 15, 25 et 35 MHz. Les
fréquences de résonance du cristal sont mesurées avec une précision de 1 Hz. La
sensibilité en masse de l'appareil dans ces conditions est de ~5 ng/cm2 dans l'eau et
de ~1 ng/cm2 dans l'air à la fréquence de résonance fondamentale de 5 MHz.
2.1.2.2. Protocole expérimental
Avant chaque expérience, le cristal est nettoyé in situ, avec une solution de
Hellmanex II à 2% (cat n : 320.001, Hellma, Müllheim, Allemagne) pendant une
demi-heure à température ambiante. Il est ensuite rincé avec du HCl 0.1N puis lavé à
l’eau et séché à l'azote.
La suite de l’expérience se déroule de manière similaire à l’étude en OWLS
par une injection alternée des solutions de polycations et de polyanions (10 min
d’adsorption suivie de 10 min de rinçage) dans la cellule de mesure (Figure 2-7).
Toutefois, il faut utiliser 2 mL de solution par dépôt : une expérience en QCM-D
nécessite des quantités de produits plus importantes qu’une expérience réalisée par
OWLS. Pour suivre la construction des films, la température de mesure est fixée à
25°C, dans les essais de dégradation salivaire la température est fixée à 37°C. Le
Matériels et Méthodes
temps séparant 2 mesures est de quelques secondes permettant ainsi d’observer les
cinétiques de dépôt et de désorption.
Cristal
Sortie
Electrodes
Entrée
Cellule de mesure
Cristal
Sortie
Electrodes
Entrée
Cellule de mesure
Cristal
Sortie
Electrodes
Entrée
Cellule de mesure
Figure 2-6 Schéma de la cellule de mesure (Q-Sense). Les polyélectrolytes sont injectés par le port d’entréeet sortent par le port de sortie.
2.1.3. Mesure du potentiel d’écoulement
La mesure du potentiel d’écoulement permet de déterminer la charge électrique
d’une surface. A ce titre, il permet le suivi des changements de charge de la surface
des films en multicouche de polyélectrolytes, et l’effet sur cette charge de
l’adsorption d’un peptide au cours de l’auto-assemblage.
L'environnement ionique d'une surface s'organise pour maintenir l'électro-
neutralité du système. Ainsi, les ions de charge opposée à celles de la surface sont
attirés sous l'effet de la force d'attraction de Coulomb et les ions de charge identique
sont repoussés. Combinées au mouvement brownien, ces forces conduisent à une
distribution des charges normale à l'interface. L'atmosphère ionique, fixée à la paroi,
constitue ce qu'on appelle la double couche.
. La double couche électrique
Graham et al. (Graham 1947) ont proposé un modèle à deux zones pour la
distribution normale des ions à une surface chargée. Dans la première zone, seuls les
Matériels et Méthodes
ions de charge opposée à la surface sont présents, cela constitue la couche de Stern.
Dans cette couche, les ions sont présents sous deux états : fortement liés à la surface,
ils sont alors très peu hydratés et leur distance moyenne avec la surface définit le
plan interne d’Helmholtz (PIH). Au-delà de ce plan, les ions sont hydratés et leur
interaction à la surface est plus faible.
D’après le modèle, dans la seconde zone, il existe une distribution entre les
anions et les cations qui suit le modèle défini par Chapman (Chapman 1913). Ce
modèle (Figure 2-7) définit l’évolution du rapport entre les espèces positives et
négatives à partir de la couche de Stern jusqu’à l’équilibre à l’aide de considérations
thermodynamiques. Ainsi, l'approximation de Debye-Hückel permet d’estimer
l’évolution du potentiel en fonction de la distance par rapport à la surface, pour des
potentiels faibles, et s’écrit :
)κexp(ψψ 0 x−=
avec ψ0 le potentiel de la surface, x la distance normale à la surface et 1/κ la
longueur de Debye-Hückel.
Le potentiel zêta (ξ) correspond au potentiel au niveau du plan de cisaillement
entre la surface et un flux parallèle à la surface. Les ions de la couche de Stern sont
fortement liés à la surface et ils ne sont pas arrachés par le flux. Le plan de
cisaillement est généralement confondu avec le plan de Stern.
Le potentiel zêta est défini par la relation de Smoluchowski (Smoluchowski
1903; 1921) :
où r est le rayon du capillaire (en m), L la longueur du capillaire (en m), RC la
résistance électrique du capillaire contenant l'électrolyte (en Ω), εε0 la permittivité
de l'électrolyte et µ la viscosité dynamique de l'électrolyte.
En mesurant ∆V en fonction de ∆P, il est ainsi possible de calculer le potentiel
zêta de la surface du capillaire.
)(**
02 πεε
µζ
rLR
PV
C∆∆
=µ
ζπεεL
RrPV C )( 02
∆=∆ d’où
Matériels et Méthodes
κ1
xi d d’
xi
κ1
xi d d’
κ1
xi d d’
κ1
xi d d’
κ1
xi d d’
κ1
xi d d’
κ1κ1
xi d d’
xi
κ1
xi d d’
κ1κ1
xi d d’
κ1κ1
xi d d’
κ1κ1
xi d d’
Figure 2-7 Le modèle de Graham (Graham 1947) Le plan interne de Helmholtz (PIH) est localisé à ladistance xi de la surface, alors que le plan externe de Helmholtz (PEH) ou plan de Stern est localisé à ladistance d et le plan de cisaillement est proche du plan de Stern à une distance d’ proche de d (Viallis-Terrisse 2000)
Expérimentalement, la mesure consiste à appliquer un flux d’une solution
d’électrolytes (solution tampon) dans un capillaire recouvert du film multicouche.
La différence de potentiel ou potentiel d’écoulement (∆V) aux extrémités du
capillaire est mesurée en fonction de la différence de pression (∆P) qui est appliquée
aux extrémités du capillaire.
2.1.3.1. Dispositif expérimental
Le dispositif expérimental mis au point par C. Picart (Figure 2-8) est constitué
de deux cellules de mesure reliées par un capillaire en silice de 20 cm de longueur et
530 + 12 µm de diamètre (Sin 2042-R10, Perichrom SARL). Les films multicouches
de polyélectrolytes sont construits dans le capillaire. L’ensemble est relié par une
extrémité à un réservoir de solution d’électrolytes qui peut être mise sous pression
(1.2 bar) avec une bouteille d’azote. Au cours de l’expérience, les valeurs du
potentiel d’écoulement ainsi que la différence de pression aux extrémités du
capillaire sont acquises en continu par un logiciel mis au point par J. Iss (Institut
Charles Sadron, Strasbourg).
Matériels et Méthodes
Azote sous pression (1.2 bar) Solution
d’électrolyte
Circuit du polyelectrolytes lors de la construction du
film
Capillaire
Mesure de différence de potentiel (DV)
Mesure de différence de pression (DP)
∆P=f(t)∆V=f(t)⇒ potentiel ξ
Flux d’électrolytes lors de la mesure
Capteur de pression
Electrode de Pt
Figure 2-8 Dispositif expérimental de mesure du potentiel d'écoulement. Le potentiel ξ est obtenu paranalyse de la différence de pression et du potentiel d’écoulement aux extrémités du capillaire en fonction dutemps lors de la mise en mouvement de la solution d’électrolytes à l’aide de la surpression dans le réservoird’électrolytes. D'autre part, un circuit secondaire au niveau du capillaire permet d'injecter directement lespolyélectrolytes dans le capillaire et de les rincer après chaque adsorption.
2.1.3.2. Procédure de mesure
Après étalonnage de la résistance du capillaire (Rc) et du circuit dans les
conditions expérimentales (sans flux), le film multicouche est construit in situ dans
le capillaire. 8 mL d’une solution de polycations sont injectés pour le dépôt de la
première couche, laissés au repos pendant 20 min puis rincés par 50 mL de solution
d’électrolytes. Après le rinçage du film, le potentiel d’écoulement est mesuré à trois
reprises en fonction de la pression aux extrémités du capillaire. La pression est
contrôlée par l’application ponctuelle d’une pression de 1.2 bars à une extrémité du
capillaire. La valeur moyenne de ces trois mesures (et l’écart type) est prise pour
valeur du potentiel zêta.
Matériels et Méthodes
2.1.4. Microscopie de fluorescence
La fluorescence est la propriété d’une molécule à absorber un photon, puis à le
ré-émettre à une longueur d’onde plus élevée (Diagramme de Jablonski, Figure 2-
10). Soumise à une excitation lumineuse de longueur d’onde donnée, la molécule
fluorescente est portée dans un état électronique excité (S1’). A température
ambiante, la conversion interne entraîne une perte partielle de l’énergie absorbée et
la molécule se retrouve à un état excité moins élevé (S1). Le retour de la molécule à
son état stable (So) est associé à la libération d’énergie sous forme lumineuse. La
perte d’énergie par conversion interne, se traduit par une longueur d’onde
d’émission supérieure à la longueur d’onde d’absorption (Déplacement de Stocke).
Ener
gie
Ener
gie
Figure 2-9 Diagramme de Jablonski. Un électron du fluorophore adsorbe de l’énergie sous forme lumineuse(1) et se retrouve à l’état excité S1’. Lors de la désexcitation, il y a tout d’abord perte de l’énergie par
conversion interne (2) (vibration, chocs...). La molécule se trouve à état d’excitation inférieur (S1) et retrouveson état stable (S0). Cette transition libère de l’énergie sous forme lumineuse (3), correspondant à une
longueur d’onde plus élevée (car l’énergie est plus faible).
2.1.5. Microscopie à épi-fluorescence
En microscopie à épi-fluorescence, la lumière est tout d’abord filtrée (filtre
d’excitation) puis dirigée par un miroir dichroïque vers l’objectif qui sert d’abord de
condensateur au faisceau d’excitation. L’objectif est ensuite utilisé pour collecter la
fluorescence émise par l’échantillon. L’utilisation d’un tel dispositif (TE200 ;
Matériels et Méthodes
Nikon) associé à l’emploi d’un miroir dichroïque et d’un film d’émission limite
l’incidence de la lumière excitatrice sur le signal collecté aux oculaires et fournit des
images avec un bon rapport signal/bruit. L’objectif collecte également la
fluorescence provenant des plans non focalisés et ne permet alors pas d’analyse
volumétrique.
2.1.6. Microscopie confocale
Le principe général de la microscopie confocale a été proposé par Minsky
(1957). Il s’agit de diriger une lumière ponctuelle, généralement obtenue à partir
d’un laser, sur un point précis (point focal) de l’échantillon à l’aide d’un microscope
à épi-fluorescence. Cependant, le trajet du faisceau laser dans l’échantillon génère de
la fluorescence en dehors du plan focal. Pour éliminer cette fluorescence parasite, un
trou de filtrage (pinhole) (Figure 2-11) est placé en amont du détecteur, il ne laisse
passer que la lumière en provenance du point focal. L’image ainsi obtenue présente
un bon rapport signal /bruit. Le balayage de l’échantillon en XY par le laser fournit
une image du plan focal. Ce balayage est obtenu à l’aide de miroirs motorisés
disposés sur le trajet optique du laser. Pour le balayage en Z, l’objectif est monté sur
un moteur piézo-électrique.
Il est ainsi possible d’obtenir des images en provenance de différents plans
focaux et ainsi de reconstituer une structure en trois dimensions avec une résolution
latérale et normale respective de 0.15 µm et 0.58µm pour un objectif ayant une
ouverture numérique de 1.4 et l’utilisation d’une longueur d’onde de 500 nm
(Stelzer and Lindek 1994).. Cette caractéristique est particulièrement intéressante
pour étudier la structure normale des films multicouches épais (micrométriques) en
milieux aqueux.
Matériels et Méthodes
Figure 2-10 Schéma de principe d'un microscope confocal en épi-fluorescence. La source laser estcondensée par l’intermédiaire du miroir dichroïque et de l’objectif en un point focal. La fluorescence est
ensuite recueillie par un photomultiplicateur. Pour éliminer la fluorescence parasite (ligne en pointillé), letrou de filtrage (pinhole) est disposé au niveau du plan image de l’objectif.
Le microscope confocal utilisé est de type LSM510 (Zeiss), monté sur un
microscope AxioVert100M (Zeiss) associé à des lasers HeNe et Ar. Pour les
visualiser, les films sont marqués à l’aide de fluorophores couplés aux
polyélectrolytes, généralement à l’aide de fluorescéine isothiocyanate (FITC
adsorption/émission 488nm/520nm) ou de TexasRed (596nm/620nm). Les
polyélectrolytes marqués utilisés sont la Poly(L-Lysine)-FITC (PLL-FITC, Sigma),
le Chitosan-FITC et le Hyaluronan-TexasRed (HA-TR) ces deux composés étant
préparés par X. Shu du groupe de G. Prestwich (University of Utah). Pour obtenir un
marquage complet du film, le polyélectrolyte est déposé en couche terminale
pendant une durée minimale de 15 min pour la PLL-FITC (0.1 mg/mL).
Sur les films multicouches dont l’un au moins des polyélectrolytes diffuse, le
dépôt d’un polyélectrolyte marqué qui diffuse à travers l’ensemble de la construction
permet de visualiser l’intégralité du film. Cela permet la détermination de son
épaisseur et de sa topographie (Figure 2-11).
Le microscope confocal utilisé disposant de plusieurs lasers, il est possible de
co-marquer les films multicouches à l’aide de deux sondes fluorescentes différentes.
Matériels et Méthodes
Il est également possible d’observer le comportement des bactéries sur un film
multicouche par un marquage distinct du film et des bactéries.
Figure 2-11 (A) Coupe normale en Zconstruit sur une lamelle de bande verte correspond à la
film et permet de mesurer l’épd’un film multicouche de (PLL
polie
2.1.7. Microscopie électroniqu
Le fonctionnement du m
par une cathode et la détection
avec l'échantillon. Ces électro
profondément dans le matéria
Le volume de cette poire dépe
l'énergie des électrons incide
faisceau vont perdre leur én
matériau générant ainsi de nom
• Réémission d'élec
• Absorption d'élec
• Courants induits
B
Ad'un film multicouche de (PLL/HA)60–PLLverre et observé avec un objectif X 40.diffusion de la PLL-FITC à travers toutaisseur du film, ici 14.5 µm.(B) Topogr/HA)20–PLL-FITC sur une surface de PMMA .(Doc. personnelle)
e à balayage
icroscope est basé sur l'émission d'électrons pro
de signaux provenant de l'interaction de ces élec
ns qui irradient la surface de l'échantillon pén
u et affectent un volume appelé "poire d'interac
nd du numéro atomique moyen de l'échantillon
nts. Dans ce volume d'interaction, les électron
ergie par collisions multiples avec les atome
breux phénomènes secondaires :
trons et de photons
trons
-FITC La leaphienon
duits
trons
ètrent
tion".
et de
s du
s du
Matériels et Méthodes
• Potentiels électriques
• Élévation de température locale
• Vibration du réseau
La figure 2-12 illustre l'ensemble des radiations pouvant être émises lors de
l'interaction entre le faisceau d'électrons et l'échantillon.
Figure 2-12 Schéma illustrant l’ensemble des radiations émises par l’échantillon
Toutes ces radiations sont produites simultanément et rendent possibles à la
fois l'observation et l'analyse d'un objet choisi (par ex. des inclusions sur une surface
de rupture).Les électrons secondaires sont créés par le passage d'un électron incident
près d'un atome. L'électron incident peut transmettre une partie de son énergie à un
électron peu lié de la bande de conduction provoquant ainsi une ionisation par
éjection de ce dernier électron. L'énergie cinétique de ce dernier ne peut excéder
50eV. Chaque électron incident peut créer plusieurs électrons secondaires. De part
leur faible énergie, seuls les électrons secondaires émis proche de la surface
(<10nm) peuvent s'échapper de l'échantillon et être recueillis par le détecteur. La
moindre variation topographique va modifier la quantité d'électrons secondaires
collectés. Les électrons rétro-diffusés sont causés par la collision entre un électron
incident et un atome de l'échantillon. Ce sont des électrons primaires qui ont réagi de
Matériels et Méthodes
façon élastique avec des noyaux d'atomes de l'échantillon. Ils sont dispersés dans
toutes les directions avec une faible perte d'énergie.
Figure 2-13 Schéma du microscope électronique à balayage Philips XL 30 (Doc. Philips)
Du fait de leur forte énergie, les électrons rétro-diffusés récupérés peuvent
provenir d'une plus grande profondeur que celle des électrons secondaires. Ils ont
une sensibilité topographique nettement inférieure. Du fait de leur origine, la
quantité d'électrons rétro-diffusés croît avec le numéro atomique des atomes
constitutifs de la cible.
♦ Le détecteur d 'électrons secondaires
La détection des électrons secondaires s'effectue grâce à un détecteur dont on
doit le principe à Everhart et Thornley (1960). Ce détecteur utitlise un des meilleurs
systèmes d'amplification de courant : le photomultiplicateur. Les électrons
Matériels et Méthodes
secondaires sont attirés par le collecteur (+300V) et sont ensuite accélérés vers le
scintillateur (10KV) qui absorbe les électrons et émet des photons. Ceux-ci arrivent
dans le photomultiplicateur à travers un guide de lumière. Dans le
photomultiplicateur, les photons sont convertis en électrons qui vont très vite se
multiplier grâce à une succession de dynodes. Le gain de ce détecteur est de l'ordre
de 100.
♦ Le détecteur d 'électrons rétro-diffusés
Le détecteur d'électrons rétro-diffusés est constitué de diodes silicium. Il
comporte deux secteurs sensibles de même surface (A=B). Cela permet deux modes
de fonctionnement :
A+B:mode composition : Les images obtenues d'un échantillon poli mettent en
évidence les phases qui le constituent.
A-B:mode topographique : Les signaux provenant de la composition s'annulent
et il reste ceux venant de la topographie qui s'ajoutent.
