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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
Tesi di Laurea Sperimentale in
FARMACOLOGIA
Nuovi peptidi antimicrobici
membranolitici: studi di citotossicità e
interazione con membrane modello
Laureanda: Relatore:
Francesca Grazioli Prof.ssa Sabrina Pacor
Correlatori:
Dott.ssa Filomena Guida
Dott. Tomislav Rončević
Anno Accademico 2017 – 2018
1
INDICE
1. INTRODUZIONE ................................................................................. 3
1.1 PEPTIDI ANTIMICROBICI ................................................................................................ 5
1.2 MECCANISMO D’AZIONE ............................................................................................... 8
1.2.1 BARREL-STAVE MODEL (Figura 1.4)..................................................................... 10
1.2.2 CARPET MODEL (Figura 1.5) ................................................................................ 11
1.2.3 TOROIDAL-PORE MODEL (Figura 1.6) .................................................................. 12
1.3 RESISTENZA BATTERICA............................................................................................... 14
1.4 SINTESI AMPs .............................................................................................................. 16
1.5 PROSPETTIVE FUTURE ................................................................................................. 17
1.6 PEPTIDI DERIVANTI DA RANE ...................................................................................... 22
1.6.1 KIADINE ............................................................................................................... 24
1.6.2 PEPTIDI SERIE P .................................................................................................... 30
2. SCOPO DELLA TESI ........................................................................ 33
3. MATERIALI E METODI .................................................................. 35
3.1 LINEE CELLULARI .......................................................................................................... 36
3.1.1 MEC-1 .................................................................................................................. 36
3.1.2 HaCat ................................................................................................................... 36
3.1.3 MCF-7 .................................................................................................................. 37
3.2 TAMPONI E TERRENI ................................................................................................... 37
3.2.1 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN SOSPENSIONE ........................................ 37
3.2.2 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN ADESIONE .............................................. 38
3.2.3 PBS: PHOSPHATE BUFFERED SALINE ................................................................... 38
3.3 ISOLAMENTO DI MONOCITI ........................................................................................ 38
3.4 GENERAZIONE DI MDM ............................................................................................... 39
3.5 ISOLAMENTO DI LINFOCITI .......................................................................................... 40
3.6 CONTA CELLULARE ...................................................................................................... 41
3.7 TEST MTT ..................................................................................................................... 43
3.8 SPETTROFOTOMETRO ................................................................................................. 45
3.9 TEST DI APOPTOSI/NECROSI........................................................................................ 46
3.9.1 PROTOCOLLO DEL TEST ....................................................................................... 49
2
3.10 CITOFLUORIMETRO E ANALISI DEI DATI ...................................................................... 49
3.11 LIPOSOMI .................................................................................................................... 52
3.11.1 PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI ............................................................................ 53
3.12 BIACORE ...................................................................................................................... 54
4. RISULTATI E DISCUSSIONE ......................................................... 57
4.1 STUDI DI CITOTOSSICITÀ – TEST MTT .......................................................................... 59
4.1.1 MEC-1 – SERIE P .................................................................................................. 59
4.1.2 MEC-1 – CLARKINE .............................................................................................. 61
4.1.3 MEC-1 – KIADINE ................................................................................................. 62
4.1.4 MCF-7_ADR – SERIE P .......................................................................................... 64
4.1.5 HaCat – P1 e P6 ................................................................................................... 65
4.1.6 MONOCITI – P1 e P6 ............................................................................................ 66
4.1.7 LINFOCITI – P1 e P6 ............................................................................................. 67
4.1.8 MACROFAGI – P1 e P6 ......................................................................................... 68
4.1.9 ASSOCIAZIONE P1-P6 .......................................................................................... 70
4.2 MECCANISMO D’AZIONE ............................................................................................. 73
4.2.1 EFFETTO DEL TRATTAMENTO SULLA MORFOLOGIA CELLULARE ........................ 73
4.2.2 ANALISI DEL DANNO – APOPTOTICO O NECROTICO ........................................... 75
4.2.3 EFFETTO DEL PEPTIDE IN TERRENO COMPLETO ................................................. 77
4.3 STUDI DI INTERAZIONE CON MEMBRANE MODELLO– SURFACE PLASMON
RESONANCE ............................................................................................................................. 79
5. CONCLUSIONI .................................................................................. 93
GLOSSARIO ............................................................................................. 96
BIBLIOGRAFIA ....................................................................................... 98
RINGRAZIAMENTI .............................................................................. 104
4
Dalla scoperta della penicillina nel 1928 da parte di Fleming a oggi, molti sono gli
antibiotici ad essere stati identificati e impiegati, sia di origine naturale che sintetica.
Tuttavia, negli ultimi 20 anni, la scoperta di nuovi antibatterici ha subito un notevole
rallentamento, a discapito del costante e sempre maggiore bisogno di nuove molecole
capaci di combattere i microorganismi patogeni. Inoltre, la costante pressione selettiva e
la capacità del microbioma di evolvere, rende fondamentale lo sviluppo di nuovi
antibiotici e terapie. Infatti, gli organismi acquistano la capacità di resistere all’azione di
sostanze esogene che perdono la capacità di indurre danno o di causare la morte dei
microorganismi, portando così all’inefficacia degli ormai consolidati trattamenti.
Questo fenomeno ha un pesante impatto nella comunità mondiale ed è noto come
farmacoresistenza. [1]
Questo crescente bisogno ha spinto la ricerca verso nuove molecole, tra queste spiccano
i peptidi antimicrobici (AMPs – antimicrobial peptides o HDPs – host defense peptides)
grazie al loro potenziale terapeutico. Negli ultimi decenni sono stati identificati più di
2000 AMPs prodotti da diverse classi di organismi (animali, funghi, piante, batteri).
Nonostante questi peptidi siamo molto simili tra loro sia nella struttura che in altre
caratteristiche intrinseche alla molecola, differiscono invece per sequenza, meccanismo
molecolare d’azione e target. Oltre ad un effetto antimicrobico, è noto che queste
molecole abbiano attività immunomodulatoria, attività anti-biofilm e anticancerogena.
[2]
5
1.1 PEPTIDI ANTIMICROBICI
Gli AMPs sono molecole a basso peso molecolare, solitamente cariche positivamente.
Hanno sia un dominio idrofilico, che un dominio idrofobico, che facilità la solubilità
della struttura in mezzi acquosi e ne permette inoltre il passaggio attraverso membrane
lipidiche. [3] Gli AMPs in natura sono prodotti sia da traduzione dell’mRNA ad opera
del ribosoma, sia mediante sintesi non ribosomiale. I peptidi che vengono sintetizzati
attraverso questo meccanismo sono prodotti per la maggior parte nei batteri, mentre il
resto delle specie utilizza il meccanismo che coinvolge il ribosoma. Molti AMPs sono
prodotti come precursori inattivi e richiedono attivazione mediante proteolisi. [4]
Malgrado sia una classe piuttosto eterogenea di peptidi e la classificazione risulti
controversa, è tuttavia possibile identificare alcune caratteristiche comuni al fine di
creare una possibile suddivisione.
Una prima classificazione può essere fatta in base alla struttura secondaria/terziaria dei
peptidi. In questo modo vengono distinti quattro gruppi di AMP [5] [6] Figura 1.1:
α-elica anfipatica
β-foglietto
extended
forcella-β o loop/ random coil
Figura 1.1 – Rappresentazione grafica della struttura di peptidi antimicrobici appartenenti ai quattro gruppi: A-
alfa elica (maganina-2); B- beta foglietto (defensina); C- extended (indolicidina); D- loop (microcina) [7]
6
Quelli ad alfa elica assumono questa particolare conformazione in presenza sia di
membrane modello che di membrane naturali a causa delle loro caratteristiche
anfipatiche . Al contrario, quando poste in ambiente acquoso, tendono ad essere meno
stabili e a destrutturarsi. Es: melittina e LL-37.
Quelli a beta foglietto sono caratterizzati dalla presenza di due o più regioni a beta
foglietto stabilizzate da ponti disolfuro. Es. alfa-beta-gamma defensine.
Gli extended sono ricchi in glicina, arginina, istidina e non presentano una struttura
secondaria. Esempi: indolicidina, istatina, drosocina.
Quelli a loop hanno invece una struttura a forcella interconnessa da un beta turn di tipo
II. (Figura 1.2) Questa classe di peptidi è particolarmente stabile perché presenta dei
ponti disolfuro tra i beta strand. Alcuni esempi: tachiplesina, bactenecina.
Figura 1.2 - Rappresentazione grafica di un beta turn di tipo I e un beta turn di tipo II [8]
I peptidi sono attivi nei confronti di diverse classi di microorganismi patogeni, quali
batteri, virus e funghi. Esibiscono al contempo diverse attività, per cui la suddivisione in
classi non è così netta come mostrata in Figura 1.3. La maggior parte ha una diretta
attività contro batteri (AMPs – antimicrobial peptides), specialmente di origine
planctonica. Mostrano inoltre attività nei confronti di complessi organizzati di batteri,
quali biofilm (ABPs – antibiofilm peptides) e nei confronti di virus (AVPs – antivirus
peptides). Sono capaci inoltre di reclutare indirettamente il sistema immunitario (HDPs
– host defence peptides). Inoltre i CPPs (cell-penetrating peptides) possiedono la
7
capacità di traslocare all’interno della membrana trasportando piccole molecole (ad
esempio anche altri peptidi). [9]
Figura 1.3 – Rappresentazione schematica delle diverse attività dei peptidi [9]
I parametri chiave per avere una selettività nei confronti dei batteri sembrano essere
l’idrofobicità della molecola e la carica netta positiva: quando queste due caratteristiche
sono bilanciate sembra manifestarsi l’attività antimicrobica. La selettività di queste
molecole non dipende esclusivamente da queste caratteristiche, ma sembra riguardare
anche altri parametri, quali la dimensione della molecola, la sua struttura e la sua
capacità di aggregazione in soluzione o a contatto con le membrane. [10]
Tra i vari AMPs, benché appartengano alla stessa famiglia o siano isolati dagli stessi
organismi, sembra che sia più conservato l’aspetto funzionale, piuttosto che una
specifica sequenza amminoacidica. Molti AMPs non contengono acido aspartico o
acido glutammico, ma piuttosto amminoacidi cationici come lisina o arginina. [11]
Inoltre la glicina si trova frequentemente in posizione C-terminale o N-terminale come
“capping-agent”, per stabilizzare l’alfa elica e proteggerla da amino o carbossipeptidasi.
[12]
Nonostante l’idrofobicità faciliti la permeabilizzazione della membrana, se troppo
elevata può determinare sia la perdita dell’attività antimicrobica del peptide sia una
maggiore citotossicità. Questo perché peptidi che hanno una grande porzione idrofobica
sono meno solubili in soluzione acquosa e tendono quindi a interagire anche con le
8
membrane delle cellule eucariotiche. Un parametro correlato alla idrofobicità e
all’anfifilicità è l’angolo polare (Φ): misura la proporzione tra parte polare e parte non
polare di un peptide. In un ipotetico peptide ad alfa elica composto da residui idrofobici
su un lato e residui idrofilici dall’altro, l’angolo polare dovrebbe essere di 180°. Questo
parametro influenza inoltre la stabilità dell’interazione peptide-membrana. [11] Molti
peptidi naturali ad alfa elica hanno un angolo polare di 140°-180°. [12]
1.2 MECCANISMO D’AZIONE
Per quanto riguarda i peptidi antimicrobici, parlare di un solo meccanismo d’azione può
risultare alquanto riduttivo. Ad oggi, sono stati infatti scoperti diversi possibili
meccanismi d’azione che rendono ancora più interessante il loro possibile utilizzo come
nuova classe farmacologica.
Secondo Brogden et al. [13] l’uso del microscopio ha dato un contributo
nell’identificazione di alcuni dei diversi target cellulari, spingendoci ad affermare che
non hanno tutti lo stesso target o lo stesso meccanismo d’azione. In alcuni casi al danno
cellulare non segue immediatamente la morte dell’organismo, portando perciò a
ipotizzare che il danno alla membrana non sia direttamente correlato al killing, ma che
vi siano altri meccanismi intracellulari che vengano attivati. In altri casi invece, la morte
dell’organismo appare come diretta conseguenza del danno cellulare.
Gli studi di interazione con membrane modello hanno mostrato che esiste una
correlazione tra struttura primaria del peptide e attività, cosa che diventa estremamente
rilevante quando si tratta di disegnare e sintetizzare peptidi ab initio. Sapendo infatti che
a una certa composizione amminoacidica corrisponde probabilmente una certa attività, i
peptidi possono essere sintetizzati partendo dal loro probabile target molecolare, in
contrapposizione ai vecchi metodi dove si valutava prima l’effetto, per poi ricercare il
target molecolare. Questo permetterebbe dunque un’importante ottimizzazione del
processo di sviluppo e produzione di queste nuove molecole.
9
Un’altra tecnica molto usata riguarda il monitoraggio dei canali voltaggio dipendenti
presenti nelle membrane cellulari. La capacità dei peptidi di legarsi ed attraversare il
doppio strato fosfolipidico viene indagata misurando il voltaggio di una corrente che si
genera in seguito alla formazione di un poro.
Tra i vari AMPs sembrano esistere degli step comuni che portano alla morte della
cellula batterica, indipendentemente dallo specifico meccanismo d’azione del peptide e
dal tempo richiesto per questo.
Per prima cosa i peptidi vengono attratti dalla membrana batterica. L’attrazione sembra
di tipo elettrostatico: peptidici antimicrobici cationici vengono attratti dalla carica
negativa della membrana esterna dei batteri Gram negativi e dagli acidi teicoici presenti
sulla superficie dei Gram positivi.
Una volta che i peptidi vengono attratti, nei Gram negativi per prima cosa devono
attraversare l’LPS per poter interagire con la membrana esterna, mentre nei Gram
positivi devono attraversare lo spesso strato di peptidoglicano. Dopodiché, quando
interagiscono con il doppio strato fosfolipidico, lo fanno in due modi distinti: quando la
concentrazione dei peptidi è bassa, questi vengono legati parallelamente rispetto al
doppio strato fosfolipidico (S state). Quando invece è alta, i peptidi iniziano a orientarsi
perpendicolarmente (I state) e a inserirsi nella membrana formando dei pori.
La concentrazione del peptide alla quale si osserva lo stato I varia in base al tipo di
peptide e alla composizione del lipide.
Sono stati proposti modelli diversi per spiegare il meccanismo di permeabilizzazione
della membrana. Possono essere così riassunti:
10
1.2.1 BARREL-STAVE MODEL (Figura 1.4)
Figura 1.4 - Rappresentazione schematica del barrel-stave model [13]
La polimerizzazione sulla membrana di più alfa eliche porta alla formazione di un
complesso proteico che crea un’interruzione nella continuità della membrana
plasmatica, detto poro. La parte idrofilica del peptide delimita il centro del poro, mentre
la parte idrofobica è posta a contatto con i fosfolipidi.
11
1.2.2 CARPET MODEL (Figura 1.5)
Figura 1.5 - Rappresentazione schematica del carpet model [13]
I peptidi si dispongono parallelamente al doppio strato fosfolipidico e lo rivestono
completamente. Ad alte concentrazioni, i peptidi sono portati a distruggere il doppio
strato attraverso un’azione simil-detergente, che può portare anche alla formazione di
micelle.
12
1.2.3 TOROIDAL-PORE MODEL (Figura 1.6)
Figura 1.6 - Rappresentazione schematica del toroidal-pore model [13]
Secondo questo modello i peptidi si inseriscono all’interno del doppio strato forzando i
fosfolipidi a curvare verso l’interno del poro, portando alla formazione di un’apertura di
forma toroidale. Il tipo di poro differisce da quello che si forma secondo il modello
barrel-stave: in questo caso l’interno non è delimitato solamente dai peptidi, ma questi
si inseriscono all’interno del doppio strato facendo in modo che il core sia delimitato sia
dai peptidi che dalla testa idrofilica dei fosfolipidi. La parte polare del peptide è infatti
associata alla parte polare dei fosfolipidi e insieme delimitano il centro del poro.
13
I tre modelli, utilizzati per spiegare l’interazione del peptide con la membrana, non
devono essere arbitrariamente considerati come meccanismi d’azione separati. Essendo
l’interazione peptide-fosfolipide un’interazione di tipo dinamico, appaiono tra loro
correlati e in continua transizione.
I peptidi antimicrobici, oltre alla capacità di interagire con la membrana e portare alla
morte per lisi cellulare, possono causare il killing batterico agendo su target, sia intra
che extracellulari (Figura 1.7).
Figura 1.7 - Rappresentazione schematica dei possibili meccanismi d’azione intracellulari [13]
14
Gli AMPs possono portare, ad esempio, all’attivazione di fosfolipasi e autolisine, come
ad esempio la N-acetilmuramoil-L-alanina amidasi in Staphylococcus simulans.
Alcuni AMPs, come PR-39, possono inibire la formazione del setto e bloccare la
divisione cellulare, provocando così un allungamento della cellula. Altri inibiscono la
biosintesi del peptidoglicano, e dunque la sintesi della parete cellulare, interferendo con
la transglicosilazione. Altri ancora si legano a DNA e RNA. Alcuni bloccano l’uptake di
timidina, uridina e leucina, inibendo così la sintesi di DNA, RNA e proteine.
