Universität Regensburg Abteilung Instrumentelle Analytik ... · HPLC-Praktikum Dr. Vasold...
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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 1
Universität Regensburg AbteilungInstrumentelle Analytik
CH 32.1.05
Chromatographie I
Einführendes Praktikum indie HPLC
Skript 2003/04
Dr. R. Vasold
Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04
Inhalt
I Theoretischer Teil
I.1 Einleitung............................................................. 4
I.2 Zielsetzung .......................................................... 4
I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase) .......................... 5
I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen ............................... 7
I.4 Die mobile Phase (Eluent) .................................. 7
I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen ....... 7
I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen ................................... 9
I.4.2.1 Die Isokratische-Elution.......................................... 10I.4.2.2 Die Gradienten-Elution ........................................... 10
I.5 Die Pumpen ....................................................... 11
I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem.......................... 11
I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme ....................................... 11
I.6 Die Injektionseinheit ......................................... 12
I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) ............. 12
I.6.2 Die manuelle Injektion ................................................... 12
I.7 Der Detektor....................................................... 13
I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 15
I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 16
I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers..................................... 16
I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil ................... 18
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II Experimenteller Teil
II.1 Einleitung ...........................................................19
II.2 Durchführung.....................................................20
II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ........................ 20
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen........................ 20II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung................ 20II.2.1.2 Vorbereitung der Probenlösungen........................ 21
II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen ................................ 22
II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung................................ 22II.2.2.2 Die Prammierung des Injektionsvolumens ............23II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung..................................... 23II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten....... 24II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter ............. 24II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers................. 25II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ........................ 25
II.2.3 Die quantitative Auswertung.......................................... 26
II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis............................... 26II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ........................... 26II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes .............. 27
I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................28
III Auswertung Theoretischer Teil ....... 29
IV Auswertung Experimenteller Teil.... 30
Abgabe-Bogen.............................................. 31
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Einführendes Praktikum in die HPLC
I Theoretischer Teil
I.1 Einleitung
Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine lei-
stungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatogra-
phischen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anor-
ganischen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbindungen, die
man in Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein chromatographi-
sches Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen trennen und an-
schließend qualitativ oder quantitativ bestimmen kann.
Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwen-
dung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems,
sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die
Eigenschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsy-
stem abschätzen können, man muss Mißerfolge bei der Trennung erklären
können und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz
erwerben.
I.2 Zielsetzung
Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung
in die HPLC zu geben.
In diesem Praktikum sollen u.a.
§ die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems
kennengelernt werden, wie
- die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h. rever-
sed phase-Phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule.
- die mobile Phase mit Eluentenversorgung,
- Pumpen und Einspritzventil (Autosampler),
- der Detektor,
- die Steuerungs- und Auswertesoftware;
§ die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt wer-
den;
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§ wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durch-
bruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsge-
schwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.
§ die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen
Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.
Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems
näher beschrieben.
I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eineRP-Phase (reversed-phase-Phase)
RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von
denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP-
Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselge-
loberfläche (normal-phase-Phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Re-
ste (z.B. C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) un-
polar gemacht worden (sog. „endcapping“). Über die chemischen Einzelheiten
der Herstellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über
die Eigenschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakteri-
sierung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Her-
steller informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine
Reihe von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller
Trennungen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wieder-
verwendbarkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen
Einstellung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöh-
ten Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor al-
lem beim Gradientenbetrieb sehr wichtig.
O Si O Si O O Si O Si O Si O Si Si O O Si O Si O Si O Si O O Si O O
O
N C H 3 C H
3
N
Cl
C18-Ketten
Durch fast vollständiges „endcapping“ sindweniger Wechselwirkungen mit noch freienSilanolgruppen (SiOH) möglich.
Folge: „scharfe Peakform“
Abb. 1: Schematische Darstellung eines gut “endgecappten“ C18-Materials.