♦ La formation de l'image
Dans un microscope électronique à balayage, l'image est obtenue
séquentiellement point par point en déplaçant le faisceau d'électrons primaires sur la
surface de l'échantillon. L'image est alors reconstruite en utilisant le signal généré
par les différents détecteurs pour moduler la brillance d'un tube cathodique. Le
rapport entre le format de l'écran et celui de la zone balayée sur l'échantillon
détermine le grandissement.
Dans nos études, le microscope électronique à balayage utilisé est un PHILIPS
XL 30 ESEM, pourvu de la capacité d’étudier les échantillons en mode
environnemental, c'est-à-dire sans traitement de métallisation préalable. Ce mode
permet donc l’observation directe des structures dans leur étét naturel hydraté ou
vivant. Dans le cadre des films multicouche ce mode est très intéressant car le film
est fortement hydraté et serait détruit par une dessication classique.
Matériels et Méthodes
2.2 : Analyses Biologiques
2.2.1. Cultures cellulaires
2.2.1.1. Cultures bactériennes
Les études d’inhibition de croissance bactérienne ont été faites sur deux
souches bactériennes, l’une à Gram négatif : Escherichia coli D22, l’autre à Gram
positif: Micrococcus luteus. Ces deux souches ont été retenues car leur sensibilité et
la concentration minimale d’inhibition (mic) à la Défensine d’Anopheles gambiae,
en solution, étaient connues. La souche mutée D22 se caractérise par l’absence des
lipides A dans les lipopolysaccharides de la membrane bactérienne d’E. coli. Les
deux souches ont été fournies généreusement par le Dr Ph. BULET (UPR CNRS
9022).
Les cultures ont été faites dans un milieu LB (Luria-Bertani Broth ; Difco–ref
0446-17-3), en aérobiose, à 37°C pour E.coli et à 30°C pour M.luteus sous agitation
(120 tpm). Les souches ont fait l’objet de repiquages réguliers en milieu gélosé dans
des boîtes de Pétri, stockées à -4°C pour E.coli D22 et à température ambiante pour
M. luteus.
Pour chaque expérience, une colonie bactérienne issue de cultures sur milieu
gélosé est ensemencée en milieu liquide LB et suivie jusqu’à saturation, soit environ
12 heures. Chaque souche est alors repiquée à nouveau en milieu liquide LB, à une
concentration de 400 µl pour 5 ml de LB. La croissance est suivie régulièrement par
mesure de la densité optique (DO) à 600 nm sur un Metertech Σ960. Les cultures
sont utilisées pour les manipulations lorsque la phase exponentielle de croissance est
atteinte, soit une DO600 de 0,3 à 0,6 mDO. La dilution finale se fait en milieu liquide
PB (Poor Broth) plus pauvre, afin de ralentir la croissance bactérienne, et ce à 1
mDO600 ou 10 mDO600 selon l’expérimentation.
Matériels et Méthodes
2.2.1.2. Culture de Candida albicans
Les souches C. albicans ont été fournies par le Dr Metz-Boutigues de l’UMR-
S575. Pour chaque expérience, une préculture est réalisée en aérobiose, à 37°C,
pendant une nuit dans un milieu de Sabouraud (Difco). Les levures sont ensuite
resuspendues en milieu liquide de Sabouraud, sous agitation lente (40 tpm) à 37°C
jusqu’à leur phase exponentielle de croissance déterminée par mesure de
l’absorbance à 600 nm. Elles sont alors diluées dans du milieu Sabouraud à 1 mDO
ou 10 mDO selon le cas.
2.2.1.3. Culture des fibroblastes
Les fibroblastes épithéliaux primaires ont été obtenus à partir d’explants
provenant de biopsies cliniques prélevées lors de l’avulsion de troisième molaire et
selon un protocole approuvé par le Comité d’Ethique des Hôpitaux Universitaires de
Strasbourg. Un consentement éclairé du patient a été obtenu dans tous les cas. Ces
biopsies snt ensuite été découpées en plusieurs fragments cultivés à 37°C en
atmosphère humide (95%O2, 5% CO2) dans des boites Nunc® 6 puits. Cette culture
s’est faite dans un milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium, Sigma)
additioné de 10% de sérum de veau fœtal, de 100 U/ml de penicilline et 100 g/ml de
streptomicine (Invitrogen). Les cellules ont été repiquées dans du milieu frais après
avoir atteint leur confluence (env. 1 semaine).
.
2.2.1.4. Culture des cellules épithéliales
Les cellules épithéliales primaires ont aussi été obtenues par la méthode des
explants, à partir des biopsies récupérées en clinique et selon un protocole approuvé
par le Comité d’Ethique des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg. Un
consentement éclairé du patient a été obtenu dans tous les cas. L’explant est placé
dans un tube eppendorf contenant 5 mL de PBS avec 10% de Trypsine et placé à
4°C pendant toute la nuit. Le PBS est éliminé et l’explant lavé avec 1 mL de PBS et
Matériels et Méthodes
le surnageant centrifugé à 1000 rpm pendant 5 minutes. L’explant est coupé en trois
morceaux et placés dans un puits avec 1 mL de Milieu Ephitélial (DMEM ; de
Medium 199 Hepes 25 ; L-Glutamine 1x , Penicilline et Streptomycine à 50U/mL et
50µg/mL respectivement ; Toxine cholérique à 8,4 ng/mL ; Insuline à 5 µg/mL ;
Hydrocortisone à 0,5 µg/mL ; EGF 2ng/mL et EPB 25 µg/mL) et 10% de FCS
inactivé (chauffé pendant 30 minutes à 55°C) pour favoriser l’adhésion initiale des
cellules épithéliales. Le culot récupéré après centrifugation du surnageant est placé
dans un puits avec 1 mL de milieu Ephitéliale et 10% de FCS inactivé. Lorsque les
cellules ont adhéré, le milieu avec FCS est éliminé et remplacé par 1 mL de milieu
sans FCS.
En phase de croissance, les cellules épithéliales ont un aspect un peu
fusiforme, un cytoplasme périphérique mince et un noyau ovalaire saillant à la
surface. A confluence, elles forment une mosaïque homogène de cellules larges,
polygonales, translucides, adhérant solidement au fond de la boîte. Leur croissance
s’arrête par inhibition de contact.
2.2.2. Modification génétique des souches E. coli
Deux souches E. coli (Invitrogen) ont été transformées par électroporation.
Une souche a été transformée en utilisant un plasmide pFPV25 portant le gène de la
protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein, GFP) sous contrôle d’un
promoteur de la protéine ribosomale de Salmonella typhimurium (plasmide
généreusement offert par le Dr B. Lemaître, CNRS-CGM, Gif-sur-Yvette, France),
l’autre en utilisant un plasmide portant le gène de la protéine rouge (Red Fluorescent
Protein, RFP) sous contrôle de Discosoma sp. (Clontech Laboratories, Inc.). Ces
plasmides portaient également un gène de résistance à l’ampicilline. Les bactéries
transformées ont été cultivées en aérobie, dans un milieu LB et sélectionnées par
ajout d’ampicilline dans le milieu.
Une souche C. albicans exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) nous a
été gracieusement fournie par le Dr D. FERRANDON de l’UPR-9022.
Matériels et Méthodes
2.2.3. Adhésion bactérienne
L’étude de l’adhésion bactérienne a été effectuée à l’aide de la souche E. Coli
modifiée pour exprimer la GFP. Les cultures sont réalisées dans des boîtes Nunc® 24
puits, sur lamelles de verre recouvertes ou non par les films en multicouche. Les
bactéries sont diluées afin d’obtenir une concentration de 1.35 × 106 bactéries par
mL, soit une DO de 0.1 à 600 nm. Après 30 minutes de culture, les multicouches
sont rincées trois fois avec du tampon phosphate, les bactéries adsorbées sur la
surface sont visualisées en microscopie à fluorescence inversée (TE200, Nikon) et
différents champs de la surface sont photographiés (DMX1200, Nikon). L’adhésion
est évaluée après comptage des bactéries, et exprimée en pourcentage de la culture
témoin.
2.2.4. Dosage de l’activité anti-microbienne par microtitration
Des plaques de microtitration Nunc® de 96 puits ont été utilisées pour toutes
les expériences. Les films en multicouche sont construits directement dans les puits,
après préparation de la surface plastique (KOH/éthanol 50/50 pendant 30 min). Les
puits périphériques sont remplis de 100 µl de milieu PB afin de limiter les
incertitudes de résultats liées à l’évaporation plus conséquente de ces puits. Ces puits
servent aussi de témoins de contamination.
Les puits centraux sont remplis de 100 µl de la culture bactérienne en phase
exponentielle de croissance, à une DO de 0.001 à 600 nm.
Ils se décomposent en :
- puits témoins de la croissance bactérienne normale,
- puits témoins avec film non fonctionnalisé, en PGA final et PLL final.
- puits témoins de 90 µl de culture bactérienne et 10µl de Défensine libre,
dissoute dans du NaCl 0,15 M, à une concentration de 10 µM,
- puits avec film fonctionnalisé.
Matériels et Méthodes
Après 12 heures d’incubation à 37°C pour E. coli et 30°C pour M. luteus, sous
agitation douce (40 tpm), la croissance bactérienne est mesurée à une longueur
d’onde de 600 nm à l’aide d’un lecteur de plaques Metertech Σ960. L’inhibition de
croissance est exprimée par comparaison de la DO600 de la fraction testée à celle de
la culture témoin.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
1Fonctionnalisation par le poly(éthylène-glycol)
Polyelectrolyte multilayer films with pegylated polypeptides as a new type
of anti-microbial protection for biomaterials
Boulmedais F., Frisch B., Etienne O., Lavalle P., Picart C., Ogier J., Voegel J. C., Schaaf P., Egles C.
Article publié dans Biomaterials vol 25 (2004)
Comme nous l’avons évoqué précédemment, l'adhésion bactérienne à la surface
d'un matériel médical est la première étape conduisant à la constitution du biofilm. Afin
de réduire cette adhésion, nous avons envisagé la construction de multicouches de poly(L-
lysine)/ d'acide poly(L-glutamique) (PLL/PGA) terminées par plusieurs bicouches de
PLL/PGApeg, où le PGApeg correspond à l'acide poly(L-glutamique) couplé au
poly(éthylène glycol).
Le PEG est un polymère biocompatible qui présente à la fois des caractéristiques
hydrophiles et hydrophobes. Il a été utilisé, greffé chimiquement ou simplement adsorbé à
la surface, dans de nombreux travaux où il a démontré qu’il réduisait l’adsorption
protéique (Cheng, Kang et al. 2000; Zhu, Eurell et al. 2001) et l’adhésion bactérienne
(Park, Kim et al. 1998). Cet effet anti-adhésif est lié à sa grande affinité pour les
molécules d’eau, qui crée ainsi à la surface du matériau une couche extrêmement hydratée
rendant l’adhésion des macromolécules difficile (Harris 1992). Le couplage du PEG avec
différents polyélectrolytes a été réalisé par les Dr B.Fritsch et F.Boulmedais.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
Dans un premier temps, la caractérisation physico-chimique de la construction de
différents films a été étudiée à l’aide de mesures du potentiel d'écoulement et de mesures
en microbalance à cristal de quartz. Ces études ont permis de confirmer le motif structural
adéquat consistant en une architecture de type (PGA/PLL)n-(PGApeg/PLL)n .
Dans un deuxième temps, l’adhésion protéique et bactérienne sur ces films a été
étudiée. Les protéines contenues dans le sérum foetal de veau s'adsorbent très peu sur les
multicouches terminées par PGA et par PGApeg, comparativement au verre de silice nu,
utilisé comme support pour les multicouches. De même, l'adhésion d'Escherichia
coli est réduite de 72% sur les films terminés par une bicouche de (PLL/PGApeg) par
rapport aux mêmes surfaces contrôles (fig. 2-14).
Figure 2-14 Adhésion d’E. coli sur des surfaces de verre nues (a) ou recouvertes d’un film PEI-(PGA/PLL)2-PGA-(PLL/PGApeg)3 (b)
Ces résultats sont conformes à ceux obtenus par d’autres auteurs utilisant le PEG
en recouvrement de surface, notamment en dépôts monocouches (SAMs). Cependant,
l’intérêt des assemblages en multicouches réside dans la possibilité d’augmenter la
concentration des molécules actives par la simple multiplication des couches
fonctionnalisées. En exploitant ce principe, nous avons pu obtenir une réduction de 92%
sur les films terminés par trois bicouches (PLL/PGApeg), comparativement au verre de
silice.
Ces résultats montrent la capacité du PGApeg, inséré dans les films de
multicouches, à réduire drastiquement l'adsorption de protéines et l'adhésion bactérienne.
Ce type de films "anti-adhésifs" représente potentiellement un nouveau type de
Applications aux matériaux prothétiques oraux
revêtement pour les biomatériaux, qui pourrait être utilisé comme protection contre
l'adhésion bactérienne, limitant ainsi ses effets pathologiques.
Dans une récente étude, Harris et al. ont modifié des surfaces de titane par
adsorption spontanée de polymères PLLpeg et de copolymères PLLpeg-RGD et PLLpeg-
RDG (Harris, Tosatti et al. 2004). Ils ont ainsi pu créer une surface d’adhésion sélective,
sur laquelle l’adhésion de S. aureus était réduite de 89 à 93%, tandis que l’adhésion de
types cellulaires était favorisée par les motifs RGD et RDG. Cette voie de
fonctionnalisation semble d’un grand intérêt, particulièrement pour les matériaux
implantés, et constitue le projet actuel d’évolution pour les films en multicouche de
polyélectrolytes à propriétés antiadhésives.
[signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]
Polyelectrolyte multilayer films with pegylated polypeptides as a new type of anti-
microbial protection for biomaterials
F. Boulmedais, B. Frisch, O. Etienne, Ph. Lavalle, C. Picart, J. Ogier, J. -C. Voegel, P.
Schaaf and C. Egles
Biomaterials, 2004, Vol. 25, n°11, pages 2003-2011
Pages 2003-2011 :
• La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
• Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l'éditeur : http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2003.08.039
• Il est également possible de consulter la thèse sous sa forme papier ou d'en faire une
demande via le service de prêt entre bibliothèques (PEB), auprès du Service Commun de
Documentation de l'ULP: [email protected]
Applications aux matériaux prothétiques oraux
2Fonctionnalisation par la Défensine
Multilayer polyelectrolyte films functionalized by insertion of defensin: a
new approach to protection of implants from bacterial colonization
Etienne O., Picart C., Taddei C., Haikel Y., Dimarcq J. L., Schaaf P., Voegel J. C., Ogier J. A., Egles C.
Article publié dans Antimicrobials Agents and Chemotherapy vol 48 (2004)
Le système anti-adhésif que nous avons obtenu avec les films fonctionnalisés par
le poly(éthylène glycol) permet de réduire considérablement l’adhésion bactérienne.
Toutefois, il est limité par son caractère non sélectif. Il peut correspondre à un usage
intéressant pour des matériaux transitoires (cathéters, fils de suture,…) mais limité pour
des matériaux implantables.
Nous nous sommes donc intéressés à une autre voie de protection antimicrobienne,
plus sélective. En effet, la fonctionnalisation des films en multicouche par un peptide
antimicrobien devait permettre cette action antimicrobienne ciblée tout en autorisant les
contacts cellulaires et protéiques nécessaires à la bonne intégration d’un matériau
implantable.
La structure générale des films de polyélectrolytes utilisés lors de ces travaux
répond à des impératifs physico-chimiques et biologiques. Ainsi, les couches primaires
sont composées de poly(éthylène imine), de poly(styrène sulfonate) et de poly(allilamine)
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hydroxyde sous la forme PEI-(PSS/PAH)2 car cette sous-couche est reconnue pour
donner une bonne stabilité au film. Les couches suivantes sont constituées par l’alternance
de poly(L-lysine) et d’acide poly(glutamique) reconnus pour leur bonne biocompatibilité.
Le choix du peptide antimicrobien s’est porté sur la Défensine d’Anopheles
gambiae, dont l’activité en solution était bien caractérisée. Ce peptide présente en effet un
large spectre ainsi que des concentrations minimum d’inhibition très faibles. De plus, son
mode d’action supposé laissait entrevoir un effet de type purement membranaire et non
intra-cellulaire (Cociancich, Ghazi et al. 1993). Dans un premier temps, des études
physico-chimiques ont été entreprises afin de confirmer et de caractériser l’adsorption de
la Défensine lors de la construction du film. Son pHi lui confère une charge positive de
+4,15 mV à pH 6,3 où les multicouches sont construites, ce qui permet d’envisager son
adsorption sur une couche anionique de type PGA. Cette adsorption reste très difficile à
caractériser sur le plan physico-chimique car le peptide de 4 ,6 kDa est à la limite de
détection de nombreuses méthodes, notamment du guide d’onde pourtant classiquement
utilisé dans ce but. Cependant, les mesures en microbalance à cristal de quartz nous ont
permis d’enregistrer un signal confirmant une dépose de la Défensine lors de la
construction du film, sans que celui-ci soit significativement exploitable à des fins
quantitatives. Les mesures en potentiel d’écoulement de la charge de surface confirment
aussi ce dépôt en montrant une diminution de la charge anionique de surface. La charge ne
s’inverse toutefois pas, laissant supposer une adsorption relative mais incomplète à la
surface du film. Il apparaît dès lors nécessaire de continuer la construction des
multicouches par une couche cationique PLL, et non comme nous aurions pu le penser par
une couche anionique emprisonnant en « sandwich » le peptide.
Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’activité antimicrobienne de ces
films fonctionnalisés, sur deux souches bactériennes (E.coli D22 et M. luteus).
L’inhibition de croissance mesurée après 16h d’incubation et exprimée en pourcentage du
contrôle, confirme l’effet significatif des films fonctionnalisés par une couche de
Défensine. La réduction est de l’ordre de 86% sur M. luteus et de 78% pour E. coli.
