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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS INSTITUTO BIOMÉDICO Graduação em Biomedicina Habilitação em Pesquisa Científica JULIANA BARRETO DE ALBUQUERQUE Caracterização da expressão de TACI, BCMA, APRIL e BAFF na infecção murina por Trypanosoma cruzi. Orientação: Carla Eponina de Carvalho Pinto Juliana de Meis Niterói 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
INSTITUTO BIOMÉDICO
Graduação em Biomedicina
Habilitação em Pesquisa Científica
JULIANA BARRETO DE ALBUQUERQUE
Caracterização da expressão de TACI, BCMA,
APRIL e BAFF na infecção murina
por Trypanosoma cruzi.
Orientação: Carla Eponina de Carvalho Pinto
Juliana de Meis
Niterói
2010
II
JULIANA BARRETO DE ALBUQUERQUE
Caracterização da expressão de TACI, BCMA, APRIL e BAFF na
infecção murina por Trypanosoma cruzi.
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Curso de Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense como requisito
para obtenção do Grau de Bacharel. Área de
Concentração: Pesquisa Científica com Habilitação
em Microbiologia e Parasitologia
Orientadoras:
Prof. Dra. Carla Eponina de Carvalho Pinto
Dra. Juliana de Meis
Banca examinadora:
Prof. Drª. Carla Eponina de Carvalho Pinto
___________________________________
Prof. Drª. Maria de Fátima Brandão Pinho
___________________________________
Msc. Désio Aurélio Faria de Oliveira
___________________________________
Suplente:
Drª. Déa Maria Serra Villa Verde
___________________________________
Niterói
2010
III
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisas sobre o Timo (LPT),
Instituto Oswaldo Cruz (IOC), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).
IV
A345 Albuquerque, Juliana Barreto de
Caracterização da expressão de TACI, BCMA, APRIL e
BAFF na infecção murina por Trypanosoma cruzi / Juliana
Barreto de Albuquerque. - Niterói: [s.n.], 2010
xiv, 52 f. :il.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação em
Biomedicina) - Universidade Federal Fluminense, 2010
1. Trypanosoma cruzi. 2. Doença de Chagas. 3. Linfócitos.
I. Título
CDD 616.9363
CDD 616.079
V
“Aos meus pais que sempre me apoiaram
e investiram no meu futuro.”
VI
"Weisheit ist nicht das Ergebnis der Schulbildung,
sondern des lebenslangen Versuchs,
sie zu erwerben."
"A sabedoria não é resultado de uma formação escolar,
porém é a tentativa de uma vida inteira
em alcançá-la."
Albert Einstein
VII
Agradecimentos
A Deus pela minha vida e por eu ser capaz de chegar até aqui.
Aos meus pais, David e Ana, por estarem sempre ao meu lado me apoiando,
investindo no meu futuro e acreditando em mim.
A toda minha família, em especial às tias Marisa pelos almoços e ajuda com
livros e Madalena pelas caronas ao longo da graduação, além também do apoio.
A Rafael, mais que um namorado, também amigo, que me aguentou durante a
tensão pré e durante TCC, e mais que isso, esteve sempre ao meu lado, me ouvindo,
incentivando e acreditando em mim.
As minhas amigas desde os velhos e bons tempos, Luana, Larissa, Tati, Carol,
Chaianny e Amanda.
A Carla e a Juliana, minhas orientadoras, que me receberam nesse finalzinho da
graduação e me ajudaram MUITO nesse trabalho que tinha tão POUCO tempo para ser
realizado. Obrigada por me incentivar e apoiar.
Ao Dr. Wilson Savino por me receber em seu laboratório e permitir a realização
desse trabalho.
Ao Dr. Michael Hahne, nosso colaborador, quem caracterizou APRIL e cedeu os
camundongos transgênicos ao nosso grupo.
A Cláudia, minha tutora, que me escutou e aconselhou bastante nos últimos
períodos da faculdade.
A Fátima, por ter me ajudado com a análise das células B e por ter aceitado
participar da minha banca.
A Désio, por me incentivar, infectar os camundongos e aceitar participar na
minha banca.
A Cecília, que mesmo do outro lado do Atlântico, me deu várias dicas e
conselhos.
A Douglas por me ajudar com os anticorpos e com as complexas células B.
A Dani e Luiz que me ajudaram com as parasitemias e com os experimentos de
citometria.
A Alexandre Morrot e Ailin pela ajuda com a PCR em tempo real.
A minha querida turma 107.48 (carinhosamente, a PATOTA) pelos ótimos
momentos durante os últimos anos. Em especial, a Alice, Thaysse, Helena, Thiago,
Aline, Stephanie, Matheus, Gabriel, Ana Paula e Vivian.
VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACK – tampão de lise cloreto de amônio (Ammonium-Chloride lysing buffer)
ADCC - citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (Antibody-
Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity)
AICD - morte celular induzida por ativação (Activation-Induced Cell Death)
APC – aloficocianina (Allophycocinin)
APRIL – ligante indutor de proliferação (A Proliferation Inducing Ligand)
BAFF – fator ativador de célula B (B-cell activation factor)
Bax - Bcl-2–associated X protein
Bcl-2 - linfoma associado à célula B-2 (B-cell lymphoma-2)
Bcl-xl - B-cell lymphoma-extra large
BCMA – antígeno de maturação de célula B (B Cell maturation antigen)
BLyS – estimulador de célula B (B-lymphocyte stimulator)
CAML - Calcium modulator cyclophilin ligand
CD – marcadores de superfície celular (Clusters of differentiation)
cDNA - Ácido desoxirribonucléico complementar (complementary deoxyribonucleic
acid)
CO2 – Dióxido de Carbono
dNTP – desoxinucleosídeo trifosfatado (Deoxynucleoside triphosphates)
DTT - Dithiothreitol
ERK - quinase reguladora de sinal extracelular (Extracellular signal–regulatory
kinase)
FACS – Fluorescence activated cell sorter
FasL - Ligante de Fas
Fas - também chamado CD95, é um membro da família TNF (TNFRSf6)
FITC – isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
GAPDH - desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenases)
HSPG - proteoglincanas de heparan-sulfato (Heparan sulfate proteoglycans)
IFN-γ - Interferon-gama
IX
Ig – Imunglobulina
IL – Interleucina
JNK - c-Jun N-terminal kinase
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
Mcl-1 - Induced myeloid leukemia cell differentiation protein
MHC – complexo principal de histocompatibilidade (Major histocompatibility
complex)
mm – Milímetro
NF-kB - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NK – células “assassinas” naturais (Natural Killer cells)
PBS – salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline)
PCR – reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction)
PE – ficoeritrina (Phycoeritrin)
PercP – proteína piridina de clorofila (Piridin-chlorophyll-a-protein)
RPM – Rotações por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
SBF – soro bovino fetal
SPF – livre de patógeno específico (Specific pathogen free)
TACI – Transmembrane activator and CAML interactor
TCR – receptor de células T (T cell receptor)
TGF-beta - Transforming growth factor beta
Th – célula T auxiliadora (T helper cell)
TNF – fator de necrose tumoral (Turmor necrosis factor)
TNF-R - receptor do fator de necrose tumoral (Tumor necrosis factor receptor)
TRAF - Fator Associado ao TNF-R (TNF Receptor Associated Factor)
XIAP - X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein
μL – Microlitro
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição geográfica da Doença de Chagas no mundo........................... 2
Figura 2. Ciclo biológico do protozoário flagelado Trypanosoma cruzi.................... 3
Figura 3. Funções biológicas de APRIL (a proliferation-inducing ligand) em
células normais e malignas.......................................................................... 13
Figura 4. Sinalização intracelular através dos receptores para APRIL....................... 14
Figura 5. Variação da parasitemia e celularidade dos diferentes compartimentos
linfoides........................................................................................................ 24
Figura 6. Esquema representativo da análise das subpopulações de linfócitos T e B. 26
Figura 7. Análise por citomeria de fluxo das subpopulações de linfócitos T............. 27
Figura 8. Análise por citomeria de fluxo das subpopulações de linfócitos B............. 28
Figura 9. Análise por citometria de fluxo do percentual de células TACI+................ 29
Figura 10. Análise por citometria de fluxo do percentual de TACI em linfócitos........ 30
Figura 11. Número de células TACI+ dentro de diferentes subpopulações de células
T e B............................................................................................................ 31
Figura 12. Análise por PCR em tempo real da expressão gênica (2-Δct
) de TACI,
BCMA APRIL e BAFF............................................................................... 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tampão de lise ACK (Amonium-Chloride Lysing buffer) pH 7,2 – 7,4......... 19
Tabela 2. Preparação do mix para PCR.......................................................................... 23
Tabela 3. Sequências dos primers utilizados.................................................................. 23
Tabela 4. Variações nos compartimentos linfoides na infecção chagásica murina........ 40
XI
RESUMO
APRIL, BAFF e seus receptores TACI e BCMA não haviam sido ainda estudados dentro
do contexto da doença de Chagas. Esta enfermidade, causada pelo Trypanosoma cruzi
(T. cruzi), é endêmica em vários países da América Latina e é considerada um problema
de saúde pública. Ao longo da infecção experimental murina, o sistema imunológico
desencadeia ativação da resposta imune inata e adaptativa, sendo observada uma
imunossupressão acompanhada de ativação policlonal de linfócitos T e B. APRIL e
BAFF, indutores de processos biológicos tais como proliferação, diferenciação,
sobrevivência e morte celulares, podem ligar-se a dois receptores: BCMA e TACI. Tanto
BCMA como TACI são expressos por células B, enquanto que as células T expressam
apenas TACI. Portanto, este trabalho buscou caracterizar a expressão de TACI e BCMA
e seus ligantes APRIL e BAFF nos linfonodos subcutâneos e mesentéricos, baço e
líquido peritoneal de camundongos BALB/c infectados por T. cruzi (cepa Tulahuén).
Após colhermos as células desses órgãos verificamos através da citometria de fluxo a
expressão de um dos receptores, o TACI, nas diferentes subpopulações de células T e B.
Ainda amplificamos por PCR quantitativa em tempo real de mRNA APRIL, BAFF, e os
receptores TACI e BCMA das células destes compartimentos para observarmos a
expressão gênica destas proteínas comparando animais infectados com não infectados.
Nossos resultados preliminares indicam uma resposta diferenciada em cada órgão
envolvido na infecção murina por T. cruzi. E com relação à expressão de TACI, BCMA,
APRIL e BAFF, podemos sugerir que BAFF, mais que APRIL, possivelmente é o
principal ligante modulado na infecção. E mais, a cavidade peritoneal é o compartimento
que apresenta variações mais evidentes de todas essas moléculas.