Per quanto riguarda l’attività degli AMPs un concetto fondamentale è rappresentato
dalla loro selettività nei confronti delle membrane delle cellule batteriche. In condizioni
fisiologiche, sembra che le cellule eucariotiche non siano sensibili all’azione dei peptidi
antimicrobici. È interessante notare che però, allo stesso tempo, le cellule tumorali
sembrano essere più suscettibili, presumibilmente a causa di un’elevata espressione di
molecole anioniche, quali fosfatidilserina, mucine O-glicosilate, gangliosidi sialilati ed
eparan-solfati. Questa alterazione nella composizione lipidica porta ad una parziale
perdita della asimmetria della membrana cellulare e ad un conseguente aumento del
potenziale negativo di membrana. [11]
1.3 RESISTENZA BATTERICA
Il legame peptide-fosfolipide sembra non essere specifico: essendo un’interazione di
tipo elettrostatico dipende in primis dall’attrazione tra carica positiva del peptide e
carica negativa della membrana dei batteri. Inoltre il peptide riesce a penetrare la
membrana grazie al fatto di avere una struttura anfifilica. Per questi motivi i batteri non
sembrano aver sviluppato molti meccanismi di resistenza, come accade invece per altre
molecole quali gli antibiotici di uso clinico. [3]
Nonostante questo, alcuni studi hanno evidenziato delle strategie che i microorganismi
col tempo hanno adottato per difendersi dall’attacco dei peptidi antimicrobici.
15
I diversi meccanismi di resistenza possono essere così riassunti:
Alterazione della carica della membrana
Lo Staphylococcus aureus esterifica la D-alanina all’acido teicoico: l’aggiunta di un
ammino gruppo basico porta così alla riduzione della carica netta negativa del gruppo
fosfato dell’acido teicoico, con conseguente alterazione della carica della membrana.
Inoltre, grazie a MprF (multiple peptide resistance factor), che codifica per LPG-
sintetasi (lisilfosfatidilglicerolosintetasi), aumenta la sintesi di LPG: un fosfolipide
basico contentente L-lisina. Questo porta ad un aumento della carica netta positiva con
conseguente effetto elettron-repulsore per i peptidi carichi positivamente.
In Salmonella typhimurium la carica negativa della membrana viene ridotta alterando la
composizione del lipide A dell’LPS (Figura 1.8): il gruppo fosfato della glucosamina I
(GLcN I) è sostituito da un residuo di fosforiletanolamina con un aminogruppo libero,
mentre al gruppo fosfato della glucosamina II (GlcN II) viene aggiunto
aminoarabinosio.
Figura 1.8 - Rappresentazione schematica del lipide A (in blu) [14]
16
Alterazione del Lipide A
Sempre in Salmonella typhimurium, la fluidità della membrana viene diminuita
aumentando il numero delle code aciliche del lipide A. Questo porta ad un aumento
delle interazioni idrofobiche tra le code e quindi ad una maggior rigidità della
membrana.
Alterazione delle proteine di membrana
In alcuni batteri Gram negativi, proteine mutate espresse nella membrana esterna
aumentano la resistenza verso i peptidi antimicrobici.
Ruolo dei trasportatori
I trasportatori che sono stati associati ad un aumento della resistenza sono quelli
appartenenti alla famiglia delle ABC (ATP Binding Cassette) che importano i peptidi
nella cellula favorendone la proteolisi, e quelli della famiglia RND (Resistance-
Nodulation-Division) che mediano invece l’efflusso dei peptidi.
Enzimi proteolitici
Grazie a questi enzimi i batteri possono degradare i peptidi. Lo S. aureus ad esempio
produce una metalloproteinasi denominata aureolisina capace di inattivare LL-37.
1.4 SINTESI AMPs
I peptidi antimicrobici vengono sintetizzati seguendo diverse tecniche [15]:
Sintesi biologica: sintesi in vitro o in vivo nella quale vengono utilizzati DNA
plasmidico o frammenti di DNA che codificano per il peptide di interesse.
Questo approccio risulta il più costoso per quanto riguarda una produzione su
larga scala. Richiede inoltre più passaggi di purificazione dato che attraverso
questa tecnica viene prodotto un complesso mix di peptidi.
Sintesi chimica: tecnica più utilizzata perché permette l’incorporazione di
componenti non-naturali. Le metodologie più comunemente utilizzate sono:
17
SPS (solution-phase synthesis): tecnica poco costosa nella quale gli
intermedi di reazione possono essere analizzati e purificati in ogni fase
del processo di sintesi. Risulta però essere un processo lungo e
complesso.
SPPS (solid-phase peptide synthesis): tecnica basata sull’accoppiamento
di amminoacidi protetti su un supporto insolubile. Tecnica adeguata per
una produzione su larga scala, anche se richiede molti materiali di
partenza.
Semi-sintesi: tecnica che combina sintesi biologica e sintesi chimica. Il peptide
biologicamente prodotto mediante tecnologia ricombinante viene
successivamente modificato attraverso metodi chimici/enzimatici.
Oggigiorno la sintesi è preceduta da studi di bioinformatica, mediante i quali, attraverso
database dedicati e algoritmi computazionali, si riescono ad avere informazioni
dettagliate riguardo punto isoelettrico, carica, coefficiente di estinzione e idrofobicità
del peptide. In questo modo si riesce a prevedere il comportamento del peptide con una
certa precisione.
1.5 PROSPETTIVE FUTURE
I peptidi antimicrobici presentano numerosi vantaggi. Molti AMPs, oltre alla loro
attività antimicrobica, intervengono nella modulazione del sistema immunitario:
inducono o inibiscono il rilascio di citochine e chemochine da differenti tipi cellulari.
Inoltre esibiscono un’attività chemotattica nei confronti di cellule del sistema
immunitario innato e adattativo. Possono essere quindi usati come immunomodulatori
per potenziare l’immunità. [16]
Gli AMPs permettono inoltre un’uccisione rapida e multitarget, portando a una minor
comparsa di fenomeni di farmaco resistenza. Presentano un ampio spettro d’azione:
hanno attività antibatterica, antivirale, antifungina e antiparassitaria (ad esempio nei
confronti di plasmodium, trypanosoma e leishmania) [17].
18
Per implementare l’efficacia di queste molecole, la ricerca si sta focalizzando sulla
possibilità di utilizzarle in co-somministrazione con i classici antibiotici, in modo da
ottenere così un effetto sinergico: si può sfruttare la capacità dei peptidi di
permeabilizzare la membrana batterica per permettere all’antibiotico di entrare nella
cellula più facilmente ed aumentare così la sua concentrazione. [6] Un esempio
esplicativo è riportato in Figura 1.9.
Figura 1.9 – Rappresentazione schematica del sinergismo tra un AMPs e la ciprofloxacina (inibitore DNA girasi). Nell’esempio il meccanismo di resistenza del batterio è rappresentato da una pompa di efflusso. Il peptide permette all’antibiotico di entrare nella cellula e di raggiungere concentrazioni maggiori nel citoplasma, dove è presente il suo
target. [6]
D’altro canto però, ci sono anche degli svantaggi legati allo sviluppo di AMPs come
farmaci. Da un punto di vista commerciale, i costi effettivi di una produzione su larga
scala di AMPs diventano considerevoli. Bisogna tener conto infatti dei costi relativi alla
sintesi e alla selezione. È stato stimato che la produzione di 1g di peptide costa dai 100
ai 600 $ [7].
19
Essendo dotati di un meccanismo d’azione non selettivo, questo può portare allo
sviluppo di tossicità sistemica o locale. Nel loro utilizzo come trattamenti farmacologici
vanno considerate le condizioni fisiologiche in vivo: le concentrazioni di composto che
riescono a raggiungere il sito d’infezione, la presenza di eventuali sistemi proteolitici
inattivanti (lisozima) e le concentrazioni fisiologiche di sali, siero e pH che possono
causarne una diminuzione dell’attività. Inoltre sono stati descritti fenomeni di
sensibilizzazione legati ad un uso ripetuto. Vanno valutate inoltre tutte le variabili
riguardanti la farmacocinetica e la farmacodinamica. [18]
Sfortunatamente, data la loro natura peptidica, gli AMPs vengono riassorbiti dal tratto
gastrointestinale se somministrati per os, mentre c’è la possibilità di scatenare una
risposta immunitaria indesiderata nel caso di somministrazione ev. Per questo motivo,
ad oggi, gli AMPs vengono studiati come formulazioni topiche per il trattamento di
infezioni della pelle o delle ferite. [19]
I punti chiave su cui ci si sta focalizzando per migliorare la produzione di nuovi farmaci
basati sui peptidi antimicrobici riguardano:
Stabilità
Tossicità
Costi di produzione
In Figura 1.10 sono riportate alcune delle strategie che oggigiorno sono adottate per
migliorare i principali problemi legati alla produzione.
Per quanto riguarda la stabilità, per proteggere il peptide dall’azione di proteasi
endogene, si ricorre alla ciclizzazione della struttura, attraverso il collegamento del
dominio N-terminale con il C-terminale. Si può ricorrere inoltre all’introduzione di D-
aminoacidi o aminoacidi non naturali, dal momento che le proteasi riconoscono e
idrolizzano preferenzialmente L-aminoacidi naturali. Un’altra strategia riguarda
l’acetilazione del dominio N-terminale, che conferisce resistenza all’azione delle
proteasi, e/o l’amidazione del dominio C-terminale, che aumenta l’attività antimicrobica
del peptide, diminuendo al contempo l’attività emolitica, riducendo la carica negativa
della molecola. L’introduzione di aminoacidi come lisina o leucina, porta alla
modificazione dell’equilibrio anfipatico, influenzando la conformazione ad alfa-elica e
20
aumentando la stabilità della molecola. La rapida degradazione di AMPs è dovuta alla
presenza di residui cationici, come arginina o lisina, per cui una loro modificazione
porta a proteggere la molecola dall’azione litica della tripsina. Per esempio si possono
introdurre amminoacidi non naturali come N-Arg con la catena laterale spostata sull’N-
terminale per aumentarne la stabilità.
Per quanto riguarda i problemi legati alla tossicità nei confronti delle cellule dell’ospite,
l’idrofobicità e la carica sono utili indicatori e devono essere adeguatamente modulati.
Si può ricorre a peptidi disegnati ex novo target-specifici, come AMPs batterio-selettivi
(adepantina-1 [20]) o peptidi fusi costituiti da un dominio che riconosce il batterio e un
dominio che ha attività battericida. Altre strategie riguardano la nanoincapsulazione del
peptide tramite polimeri (nanosfere) o formulazioni lipidiche (nanovescicole
liposomiali), l’aggiunta di PEG (polietilenglicole) e l’uso di nuovi sistemi per il drug
delivery, come ad esempio l’uso di albumina da siero umano come carrier.
Un altro problema legato alla produzione di AMPs, sono gli eccessivi costi di
produzione. Strategie utili possono essere la riduzione della dimensione del peptide, la
sintesi ex novo e l’uso di metodi di purificazione più economici. Per ridurre la
dimensione del peptide si può ricorrere allo studio del meccanismo d’azione, che porta a
scoprire solo la minima sequenza attiva necessaria all’attività e al legame con il target.
Figura 1.10 - Strategie per lo sviluppo di nuovi farmaci basati sui peptidi antimicrobici [7]
21
Come riporta Brogden et al. [21], i ricercatori stanno adottando nuovi e sofisticati
approcci per superare questi ostacoli, in particolar modo focalizzando la produzione su
peptidi antimicrobici:
Mimetici: AMPs sintetici non peptidici che mimano AMPs naturali
Ibridi: costituiti dalle regioni attive di due o tre AMPs naturali
Congeneri: composti chimici correlati agli AMPs per composizione (ottenuti dal
rilassamento della loro struttura terziaria, dallo scambio di specifici residui
amminoacidici o dal taglio del dominio N-terminale o C-terminale, o dalla
combinazione dei precedenti)
Ciclici e stabilizzati: AMPs ciclici dati dalla congiunzione “head-tail”,
contenenti tre ponti disolfuro formanti un nodo di cisteine
Coniugati: AMPs coniugati con anticorpi specifici o con ligandi di specifici
recettori batterici
Immobilizzati: AMPs incorporati o assorbiti su materiali, quali plastiche, film,
resine
Ad oggi, alcuni peptidi di origine mammifera sembrano avere un potenziale per essere
impiegati in terapia: ad esempio LL-37, hBD-1, retrociclina per la prevenzione dell’HIV
e coniugati di protegrina-1. Pexiganina, un analogo di maganina-2 (un peptide isolato
dalla pelle di rana Xenopus laevis), si trova al momento in sperimentazione clinica in
fase III sottoforma di antibiotico topico (Locilex® - crema di pexiganina 0,8%,
Dipexium Pharmaceuticals co.) per il trattamento di lievi infezioni da piede diabetico.
Rappresenta inoltre un promettente candidato per il trattamento di ABSSSI (Acute
Bacterial Skin and Skin Structure Infections). [22]
22
1.6 PEPTIDI DERIVANTI DA RANE
Gli anfibi rappresentano una delle più abbondanti fonti di AMPs. Possiedono infatti
delle ghiandole, poste sulla pelle, ricche in peptidi antimicrobici con struttura ad alfa
elica. Ciascuna specie di rana esprime il proprio repertorio di AMPs (10-20 peptidi),
aventi differenti sequenze, dimensioni e spettro di azione, anche tra specie strettamente
correlate. Le ghiandole sierose degli Anuri producono vari AMPs implicati nella difesa
della pelle contro microorganismi nocivi presenti nell’ambiente. Questi peptidi
presentano un ampio spettro d’azione, che previene la comparsa di fenomeni di
resistenza. Rappresentano una classe eterogenea di peptidi, aventi però tre
caratteristiche in comune tra loro:
Carica netta positiva (presenza di aminoacidi basici)
Composti per il 50% da aminoacidi idrofobici
Tendenza a formare alfa-eliche anfipatiche e/o beta-foglietti in corrispondenza
di membrane fosfolipidiche
Gli AMPs, che sono stati caratterizzati fino ad oggi, sono stati trovati in 14 diverse
famiglie di rane appartenenti all’ordine Archeobatrachia e Neobatrachia. Sulla base
della loro sequenza amminoacidica sono stati suddivisi in più di 40 classi. Si osservano
differenze sia interspecie che intraspecie per quanto riguarda potenza e specificità. Ciò
suggerisce l’esistenza di un sistema di difesa a più livelli che conferisce il massimo
della protezione con un minimo dispendio energetico. [23]
I peptidi sono inizialmente sintetizzati nelle cellule multi-nucleate delle ghiandole
epiteliali come pre-pro-peptidi. Successivamente maturano e vengono conservati
all’interno dei granuli delle ghiandole. Ciascun precursore è il risultato della trascrizione
di un singolo locus genico che codifica per un unico peptide maturo. I precursori sono
costituiti generalmente da tre porzioni (Figura 1.11):
Sequenza segnale in posizione N-terminale
Sequenza acidica interposta che termina generalmente con Lys-Arg
Sequenza che costituisce il peptide maturo in posizione C-terminale
23
Figura 1.11 - Rappresentazione schematica di un pre-pro-peptide.[24]
È interessante notare che la regione pre-pro appare conservata all’interno delle diverse
specie, mentre i peptidi maturi risultano differenti. Questo suggerisce l’esistenza di uno
o più geni che derivano da un progenitore comune. [23]
Figura 1.12 - Schema rappresentativo di vari AMPs provenienti da anfibi [22]
In Figura 1.12 sono riportati alcuni dei più promettenti AMPs anfibi:
Pexiganina, un analogo di maganina-2 (un peptide isolato dalla pelle di rana
Xenopus laevis) [25] [26]
Dermaseptina, isolata dalle secrezioni epiteliali di rane Phyllomedusa, e
piscidina da teleostei, entrambe modificate mediante sostituzione di residui
amminoacidici non polari con lisina per implementare l’effetto antimicrobico e
minimizzare la citotossicità [27]
Temporina, isolato dall’epitelio di rana Pelophylax Saharica. [28]
24
1.6.1 KIADINE
Alcuni AMPs naturali causano effetti tossici nei confronti delle cellule dell’ospite: da
qui deriva la necessità di modificarli o in alternativa disegnarli ex novo, in modo da
aumentare l’attività contro i batteri, diminuendo o possibilmente annullando gli effetti
tossici. Fra i gruppi coinvolti in questo ambito, alcuni ricercatori del Dipartimento di
Scienze dell’Università di Spalato stanno lavorando ad un progetto di studio su peptidi
antimicrobici provenienti da Anuri. Questa classe di rane è particolarmente ricca in
HDPs: peptidi antimicrobici naturali ubiquitari. [29]. Sulla base di studi QSAR hanno
analizzato peptidi con struttura ad alfa elica per determinare un Indice di Selettività (SI)
che mettesse in relazione la MIC verso E.Coli con l’attività emolitica (SI=HC50/MIC).