Deux observations importantes ressortent aussi de ces premiers résultats, la
première est l’effet propre du film non fonctionnalisé à fin cationique qui montre une
réduction de l’ordre de 43% sur M. luteus et de 8% sur E.coli. La deuxième observation
est liée aux résultats de la croissance sur films fonctionnalisés à fin anionique, qui ne
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laisse apparaître aucune différence par rapport au contrôle. Ce deuxième point conforte
l’idée du non-relargage du peptide dans le milieu environnant.
Deux autres analyses biologiques ont alors été envisagées, afin de préciser l’effet
éventuel de la concentration du peptide inséré en monocouche et l’effet de la
multiplication de ces couches à une concentration donnée. La concentration ne s’est pas
révélée être un facteur d’importance puisqu’aucune différence significative n’a pu être
mise en évidence entre l’activité de films construits avec une solution de Défensine à 5,
10, 50, ou 100 µM. L’hypothèse retenue est que l’adsorption de la Défensine sur la couche
anionique répond à une loi de saturation, indépendante de sa concentration initiale en
solution.
En revanche, la multiplication des couches de Défensine à concentration constante
(10 µM) s’est révélée probante. L’insertion de 10 couches de Défensine dans le film s’est
traduite par une inhibition de croissance de presque 99%.
Enfin, afin de mieux comprendre les effets différents obtenus selon la charge finale
du film, nous nous sommes intéressés à l’interface et aux rapports des bactéries avec les
films à ce niveau. Pour cela, deux souches génétiquement modifiées pour exprimer l’une
la protéine fluorescente rouge, l’autre la verte, ont été utilisées afin d’observer en
microscopie confocale leurs rapports avec les films eux-mêmes de fluorescence opposée.
Les films à fin cationique présentent des rapports de contact intimes avec les bactéries
E.coli, tandis que celles-ci restent à distance des films à fin anionique. Ces observations
confirment le rôle prédominant des forces électrostatiques en présence. Des observations
en microscopie à balayage ont permis de préciser cette intimité de contact en montrant une
probable réorganisation du film autour de la bactérie, créant ainsi une « gangue » autour
de la membrane et favorisant l’action des peptides insérés.
Fma
Obser
a b
igure 2-15 (a) Schéma de l’interface bioactive : laximisant ainsi les zones de contact entre les peptidvation en microscopie à balayage de la surface d’u
E. coli. Noter les zones d’insertio
bactérie interagit en s’enfonçant dans le film,es antimicrobiens et la surface membranaire.(b)n film PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-PLL)20 recouvert d’n des bactéries dans le film.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
Ces travaux ont permis de valider le concept d’action antimicrobienne des films en
multicouche de polyélectrolytes fonctionnalisés par un peptide antimicrobien. Le choix du
peptide apparaît capital et dépendant de la protection recherchée. Les multicouches
constituent une forme d’exploitation très intéressante pour les peptides antimicrobiens,
dans la mesure où leur activité est spatialement définie.
[signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]
Multilayer Polyelectrolyte Films Functionalized by Insertion of Defensin: a New
Approach to Protection of Implants from Bacterial Colonization
O. Etienne, C. Picart, C. Taddei, Y. Haikel, J. L. Dimarcq, P. Schaaf, J. C. Voegel, J. A. Ogier,
and C. Egles
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, Vol. 48, n°10, pages 3662-3669
Pages 3662-3669 :
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Applications aux matériaux prothétiques oraux
3Applications aux matériaux prothétiques oraux
Polyelectrolytes multilayered films deposition and stability at the surface of
denture base polymers: an in vitro and in vivo study
Etienne O., Picart C., Taddei C., Keller P., Hubsch E., Schaaf P., Voegel JC., Haikel Y., Ogier J., Egles C.
Article soumis à Journal of Dental Research, en révision
Après avoir validé le concept de protection antimicrobienne par la
fonctionnalisation des films multicouches par un peptide antimicrobien, nous nous
sommes concentrés sur l’application de cette technologie à la protection des prothèses
dentaires vis-à-vis des infections fongiques à C. albicans.
La plupart des expérimentations menées sur les multicouches sont réalisées sur des
substrats lisses et chargés comme le verre, le quartz ou le silicium. Il nous fallait dans un
premier temps, valider la dépose uniforme des films en multicouche de polyélectrolytes
sur des matériaux couramment utilisés dans le matériel médical en général et en prothèse
dentaire en particulier. Le poly(métacrylate) de méthyle et le poly(vinyl-siloxane) ou
silicone ont retenu notre attention. Ces deux matériaux constituent en effet la base de
nombreux matériels implantés définitivement ou temporairement. L’état de surface de ces
matériaux présente divers degrés de polissage selon que la méthodologie de fabrication
soit industrielle ou individualisée. Nous avons par conséquent préparé des échantillons de
Applications aux matériaux prothétiques oraux
différentes compositions de PMMA et de PVS, avec des états de surface polis ou non
polis.
Après avoir analysé la topographie de surface de ces échantillons, nous avons
construit à leur surface des films multicouches PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20 dont les
caractéristiques de taille et d’homogénéité avaient été au préalable étudiées sur des
substrats de verre. L’observation en microscopie confocale de ces films, et
particulièrement leur section en z, nous permet de conclure au dépôt homogène des films
sur toutes les surfaces testées. La hauteur du film sur les surfaces polies est comparable à
celle mesurée sur les surfaces de verre (env. 1µm) sauf pour le PVS sur lequel la hauteur
apparaît doublée (env. 2µm). En revanche, sur les surfaces non polies la hauteur du film
est environ 4 fois celle du contrôle sur verre, et son homogénéité est moins grande.
L’épaisseur du film de polyélectrolyte étant directement liée à son degré d’hydratation,
nous avons étudié la mouillabilité des différentes surfaces, polies ou non, avec ou sans
recouvrement par le film. Dans tous les cas, les échantillons recouverts du film
multicouches présentent une grande mouillabilité caractérisée par un angle de contact très
faible, y compris pour le matériel silicone pourtant hautement hydrophobe à l’origine.
Cette caractéristique hydrophile peut présenter en elle-même un grand intérêt comme
interface de contact avec les muqueuses environnantes notamment pour les prothèses
dentaires.
L’application de ces interfaces doit aussi faire face à la dégradation dans les
fluides corporels. Dans cette optique, nous nous sommes attachés à étudier le
comportement des films de polyélectrolytes dans un environnement oral, in vitro et in
vivo.
Ainsi, dans un deuxième temps, nous avons étudié la dégradation de ces films de
polyélectrolytes en présence de salive naturelle, in vitro. Différentes méthodes d’analyse
ont été utilisées afin de s’adapter au mieux au temps d’observation. Ainsi, pour un délai à
court terme (17h), des mesures en microbalance à cristal de quartz ont permis de suivre le
comportement du film en présence de salive, à 37°C. Sur le délai d’observation aucune
perte de poids n’a été enregistrée, et seul le passage du surfactant de nettoyage permet
d’observer la disparition complète du film. Les observations en microscopie confocale et à
fluorescence ont été faites sur des lamelles de verre recouvertes du film et plongées dans
un bain salivaire renouvelé deux fois par jour et maintenu en permanence à 37°C. Après
48h aucune dégradation n’est observable en surface comme en épaisseur. Enfin,
l’observation à 12 jours confirme le bon état du film en surface.
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Ces résultats démontrent la bonne résistance du film vis-à-vis de la dégradation
chimique qu’auraient pu engendrer la salive et ses composants enzymatiques. Cependant,
les études in vitro souffrent de conditions particulières, liées à un renouvellement très
partiel de la salive contrairement aux conditions réelles in vivo, où ce renouvellement est
permanent. De plus, les variations de pH, courantes en milieu oral, sont difficilement
reproductibles in vitro.
Nous avons donc conçu un modèle d’étude animal, sur le rat wistar. Les difficultés
rencontrées lors des tentatives d’appareillage par plaque palatine avec ancrage dentaire,
nous ont fait opter pour une solution plus facile et plus reproductible, la suture jugale
d’une pastille échantillon.
Figure 2-16 Premier modèle test: la plaque palatine est réalisée sur un modèle en plâtre de la gueule du rat.L’ancrage de la plaque est obtenu par collage orthodontique aux molaires. Ce modèle a été abandonné carpas assez durable dans le temps.
Figure 2-17 Modèle retenu: une pastille ronde est suturée à la face interne de la joue du rat. Cette zone n’estpas soumise aux contraintes masticatoires. La pastille est recouverte du film de polyélectrolytes rendufluorescent par l’addition d’un PLL-FITC en couche finale.
Ce modèle a l’avantage d’être situé dans une zone non soumise à la mastication
directe par les incisives ou les molaires, et présente une face interne (intrados) et une face
externe (extrados) soumises à des contraintes mécaniques très différentes. L’observation
des échantillons recueillis à 4 jours confirme la bonne stabilité des films sur l’intrados,
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tandis que l’extrados apparaît relativement dégradé. Cette dégradation s’explique très
certainement par la gêne occasionnée par la présence de la pastille, qui a dû engendrer des
forces de frottements importantes par la langue. Cette hypothèse est soutenue par la perte
relativement importante du nombre d’échantillons lors de nos études.
Si le nombre d’échantillons examinés (6) peut paraître relativement faible, la
différence de comportement entre intrados et extrados n’en reste pas moins significative.
Le recouvrement de surfaces de PMMA ou de PVS soumises à des contraintes
mécaniques fortes doit faire l’objet de travaux complémentaires afin de renforcer la
cohésion intrinsèque et extrinsèque du film. Cependant, l’application de cette technologie
au recouvrement de l’intrados prothétique qui constitue l’interface impliquée dans la
candidose sous-prothétique est valide. Il reste toutefois à préciser la durée réelle de
dégradation totale du film in vivo.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
Polyelectrolytes multilayered films deposition and stability
at the surface of denture base polymers: an in vitro and in
vivo study
ETIENNE O. 1,2, PICART C.1, TADDEI C.2, KELLER P.1, HUBSCH E.3, SCHAAF P.3,
VOEGEL J.C.1, HAIKEL Y 2, OGIER J.A.1, EGLES C.1*
1. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, 11, rue
Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France
2. Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1, Place de l’hôpital,
67000 Strasbourg, France
3. Institut Charles Sadron, UPR 22 CNRS, 6 rue Boussingault 67083 Strasbourg
Cedex, France
(*) Corresponding author: Phone: 33 (0)3 90 24 33 82; Fax: 33 (0)3 90 24 33 79
Email: [email protected]
Short title: Multilayered films at dental polymers surface
Keywords: Surface treatment, Polyelectrolyte multilayer film, Denture base
polymer, Coating
Applications aux matériaux prothétiques oraux
Abstract
The surface of dental materials is a common site of bacterial adhesion; therefore
many surface modifications have been developed to modify the physical or biological
properties of this interface. A new approach of surface coating involving the layer-by-
layer technique has been recently developed with many potential
biofunctionalizations. Here, we investigate the compatibility of such a technique to
dental-linked applications, by testing the construction and coating of polyelectrolyte
multilayer films on denture base polymers. We demonstrate that the multilayered
films coat the whole material surface and increase the wettability of these surfaces.
Stability of these structures is tested in vitro, in saliva, and in vivo in a rat model.
Saliva does not affect the film, only a strong mechanical action involves a partial
degradation.
Taken together, our results establish that the multilayered film technique is of
interests for oral bio-application.
Introduction
Poly(methacrylate) (PMA), poly(methyl-methacrylate) (PMMA) and
poly(vinylpolysiloxane) (PVS) polymers are widely used in oral prosthesis. However,
these materials are known to be quickly colonized by a bacterial and fungal biofilm
(Radford et al., 1999) which may result in local host inflammations, stomatitis,
periodontitis and caries (Nikawa et al., 1998). Adhesion of micro-organisms at the
surface of biomaterials is the initial step of biofilm formation and depends on a variety
of physical properties such as roughness, hydrophobicity or surface free-energy
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(Satou et al., 1991; Bollen et al., 1997; Radford et al., 1998), but also on the nature of
the pellicle that covers the material (Edgerton and Levine, 1992; Gocke et al., 2002).
Various techniques have been used to decrease bacterial adhesion on polymer
surfaces (Jansen and Kohnen, 1995; Park et al., 1998; Monsenego, 2000) or to
confer them antimicrobial properties (Bapna et al., 1988; Othman et al., 2002).
The build-up of polyelectrolyte multilayer (PEM) films (Decher, 1997) offers new
challenging opportunities for the preparation of bioactive biomaterial surfaces. This
method is based on alternate deposition of oppositely charged polyelectrolyte layers
(Figure 1A). The driving force for the construction is the charge excess (alternatively
positive and negative) which appears after each new polyelectrolyte deposition. The
number of cycles, the type of polyelectrolyte and the biophysical characteristics
modulate the thickness and roughness of the multilayered film. This approach allows
the preparation of supramolecular nanoarchitectures exhibiting specific properties in
terms of thickness or roughness of the film.
The purpose of this work was to study the possible application of the PEM film
technique to the dental prosthodontic field. We used environmental scanning electron
microscopy to analyze the surface of three dental polymers with or without polishing
treatment, and we observed the coating of such surfaces by PEM films using lateral
reconstruction by confocal scanning laser microscopy. We then investigated the
biostability of these PEM films: (i) using fluorescent and confocal microscopy and
using quartz crystal microbalance in vitro in natural saliva up to 7 days; (ii) using
confocal microscopy in vivo 4 days after implantation in wistar rat’s oral cavity.
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Materials and Methods
Polymer specimen discs preparation
Specimen discs (1 mm thickness x 12 mm diameter for in vitro study; 1 mm x 3 mm
for in vivo study) were prepared with: heat-cured poly(methylmethacrylate) (PMMA)
(IVOCAP, IVOCLAR, Liechtenstein), cold-cured poly(dimethacrylate) (PDM) modified
by glass particles and bead polymerates (UFI gel hard C, VOCO GmbH, Germany),
and poly(vinylpolysiloxane) (PVS) (UFI gel SC, VOCO GmbH, Germany). All
specimen discs were prepared according to the manufacturer’s instructions. Half of
the specimen discs were polished.
Multilayer preparation
Poly(ethylene-imine) (PEI; MW 750 kDa), poly(sodium 4-styrene sulfonate) (PSS;
MW 70 kDa), poly(allylamine hydrochloride) (PAH; MW 70 kDa) from Aldrich, poly(L-
glutamic acid) (PGA; MW 54.8 kDa) and Poly(L-lysine) (PLL; MW 23.4 kDa) from
Sigma were used to build the films. All solutions were prepared at 1 mg/mL in a
0.15M NaCl solution (pH 6.5). For all experiments, a precursor film of PEI-(PSS-
PAH)2 (noted Pre) was build in order to cover the surface of the substrate. Sequence
was followed with (PGA-PLL) bilayers (noted Pre-(PGA-PLL)n), n varying between 11
and 20, depending on the analysis method.
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Wettability measurements
The contact angle analyses were carried out in a contact angle meter face (CA-S-
150, Kyowa Kaimenkagaku) following an already described protocol (Bigelow et al.,
1946; Neumann and Good, 1979). The functionalized films were dried under nitrogen
flow before being brought in contact with a drop (Millipore MilliQ water) of 1.52mm
height and 1mm diameter. The angle was determined by the relation
∗=θ
rharctan2
with h corresponding to the height and r to the radius of the contact area of the drop
on the sample. For each sample, the mean value of three measurements was taken.
Quartz crystal microbalance (QCM)
Measurements were performed using the QCM system from Q-Sense (Götenborg,
Sweden) according to the procedure presented in (Picart et al., 2001). A decrease in
∆f/ν is usually associated, in a first approximation, to an increase of the mass
coupled to the quartz. The crystal used here is coated with a ≈ 100 nm thick SiO2
film. Polyelectrolytes were injected into the measurement cell during 5 min and rinsed
during 5 min with a 0.15M NaCl solution. During these steps, the shifts in ∆f were
continuously recorded. At the end, a surfactant (Hellmanex II, HELLMA GmbH,
Germany) was injected to clean the crystal.
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)
PLL conjugated to FITC (PLL-FITC, MW 50 KDa, Sigma) was used to image the dye
labeled film in the green channel. The specimen discs were introduced in a home
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made chamber and observed by imaging series of consecutive overlapping optical
sections using a Zeiss LSM510 Confocal microscope. The mean thickness (±
standard deviation) of the film was determined from 80 different measurements of the
width of the green band along a computed orthogonal vertical section through the
imaged volume (Picart et al., 2002). In order to fully appreciate PEM films by CLSM,
a minimum of 20 bilayers was needed.
Environmental scanning electron microscopy (ESEM)
Specimen discs were viewed in an environmental mode with a Philips XL30 ESEM
(FEI Company) equipped with a lanthanum hexaboride (LaB6) electron gun and a
gaseous secondary electron detector.
Stability studies
Saliva used for in vitro studies was obtained after stimulation by paraffin chewing and
used immediately at 37°C. For long-time observations saliva was changed every 12
hours. In vivo studies were conducted on 6 wistar rats. All studies were conducted
following the highest principles of animal welfare.
Results
Polyelectrolytes multilayered films build-up
The build-up of the architecture was followed step-by-step, after each new
polyelectrolyte injection, by QCM (Figure 1B). Pre-(PGA/PLL)9 film build-up showed
an exponential growth similar to that observed with PLL/hyaluronan films (Picart et
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al., 2002). This exponential growth regime has been explained by the PLL diffusion in
and out of the film during the build-up steps. The film thickness, followed by optical
waveguide lightmode spectroscopy, is also directly correlated to the number of layers
with the same exponential growth (data not shown). For a Pre-(PGA/PLL)20-
PGA/PLLFITC structure built on glass surface, the film thickness is around 1µm as
observed by CLSM (Figure 1C).