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Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma Pheno-
menex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend „hydrophobem
Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen Sila-
nolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Hersteller
unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. Wegen der
schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser Restanteil
den somit nicht vollständig „endgecappten" RP-Phasen gewisse „Ionenaus-
tauscheigenschaften“.
Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Gelade-
ne Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert ihren La-
dungszustand ändern, z.B. saure Substanzen (z.B. Phenole) und besonders
basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen
"nicht vollständig endgecappten“ RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum
Tailing. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein,
dass man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es
heute viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen spezi-
ellen RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit
kürzeren organischen Resten (z.B. C12) möglichst vollständig modifiziert.
O Si O O Si O O O O O O O Si Si O O Si O O O O O Si O O Si O O
O
N C H 3 C H 3
N Cl
C18-Ketten
Verbindung interagiert mit noch„freien Silanolgruppen“
Folge: „Peaktailing“
Abb. 2: Schematische Darstellung eines nicht vollständig „endgecappten“
C18-Materials.
Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden
wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end-
gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig frei
ist von Schwermetallverunreinigungen (z.B. Merck: Purospher)
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I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen
Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen
sind:
1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irre-
versibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub,
Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent.
Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des
Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns;
Säulenspülung mit geeignetem Eluenten.
2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer pH-Werte.
Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten"
3. Falsche Säulenaufbewahrung.
Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen !) und der Gefahr des Auskristallisie-
rens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in
Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung
von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril
gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich
eine Mischung aus 20% H2O und 80% Acetonitril.
I.4 Die mobile Phase (Eluent)
I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilenPhasen
In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem
unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fäl-
len (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen
Mengen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder „Stärke“ der verschiedenen Elu-
enten wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert fest-
gehalten. Als Symbol dafür verwendet man E0 oder å0. Die so gefundene Rei-
henfolge von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man
die Eluotrope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität
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geordnet sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) starker Eluent ist
polar, ein schwacher ist unpolar:
Eluent Polarität [E0] UV-Grenze [nm]
n-Hexan 0,00 190
Toluol 0,29 285
Chloroform 0,40 245
Dichlormethan 0,42 230
Aceton 0,56 330
Essigsäureethylester 0,58 260
Dimethylsulfoxid 0,62 270
Diethylamin 0,63 275
Acetonitril 0,65 190
Ethanol 0,88 210
Methanol 0,95 205
Wasser >1,11 <190
Tab. 1: Eluotrope Reihe (Auszug). Die angegebenen E0-Werte
gelten für Aluminiumoxid als Adsorbens, doch sind sie
für Silicagel nur um einen konstanten Faktor verschie-
den: E0 (SiO2) = 0,77 E0 (Al2O3). Die Lösungsmittelrei-
henfolge ändert sich also nicht, wenn man von Alumini-
umoxid auf Silicagel übergeht.
In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase
in der Mehrzahl der Fälle aus einem relativ polaren, mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel (meist Methanol oder Acetonitril), dem zur Erh -
hung der Polarität ein bestimmter Wasseranteil (evtl. mit Zusatz von Salzen:
Puffersysteme zur Einstellung eines erwünschten pH-Wertes) beigemischt wird.
Bei der Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels sind
viele Aspekte zu erwägen, auf die hier nicht eingegangen werden soll. Bei
Standardtrennungen ist meist Acetonitril die bessere Wahl (warum ?).
Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein und darf insbesondere keine
organischen Verunreinigungen enthalten (deshalb niemals Wasser verwenden,
das lediglich mit Ionenaustauschern entionisiert wurde). Solche Verunreinigun-
gen werden auf RP-Phasen zunächst stark retardiert (adsorbiert), und erschei-
nen dann oft unerwartet (besonders gegen Ende eines Gradientenlaufes) als
"Geisterpeaks" in einem Chromatogramm.
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Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase
enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig
entgast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch:
Vakuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in
Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium
mischbar sind, ab).