Hanno successivamente inserito un parametro strettamente correlato con SI, ovvero
“Sequence Moment”, in un algoritmo computazionale validato (denominato “Designer”)
per selezionare nuovi peptidi ad alta selettività. Tra questi sono state selezionate le
adepantine (ADP – Automatically Designed Peptides): corti peptidi lineari ricchi in
residui di glicina/lisina altamente selettivi per i batteri Gram negativi e con bassa
tossicità emolitica. Grazie agli studi effettuati su questa classe, il gruppo ha ideato un
algoritmo capace di elaborare ed identificare AMPs attivi nei confronti di Gram
negativi, in particolare E. coli, con un alto SI. Questi AMPs interagiscono con
membrane neutre, invece di adottare una struttura ad alfa elica in presenza di membrane
cariche negativamente per permeabilizzarle, presumibilmente in base all’elevato
contenuto in glicina. Inoltre, la dimerizzazione gioca un ruolo significativo nella
modulazione sia dell’attività antimicrobica che della citotossicità verso le cellule
dell’ospite. [30]
Partendo dagli studi effettuati sulle adepantine, lo stesso gruppo di ricerca ha descritto
una nuova classe di peptidi ricchi in glicina/lisina, denominata Kiadine, progettate
mediante l’uso di un ulteriore algoritmo computazionale validato. Questi peptidi sono
stati ottenuti sia attraverso la modificazione di un peptide naturale denominato PGLa-H,
sia attraverso una sintesi ab initio mediante studi QSAR.
Il peptide PGLa-H, un frammento C-terminale di PGLa, isolato dalla pelle di rana
Xenopus laevis (da cui è stata isolata anche maganina-2), ha mostrato in vitro attività
25
antimicrobica contro E.coli e S.aureus (incluso MRSA) e bassa attività emolitica.
Forma una struttura ad alfa elica che sembra responsabile della formazione di pori sulla
membrana, causando un’alterazione della permeabilità e portando la cellula batterica a
morte. [31] [32]
Partendo dalla struttura di PGLa-H è stato disegnato un nuovo peptide costituito dalla
ripetizione di questo frammento, ovvero diPGLa-H o (PGLa-H)2. [33] Il peptide ha
mostrato in vitro attività antibatterica verso Gram negativi e Gram positivi, e bassa
tossicità verso le cellule dell’ospite (saggi di emolisi, vitalità cellulare e danno al DNA).
Partendo da diPGLa-H è stato disegnato un analogo, denominato Kiadina-1, contenente
una sostituzione di valina con glicina in una specifica posizione. (Figura 1.13) Questo
ha portato a un leggero miglioramento dell’attività antibatterica e a una riduzione
dell’attività emolitica, probabilmente correlata ad una maggiore flessibilità dell’alfa
elica.
Figura 1.13 - Struttura amminoacidica di PGLa-H, DiPGLa-H e Kiadina-1 a confronto [33]
I saggi di citotossicità e genotossicità sono stati effettuati su cellule isolate dal sangue e
su coltura primaria di fibroblasti umani. Dai risultati è emerso che Kiadina-1 causa una
minor emolisi rispetto a diPGLa-H ed entrambi i peptidi non sono tossici verso cellule
isolate dal sangue a concentrazioni significativamente superiori alla MIC. Al contrario,
possiedono una tossicità marcata verso i fibroblasti, sottolineando un diverso effetto
verso questo tipo di cellule. Per quanto riguarda l’aspetto conformazionale, entrambi i
peptidi mostrano un comportamento diverso: in ambiente acquoso presentano una
struttura random coil, mentre a contatto con le membrane cellulari transiscono verso
una struttura ad alfa elica, suggerendo inoltre un’associazione di più alfa eliche. (Figura
1.14)
26
Figura 1.14 – Rappresentazione delle diverse conformazioni assunte dai peptidi in ambienti diversi: F- diPGLaH in H20; G- kiadin in H20; H- diPGLaH in presenza di fosfolipidi; -I kiadin in presenza di fosfolipidi [33]
Sulla base di questi studi sono state disegnati ulteriori peptidi (Figura 1.15) [34]:
Kiadina 2 e Kiadina 3 da Kiadina 1
Kiadina 4, Kiadina 5 e Kiadina 6 sintesi ab initio
Figura 1.15 - Sequenza amminoacidica dei peptidi appartenenti alla serie delle Kiadine a confronto. In rosso sono evidenziati i residui di glicina [34]
La sequenza amminoacidica di Kiadina-2 (K2) è basata su quella di Kiadina-1 (K1): in
K2 Val5
e Gly15
sono invertite e per Kiadina-3 (K3) Gly occupa entrambe le posizioni (5
e 15). Kiadina-4, Kiadina-5 e Kiadina-6 presentano più modifiche nella sequenza
27
amminoacidica, rispetto al “template naturale”, essendo disegnate ab initio; in
particolare, K4 e K5 presentano 4 residui di Gly.
In seguito a simulazioni di dinamica molecolare che sono state effettuate su questi
peptidi è emerso che tutti i peptidi, tranne Kiadina-5, interagiscono con le membrane
modello anioniche LUVs dipendentemente dalla sequenza amminoacidica di cui sono
costituiti.
Potenza e selettività non dipendono solo dal numero di residui di glicina, che
conferiscono flessibilità conformazionale, ma anche dalla struttura anfipatica della
molecola in toto: un arrangiamento anfipatico simmetrico porta ad un aumento
dell’interazione con la membrana, con conseguente aumento sia dell’attività
antimicrobica che dell’attività citotossica.
Un alto contenuto in glicina, inoltre, porta ad una maggiore distensione della molecola
in soluzione acquosa e ad un aumento dell’instabilità della molecola: i peptidi che,
invece, mantengono stabilità in acqua, riescono a creare un legame più stabile con la
membrana (Figura 1.16).
Figura 1.16 - Rappresentazione della conformazione che i peptidi assumono in H2O ottenuta mediante simulazione
molecolare dinamica [34]
Dai risultati è emerso inoltre che la potenza non appare correlata esclusivamente alla
permeabilizzazione della membrana, ma riguarda anche il tempo di permanenza nel sito
d’azione. Si è notato che tutti i peptidi (tranne Kiadina-5) interferiscono con la crescita
batterica a concentrazioni sub-letali, ma il patogeno riesce comunque a detossificare la
sostanza e continuare a crescere, questo fino alla concentrazione corrispondente alla
MIC (Figura 1.17), alla quale si osservano pori e micellizzazione che causano la morte.
La permeabilizzazione appare tempo-dipendente e concentrazione-dipendente.
28
L’attività emolitica dipende dall’anfipaticità della molecola, in particolare dalla parte
idrofobica, e dalla capacità di mantenere una struttura ad afa elica che vada ad interagire
con la membrana.
30
1.6.2 PEPTIDI SERIE P
Come citato precedentemente, gli Anuri, in particolare quelli appartenenti alla famiglia
delle Ranidae, sono caratterizzati da un genoma che codifica per molti AMPs. In
precedenza, l’identificazione di nuovi AMPs richiedeva l’uso di un numero
considerevole di rane, che venivano stimolate mediante noradrenalina (norepinefrina)
per ottenere AMPs, che venivano successivamente testati e purificati. Questo risultava
essere un processo lungo e da un punto di vista etico non così ottimale. Per questo
motivo, i peptidi appartenenti a questa classe, sono stati identificati mediante l’utilizzo
di un metodo alternativo, più rapido, efficiente e meno invasivo, che permette
l’identificazione simultanea di AMPs provenienti da più specie.
Come riporta Rončević et al. [35] i peptidi sono stati identificati da 5 differenti specie di
Ranidae (Pelophylax ridibundus, Pelophylax kl. esculentus, Rana dalmatina, Rana
temporaria e Rana arvalis). L’RNA è stato estratto dall’epidermide delle rane, è stato
successivamente sequenziato e sono state identificate le sequenze codificanti per AMPs.
I dati ottenuti sono stati elaborati e incrociati con diversi database (Database of Anuran
Defense Peptides (DADP) [29] e Sequence Read Archive (SRA) database [36]) come
conferma. Sono stati identificati 128 peptidi, 6 dei quali sono stati selezionati per essere
sintetizzati e testati come agenti antibatterici contro Gram negativi e Gram positivi.
I peptidi sono stati selezionati in base alla carica (da -1 a +6), all’idrofobicità e ad altri
aspetti legati alla struttura. I peptidi 3 (P3) e 4 (P4) contengono due residui di cisteina
formanti un ponte disolfuro. Tutti gli altri peptidi sono lineari. La sequenza
amminoacidica dei vari peptidi è riportata in Tabella 1-1.
31
Peptide Coding sequencea Sequence Charge
Peptide-1 rtemp_4.3_210 LVPFIGRTLGGLLARF-NH2 +4
Peptide-2 rtemp_4.6_20 FLGALGNALSRVL-NH2 +3
Peptide-3 rtemp_32_47 NNLRHIVAWCKNRNYSLAVCARFKPQ +6
Peptide-4 rdal_39_24 NLLGFLQGAKDILKECEADNYQGWLCESYKPQ -1
Peptide-5 rdal_8_600 FLGFVGQALNALLGKL-NH2 +3
Peptide-6 rarv_10.1_19 LLGAALSALSSVIPSVISWFQK-NH2 +3
Tabella 1-1 - Sequenza dei peptidi della serie P e caratteristiche chimico fisiche. a. il nome del peptide è composto
dalla prima lettera del genere della rana dal quale il peptide è stato identificato, seguita da 3 o 4 lettere che si
riferiscono al nome della specie. Il primo numero si riferisce al contig del peptide, mentre il secondo al numero di
reads che lo supportano. [35]
Da un punto di vista evoluzionistico, il peptide-1 (P1) e il peptide 2 (P2) da R.
Temporaria sembrano essere correlati alle temporine, esibendo una significativa
omologia, in particolare per quanto riguarda la regione propeptidica. Allo stesso modo,
anche il peptide-5 (P5), da R. Dalmatina, sembra essere correlato alle temporine. Il
peptide-6 (P6) invece, identificato da R.Arvalis, non è conforme a nessuna famiglia di
AMPs anuri. Allo stesso tempo, però, il gene che codifica per il peptide sembra essere
presente in singola copia in tutte le specie del genere Rana.
Gli studi di DC eseguiti sui peptidi, indicano che in soluzione acquosa si presentano
come random coil, tranne il peptide-3 (P3) e il peptide-4 (P4) che, avendo ponti
disolfuro, presentano una struttura più rigida. Da ciò ne deriva che probabilmente o la
loro interazione con le membrane è meno forte rispetto agli altri peptidi della serie, o
l’interazione non va ad influire sulla loro conformazione. Il peptide-1 (P1) sembra
essere più selettivo nei confronti delle membrane anioniche rispetto al peptide-6 (P6), il
quale mostra invece spettri molto simili sia in presenza di PG che di DOPC LUVs.
Dai test di MIC (minima concentrazione inibente) e MBC (minima concentrazione
battericida) eseguiti su S. aureus, E. faecalis, E. coli e A. baumannii, è emerso che i
peptidi 1 (P1), 2 (P2), 3 (P3), 4 (P4) e 5 (P5) hanno debole attività nei confronti dei
32
batteri. Il peptide 6 (P6) si è mostrato invece più efficace contro S. aureus, anche nei
confronti di isolati clinici (Tabella 1-2).
Bacterial strains
Peptide-6
MIC MBC
S. aureus ATCC 29213 4 4
S. aureus c.i. 8 16
E. faecalis ATCC 29212 16 16
E. coli ATCC 25922 >64 /
A. baumannii ATCC 19606 32 64
Tabella 1-2 - Valori di MIC e MBC di P6 [35]
Il peptide 6, identificato in Rana Arvalis, è capace di permeabilizzare la membrana
anche a concentrazioni inferiori alla MIC, e a concentrazioni corrispondenti alla MIC e
alla MBC causa evidente danno.
34
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare la citotossicità di nuovi
AMPs verso cellule eucariote in vitro e la loro interazione con membrane modello.
I peptidi sono stati progettati e sintetizzati all’Università di Spalato con cui è attiva una
collaborazione, ed in particolare con il Dott. Dott. Rončević Tomislav che li ha
caratterizzati e ha svolto le prove antimicrobiche preliminari.
Dato che questi peptidi esibiscono un’interessante attività antimicrobica, sono state
svolte le prove per determinare la tossicità su diverse linee cellulari eucariotiche e sono
stati eseguiti dei saggi atti a definire le curve dose-effetto per estrapolare il valore di
IC50.
Successivamente, è stato valutato anche il tipo di danno cellulare con cui questi peptidi
inibiscono le cellule in vitro, mediante tecnica citofluorimetrica.
Per fare ciò è stato necessario valutare il tipo di risposta cellulare alla presenza degli
AMPs, ossia valutare l’attivazione di due differenti pathway di risposta al danno:
L’apoptosi
La necrosi
Infine, poiché è descritto che le proprietà anfipatiche degli AMP ne promuovono
l’interazione con le membrane biologiche, ulteriore scopo di questa tesi è determinare
l’affinità o la costante cinetica dei peptidi più citotossici mediante studi SPR con
membrane modello.
36
3.1 LINEE CELLULARI
Le cellule vengono mantenute in coltura all’interno di un incubatore ad una temperatura
di 37°C e pCO2 del 5%.
Per lavorare con le colture cellulari è necessario che vengano garantite condizioni di
sterilità nell’ambiente di lavoro, queste infatti sono mantenute mediante l’utilizzo di una
cappa a flusso laminare. Nella cappa è presente una lampada UV che ne permette la
sterilizzazione mediante un ciclo di 20-30 minuti effettuato all’inizio di ogni giornata.
3.1.1 MEC-1
Questa linea cellulare deriva da un paziente caucasico di 61 anni affetto da una leucemia
linfocitica cronica. [37] [38] La coltura è costituita da linfociti B neoplastici che
crescono in sospensione ed hanno un tempo di duplicazione di circa 40h, sono quindi in
attiva proliferazione. Le cellule vengono mantenute in flask in terreno completo (con
rosso fenolo). Il mantenimento della coltura viene eseguito con split 1:2 o 1:3 ogni 2 o 3
giorni (mantenendo le cellule a ≈ 200000/mL). La rimozione del terreno consumato
viene eseguita diluendo abbondantemente le cellule con tampone PBS, e successiva
centrifugazione (330xg per 5 minuti a 4°C). Si procede con la conta cellulare mediante
l’utilizzo del test di esclusione con Trypan Blue. Le cellule vengono poi messe in una
nuova flask con terreno fresco.
3.1.2 HaCat
È una linea cellulare derivante da cheratinociti umani immortalizzati. [39] [40] In vitro
queste cellule crescono adese alla flask formando un monostrato. Vengono mantenute
ad una concentrazione ≈ 200000/mL di terreno completo. Per il passaggio le cellule
devono essere staccate dalla flask: è stata utilizzata tripsina con EDTA (acido
etilendiamminotetracetico). Per il passaggio il terreno nella flask viene eliminato,
successivamente viene aggiunta la soluzione di tripsina per 10 minuti in incubatore a
37°C e successivamente vengono recuperate le cellule tripsinizzate e poste in tubo da
centrifuga con PBS e FBS. Se rimangono cellule adese nella flask si consiglia un
ulteriore recupero con tripsina o con PBS. Si procede con la centrifugazione a 300xg per
37
5 minuti a 4°C. Viene eliminato il surnatante, viene rotto il pellet e si procede con la
conta cellulare mediante l’utilizzo del Trypan Blue. Le cellule vengono poi messe in
una nuova flask contenente terreno fresco.
3.1.3 MCF-7
MCF-7 è una linea cellulare di cancro al seno isolata da una donna caucasica nel 1970.
Il nome deriva dall’istituto che ha prodotto la linea cellulare, il Michigan Cancer
Foundation [41, p. 7]. La coltura cresce in adesione formando un monostrato sulla
parete della flask. Viene mantenuta ad una concentrazione di ≈ 200000/mL di terreno
completo per cellule in adesione. Il passaggio viene effettuato analogamente a quanto
descritto per la linea cellulare HaCat.
3.2 TAMPONI E TERRENI
Le cellule vengono mantenute in proliferazione mediante l’utilizzo di terreni completi
contenenti siero per fornire i fattori di crescita necessari alla divisione continua delle
cellule. I terreni si distinguono in terreni per cellule in sospensione e terreni per cellule
in adesione.
3.2.1 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN SOSPENSIONE
Il terreno completo per cellule in sospensione è composto da:
RPMI 1640: contenente amminoacidi, vitamine, fosfato, potassio, magnesio e
calcio
10% FBS (siero fetale bovino)
2mM L-Glutamina
100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina
38
3.2.2 TERRENO COMPLETO PER CELLULE IN ADESIONE
Il terreno completo per cellule in adesione è composto da:
DMEM High Glucose
10% FBS (siero fetale bovino)
2mM L-Glutamina
100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina
3.2.3 PBS: PHOSPHATE BUFFERED SALINE
Il PBS viene utilizzato per fare tutti i lavaggi delle cellule.
È costituito da:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
8,1 mM Na2HPO4 2H2O
1,47 mM KH2PO4
Sali sciolti in acqua demineralizzata e successivamente la soluzione viene sterilizzata in
autoclave.
3.3 ISOLAMENTO DI MONOCITI
I monociti sono stati estratti a partire da buffy coat, ovvero concentrati di leucociti e
piastrine. Sono stati ottenuti mediante centrifugazione di sangue intero di donatori
volontari, privato del plasma e della maggior parte dei globuli rossi. I buffy coat
utilizzati sono provenienti da donatori sani della Banca del Sangue dell’Ospedale
Maggiore di Trieste.
Il contenuto del buffy coat è stato diluito in rapporto 1:1 con una soluzione tampone di
PBS-EDTA-glucosio (EDTA (etilendiaminotetraacetatotetrasodico) 1mM – glucosio
5mM). La sospensione ottenuta è stata poi stratificata su Histopaque 1077 in rapporto
39
1:2 e centrifugata per 30 minuti a 400xg a 18°C. Grazie al gradiente di densità si
formano un pellet con eritrociti/granulociti, banda all’interfaccia con linfo-monociti.