XII
ABSTRACT
APRIL, BAFF and its receptors TACI and BCMA had not yet been studied within the
context of Chagas disease. This disease, caused by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is
endemic in several countries in Latin America and is considered a public health
problem. Throughout the experimental murine infection, the immune system leads to
the activation of innate and adaptive immune response. That response envolves an
immunosuppression and a polyclonal activation of T and B lymphocytes. APRIL and
BAFF, that induce biological processes such as proliferation, differentiation, survival
and cell death, can bind to two receptors, BCMA and TACI, expressed in T and B cells.
Both BCMA and TACI are expressed by B cells, whereas T cells only express TACI.
Therefore, this study aimed to characterize the expression of TACI, BCMA and its
ligands APRIL and BAFF in subcutaneous and mesenteric lymph nodes, spleen and
peritoneal fluid of BALB/c mice infected by T. cruzi (Tulahuen strain). After harvesting
the cells of these organs, we verified by flow cytometry the expression of the receptor,
TACI, in the different subpopulations of T and B cells. Also, by real-time quantitative
PCR, we amplified the APRIL, BAFF, and the receptors TACI and BCMA mRNA of
the cells obtained from these compartments to observe the gene expression of these
proteins, comparing infected animals with uninfected. Thus, our preliminary results
indicate a differential response in each compartment involved in murine T. cruzi
infection. And with respect to the expression of TACI, BCMA, BAFF and APRIL, we
suggest that BAFF, but not APRIL, is possibly the main ligand modulated in this
infection. Moreover, the peritoneal cavity is the one that presents the most apparent
variations of all these molecules.
XIII
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS IX
LISTA DE FIGURAS IX
LISTA DE TABELAS XI
RESUMO XII
ABSTRACT XIII
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Doença de Chagas 1
1.1.1. Epidemiologia 1
1.1.2. Ciclo da Doença de Chagas 2
1.1.3. Manifestações clínicas 4
1.2. Modelo experimental da doença 5
1.3. Sistema Imune na doença de Chagas 5
1.3.1.Comportamento dos órgãos linfoides 8
1.4. Família dos Fatores de Necrose Tumoral (TNF – tumor necrosis factor) 11
1.5. APRIL (A PRoliferation-Inducing Ligand) 11
1.5.1. Processamento de APRIL 12
1.5.2. APRIL e seus receptores 13
2. JUSTIFICATIVA 17
3. OBJETIVOS 17
3.1. Objetivo geral 17
3.2. Objetivos específicos 17
4. MATERIAIS E MÉTODOS 18
4.1. Animais e infecção 18
4.2. Obtenção das células 18
4.3. Citometria de fluxo 19
4.4. Extração do RNA 20
4.5. Obtenção do cDNA 20
4.6. PCR em tempo real 22
4.7. Análises estatísticas 22
XIV
5. RESULTADOS 24
5.1. Curva de parasitemia e celularidade. 24
5.2. Comparação entre subpopulações de células T e B. 25
5.3 Expressão de TACI em linfócitos T e B. 28
5.4 Expressão gênica de APRIL, BAFF e seus receptores TACI e BCMA. 31
6. DISCUSSÃO 34
7. CONCLUSÃO 41
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doença de Chagas
1.1.1. Epidemiologia
A doença de Chagas (também conhecida como tripanosomíase americana), cujo
agente etiológico é o parasita intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é a maior causa
de infecção cardíaca na América Latina, sendo endêmica em vários países nessa região
(WHO, 2005). A Organização Mundial de Saúde relata que existam em torno de 18
milhões de pessoas infectadas e mais de 100 milhões em risco de infecção no mundo
(WHO, 2007) (Figura 1).
A infecção pelo T. cruzi é considerada um problema de saúde pública em vários
países e uma doença tropical negligenciada com deficiências de tratamento, ausência de
vacinas apropriadas e disseminação mundial (Hotez et al., 2006; Savino et al., 2007)
(Figura 1). Nos países onde a doença é endêmica, é principalmente transmitida pelo
vetor, seja durante a hematofagia ou por transmissão oral através da ingestão de
alimentos contaminados (Gascón et al., 2007; Valente et al., 1999; Prata et al., 2001).
Esta última provocou os episódios de surto epidêmico de quadro agudo da doença de
Chagas em vários estados como Amazonas, Bahia, Rio Grande do Sul e Santa Catarina,
corroborando com o fato de que esta enfermidade ainda representa um importante
problema de saúde pública no país (De Meis et al., 2009; Nóbrega et al., 2009; Dias et
al., 2008; Marcili et al., 2009). Por outro lado nos paises não endêmicos, as transfusões
sanguíneas e transplantes de órgãos são as formas que representam maior risco de
transmissão, devido ao elevado números de imigrantes (Milei et al., 2009). Apesar de
apresentar menor relevância epidemiológica, há também a transmissão acidental em
laboratórios e a infecção congênita (Dias et al., 2000; Milei et al., 2009) .
2
Figura 1. Distribuição geográfica da Doença de Chagas no mundo. A endemicidade é
observada principalmente na América Latina, sendo que o aumento do número de casos
nos países mais desenvolvidos ocorre devido ao elevado número de imigrantes
(http://www.revistapesquisa.fapesp.br/arq/r/pt/924/memoria2_mapa.jpg).
1.1.2. Ciclo da Doença de Chagas
No decorrer do seu ciclo biológico, o parasita apresenta diferentes formas. No
triatomíneo, o parasito replica-se sob a forma epimastigota no intestino anterior e
diferencia-se, no intestino posterior, em tripomastigota metacíclico flagelado, forma
infectante para o vertebrado que é encontrada nas fezes do barbeiro (Garcia &
Azambuja, 1991). Durante ou logo após a hematofagia, o inseto deposita suas fezes no
local da picada, e através da região da picada, o parasita chega a corrente sanguínea do
hospedeiro vertebrado (Revisado por Rey, 2002). Neste, o tripomastigota sanguíneo
entra em contato com diferentes tecidos e pode infectar uma grande variedade de
células, incluindo macrófagos, fibroblastos, células musculares esqueléticas, células
epiteliais e neuronais (Gutierrez et al., 2009). No interior dessas células o T. cruzi
diferencia-se para a forma amastigota (que não apresenta flagelo livre) e replica-se no
citoplasma, escapando de vacúolos fagocíticos. Antes de romper a célula hospedeira, a
forma amastigota diferencia-se em tripomastigota sanguíneo, forma infectante para o
inseto vetor e outras células do hospedeiro (Buscaglia & Di Noia, 2003) (Figura 2).
3
Figura 2. Ciclo biológico do protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. 1) O
triatomíneo alimenta-se de sangue e deixa no local as fezes contendo tripomastigotas
metacíclicos que entram pelo local da picada ou membrana mucosa. 2) Tripomastigotas
metacíclicos penetram em várias células no local da picada, incluindo macrófagos,
fibroblastos, células musculares esqueléticas, células epiteliais e neuronais. No interior
destas, proliferam sob a forma amastigota. 3) Amastigotas multiplicam-se por divisão
binária nas células infectadas. 4) Amastigotas intracelulares transformam-se em
tripomastigotas, destroem a célula e vão para a corrente sanguínea. Tripomastigotas
podem infectar outras células e transformam-se em amastigotas intracelulares em novos
sítios de infecção. 5) O triatomíneo alimenta-se do sangue, ingerindo os tripomastigotas.
6-7) Epimastigotas multiplicam-se no intestino médio. 8) Posteriormente, diferenciam-
se em tripomastigotas metacíclicos no intestino posterior (Adaptado do site do CDC -
Centers for Disease Control and Prevention).
Estágios no triatomíneo
Estágios em mamíferos
Estágio infectante
Estágio diagnóstico
4
1.1.3. Manifestações clínicas
A doença de Chagas possui duas fases clínicas: aguda e crônica.
Fase aguda
A fase aguda tem início logo após o inóculo do parasita no hospedeiro. Quando a
infecção ocorre através da picada do inseto vetor, pode ocorrer uma reação inflamatória
local, conhecida como Chagoma de Inoculação (Sinal de Romana), podendo apresentar
edema e linfadenopatia local em torno de 7-14 dias (Revisado por Rey, 2002). Essa fase
caracteriza-se pela presença de tripomastigotas sanguíneos liberados devido à intensa
multiplicação do parasita nos tecidos. Desta forma, durante a fase aguda são comumente
observados nas células musculares e da glia, ninhos de amastigotas (Tanowitz et al,
1992; Prata et al., 2001). A fase aguda pode ser assintomática em 95% dos casos, e nos
sintomáticos, as manifestações clínicas são febre, dores musculares e nas articulações,
sonolência, diarreia, linfadenomegalia, hepatomegalia, distúrbios respiratórios, cianose
e coma (Revisado por Teixeira et al., 2006). Um sintoma importante dessa fase é a
miocardite causada pelo parasitismo das fibras do miocárdio que levam a uma intensa
resposta inflamatória, destruindo, portanto, tanto o tecido infectado como o não
infectado (Luppi et al, 1998; Dias et al., 2000). Há pacientes infectados que morrem
nessa fase da doença devido às complicações da miocardite e meningoencefalite, mas a
maioria apresenta recuperação espontânea em 3-4 meses (Teixeira et al., 2006). O
desenvolvimento da fase aguda pode variar de acordo com a cepa de T. cruzi e a
resistência do hospedeiro (Kierszenbaum & Sztein, 1990). Posteriormente, a doença
torna-se assintomática e latente por até 20 anos após infecção e pode ou não evoluir
para fase crônica (Vitelli-Alvelar et al., 2006). Cerca de um terço dos indivíduos
infectados evoluem para uma fase crônica sintomática e passam a apresentar
morbidades como cardiomiopatia, megacólon ou megaesôfago. Em geral, esses
pacientes possuem uma expectativa de vida reduzida em 9 anos (Punukollu et al.,
2007).
Fase crônica
Dois terços das 18 milhões de pessoas na fase crônica da infecção não
apresentam manifestações clínicas detectáveis da doença de Chagas. Dos sintomáticos,
94,5% dos pacientes apresentam doença cardíaca e os 4,5% restantes apresentam a
5
síndrome dos mega (megaesôfago e megacólon) (Meneghelli et al., 1982). A
cardiomiopatia chagásica crônica é um dos sintomas mais importantes na doença e a
principal causa de morte nos pacientes. Essa cardite pode gerar cardiomegalia, arritmia e
falência do órgão (Higuchi et al., 2003).