Figure 1: Construction and characterization of the PEM films.(A) The buildup and structure of PEM films are based on the alternate deposition andarranging of polyanions (grey) and polycations (black).(B) Build-up of a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)9 multilayer film as detected by QCM. Global increase in theadsorbed mass is shown by the exponential increase of frequency shift (∆f at15Hz,ν=3). (C) Vertical section obtained by CSLM observation through a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC film built up on a glass substrate. The film thickness isabout 1 µm.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
Film construction on polymer surfaces
In order to analyze the topological differences between all the specimen discs, we
observed them by ESEM. Environmental mode enabled direct observations without
any of the surface treatment needed for SEM. PMMA (Fig. 2A) and PDM (Fig. 2C)
specimen discs showed a relatively smooth surface when compared to PVS (Fig.
2E). For all specimens, the effect of polishing was noticeable: PMMA specimens
presented a very homogeneous surface (Fig. 2B) whereas PDM surfaces were
heterogeneous with glass particles and bead polymerates (Fig. 2D); roughness of
PVS surfaces, while decreased, was still visually important (Fig. 2F).
Figure 2: ESEM observations of different polymer surfaces (scale bars: 50µm, inlays10µm): heat-cured poly(methylmethacrylate) (A, B), cold-cured poly(dimethacrylate)modified by glass particles and bead polymerates (C, D), poly(vinylpolysiloxane) (E,F). All the polymers have been used non-polished (A, C, E) or polished (B, D, F).PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC films were built-up on the differentsamples and observed by CSLM. Vertical sections of the film on non-polished (A’, C’,E’) or polished samples (B’, D’, F’).
Applications aux matériaux prothétiques oraux
All specimen were coated with a Pre-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC. Analysis of the Z-
sections showed a total coating on each surface, with high variations in the thickness,
especially for non-polished specimen and more particularly for PVS (as expressed by
a high standard error of the means). Polished surfaces showed a more
homogeneous film deposition (Figures 2B’, 2D’, 2F’) not influenced by the polymer
composition, with a mean thickness of 0.83 ±0.01 µm, 1.49 ±0.20 µm, 2.11 ±0.47 µm
respectively for PMMA, PDMA and PVS. Non-polished specimens showed a less
homogeneous coating, with aggregates (Figures 2A’, 2C’, 2E’) and a mean thickness
of 4.03 ±0.29 µm, 4.07 ±0.70 µm, 4.67 ±1.66 µm respectively for PMMA, PDMA and
PVS.
All samples covered with PEM films exhibited a modification in their wettability,
essentially characterized by a higher hydrophilic property as assessed by contact
angles measurements. In all conditions the contact angle was at least reduced by 5
times between the bare and the PEM coated material. Respectively: for polished
PMMA: bare θ=72.5±2, PEM coated θ=6.1±1; non polished, bare θ=100.8±2, PEM
coated θ=10.5±1; for polished PDMA: bare θ=71.9±2, PEM coated θ=9.1±1; non
polished, bare θ=95.3±2, PEM coated θ=7±1; for polished PVS: bare θ=113±2, PEM
coated θ= 24.6±1; non polished, bare θ=109.3±3, PEM coated θ=7.6±1.
Stability of the films in saliva
PEM films were observed after incubation in saliva at 37°C. QCM measurements
showed no alteration of Pre-(PGA-PLL)6 film up to 17 hours, whereas surfactant’s
injection completely removed it (Figure 3A). Stability of Pre-(PGA-PLL)20-PGA-
PLLFITC film was also assessed using confocal microscopy: no changes in thickness
between the control film dipped in NaCl 0.15M (1.24±0.37µm ) and the film in saliva
Applications aux matériaux prothétiques oraux
(1.28±0.46µm) were observed after 48h (Figure 3B, 3C). Fluorescence microscopy
was used to follow the stability up to 7days (Figure 3D, 3E) and confirmed the
integrity of the film in saliva at 7 days.
Figure 3: Stability of the PEM films in saliva. (A) Measurements performed using theQCM system shows no changes in -∆f/ν associated to a decrease of the masscoupled to the quartz during 1000 min (16 h and 40 min), the injection of a surfactant(Hellmanex) in the chamber totally removes the film in seconds. (B,C). CSLM verticalsections through a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC film, after 48 hours inNaCl 0.15M (B) or in saliva (C). (D,E) Top view of a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC observed by fluorescent microscopy before (D) and after 7 days insaliva (E). Films were scratched to follow their integrity.
In vivo observations
Specimen discs were coated with a Pre-(PGA/PLL)20-PGA-PLLFITC film using a
dipping automate (DR3, Kirstein GmbH, Germany) to ensure a whole coating (Figure
4A) and sutured to the rat’s cheek (Figure 4B). This location was chosen to avoid
Applications aux matériaux prothétiques oraux
interferences with teeth and to ensure a strong tongue mechanical action. After 4
days, the discs were retrieved and observed by CLSM. Cheek side surface, only
exposed to saliva, showed almost no degradation (Figure 4C) while tongue side
surface showed large free spaces but were, however, not totally degraded (Figure
4D).
Figure 4: In vivo experiments in rat oral cavity. PMMA discs are coated on theirwhole surface with PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA-PLLFITC film using a dippingautomate (A) and sutured to the rat’s cheek (B). (C,D) Top view observation byCSLM of surfaces of the polymer after 4 days in the rat mouth. PEM film is stillentirely covering the disc on its cheek side (C) while only fragments are detectable onthe lingual side (D). Each area is 115X115 µm.
Discussion
The aim of this study was to investigate the possible use of a new type of surface
coating, based on PEM films, onto dental polymers. This technique has been
described as able to cover, theoretically, all kind of surfaces, as soon as these
surfaces are or can be charged (Decher, 1997). Various applications have been
Applications aux matériaux prothétiques oraux
considered, covering large domains, from food to medical industries. Although, to our
knowledge, there are no studies to date devoted to dental polymers using PEM films.
Dental applications have to face two major problems: the specific environment of the
oral cavity in which materials are in constant contact with saliva, containing, among
many other components, specific enzymes such as lysozymes or amylases.
Furthermore, the low and changing pH of the mouth could be a serious destabilizing
factor for the integrity of the multilayered films. According to our results, PGA-PLL
multilayered films are resistant to saliva environment and only mechanical abrasion
seems able to alter the film. To overcome this mechanical degradation, two
approaches could be considered: one would be a polyelectrolyte chemical cross-
linking, changing physical to covalent bonds between polyelectrolytes. Using this
approach, (Engler et al., 2004) have shown a 10 times increase in the elastic
modulus, leading to a more rigid film. Another approach would be to increase the
interactions between the film and the material, either by increasing the electrostatic
surface charge with copolymerization of methacrylic acid to methyl methacrylate
(Park et al., 2003), or creating covalent interactions by chemical grafting.
The second problem is the complex topography of such surfaces when compared to
glass or industrial metal surfaces. The roughness and the non-homogeneous
character of such surfaces could also lead to an incomplete build-up. Our results
establish that these films can be successfully used in the oral cavity, as the coating of
polymer surfaces was achieved and no chemical degradation was observed.
Moreover, the high initial hydrophobicity of PVS did not seem to affect the deposition.
Indeed not only for PVS, but also for PMA and PMMA, the covering of the polymer
Applications aux matériaux prothétiques oraux
surface by multilayer films was strongly increasing the wettability of the material. The
PEM would therefore add a superior lubricating layer between the material and the
supporting tissues, reducing physical frictions and patient discomfort.
More than surface modifications the PEM films technique make many potential dental
applications conceivable. Anti-microbial protection of oral polymer surfaces is one of
the most promising. Simple chemical modifications by grafting poly(ethylene glycol)
directly on the polyelectrolytes have been shown to increase the anti-adhesive
properties of these films on glass surfaces (Boulmedais et al., 2004). Another
biofunctionalizing approach is to confer specific biological properties to multilayered
films by integrating antimicrobial proteins directly in the film (Etienne et al., Accepted
for publication # 164-04 164-04 #33).
PEM films seem therefore an extremely promising method to achieve active coatings
of great interest for biomaterials in general and especially dental polymers as a
possible prevention of oral infections.
Acknowledgements
The authors thank Jerome Mutterer (IBMP, Strasbourg) for the access to the CSLM,
and J.H. Lignot for the SEM.
Applications aux matériaux prothétiques oraux
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Films de polysaccharides dégradables
4Films de polysaccharides dégradables
Degradability of polysaccharides multilayer films in oral environment: an
in vitro and in vivo studyOlivier Etienne, Aurore Schneider, Corinne Taddei, Pierre Schaaf, Jean-Claude Voegel, Christophe Egles,
Catherine Picart
Article soumis à Biomacromolecules, accepté
La stabilité des films de polyélectrolytes PGA-PLL dans l’environnement oral
(article 3) et le maintien in situ du peptide inséré dans le film (article 2) ne nous
permettaient pas d’envisager un contrôle dans le temps du relargage peptidique. Nous
nous sommes intéressés alors à d’autres types de films élaborés à base de constituants
naturels, biocompatibles et biodégradables : le chitosan et l’acide hyaluronique.
Le chitosan est dérivé de la chitine, qui est un produit naturel extrait de carapaces
de crustacés ou de plumes de calmars. La chitine est constituée d'une chaîne linéaire de
groupes acétylglucosamine. Le chitosan est obtenu en enlevant suffisamment de groupes
acétyl (CH3-CO) pour permettre à la molécule d'être soluble dans la plupart des acides
dilués. Cette opération, appelée déacétylation libère les groupes amine (NH) et confère au
chitosan une nature "cationique".
L’acide hyaluronique, ou hyaluronane, appartient au groupe des
glycosaminoglycanes qui forment de grandes chaînes de polysaccharides. Il contient
jusqu’à 25 000 molécules de disaccharides identiques. Cette molécule volumineuse est un
Films de polysaccharides dégradables
des constituants les plus importants de la matrice extracellulaire qui joue un rôle important
dans beaucoup de tissus, mais surtout dans le tissu conjonctif. Grâce à sa très grande
capacité de rétention d’eau, il forme, même à de faibles concentrations, des gels très
volumineux et viscoélastiques.
Ces deux constituants sont des polysaccharides déjà utilisés dans le domaine
dentaire sous forme de gel : le premier pour ses propriétés anti-microbiennes (Sano,
Shinasaki et al. 2001; Ikinci, Senel et al. 2002) et le second pour lutter contre les états
inflammatoires (Moseley, Waddington et al. 2002; Jentsch, Pomowski et al. 2003).
La construction de ces films a été caractérisée préalablement à l’étude de leur
dégradabilité in vitro puis in vivo. Enfin, la réticulation de ces films, et son influence sur le
temps de dégradation, ont été évaluées dans l’optique de déterminer un système de
relargage contrôlé.
Les films ont montré qu’ils s’auto-assemblaient selon une croissance de type
exponentielle, et une épaisseur de 6µm a été mesurée en microscopie confocale pour un
film de 24 bicouches (CHI/HA)24-CHIFITC. Ces films sont par conséquent plus hydratés
que les films de polyélectrolytes (PGA/PLL) avec lesquels nous avions travaillé jusque là.
Leur réticulation a été réalisée par les Dr L. Richert et C. Picart, selon un procédé de
réticulation chimique en présence d’EDC/sulfo-NHS. Celle-ci a été suivie en
spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et a permis de confirmer la
formation de liaisons amides et esters entre le chitosan et l’acide hyaluronique.
Dans un deuxième temps, la stabilité des films a été évaluée in vitro, à la fois en
présence d’enzymes spécifiques à la cavité orale (lysozyme, alpha-amylase) et en
présence de salive naturelle. Les films non réticulés présentent rapidement une
dégradation, avec des aspects toutefois différents selon l’enzyme. En revanche, les films
réticulés semblent résister à la dégradation enzymatique.
Les observations en microbalance à cristal de quartz et en microscopie confocale
confirment ces résultats en présence de salive naturelle. La dégradation des films non
réticulés est lente et progressive durant les 5 premières heures, puis s’accélère ensuite
jusqu’à la disparition quasi-totale du film en 10 heures. Les observations en microscopie
confocale mettent en évidence une dégradation évoluant de la superficie vers la
profondeur, ce qui laisse envisager des perspectives pharmacodynamiques intéressantes
Films de polysaccharides dégradables
car contrôlées par la profondeur de l’enfouissement du peptide à relarguer. Les films
réticulés, sur la même période, n’ont pas présenté de dégradation notable.
Ces observations in vitro ont été complétées par des études in vivo, sur le modèle
de la pastille jugale chez le rat wistar (article 3). A nouveau, le contraste entre la face
jugale et la face linguale a pu être observé, confirmant le rôle de l’action mécanique
d’auto-nettoyage de la langue. Cependant, les résultats concernant l’effet de la réticulation
sur la stabilité du film se sont avérés concluants. En effet, après 6 heures, il ne reste plus
que 12% de surface recouverte sur les faces jugales des pastilles à films non réticulés,
contre 80% dans le cas des films réticulés. Après 3 jours, le film non réticulé a disparu de
la surface jugale tandis qu’il persiste plus de 60% des films réticulés.
Ces films à base de polysaccharides (CHI/HA) constituent une alternative très
intéressante aux films de polyélectrolytes (PGA/PLL) dans la mesure où leur dégradation
est totale, et surtout contrôlable, dans l’environnement salivaire.
Films de polysaccharides dégradables
Degradability of polysaccharides multilayer films in oral environment: an
in vitro and in vivo study
Olivier Etienne1,2, Aurore Schneider1, Corinne Taddei2, Ludovic Richert1, Pierre Schaaf3,
Jean-Claude Voegel1, Christophe Egles1, Catherine Picart 1*
1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, Université Louis
Pasteur, Faculté de Chirurgie Dentaire, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France
2Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1 Place de l’Hôpital, 67000
Strasbourg
3Institut Charles Sadron, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Louis
Pasteur, 6 rue Boussingault, 67083 Strasbourg Cedex, France
AUTHOR EMAIL ADDRESS : [email protected]
TITLE RUNNING HEAD : Degradability of polysaccharide multilayer films in oral
environment.
CORRESPONDING AUTHOR FOOTNOTE. Catherine Picart, INSERM U595, Faculté
de Médecine, Bât 3, 11 rue Humann, 67 085 Strasbourg cedex, France. Tel : 33-3-90-24-32-
58 ; Fax : 33-3-90-24-33-79.
ABSTRACT.
Films de polysaccharides dégradables
Biomedical devices and modified biomaterial surfaces constitute an expanding research
domain in the dental field. However, such oral applications have to face a very particular
environment with specific physiological conditions and specific enzymes. To evaluate
whether polyelectrolyte multilayer films coating could be useful to develop new types of oral
applications, the degradability of polyelectrolyte multilayer films made of chitosan and
hyaluronan (CHI/HA), which are natural polysaccharides, was investigated in vitro,
mimicking an oral environment, and in vivo in a rat mouth model. The films were either
native or cross-linked using a water soluble carbodiimide (EDC) in combination with N-
hydroxysulfosuccinimide. The in vitro degradation of the films in contact with different
enzymes present in the oral environment, such as lysozyme and amylase, was followed by
quartz crystal microbalance measurements and confocal laser scanning microscopy
observations after film labeling with CHIFITC. Whereas the native films were subjected to
degradation by all the enzymes, the cross-linked films were more resistant to enzymatic
degradation. The films were also put in contact with whole saliva, which induced a slow
degradation of the native films over an 18 h period. The in vivo degradation of the films
deposited on polymer discs and sutured in the rat mouth was followed on a 3 days period.
Whereas film degradation is fast for the native films, it is much slower for the cross-linked
ones. More than 60% of these films remained on the discs after a 3 days presence in the
mouth. Taken together, these results suggest that the multilayer films made of natural
polysaccharides are of high potential interest for oral applications, especially as drug release
system, offering various degradation and therefore releasing times.
KEYWORDS. Polyelectrolyte multilayers, polysaccharides, cross-linking, saliva, lysozyme,
amylase, degradability, in vivo, dental implant, oral bio-applications.
Films de polysaccharides dégradables
INTRODUCTION
Polyelectrolyte multilayer (PEM) coatings have become a new and general way to
functionnalize surfaces and their applications range from optical devices to biomaterial
coatings 1,2. The technique is based on the alternate deposition of polyanions and
polycations3,4. Film functionnalization can be achieved by incorporating particles 5 or
bioactive molecules into the architecture 6,7. Various types of films can be prepared using
synthetic polyelectrolytes, such as poly(styrene sulfonate) (PSS) or poly(allylamine
hydrochloride) 3,8synthetic polypeptides, such as poly(L-lysine) (PLL) and poly(L-glutamic)
acid (PGA) 9,10, or even natural polyelectrolytes, such as dextran, alginate, heparin,
hyaluronan and chitosan 11-13. This last type of films, being biocompatible, non toxic, and
biodegradable, is rapidly expanding due to great potential applications : preparation of
biomimetic films11,14; of drug release vehicles13,15; of bioactive coatings either by drug
incorporation or by the use of the intrinsic properties of the polyelectrolytes16,17, or build-up
of cell adhesive or non-adhesive films 11,18.
Despite the incorporation of precise functionalities into PEM films, only few examples of
functional multilayer assemblies designed to release incorporated materials have been
described 19,20. This can be achieved by gradually decomposing the film. Most of these
decomposable assemblies concern synthetic polyelectrolytes and the release mechanisms rely
on physico-chemical film properties. Usually, the dissolution of PEM films is a consequence
of a change in environmental pH, for instance for hydrogen bonded multilayers 20 or a change
in ionic strength19,21. Dubas and Schlenoff 21and Schüler and Caruso 19 have demonstrated that
salt induced dissolution can occur in high salt containing solutions. However, the transitions
from stability to dissolution are very rapid and neither does it seem possible to control either
the degradation rate or such decomposition in physiological conditions. Recently, Vazquez et
al. 22 used a hydrolytically degradable polyelectrolyte, poly(β-amino-ester) in combination
Films de polysaccharides dégradables
with poly(styrene sulfonate) (PSS) to build a degradable film in aqueous environment. In
these experiments, the film was degraded within about a day.