Viene prelevata la banda linfo-monocitaria e diluita 1:1 con PBS-EDTA-glucosio,
centrifugata a 400xg a 4°C per 5 minuti e lavata altre due volte in PBS, eliminando il
surnatante e riunendo i pellet. Le cellule vengono quindi contate con il Trypan Blue
mediante la camera di Burker. Dalla concentrazione totale di cellule si ricava la
concentrazione dei monociti, considerando come da formula leucocitaria la componente
monocitaria come ≈ 30% del totale delle cellule. Si prepara dunque una sospensione
cellulare in terreno di adesione (RPMI 1640 e HEPES 25 mM). Si procede quindi con
l’incubazione in termostato a 37°C, 5% CO2 per 90 minuti: in questo modo i monociti
aderiscono alla flask, mentre i linfociti rimangono in sospensione. Il surnatante viene
recuperato per ottenere i linfociti. Ai monociti adesi si aggiunge quindi il terreno
completo composto da:
RPMI-1640
Hepes 25mM pH 7.4
2mM L-Glutamina
100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina
10% FBS
Le flask sono dunque poste in incubatore a 37°C con 5% CO2 e le cellule sono
utilizzabili fino a 48h dalla data dell’estrazione.
3.4 GENERAZIONE DI MDM
I monociti che sono stati estratti dal sangue secondo la procedura descritta in
precedenza vengono differenziati in vitro in macrofagi aggiungendo al terreno di coltura
lo stimolo pro-infiammatorio (LPS).
Il terreno completo per l’ottenimento di cellule macrofagiche (MDM-LPS) è costituito
da:
40
RPMI-1640
Hepes 25mM pH 7.4
2mM L-Glutamina
100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina
10% FBS
LPS 10 ng/mL (soluzione di lipopolisaccaride ottenuto da E.Coli)
Le cellule vengono incubate in termostato a 37°C con 5% di CO2. Al terzo o al quarto
giorno di incubazione viene aggiunta la stessa quantità di terreno fresco con LPS alla
concentrazione 2x per mantenere costante la concentrazione finale. Le cellule sono
utilizzabili in sesta giornata.
3.5 ISOLAMENTO DI LINFOCITI
I linfociti vengono isolati a partire da buffy coat. Si esegue lo stesso procedimento usato
per l’isolamento dei monociti fino allo step di adesione in termostato per 90 minuti.
Dopo l’incubazione vengono recuperati i linfociti presenti nel surnatante e centrifugati a
400xg per 5 minuti a 4°C. Si elimina il surnatante e si procede con la conta cellulare
utilizzando il Trypan Blue e la camera di Burker. In seguito vengono seminate in
terreno completo per linfociti costituito da:
RPMI-1640
Hepes 25mM pH 7.4
2mM L-Glutamina
100 U-100 μg/mL penicillina-streptomicina
10% FBS
1mM aminoacidi non essenziali
1mM sodio piruvato
0,05 mM 2-mercaptoetanolo
Le flask sono dunque poste in incubatore a 37°C con 5% CO2 e le cellule sono
utilizzabili fino a 48h dalla data dell’estrazione.
41
3.6 CONTA CELLULARE
La conta cellulare viene effettuata mediante l’utilizzo del Trypan Blue (Figura 3.1): un
colorante derivato dalla toluidina con un peso molecolare di circa 960 Da.
Figura 3.1 – Struttura chimica del Trypan Blue [42]
Il TB è una molecola che risulta impermeabile alla membrana cellulare, di conseguenza
riesce a penetrare solo le cellule la cui integrità di membrana è compromessa. Una volta
all’interno si lega alle proteine intracellulari, facendo così apparire la cellula di colore
blu. Le cellule vitali assumeranno perciò una colorazione più chiara. [43]
Per procedere con la conta si utilizza come supporto la camera di Burker (Figura 3.2 e
Figura 3.3):
Figura 3.2 - Camera di Burker
42
La camera di Burker è un dispositivo formato da due griglie (una superiore e una
inferiore) e da un vetrino coprioggetti. La griglia è formato da 9 grandi quadranti,
ognuno della superficie di 1 mm2. Ogni quadrante è a sua volta suddiviso in 16
quadranti più piccoli aventi lato di 0,25 mm. Nel quadrante centrale più grande, ogni
quadrante più piccolo è a sua volta diviso in 16 piccoli quadranti. Per il conteggio delle
cellule si utilizza solitamente uno dei grandi quadranti posti agli angoli.
Inizialmente si pone parte del pellet con il Trypan Blue in rapporto 1:5 o 1:10.
Si procede ponendo una goccia di sospensione con il TB nel reticolo superiore e una nel
reticolo inferiore. Attraverso il microscopio si vanno a contare le cellule vitali
(colorazione più chiara) nei 4 quadranti di 0.25 mm posti ai 4 vertici del grande
quadrante, più un quadrante a caso tra i restanti. Si procede con la conta nello stesso
modo anche nel reticolo inferiore.
La concentrazione di cellule per millilitro viene calcolata mediante l’equazione:
𝑵°𝒄𝒆𝒍𝒍𝒎𝑳⁄ = (∑ 𝒖𝒑𝟓 + ∑ 𝒅𝒐𝒘𝒏𝟓 ) x 25 x1000 x FD
Dove con “Σ5 up” si intende la somma delle cellule vitali contate nel reticolo superiore,
“Σ5 down” la somma delle cellule vitali contate nel reticolo inferiore, e “FD” il fattore
di diluizione utilizzato per il TB.
Figura 3.3 – Rappresentazione schematica della camera di Burker e ingrandimento di una griglia
43
3.7 TEST MTT
Questo tipo di test sfrutta un metodo colorimetrico per un’analisi di tipo quantitativa
[44] [45] [46] e misura indirettamente la vitalità delle cellule. In questo progetto
abbiamo usato questo metodo per testare la citotossicità di alcuni peptidi antimicrobici,
espressa come IC50, concentrazione di composto alla quale viene inibito il 50% della
popolazione cellulare.
L’MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) è un sale di
tetrazolio che viene metabolizzato dall’enzima succinato deidrogenasi del mitocondrio
in sale di formazano blu (Figura 3.4).
Figura 3.4 - Reazione di riduzione dell'MTT ad opera della succinato deidrogenasi mitocondriale [47]
In questo modo si osserva un colore blu quando le cellule sono vitali e hanno quindi un
sistema metabolico capace di trasformare l’MTT in un sale blu, mentre si nota un colore
giallo quando le cellule, non più vitali e quindi con un mitocondrio non più funzionale,
non sono in grado di attuare questo processo.
Il vantaggio di utilizzare un test di tipo colorimetrico si collega alla rapidità e alla
precisione di questo metodo, evitando così l’utilizzo di sostanze che potrebbero esporre
l’operatore a rischi.
Il test è stato effettuato in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto, sterili. In ogni pozzetto
sono stati immessi 90 μL di cellule in terreno completo. Il trattamento, costituito da 10
44
μL di peptidi in PBS diluiti all’opportuna concentrazione, è stato effettuato per ogni
pozzetto, ottenendo così un volume finale di 100 μL (nei pozzetti di controllo sono stati
aggiunti 10 μL di PBS). Nel caso della linea cellulare MEC-1 i peptidi sono stati
aggiunti subito dopo la semina delle cellule, nel caso invece della linea HaCat sono stati
aggiunti il giorno successivo per permettere alle cellule di aderire al pozzetto. La piastra
è stata poi posta in incubatore a 37°C con 5% CO2 per 24 ore. Nelle ultime 4 ore di
incubazione, in ogni pozzetto, sono stati messi 20 μL di MTT.
La soluzione di MTT è stata preparata sciogliendo 5mg di MTT per mL di PBS.
Successivamente è stata sterilizzata per filtrazione tramite una siringa con filtro da 0,22
μM e mantenuta a 4°C.
Trascorso il tempo necessario per l’incubazione dell’MTT, è possibile osservare al
microscopio i cristalli di formazano blu presenti nei pozzetti contenenti cellule vitali,
come mostrato in Figura 3.5 e Figura 3.6:
Successivamente in ogni pozzetto sono stati messi 100 μL di IGEPAL (tert-
octylphenoxy poly(oxyethylene)ethanol – (C2H4O)nC14H22O) con HCl 0,01 N per
solubilizzare i cristalli di formazano e la piastra è stata posta in incubatore overnight.
La lettura della D.O. della piastra è stata effettuata a una lunghezza d’onda di 620 nm.
Figura 3.6 - MEC-1 Figura 3.5 - HaCat
45
3.8 SPETTROFOTOMETRO
Per misurare l’assorbimento di una radiazione elettromagnetica si opera mediante
l’utilizzo di uno spettrofotometro.
Lo spettrofotometro (Figura 3.7) è costituito da:
Figura 3.7 Schematizzazione della struttura di uno spettrofotometro [48]
Sorgente: lampada che emette radiazioni con diverse lunghezze d’onda
Monocromatore: filtro che seleziona la lunghezza d’onda desiderata
Cella: compartimento contenente il campione in soluzione
Rilevatore: misura l’intensità della radiazione emessa
Il concetto si basa sulle seguenti formule:
T = 𝐼
𝐼0 A= − log 𝑇 A=log
𝐼0
𝐼
T = trasmittanza
I = intensità della luce incidente
I0 = intensità della luce trasmessa
A = assorbanza
E sulla legge di Lambert-Beer: A=εbc
ε=coefficiente di estinzione molare
b=cammino ottico
c=concentrazione
46
Secondo questa legge quando una radiazione monocromatica colpisce un campione,
parte della radiazione viene assorbita. L’assorbanza sarà perciò direttamente
proporzionale alla concentrazione della specie assorbente. Per questo motivo lo
spettrofotometro, che va a misurare dunque la radiazione assorbita, sarà necessario per
un’analisi di tipo quantitativo. Nel caso specifico del test MTT, la misurazione viene
effettuata alla lunghezza d’onda di 620 nm. Tenendo conto del picco di assorbimento
dell’MTT, maggiore sarà il valore di densità ottica (assorbanza) misurato, maggiore sarà
la concentrazione di sale di formazano nel campione (seguendo appunto la legge di
Lambert-Beer). Inoltre, sapendo che maggiore sarà la concentrazione di formazano,
maggiore sarà la vitalità cellulare, ne deriva di conseguenza che assorbanza e
percentuale di cellule vitali saranno dunque direttamente proporzionali (Figura 3.8).
D.O.
n° cell
3.9 TEST DI APOPTOSI/NECROSI
Questo test è stato effettuato mediante l’utilizzo del citofluorimetro. Il test di
necrosi/apoptosi è un test funzionale, che consente di valutare la funzionalità della
cellula a livello della membrana plasmatica e del mitocondrio. Vengono utilizzate due
sonde: lo ioduro di propidio (PI) e la DiOC6. Questi due fluorocromi sono eccitabili alla
stessa lunghezza d’onda, ovvero a 488 nm (lunghezza d’onda del laser) ed emettono a
lunghezze d’onda diverse.
Figura 3.8 - Schema rappresentativo della correlazione tra densità ottica e numero di cellule
47
Lo ioduro di propidio (Figura 3.9) è una molecola carica che si intercala nel DNA. Una
volta che viene eccitata dal laser, emette a 610 nm una fluorescenza rossa. Se la
membrana della cellula è integra, questa non permette l’ingresso del PI, e di
conseguenza non si osserva emissione di fluorescenza rossa.
Figura 3.9 – Struttura chimica di PI [49]
La DiOC6 (3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide) (Figura 3.10) è una sonda vitale
potenziometrica: misura la differenza di potenziale della membrana del mitocondrio e
non risulta tossica per la cellula. Questa sonda emette a 525 nm una fluorescenza verde.
Quando il sistema di trasporto mitocondriale degli elettroni si trova a livelli fisiologici,
la sonda si aggrega ed emette fluorescenza. Nei casi in cui si instaura una
depolarizzazione di membrana (ad esempio durante l’apoptosi), e di conseguenza il
transito degli elettroni rallenta, si osserva invece una diminuzione dell’intensità di
fluorescenza verde perché la sonda tende a disaggregare.
48
Figura 3.10 – Struttura chimica di DiOC6 [50]
Nel campione che rappresenta il controllo positivo le cellule vengono trattate con CCCP
(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) (Figura 3.11) : è un protonoforo, ovvero
una molecola che è in grado di trasportare protoni dallo spazio intermembrana (ricco in
protoni) alla matrice del mitocondrio, dissipando così il gradiente protonico. In questo
modo induce una depolarizzazione mitocondriale. Questo composto presenta un’attività
depolarizzante sia concentrazione-dipendente che tempo-dipendente.
Figura 3.11 – Struttura chimica di CCCP [51]
49
3.9.1 PROTOCOLLO DEL TEST
Fase di staining: la sospensione cellulare (1x106 cell) viene colorata con DiOC6 10 µM
(concentrazione finale 0,2 µM) a 37°C per 15 minuti. Si effettuano due lavaggi in PBS a
15-18°C per eliminare l’eccesso di sonda. Eliminato il surnatante, le cellule vengono
risospese in PBS, a cui viene aggiunto il PI 10x (concentrazione finale 10 μg/mL). La
sospensione viene poi aliquotata nei tubi da citofluorimetro per allestire i gruppi di
trattamento. Le letture al citofluorimetro vengono effettuate a 15, 30 e 60 minuti.
3.10 CITOFLUORIMETRO E ANALISI DEI DATI
Quando un’onda elettromagnetica colpisce una particella, parte dell’energia viene
assorbita e parte dell’energia viene riemessa sottoforma di radiazione riflessa/diffusa
secondo quello che viene definito come “light scattering” (LS). Nel caso di cellule si
può sfruttare l’LS per risalire alle loro dimensioni e alla loro forma. Nel citofluorimetro
la radiazione viene rilevata tramite il forward scatter (FSC) e il side scatter (SSC).
Il forward scatter è posto lungo la direzione della luce incidente (con angolo quindi di
0°) e rileva la luce rifratta, mentre il side scatter è posto a 90° rispetto alla luce incidente
e rileva la luce riflessa. La sospensione unicellulare viene fatta flussare in modo tale che
intersechi una sorgente di radiazione (laser). Oltre a rilevare la luce riflessa e rifratta,
mediante l’utilizzo di fluorocromi è possibile rilevare anche l’intensità di fluorescenza.
Il fluorocromo infatti assorbe energia dal laser e la rilascia sottoforma di fotoni.
Il citofluorimetro è costituito da:
Un sistema fluidico: che permette al campione di flussare e di essere colpito dal
raggio del laser
Un sistema ottico: che genera e seleziona i segnali luminosi
Un sistema elettronico: che permette la trasformazione dei segnali luminosi in
segnali elettrici e la loro memorizzazione in una memoria multicanale
50
Un sistema di software: che media l’elaborazione e l’analisi dei dati raccolti dal
sistema elettronico
Tramite il flusso si riescono a raccogliere contemporaneamente valori di FSC, SSC e
fluorescenza per ogni singola cellula presente nella sospensione. Per il segnale FSC si
mantiene una soglia che consente di escludere detriti cellulari e particelle che
potrebbero interferire con l’analisi. I dati una volta analizzati possono essere combinati
secondo un istogramma monoparametrico o un diagramma biparametrico.
L’istogramma monoparametrico (Figura 3.12) confronta il numero di eventi rilevati con
l’intensità di fluorescenza di DiOC6.
Il diagramma biparametrico (Figura 3.13) combina i valori di FS (forward scatter) e SS
(side scatter).
CTRL MEC-1
AP241117 MEC1 CCCP T30 00033740 379.LMD
AP241117 MEC1 P6 11uM T30 00033741 380.LMD
AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD
AP241117 MEC1 P6 57uM T30 00033743 382.LMD
DiOC6 (FL1Log, 525nm)
events
100
101
102
103
104
0
25
51
76
101
M1
Figura 3.12 - Esempio di istogramma monoparametrico
51
Figura 3.13 - Esempio di diagramma biparametrico
Gate 1: cellule integre
Gate 2: cellule danneggiate
Gate 3: tutte le cellule
Il diagramma biparametrico (Figura 3.14) può inoltre combinare i valori di fluorescenza
di PI e DiOC6.
Figura 3.14 - Esempio di diagramma biparametrico
SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD
SS Log
FS
Lin
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
Gate 2
Gate 1
Gate 3
< SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD >
Gate 3
DiOC6 (FL1 Log, 525nm)
PI (F
L3
Lo
g, 6
10
nm
)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
91,07%
0,00%
6,51% 2,42%
Gate 4
L3 Upper Left (UL) L2 Upper Right (UR)
L1 Low Left (LL) L4 Low Right (LR)
52
FL3 rileva la fluorescenza rossa
FL1 rileva la fluorescenza verde
L2 (UR): cellule tardo apoptotiche (doppie positive)
L3 (UL): cellule necrotiche (PI positive)
L4 (LR): cellule vitali
3.11 LIPOSOMI
I liposomi sono dei piccoli globuli formati da uno o più strati lipidici. In questo progetto
sono stati utilizzati come modello per simulare la membrana plasmatica di una cellula
eucariote per studiare le interazioni tra questa e alcune molecole, nel caso specifico
peptidi antimicrobici.
I liposomi sono innanzitutto formati da fosfolipidi (Figura 3.15). Data la loro struttura
chimica, una volta immessi in ambiente acquoso, si organizzano in un doppio strato
mantenendo la coda idrofobica all’interno e la testa idrofilica a contatto con l’ambiente
acquoso.