1.2. Modelo experimental da doença
Devido à dificuldade de estudos mais aprofundados em pacientes, os modelos
experimentais da doença de Chagas são amplamente utilizados para analisar os vários
aspectos do processo infeccioso. Grande parte do conhecimento que se tem sobre a
biologia da infecção foi inicialmente obtida a partir do modelo murino experimental. Na
fase aguda, os camundongos apresentam intensa ativação das respostas inata e
adaptativa. Assim como observado em pacientes, camundongos infectados apresentam,
na fase aguda, esplenomegalia e hipertrofia dos linfonodos subcutâneos (Minoprio,
2001; Minoprio et al., 1986, 1988). Ainda no modelo murino, achados anteriores do
nosso laboratório demonstraram que os linfonodos mesentéricos e o timo sofrem um
atrofia na infecção (Savino et al., 1989; De Meis et al., 2006; Savino, 2006).
1.3. Sistema Imune na doença de Chagas
Ao longo da infecção pelo T. cruzi, são observadas diversas variações no sistema
imune e a evolução dessa infecção depende das características genéticas do hospedeiro
e do parasita (Kierszenbaum & Sztein, 1990). Sendo assim, existem particularidades
imunológicas relacionadas a esta doença.
Células do sistema imune inato são capazes de responder contra patógenos
intracelulares como o T. cruzi, em particular, macrófagos e células dendríticas. Estas
células quando ativadas tornam-se potentes apresentadoras de antígenos e ativadoras da
resposta imune adaptativa. Elas iniciam uma ação microbicida através da produção
exacerbada de IFN-γ e TNF-α bem como ativação de células Natural Killer (NK)
através de IL (interleucina)-12, estimulando uma grande produção de óxido nítrico que
contribuem para o controle inicial da infecção (Lima-Martins et al., 1985).
Sensibilizam, também, células não-hematopoéticas, em particular miócitos e adipócitos
(Revisado por Tarleton, 2007).
6
Na fase aguda, observa-se uma intensa ativação policlonal de células T CD4+ e
CD8+ e B, que são expandidas em órgãos linfoides periféricos persistindo até a fase
crônica da doença (Minoprio et al., 1986).
Essa ativação é seguida de imunossupressão de linfócitos, mediada por células
T e macrófagos, que controla o escape e a permanência do parasita nos tecidos
(Tarleton, 1988). Além disso, o aumento na produção de óxido nítrico estimula a
produção de Fas e FasL em linfócitos levando-os à apoptose e promovendo lesões
teciduais progressivas características da doença, como a miocardite (Martins et al.,
1999). Foi observada também uma deficiência da produção de IL-2 e uma menor
expressão de CD25 (cadeia alfa do receptor para IL-2) em células T também contribuem
para essa imunossupressão (Tarleton, 1988).
Na fase aguda, são observados numerosos parasitas circulantes, resultando em
uma ativação das respostas imunes humoral e celular (Dorn et al., 2007). O controle
imunológico da parasitemia é essencial para evitar as lesões crônicas no coração,
esôfago, cólon e sistema nervoso periférico (Tarleton et al., 2007). Estudos em
camundongos deficientes de MHC de classe I ou de classe II revelaram uma elevada
susceptibilidade a infecção e morte desses animais, demonstrando assim que linfócitos
T CD4+ e CD8
+ são importantes no controle da doença (Hotez et al., 2006; Savino et
al., 2007). Outros grupos também demonstraram o papel das citocinas produzidas por
células CD4+ e CD8
+ na resistência e susceptibilidade à infecção por T. cruzi. Desse
modo, citocinas do tipo Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-12) estão relacionadas com resistência
à infecção, aumentando a capacidade microbicida dos macrófagos (Abrahamsohn &
Coffman, 1996; Silva et al., 1995). Por outro lado as citocinas do tipo Th2 (IL-10 e IL-
4) aumentam a susceptibilidade à infecção por T. cruzi (Kumar & Tarleton, 2001;
Barbosa-de-Olveira et al., 1996).
As respostas inata e adaptativa são desencadeadas pelo parasita e suas moléculas
de superfície. Durante a fase aguda, há uma exacerbada produção de citocinas
inflamatórias, incluindo IL-12, TNF-α e IFN-γ. Estudos mostraram que camundongos
deficientes de IFNγ e TNF-R (receptor) são mais susceptíveis a infecção que os
selvagens, portanto a produção destas citocinas pode estar associada à proteção contra o
parasita (Aliberti et al., 2001; Bilate et al., 2008). Entretanto, camundongos deficientes
de IL-10, apesar do eficiente controle da infecção, desenvolvem uma síndrome similar
ao choque endotóxico provocada pela elevada produção de TNF-α e IFN-γ, mostrando
que a ausência das citocinas anti-inflamatórias tem efeitos prejudiciais (Holscher et al.,
7
2000). Os altos níveis de TNF-α estão associados à elevada parasitemia, perda de peso e
mortalidade. Sendo assim, essa citocina em altas concentrações pode apresentar um
papel negativo na fase aguda (Bilate et al., 2007; De Meis et al., 2006). Trabalhos
recentes relatam o papel do TGF-β na infecção por T. cruzi. A inibição do receptor
dessa citocina dificulta a invasão do cardiomiócito e a diferenciação e liberação de
tripomastigotas, reduzindo então o número de parasitas por células infectadas (Waghabi
et al., 2007). Esses dados sugerem que o TGF-β pode ser um potencial alvo terapêutico
para tratamento da enfermidade (Waghabi et al., 2007; Bilate et al., 2008). Deste modo,
as citocinas pró-inflamatórias são essenciais para o controle da disseminação do parasita
ao passo que as anti-inflamatórias são necessárias para promover uma regulação dos
efeitos destrutivos da inflamação exacerbada a qual promove danos teciduais. Desta
forma, um balanço entre essas citocinas é essencial para manter a homeostasia tecidual
(Bilate et al., 2008).
As células B são relevantes no controle da parasitemia. Sendo assim, a depleção
de células B leva a uma elevada susceptibilidade a infecção, e a transferência de
imunoglobulinas (Ig) purificadas de camundongos infectados protege o receptor contra
infecção letal (Devera et al., 2003; Punukollu et al., 2007). Nos camundongos
infectados por T. cruzi ocorre uma ativação policlonal de células B na fase aguda, que
persiste na fase crônica. Esta ativação causa uma hipergamaglobulina poliisotípica
significativa, sendo caracterizada por um aumento considerável de imunoglobulinas e
uma resposta específica ao parasita. Durante a resposta, é comum detectar altas
concentrações de IgG2a e IgG2b entre os anticorpos específicos a T. cruzi, e IgG2a
entre os inespecíficos. Esta ativação policlonal das células B foi bem demonstrada no
modelo murino, mas ainda não está totalmente estabelecida em humanos (Spinella et
al., 1992; El Bouhdidi et al., 1994). Além do mais, a produção de anticorpos
autorreativos tem sido relacionada às células B-1 CD5+, já que há um aumento destas
no baço durante a infecção por T. cruzi (Minoprio et al., 1989). A participação dos
anticorpos no controle da infecção envolve os processos de opsonização, citoxicidade
mediada por anticorpos (ADCC - Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity),
ativação da via clássica do complemento e inibição de invasão da célula hospedeira
(Kumar & Tarleton, 1998; Spinella et al., 1992; Almeida et al., 1991; Mota & Umekita,
1989; Lima-Martins et al., 1985; Scott & Moyes, 1982).
No entanto, trabalhos recentes do nosso grupo demonstram que o perfil de
resposta ao parasita pode variar dependendo do órgão (linfonodos subcutâneos,
8
linfonodos mesentéricos e baço), sugerindo que a análise da capacidade proliferativa e
da produção de citocinas de linfócitos deva ocorrer de forma compartimentalizada (De
Meis et al., 2006; 2009).
1.3.1. Comportamento dos órgãos linfoides
A infecção por Trypanosoma cruzi promove alterações estruturais e fisiológicas
em diferentes tecidos do sistema imune. Nos camundongos, são observados diferentes
padrões de resposta nos distintos compartimentos do sistema imune e a infecção
desencadeia uma forte ativação da resposta imune inata e adaptativa (Revisado por De
Meis et al., 2009) .
Linfonodos
Os linfonodos são órgãos linfoides secundários distribuídos pelo corpo,
especialmente em áreas de drenagem de tecidos (Fu & Chaplin, 1999). No trato
gastrointestinal e na pele, são encontrados os linfonodos mesentéricos e subcutâneos
(por exemplo, axilar, braquial e inguinal) respectivamente (Van-der-Valk & Meijer,
1987). Apresentam organização tecidual relacionada com os eventos de ativação de
linfócitos T e B. Os cordões medulares e seios linfáticos são ricos em macrófagos e
células dendríticas que são responsáveis pelo processamento de antígenos transportados
pela linfa (Van-der-Valk & Meijer, 1987). Além disso, na região paracortical, os
linfócitos T CD4+ e T CD8
+ são ativados por macrófagos e células dendríticas que
captaram o antígeno e apresentaram a essas células (van Eijik et al., 2001a). Essas
células T ativadas proliferam e uma parte vai atuar em focos inflamatórios pelo
organismo, enquanto as T CD4+ ativadas migram para a periferia da região folicular
onde ativam os linfócitos B específicos para o antígeno. Estes, após a proliferação,
tornam-se plasmócitos (Luster et al., 2002; van Eijk et al., 2001a).
A infecção por T. cruzi leva ao aumento significativo do tamanho dos linfonodos
subcutâneos (LSC) como resultado de uma intensa proliferação de linfócitos T e B
encontrada na fase aguda e crônica tanto em camundongos como em pacientes. Estudos
realizados em camundongos demonstraram que a infecção leva a um aumento de
linfócitos T em proliferação nos LSC, capazes de produzir IL-2 e proliferar após
ativação in vitro (De Meis et al., 2008) e que ocorre uma ativação policlonal de
linfócitos T e B no LSC (Minoprio, 2001; Minoprio et al., 1986, 1988). Esses linfócitos
9
T ativados secretam citocinas do tipo 1 como IFN-γ e do tipo 2 como IL-4 e IL-10.
Além disso, em uma fase mais tardia da infecção, linfócitos T e B dos LSC também
sofrem apoptose por AICD (Activation-Induced Cell Death) (De Meis et al., 2006;
Revisado por De Meis et al., 2009).