Ganz wichtig ist auch, daß die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei von
Partikeln (z.B. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr
feinen Einlaßfritten (2 µm) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die
Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder
der Gebrauch von Einlaßfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist
bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es
muß sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wäs-
serige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Nie-
mals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach
Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pum-
pen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im
Laufe der Zeit auskristallisieren !
I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen
Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem
Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < σ < 0,95). Dies ent-
spricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen
H2O im Verlauf der Trennung
Anmerkung:
Man muss sich leider damit abfinden, dass in allen HPLC-Büchern und Arbeits-
anweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben un-
ter Verwendung der definierten Gehaltsgröße ó "Volumenanteil", sondern oft
nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.B. oft: "Methanol/Wasser
50:50" oder "50% Wasser in Methanol" oder "Methanol 50 proz". Man kann
dann vermuten, dass damit wohl meist der Volumenanteil gemeint ist, weil das
der gängigen Arbeitsweise entspricht.
Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwei Arbeitswei-
sen: Die isokratische Elution und die sog. Gradientenelution.
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I.4.2.1 Die Isokratische-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung
nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis gemischt und entgast und
können dann von z.B. nur einer Pumpe gefördert werden.
- Vorteil: es wird nur einer Pumpe benötigt;
- Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennpro-
blemen oder in der Erprobungsphase eines neuen Eluen-
tensystems muss der Vorratsbehälter der mobilen Pase
häufig gewechselt werden. Erfahrung oder langwierige Er-
probungen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches Elu-
entengemisch zu optimieren (Zeitaufwendig !!).
I.4.2.2 Die Gradienten-Elution
Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung!
Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus zwei, von
ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw. vier Be-
standteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zusam-
mensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden. Auf
diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, konkav,
stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausreichend.
- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennpro-
blemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von
Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen;
- Nachteil: es werden oft zwei Pumpen (Hochdruckgradient) benötigt;
Erfahrungen im Gradientendesign sind nötig. So muß man
z.B. wissen, daß Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung
von Gradienten nicht optimal sind, weil die Mischungsreak-
tion stark exotherm ist, sowie eine Volumenverminderung
und eine Viskositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt.
Gemische aus Acetonitril und Wasser sind in dieser Hin-
sicht viel unproblematischer.
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I.5 Die Pumpen
I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem
Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der
Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wich-
tigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien ge-
nannt:
§ Es muß eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit ge-
währleistet werden.
Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und
damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig.
§ Es muß ein möglichst pulsationsfreier Fluß gewährleistet werden, weil
sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die
stationäre Phase schädigen können.
Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt,
dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung
durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmtem Wert
hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon würde der
Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen
der stationären Phase (< 5 µm) auch viel zu hoch werden. Deshalb erfolgen
LC-Trennungen im analytischen Maßstab (Trennsäulenlängen: bis 250 mm;
Durchmesser bis 4 mm) bei Fließgeschwindigkeiten im Bereich zwischen 1 und
I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme
Hydraulik-Flüssigkeit
Membran
Kolben
Einlaßventil
Auslaßventil
Kolben
Abb. 3: Kolbenpumpe Abb. 4: Diaphragmapumpe
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I.6 Die Injektionseinheit
I.6.1 Der automatische Probengeber (Auto-sampler)
Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Pro-
bengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen
Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der
außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges.
I.6.2 Die manuelle Injektion
Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, emp-
findliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Ver-
bindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten
Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die
technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionweise muss man sich in ge-
eigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines Auto-
samplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen sein,
seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beachtung
genannt:
§ Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen.
§ Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden.
Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe
dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet
werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt wer-
den.
§ Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-Stellung,
der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es
sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpak-
kung schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des ge-
samten Systems zum Ansprechen bringt.
§ Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen wer-
den, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.
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I.7 Der Detektor
Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Die Wahl eines geeig-
neten Detektors ist abhängig von der Art der zu trennenden und zu bestimmen-
den Substanzen und von der Art der Begleitsubstanzen, deren eventuelle An-
wesenheit man erkennen will. Es gibt eine Vielzahl von Detektionsverfahren.
Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder sichtbarer Strahlung beruhen,
haben einen großen Einsatzbereich. Viele organische und anorganische Mole-
küle (Aromaten, Carbonylverbindungen, Komplexe) absorbieren im mittleren
UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen Absorptionskoeffizienten
(Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht ausreicht, kann man auch in das
kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann allerdings ist die Verwendung
von Eluenten mit Eigenabsorption ausgeschlossen. So muss man z.B. sehr
sauberes Acetonitril an Stelle von Methanol verwenden, um auch noch bei ei-
ner Wellenlänge von 190 nm messen zu können.
Spalt
Deuteriumlampe
Gitter
Flußzelle
Abb. 5: Schematische Darstellung eines Variablen-Wellenlängen-
Detektors (VWD-Detektor)
Anstelle eines gewöhnlichen VWD-Detektors (Abb. 5) kann auch ein spezielles,
computerunterstütztes Spektrophotometer, der Photodioden-Array-Detektor
(DAD) mit sog. „inverser Optik“ eingesetzt werden (siehe Abb. 6). Die Be-
zeichnung „inverse Optik“ bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, son-
dern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch
die Flußzelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale
Lichtfächer fällt dann auf das Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen
(100 - 1000) lichtempfindlichen Photodioden, welche nebeneinander angeord-
net sind. Diese Dioden werden elektronisch in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) kon-
tinuierlich ausgelesen und daraus eine Vielzahl von UV-Spektrum generiert.
Der DAD-Detektor ist somit in der Lage, während einer chromatographischen
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Trennung die kompletten UV-Spektren der Peaks zu registrieren und abzuspei-
chern.
Dies ist besonders wichtig zur Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-
Purity-Check) und zur Ermittlung optimaler Detektionswellenlängen bei der
Untersuchung unbekannter Proben.
Deuteriumlampe
Gitter
Spalt Photodioden
Flußzelle
Abb. 6: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors
(DAD-Detektor)
Beim Einsatz eines UV-Detektors (bei anderen, komplizierteren Detektoren erst
recht) sind mehrere Punkte zu beachten, die hier nur kurz angesprochen wer-
den:
§ Lampenart (Hg, Wolfram, Deuterium), Wellenlängenbereich und Lebens-
dauer, feste Wellenlänge, variable Wellenlänge, DAD.
§ Volumen der Detektorzelle, das Peakvolumen und die Bandenverbreiterung:
- Als Peakvolumen wird das während der Elution des Peaks geförderte
Volumen bezeichnet. Es ist berechenbar aus der Basisbreite des Peaks
und der Fließgeschwindigkeit. Es ist einzusehen, dass das Volumen der
Detektorzelle viel kleiner sein muss als das Peakvolumen, denn sonst
würden sich (im Extremfall) bereits getrennte Peaks in der Detektorzelle
wieder vermischen. Zumindest kann ein zu großes Zellvolumen erheblich
zur Bandenverbreiterung beitragen.
- Das Peakvolumen steigt mit der Retentionszeit und dem k-Wert eines
Peaks (Substanz). Deshalb ist gerade für früh eluierende, schmale Pe-
aks mit kleinen Peakvolumina das Zellvolumen eine kritische Größe.
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 15
§ Die Empfindlichkeit eines Detektors hängt von Art, Typ und Hersteller ab
und kann meist in einem weiten Bereich eingestellt werden.
I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software
Bei neueren HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Proben-
aufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem Rech-
ner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Darstel-
lung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach Auf-
nahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Bear-
beitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen pas-
senden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei de-
nen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt, über-
nimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der Chro-
matogramme (heute nicht mehr gebräuchlich).
Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration)
wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Vorausset-
zung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen
Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie
konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlap-
pende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der
Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die
Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um
Störpeaks zu beseitigen.
Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog. Peak-
verarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus den
Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wich-
tigsten Peakverarbeitungsparameter sind:
- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der
ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten
interessierenden Peaks.
- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest (Peakerken-
nungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn) bzw.
negative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwan-
kungen der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur Peaker-
kennung durch die Software.