An alternative way to create biodegradable films for biomedical applications is to make use
of the intrinsic properties of natural polyelectrolytes and of the potential presence in vivo of
different enzymes in the biological fluids. For instance, all the natural polyelectrolytes and
proteins present in tissues and fluids can be cleaved by specific enzymes : this is the case for
collagen by collagenase, for hyaluronan by hyaluronidase23, for chitosan by chitosanase and
other enzymes…Serizawa et al. started to explore such possibilities by investigating, by
quartz crystal microbalance, the degradation of chitosan/dextran sulfate films in the presence
of chitosanase24. They found a more rapid hydrolysis when dextran sulfate constitute the
outermost layer of the film, which occurred only at 40°C. These authors also evidenced that
DNase can hydrolyze DNA/poly(diallyl dimethylammonium chloride) films in a controlled
manner provided that the concentration of both Mg2+ and Ca2+ ions in the medium is
adjusted25. In an attempt to mimic the in vivo behavior, one also has to consider the nature of
the enzymes present in vivo, which will largely depend on the nature of the fluid in contact
with the coated material in its specific location. In the oral environment, biomaterials will be
in contact with saliva, which contains many proteins and enzymes such as lysozymes and α-
amylase26. The polyelectrolyte multilayer films can be used for many potential oral bio-
applications such as antimicrobial protection27,28, or anti-inflammatory protection 29. All the
biomedical applications are mainly linked to two factors, the biocompatibility of the
multilayer films and the stability of the films in vivo, especially for a controlled release of a
peptide or a molecule. The biocompatibility of various polyelectrolyte multilayers made of
polysaccharides and polypeptides has already been evaluated 7,17.
In the present work, we investigate the degradability properties of chitosan/hyaluronan
(CHI/HA) films in vitro and in vivo in oral environment over several days. Chitosan is
Films de polysaccharides dégradables
obtained after N-deacetylation of chitin by alkaline treatment (Figure 1), chitin being the
second most abundant naturally occurring polysaccharide 30. It is found in crustacea shells and
insects and is also synthesized by some unicellular organisms. Hyaluronan (HA) (Figure 1) is
a highly hydrated polysaccharide of great biological interest 31. It possesses lubricating
functions in the cartilage, participates in the control of tissue hydration, water transport, and in
the inflammatory response after a trauma. It is widely used in cosmetic formulation and seems
promising in tissue engineering applications 32,33. These two polysaccharides are
biocompatible, non-toxic and biodegradable by enzymatic hydrolysis with chitosanase 24, α-
amylase 26, lysozyme, and hyaluronidase 34. Both have already been widely used in
biomedical applications and have interesting intrinsic properties 35. Chitosan in solution or as
hydrogel are particularly used in pharmaceutical drug formulations, in sustained release of
water-soluble drugs 30,36 and also exhibit anti-bacterial and anti-microbial activity 37,38. Tissue
engineering based on chitosan and hyaluronan hydrogels seems also promising 39,40. Chitosan
and hyaluronan can be easily chemically modified 41-43 and bounded to various molecules
such as cell-targeted prodrugs44, carbohydrates 45, which could be released upon film
hydrolysis.
O
--
--
OH
- OH
COOH
-
OO
--
--
OH
- NHCOCH3
CH2OH
O-
BNnAnio
Films de polysaccharides dégradables
FIGURE 1. Molecular structures of the hyaluronan (A) and chitosan (B) repeating units.
DA is the degree of acetylation of chitosan.
Chitosan and hyaluronan have already been used for oral applications as hydrogel or
membranes 37,46. Recently, we showed also that these polysaccharides can form PEM films in
acidic conditions in the presence of 0.15 M NaCl. As the film growth is exponential, film
morphology and thickness can be estimated by confocal laser scanning microscopy using
fluorescently labeled chitosan. The activity of the whole saliva, as well as specifically
lysozyme and α-amylase enzymatic activity on these films will be more precisely
investigated. Lysozyme (14 kDa) is able to hydrolyze chitin and chitosan 47. Alpha-amylase
(45-60 kDa) is an abundant salivary enzyme that catalyzes the hydrolysis of α(1,4) glycosidic
bindings between glucose residues of polysaccharides. Amylase has already been found to
hydrolyze chitosan in solution 47. For our in vivo experiments, the films were deposited on
polymer discs and sutured in oral cavities of rats. Film cross-linking was performed using a
water soluble carbodiimide 48 in order to investigate the possible relations between physico-
chemical properties of the film and modifications in its biodegradability.
Materials and Methods
Polyelectrolyte and enzyme solutions. HA (sodium hyaluronate, 4x105 g/mol), was
purchased from Bioiberica (Spain). HA is a polyanionic macromolecule with a pKa ≈ 2.9 32
and with a negative charge at pH = 4.5. It has a low charge density since only one residue
from two is charged 49. CHI (chitosan, oligo-saccharide of low molecular weight, LMW =
5x103 g/mol) was purchased from Medipol (Switzerland). According to the manufacturer, the
degree of acetylation (DA) given is below 20%. CHI is a weak base, a positively charged
polyelectrolyte in acidic condition with a pKa ≈ 6 49,50. Sodium dodecyl sulfate (SDS) was
Films de polysaccharides dégradables
purchased from Sigma and sodium chloride (purity 99.5%) was obtained from Fluka (St
Quentin Fallavier, France). All solutions were prepared using ultrapure water (Milli Q-plus
system, Millipore) with a resistivity of 18.2 MΩ.cm. Fresh polyelectrolyte solutions at 1
mg/mL were always prepared by dissolution of the respective adequate polymer amounts in
filtered saline solutions. CHI and HA were dissolved at 1 mg/mL in 0.15 M NaCl in water and
were gently stirred overnight. The pH of the polyelectrolyte solutions was adjusted to 4.5 with
0.1M acetic acid. For both polyelectrolytes, taking into account their molecular weight, the
concentration were below the critical concentration c*51,52. (CHI/HA)i architectures were
built with i number of deposited layer pairs. Fluorescently labeled chitosan (CHIFITC) was
prepared according to a published protocol 11.
Lysozyme (L6876, Sigma) and α-amylase (A4551, Sigma) were prepared in the NaCl
solution at pH 5 at 1 mg/mL and 500U/mL respectively. Natural saliva was obtained after
stimulation by paraffin chewing and used immediately at 37°C. For long-term observations,
saliva was changed every 12 hours.
Automatic buildup of the polyelectrolyte multilayered films. For confocal microscopy,
fluorimetry and in vivo experiments, (CHI/HA)i films were prepared with an automatic
dipping machine (Dipping Robot DR3, Kirstein and Riegler GmbH, Germany) on 12 mm
glass slides (VWR Scientific, France) preliminarily cleaned with 10 mM SDS and 0.1 N HCl
and extensively rinsed. The glass slides were introduced vertically in a home made holder
which was dipped for 15 min. into a first polyelectrolyte solution (CHI, 12 mL) and
subsequently rinsed in 3 different beakers containing the 0.15 M NaCl solution at pH = 4.5.
The slides were dipped in the first rinsing beaker (350 mL) and once for 150 s in the two other
rinsing beakers (40 mL each). The slides were then dipped into the oppositely charged
polyelectrolyte solution (HA, 12 mL) followed by the same rinsing procedure. The robot was
Films de polysaccharides dégradables
programmed to move to fresh rinsing solutions after each deposition of six layers. Slides were
then stored at 4°C until use in 24-well culture plates.
Film cross-linking procedure and characterization by Fourier Transformed Infrared
Spectroscopy. For the chemical cross-linking of the films, a previously published protocol
that was applied on (PLL/HA)i films 48 was followed. It is based on the reaction of activated
carboxylic sites with primary amine groups 53 in the presence of a water soluble carbodiimide,
1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl)Carbodiimide (EDC) and of N-Hydrosulfosuccinimide
(sulfo-NHS) (both purchased from Sigma). Briefly, EDC and sulfo-NHS were purchased from
Sigma and prepared at 400 mM and 100 mM respectively in a 0.15 M NaCl solution at pH
4.5. 1 mL of the mixed EDC/Sulfo-NHS solution (v/v) was deposited in the wells containing
the (CHI/HA)24–CHIFITC coated glass slides or in the Eppendorf tubes containing the polymer
discs and left for 12 hours at 4°C.
For film cross-linking characterization, (CHI/HA)9 films deposited on a ZnSe crystal were
investigated by in situ Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy in Attenuated Total
Reflection (ATR) mode with an Equinox 55 spectrophotometer (Bruker, Wissembourg,
France). All the experimental details have been given previously 54. The experiments were
performed in deuterated 0.15 M NaCl solution at pH ≈ 4.5. The parameters and configuration
used for the acquisition during the cross-linking reaction have already been detailed 48. The
films were cross-linked with the EDC/NHS solution and spectra were acquired before and
after cross-linking.
Film degradation analysis by quartz crystal microbalance (QCM).
The (CHI/HA)i film build-up process and its subsequent degradation by enzymes and by
saliva were followed by in situ quartz crystal microbalance (QCM-Dissipation, Qsense,
Sweden) 55,56The quartz crystal is excited at its fundamental frequency (about 5 MHz) as well
Films de polysaccharides dégradables
as at the third, fifth and seventh overtones (corresponding respectively to 15, 25 and 35 MHz).
Changes in the resonance frequencies δf and in the relaxation of the vibration once the
excitation is stopped are measured at the four frequencies. The apparatus gives also access to
the dissipation D of the vibrational energy stored in the resonator. From those parameters, the
film thickness can be determined using the model developed by Voinova et al. 57. (CHI/HA)6
films were built at 25°C by successive injections of 500 µL of the polyelectrolyte solutions in
the measuring cell (12 min adsorption for each layer) and a subsequent rinsing with 500 µL of
the NaCl solution (injected in about 10 seconds). This number of layer pairs was chosen to
ensure that at least two frequencies/dissipations (5 and 15 MHz) could be acquired during the
whole experiment. After film build-up, the temperature was raised to 37°C in 2°C steps in
about 2 hours and 1 mL of the enzyme or saliva solutions was injected and left at rest
overnight at 37°C.
Film degradation observations by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).
For the CLSM experiments, the film coated glass slides were prepared with the dipping
robot. CHIFITC was adsorbed as the ending layer. As an example, (CHI/HA)24-CHIFITC
corresponds to a film composed of 24 pair of layers on top of which a final CHIFITC layer has
been deposited. The configuration of the microscope and the parameters used for the CLSM
observations on a Zeiss LSM510 microscope have been given elsewhere 58. 1 mL of the
enzyme solution or of saliva was deposited on the film coated glass slides (introduced in a 24-
well culture plate) and kept in an incubator at 37°C for a given period of time (from three
hours to 24 hours). For the observations, the 12 mm glass slides were introduced in a home-
made chamber and observed by imaging series of consecutive overlapping optical sections (x-
y images at different depth z). Orthogonal vertical sections were computed in order to image a
(x-z) section of the film.
Films de polysaccharides dégradables
In vivo studies in rat mouth
In vivo studies were conducted on 8 male Wistar rats following the principles of animal
welfare. Sixteen heat-cured poly(methyl-methacrylate) (PMMA) discs, 1 mm thick x 3 mm
diameter (Probase®, Ivoclar, Lichtenstein), were prepared as buttons with 2 holes at their
center to facilitate the suture. The discs were divided in two groups: eight discs were covered
with a native (CHI/HA)24 film and eight discs were covered with a cross-linked (CHI/HA)24
film using the automatic dipping machine (DR3, Kirstein GmbH, Germany). In order to
obtain a well-coated surface, a precursor film composed of poly(ethylene imine) (PEI),
poly(styrene sulfonate) (PSS), and poly(allylamine hydrochloride) (PAH), ie PEI-(PSS/PAH)-
PSS was first deposited on the polymer discs. For each animal, one disc was fixed with a
polyglactine 910 suture (3/0 VICRYL®, ETHICON, Johnson & Johnson Intl, Belgium) to the
cheek, between the molars and the incisors zone to prevent any risk of extraction by teeth. Six
out of the 16 discs were not recovered, which indicates that there was a strong tongue activity
around them. Ten discs were recovered: six discs after 6 hours (three of each group), two
discs after 48 hours (one of each group), and two discs after 72 hours (one of each group). All
discs were stored in a 0.15M NaCl solution and viewed under epifluorescent illumination
(excitation filter, 480/40 nm; dichroic filter, 505 nm; and emission filter, 510 nm) with a
Leica MZFLIII stereomicroscope and also by confocal laser scanning microscopy. The stereo
microscope images were analyzed by Image J software (NIH, Bethesda) to determine the film
area remaining on the disc, which was divided by the total disc area (the result being
explained in percentage).
Films de polysaccharides dégradables
Results and discussion
Film characterization and cross-linking
As (CHI/HA) film growth is exponential (Figure 2A), film thickness rapidly reaches several
micrometers for film containing a few tens of layers. The mean thickness (+ SE) of a
(CHI/HA)6 film was estimated at 175 nm + 18 nm by QCM (mean of three independent
experiments). For high numbers of deposited layers and much thicker films (of the order of at
least one micrometer), confocal microscopy is used to determine the film thickness. This is
done after labeling the film with CHIFITC as ending layer and measuring, on z-sections
obtained by CLSM, the green band corresponding to CHI diffusion (Richert et al. 2004b). For
a (CHI/HA)24-CHIFITC film with CHI of MW = 5kDa, the film thickness is of about 6 µm
(Figure 2B).
FIGURE 2. Film growth followed by QCM-D for a (CHI/HA)10-CHI film built in 0.15 MNaCl at pH = 4.5 (CHI, MW = 5x103 g/mol ; HA = 4x105 g/mol). Confocal laser scanningmicroscopy observation of a (CHI/HA)24-CHIFITC film built in the same conditions. Filmthickness is about 6.5 µm (line).
Number of layer pairs0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
δ f/ν
(MH
z)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200 5 MHz 15 MHz 25 MHz 35 MHz
Films de polysaccharides dégradables
In order to investigate the possibility of cross-linking the CHI/HA films, a protocol based on
the reaction of activated carboxylic sites with primary amine groups 53 in the presence of a
water soluble carbodiimide, EDC in combination with sulfo-NHS, was used. The cross-
linking reaction in the presence of EDC/sulfo-NHS was more precisely followed by FTIR-
ATR. Recently, this technique proved to be a powerful tool to follow the cross-linking
reaction kinetics for PLL/hyaluronan films 48 and for poly(L-lysine)/poly(L-glutamic) acid
(PLL/PGA) films 59. The detailed mechanism of the cross-linking reaction with EDC
combined to sulfo-NHS have previously been given 48. By FTIR, carboxylate peaks,
saccharide peaks and amide bands can be unambiguously identified. Figure 3 shows a typical
spectrum of a (CHI/HA)8 film deposited on a ZnSe crystal before contact with the EDC/NHS
solution. The peaks attributed to asymmetric and symmetric –COO- stretches (1606 and 1412
cm-1 respectively) from HA can be clearly identified 60. The amide I band from HA in D2O
appears in the 1630-1700 cm-1 region 60 and the C=O band for chitosan appears at around
1620 and 1660 cm-1 61. Characteristic bands of saccharide peaks representative of the skeletal
vibrations include the C-O stretching at 1082 cm-1 and 1032 cm-1 and that at 1159 cm-1 61,62
After the film has been brought in contact with the EDC/NHS solution for ten hours, the
spectrum has evolved. In particular the intensity of the peaks attributed to the carboxylic
groups (1606 and 1412 cm-1) has decreased and correlatively the intensity of the amide band
around 1660 cm-1 has increased. This proves the reaction between the ammonium groups of
CHI and the carboxylic groups of HA. The characteristic bands of the saccharide peaks also
decrease during the cross-linking reaction. This suggests the formation of other bonds such as
ester bonds, which involve hydroxyl groups of polysaccharide and carboxylic groups or acid
anhydride formed by the reaction between two carboxylic groups 63. Such reaction was
proposed by Tomihada et al. to explain the cross-linking of pure HA gels by EDC 63.
Conversely, the intensity of the peak attributed to the ester bond at 1740 cm-1 64 increases. In
Films de polysaccharides dégradables
the present case, the reaction most probably occurs between chitosan and hyaluronan
molecules, and not only between hyaluronan molecules, since comparable observations were
not made during the cross-linking of (PLL/HA) films 48.
The difference between the final spectrum (after rinsing the film that has been in contact for
ten hours with the EDC/NHS solution) and the spectrum of the film before contact with the
EDC/NHS solution thus clearly evidences the structural modification occurring in the film
upon cross-linking.
FIGURE 3. Film cross-linking followed by FTIR-ATR : a spectra of a native (CHI/HA)8 film(thin line) and of the same film after the cross-linking procedure and the final rinsing step (-ο-). The difference between the two spectra (before and after cross-linking) is alsorepresented (thick black line shifted downward for a better visualization).
Film degradation by enzymes and saliva in vitro : CLSM observations and QCM
measurements
In order to investigate the biodegradability of the films in vitro, the films were put in
contact with saliva enzymes such as lysozyme and α-amylase and with natural saliva. Film
degradation was followed by QCM and by confocal microscopy. For QCM, thin films
made of six layer pairs were built and then put in contact with the solutions, in order to
Frequence (cm-1)900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Abs
orba
nce
(AU
)
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
1412 cm-1
COO- of HA
1606 cm-1
COO- of HA Amide I saccharide
peaks
Amide II
Films de polysaccharides dégradables
follow the signal over a long time period. For CLSM observations, thick (CHI/HA)24-
CHIFITC films were used since they allow clear film morphology and thickness
visualization. Native and cross-linked films were compared. The native films were
degraded by both lysozyme and α-amylase, with however some differences in the resultant
film morphologies. In fact, lysozyme is already known to cleave chitin and chitosan gels 65-
67. In its presence, pores appear in the film after several hours contact (Fig 4 A) and are
visible on the film vertical sections (Fig. 4A’). The action of α-amylase is also noticeable:
a regular netlike pattern associated to a “spider’s web” like film structure (Fig. 4C and C’).