Em modelos murinos de experimentação animal, a infecção por T. cruzi induz
diversas alterações nos tecidos linfoides associados ao intestino. As placas de Peyer
apresentam uma redução de número, tamanho e celularidade devido ao aumento da
depleção de linfócitos T e B (Antunez et al., 1997). Ao mesmo tempo, os linfonodos
mesentéricos (LMs) sofrem atrofia na infecção aguda por T. cruzi (Caraujo-Jorge et al.,
1993; De Meis et al., 2006). Camundongos submetidos à cirurgia de remoção dos LMs
são mais susceptíveis à infecção, com elevada parasitemia quando comparados ao grupo
controle, sugerindo então, que a resposta imune desenvolvida pelos LMs contribui para
o controle da parasitemia no curso da infecção (De Meis et al., 2008). A apoptose de
células T e B de LM ocorre no curso da infecção por T. cruzi (De Meis et al., 2006).
Corroborando com esse dado, foi observado um aumento de células positivas para
anexina-V (molécula que se liga a fosfatidilserina presente na parte externa da
membrana de células em apoptose) nos LMs de camundongos infectados (De Meis et
al., 2008). Quanto à produção de citocinas, os linfócitos T dos LMs produzem
principalmente citocinas do tipo-1 (IFN-γ), havendo uma redução da produção de IL-2,
IL-4 e IL-10 pelos linfócitos T ativados (De Meis et al., 2006, 2008). Ao contrário dos
LSCs, a infecção aguda por T. cruzi promove atrofia da cadeia de LMs com apoptose
precoce dos linfócitos T e B através das vias de Fas e TNF-R 1 (De Meis et al., 2006).
Baço
Órgão no qual os linfócitos respondem a antígenos vindos do sangue. Assim
como os linfonodos, o baço é organizado em zona de células B (folículos) e zona de
células T, onde ocorre maturação das células dendríticas. As células dendríticas
foliculares residem na zona de células B e ativam as mesmas durante a resposta humoral
(Abbas et al., 2007).
A infecção promove a ativação e expansão das células T e B do baço, levando à
esplenomegalia (Revisado por De Meis et al., 2009). Apesar de proteínas do parasita
serem capazes de induzir a expansão de células B, a contribuição dessas células na
resistência adquirida à infecção por T. cruzi permanece em discussão (Acosta Rodriguez
et al., 2007). Camundongos deficientes de células B apresentam maiores taxas de
10
mortalidade nos estágios mais avançados da infecção e um aumento tardio da
parasitemia, com dificuldade de remover os tripomastigotas sanguíneos da circulação
(Kierszenbaum et al., 1976). Linfócitos T ativados do baço de camundongos infectados
por T. cruzi secretam IFN-γ, IL-4 e IL-10, sugerindo um perfil misto de secreção de
citocinas tipo Th1 e tipo Th2, semelhante ao LSC. No entanto, é observada uma
diminuição da produção de IL-2. Apesar de diversos estudos sobre o comportamento do
baço em camundongos infectados por T. cruzi, há poucos relatos do envolvimento do
baço em pacientes chagásicos, e o que já foi descrito é baseado em autópsias realizadas
na fase crônica (Revisado por De Meis et al., 2009).
Cavidade peritoneal
A cavidade peritoneal é delimitada por uma membrana, o peritônio, e abriga
células do sistema imunológico, como macrófagos, células B e T. É preenchida por
fluido e contém vários órgãos, como o baço, o fígado, o trato gastro-intestinal e outras
vísceras (Zhang et al., 2008). Essa cavidade é importante no estudo de células B devido
à existência de uma subpopulação única conhecida como células B-1, subdivididas em
B-1a e B-1b além das convencionais B-2 (Dorshkind et al., 2007; Ray et al., 2010). As
células B-1(que se originam em sua maioria no fígado fetal) são importante fonte de
IgM natural, específica para antígenos polissacarídicos e lipídicos, mesmo na ausência
de infecção, promovendo assim proteção inicial contra uma variedade de patógenos
(Boes et al., 1998; Abbas et al., 2007). Estas células são autorreativas por natureza
(Mercolino et al., 1988), entretanto, o mecanismo pelo qual elas são controladas para
prevenir autoimunidade ainda não está completamente compreendido (O'Garra et al.,
1992). Quanto às B-2, estas originam-se na medula óssea e são as células B
convencionais, como foi mencionado, as quais produzem anticorpos específicos ao
antígeno (Abbas et al., 2007).
Durante a infecção por T. cruzi, nessa cavidade, há uma marcada redução de
células B CD19+
devido à diferenciação em plasmócitos, e não à morte celular. Tanto as
células B-1 com as células B-2 peritoneais apresentam uma redução ao longo da
infecção, mas em cinéticas diferentes. As células B-2 começam a diminuir cerca de 4
dias pós-infecção e as células B-1, 12-15 dias pós-infecção. Com relação às células T,
há aumento tanto das CD4+, como CD8
+ em camundongos infectados por T. cruzi
(Merino et al., 2010). Esses dados demonstram que há uma alteração na composição
celular desta cavidade.
11
1.4. Família dos Fatores de Necrose Tumoral (TNF – tumor necrosis factor)
As proteínas da família TNF são citocinas, ligantes e receptores (TNF-R) que
possuem papel importante na indução de diversos processos biológicos como
proliferação, diferenciação, sobrevivência e morte celulares (Aggarwall, 2003).
A manutenção da homeostasia do sistema imunológico depende, dentre outros
fatores, de sinais gerados por membros dessa superfamília. Além da homeostasia
tecidual, estão envolvidos na regulação de infecções, processos inflamatórios e
organogênese. No entanto, esses mesmos membros são responsáveis por efeitos danosos
observados na sepse, caquexia e doenças autoimunes (Hehlgans et al., 2005; Smith et
al, 1994). Os ligantes dessa família podem atuar ligados à superfície da membrana ou
na forma de citocinas solúveis, de maneira autócrina, parácrina ou endócrina indicando
a diversidade de funções atribuídas a essas proteínas (Smith et al., 1994).
1.5. APRIL (A PRoliferation-Inducing Ligand)
Em 1998, Hahne et al. descreveram um novo ligante da superfamília do TNF,
APRIL, também conhecido como TNFSF13A, Tall-2, TRDL-1 e CD256, que estimula a
proliferação de células tumorais in vitro e in vivo, motivo pelo qual foi denominada de
APRIL. Esta proteína foi identificada após o mapeamento genético, seguido de
alinhamentos múltiplos em bancos de dados para sequências semelhantes a outros
ligantes da família já conhecidos. Desta forma, obtiveram a estrutura primária de
APRIL que é codificada pela região cromossômica 17p13, e constitui-se de 250
aminoácidos (Hahne et al., 1998).
APRIL é expresso por tecidos tumorais, células B em desenvolvimento na
medula óssea, células B ativadas, células B-1 em repouso, monócitos, macrófagos,
células dendríticas, neutrófilos, células epiteliais, células T e por algumas células não
pertencentes ao sistema imune, como os osteoclastos, megacariócitos e células
estromais da medula óssea (Kimberley et al., 2009a; Dillon et al., 2006). Além de
estimular células tumorais, foi descrito que APRIL recombinante atua como co-
estimulador de células primárias B e T in vitro e estimula a produção de IgM por células
B de sangue periférico in vitro (Marsters et al., 2000; Yu et al., 2000). O envolvimento
de APRIL na regulação do crescimento tumoral pode não ser apenas como fator de
12
crescimento no estabelecimento do tumor, mas também induz a formação do tumor
(Planelles et al., 2004). APRIL atua em células B normais e malignas, promovendo
aumento da sobrevivência, proliferação e apresentação de antígenos e também troca de
classe de imunoglobulina em vários estágios de desenvolvimento das células B (Dillon
et al., 2006).
Para maior compreensão dos efeitos da proteína in vivo e mais especificamente,
na fisiologia e patologias do sistema imune, foi de fundamental importância a criação
dos camundongos transgênicos para APRIL (Stein et al., 2002) (Figura 3).
1.5.1. Processamento de APRIL
APRIL é clivado intracelularmente e depois secretado. Não se liga à membrana,
sendo, portanto, encontrado apenas na forma solúvel no meio extracelular. A clivagem
ocorre no aparato de Golgi por uma furina, pro-proteína convertase que promove
ativação de proteínas por clivagem e processa muitos precursores inativos incluindo
hormônios, fatores de crescimento e receptores (Lopez-Fraga et al., 2001; Molloy et al.,
1999).
Figura 3. Funções biológicas de APRIL (a proliferation-inducing ligand) em células
normais e malignas. APRIL é produzido por uma variedade de tipos celulares, como
Aumenta a apresentação
antigênica de linfócitos B.
Aumenta a sobrevivência de
plasmócitos.
Linfócito B
virgem
Co-estimula a
proliferação de
linfócitos B.
Co-estimula proliferação
de linfócitos T ?
Células tumorais, monócitos, macrófagos,
células dendríticas, linfócitos, neutrófilos,
osteoclastos, células estromais da medula
óssea e megacariócitos.
Aumenta a proliferação e
sobrevivência de células
tumorais.
Induz mundança de classe
de anticorpos para IgA e
IgG.
13
células tumorais, monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos, neutrófilos,
osteoclastos, células estromais da medula óssea e megacariócitos. Pode atuar tanto em
células B normais como malignas aumentando sua sobrevivência, proliferação, função
de apresentação de antígeno e troca de classe de imunoglobulina em vários estágios de
desenvolvimento das células B. Parece aumentar a sobrevivência e proliferação de
vários carcinomas e, assim como Blys (B lymphocyte stimulator) co-estimular células T
sob determinadas condições (Adaptado de Dillon et al., 2006).
1.5.2. APRIL e seus receptores
APRIL é capaz de ligar-se a dois receptores já caracterizados, TACI
(transmembrane activator and calcium modulator cyclophilin ligand interactor) e
BCMA (B cell maturation antigen), assim como a citocina BAFF (B-cell activating
factor, também chamado de Blys – B lymphocyte stimulator), outro membro da mesma
subfamília de TNF (Mackay et al., 2006), devido ao fato de ambos possuírem uma
grande semelhança estrutural. Sabe-se que APRIL liga-se com maior afinidade a
BCMA, ao passo que BAFF possui maior afinidade por TACI (Marsters et al., 2000).
Tanto BCMA como TACI são expressos por células B, enquanto que as células T
expressam apenas TACI (Mackay et al., 2003). Inicialmente, TACI foi descrito, apenas
em células T ativadas (von Bülow & Bram, 1997). Os estudos sobre o efeito de APRIL
em linfócitos T ainda não estão bem compreendidos, no entanto foi visto que a proteína
parece ser fundamental para a sobrevivência destas células (Mackay & Leung, 2006).