Figura 3.15 - Struttura chimica di un fosfolipide e rappresentazione schematica della struttura di un liposoma
53
Esistono diversi tipi di fosfolipidi: neutri o carichi. In questo progetto sono stati
utilizzati fosfolipidi neutri DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). I
liposomi che si formano possono essere classificati in base a diversi parametri:
dimensione o numero di doppi strati fosfolipidici che li compongono (unilamellari,
multilamellari). In questo caso sono stati utilizzati i LUVs, ovvero large unilamellar
vescicles.
3.11.1 PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI
I liposomi sono stati preparati partendo da una soluzione di fosfolipidi in
metanolo/cloroformio (in rapporto 2:1) 10 mg/mL. Sono stati prelevati 393,7 μL e sono
stati immessi in un palloncino di vetro. Il solvente è stato poi evaporato mediante un
flusso di azoto gassoso, mantenendo il sistema in rotazione. Così facendo si è formato
uno strato di fosfolipidi secchi adeso al fondo del palloncino (cake). Successivamente è
stato messo in liofilizzatore overnight per eliminare completamente il solvente.
Il giorno successivo il film lipidico è stato reidratato con 1 mL di PBS non sterile
(concentrazione finale 5 mM) : il pallone è stato dunque messo nel rotavapor in
agitazione e lasciato a bagnomaria ad una temperatura superiore ai 50°C per 1 ora. In
questo modo si ha la formazione di liposomi disomogenei, multilamellari/unilamellari e
di dimensioni variabili.
In seguito a questa fase si è sottoposta la soluzione a shock termico: si è immerso prima
il pallone in azoto liquido per alcuni secondi, e successivamente a bagnomaria ad una
temperatura intorno ai 25°C. Questo è stato fatto all’incirca per una decina di volte.
Questo passaggio permette la rottura delle vescicole multilamellari e la formazione di
una sospensione più omogenea di vescicole unilamellari.
Il passaggio successivo consiste nella fase di estrusione: la sospensione è stata fatta
passare usando un Mini-Extruder Kit (Avanti Polar Lipids, Inc.) attraverso una serie di
filtri in policarbonato con pori di dimensioni decrescenti, per permettere la formazione
di liposomi di dimensioni ottimali per l’esperimento. Sono state utilizzate membrane
con pori di 1 μm, 0,4 μm e 0,1 μm per ottenere liposomi LUVs 100 nm.
54
3.12 BIACORE
Il biacore utilizza la tecnologia della risonanza plasmonica di superficie (surface
plasmon resonance – SPR). Il concetto base consiste nell’attacco di una molecola
(ligando) sulla superficie di un chip, e successivamente nel far fluire una soluzione
contente un campione (analita) sulla superficie del chip (Figura 3.16). L’attacco di
molecole sulla superficie del chip genera una risposta che risulta proporzionale alla
massa legata.
Figura 3.16 - Rappresentazione schematica dell'interazione sul chip [52]
L’analisi viene effettuata iniettando la soluzione sul sensore del chip: la soluzione viene
trasportata tramite un flusso continuo di tampone chiamato running buffer.
Si definisce rigenerazione (regeneration) il processo mediante il quale l’analita viene
rimosso dalla superficie del chip dopo un ciclo di analisi. In questo modo si dovrebbe
riuscire ad ottenere ligando libero, pronto per una nuova analisi. Questo dipende però
dalla forza del legame analita-ligando. Se questa infatti è molto forte, non si riuscirà a
rimuovere completamente l’analita.
La risposta generata dal legame viene misurata in RU (resonance units). L’intensità
della risposta è direttamente proporzionale alla quantità di molecole che si lega sulla
superficie. L’interazione viene poi illustrata tramite un grafico (sensogramma - Figura
3.17) che mette in relazione risposta (RU) e tempo.
55
Figura 3.17 - Rappresentazione schematica di un sensogramma [52]
La risonanza plasmonica di superficie è un fenomeno che si osserva in sottili strati di
materiale conduttore in corrispondenza dell’interfaccia tra mezzi con differente indice di
rifrazione. Nel biacore i mezzi sono rappresentati da una slide in vetro del chip e la
soluzione contente il campione. Tra questi è posto il materiale conduttore, che è
costituito da un sottile strato di oro sulla superficie del chip (Figura 3.18).
Figura 3.18 - Rappresentazione schematica della SPR [52]
56
Durante l’interazione le condizioni che permettono l’instaurazione del fenomeno di
risonanza sono molto sensibili a variazioni nell’indice di rifrazione della soluzione. Per
questo motivo anche minimi cambiamenti nella concentrazione della soluzione causano
cambiamenti nell’indice di rifrazione e di conseguenza nella risposta della SPR.
In questo progetto abbiamo utilizzato come ligando i liposomi LUVs e come analita i
peptidi antimicrobici a differenti concentrazioni. Gli studi di interazione tra peptidi e
membrane modello sono stati effettuati usando un Biacore X100 (GE Lifescience). Il
chip utilizzato è il chip L1 che presenta delle molecole di destrano modificate con dei
residui lipofilici che hanno lo scopo di ancorare i liposomi al chip (Figura 3.19).
Figura 3.19 - Rappresentazione schematica del chip L1 [52]
Inizialmente i liposomi sono stati immobilizzati sul chip iniettando una soluzione 1 mM
di DOPC LUVs: sono state effettuate tre iniezioni per 10 minuti con un flusso di 5
μL/min. Sono stati effettuati poi dei lavaggi con NaOH per eliminare eventuali liposomi
non ancorati al chip. Si è raggiunto un segnale di circa 9000 RU. Successivamente è
stata fatta flussare una soluzione di BSA (albumina da siero bovino) 0,1 mg/mL per
occupare i siti attivi del chip non occupati dai liposomi. Dopodichè sono stati effettuati
gli esperimenti di binding iniettando concentrazioni crescenti di peptide. Il flusso
dell’iniezione è stato mantenuto a 10 μL/min con un tempo di contatto di 540 secondi,
seguito da un tempo di dissociazione di 1200 secondi mediante PBS. I sensogrammi
sono stati ottenuti usando il software BIAevaluation v1.1 e quindi elaborati usando
GraphPad v 6.04.
58
In questo progetto sono state analizzate diverse serie di peptidi antimicrobici identificati
e caratterizzati dal Dott. Tomislav Rončević e dal gruppo di ricerca del Dipartimento di
Scienze dell’Università di Spalato, nell’ambito di una collaborazione scientifica con il
gruppo di ricerca in cui ho svolto la tesi.
I peptidi in oggetto sono stati suddivisi in tre classi:
Serie P
Clarkine
Kiadine
Il gruppo del Dott. Rončević, ha precedentemente condotto degli studi per saggiare
l’attività antibatterica dei peptidi, dai quali è stato possibile estrapolare un valore di
MIC (minima concentrazione inibente) e di MBC (minima concentrazione battericida).
Partendo da questi dati preliminari, in questo progetto abbiamo focalizzato la nostra
attenzione sullo studio degli effetti tossici in vitro che queste molecole possono causare
alle cellule dell’ospite, andando così a indagare la possibile interazione con membrane
cellulari e l’induzione del danno.
In particolare in questo progetto sono stati effettuati, dapprima, degli studi di
citotossicità su diverse linee cellulari, utilizzando sia cellule in attiva proliferazione che
cellule resting. Successivamente si è analizzata la capacità di interazione di questi
peptidi con membrane modello: si è cercato di ottenere delle informazioni riguardo il
possibile meccanismo d’azione, il tipo di interazione e sul possibile ruolo che altri
fattori possono svolgere.
59
4.1 STUDI DI CITOTOSSICITÀ – TEST MTT
Sono stati condotti i test MTT per valutare se il trattamento con peptidi antimicrobici
potesse essere tossico anche per le cellule dell’ospite.
Il test MTT si basa sulle proprietà che questo composto ha di attraversare la membrana
plasmatica e di essere ridotto all’interno del mitocondrio delle cellule metabolicamente
attive in blu di formazano. Tenendo conto del picco di assorbimento dell’MTT, è stato
possibile correlare il valore di densità ottica con la concentrazione di cellule vitali nel
pozzetto.
4.1.1 MEC-1 – SERIE P
Le prime prove sono state effettuate trattando le cellule MEC-1 per 24h in terreno
completo (TC) con i peptidi della serie P a concentrazioni scalari da 1 μM a 100 μM;
inoltre, ogni set sperimentale comprendeva il gruppo di controllo (cellule non trattate
con i peptidi). I risultati ottenuti sono riportati nella Figura 4.1 e sono espressi come
valori medi della percentuale di cellule vitali (±SEM) dopo 24h di esposizione con i
peptidi alle concentrazioni indicate in asse X; le colonne in grigio riportano i valori del
gruppo di controllo.
Dall’analisi si può notare che i peptidi P3, P4 e P5 non hanno alcun effetto sulla vitalità
della linea cellulare, fino alla concentrazione più elevata. Per quanto riguarda i peptidi
P1 e P2, solo alla concentrazione di 100 μM la vitalità scende in modo statisticamente
significativo, ed in particolare P1 raggiunge il valore di IC50.
Per quanto riguarda il P6 le cellule risultano molto più sensibili: già a 50 μM la
percentuale di vitalità scende a 15,7% ± 0,10, mentre a 10 μM si osserva il 91% ± 2,75
di vitalità. I risultati appaiono statisticamente significativi.
60
**
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 25 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
**
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P2
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P3
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P4
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P5
** *
*** ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P6
Figura 4.1 – Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100
μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
61
4.1.2 MEC-1 – CLARKINE
Successivamente le cellule della linea MEC-1 sono state trattate con i peptidi
appartenenti alla classe delle Clarkine, mantenendo lo stesso range di concentrazione. I
risultati ottenuti sono riportati in Figura 4.2.
Dai grafici risulta che nessuno dei peptidi appartenenti a questa classe è capace di
causare una diminuzione nella percentuale di vitalità cellulare, pertanto sembra non
esserci alcun tipo di interazione con la membrana delle cellule dell’ospite. I risultati
infatti non risultano statisticamente significativi (analisi statistica effettuata con Test
Student Newman Keuls, ANOVA).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P9
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P10
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P11
Figura 4.2 – Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P9 – P11 (0-100
μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM
62
4.1.3 MEC-1 – KIADINE
I test di citotossicità sono stati inoltre effettuati utilizzando come trattamento una nuova
serie di peptidi antimicrobici appartenenti alla classe delle Kiadine, peptidi sintetici
ricchi in residui di Gly e Lys, ottenuti a partire dal “template” di un piccolo peptide
naturale (PGLa-H). Partendo dalle analisi già condotte su questa classe di peptidi
riportate in letteratura [33] [34], i risultati dei nostri test, effettuati con una diversa linea
cellulare, sono in accordo con i dati precedentemente riportati.
In questo set di esperimenti sono state mantenute concentrazioni di peptide fino a 50
μM, in riferimento ai dati riportati negli articoli riguardo l’attività antimicrobica (valori
di MIC e MBC).
Dai risultati riportati in Figura 4.3 emerge che tutti i peptidi di questa serie riducono la
percentuale di vitalità cellulare.
In particolare, per quanto riguarda (PGLaH)2, l’IC50 viene raggiunta ad una
concentrazione di 10 μM.
Kiadina-2 (K2) e Kiadina-3 (K3) appaiono meno citotossici nei confronti di MEC-1:
alla massima concentrazione utilizzata (25 μM) circa l’80% della popolazione cellulare
risulta ancora vitale. Le modifiche introdotte nella struttura risultano quindi utili nel
ridurre la tossicità per la cellula ospite.
Nel caso di Kiadina-4 (K4) e Kiadina-6 (K6), rispettivamente a 50 μM e 25 μM, la
percentuale di vitalità è di circa il 20%. K6, in particolare, mantiene un’attività
citotossica confrontabile con il peptide naturale.
63
* ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 25
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
K2
* **
*** ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 25
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
(PGlaH)2
* **
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 25
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
K3
***
***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 0,5 1 5 50
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
K4
**
***
***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 25
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
K6
Figura 4.3 - Test MTT su cellule MEC-1 (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi della serie
Kiadine (0-25/50 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
64
4.1.4 MCF-7_ADR – SERIE P
In seguito ai risultati riportati negli esperimenti finora descritti, è stata impiegata
un’ulteriore linea cellulare per verificare se il comportamento del peptide potesse essere
linea cellulare-dipendente. La linea cellulare utilizzata, derivante da un carcinoma
mammario, è resistente all’adriamicina ed è caratterizzata da overespressione di P-gp
(glicoproteina-P) [53]. Sono state mantenute le stesse condizioni di concentrazione e di
tempi di trattamento utilizzate per la linea MEC-1. I risultati sono visibili in Figura 4.4.
*** ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P2
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P3
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P5
Figura 4.4 - Test MTT su cellule MCF-7_ADR (10^5 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 – P2 – P3 – P5 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi
statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
65
Dagli istogrammi sopra riportati, si evince che questa linea cellulare risulta molto meno
sensibile ai peptidi utilizzati rispetto alla linea MEC-1. Questo comportamento può
dipendere dal fenotipo resistente; si tratta, infatti, di una linea MDR che iperesprime la
pompa di estrusione per farmaci. [53] La vitalità cellulare si mantiene intorno al 90%
alla concentrazione massima utilizzata per P2, P3 e P5, eccezion fatta per il P1, che, a
100 μM appare leggermente più tossico, portando la percentuale di vitalità al 70% circa.
In questo caso infatti si può osservare una significatività statistica dei risultati.
La minor suscettibilità di questa linea e la diversa attività citotossica dei peptidi, hanno
indotto ad estendere lo studio anche ad altre cellule, sia proliferanti, sia resting,
focalizzandolo sui due peptidi più citotossici, ovvero il P1 e il P6.
4.1.5 HaCat – P1 e P6
La linea HaCat rappresenta un modello di cheratinociti in attiva proliferazione che
crescono in adesione. I risultati dei test MTT riportati in Figura 4.5 mostrano che questa
linea risulta sensibile agli effetti tossici di P1 e P6 tanto quanto la linea MEC-1. I dati
inoltre, mediante analisi statistica, sono risultati altamente significativi (P<0,001) anche
tra le varie concentrazioni dei singoli peptidi.
*** *** ***
***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 25 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
** ***
***
*** ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P6
Figura 4.5 - Test MTT su cellule HaCat (2 x 10^5 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100 μM)
per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
66
Come ulteriore modello in vitro per studiare la citotossicità dei peptidi sono stati
utilizzati dei leucociti, estratti da sangue di donatori sani, per allestire delle colture
primarie. Da letteratura è stato riportato che le cellule da coltura primaria o da linea
mantenuta in vitro, presentano caratteristiche in parte diverse, quali la fluidità della
membrana e marker di differenziamento [54] [55]. Pertanto, i leucociti ottenuti ex vivo,
rappresentano un utile e predittivo modello sperimentale in quanto consentono di
studiare gli effetti su cellule circolanti, il cui ruolo è fondamentale nei sistemi di difesa
dell’ospite dalle infezioni.
4.1.6 MONOCITI – P1 e P6
I monociti sono stati isolati dal buffy coat, precedentemente separato dall’Ospedale
Maggiore di Trieste, e sono stati messi in coltura e trattati con P1 e P6 a concentrazioni
analoghe a quelle usate per le linee cellulari in attiva proliferazione. Si è voluto
indagare, infatti, l’effetto dei peptidi su cellule resting estratte dal sangue. I risultati
degli esperimenti condotti sono riportati in Figura 4.6.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 25 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P6
Figura 4.6 - Test MTT su monociti estratti da buffy coat (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi
P1 - P6 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
67
Analizzando i grafici si evince che risultano meno sensibili rispetto alle colture cellulari
immortalizzate, solo a concentrazioni più alte (100 μM) notiamo una diminuzione della
vitalità cellulare di circa il 20% con entrambi i peptidi. Questo perché, essendo una
coltura primaria, le cellule sono vitali ma non in attiva proliferazione e di conseguenza
la loro attività metabolica risulta rallentata rispetto alle linee cellulari neoplastiche.
4.1.7 LINFOCITI – P1 e P6
In seguito i test MTT sono stati condotti su linfociti, analogamente estratti da sangue
proveniente da donatori sani. I risultati sono riportati in Figura 4.7.
Anche in questo caso si può osservare lo stesso trend: sensibilità minore riguardo agli
effetti tossici, ma comunque significativa (P<0,01) per P6 a 50 μM.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 25 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
**
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P6
Figura 4.7 - Test MTT su linfociti estratti da buffy coat (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100 μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 ***
P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
68
4.1.8 MACROFAGI – P1 e P6
Infine a partire da monociti estratti da buffy coat, è stato indotto il differenziamento in
macrofagi mediante la somministrazione di lipopolisaccaride batterico (LPS), ovvero un
endotossina in grado di attivare la risorsa immunitaria dell’ospite, ottenendo così cellule
MDM-LPS (procedura dettagliata riportata nella sezione Materiali e Metodi). La coltura
è stata utilizzata per effettuare il test MTT con P1 e P6 alle stesse condizioni di
trattamento usate per le altre linee. I risultati sono così riportati in Figura 4.8.
Questa coltura appare meno sensibile a P1 e P6 rispetto alle altre due colture primarie. I
risultati infatti non risultano statisticamente significativi.