This enzyme is able to cleave the α(1,4) glycosidic binding between glucose residues of
polysaccharides and to degrade CHI 47,68.
FIGURE 4. Enzymatic degradation of native (left hand side) and cross-linked (right handside) (CHI/HA)24–CHIFITC films observed by CLSM : lysozyme at 1 mg/mL after 17 hourson a native film (A, top view and A’, vertical section through the film) and on a cross-linked film (B) and (B’) ; α-amylase at 500 U/mL after 15 hours on a native film (C, topview and C’ side view) and on cross-linked film (D) and (D’).
Films de polysaccharides dégradables
This result suggests also that the contact with certain enzymes enables three-dimensional
regulation of the surface structure of the multilayer film and could be used for instance to
prepare films or membranes of various porosity. In contrast, the cross-linked films are
much more resistant to all enzymatic degradation. No degradation was observed after
contact with lysozyme (Fig 4B and B’). For α-amylase, a small superficial degradation was
observed on the top view (Fig 4D), which was not visible on the film vertical section (Fig
4D’).
The effect of natural saliva on the native and cross-linked films was also investigated.
QCM degradation of a native (CHI/HA)6 film in contact with saliva at 37°C was followed
overnight (Fig 5A). The degradation is slow but progressive in the five initial hours, then a
more rapid degradation is observable during 5 and 10 hours, time after which the film is
almost totally degraded. On the CLSM observations of a (CHI/HA)24-CHIFITC film that
was in contact with saliva for 24 hours, a uniform degradation with the appearance of
preferred degradation sites can be visualized (Fig 5B and C). On the film top views, a
regular pattern of small “nodules” is visible, which looks like a grainy material. The side
view image also evidences a smooth and incomplete degradation with preferred dissolution
areas on this thick film. It is thus proven that the native films are slowly and uniformly
degraded in saliva. The degradation seems to progress from top to bottom and could thus
present advantages for the release of incorporated material, allowing a precise control of
the sequences by which one or more components are progressively released. The cross-
linked films totally resist to saliva degradation over the same time period (data not shown).
Films de polysaccharides dégradables
FIGURE 5. Differences in the QCM frequency shifts -δf/ν (A) as a function of time for a(CHI/HA)6 film after contact with saliva : ( ) 5 MHz, ( ) 15 MHz, (∇) 25 MHz, and ( )35 MHz. CLSM observations of a native (CHI/HA)24-CHIFITC films that has been in contactwith saliva for 24 hours : (B) scan size is 230 x 230 µm2 and (C) 57.6 x 57.6 µm2.Corresponding Z-section image (side view) of the same film (D) at 46.1 x 15.5 µm2.
Film degradation in vivo in oral environment
In oral applications, the films will be exposed to saliva in a rather harsh environment (like
tongue mechanical action and chewing) compared to the sole action of enzymes as tested
time (hours)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
δ f/ν
(MH
z)
0
100
200
300
400
500
600
700
5MHz 15MHz 25MHz 35MHz
A
Films de polysaccharides dégradables
in vitro. The films were thus placed in in vivo conditions to mimic a real environment. For
these in vivo experiments, the (CHI/HA)24FITC films were deposited on top of 6 mm
diameter PMMA discs (Figure 6A), which were subsequently sutured to rat’s cheek
(Figure 6B). This location was chosen to avoid any direct contact with the teeth and to
ensure a strong tongue mechanical action. Thus, the outer side of the disc was in contact
with the tongue and the inner side with the cheek, which means that this latter side was
more protected against the mechanical action and was mostly exposed to saliva.
FIGURE 6. In vivo experiments in rat oral cavity. PMMA discs are coated on both sideswith a (CHI/HA)24-CHIFITC film using the automatic dipping machine. A fluorescencestereo microscope image of the film coated polymer discs was taken before implantation inthe rat mouth. The disc was subsequently sutured to the rat’s cheek (B).
After different time periods varying from 6 hours to 3 days in the mouth, the discs were
recovered and both sides were observed using a fluorescence stereomicroscope (Figure 7)
and CLSM (Figure 8). The area of the film remaining on the disc surface was measured
using Image J software and expressed in percentage of the total surface area (Table 1).
Films de polysaccharides dégradables
Table 1. Percentage of (CHI/HA)24-CHIFITC film remaining on the polymer discs after varioustimes in vivo in the rat mouth.
Type of film 6 hours Day 2 Day 3TONGUE SIDE
nativecross-linked
≈ 7%≈ 75%
≈ 10 %≈ 55 %
< 2 %≈ 40 %
♦ CHEEK SID Enative
cross-linked≈ 12%≈ 81%
≈ 8 %≈ 65 %
< 2 %≈ 77 %
FIGURE 7 : Observation of the native and cross-linked (CHI/HA)24-CHIFITC coatedpolymer discs after implantation in rat oral cavity (each image is a different disc).Fluorescence stereo microscope images of the polymer discs coated with native (A, B, C)and cross-linked (D, E, F) (CHI/HA)24-CHIFITC films that have been placed in vivo fordifferent time periods in rat oral cavity : after 6 hours (A,D), after two days (B, E), afterthree days (C, F). Image sizes are 6.3 x 4.8 mm2.
The native films are rapidly degraded in the mouth on both cheek and tongue side. On the
cheek side, only 12% of the native film remains after 6 hours (Figure 7A), 8% after two
days and no film traces are visible after three days (Figure 7B,C). Only 7% of the native
Films de polysaccharides dégradables
film remains on the tongue side after 6 hours and the film is totally degraded after 3 days
(images not shown).
The cross-linked films are more resistant against degradation. Considering the cheek sides,
after 6 hours, more than 80% of the film remains (Figure 7D). Observations of discs
implanted in different rats after two or three days show around 65% and 75% of remaining
film respectively (Figure 7E and 7F). These data indicate that a large fraction of the cross-
linked film is still on the polymer discs after three days of implantation in vivo. Results for
the tongue side show the same trend (images not shown), except that the percentage of
cross-linked film remaining on the polymer disc is systematically lower. After six hours,
75% of the film remains on the tongue side, whereas only 55% and 40% remain after two
and three days (Table 1). The confocal images obtained by projection of a whole z-series
acquisition confirm these observations (Figure 6). Only few amounts of the native un-
cross-linked films remain after six hours, two and three days (Figure 8A, B, C). In
contrary, the discs coated with the cross-linked films are still almost entirely covered after
six hours (Figure 8D). After two days, a degradation of the film is clearly visible and the
film has a granular aspect (Figure 8E), which is even more pronounced at three days
(Figure 8F). This suggests potential applications to protect implantable materials over a
week in the oral environment.
It has to be noticed that the film coated polymer discs are not only subjected in vivo to
saliva degradation but also to a mechanical degradation due to the rat’s chewing. This
explains why the tongue side is always more degraded than the cheek side. The mechanical
action of the rat’s teeth may be responsible for the extremely rapid degradation observed
for the native films, which were not so rapidly degraded in vitro by enzymes and by saliva.
Cross-linked films, which were barely degraded in vitro are also partially degraded in the
harsh in vivo conditions. One way to reduce the mechanical degradation would be to attach
Films de polysaccharides dégradables
more firmly the film to the polymer discs by creating covalent bonds between PMMA and
the film. Such a way has already been used to graft hydroxyapatite to PMMA 69. A recent
work performed in our laboratory suggests the possibility to modulate the degree of cross-
linking of the film (Rudolphe Obeid, personal communication). This indicates that the
degradation rate of the cross-linked films may be more finely tuned.
FIGURE 8 : CLSM observations of native (A, B, C) and cross-linked (D, E, F)(CHI/HA)24-CHIFITC coated slides that have been placed in vivo in rat oral cavity fordifferent time periods : after 6 hours (A,D), after two days (B, E), after three days (C, F).Image sizes are 921 x 921 µm2. Each image is the projected image of a whole z-serieacquisition.
It may also be possible to combine fully degradable polyelectrolytes, such as the
polysaccharides, with less degradable polyelectrolytes, either synthetic ones like
poly(styrene sulfonate) or polyamino acids such as poly(L-glutamic acid). It would now be
Films de polysaccharides dégradables
of interest to embed drugs into the multilayered assembly for further controlled release of
the drug.
CONCLUSION
We successfully demonstrated that polyelectrolyte multilayers made of chitosan and
hyaluronan can be degraded by specific enzymes present in saliva and by saliva in vitro. Film
degradability was followed by quartz crystal microbalance and observed by confocal laser
scanning microscopy after film labeling with CHIFITC. The native films were rapidly degraded
whereas the cross-linked films, which exhibits amide and ester bonds, are resistant to
degradation in vitro. The in vivo degradation of the films deposited on polymer discs and
grafted in the rat oral cavity was also very rapid for the native films. However, dissolution
was much slower for cross-linked films, for which more than 60% of the films remained on
the discs after three days presence in the mouth. These results suggest that multilayer films
made of polysaccharides are of high potential interest for oral applications, especially as drug
release systems.
Acknowledgment.
We thank L. Le Bars and C. Betscha for their technical help and B. Senger for the
quantitative QCM data analysis. We are grateful to Anne Braun for careful reading of this
manuscript and for her critical comments. This work was supported by the “Institut Français
pour la Recherche Odontologique” (IFRO) through a fellowship (2004) (CP). We also thank
J. Mutterer for the access to the CLSM platform used in this study which was co-financed by
the Région Alsace, the CNRS, the Université Louis Pasteur, and the Association pour la
Recherche sur le Cancer.
Films de polysaccharides dégradables
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(69) Liu, Q.; de Wijn, J. R.; van Blitterswijk, C. A. J. Biomed. Mater. Res. 1998, 40, 257-
263.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
5Fonctionnalisation par la Chromofungine
Biofunctionalized polyelectrolytes multilayered films presenting antifungal
activity: an in vitro and in vivo study
Etienne o. 1,2, Taddei c.2, Voegel j.c.1, Aunis d.3, Metz-boutigues m.h.3, Bolcato-Bellemin a.l.1, Egles c.1*
Article en cours pour Journal of Dental Research
Les matériaux prothétiques oraux font souvent l’objet d’une contamination de leur
surface par des microorganismes fongiques. Parmi ceux-ci, Candida albicans est impliqué
comme le principal agent pathogène responsable des candidoses orales. D’autres
champignons et bactéries côtoient cette levure et sont aussi associés dans ces pathologies
fongiques. En odontologie, la forme la plus répandue de candidose est la candidose sous-
prothétique, encore appelée stomatite sous-prothétique.
Afin de conférer à la surface de ces matériaux prothétiques des propriétés
antifongiques, nous nous sommes attachés à fonctionnaliser les films en multicouches de
polyélectrolytes par des peptides antimicrobiens à spectre antifongique. La Défensine que
nous avions utilisé préalablement ne possédait pas un spectre suffisamment intéressant,
notre choix s’est donc porté sur la Chromofungine. Ce peptide constitué de 20 acides
aminés est une fraction de la vasostatine I et correspond à la région 47-66 de la
Chromogranine A (CGA). Plusieurs autres peptides à propriétés antimicrobiennes sont
Fonctionnalisation par la Chromofungine
issus de la dégradation de la CGA et de la CGB, présents dans les granules de sécrétion
ainsi que dans les neutrophiles polymorphonucléaires, les milieux infectieux, les liquides
de cicatrisation et les fluides post-opératoires. La Chromofungine est le plus petit
fragment issu de la CGA à exercer une activité antifongique forte. La présence de CGA a
été démontrée dans la salive, et nos travaux en collaboration avec l’équipe de MH Metz-
Boutigues (INSERM U575) nous ont permis de confirmer sa présence dans le fluide
gingival. Ce travail fait actuellement l’objet d’investigations plus poussées afin de préciser
par microséquençage, la quantité exacte de peptide ainsi que de produits post-
traductionnels associés. Tout porte à penser que parmi ces derniers, des peptides à
propriétés antimicrobiennes existent dans ce fluide gingival destiné à la protection de cette
zone sensible qu’est le sulcus.
Figure 2-18 Prélèvement de fluide gingival par pointes de papier stériles. Dot-blots (A) aucun dépôt, (B,C)fluide gingival, (D) solution de CGA à 10 µg/ml démontrant la présence de CGA et de ses dérivés dans le
fluide gingival.
Nous avons tout d’abord confirmé la bonne insertion du peptide au sein du film à
l’aide d’une Chromofungine rhodaminée. Les observations en microscopie à fluorescence
nous ont permis de constater l’homogénéité de la distribution des peptides dans le film,
mais aussi sa cohésion au sein du film après avoir supprimé ponctuellement ce dernier par
grattage. Nous avons testé deux protocoles de construction : le premier suivant le même
principe que pour l’insertion de la Défensine et alternant polyanions-peptides-polycations
(3 temps de trempage), le deuxième après mélange préalable des peptides avec les
polyanions, alternant ensuite (polyanions/peptides)-polycations (2 temps de trempage).
Dans les deux cas nos films ont montré la présence de la Chromofungine rhodaminée,
sans toutefois pouvoir en quantifier la concentration finale dans le film. Les
concentrations minimales d’inhibition (mic) en solution de la Chromofungine envers de
nombreux microorganismes ont été publiées par Lugardon et al. (2001). Nous avons
Fonctionnalisation par la Chromofungine
retenu la levure C. albicans (mic à 10µm) et le champignon filamenteux Neurospora
crassa (mic à 5 µm) pour nos expérimentations. En effet, pour ces deux champignons la
forte activité de la Chromofungine nous permettait d’envisager un résultat sans toutefois
connaître précisément la concentration de peptide disponible dans le film. De plus, nous
avons testé cet effet sur des films de 24 bicouches PEI-(PSS-PAH)2-(PGA-Chf-PLL)24
puisque l’effet additif des couches avait été démontré lors de nos précédents travaux avec
la Défensine.
Afin d’évaluer le risque de cytotoxicité de telles architectures, nous avons comparé
une culture de fibroblastes sur supports recouverts de films fonctionnalisés et sur supports
recouverts de films non-fonctionnalisés. Les fibroblastes gingivaux primaires ont été
obtenus à partir d’explants issus de biopsies gingivales lors d’avulsions de troisième
molaire, avec consentement des patients. Après 6 jours de culture, le support
fonctionnalisé n’a montré aucune cytotoxicité envers les cellules, au contraire le décompte
des cellules vivantes semble démontrer une meilleure acclimatation des cellules.
La pénétration de la Chromofungine dans la membrane des champignons constitue
l’étape initiale du processus antifongique. Nous l'avons observée in vitro pour C. albicans
comme pour N. crassa. Toutefois, les essais antifongiques par microtitration n’ont permis
de montrer une différence de croissance que de l’ordre de 35%. Deux explications peuvent
être avancées pour expliquer ce résultat relatif. D’une part, la concentration de peptides au
sein du film était peut être insuffisante. D’autre part, lors de nos travaux sur
l’incorporation de la Chromofungine dans la membrane, nous avons observé que toutes les
cellules ne présentaient pas cette incorporation. Il est probable que des mécanismes plus
complexes entrent en jeu. Les derniers travaux de l’unité INSERM U-575, en microscopie
confocale en temps réel, montrent que le site de prédilection pour la pénétration de la
Chromofungine correspond au site de croissance de l'hyphe ou du filament. Il est probable
que toutes les cellules ne soient pas au même stade de croissance et que le film se "vide"
de ses composants peptidiques sur les cellules alors en phase de croissance filamenteuse.
Il apparaît donc nécessaire de mieux gérer ce mécanisme antifongique afin d’augmenter
l’effet protecteur du film. Nos prochains travaux s’intéresseront plus spécifiquement à
l’étude des champignons à la surface du film en faisant abstraction du surnageant qui
n’entre donc pas en contact avec le film. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire seront
Fonctionnalisation par la Chromofungine
réalisés, sur des films d’épaisseur encore plus importante, permettant ainsi de corréler le
nombre de couches de Chromofungine et l'effet en résultant.
Enfin, une étude in vivo a été menée sur 8 rats wistar, équipés des mêmes pastilles
de polyméthacrylate de métyle développées précédemment. Avant la mise en place des
pastilles, une insémination de la muqueuse juggale par C. albicans exprimant la GFP a été
réalisée. Chaque rat a été appareillé par deux pastilles, l’une vierge, l’autre recouverte
d’un film fonctionnalisé ou non, sur chaque joue. Après 6 jours in situ, les pastilles ont été
récupérées, les animaux sacrifiés afin d’observer la muqueuse sous-jacente. Ces
observations démontrent que les pastilles fonctionnalisées sont presque exemptes de
contamination par les C. albicans et que la muqueuse sous-jacente est nettement moins
infiltrée par la candidose. De plus, les surinfections autour des points de suture muqueux
donnant lieu à une suppuration, sont pratiquement inexistantes dans le cas des pastilles
fonctionnalisées par la Chromofungine.
Cette étude de la fonctionnalisation des films en multicouche de polyélectrolytes
par un peptide antifongique est par conséquent très prometteuse. Les mêmes obstacles
qu’avec l’insertion de la Défensine, notamment sur le dosage précis de la concentration en
peptides du film, limitent encore la compréhension et la maîtrise totale du système.