Recentemente foi demonstrado que em camundongos, linfócitos T CD4+ e CD8
+ de
baço, linfonodos mesentéricos e subcutâneos, assim como de lavado peritoneal,
expressam o receptor TACI constitutivamente (Hardenberg et al., 2008). BAFF possui
um terceiro receptor, BR3 (BAFF-R), e este não é dividido com APRIL (Thompson et
al., 2001). Por outro lado, foi descrito que APRIL liga-se também a outro receptor ainda
não caracterizado expresso em células tumorais, pois algumas células tumorais de
linfoma de células T humano (Jurkat) proliferam em resposta à proteína, mas não
possuem os receptores TACI e BCMA (Hahne et al., 1998; Rennert et al., 2000). Foi
observado que APRIL liga-se especificamente a proteoglicanos de heparan sulfato
(HSPG – heparan sulfate proteoglycan) na superfície de células tumorais, sugerindo
então, que HSPG seja o terceiro receptor de APRIL (Hendriks et al., 2005). A
administração de BCMA-Fc não afeta a ligação entre APRIL e HSPG, sugerindo que a
14
seqüência protéica envolvida nesta ligação é diferente daquela necessária para a ligação
com BCMA e TACI, sendo assim, uma ligação específica para HSPG (Ingold et al.,
2005).
A ligação com BCMA e TACI influencia a atividade das células B, pois
promove ativação destes receptores, aumentando a sobrevivência celular, proliferação, a
expressão de moléculas co-estimulatórias, a apresentação antigênica, assim como induz
mudança de classe de imunoglobulinas para IgG e IgA, e formação de centro
germinativo (Yang et al., 2005; Dillon et al., 2006).
As vias de transdução de sinais (Figura 4) utilizadas por estes estão parcialmente
caracterizadas. Até o momento, sabe-se que TACI e BCMA ativam a via clássica do
fator de transcrição NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells) (Marsters et al., 2000). Esta ativação promove, principalmente, a produção de
anticorpos e o aumento de sobrevivência em linfócitos através da interação com os
membros da família TRAF (TNF Receptor Associated Factor) (Kimberley et al.,
2009a). O efeito de APRIL na inibição de morte foi descrito como resultado da
modulação de proteínas evolvidas com apoptose, pois estimula o aumento de fatores
anti-apoptóticos e leva à diminuição dos pró-apoptóticos (Stein et al., 2002, He et al.,
2004; Kern et al., 2004; Belnoue et al., 2008). Entretanto, ainda não se sabe se a
interação entre HSPG e APRIL ativa algum sinal intracelular. Essa interação com
APRIL auxiliaria o acúmulo da proteína na membrana facilitando, assim, a sinalização
através dos outros receptores (Kimberley et al., 2009b). As vias envolvidas com o
receptor BCMA associam-se aos fatores TRAF1, TRAF2 e TRAF3 resultando na
ativação de NF-kB, Elk 1, JNK (c-Jun N-terminal kinase) e p38 (Mukhopadhyay et al.,
1999; Hatzoglou et al., 2000; Marsters et al., 2000). Enquanto o domínio intracelular do
receptor TACI interage com os fatores TRAF2, TRAF5 e TRAF6 ativando, NF-kB e
JNK (Xia et al., 2000). Diminuindo então, os níveis das proteínas pró-apoptóticas Bim,
Bax (Bcl-2–associated X protein) e p53, e, paralelamente, aumentando a expressão de
proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra
large), Mcl-1 (Induced myeloid leukemia cell differentiation protein), XIAP (X-linked
Inhibitor of Apoptosis Protein) (He et al., 2004; Kimberley et al., 2009a). As vias
responsáveis pelas demais funções de APRIL ainda não estão totalmente caracterizadas,
no entanto, sabe-se que os receptores dessa proteína ativam diferentes vias que levam ao
aumento da sobrevivência (Belnoue et al., 2008).
15
Figura 4. Sinalização intracelular através dos receptores para APRIL. APRIL pode
ligar-se a TACI, BCMA e HSPG. No entanto não se sabe se este último leva a uma
sinalização intracelular. BCMA e TACI recrutam diferentes TRAFs, sendo que TRAF-2
pode ligar-se a ambos. A principal via de sobrevivência descrita para estes receptores é
a do NF- kB, com ativação de vários fatores de transcrição e resultando na modulação
de proteínas anti- e pró-apoptóticas. Ao final, há um aumento da sobrevivência e
possivelmente de proliferação. Além destes, em células B, TACI pode levar a troca de
classe de imunoglobulina e produção de IgA (Modificado de Kimberley et al., 2009a).
16
2. JUSTIFICATIVA
APRIL e BAFF possuem dois receptores em comum, TACI e BCMA. Com relação
a BAFF, já foram descritos níveis séricos elevados na infecção por T. cruzi e que essa
proteína poderia possuir efeito na ativação policlonal de células B na infecção chagásica
experimental murina. No entanto, neste contexto, não há relatos referentes às demais
moléculas. APRIL, por exemplo, tem sido principalmente relacionado a neoplasias e
doenças autoimunes. Sabemos que diferentes moléculas estão envolvidas na resposta
imunológica da doença de Chagas, a qual promove alterações em células linfoides do
hospedeiro. Portanto, considerou-se relevante verificar o comportamento desses ligantes e
receptores nessa enfermidade que acomete milhões de pessoas na América Latina.
3. OBJETIVOS
Objetivo geral:
Caracterizar a expressão de TACI e BCMA e seus ligantes APRIL e BAFF nos
linfonodos subcutâneos e mesentéricos, baço e células da cavidade peritoneal de
camundongos BALB/c infectados por T. cruzi comparados com animais não infectados.
Objetivos específicos:
Caracterizar por citometria de fluxo a expressão de TACI em linfócitos T e B
de linfonodos subcutâneos e mesentéricos, baço e cavidade peritoneal.
Avaliar por PCR em tempo real a expressão gênica do mRNA de TACI, BCMA,
APRIL e BAFF em células totais de linfonodos subcutâneos e mesentéricos, baço e
cavidade peritoneal
17
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais e infecção
Foram utilizados camundongos BALB/c machos de 6-8 semanas de idade
obtidos no biotério central da Fundação Oswaldo - RJ (CECAL) e mantidos no biotério
experimental do Pavilhão Leônidas Deane em condições SPF (Specific Pathogen Free)
Foram estabelecidas culturas de células Vero, com partida de 2x104 células/mL.
Após 24 horas, estas culturas foram infectadas com 20 parasitas/célula (8 horas) por
tripomastigotas da cepa Tulahuén de T. cruzi isoladas de sangue de camundongos
BALB/c machos com 7-8 semanas. Posteriormente ao período de infecção, os parasitas
livres foram retirados do sobrenadante por repetidos banhos em PBS. Após cinco dias
em co-cultivo com as células Vero, os parasitas liberados foram recolhidos, lavados por
centrifugação (800g) e contados em câmara de Neubauer
A infecção foi realizada por inoculação intraperitoneal de 10² tripomastigotas.
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética de uso de
animais da FIOCRUZ (Licença CEUAL-0024/07).
A eficácia da infecção foi confirmada através da realização da parasitemia,
utilizando 5 μL de sangue isolados da porção distal da cauda do camundongo, sendo em
seguida, quantificados os parasitas presentes em 50 campos entre lâmina e lamínula
(18x18mm).
4.2. Obtenção das células
Os animais controles e infectados foram eutanasiados, 14 dias pós infecção, em
câmara de CO2 de acordo com as orientações éticas para uso de animais na
experimentação e os linfonodos subcutâneos (inguinal, axilar e braquial) e
mesentéricos, baço e células da cavidade peritoneal foram removidos.
Linfonodos subcutâneos e mesentéricos
Os linfonodos subcutâneos e mesentéricos de cada animal depois de retirados
foram mantidos em meio RPMI com 10% de SBF mantido a 4°C. Em seguida foram
macerados em potter de vidro, sendo as suspensões celulares centrifugadas a 450 g por
5 minutos, 4°C. O sobrenadante foi desprezado, e as células ressuspedindas em 1mL de
meio RMPI suplementado com 10% de SBF para contagem. Durante esse
procedimento, o material foi conservado e trabalhado a 4°C.
18
Baço
Os baços foram imersos em PBS à temperatura ambiente. Após macerados,
foram colocados em tubos Falcon de 15 mL e centrifugados 450 g por 5 minutos. O
sobrenadante foi retirado e os esplenócitos ressuspendidos em 1 mL de tampão ACK
para lise das hemácias. Após homogeneizar lentamente, as células com solução ACK
foram mantidas em repouso por 7 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente a
outra homogeneização, os resíduos da cápsula do órgão foram retirados e a suspensão
celular em ACK permaneceu mais 2 minutos em repouso em temperatura ambiente. Em
seguida, foram adicionados 10 mL de meio PBS, as amostras foram centrifugadas a 450
g por 5 minutos e o sobrenadante desprezado. Foram adicionados 10 mL de PBS e após
nova centrifugação a 450 g por 5 minutos, o sobrenadante foi desprezado. Em seguida
para contagem dos esplenócitos, foi adicionado então 1 mL meio RPMI com 10% de
SBF. Na etapa final, após a lise com ACK, o material foi mantido a 4°C.
Reagente Quantidade
NH4Cl 01,5M 8,29g
KHCO3 mM 1g
EDTA 0,1mM 200mL
Água destilada Volume até completar 1 litro
Tabela 1. Tampão de lise ACK (Amonium-Chloride Lysing buffer) pH 7,2 – 7,4
Cavidade peritoneal
As células peritoneais foram obtidas a partir de um lavado injetando-se na
cavidade 3 mL de meio RPMI com 10% de SBF. Após realizar uma massagem na
região para que o meio alcançasse a maior quantidade possível de células da cavidade,
recolheu-se a suspensão celular com a seringa. A amostra foi centrifugada a 450 g por 5
minutos, 4ºC e o sobrenadante desprezado. As células foram ressuspendidas em 1mL de
RMPI com 10% de SBF para contagem. Sempre mantendo o material a 4°C.
Contagem celular
A análise da viabilidade celular das amostras foi realizada por exclusão das
células não viáveis através do corante Azul de Trypan (0,04%) em câmara de Neubauer.