Riassumendo, dai risultati riportati negli esperimenti finora descritti, si può quindi
effettuare un confronto tra le diverse linee cellulari, per quanto riguarda P1 e P6, come
riportato in Figura 4.9 e Figura 4.10.
Per quanto riguarda P1 le linee MEC-1 e HaCat risultano più sensibili rispetto alle
colture primarie. In particolare si può osservare una chiara dipendenza dalla
concentrazione nella linea HaCat. Mentre monociti e linfociti appaiono poco sensibili e
solo le concentrazioni più alte (intorno a 100 μM) causano una lieve inibizione della
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 10 25 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P1
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1 5 10 50 100
Vit
alit
à (%
)
Peptide (μM)
P6
Figura 4.8 - Test MTT su MDM-LPS (10^6 cell/mL) – Grafici a istogrammi rappresentanti in ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale, e in ascissa i valori di concentrazione del trattamento con i peptidi P1 - P6 (0-100
μM) per 24h in TC. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM.
69
vitalità. P6 invece appare molto più tossico in MEC-1 e HaCat, riducendo la percentuale
di cellule vitali al di sotto del 20% già a 50 μM. Per quanto riguarda le colture primarie
invece, gli effetti sono sovrapponibili a quelli riportati per P1: tossicità trascurabile,
tranne alle concentrazioni più alte.
*** ***
***
***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
MEC-1 HaCat Monociti Linfociti Macrofagi
Vit
alit
à (%
)
P1
0
1
10
25
50
100
**
Figura 4.9 – Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P1 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di
campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
**
**
*** *
***
*** **
*** ***
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
MEC-1 HaCat Monociti Linfociti Macrofagi
Vit
alit
à (%
)
P6
0
1
5
10
50
100
Figura 4.10 - Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P6 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di
campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
*** ***
70
4.1.9 ASSOCIAZIONE P1-P6
Visti i risultati degli esperimenti, il gruppo di ricerca dell’Università di Spalato ha
effettuato successivamente dei test di MIC valutando l’effetto dell’associazione di P1 e
P6 (in rapporto 1:1), per indagare se i due peptidi in combinazione potessero avere o
meno un effetto sinergico. Gli esperimenti sono stati condotti in due condizioni
differenti (full MH e 20%MH) su S. aureus (ATCC e c.i.), E. faecalis ATCC, E. coli
(ATCC e c.i.), A. baumanii (ATCC e c.i.). I risultati più rilevanti sono emersi nei
confronti di S. aureus e sono riportati in Tabella 4-1, messi a confronto con i precedenti
risultati dei singoli peptidi.
Tabella 4-1 – Risultati dei test di MIC
MH P1 P6 MIX FIC index
S. aureus ATCC 29213 16 4 2 0,625
S. aureus c.i. 64 8 8 1,125
20%MH
S. aureus ATCC 29213 4 1 1 1,250
S. aureus c.i. 32 4 4 1,125
Valori di MIC (µM) di P1, P6 e MIX (P1 + P6 in rapporto 1:1) ottenuti in terreno completo (MH) e in 20% MH. Si
riporta il FIC index calcolato.
È stato calcolato il FIC index (fractional inibitory concentration) [56] applicando la
formula:
𝑭𝑰𝑪 𝒊𝒏𝒅𝒆𝒙 = 𝑭𝑰𝑪 (𝑨) + 𝑭𝑰𝑪 (𝑩) = ( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑨 𝒘𝒊𝒕𝒉 𝑩 )
( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑨 𝒂𝒍𝒐𝒏𝒆 )+
( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑩 𝒘𝒊𝒕𝒉 𝑨 )
( 𝑴𝑰𝑪 𝒐𝒇 𝑩 𝒂𝒍𝒐𝒏𝒆 )
Il valore di FIC index varia da 0 a 2 (Figura 4.11), dove per valore:
≤ 0,5 associazione sinergica
> 0,5 e ≤ 1 associazione additiva
> 1 e ≤ 2 associazione indifferente
> 2 associazione antagonista
71
Figura 4.11 - Figura rappresentativa della distribuzione dei valori di FIC index calcolati nel caso di un'associazione di due farmaci [57]
Il valore di FIC index calcolato (Tabella 4-1) evidenzia che la combinazione dei due
peptidi in terreno MH ha un effetto di associazione additiva impiegando il ceppo ATCC
di S. aureus, mentre in tutti gli altri casi l’associazione risulta indifferente. I due peptidi
associati non mostrano effetto antagonista.
Per questo motivo abbiamo condotto i successivi test MTT utilizzando come
trattamento l’associazione dei due peptidi, al fine di valutare l’effetto tossico sulle
cellule dell’ospite. Le concentrazioni sono state scelte valutando il valore di MIC
calcolato negli esperimenti effettuati dall’Università di Spalato, combinandolo con il
valore di IC50 calcolato nei test MTT fino ad ora descritti. Sono state utilizzate tre
differenti combinazioni:
P1 25 μM + P6 5 μM ≈ MIC
P1 25 μM + P6 10 μM 1 4⁄ IC50
P1 100 μM + P6 50 μM IC50
72
I risultati sono riportati in Figura 4.12 mettendo a confronto le varie linee cellulari.
Dal grafico si nota che, alle concentrazioni batteriostatiche (MIC), l’associazione è ben
tollerata dalla linea MEC-1 (fino a ¼ IC50). L’effetto citotossico si manifesta in maniera
marcata alla concentrazione più alta utilizzata. Gli stessi risultati si sono osservati anche
per la linea HaCat. Per quanto riguarda le colture primarie si può osservare una
diminuzione della vitalità cellulare concentrazione-dipendente meno evidente
(inibizione del 10-25%), ma comunque presente.
Le prove di citotossicità descritte finora sulle diverse linee cellulari, indicano che per
quanto riguarda le Kiadine, tutti i peptidi analizzati risultano avere un effetto tossico
marcato per le cellule, ad eccezione di K2 e K3. Per quanto riguarda invece i peptidi
della serie P solo P6, e in parte P1, mostrano un’attività citotossica nei confronti delle
diverse linee impiegate e che questa attività è chiaramente concentrazione-dipendente.
** ** *
*** **
**
***
0
20
40
60
80
100
120
MEC-1 HaCat Monociti Linfociti MDM-LPS
Vit
alit
à (%
) 0
P1 25 + P6 5
P1 25 + P6 10
P1 100 + P6 50
Figura 4.12 - Istogramma riassuntivo che mette a confronto i risultati dei test MTT di P1 + P6 nelle diverse linee cellulari. In ordinata i valori di vitalità espressi in percentuale e in ascissa i nomi delle linee cellulari. Valori medi di
campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
73
Successivamente alle prove di citotossicità, si è proceduto con l’analisi del danno
cellulare indotto dall’esposizione con i peptidi P1 e P6 mediante l’utilizzo del
Citofluorimetro e inoltre della Risonanza Plasmonica di Superficie per dettagliare
l’interazione con membrane modello.
4.2 MECCANISMO D’AZIONE
4.2.1 EFFETTO DEL TRATTAMENTO SULLA MORFOLOGIA
CELLULARE
I primi esperimenti sono stati effettuati impiegando la tecnica citofluorimetrica per
andare a valutare se l’interazione con P1 e P6 causasse un danno diretto alla membrana
plasmatica. La sonda PI che è stata utilizzata è infatti in grado di attraversare la
membrana solo nel caso in cui questa non sia integra (evento correlato a un danno di
tipo necrotico).
Per tutte le analisi eseguite al citofluorimetro è stata utilizzata la linea MEC-1
mantenendola in PBS nel tempo di incubazione con i peptidi (fino a 60 minuti). Le
condizioni impiegate consentono di valutare la relazione tempo-danno, in un ambiente
minimo, quale il tampone fosfato-salino, che previene sia interazioni che sequestro del
peptide.
Le prime prove sono state effettuate con P1 alla concentrazione di 10 μM e 25 μM. Gli
istogrammi biparametrici (FS/SS) riportati in Figura 4.13 mostrano che, anche dopo 60
minuti, alla concentrazione più elevata non si osserva un’alterazione nella morfologia
delle cellule, che appaiono sovrapponibili al controllo.
74
AP241117 MEC1 CTRL T30 00033739 378.LMD
SS Log
FS
Lin
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
Gate 3
Gate 1
Gate 2
AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD
SS Log
FS
Lin
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
Gate 2
Gate 1
Gate 3
Figura 4.14 - Istogrammi biparametrici dot plot che correlano i segnali di side scatter (SSlog) con quelli di forward scatter (FSlin). A sinistra cellule di controllo a T30, a destra cellule trattate con P6 a ≈25μM a T30.
Questo dato conferma i risultati dei test MTT condotti su MEC-1, dove a 25μM si
osserva una percentuale di cellule vitali del 96% ± 0,69.
Successivamente si è andato a valutare P6 alle stesse condizioni di trattamento e tempo
di esposizione di P1. Da questi risultati preliminari si è visto che alla concentrazione di
10 μM, sia a T30 che a T60, la percentuale di cellule in Gate 1 si mantiene intorno
all’80%. Al contrario, a 25μM, già a T30 si osserva uno shift verso il Gate 2 (cellule
danneggiate) che raccoglie circa il 90% delle cellule (Figura 4.14).
SP230218 MEC1 in PBS 4 P1 25uM T60 00033966 580.LMD
SS Log
FS
Lin
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
Gate 2
Gate 1
Gate 3
SP230218 MEC1 in PBS 1 CTRL T60 37^C 00033963 577.LMD
SS Log
FS
Lin
100
101
102
103
104
0
256
512
768
1024
Gate 2
Gate 1
Gate 3
Figura 4.13 – Istogrammi biparametrici dot plot che correlano i segnali di side scatter (SSlog) con quelli di forward scatter (FSlin) di cellule MEC-1. A sinistra cellule di controllo a T60, a destra cellule trattate con P1 a 25μM
per 60 minuti (T60).
75
Questi risultati sono in accordo con quelli ottenuti nei test MTT in cui il trattamento con
P6 causa tossicità cellulare concentrazione-dipendente.
In Tabella 4-2 sono riportati i dati relativi alle % di cellule in Gate 1 e Gate 2 per
entrambi i peptidi, in funzione della concentrazione e del tempo di trattamento.
T15 P1 (10 μM) P1 (25 μM) P6 (10 μM) P6 (25 μM)
% Gate 1 95,38 94,52 64,61 ± 10,97 6,11 ± 0,49
% Gate 2 3,94 4,68 31,88 ± 9,59 86,41 ± 2,36
T30
% Gate 1 94,63 92,38 51,86 ± 19,43 8,58 ± 1,56
% Gate 2 4,57 6,45 32,51 ± 8,67 70,46 ± 5,72
T60
% Gate 1 94,67 91,61 - -
% Gate 2 4,41 6,77 - -
Tabella 4-2 - % di cellule in Gate 1 e Gate 2 per P1 e P6 in funzione della concentrazione e del tempo di trattamento. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM.
4.2.2 ANALISI DEL DANNO – APOPTOTICO O NECROTICO
La valutazione del danno causato dai peptidi, in particolare P6, è stata effettuata
utilizzando una doppia marcatura con una sonda vitale potenziometrica (DiOC6) ed il
PI, indicatore di danno di membrana. L’impiego di entrambe le sonde permette di
discriminare il danno cellulare di tipo necrotico o di tipo apoptotico; in particolare, le
cellule vitali si raccolgono nel quadrante LR, le tardo apoptotiche nel quadrante UR e le
necrotiche in quello UL. In Figura 4.15 sono riportati dei dot-plot rappresentativi di
cellule con la doppia marcatura del gruppo di controllo (A) o trattate con i peptidi (B,
C).
76
Dai grafici si può notare che, nel caso di P1, sia le cellule di controllo che le cellule
trattate con il peptide a 25μM, si posizionano per circa il 90% all’interno del quadrante
in basso a destra (LR) e rappresentano la percentuale di cellule vitali. La situazione
rimane invariata anche dopo 60 minuti dall’esposizione al trattamento.
Per quanto riguarda P6, invece, dopo 30 minuti dall’esposizione a 25μM di peptide, le
cellule shiftano per più dell’80% nel quadrante delle tardo apoptotiche in alto a destra
(UR): un aumento della fluorescenza verde e un concomitante aumento della
fluorescenza rossa indicano che il peptide è in grado di indurre danno e portare la
< SP230218 MEC1 in PBS 4 P1 25uM T60 00033966 580.LMD >
Gate 3
DiOC6 (FL1 Log, 525nm)
PI (F
L3
Lo
g, 6
10
nm
)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
86,77%
0,00%
10,40% 2,83%
Gate 4
< AP241117 MEC1 P6 28uM T30 00033742 381.LMD >
Gate 3
DiOC6 (FL1 Log, 525nm)
PI (F
L3
Lo
g, 6
10
nm
)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
15,90%
0,04%
83,44% 0,62%
Gate 4
< AP241117 MEC1 CTRL T30 00033739 378.LMD >
Gate 3
DiOC6 (FL1 Log, 525nm)
PI (F
L3
Lo
g, 6
10
nm
)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
Gate 4
0,56% 1,99%
0,00%
97,45%
Figura 4.15 – Grafico biparametrico dot plot che correla i segnali relativi a PI (FL3Log) e a DiOC6 (FL1Log). Le cellule MEC-1 (1x10^6 cell/mL) sono state colorate con DiOC6 e PI. A) cellule di controllo a T60, B) cellule trattate
con P1 a 25uM a T60, C) cellule trattate con P6 a ≈ 25 μM
UR UL
LL LR
B
UL UR
LL LR
UR UL
LL LR
A
C
77
cellula in apoptosi. Pressoché la stessa situazione si presenta anche dopo 60 minuti,
indicando che si raggiunge rapidamente l’effetto massimo e che questo risulta
concentrazione-dipendente.
4.2.3 EFFETTO DEL PEPTIDE IN TERRENO COMPLETO
Negli esperimenti successivi si è deciso di indagare il possibile effetto di altre varianti
nell’influenzare la tossicità di P6. In particolar modo, si è deciso di valutare se
l’ambiente extracellulare, e quindi la quantità di sali, potesse avere qualche effetto nel
modulare la tossicità. È noto, infatti, che l’azione dei peptidi antimicrobici è
strettamente correlata alla sequenza amminoacidica e corrispondentemente alla
conformazione che il peptide assume quando viene a contatto con il doppio strato
fosfolipidico. Come noto, uno svantaggio nell’uso dei peptidi come terapia
antimicrobica è dovuto alla loro “salt-sensitivity”. E’ stato descritto che per alcuni AMP
l’attività antimicrobica risulta diminuita dalla presenza di sali nell’ambiente
extracellulare. Ci sono molti esempi in letteratura che trattano questo argomento [58]
[59] [60] allo scopo di comprendere e implementare la salt-resistance. [61] [62]
Gli AMPs necessitano di un’interazione elettrostatica con la membrana dei batteri per
formare strutture secondarie ed esplicare quindi la loro funzione antimicrobica. Questa
attrazione è influenzata dalla concentrazione di sali. Una stabilizzazione, infatti, della
struttura secondaria sembra portare ad un aumento della salt-resistance. [63]
Poiché i risultati citofluorimetrici hanno evidenziato per P6 una notevole tossicità, a
parità di concentrazione, più marcata rispetto ai test MTT, pur esponendo le cellule per
un’ora rispetto alle 24h del test MTT, un’ulteriore variante nello svolgimento delle due
prove (citofluorimetrica e spettrofotometrica), ha riguardato il fatto che per i test
citofluorimetrici i peptidi sono stati mantenuti in tampone PBS, rispetto al terreno
completo impiegato nei test MTT. Per comprendere il ruolo dei due mezzi (PBS o
Terreno Completo) in cui sono stati sciolti i peptidi, i successivi esperimenti al
citofluorimetro sono stati condotti utilizzando sempre la stessa concentrazione di
peptide (10 μM e 25μM), sospendendo però le cellule sia in PBS che in terreno di
coltura e confrontando i risultati sul danno cellulare indotto dal peptide. I risultati sono
esposti utilizzando un grafico a istogramma (Figura 4.16):
78
Figura 4.16 - Grafico a istogrammi che mette a confronto cellule in PBS e cellule in TC trattate con P6 a 10 μM e a 25μM a T30. Valori medi di campioni in triplicato ± SEM (* P<0,05 **P<0,01 *** P<0,001 – a: P<0,05 aa: P<0,01 aaa:
P<0,001 analisi statistica effettuata con Test Student Newman Keuls, ANOVA)
Dal grafico si può notare che, per quanto riguarda le cellule sospese in PBS, si osserva
una diminuzione della percentuale di cellule vitali con l’aumentare della concentrazione
di P6. Corrispondentemente si nota un aumento della percentuale di cellule danneggiate,
accumulate in tarda apoptosi, mentre la percentuale di cellule necrotiche rimane
trascurabile. I valori sono statisticamente significativi rispetto al controllo in PBS.