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I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD)
In der HPLC ist es von großer Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen
Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Be-
dingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten er-
lauben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei ex-
akt symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herange-
zogen werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge
der zu analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der
Konzentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten ab-
hängig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Kon-
zentration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder
Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-
zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-
barer Korrekturfaktor verwendet werden.
I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers
Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchen-
den Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den
sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard
eingesetzt werden soll, muß aber unbedingt einige wichtige Bedingungen er-
füllen:
§ sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-
kommen.
§ sie muß chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kom-
ponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der
Säule und der verwendeten mobilen Phase.
§ sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.
§ sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften
(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestim-
mende Substanz verfügen.
§ sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den
chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in ver-
gleichbarer Konzentration zugesetzt werden.
Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den
genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine
Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 17
ähnlichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, läßt sich
für jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr
und fi nach folgenden Zusammenhängen ermitteln:
fi = i
i
ma fi = Response-Faktor der
Komponente i
ai = Fläche der Substanz i
mi = Masse der Komponente i
KFi = i
Tr
f
f = K
iKTr
KTr
Ki
am
am
⋅⋅ KFi = Kalibrierfaktor der
Komponente i
fTr = Response-Faktor
desTracers
miK = Masse der Komponente i in
der Kalibrierlösung (K)
mTrK = Masse des Tracers in der
Kalibrierlösung (K)
aTrK = Fläche des Tracers in der
Kalibrierlösung (K)
aiK = Fläche der Komponente i in
der Kalibrierlösung (K)
m xi = KFi ⋅⋅
xTr
xi
a
amTr
m xi = Masse der Komponente i in
der Probenlösung (X)
m xTr = Masse des Tracers in der
Probenlösung (X)
a xi = Fläche der Komponente i
a xTr = Fläche des Tracers
Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und glei-
cher Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus
der Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten
nach Formel (3) ermitteln.
(1)
(2)
(3)
Seite 18 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04
I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil
1.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu
Normal-Phasen aufweisen.
2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.
3.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe ?
4) Welchem Ordnungsprinzip folgt die Eluotrope Reihe im Hinblick auf Po-
larität und Elutionskraft des Eluenten ?
5) Für welches Adsorbens gelten Eo-Werte ?
6) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?
7) Nennen Sie mindestens zwei mögliche Arten der Eluentenentgasung.
8) Worin betsteht der Unterschied zwischen einem binären und einem ter-
nären Gradienten ?
9) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer
aufweisen muß.
10) Wie ist der Kalibrierfaktor einer Komponente i definiert ?
11) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip
eines VWD-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläutern sie in diesem
Zusammenhang der Ausdruck: „Inverse Optik“.
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 19
II Experimenteller Teil
HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken(Kaffee und Energy-Drinks) mit der Metodedes Internen Standards
II.1 Einleitung
Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psycho-
pharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Sub-
stanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen
Krämpfe auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen,
die vorwiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.B. bei Coffein
diuretische, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Re-
gel keine bleibenden organische Schädigungen.
Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7-
Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und The-
obromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle drei
genannten Xanthinderivate kommen in Teeblättern
vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und in der
Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in Teeblät-
tern ist Coffein gegenüber den beiden anderen
Xanthinderivaten der Hauptbestandteil.
N
NN
N
O
O
CH3
CH3
CH3
Coffein
Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentra-
tionen von 85 - 250 mg/L enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach spezi-
ellen Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentra-
tion (ca. 350 mg/L) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2-
Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthal-
ten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" ver-
helfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksam-
keit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 mL Energy Drink
hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der
übrigen Bestandteile eher spekulativ.
Seite 20 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04
II.2 Durchführung
II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen
Coffein-Stammlösung (Lösung A):
10 mg Coffein (27600 Fluka � 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen
(Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysen-
systeme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend
wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkol-
ben überführt und mit H2O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der
Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird
beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml] ! ).