19
4.3. Citometria de fluxo
Essa técnica foi realizada para analisar diferentes subpopulações de linfócitos T
e B presentes nos órgãos estudados e a expressão de TACI, receptor para APRIL e
BAFF, na superfície destas células.
Para os estudos da população de linfócitos T foram utilizados os anticorpos
monoclonais anti-TCRβ conjugado a FITC (BD - Becton Dickinson, EUA) em diluição
1:50; anti-CD4 conjugado a APC (BD, EUA) em diluição 1:50 e anti-CD8 conjugado a
PercP (BD, EUA) em diluição 1:50. Para estudo da população de linfócitos B, foram
utilizados os anticorpos monoclonais anti-CD19 conjugado a APC (Pharmingen, EUA)
em diluição 1:100; anti-IgD conjugado a FITC (Pharmingen, EUA) em diluição 1:100 e
anti-CD5 biotinilado (Pharmingen, EUA) em diluição 1:50 + estreptavidina PECy5.5
(Pharmingen, EUA) em diluição 1:100 . Todas as amostras celulares foram marcadas
com o anticorpo monoclonal anti-TACI conjugado a PE (R&D Systems, EUA) em
diluição 1:10 para avaliação da expressão deste receptor. Como controle isotípico do
anti-TACI PE foi utilizado IgG2a rat conjugado a PE (BD, EUA) em diluição 1:10.
Após contagem das células dos órgãos utilizados, 106 células foram distribuídas
por poço de uma placa de 96 poços de fundo “V”. Em seguida, foram lavadas por
centrifugação a 450 g por 5 minutos, 4 °C. O sobrenadante foi desprezado e 2 μL de
soro normal de camundongo foram adicionados em cada poço para bloqueio de
receptores Fc expressos na superfície das células. Após agitar a placa, as amostras em
soro mantidas no gelo foram incubadas por 15 minutos. Após a adição de 10 μL das
combinações específicas de anticorpos em cada poço, as amostras foram incubadas no
gelo por 20-30 minutos protegidas da luz. Realizou-se uma lavagem com 100μL meio
RPMI com 10% de SBF. Posteriormente, a placa foi colocada na centrífuga a 450 g por
5 minutos a 4°C e o sobrenadante desprezado. Foi acrescida estreptavidina APC nos
poços que continham anti-CD5 biotinilado e novamente incubou-se por 15-20 minutos
no gelo. Após nova centrifugação a 450 g por 5 minutos a 4 °C , o sobrenadante foi
desprezado e as amostras foram transferidas para tubos de FACS com 300 μL de PBS
com 1% formol para fixação. Até a aquisição no citômetro de fluxo (FACSCalibur), as
amostras foram estocadas a 4°C protegidas da luz.
Os dados foram analisados utilizando os programas FlowJo Flow Cytometry
Software versão 7.5.5 (Tree Star, Inc; EUA) e Summit versão 4.3.2 (Dako, Colorado).
20
4.4. Extração do RNA
Assim como para a citometria de fluxo, foram utilizados camundongos BALB/c
machos infectados com 102 formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, cepa
Tulahuén, com idade aproximada de seis semanas. Após 14 dias de infecção os
linfonodos subcutâneos, mesentéricos, lavado da cavidade peritoneal e baço foram
obtidos para análise de expressão gênica por PCR em tempo real de TACI, BCMA,
APRIL e BAFF.
Todas as análises foram realizadas após a formação de um pool de órgãos, a
partir do qual foi realizada a extração de RNA através de uma solução de lise de
tiocianato de guanidina*. Para tal, todas as amostras foram mecanicamente processadas
junto à solução de lise em um homogeneizador de tecidos e conservadas congeladas à -
20°C até o momento da extração de RNA, cujo protocolo está descrito a seguir:
*Solução de Tiocinato de Guanidina
4 M de tiocinato de guanidina
2% de Sarcosil
50 mM de Tris (pH7,6%)
10 mM EDTA
1% β-mercaptoetanol
Após homogeneizadas em 3 mL da solução de lise, 1 mL de cada amostra foi
centrifugada a 800 g, por 5 minutos a 4°C e 500 μL do sobrenadante foram retirados e
colocados em outro tubo. Em seguida, os seguintes reagentes foram adicionados na
ordem e volume indicados: 0.1 V de acetato de sódio 2M, pH 4; 1 V de fenol-DECP;
0.3 V de clorofórmio:álcool iso-amil (49:1), sendo V igual ao volume de sobrenadante
utilizado (500 μL). As amostras foram homogeneizadas por agitação em vortex, sendo
posteriormente incubadas em banho de gelo por 20 minutos. As amostras foram
centrifugadas a 14.000 rpm por 25 minutos a 4°C para separação das fases. A fase
superior aquosa foi transferida para um novo tubo cuidadosamente para não contaminar
com a camada inferior a esta. A cada tubo adicionou-se 1,1 V de isopropanol e
permaneceram em incubação overnight a -20°C para precipitação do ácido nucléico.
21
As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 25 minutos a 4°C e o
sobrenadante descartado cuidadosamente. Para lavagem das amostras adicionou-se 1mL
de etanol 70% e em seguida, verteu-se desprezando o mesmo. Para melhor retirada do
etanol 70%, foi realizado um short spin até 14000 rpm e o sobrenadante retirado com
auxílio de uma pipeta. Posteriormente, foram adicionados 30 µl de água RNase-free
para dissolução do RNA.
4.5. Obtenção do cDNA
Inicialmente, o total de RNA extraído foi quantificado por análise
espectrofotométrica no Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) no comprimento de onda de
260 nm. Em seguida, para degradação de possíveis moléculas de DNA na amostra, foi
transferido para outro tubo o volume correspondente a 2 μg de RNA e adicionados 1 μL
de tampão para reação, 2 μL de DNase (Invitrogen) e água RNase-free (QIAGEN) até
completar 10 μL. A mistura foi mantida por 30 minutos a 37°C, sendo posteriormente
adicionado 1 μL de solução de stop (Invitrogen), por 10 minutos a 65°C para bloquear a
ação da DNase.
Para obtenção do cDNA (DNA complementar), primeiramente foi preparada
uma mistura com 5 μL da solução contendo RNA, 1 μL de mix dNTP, 1 μL de
hexâmero (primer randômico) e 3 μL de água RNase-free, totalizando 10 μL para cada
amostra separadamente. As amostras foram incubadas a 65° por 5 minutos e depois
colocadas no mínimo 1 minuto no gelo. Em seguida, foram adicionados 2 μL de tampão
10X, 4 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de DTT (dithiotreithol) 0,1 M, 1 μL de inibidor de
RNase e 1 μL da enzima transcriptase reversa. As amostras foram transferidas para
tubos próprios para PCR (polymerase chain reaction – reação em cadeia da polimerase)
e colocadas no termociclador cuja programação foi para o seguinte ciclo: 50 minutos a
42°; 15 minutos a 70°C; e resfriar até 4°C. Posteriormente, permaneceram a -20°C até a
realização da PCR em tempo real.
4.6. PCR quantitativa em tempo real
Essa técnica foi utilizada para comparar a expressão de mRNA de APRIL,
BAFF, TACI e BCMA em camundongos infectados em relação aos controles não
infectados. A amplificação dos cDNAs foi realizada pela PCR em tempo real utilizando
o kit Power SYBR Green Mix 2X (Applied Biosystems).
22
Para preparação do mix acrescentado às amostras, foram utilizados os seguintes
reagentes:
reagente volume
SYBR 2x 27,5μL
cDNA 2,2 μL
Sense primer¹ 1,0 μL
Antisense primer² 1,0 μL
H2O Mili-Q 23,3μL
Total 55 μL
Tabela 2. Preparação do mix para PCR.
Cada amostra foi colocada em duplicata na placa de leitura (25µl/poço) e o
volume final de cDNA/poço foi 1µl contendo uma quantidade final entre 20-100ng de
ácido nucléico. Para cada gene analisado foi feito um controle sem amostra (NTC - non-
template control) correspondente para verificar a ausência de contaminação da amostras
analisadas. Para controle interno foi utilizada a expressão do gene constitutivo GAPDH
(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), a partir do qual obtivemos o Δct de cada
amostra para a expressão dos genes de APRIL, BAFF, TACI e BCMA. Após
centrifugar a placa por 2 minutos a 800 g, a mesma foi colocada no Real Time PCR
7500 (Applied Biosystems). Todas as análises foram realizadas com base na equação 2-
Δct.
Sense primer Antisense primer
APRIL GGG-GAA-GGA-GTG-TCA-GAG-TG
GCA-GGG-AGG-GTG-GGA-ATA-TG
BAFF GG-CTG-GAA-GAA-GGA-GAT-GAG
CAG-AGA-AGA-CGA-GGG-AAG-GG
TACI GTG-TGG-CCA-CTT-CTG-TGA-GA
GGG -TAG-TCG-ATT-GTGC-TGA-TT
BCMA ATC-TTC-TTG-GGG-CTG-ACC-TT
TAG-CGC-AAG- ATG -CTT-AGC-AC
GAPDH GGG-TGT-GAA-CCA-CGA-GAA-AT CGC-GTT-GGC-CAT-GAC-AAT-CT
Tabela 3. Sequências dos primers utilizados.
4.7. Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas pelo Teste t no programa GraphPad
Prism 5.
23
5. RESULTADOS
5.1. Curva de parasitemia e celularidade.
Para acompanhamento da evolução da infecção, a parasitemia foi monitorada até
19 dias pós-infecção (Figura 5A). Assim, foi detectada a presença do parasita no sangue
dos camundongos infectados a partir de 11 dpi (dias pós infecção).
Para os experimentos foi escolhido o 14º dia após a infecção, pois nesta fase há
aparente parasitemia, modulação dos órgãos linfóides e viabilidade do animal (Figura 5ª
e B). Sendo assim, para efeito de comparação entre animais infectados e não infectados
realizou-se a contagem das células dos diferentes compartimentos linfoides utilizados
(linfonodos subcutâneos, linfonodos mesentéricos, baço e cavidade peritoneal). A partir
da análise da celularidade (Figura 5B), foi possível evidenciar nos animais infectados
um aumento significativo do número de células nos linfonodos subcutâneos (LSC) e
uma tendência de aumento no baço (B). Na cavidade peritoneal (CP), não observamos
variações na celularidade (B), enquanto que nos linfonodos mesentéricos (LM) houve
uma diminuição significativa nos animais infectados com relação aos controles.