Per quanto riguarda invece le cellule sospese in terreno completo (TC), il peptide perde
l’effetto tossico a bassa concentrazione, infatti, non si nota con P6 a 10 μM, nessuna
riduzione nella percentuale di cellule vitali, che risultano completamente confrontabili
con il gruppo non trattato dei controlli (CTRL). Aumentando la concentrazione (25 μM)
vi è un brusco calo nella percentuale di cellule vitali per entrambe le condizioni (<20%),
ma il danno osservato sembra dipendere dal mezzo in cui si trovano le cellule. In PBS,
ovvero in una situazione minima di un tampone che contiene la concentrazione di sali
necessaria e sufficiente a mantenere funzionali i sistemi di trasporto e la vitalità
***
*** ***
**
***
*
***
0
20
40
60
80
100
120
CTRL_PBS 10_PBS 25_PBS CTRL_TC 10_TC 25_TC
% p
op
ola
zio
ne
ce
llula
re
P6 T30
% vitali
% late apo
% necrotiche
aaa
aaaa
aaa
79
cellulare, il peptide risulta particolarmente tossico già a 10 μM. Al contrario, in TC, è
interessante notare che fino a 10 μM, sembra che il terreno svolga un ruolo protettivo
nei confronti della cellula, mantenendola vitale, forse sequestrando parte del peptide.
Questo rappresenta un’ulteriore conferma dei risultati dei test MTT condotti
precedentemente. Il test infatti viene condotto in terreno completo, non in PBS.
Aumentando la concentrazione (25 μM) il TC perde la capacità di ridurre il danno
indotto dal peptide ed infatti la % di cellule vitali (< 20%) è confrontabile nelle due
condizioni; risulta però diverso il tipo di danno, in quanto in TC le cellule muoiono per
necrosi.
Le prove sono state effettuate sia a 15 che a 30 minuti. Il grafico si riferisce ai dati
raccolti a 30 minuti, ma risulta esattamente sovrapponibile al grafico dei dati raccolti a
T15. Questo conferma l’ipotesi che era emersa nei precedenti esperimenti riguardo la
dipendenza dal tempo: gli effetti tossici nei confronti delle cellule MEC-1 si
manifestano in tempi rapidi e si mantengono nel tempo. In conclusione si può affermare
che la capacità del peptide di indurre tossicità risulta influenzata dall’ambiente di
incubazione.
4.3 STUDI DI INTERAZIONE CON MEMBRANE
MODELLO– SURFACE PLASMON RESONANCE
Dopo aver effettuato gli studi per testare la tossicità dei peptidi su diverse linee cellulari,
si è deciso di continuare analizzando l’interazione di questi con membrane modello, per
identificare con maggiore precisione il tipo di legame che si instaura con il doppio strato
fosfolipidico della membrane cellulari.
Per fare questo sono stati utilizzati dei liposomi (LUVs) grandi 100 nm, costituiti da
fosfolipidi neutri, ovvero DOPC. La struttura chimica è riportata in Figura 4.17.
Possiede una temperatura critica (Tc) di - 20C°, di conseguenza a temperatura ambiente
si trova in fase liquida.
80
Figura 4.17 – struttura chimica fosfolipide DOPC (Dioleoylphosphatidylcholine)[64]
I liposomi sono stati testati sia con i peptidi appartenenti alla serie P (P1 e P6), sia con
le Kiadine, integrando così le informazioni raccolte dagli articoli riguardanti questa
classe.
I liposomi LUVs, preparati come riportato nella sezione Materiali e Metodi, costituiti da
DOPC, sono stati immobilizzati sul sensor chip L1 del Biacore: il chip presenta delle
molecole di destrano modificate con dei residui lipofilici che hanno lo scopo di ancorare
i liposomi al chip, quando questi vengono fatti flussare sulla sua superficie. Dopo la
prima iniezione di DOPC si verifica un notevole aumento di RU, fino a circa 9000,
valore che rimane costante nelle successive iniezioni. Questo suggerisce una possibile
saturazione dei siti sulla superficie del chip. Per confermare questa ipotesi, viene
iniettata BSA per occupare gli eventuali siti liberi. Il livello di immobilizzazione
raggiunto dalla BSA è talmente basso da indicare che la superficie è già stata
completamente coperta dai liposomi LUVs. Successivamente è stata testata la capacità
di binding, tramite l’iniezione di una serie di concentrazioni crescenti di peptidi.
In primo luogo sono stati analizzati i peptidi P1 e P6. In Figura 4.18 sono riportati il
sensogramma di binding (A) e la relativa curva di affinità (B) ottenuti per P1.
81
Dal grafico emerge che P1 è in grado di legarsi alla membrana, il segnale di RU
aumenta all’aumentare della concentrazione di peptide iniettata. Nonostante questo non
è possibile raggiungere la saturazione. Per questo motivo, tramite BiaEvaluation
Software, non è stato possibile calcolare accuratamente la KD, che viene stimata a
5,084E-4 M. Durante la fase di dissociazione a 32 μM la curva di binding non ritorna
alla baseline dopo il lavaggio con il running buffer, suggerendo che il peptide a questa
concentrazione forma un complesso stabile e irreversibile con i fosfolipidi della
membrana modello. Dai sensogrammi non si evidenzia una diminuzione improvvisa del
segnale, indicando che non ci dovrebbe essere uno sfaldamento del LUVs. [65]
Figura 4.18 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di P1 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di P1 (0-32 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato.
82
Quindi conferma quanto emerso dagli esperimenti condotti al citofluorimetro in cui non
si evidenzia alcun effetto membranolitico.
Successivamente sono stati condotti gli esperimenti con P6, i risultati sono riportati in
Figura 4.19.
Figura 4.19 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di P6 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di P6 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato.
83
Osservando i grafici si può notare che P6, analogamente a P1, è in grado di legarsi alla
membrana, infatti, anche in questo caso, il segnale di binding aumenta all’aumentare
della concentrazione di peptide, ma mostra un comportamento molto diverso rispetto al
peptide precedente. Il segnale di RU cresce esponenzialmente, in maniera non lineare.
Si può osservare infatti un aumento netto che passa dai 2000 RU di binding quando si
inietta il peptide a 8 μM a 8000 RU quando la concentrazione è raddoppiata a 16 μM.
Questa anomalia nel segnale suggerisce che in corrispondenza di queste concentrazioni
il peptide forma degli aggregati, probabilmente anche degli oligomeri, sulla superficie
dei liposomi. In questo caso la curva non è propriamente una curva di affinità, ed è
perciò impossibile calcolare una KD. Anche in questo caso troviamo conferma dei
risultati condotti al citofluorimetro, dove tra 10 µM e 25 µM la percentuale di cellule
vitali diminuiva. Questo ci indica che probabilmente l’effetto tossico di P6 è
strettamente correlato con la formazione di dimeri/oligomeri.
Gli esperimenti successivi sono stati condotti usando come peptidi quelli appartenenti
alla classe delle Kiadine. Per quanto riguarda i liposomi, sono stati utilizzati gli stessi
fosfolipidi usati per gli altri peptidi, ovvero DOPC. I LUVs sono stati sintetizzati
mediante la stessa procedura.
Per quanto riguarda diPGLa-H i risultati degli esperimenti condotti sono riportati in
Figura 4.20. Dal sensogramma si nota che il peptide è capace di legarsi ai liposomi,
infatti è stato possibile calcolare una KD = 5,2 µM. I segnali di RU infatti aumentano
proporzionalmente in base alla concentrazione iniettata.
84
In seguito i successivi esperimenti sono stati condotti su K1. I risultati sono riportati in
Figura 4.21.
Figura 4.20 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di (PGLaH)2 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di (PGLaH)2 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico
“affinity-steady state”.
85
Da questo grafico risulta che K1 è in grado di legarsi ai liposomi DOPC LUVs. Nel
sensogramma in corrispondenza di 8 µM e 16 μM la curva non torna alla baseline
durante la fase di dissociazione tramite il lavaggio con il running buffer. Questo indica
che il peptide forma un complesso stabile con i liposomi e non riesce a dissociarsi. Per
questo motivo non viene raggiunta la saturazione, e risulta impossibile calcolare una
KD. Rispetto a diPGLaH, si nota quindi un aumento dell’interazione con i liposomi e la
Figura 4.21 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K1 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K1 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
86
formazione di un legame più forte rispetto al peptide precedente. Si noti infatti che il
segnale di RU raggiunge circa i 2000, contro i 600 raggiunti da diPGLaH.
Per quanto riguarda K2 i grafici sono riportati in Figura 4.22.
Figura 4.22 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K2 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K2 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
87
In questo caso il peptide K2 risulta anch’esso capace di legarsi ai liposomi, infatti si
nota che il segnale di binding aumenta all’aumentare della concentrazione di peptide.
Rispetto ai peptidi precedenti però, mostra un comportamento molto particolare alla
concentrazione di 16 µM: il segnale decresce improvvisamente. Questo potrebbe essere
dovuto a perdita del materiale immobilizzato sul chip, quindi probabilmente a rottura o
sfaldamento dei liposomi. L’esperimento è stato condotto in duplicato e il risultato è
stato confermato. Questa volta è stato possibile calcolare una KD che è risultata essere
rispettivamente 2,7 μM e 2,4 µM.
Per quanto riguarda K3 i risultati sono riportati in Figura 4.23.
88
Il peptide K3 risulta in grado di legarsi ai liposomi DOPC LUVs e con alta affinità. A
16 μM è capace di formare un complesso stabile con le membrane modello, infatti il
segnale di binding non ritorna alla baseline dopo i lavaggi con il running buffer. La KD
è stata calcolata 6,4 µM.
Figura 4.23 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K3 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K3 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
89
Per quanto riguarda K4 i risultati sono riportati in Figura 4.24.
In questo grafico K4 risulta capace di legare i liposomi DOPC LUVs (esattamente come
le altre kiadine). A 16 µM forma un complesso stabile con le membrane modello, infatti
anche in questo caso il segnale di binding non ritorna alla baseline dopo i lavaggi con il
Figura 4.24 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K4 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K4 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
90
buffer. Dai due esperimenti che sono stati condotti, le KD sono state calcolate
rispettivamente 18 µM e 30 μM.
Per quanto riguarda K5 i risultati sono riportati in Figura 4.25.
Figura 4.25 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K5 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K5 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
91
Nel caso di K5, ugualmente capace di legare i liposomi DOPC LUVs, si nota un diverso
profilo delle curve di affinità del sensogramma, forse dato da un meccanismo di
interazione differente. Non è stato possibile calcolare una KD perché la curva di affinità
non riesce a raggiungere la saturazione. Il valore è stato solamente stimato a 0,2 M.
Per quanto riguarda K6 i risultati sono riportati in Figura 4.26.
Figura 4.26 - Sensogramma rappresentativo dell'interazione di K6 con DOPC (sopra) e curva di affinità(sotto). I sensogrammi sono stati ottenuti iniettando concentrazioni crescenti di K6 (0-16 μM) su DOPC LUVs immobilizzati su
chip L1. Le curve di affinità sono state adattate applicando il modello matematico “affinity-steady state”.
92
Nel caso di K6, ugualmente capace di legare i liposomi DOPC LUVs, in corrispondenza
di 16 μM si può dedurre la formazione di un complesso stabile con le membrane
modello. Sono stati condotti due esperimenti e, nonostante questo, non è stato possibile
raggiungere la saturazione e calcolare un valore di KD. Analogamente a K1, il segnale
raggiunge circa i 2000 RU.
In Tabella 4-3 sono riportati i valori di KD calcolati per ciascun peptide appartenente
alle Kiadine.
PEPTIDE KD
diPGLa-H
5,2 μM
K1
n.d.
K2
2,5 μM
K3
6,4 μM
K4
24 μM
K5
n.d.
K6 n.d.
Tabella 4-3 - Valori di KD calcolati per ciascun peptide. n.d. - non viene raggiunta la saturazione e non è stato possibile calcolare un valore di KD
94
Questo progetto di tesi è stato svolto nell’ambito di una collaborazione scientifica con il
Dipartimento di Scienze dell’Università di Spalato, ed in particolare con il dott.
Roncevic che si sta occupando di un progetto di studio su peptidi antimicrobici
provenienti da Anuri. I peptidi sono stati valutati per le proprietà citotossiche in modelli
di cellule eucariote e per la capacità di interazione con membrane modello; i peptidi
antimicrobici oggetto dello studio sono stati denominati “serie P”, “Kiadine” e
“Clarkine”.
I peptidi della serie P derivano da studi bioinformatici di analisi di database incrociati
con dati di sequenziamenti di RNA di 5 specie di Ranidae; sono stati selezionati 6
peptidi, in base alla idrofobicità, carica e altri aspetti legati alla struttura, per essere
sintetizzati e testati come agenti antibatterici.
Le Kiadine sono invece peptidi ricchi in glicina/lisina, progettati mediante l’uso di un
algoritmo computazionale validato. Questi peptidi sono stati ottenuti sia attraverso la
modificazione di un peptide naturale denominato PGLa-H, sia attraverso una sintesi ab
initio mediante studi QSAR.
Gli esperimenti condotti sui peptidi della serie P, hanno portato ad affermare che P1 e
P6 sono i peptidi più citotossici della serie, in particolare nei confronti delle linee
cellulari in attiva proliferazione, mentre per quanto riguarda le colture primarie la
tossicità appare trascurabile. Associando i due peptidi, alle concentrazioni
batteriostatiche (MIC), l’associazione è ben tollerata da tutte le colture cellulari
utilizzate. Gli esperimenti condotti hanno portato ad affermare inoltre che la
citotossicità evidenziata in P6 appare influenzata dall’ambiente.
Per quanto riguarda la classe delle Kiadine, è interessante notare che le modifiche
introdotte nella sequenza amminoacidica vanno a influenzare il comportamento del
peptide e quindi anche la tossicità verso le cellule dell’ospite.
Kiadina-4, Kiadina-5 e Kiadina-6 presentano più modifiche nella sequenza
amminoacidica, rispetto a K2 e K3, essendo disegnate ab initio. Dai risultati degli studi
condotti in questo progetto, si deduce che l’introduzione di molte modifiche nella
sequenza amminoacidica porta ad un mantenimento della tossicità verso le cellule
dell’ospite. Si può notare, invece, che, singole modifiche apportate alla sequenza
95
amminoacidica, come nel caso di K2 e K3, portano ad un miglioramento della
citotossicità, senza influenzare l’attività antibatterica.
Tutti i peptidi perdono parzialmente la struttura ad alfa-elica in ambiente acquoso, in
particolare K5, che appare completamente destrutturata, anche quando viene a contatto
con le membrane cellulari. K5 infatti, oltre alla struttura secondaria, perde anche
l’attività antimicrobica. Comportamento confermato dal diverso profilo delle curve di
affinità del sensogramma degli esperimenti di SPR.
K2 e K6 si approcciano parallelamente alla membrana, mantenendo la struttura ad alfa
elica, mentre K3 e K4 assumono una posizione verticale, legandosi alla membrana con
il dominio N-terminale carico positivamente.
Per quanto riguarda K6 si osserva un profilo di tossicità analogo al “template” naturale.
Riassumendo, i peptidi meno citotossici appaiono essere K2 e K3. Dagli esperimenti al
Biacore però, è emerso che K2 provoca alla concentrazione più alta, rottura o
sfaldamento dei liposomi. Questo appare in disaccordo con i risultati dei test MTT dove
si osserva una vitalità cellulare di circa l’80%. Questo diverso profilo di citotossicità
porta ad ipotizzare che sussista lo stesso comportamento osservato nel caso di P6: la
citotossicità potrebbe essere influenzata dall’ambiente di incubazione; gli esperimenti al
Biacore sono infatti condotti in PBS, contrariamente ai test MTT condotti in TC.
In conclusione si può affermare che, tra i peptidi studiati e riportati in questa tesi, i
risultati più interessanti sono stati ottenuti con Kiadina-3, che potrebbe essere valutata
come antibiotico di nuova generazione, grazie alla sua attività contro batteri MDR e alla
sua limitata citotossicità, non influenzata dall’ambiente.
96
GLOSSARIO
ABC = ATP Binding Cassette
ABPs = antibiofilm peptides
ABSSSI = Acute Bacterial Skin and
Skin Structure Infections
ADPs = Automatically Designed
Peptides
AMPs = antimicrobial peptides
Arg = arginina
AVPs = antivirus peptides
BSA = siero di albumina bovina
CCCP = carbonyl cyanide m-
chlorophenyl hydrazone
CPPs = cell penetrating peptides
D.O. = densità ottica
DADP = Database of Anuran Defense
Peptides
DC = dicroismo circolare
DiOC6 = 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine
Iodide
DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-
phosphocholine
EDTA = acido
etilendiamminotetracetico
Ev = endovena
FBS = siero fetale bovino
FC = flow cell
FD = fattore di diluizione
FIC = fractional inibitory concentration
FSC = forward scatter
GLcN I = glucosamina I
GLcN II = glucosamina II
Gly = glicina
HDPs = host defence peptides
IC50 = concentrazione inibente il 50%
della popolazione
KD = costante di affinità
LPG = lisilfosfatidilglicerolo
LPS = lipopolisaccaride
LS = light scattering
LUV = large unilamellar vescicle
Lys = lisina
MBC = minima concentrazione
battericida
MDM = monocyte derived macrophage
MDR = Multi-Drug Resistance
MFI = intensità media di fluorescenza
MH = Müller-Hinton
MIC = minima concentrazione inibente
MprF = multiple peptide resistance
factor
MRSA = Methicillin-Resistant
Staphylococcus Aureus
MTT = bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-
2-il)-2,5-difeniltetrazolio
n.d. = non determinato
o.n. = overnight
PBS = phosphate buffered saline
PEG = polietilenglicole
97
P-gP = glicoproteina-P
PI = propidio ioduro
QSAR = Quantitative Structure-Activity
Relationship
RND = Resistance-Nodulation-Division
RU = resonance units
SI = Indice di Selettività
SPPS = solid-phase peptide synthesis
SPR = surface plasmon resonance
SPS = solution-phase synthesis
SRA = Sequence Read Archive
Database
SSC = side scatter
TB = trypan blue
TC = terreno completo
UV = ultravioletto
Val = valina
98
BIBLIOGRAFIA
[1] ‘WHO | High levels of antibiotic resistance found worldwide, new data shows’,
WHO. [Online]. Available:
http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2018/antibiotic-resistance-
found/en/. [Accessed: 10-Oct-2018].