Cependant, l’application topique d’un agent antifongique sans résistance connue reste une
voie de premier ordre pour la protection du matériel prothétique oral, particulièrement
chez les populations à risque augmenté tels les populations âgées, diabétiques ou
immunodéprimés.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
Biofunctionalized polyelectrolytes multilayered films presenting antifungal
activity: an in vitro and in vivo study
ETIENNE O. 1,2, TADDEI C.2, VOEGEL J.C.1, AUNIS D.3, METZ-BOUTIGUES M.H.3,
BOLCATO BELLEMIN A.L.1, EGLES C.1*
1. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, 11, rue Humann,
67085 Strasbourg Cedex, France
2. Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1, Place de l’hôpital, 67000
Strasbourg, France
3. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 575, 5, rue B. Pascal,
67084 Strasbourg Cedex, France
(*) Corresponding author: Phone: 33 (0)3 90 24 33 82; Fax: 33 (0)3 90 24 33 79
Email: [email protected]
Short title: Functionnalized multilayered films with anti-candidal activity
Keywords: Biofunctionnalization, Polyelectrolyte multilayer film, Chromofungin,
Chromogranin A, Bioactive coating
Fonctionnalisation par la Chromofungine
ABSTRACT
Denture stomatitis is a common oral mucosal lesion in denture weavers, in which denture base
is mainly implicated as a microbial reservoir. In order to prevent such infections several
physical and chemical modifications of the denture surface have been tested. Here, we
propose a topical antifungal coating based on the layer-by-layer technique functionalized by
insertion of an antifungal peptide, Chromofungin, inside the coating film. We show that the
peptide keeps its biological activity while immobilized in the films in vitro. The non-
cytotoxicity of such architecture, functionalized or not, is also successfully assessed by
growing of oral derived cells at its surface. Finally, the coating is tested in vivo in an oral
candidosis rat model. These results describe the functionalized multilayer films as a novel and
promising technique for local antifungal protection adapted to oral applications.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
INTRODUCTION
Poly(methyl-methacrylate) polymers used for dental and oral prosthesis are known to be
quickly colonized by a bacterial and/or fungal biofilm (Lamfon et al., 2003; Radford et al.,
1999) which results in local and focal host infections (Nikawa et al., 1998). Candida albicans
is described as the main agent causing denture stomatitis. The frequency of these fungal
infections in denture weavers, diabetic and immunocompromised patients, together with an
increase of resistance to classical azole antifungal drugs (Lupetti et al., 2002a) point to the
need for a new type of protection.
Antimicrobial peptides have been proposed as a new candidate class of antimycotics (Lupetti
et al., 2002b), since they have a different mode of action and are able to regulate the host
immune defense systems. Moreover, due to their specific membrane destabilization effect,
microbial resistance is very improbable. The main limitation for using such peptides is the
way to obtain their local delivery at the interface between tissues and material surface.
Different techniques have been described to immobilize an antimicrobial peptide at the
surface of biomaterials. For instance, Haynie et al. (Haynie et al., 1995) covalently linked the
carboxy-terminal amino acid of Magainin with an ethylenediamine-modified polyamide resin.
Polyelectrolyte multilayer films (Decher, 1997) offer a new type of coating, based on the
alternate deposition of oppositely charged polyelectrolyte layers (layer-by-layer technique).
The coating is achieved simply by dipping alternatively the solid surface into the
polyelectrolyte solutions. The electrostatic forces enable the build-up process between the
charge excess (alternatively positive and negative) after each new layer deposition. To create
a bioactive coating, these films can be functionalized by insertion of biological components
during the build-up process. Many applications have already derived from this technique in a
large variety of fields such as biosensors (Caruso et al., 1997), neurobiology (Vodouhé, 2004)
Fonctionnalisation par la Chromofungine
or antimicrobial protection (Boulmedais et al., 2004; Etienne et al., 2004). Our aim is to
functionalize such polyelectrolytes multilayer films with an antifungal peptide. The choice of
Chromofungin for this particular application comes from the detection of this peptide in the
oral fluids, either in saliva (Kanno et al., 1999) or in gingival crevicular fluid (OE, CE,
MHMB, personal communication), demonstrating the important role of this peptide in the
natural protection of the oral cavity. Chromofungin has been characterized as the shortest
active fragment (amino-acides 47 to 66) from Chromogranin A to exert antifungal properties
in solution (Lugardon et al., 2001). The Chromofungin activity in solution is well defined,
with a minimal concentration inhibiting fungal growth of 10µM and 5µM for Candida
albicans and Neurospora crassa respectively (Metz-Boutigue et al., 2003).
In order to validate this antifungal coating, embedding of the Chromofungin inside the films
was first studied by fluorescence microscopy. Cytotoxicity of both functionalized and non-
functionalized films was tested by growing oral derived fibroblasts. Chromofungin
penetration from the film to the cells and in vitro antifungal assays were conducted on
Candida Albicans and Neurospora crassa. Finally, in vivo experiments were made to
demonstrate the antifungal activity of this coating against oral candidosis.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
MATERIALS & METHODS
Multilayer preparation
Poly(ethylene-imine) (PEI; #03880, MW 750 kDa), poly(sodium 4-styrene sulfonate) (PSS;
#243051,MW 70 kDa), poly(allylamine hydrochloride) (PAH; #283223, MW 70 kDa),
poly(L-glutamic acid) (PGA; #P4886, MW 54.8 kDa) and Poly(L-lysine) (PLL; #P7890,
MW 23.4 kDa) from Sigma-Aldrich were used in solutions to build the films. All solutions
were prepared at 1 mg/mL in a 0.15M NaCl solution (pH 6.5). For all experiments, the
multilayer film was either constructed by directly filling wells with these solutions, one after
each other with NaCl 0.15M rinses between each filling, or simply by dipping specimen discs
in the different solutions. Each filling/dipping creates a monolayer coating over the previous
one, and the sequence finally creates a multilayered film. For our experiments, a precursor
sequence of PEI-(PSS-PAH)2 (noted Pre) was followed with 24 (PGA-PLL) bilayers (noted
Pre-(PGA-PLL)24), or 24 (PGA-Chromofungin-PLL) trilayers (noted Pre-(PGA-Chf-
PLL)24). The precursor sequence has been described on silica surfaces as necessary to confer
a homogeneous final coating. When the coating was achieved, wells and discs were
maintained in a hydrated NaCl 0.15M solution to avoid dehydratation.
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)
Fluorescence staining was monitored with a Zeiss LSM510 Confocal microscope. Synthetic
Chromofungin labeled with rhodamine was used to image the embedding of the peptide inside
the film and the interaction of Chromofungin with fungal membranes. Rhodamine emission
was excited using the helium/neon laser 543-nm line, and the emission signal was filtered
with a Zeiss long pass 595-nm filter. Fungi were subjected to optical serial sectioning (0.2-0.3
Fonctionnalisation par la Chromofungine
µm) to produce image in the x-y plane. Each optical section was scanned six times to obtain
an average image.
Chromofungin embedding
Chromofungin (Chf) was kindly synthesized and provided by M.H. Metz-Boutigues in
dehydrated form, with the following sequence: RILSILRHQNLLKELQDLAL. The peptide
has a pHi of 10.8 , the protein is positively charged at our working pH (6.5) which implies to
adsorb it onto a negative layer. Two embedding protocols were tested, one by inserting the
peptide between two layers of polyelectrolytes and repeating this step n times, in this case the
architecture was: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-Chf-PLL)n with n=24 (Figure 1A). The other
protocol consisted by first mixed the Chromofungin (cationic) with the anionic polyelectrolyte
(PGA) in a ratio of 1 to 10 in order to keep a global negative charge after the adsorption. Later
on, this peptidized polyanion (PGA*Chf) was used in place of PGA in the construction of the
multilayer architecture described as: PEI-(PSS/PAH)2-((PGA*Chf)-PLL)n with n=24 (Figure
1B).
Antifungal assays
In order to assess that Chromofungin embedded in the film had kept its antifungal action, we
cultured two types of fungi, filamentous Neurospora Crassa (CBS 327-54) and yeast Candida
Albicans (gift of Dr. M.H. Metz-Boutigues), at the surface of functionalized films. Both were
grown aerobically at 37°C in a Sabouraud liquid medium (BD Difco, #210986). They were
harvested at mid-exponential growth phase and diluted to an optical density at 600nm
(OD600) of 0.001 in their respective medium. Experiments were done in 96 well plates
(Sarstedt, #83-1835, USA) in which polyelectrolytes multilayer films had been constructed by
alternate depositions, in order to coat the inner surface of the wells. Control and test wells
Fonctionnalisation par la Chromofungine
were filled with 100 µL of fungal medium. The peripheral wells were always filled with 100
µL of respective medium in order to decrease the result uncertainties due to the strong
evaporation of these wells; they also served as control for contamination. After 6 hours of
incubation under agitation (40 r/min) at 37°C, C. albicans growth was measured using a
Metertech spectrometer Σ 960 at 600 nm. Mean of the test wells measurements was compared
to the mean of the control wells measurements. Results were expressed in % of control ±
standard deviation and a Student statistical test was done. The filamentous growth of N.
crassa was observed by optical microscopy after 18 hours incubation under the same
conditions.
Cell culture
Human gingival fibroblasts (HGF) were isolated and cultured from human biopsy (Bolcato-
Bellemin et al., 2000). Briefly, gingival biopsy was obtained during surgical removal of third
molar with informed consent of the patient. Tissues were cut into small pieces and cultured in
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, #31331-028, GIBCO) containing 10% fetal
calf serum (FCS), 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Invitrogen) at 37°C in a
humidified atmosphere of 95%air/5%CO2. After 4-8 days, fibroblasts began to outgrow from
the explant. When the primary culture reached near confluence, cells were trypsinized and
subcultured in the medium at a ratio 1:3. Cell cultures between 3 to 5 passages were used in
this study. 2.104 cells were deposed onto the polyelectrolyte multilayer. After 5 days, the cells
were washed with DMEM without serum, trypsinized, stained with trypan blue (Invitrogen)
and counted. Measurements were done over three cultures by counting at least 15 areas in
each culture. Standard deviation and Student T-test were done.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
Polymer specimen discs preparation and in vivo studies
A 3 mm diameter cylinder made of poly(methyl-methacrylate) (PMMA) (Probase,
IVOCLAR, Liechtenstein) was obtained using the lost-wax technique and heat-cured
following a classical laboratory denture preparation. Specimen discs (1 mm thickness) were
sliced from this cylinder and were perforated by 2 holes, in their center, to enable suture. This
suture ensures a strong contact between the disc and the dental tissues in order to mimic
denture base conditions. Specimen discs were used as-is, not polished. The multilayer films
were constructed using a dipping robot (DR3, Kirstein GmbH, Germany) to ensure a coating
of the whole surface of the discs. Specimen discs were either coated with a non-functionalized
film (Pre-(PGA-PLL)24) or with a functionalized film (Pre-(PGA-Chf-PLL)24) and sutured
to the center of the rat’s cheek. This location was chosen to avoid contacts with teeth. Studies
were conducted on 8 males wistar rats, aged of 3 month. An oral candidosis model was
obtained by spreading 1 OD600 GFP-expressing Candida albicans (strain GFP-CA14,
(Alarco et al., 2004)) along the rat cheeks. Two discs were immediately sutured after
spreading, one on each cheek. The discs were kept for 6 days in the rat mouth and then
retrieved. The animals were sacrificed, and mucosa underlying discs was clinically examined
and observed. All observations were done under epifluorescent illumination (excitation filter,
480/40 nm; dichroic filter, 505 nm; and emission filter, 510 nm) with a Leica MZFLIII
stereomicroscope. All studies were conducted following the highest principles of animal
welfare, according to French ethics committee recommendations.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
RESULTS
Embedding of Chromofungin in the polyelectrolyte multilayer films
No differences could be observed between the functionalized films according to their
construction protocol. The whole surface appears with red fluorescence and scratching the
film enables to confirm the embedding as no fluorescence is observed in the scratched cross
(Figure 1C and 1D). The second embedding protocol using a peptidized polyanion
(PGA*Chf) is of great interest as it limits construction time.
Figure 1: Construction and functionalization of the polyelectrolyte multilayer films.(A,B) Scheme of the construction of the polyelectrolyte multilayer film, based on the alternate deposition ofpolyanions (grey), polycations (black), and Chromofungin (black balls). Adsorption of the peptide is obtainedeither on a layer of the opposite charge (A) or by mixing first the peptide and the polyanion (B). The peptide isthen embedded under another polyelectrolyte layer. (C,D) Both construction protocols allow a stable insertion of
A
C D
Charged surface
Cationic deposition
Anionic deposition
nx3Peptide deposition
Charged surface
Cationic deposition
Anionic deposition
nx2
(Anionic + Peptide)deposition
B
Fonctionnalisation par la Chromofungine
rhodamin-labeled Chromofungin in the architecture (C). Removing of the multilayer by scratching demonstratethat the presence of Chromofungin is restrained to the polyelectrolyte multilayer film (D).
Antifungal activity of Chromofungin embedded in the film
For both strains, we first tested if Chromofungin was able to cover fungi growing at the
surface of the film. After 30 minutes of culture at the surface of polyelectrolytes multilayer
films containing rhodamine-labeled Chromofungin, C. albicans were detected completely
stained in CLSM observations (Figure 2A, 2B and 2C) demonstrating that Chromofungin was
able to transfer from the film to the surface membrane of the fungi. Microplate assays
confirmed that Chromofungin kept its antimicrobial activity while inserted in the
polyelectrolyte multilayer films, reducing the number of Candida Albicans by 35%±5,02%
(Figure 2D) and inhibiting the growth of Neurospora Crassa at the surface of functionalized
polyelectrolytes multilayer films (Figure 2E and F).
Figure 2: Antifungal activity of Chromofungin embedded in the polyelectrolytes multilayer films.CLSM observation of Candida Albicans (A,C) and Neurospora crassa (B) after two hours of culture at thesurface of functionalized polyelectrolytes multilayer films constructed with rhodamin-labeled Chromofungin.For both strains, the cells are covered with the fluorescent peptide demonstrating the ability of the peptide totransfer from the film to the membrane of the fungus. (D) Antifungal assays for Candida Albicans. Results areexpressed in % of control ± SD. The functionalized films showed a high capacity of reducing candidal growth by35%±5,02% (***: p > 0.001). (E,F) Optical microscopy observation of Neurospora Crassa cultured at the surface
C D
A B
E F
0
20
40
60
80
100
120
Control Chfg
Fonctionnalisation par la Chromofungine
of non-functionalized (E) or Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (F). TheChromofungin embedded in the film keeps its activity and inhibit the growth of the filamentous fungus.
Cytotoxicity of functionalized multilayer films
No differences could be detected between the two supports by counting the number of dead
cells (Figure 3A), the number of living cells was higher on the functionalized polyelectrolytes
multilayer films (Figure 3B), and no differences could be observed comparing the overall
morphology of the cultured cells (Figure 3C and D). Our results do not allow us to detect any
potential cytotoxicity of the functionalized polyelectrolytes multilayer opposed to non-
functionnalized.
Figure 3: Cytotoxicity of the functionalized multilayered films.(A) Counting of the number of dead human gingival fibroblasts at the contact of polyelectrolyte multilayer filmsor Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films. (B) Counting of living cells on both surfaces.(C,D) Human gingival fibroblasts morphology after 6 days in culture at the surface of polyelectrolyte multilayer
0
1
2
3
4
5
Non-functionalized Functionalized
X104 c
ells
/mL
0
1
2
3
4
5
Non-functionalized Functionalized
X104 c
ells
/mL
A B
C D
Fonctionnalisation par la Chromofungine
films (C) or Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (D). In both cases the cells exhibitmany points of adherence and a normal cell body morphology.
In vivo observations
All control specimen discs retrieved were covered by C. albicans on the cheek side. Cheek
side surface of discs covered with non-functionalized films showed in 3 cases out of 4 a
diffuse covering of a candidal layer as demonstrated by a green staining of the surface. In 2 of
these 3 specimens, a more intense candidal proliferation was noticeable. None of this staining
could be detected at the surface of discs covered with Chromofungin functionalized films
(Table 1). Discs covered with non-functionalized polyelectrolyte multilayer film were
associated with an increase in the pus collection at the suture area and with an increase in the
candidosis on the mucosal layer demonstrating the good infectious protection offered by the
chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (Table 1).
As-is Non functionnalized Functionnalized
Disc surface ++ ++++ -
Mucosa candidosis ++ ++++ +
Pus collection ++++ +++ +
Table 1: In vivo experiments in rat oral cavity.Discs made of poly(methyl-methacrylate are coated with polyelectrolyte multilayer films PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)24 or with chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-Chf-PLL)24) were sutured to the rat’s cheek. Observations of the cheek side of the discs by fluorescentmicroscope after 6 days in situ in the rat mouth, showed that functionalized film surface presented almost notrace of GFP-expressing Candida Albicans while non-functionalized surfaces begin to be colonized by the fungi.Discs covered with non-functionalized polyelectrolyte multilayer film were also associated with an increase inpus collections at the suture level and of an increase in the candidosis on the mucosal layer.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
DISCUSSION
The aim of this study was to investigate the possible antifungal protection offered by
polyelectrolytes multilayer films functionalized with antimicrobial peptides from the innate
immunity system, onto oral medical devices.
Antimicrobial protection for medical devices can be achieved by various approaches. One
consists in preventing or reducing the bacterial adhesion at the material surface. This
approach was tested with various physical modifications (Wang et al., 1995) or monolayer
surface coatings (Huang et al., 2001). It was also assessed with the polyelectrolytes multilayer
film coating using PLL or PGA grafted to poly(ethylene glycol) (PEG) and inserted several
times in the film (Boulmedais et al., 2004; Kenausis et al., 2000). These experiments showed
that PEG containing films are able to reduce significantly bacterial adhesion. However, the
anti-adhesion properties of such films are not specific against microbial agents since such
surfaces exhibit also protein and cell repellent properties. Another way, developed in this
article, is to protect devices by attempting to “kill” microorganisms once they have adhered
on the protected surface. It has been shown previously that coatings by polyelectrolytes
multilayer films were stable in the oral environment and were able to cover most of the
polymers used for oral medical devices (Etienne et al., 2004). In order to confer bioactivity to
these films, embedding of specific bioactive components must be achieved. Here, we have
tested a specific bioactivity which is an antifungal protection of denture base conferred by an
antimicrobial peptide.