Figura 5. Variação da parasitemia e celularidade dos diferentes compartimentos
linfoides. Camundongos BALB/c foram infectados com 10² tripomastigotas da cepa
Tulahuén de T. cruzi por via intraperitoneal. A) Demonstra a cinética da parasitemia em
diferentes dias pós infecção (11 dpi, n = 3; 14 dpi, n = 7; 19 dpi n= 6). A parasitemia
foi obtida pela contagem dos parasitas presentes em 5 microlitros de sangue observados
em 50 campos em uma área de lamínula 18 x 18 mm. B) Evidencia a celularidade por
exclusão das células inviáveis por azul de trypan em linfonodos subcutâneos (LSC) e
mesentéricos (LM) e cavidade peritoneal (CP) entre os animais infectados (n = 14) e
0
10
20
75
100
125
150
Controle
Infectado
***
*
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
LSC LM CP B
A
0 2 40
100
200
300
400
10 12 14 16 18 20
dias pós infecção
Nú
mero
de p
ara
sit
as / 5
0 c
am
po
s
B
24
seus controles (n = 9) após 14 dias pós-infecção. No caso do baço, foram utilizados 5
infectados e 4 controles. *p<0,05; ***p<0,001
5.2. Comparação entre subpopulações de células T e B.
Com o objetivo de avaliar se a variação da celularidade observada estava
relacionada com uma população de linfócito específica, foram utilizadas análises por
citometria de fluxo para as subpopulações de linfócitos T e B. A figura 6 é ilustrativa, e
exemplifica com as células do LM, como foram analisados estes tipos celulares nos
diferentes compartimentos estudados na infecção murina pelo T. cruzi.
5.2.1 Células T.
Os valores relativos e absolutos das células TCRβ+CD4
+e TCRβ
+CD8
+ (Figura
7) foram analisados. As células TCRβ+CD4
+ apresentaram nos LSC dos animais
infectados uma diminuição percentual significativa quando comparados com as dos
controles, mas houve um aumento significativo em número absoluto (Figura 7A e C).
Entretanto, nos LM e baço, os percentuais destas células não apresentaram grandes
variações no grupo de animais que utilizamos, sendo o número de TCRβ+CD4
+ nos
infectados significativamente menor nos LMs e com tendência de aumento no baço
(Figura 7A e C). Na cavidade peritoneal, notou-se que os linfócitos TCRβ+CD4
+ nos
camundongos infectados estavam percentualmente e em números absolutos
aumentados. Por outro lado, as células TCRβ+CD8
+ não apresentaram grandes variações
em números relativos nos LSC, LM e baço, porém na cavidade peritoneal houve um
aumento significativo nos camundongos infectados (Figura7B e D). Enquanto que, em
números absolutos, estas células encontravam-se aumentadas significativamente nos
LSC e CP, com diminuição significativa nos LM e tendência de aumento no baço.
5.2.2 Células B.
Como APRIL tem sido descrito mostrando-se capaz de modular linfócitos B,
decidimos estudar estas células na infecção murina por T. cruzi (Medema et al., 2003;
Belnoue et al., 2008; He et al., 2007).
25
A Figura 8 mostra os valores relativos e absolutos de células CD19+IgD
low,
consideradas segundo a literatura como os linfócitos B-1 e
as CD19+IgD
high os
linfócitos B-2 (Dorshkind et al., 2007). As células B-1 e B-2 apresentaram percentuais
significativamente elevados nos LSC e baço, quando se comparou os animais infectados
com os controles e, na cavidade peritoneal, os valores relativos da população B1
tiveram redução significativa e B-2 tenderam a reduzir nos infectados (Figura 8A e B).
Enquanto que, nos LM, o percentual das B-1 não apresentou diferenças e as B-2
tenderam a diminuir (Figura 8A e B). Com relação aos valores absolutos destas células
observou-se nos animais infectados um aumento significativo nos LSC e baço de ambas
subpopulações de B (Figura 8C e D). As células B-1 da cavidade peritoneal
apresentaram uma tendência de redução em número absoluto nos infectados, enquanto
nas B-2 não houve variação. Quanto aos LM, a celularidade dos linfócitos B-1 e B-2
tendeu a reduzir (Figura 8C e D).
Figura 6. Esquema representativo da análise das subpopulações de linfócitos T e
B. Exemplo referente a linfonodos mesentéricos infectados. As células obtidas de um
camundongo infectado por 10² tripomastigotas da cepa Tulahuén de T. cruzi com 14
dias após a infecção. A) Seleção da população (linfócitos viáveis - gate) a ser estudada
26
com base nos parâmetros morfológicos de tamanho (eixo y) e granulosidade (eixo x). B
e C) linfócitos TCRβ+CD4
+ e TCRβ
+CD8
+ dentro da população de linfócitos viáveis.
D) Linfócitos CD19+IgD
low (R10) CD19
+IgD
high (R9) dentro da população de linfócitos
viáveis.
TCRβ+CD4
+ TCRβ
+CD8
+
Figura 7. Análise por citomeria de fluxo das subpopulações de linfócitos T. Os
órgãos utilizados foram linfonodos subcutâneos (LSC) e mesentéricos (LM) e cavidade
peritoneal (CP) de camundongos BALB/c infectados (n = 14) e controles não
infectados (n = 9) com 10² tripomastigos da cepa Tulahuén de T. cruzi, sendo que para
o baço foram 5 infectados e 4 controles. A e C) Valores relativos e absolutos de células
TCRβ+CD4
+. B e D) Valores relativos e absolutos de células TCRβ
+CD8
+. *p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001.
0
20
40
60
80
100
***
***
Perc
en
tual
de c
élu
las
0
20
40
60
80
100
***
Perc
en
tual
de c
élu
las
0.00
0.25
0.50
20
40
60
**
***
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
0.0
0.1
0.2
5
10
15
20
** ****
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
LSC LM CP B
LSC LM CP B
A B
C D
LSC LM CP B
LSC LM CP B
27
CD19+IgD
low CD19
+IgD
high
C
Figura 8. Análise por citomeria de fluxo das subpopulações de linfócitos B. Os
órgãos utilizados foram linfonodos subcutâneos (LSC) e mesentéricos (LM), cavidade
peritoneal (CP) e baço (B) de camundongos BALB/c machos controles infectados (n =
14) e não infectados (n = 9) com 10² tripomastigos da cepa Tulahuén de T. cruzi, sendo
que para o baço foram 4 controles e 5 infectados. A e C) Valores relativos e absolutos
de células CD19+IgD
low, B-1. B e D) Valores relativos e absolutos de células
CD19+IgD
high, B-2. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
5.3 Expressão de TACI em linfócitos T e B.
Os resultados obtidos na análise pelo FACS da expressão de TACI, receptor para
APRIL, nas subpopulações de linfócitos T e B dos compartimentos linfoides estudados,
são mostrados nas figura 9, 10 e 11. Observamos que os LSC, LM e baço não
apresentaram grandes variações no percentual de células TACI+
dentro do gate de
linfócitos viáveis, enquanto que na CP há uma tendência a diminuição nos
C
LSC LM CP B
0.00
0.25
0.50
2
4
6
8
Controle
Infectado
***
*
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
D
LSC LM CP B 0
1
2
20
40
60Controle
Infectado
**
*N
úm
ero
de c
élu
las (
x10
6)
A
LSC LM CP B
0
2
4
6
20
40
60
80
100
Controle
Infectado
**
**
*
Perc
en
tual
de c
élu
las
B
LSC LM CP B
0
25
50
75
100Controle
Infectado
***
Perc
en
tual
de c
élu
las
28
camundongos infectados por T. cruzi quando comparados com os não infectados
(Figura 9).
Conforme a figura 10, nos LSC, a tendência é de aumento em ambas
subpopulações de linfócitos T. Nas células fenotipicamente identificadas como B-1 e B-
2 não foram observadas variações. Nos LMs, TCRβ+CD4
+ e B-1 tenderam a aumento, já
TCRβ+CD8
+ e B-2 não apresentaram grandes variações. Na cavidade peritoneal, todas
as subpopulações de linfócitos tenderam a redução da expressão deste receptor,
enquanto que os linfócitos B não apresentaram grandes variações nos infectados. No
entanto, no baço sugere-se que não houve expressão de TACI em linfócitos T, porém o
percentual de TACI+ neste órgão para B-1 e B-2 diminuiu como se pode notar na figura
10C e D.
A avaliação dos valores absolutos de células TACI+ em TCRβ
+CD4
+,
TCRβ+CD8
+, CD19
+IgD
low (B-1) e CD19
+IgD
high (B-2) mostrou que apenas B-1 e B-2
tenderam a aumentar nos LSC infectados. Nos LMs, em nenhuma das subpopulações
estudadas, o número de células TACI+ apresentou variação. Na cavidade peritoneal,
houve tendência de aumento em todas em TCRβ+CD4
+ e
TCRβ
+CD8
+, enquanto que
em B-1 e B-2 não houve variação. No baço, não houve expressão de TACI em T, mas a
relação foi de tendência de aumento das B-1 e B-2 nos camundongos do grupo
experimentado (Figura 11).
Figura 9. Análise por citometria de fluxo do percentual de células TACI+. Para a
realização desses experimentos foram utilizadas células obtidas de linfonodos
subcutâneos (LSC) e mesentéricos (LM), cavidade peritoneal (CP) e baço (B) de
animais infectados por 10² tripomastigotas da cepa Tulahuén de T. cruzi com 14 dpi e
controles. p>0,05.
LSC LM CP B0
1
220
40
60
80
100Controle
Infectado
Perc
en
tual
de c
élu
las
29
Figura 10. Análise por citometria de fluxo do percentual de TACI em linfócitos.
Para a realização desses experimentos foram utilizadas células obtidas de linfonodos
subcutâneos (LSC) e mesentéricos (LM) e cavidade peritoneal (CP) de animais
controles (n = 9) e animais infectados (n = 14) e por 10² tripomastigotas da cepa
Tulahuén de T. cruzi com 14 dias após a infecção. Sendo que para o baço (B), foram 4
controles e 5 infectados. A) Valor relativo das células TCRβ+CD4
+ que são TACI
+. B)
Valor relativo das células TCRβ+CD8
+ que são TACI
+. C) Valor relativo das células
CD19+IgD
low que são TACI
+. D) Valor relativo das células CD19
+IgD
high que são
TACI+. Barras pretas representam os infectados e as barras brancas, os controles.
p>0,05.