25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z
276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysensysteme
GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das
Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben über-
führt und mit Acetonitril (HPLC –Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt
Baker, D-64347 Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Mess-
kolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird be-
schriftet (Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml] ! ).
II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung
Herstellung der Eichlösung C:
Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany)
werden je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen
zusammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze
vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel ver-
schlossen und 10 s ultrabeschallt (Durchmischung) und beschriftet.
Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze
(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels
einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x
Tracer-Stammlösung (Lösung B):
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 21
11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die
Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach
oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil
Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Mache-
rey-Nagel, D-52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig !
durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst.
Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet
(Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentratio-
nen angeben !
II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen
Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1):
Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung wer-
den mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen
überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es
wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s ultrabeschallt. Filtration
analog Lösung C.
Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2):
700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden
mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein
Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen
und 10 s ultrabeschallt. Filtration analog Lösung C.
Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3):
700µl (Transfepette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden
mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein
Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen
und 10 s ultrabeschallt. Filtration analog Lösung (C).
Seite 22 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04
II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Säule:
Phenomenex Luna© C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm
Vorbereitung:
Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H2O
[Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC –Ultra-Gradient-Grade
9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D-64347 Griesheim, Germany] bestückt wurde,
wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditio-
niert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingun-
gen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence
mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) ver-
messen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenom-
men, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard über-
haupt verwendet werden kann.
II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung
A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein.
B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen).
C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte Gra-
dientenprogramm angeben 10% B → 95% B in 20 min.
B
C
A
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II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens
D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein.
II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung
E : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein.
F : Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.
D
E
F
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II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten
G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0°C ein.
II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter
H : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein.
I : Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.
G
H
I
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II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers
J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die
Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abge-
arbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ).
Unter „Inj/Location“ ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeu-
tet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll.
Tragen sie unter der Rubrik „Sample Info“ die jeweiligen Vialkon-
zentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein.
II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence
K : Starten sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die Analysense-
quence, nachdem sie die Proben in den Probenteller des Auto-
samplers gestellt haben.
J
K
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II.2.3 Die quantitative Auswertung
II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis
L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter
dem Menüpunkt „Data Analysis“. Hier können u.a. die Integrations-
parameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als
auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot
etc.) durchgeführt werden.
II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle
M : Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie
die „Calibration Table“. Geben sie unter der Rubrik „Compound“
für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein.
N : Geben sie in der der Spalte „Amt (=Amount !)“ die Vialkonzentrati-
on der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in der Spalte
ISTD mit „YES“. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode drucken
sie mit „Print“ die Tabelle aus und schließen mit „OK“ ab.
L
NM
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 27
II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes(ISTD-Report)
O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben
(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme
der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes Chromato-
gramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen sie
den Menüpunkt „Specify Report“ aus. Im Fenster „Destination“
wählen sie „Printer“, im Fenster „Style“ wählen sie „Short“ aus.
Unter der Rubrik „Quantitative Results“ muss „ISTD“ aktiviert sein.
Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit dem
Kommando „Print Report“ kann danach jeweils der spezifische
quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie diesen
Report für jedes Chromatogramm aus.
O
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II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil
1.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)
von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit tm des chromatographi-
schen Systems.
2.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen
Phase um in [cm/min].
3) Welche Geräteparameter tragen zur Beeinflussung der Durchbruchszeit
im Wesentlichen bei (nennen sie 2 Beispiele) ?
4) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie
das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.
5) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.
6) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen
Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.
7) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentrationen
an Coffein in [mg/ml] in den untersuchten Probenlösungen (Caffee-
8) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz
Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-
sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin.
9) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum
Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit).
10) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor ein-
schätzen (Begründung) ?
11) Was verstehen sie unter dem Ausdruck Isoplot ?
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2003/04 Seite 29
III Auswertung Theoretischer Teil
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IV Auswertung Experimenteller Teil
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Abgabe-Bogen / Gruppe
Name Vorname
Bemerkungen:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Testat erteilt am
durch