As antimicrobial peptides have been described with potential cytotoxicity at high
concentration (Pacor et al., 2002), it encourages rather topical application than general
injection. Here, we demonstrated the non-cytotoxicity of Chromofungin functionalized films.
The observation that gingival fibroblasts grow better on functionalized films may come from
Fonctionnalisation par la Chromofungine
an increase in the rigidity of the polyelectrolytes multilayer films after the adsorption of the
peptides. As demonstrated before (Richert et al., 2004) this rigidity favors adhesion and
growth at the surface of the films.
Embedding of the Chromofungin was successfully demonstrated by fluorescence microscopy
observations. However, no quantitative data on the final concentration of embedded
Chromofungin could be measured with classical used techniques such as Quartz Crystal
Microbalance or Optical Waveguide Laser Spectroscopy. Due to low molecular weight of the
peptide, no signals could be recorded. Therefore, the moderate activity of Chromofungin
functionalized films measured for Candida Albicans by microplate assays could be explained
either by the fact that only the surface of the multilayer exerts an antimicrobial activity or by a
low concentration of peptide in the film. In both case, the film surface cannot kill the totality
of Candida in the culture medium. We recently described the immobilization of an
antibacterial peptide, the Defensin from Anopheles gambiae, onto a planar substrate by
embedding it in multilayered films (Etienne et al., 2004). This bioactive coating was able to
decrease bacterial growth from more than 92%. Taken together, these results conclude that
activity of the functionalized films relies totally on the concentration, the activity and
spectrum of the inserted peptide. Increasing the number of Chromofungin layer, as well as
testing new kind of antifungal peptides from the innate immune system could lead to a higher
activity.
Biofunctionalized polyelectrolytes multilayer films containing antimicrobial peptides seem
therefore an extremely promising method to achieve bioactive coatings of great interest for
biomaterials in general and dental applications in particular, especially as a possible
prevention of oral fungal infections.
Fonctionnalisation par la Chromofungine
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank Jerome Mutterer (IBMP, Strasbourg) for the access to the CSLM, and Dr
Metz-boutigues’s team for technical help with the Neurospora Crassa culture.
REFERENCES
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Conclusion et perspectives
Conclusion et perspectives
Le but de ce travail était de mettre au point une interface antimicrobienne, à partir
d’une technique de recouvrement de surface originale : les films en multicouche de
polyélectrolytes. L’étude de ces films est en effet le principal thème de recherche du
laboratoire INSERM U595 dans lequel ce travail a été réalisé. Les résultats obtenus ont
permis de valider à la fois la structure physico-chimique des films que nous avons
fonctionnalisés et leur effet antimicrobien.
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la mise au point d’une
structure limitant l’adhésion bactérienne. Le poly(éthylène glycol) (PEG), de par ses
propriétés physico-chimiques, nous a paru être le candidat le plus adapté à la technique
des multicouches. En effet, ce polymère avait déjà démontré ses propriétés anti-adhésives
vis-à-vis des bactéries sur des recouvrements de surface en monocouche, par adsorption
spontanée. La construction de films multicouche par l’alternance d’un polyélectrolyte
couplé au PEG (PGApeg) et d’un polyélectrolyte de charge opposée non couplé (PLL)
s’est avérée concluante. L’adhésion d’E. coli à une surface de verre recouverte d’un film
fonctionnalisé (PEI-(PGA/PLL)2-PGA-(PLL-PGApeg)) a été diminuée de plus de 70%
par rapport aux surfaces nues. La multiplication des couches actives sous la forme de trois
bicouches terminales PLL/PGApeg a confirmé l’intérêt de la technologie des
multicouches puisque la réduction d’adhésion a alors atteint plus de 90%.
De telles surfaces sont particulièrement intéressantes dans l’optique d’une
protection antimicrobienne de matériel temporairement implanté, comme les cathéters.
Cependant, ce système présente l’inconvénient d’empêcher tout type d’adhésion, il est
totalement non spécifique en l’état actuel. Il ne convient donc pas à des matériels destinés
à être implantés de façon durable dans l’organisme et nécessitant par là-même une
adhésion protéique et cellulaire assurant leur intégration dans les tissus environnants.
C’est pourquoi, dans un deuxième temps, nous nous sommes attachés à améliorer
cette interface afin de la rendre spécifiquement antimicrobienne. Pour cela, nous nous
sommes intéressés aux possibilités d’incorporation d’un agent antimicrobien au sein du
Conclusion et perspectives
film. Les critères de sélection d’un tel agent étaient liés à sa taille, à son spectre d’activité,
à sa toxicité éventuelle et à son mode d’action. Face aux risques d’engendrer une
résistance bactérienne en insérant une molécule antibiotique, nous avons envisagé
l’utilisation de peptides antimicrobiens. Leur mode d’action principalement lié à une
déstabilisation de la membrane microbienne, leur poids moléculaire minime (4-5 kDa)
ainsi que leur spectre large en faisaient des candidats idéaux. Parmi tous les peptides
antimicrobiens déjà découverts, la Défensine d’insecte s’est révélée non toxique, son
spectre est large et sa concentration minimale inhibitrice bien connue en solution. La
société Entomed SA, spécialisée dans l’application médicale des peptides antimicrobiens,
nous a gracieusement fourni une Défensine isolée initialement chez le moustique
Anopheles gambiae.
La première interrogation concernait l’insertion de ce peptide au sein du film. Sa
charge cationique au pH de travail étant beaucoup plus faible que celle des
polyélectrolytes utilisés, son adsorption et plus encore sa désorption pouvaient être
redoutées. Nous avons tenté de mesurer cette adsorption à l’aide de la spectroscopie
optique par guide d’onde sans succès, sa taille étant manifestement en dessous du seuil de
détection de cette méthode. Néanmoins, les mesures en microbalance à cristal de quartz et
l’analyse du potentiel de charge de surface, ont permis d’enregistrer un signal, confirmant
l’adsorption du peptide lors de la construction du film. Aucune de ces méthodes n’a été en
mesure de fournir la quantité précise de peptide adsorbée et donc insérée dans le film, ni
d’affirmer qu’aucune désorption n’avait eu lieu.
Ce sont des preuves indirectes, données par les résultats biologiques, qui ont
permis de confirmer la présence du peptide au sein du film. En effet, lors de nos tests sur
deux souches bactériennes E. coli D22 et M. luteus, nous avons obtenu une inhibition de
croissance significative sur ces films fonctionnalisés par rapport aux mêmes films non
fonctionnalisés et aux surfaces nues.
Cependant, l’effet antimicrobien n’a été observé que pour les films dont la couche
finale était cationique. Nous avons donc étudié les rapports à l’interface entre les bactéries
et les films de charge de surface différente. Le comportement des bactéries s’est révélé
radicalement opposé, puisqu’elles présentaient des contacts intimes avec les films
cationiques et au contraire restaient distantes de la surface des films anioniques. Cette
interaction, principalement liée aux forces électrostatiques en présence (membrane
bactérienne de charge négative), peut expliquer les résultats biologiques obtenus. En effet,
Conclusion et perspectives
contrairement aux films anioniques, les films cationiques autorisent une surface
d’interaction maximale entre la membrane bactérienne et les peptides insérés dans le film,
favorisant l’action de ces derniers.
De plus, ces observations démontrent qu’aucun relargage du peptide dans le milieu
ne s’est produit, puisqu’aucun effet inhibiteur n’a été mesuré dans le cas des films
fonctionnalisés anioniques.
La concentration du peptide dans la solution déposée lors de la construction du
film n’a aucunement influencé l’effet antimicrobien, suggérant un phénomène de
saturation lors de l’adsorption. En revanche, les films composés de dix couches
(PGA/Défensine/PLL) ont montré une inhibition de croissance quasi-totale, confirmant à
nouveau le potentiel de la technique des multicouches.
L’application biomédicale de tels recouvrements de surface suppose une mise en
contact avec différents tissus, fluides et cellules environnants. Dans le souci de valider
notre concept, nous nous sommes concentrés sur la protection de matériaux largement
répandus dans le matériel médical et odontologique, le polyméthacrylate de méthyle et le
polyvinyl siloxane (silicone). Ces deux matériaux sont connus pour être colonisés
rapidement par un biofilm et constituer alors de véritables réservoirs microbiens. En
odontologie, la pathologie la plus fréquente liée à l’usage de ces matériaux est la
candidose sous-prothétique. Sa prévalence chez les personnes appareillées par des
prothèses amovibles est importante, plus particulièrement lorsqu’un terrain favorable
préexiste comme le diabète ou l’immunodépression.
Nous avons testé avec succès l’application de la technique des multicouches au
recouvrement de telles surfaces, qu’elles soient polies ou non polies. Nous avons ensuite
étudié le comportement des films en multicouche face au milieu salivaire dans lequel ils
sont utilisés. Pour cela, des études in vitro ont tout d’abord permis de confirmer la stabilité
du film jusqu’à 12 jours en milieu salivaire naturel renouvelé, à 37°C. Des études in vivo
complémentaires, menées sur le rat, ont permis de constater après 4 jours in situ, la
stabilité du film sur la face prothétique en contact avec la muqueuse et sa relative
dégradation sur la face linguale.
Il peut être conclu de ces études que la salive n’engendre pas une dégradation
importante du film (PGA/PLL) mais que celle-ci est plutôt dépendante de l’action
mécanique des frottements. Or, ces frottements concernent essentiellement la face externe
Conclusion et perspectives
des prothèses dentaires qui est soumise à de multiples appuis linguaux pendant les
déglutitions quotidiennes. Au contraire, l’intrados est isolé de cet auto-nettoyage, ce qui
favorise la prolifération bactérienne et candidosique, et justifie pleinement la protection
antimicrobienne que le film est capable d’assurer sur cette face. L’amélioration de la
cohésion du film à la surface du matériau, de même que sa cohésion intrinsèque doivent
faire l’objet de futurs travaux afin d’allonger la durée de stabilité du film dans la cavité
orale. La durée idéale est difficile à estimer, mais un renouvellement hebdomadaire serait
déjà une intéressante proposition clinique.
A ce type de films PGA/PLL particulièrement résistants à la dégradation salivaire,
correspond une notion de maintien d’activité dans le temps. L’élaboration de films
biodégradables dans la salive répond à une autre voie de fonctionnalisation permettant le
relargage, contrôlé dans le temps, de molécules actives. Deux polysaccharides naturels, le
chitosan et l’acide hyaluronique, connus pour leurs propriétés antimicrobiennes, ont été
utilisés comme éléments de base de l’auto-assemblage en multicouche. La construction du
film a été validée, ainsi que sa biodégradabilité. La réticulation chimique du film CHI/HA
a permis de modifier la stabilité du film face à un environnement salivaire in vitro et in
vivo. Le contrôle de cette propriété est particulièrement intéressant pour la délivrance
localisée et contrôlée de principes actifs au niveau de la zone d’implantation. Toutefois, le
procédé de réticulation chimique utilisé pourrait dénaturer les molécules internalisées.
Ceci reste à vérifier sur quelques molécules tests, mais pourrait limiter les possibilités de
fonctionnalisation de ces films multicouches biodégradables. L’optimisation de différents
paramètres de réticulation (temps, température, concentration) voire l’utilisation d’autres
agents de réticulation, devraient permettre de moduler précisément les propriétés des films
(vitesse de dégradation, propriétés mécaniques…) mais aussi de préserver l’activité
biologique des principes actifs insérés dans les films.
Enfin, après avoir validé la stabilité du film en multicouche de polyélectrolytes
dans la cavité orale, nous nous sommes attachés à le fonctionnaliser spécifiquement face à
l’infection fongique. Pour cela, le peptide antimicrobien retenu a été la Chromofungine,
peptide à forte activité antifongique. Nous avons tout d’abord confirmé la présence du
peptide au sein du film PGA/PLL en microscopie à fluorescence, en utilisant une
Chromofungine rhodaminée. Cette même Chromofungine fluorescente nous a permis
d’observer la pénétration rapide du peptide dans les souches C. albicans en culture sur le
Conclusion et perspectives
film. Dans un deuxième temps, des cultures cellulaires, de fibroblastes humains primaires,
ont confirmé la non cytotoxicité du film fonctionnalisé par la Chromofungine.
Enfin, un modèle d’infection fongique à C. albicans sur le rat wistar nous a
permis, in vivo, de constater le potentiel protecteur de ce type de recouvrement pour des
surfaces de PMMA.
En conclusion, l’application des multicouches fonctionnalisées à la protection
antifongique des prothèses dentaires apparaît réaliste. Ce modèle infectieux a été choisi
pour son approche clinique peu invasive et sa pathologie bien caractérisée. Cependant, le
concept de protection antimicrobienne par les films en multicouche de polyélectrolytes
fonctionnalisés par des peptides antimicrobiens est destiné à des applications beaucoup
plus larges dans le domaine médical. Chaque système et chaque problématique infectieuse
étant spécifique, les approches scientifiques futures devront suivre la même démarche de
validation : sélection in vitro du ou des peptides les plus appropriés, étude de la
dégradation dans le milieu physiologique concerné (sang, urine, …) et dans les contraintes
propres à ce milieu (dynamique des fluides, acidité, processus enzymatiques, …). Enfin,
les études in vivo permettront de valider ce concept pour les différentes applications
envisagées.
Au-delà des résultats obtenus au cours de ce travail, démontrant que le concept de
films multicouches de polyélectrolytes biofonctionnalisés pouvait s’appliquer à la
protection antimicrobienne tout particulièrement dans le milieu buccal, de nombreuses
voies de recherche sont à présent ouvertes.
Au cours de mon travail, je n’ai inséré qu’une seule sorte de molécules dans les
films multicouches (PEG, Défensine ou Chromofungine) or rien techniquement de
s’oppose à l’insertion de plusieurs molécules à la fois dans les films. Cette possibilité de
multifonctionnalisation peut être utilisée de plusieurs manières :
- soit pour augmenter le spectre d’activité antimicrobien des films. Dans ce cas,
plusieurs protéines antimicrobiennes peuvent être insérées dans les films, chacune avec
une activité différente. L’addition de ces activités permettra d’obtenir un film multicouche
protégeant le matériel implanté contre tous types de microorganismes capables de
l’attaquer. La combinaison de plusieurs peptides nous rapprocherait du mécanisme
immunitaire inné, en assurant une couverture large et en offrant peu de risques de
résistance.
Conclusion et perspectives
- soit pour moduler la fonctionnalisation de ces films. Ainsi, l’interface anti-
adhésive non spécifique des films multicouches fonctionnalisés par le PEG pourrait être
modifiée par l’ajout de motifs de reconnaissance propres à certains types cellulaires.
L’interface ainsi constituée autoriserait alors l’adhésion spécifique de certaines cellules à
la surface du matériau, tout en conservant son caractère anti-adhésif envers les micro-
organismes.
- soit enfin pour multiplier les fonctionnalités d’un même film. En effet, si notre
approche s’est concentrée sur la protection antimicrobienne, le travail d’autres équipes a
montré qu’il était possible d’insérer des protéines ayant d’autres propriétés (anti-
inflammatoires, anti-cancéreuses, mélano-stimulantes, etc.). L’insertion de plusieurs
protéines pourrait donc aboutir à des surfaces protégeant le matériel implanté contre les
attaques microbiennes mais également favorisant son insertion dans les tissus alentours ou
limitant l’inflammation induite par l’implantation.
La protection antimicrobienne concerne de nombreux types de matériaux et de
multiples applications spécifiques. Au cours de mon travail de thèse, je me suis limité à
des applications liées à l’Odontologie, afin de mettre les films multicouches de
polyélectrolytes biofonctionnalisés à l’épreuve d’un environnement physiologique très
spécifique et d’une protection antimicrobienne ciblée. Si les résultats que j’ai obtenus sont
particulièrement intéressants, ils n’en restent tout du moins que préliminaires. Des études
futures devront d’une part poursuivre ce travail afin de valider ces techniques pour des
applications humaines et d’autre part tester d’autres applications. Les résultats que j’ai
obtenus par exemple sur des résines de PMMA ou sur le silicone permettent d’envisager
un grand nombre d’applications notamment dans le domaine des lentilles de contact, des
applications orthopédiques (ciment à os), de la chirurgie esthétique (injections d’acide
hyaluronique et de billes de PMMA), des applications cardiaques (valves), orthopédiques,
ou de reconstruction (prothèses maxillo-faciales). Dans chaque cas, il faudra définir
comme je l’ai fait dans mon travail le type de polyélectrolytes le mieux adapté à la
protection (dégradable ou non), le type de protéine inséré ainsi que le suivi du matériel
après implantation.
Enfin, une autre voie de recherche réside dans le développement des films pouvant
se dégrader dans leur environnement physiologique. Comme, je l’ai montré, cette
perspective est envisageable dans le milieu buccal avec des films CHI/HA, la dégradation
Conclusion et perspectives
de ses films semblant être ralentie par le cross-linking chimique. Ce travail se prolongera
pour rechercher les cinétiques de dégradation des différents films (non-crosslinkés et
crosslinkés de manière plus ou moins forte). De plus, il serait intéressant de savoir si cette
dégradation permet également la libération de protéines enfouies dans les films et si les
protéines ainsi libérées le sont sous forme libre ou complexée à des polyélectrolytes. Si tel
était le cas, ces systèmes dits de « release control » nous permettraient non plus de ne
protéger que l’interface des matériaux, mais également leur environnement cellulaire et
physiologique immédiat augmentant de ce fait la protection antimicrobienne apportée.
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