[2] E. F. Haney, S. C. Mansour, and R. E. W. Hancock, ‘Antimicrobial Peptides: An
Introduction’, Methods Mol. Biol., vol. 1548, pp. 3–22, 2017.
[3] A. Izadpanah and R. L. Gallo, ‘Antimicrobial peptides’, J. Am. Acad. Dermatol.,
vol. 52, no. 3 Pt 1, pp. 381–390; quiz 391–392, Mar. 2005.
[4] M. Mahlapuu, J. Håkansson, L. Ringstad, and C. Björn, ‘Antimicrobial Peptides:
An Emerging Category of Therapeutic Agents’, Front Cell Infect Microbiol, vol.
6, p. 194, 2016.
[5] A. Ahmad, E. Ahmad, G. Rabbani, S. Haque, M. Arshad, and R. H. Khan,
‘Identification and design of antimicrobial peptides for therapeutic applications’,
Curr. Protein Pept. Sci., vol. 13, no. 3, pp. 211–223, May 2012.
[6] A. Hollmann, M. Martinez, P. Maturana, L. C. Semorile, and P. C. Maffia,
‘Antimicrobial Peptides: Interaction With Model and Biological Membranes and
Synergism With Chemical Antibiotics’, Front Chem, vol. 6, p. 204, 2018.
[7] S.-J. Kang, S. J. Park, T. Mishig-Ochir, and B.-J. Lee, ‘Antimicrobial peptides:
therapeutic potentials’, Expert Rev Anti Infect Ther, vol. 12, no. 12, pp. 1477–
1486, Dec. 2014.
[8] [Online]. Available: https://nptel.ac.in/courses/104103018/module2/lec8/1.html.
[Accessed: 11-Oct-2018].
[9] B. Gomes et al., ‘Designing improved active peptides for therapeutic approaches
against infectious diseases’, Biotechnol. Adv., vol. 36, no. 2, pp. 415–429, Apr.
2018.
[10] Y. Shai, ‘Mode of action of membrane active antimicrobial peptides’,
Biopolymers, vol. 66, no. 4, pp. 236–248, 2002.
99
[11] M. Pasupuleti, A. Schmidtchen, and M. Malmsten, ‘Antimicrobial peptides: key
components of the innate immune system’, Crit. Rev. Biotechnol., vol. 32, no. 2,
pp. 143–171, Jun. 2012.
[12] A. Tossi, L. Sandri, and A. Giangaspero, ‘Amphipathic, alpha-helical
antimicrobial peptides’, Biopolymers, vol. 55, no. 1, pp. 4–30, 2000.
[13] K. A. Brogden, ‘Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in
bacteria?’, Nat. Rev. Microbiol., vol. 3, no. 3, pp. 238–250, Mar. 2005.
[14] ‘Image Gallery lipid a’. [Online]. Available:
http://keywordsuggest.org/gallery/508247.html. [Accessed: 03-Sep-2018].
[15] J. P. da Costa, M. Cova, R. Ferreira, and R. Vitorino, ‘Antimicrobial peptides: an
alternative for innovative medicines?’, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 99, no. 5,
pp. 2023–2040, Mar. 2015.
[16] T. Kruse and H.-H. Kristensen, ‘Using antimicrobial host defense peptides as anti-
infective and immunomodulatory agents’, Expert Rev Anti Infect Ther, vol. 6, no.
6, pp. 887–895, Dec. 2008.
[17] J. M. Sierra, E. Fusté, F. Rabanal, T. Vinuesa, and M. Viñas, ‘An overview of
antimicrobial peptides and the latest advances in their development’, Expert Opin
Biol Ther, vol. 17, no. 6, pp. 663–676, 2017.
[18] Y. J. Gordon, E. G. Romanowski, and A. M. McDermott, ‘A Review of
Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs’,
Curr Eye Res, vol. 30, no. 7, pp. 505–515, Jul. 2005.
[19] J. Wiesner and A. Vilcinskas, ‘Antimicrobial peptides: the ancient arm of the
human immune system’, Virulence, vol. 1, no. 5, pp. 440–464, Oct. 2010.
[20] D. Juretić, D. Vukicević, N. Ilić, N. Antcheva, and A. Tossi, ‘Computational
design of highly selective antimicrobial peptides’, J Chem Inf Model, vol. 49, no.
12, pp. 2873–2882, Dec. 2009.
[21] N. K. Brogden and K. A. Brogden, ‘Will new generations of modified
antimicrobial peptides improve their potential as pharmaceuticals?’, Int. J.
Antimicrob. Agents, vol. 38, no. 3, pp. 217–225, Sep. 2011.
[22] H.-K. Kang, C. Kim, C. H. Seo, and Y. Park, ‘The therapeutic applications of
antimicrobial peptides (AMPs): a patent review’, J. Microbiol., vol. 55, no. 1, pp.
1–12, Jan. 2017.
100
[23] A. Ladram and P. Nicolas, ‘Antimicrobial peptides from frog skin: biodiversity
and therapeutic promises’, Front Biosci (Landmark Ed), vol. 21, pp. 1341–1371,
01 2016.
[24] P. A. Santana, C. A. Álvarez, F. Guzmán, and L. Mercado, ‘Development of a
sandwich ELISA for quantifying hepcidin in Rainbow trout’, Fish Shellfish
Immunol., vol. 35, no. 3, pp. 748–755, Sep. 2013.
[25] M. Zasloff, ‘Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin:
isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a
precursor.’, Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 84, no. 15, pp. 5449–5453, Aug. 1987.
[26] Y. Ge, D. L. MacDonald, K. J. Holroyd, C. Thornsberry, H. Wexler, and M.
Zasloff, ‘In vitro antibacterial properties of pexiganan, an analog of magainin’,
Antimicrob. Agents Chemother., vol. 43, no. 4, pp. 782–788, Apr. 1999.
[27] Z. Jiang, R. S. Hodges, L. Gera, and C. T. MANT, ‘Dermaseptin-type and
piscidin-type antimicrobial peptides’, US20160333062A1, 17-Nov-2016.
[28] A. Ladram, B. Oury, D. Sereno, and T. Foulon, ‘Analogues of temporin-SHa and
uses thereof’, EP2853538A1, 01-Apr-2015.
[29] M. Novković, J. Simunić, V. Bojović, A. Tossi, and D. Juretić, ‘DADP: the
database of anuran defense peptides’, Bioinformatics, vol. 28, no. 10, pp. 1406–
1407, May 2012.
[30] N. Ilić et al., ‘Selective antimicrobial activity and mode of action of adepantins,
glycine-rich peptide antibiotics based on anuran antimicrobial peptide sequences’,
Biochim. Biophys. Acta, vol. 1828, no. 3, pp. 1004–1012, Mar. 2013.
[31] F. Hou et al., ‘Isolation and characterisation of a new antimicrobial peptide from
the skin of Xenopus laevis’, Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 38, no. 6, pp. 510–515,
Dec. 2011.
[32] K. Lohner and F. Prossnigg, ‘Biological activity and structural aspects of PGLa
interaction with membrane mimetic systems’, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1788,
no. 8, pp. 1656–1666, Aug. 2009.
[33] T. Rončević et al., ‘PGLa-H tandem-repeat peptides active against multidrug
resistant clinical bacterial isolates’, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Biomembranes, vol. 1859, no. 2, pp. 228–237, Feb. 2017.
101
[34] T. Rončević et al., ‘Antibacterial Activity Affected by the Conformational
Flexibility in Glycine–Lysine Based α-Helical Antimicrobial Peptides’, J. Med.
Chem., vol. 61, no. 7, pp. 2924–2936, Apr. 2018.
[35] T. Rončević et al., ‘Membrane-active antimicrobial peptide identified in Rana
arvalis by targeted DNA sequencing’, p. 1.
[36] Y. Kodama, M. Shumway, R. Leinonen, and International Nucleotide Sequence
Database Collaboration, ‘The Sequence Read Archive: explosive growth of
sequencing data’, Nucleic Acids Res., vol. 40, no. Database issue, pp. D54-56, Jan.
2012.
[37] A. Stacchini et al., ‘MEC1 and MEC2: two new cell lines derived from B-chronic
lymphocytic leukaemia in prolymphocytoid transformation’, Leuk. Res., vol. 23,
no. 2, pp. 127–136, Feb. 1999.
[38] ‘Details: ACC-497’. [Online]. Available:
https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/ACC-
497.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=192. [Accessed: 11-Oct-
2018].
[39] I. Colombo et al., ‘HaCaT Cells as a Reliable In Vitro Differentiation Model to
Dissect the Inflammatory/Repair Response of Human Keratinocytes’, Mediators
Inflamm., vol. 2017, p. 7435621, 2017.
[40] P. Boukamp, R. T. Petrussevska, D. Breitkreutz, J. Hornung, A. Markham, and N.
E. Fusenig, ‘Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid
human keratinocyte cell line’, J. Cell Biol., vol. 106, no. 3, pp. 761–771, Mar.
1988.
[41] A. V. Lee, S. Oesterreich, and N. E. Davidson, ‘MCF-7 cells--changing the course
of breast cancer research and care for 45 years’, J. Natl. Cancer Inst., vol. 107, no.
7, Jul. 2015.
[42] Pubchem, ‘Trypan blue’. [Online]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/9562061. [Accessed: 02-Sep-2018].
[43] F. Piccinini, A. Tesei, C. Arienti, and A. Bevilacqua, ‘Cell Counting and Viability
Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue
Assay’, Biol Proced Online, vol. 19, p. 8, 2017.
102
[44] T. Mosmann, ‘Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays’, J. Immunol. Methods, vol. 65,
no. 1–2, pp. 55–63, Dec. 1983.
[45] D. Gerlier and N. Thomasset, ‘Use of MTT colorimetric assay to measure cell
activation’, J. Immunol. Methods, vol. 94, no. 1–2, pp. 57–63, Nov. 1986.
[46] H. Tada, O. Shiho, K. Kuroshima, M. Koyama, and K. Tsukamoto, ‘An improved
colorimetric assay for interleukin 2’, J. Immunol. Methods, vol. 93, no. 2, pp. 157–
165, Nov. 1986.
[47] S. Desai, P. S. Sukhramani, P. S. Sukhramani, S. R. Tirthani, S. A. Desai, and M.
P. Suthar, ‘Biological cytotoxicity evaluation of spiro[azetidine-2, 3’-indole]-2’,
4(1’H)- dione derivatives for anti-lung and anti-breast cancer activity’, SCHOLAR
RESEARCH LIBRARY, vol. 3, pp. 236–243, Jul. 2011.
[48] ‘2 Metodi di separazione Parte1.pdf’. .
[49] Pubchem, ‘Propidium iodide’. [Online]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104981. [Accessed: 02-Sep-2018].
[50] Pubchem, ‘3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide’. [Online]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5702702. [Accessed: 02-Sep-2018].
[51] Pubchem, ‘(3-Chlorophenyl)hydrazonomalononitrile’. [Online]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2603. [Accessed: 02-Sep-2018].
[52] ‘biacore3000-sensorsurface.pdf’. .
[53] ‘Cellular pharmacokinetic mechanisms of adriamycin resistance and its
modulation by 20(S)-ginsenoside Rh2 in MCF-7/Adr cells. - PubMed - NCBI’.
[Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21615726. [Accessed:
20-Sep-2018].
[54] M. Inbar et al., ‘Fluidity difference of membrane lipids in human normal and
leukemic lymphocytes as controlled by serum components’, Cancer Res., vol. 37,
no. 9, pp. 3037–3041, Sep. 1977.
[55] M. Daigneault, J. A. Preston, H. M. Marriott, M. K. B. Whyte, and D. H. Dockrell,
‘The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated
THP-1 cells and monocyte-derived macrophages’, PLoS ONE, vol. 5, no. 1, p.
e8668, Jan. 2010.
103
[56] M. J. Hall, R. F. Middleton, and D. Westmacott, ‘The fractional inhibitory
concentration (FIC) index as a measure of synergy’, J. Antimicrob. Chemother.,
vol. 11, no. 5, pp. 427–433, May 1983.
[57] ‘FIC INDEX.pdf’. .
[58] R. Bals, M. J. Goldman, and J. M. Wilson, ‘Mouse beta-defensin 1 is a salt-
sensitive antimicrobial peptide present in epithelia of the lung and urogenital tract’,
Infect. Immun., vol. 66, no. 3, pp. 1225–1232, Mar. 1998.
[59] I. H. Lee, Y. Cho, and R. I. Lehrer, ‘Effects of pH and salinity on the antimicrobial
properties of clavanins’, Infect. Immun., vol. 65, no. 7, pp. 2898–2903, Jul. 1997.
[60] W. Aoki and M. Ueda, ‘Characterization of Antimicrobial Peptides toward the
Development of Novel Antibiotics’, Pharmaceuticals (Basel), vol. 6, no. 8, pp.
1055–1081, Aug. 2013.
[61] H.-L. Chu et al., ‘Boosting Salt Resistance of Short Antimicrobial Peptides’,
Antimicrob Agents Chemother, vol. 57, no. 8, pp. 4050–4052, Aug. 2013.
[62] H.-Y. Yu et al., ‘Easy strategy to increase salt resistance of antimicrobial
peptides’, Antimicrob. Agents Chemother., vol. 55, no. 10, pp. 4918–4921, Oct.
2011.
[63] I. Y. Park, J. H. Cho, K. S. Kim, Y.-B. Kim, M. S. Kim, and S. C. Kim, ‘Helix
stability confers salt resistance upon helical antimicrobial peptides’, J. Biol.
Chem., vol. 279, no. 14, pp. 13896–13901, Apr. 2004.
[64] Pubchem, ‘Dioleoylphosphatidylcholine, DL-’. [Online]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6437081. [Accessed: 31-Aug-2018].
[65] S. Pacor, F. Guida, D. Xhindoli, M. Benincasa, R. Gennaro, and A. Tossi, ‘Effect
of targeted minimal sequence variations on the structure and biological activities
of the human cathelicidin LL-37’, Peptide Science, 2018.
104
RINGRAZIAMENTI
Voglio ringraziare innanzitutto la Prof.ssa Sabrina Pacor, per avermi permesso di
svolgere la tesi sperimentale nel Dipartimento di Scienze della Vita, per avermi guidato
durante tutto il mio progetto con il suo costante aiuto, i suoi preziosi consigli e la sua
esperienza.
Ringrazio la Dott.ssa Filomena Guida per avermi accompagnato e sostenuto in questo
progetto e per avermi dato tutto l’aiuto possibile.
Vorrei ringraziare inoltre il Dott. Tomislav Rončević per la sua disponibilità e per il
materiale fornitomi per questa tesi.
Vorrei ringraziare tutte le persone che hanno fatto parte di questi ultimi anni della mia
vita, che mi hanno accompagnato in questo percorso che ho scelto di intraprendere.
Ringrazio i miei colleghi di laboratorio e i miei compagni di corso, che mi hanno
accompagnato con la loro quotidiana presenza, rendendo il tutto più piacevole e
divertente.
In particolare vorrei ringraziare Martina ed Erica, fedeli compagne di risate, senza di
voi, la vita triestina, sarebbe stata decisamente molto triste e piatta.
Un pensiero in particolare va a Federica, che non smetterò mai di ringraziare per tutto
l’appoggio e l’affetto dimostratomi. Grazie per il tuo costante supporto, per la tua
sincerità e la tua disponibilità. Mi hai insegnato a vedere sempre il lato positivo delle
cose e, anche se non so dove mi porteranno questi prossimi anni, sono sicura che ti
porterò sempre nel cuore.
Grazie a tutte le mie coinquiline per avermi sopportato e supportato nella quotidianità
della mia vita triestina, per avermi fatto ridere e divertire. Un grazie in particolare va
ad Ester, per avermi accolto e guidato fin dall’inizio. Grazie per avermi fatto sentire a
casa e per avermi accompagnato in questo mio viaggio.
105
Voglio ringraziare le mie amiche di sempre: Irene, Silvia e Alessandra. Nonostante la
distanza e nonostante la vita ci abbia portato a fare delle scelte e ad intraprendere
percorsi diversi, voi siete e sarete sempre con me. Grazie per essere state sempre
presenti in tutti questi anni e per esserci sempre.
Il mio ringraziamento più speciale va a te, Fabrizio, che mi hai accompagnato in
quest’ultimo anno. Vorrei dirti quanto io sia grata per averti accanto ogni giorno.
Grazie per essermi stato vicino nelle sfide della vita di tutti i giorni, grazie per avermi
ascoltato in qualsiasi momento, supportato in ogni mio passo, e sopportato in ogni
circostanza.
Ringrazio i miei genitori e mia sorella Chiara, che mi hanno sempre sostenuto in ogni
scelta che ho compiuto e che mi hanno accompagnato in ogni passo di questo viaggio.
Grazie a voi, che avete permesso tutto questo e avete creduto in me, fin dall’inizio, e
che ancora adesso, giorno per giorno, mi spronate a migliorare.