0.0
0.1
0.220
40
60
80
100
Perc
en
tual
de c
élu
las
0.00
0.25
0.50
20
60
100
Perc
en
tual
de c
élu
las
0
5
1020
60
100
Perc
en
tual
de c
élu
las
0.0
2.5
5.0
40
70
100
Perc
en
tual
de c
élu
las
% TACI+ em CD19
+IgD
low % TACI
+ em CD19
+IgD
high
% TACI+ em TCRβ
+CD4
+ %
TACI
+ em TCRβ
+CD8
+
A B
C D
LSC LM CP B LSC LM CP B
LSC LM CP B LSC LM CP B
30
Figura 11. Número de células TACI+ dentro de diferentes subpopulações de células
T e B. Foi realizada análise por citometria de fluxo de linfócitos de animais controles
não infectados (n = 9) e infectados (n = 14) com 10² tripomastigotas da cepa Tulahuén
de T. cruzi com 14 dias após a infecção, sendo que para o baço foram 4 controles e 5
infectados. A) Valor absoluto das células TCRβ+CD4
+ que são TACI
+. B) Valor
absoluto das células TCRβ+CD8
+ que são TACI
+. C) Valor absoluto das células
CD19+IgD
low que são TACI
+. D) Valor absoluto das células CD19
+IgD
high que são
TACI+. Para a realização desses experimentos foram utilizadas células obtidas de
linfonodos subcutâneos (LSC) e mesentéricos (LM), cavidade peritoneal (CP) e baço
(B) de animais controles e infectados. Barras pretas representam os infectados e brancas
os controles. p>0,05.
5.4 Expressão gênica de APRIL, BAFF e seus receptores TACI e BCMA.
Como as variações observadas na expressão de TACI em linfócitos T e B nos
diferentes órgãos linfoides de camundongos normais e infectados não foram
conclusivas, consideramos importante confirmar por análise em tempo real de mRNA
para TACI. Entretanto, no mesmo ensaio, para uma melhor compreensão do possível
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
TACI+ em CD19
+IgD
low TACI
+ em CD19
+IgD
high
0.0
0.2
0.4
2
4
6
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
0.00
0.04
0.08
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
6)
LSC LM CP B LSC LM CP B
LSC LM CP B LSC LM CP B
TACI+ em TCRβ
+CD4
+ TACI
+ em TCRβ
+CD8
+
A B
C D
31
modulação não somente de APRIL, mas também, de seu competidor, BAFF na infecção
por T. cruzi, foram quantificados, ainda, os mRNAs destas proteínas e do outro
receptor, BCMA, que pode estar ativado em células B.
Sendo assim, comparamos a quantidade gênica de mRNA de TACI, BCMA,
APRIL e BAFF proveniente das células totais obtidas de cada órgão/região de
camundongos infectados e seus respectivos controles (Figura 12). Nos LSC e LM, não
houve grande variação na expressão gênica de TACI. Enquanto que na CP houve uma
redução da transcrição de mRNA de TACI após 14 dias de infecção, e no baço a relação
foi inversa, aumentou a expressão do mRNA deste receptor (Figura 12A).
Nos LSC, não foi observada variação dos valores de 2-Δct
de APRIL, mas para
BAFF e BCMA houve um aumento discreto nos animais infectados em comparação
com os controles não infectados. Nos LM, a infecção promove uma ligeira diminuição
para APRIL e BCMA, e para BAFF não variação. Já na CP, observamos uma
diminuição de mRNA de APRIL e BCMA, mas um aumento considerável para BAFF.
No baço, encontramos uma redução discreta de mRNA de APRIL, e para BAFF, essa
redução nos infectados em relação ao controles é mais evidente, no entanto não
observamos variação na expressão gênica de BCMA (Figura 12B, C e D).
32
Figura 12. Análise por PCR em tempo real da expressão gênica (2-Δct
) de TACI,
BCMA APRIL e BAFF. Foi realizado um pool de células de linfonodos subcutâneos
(LSC) e mesentéricos (LM), cavidade peritoneal (CP) e baço (B) de camundongos
BALB/c controles não infectados e infectados por 10² tripomastigotas da cepa
Tulahuén de T. cruzi com 14 dias após a infecção. A) Expressão gênica de TACI. B)
Expressão gênica de BCMA. C) Expressão gênica de APRIL. D) Expressão gênica de
BAFF.
LSC LM CP B LSC LM CP B
TACI
0.0
0.4
0.8
1.2Controle
Infectado
valo
r d
e e
xp
ressão
gên
ica (
2-
ct )
BCMA
0
2
4
6
8Controle
Infectado
valo
r d
e e
xp
ressão
gên
ica (
2-
ct )
APRIL
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4Controle
Infectado
valo
r d
e e
xp
ressão
gên
ica (
2-
ct )
BAFF
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20Controle
Infectadovalo
r d
e e
xp
ressão
gên
ica (
2-
ct )
LSC LM CP B LSC LM CP B
C D
A B
33
6. DISCUSSÃO
APRIL tem sido relacionado principalmente a doenças autoimunes e tumores
(Hahne et al., 1998; Planelles et al., 2004; Mackay et al., 2007). No momento, os
únicos trabalhos que estudam o papel de APRIL com patógenos, resumem-se aos
estudos de 1) APRIL facilitando a eritroleucemia induzida pelo vírus MLV (Friend
Murine Leukemia vírus) e 2) a interação de TLR.em células epiteliais intestinais com
Salmonella typhimurium e bactérias da microbiota intestinal aumentando a secreção de
APRIL e produção e IgA2 (He et al., 2007; Hardenberg et al., 2008). No entanto, ainda
não existem trabalhos relacionando APRIL e doença de Chagas.
Os estudos relacionados à doença de Chagas ainda são alvo de investimentos por
ser um problema de saúde pública (Dias et al., 2008). A resposta imune é essencial para
o controle da infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi), e sabe-se que esta
enfermidade promove alterações em tecidos e células linfoides no hospedeiro (Revisado
por De Meis et al., 2009). Nesse sentido, decidimos avaliar a expressão de TACI
(receptor para APRIL) no contexto da doença de Chagas. Este receptor está presente na
superfície de células T e B, e nesse estudo verificamos sua expressão nas subpopulações
celulares em compartimentos envolvidos na resposta imunológica.
Utilizando camundongos BALB/c infectados com 100 formas tripomastigotas da
cepa Tulahuén do T. cruzi, por via intraperitoneal, realizamos uma análise da
parasitemia desses animais (Figura. 5A). Para tal, monitoramos durante o curso da
infecção a aprtir do 11º dpi até o 19º dpi, evidenciando que os parasitas começaram a
aparecer na corrente sanguínea com 11 dpi. Corroborando com nossos dados, outro
grupo encontrou resultados similares de parasitemia, cuja inoculação foi por via
subcutânea com a mesma cepa e inóculo em camundongos (Roggero et al., 2002).
Assim como estes autores, encontramos com 14 dpi uma média de 40-50 parasitas/50
campos, e do 19º ao 21º dia após a infecção, esses valores podem alcançar em média
300 parasitas/50 campos ou mais (Roggero et al., 2002).
Para melhor compreensão do comportamento dos compartimentos linfoides,
analisamos as diferenças de celularidade (Figura 5B) e subpopulações de linfócitos T e
B nos linfonodos subcutâneos e mesentéricos, cavidade peritoneal e baço. Buscamos
nas células T e B um possível papel para APRIL na doença através da expressão de
TACI nessas subpopulações. Os resultados demonstraram que na fase aguda, com 14
34
dias após a infecção, os animais infectados pelo T. cruzi apresentaram aumento de
celularidade nos linfonodos subcutâneos e baço, uma redução nos linfonodos
mesentéricos, mas não houve variação na cavidade peritoneal (Figura 5B). Os achados
nos linfonodos estão de acordo com resultados anteriores do nosso grupo que
demonstrou as mesmas diferenças utilizando a cepa Colombiana, isto é, expansão das
células dos linfonodos subcutâneos e atrofia dos mesentéricos na infecção (De Meis et
al., 2006). Na necropsia encontramos uma esplenomegalia acentuada, com aumento do
número de células, apesar de não ser significativo, provavelmente pelo reduzido número
de animais cujo baço foi analisado e por ainda não ser o pico de parasitemia. Os dados
de hipertrofia nos linfonodos subcutâneos e da esplenomegalia estão de acordo com o
que foi visto por Minoprio e colaboradores em 1986. Quanto à cavidade peritoneal, não
observamos alteração da celularidade do lavado após 14 dias de infecção. No entanto,
Merino e colaboradores (2010), encontraram uma significativa redução do número de
células nessa cavidade após 15 dias de infecção de BALB/c por 500 tripomastigotas
sanguíneos da cepa Tulahuén de T. cruzi via intraperitoneal. Essa diferença de
resultados pode ter ocorrido pela diferença do inóculo, os autores, também, não
deixaram explicito o sexo dos camundongos e a forma pela qual obtiveram as células.
Diante dessa análise comparativa, reiteramos a importância do estudo da resposta imune
na doença de Chagas de forma compartimentalizada, uma vez que se observou um
comportamento diferencial entre os órgãos analisados (Minoprio et al., 1986; De Meis
et al., 2006; Merino et al., 2010).
A expansão celular observada nos nossos experimentos com linfonodos
subcutâneos (axilar, braquial e inguinal) foi acompanhada pelo aumento da quantidade
de células T CD4+ e CD8
+, B-1 e B-2 (Figuras 7C e D e 8C e D). Esta ocorre devido a
uma ativação policlonal de linfócitos T e B nesses gânglios (Revisado por De Meis et
al., 2009). Da mesma forma, a hiperplasia encontrada no baço estava relacionada ao
aumento no número de células das subpopulações celulares estudadas ou tendência no
caso das T CD4+ e T CD8
+ (Figuras 7C e D e 8C e D) assim como observaram
Minoprio e colaboradores, em 1986. Houve uma redução no número das células T CD4+
e CD8+ e tendência de redução de B-1 e B-2 nos linfonodos mesentéricos, sendo que De
Meis e colaboradores (2006) haviam encontrado este mesmo resultado nos linfócitos T,
enquanto que nas B, descreveram uma redução total, porém sem fenotiparem B-1 e B-2.
Ainda demonstraram que este fato era por uma menor taxa proliferativa e aumento de
morte celular.
35
Resolvemos estudar as subpopulações da cavidade peritonal, importante no
estudo das células B, porque APRIL, ligante de TACI (presente em células T e B), tem
sido citado em experimentos com os camundongos transgênicos para esse ligante, sendo
que estes animais apresentam aumento das células B-1 nesse compartimento (Planelles
et al., 2004). Nossos resultados não foram totalmente compatíveis com dados da
literatura descritos por Merino e colaboradores (2010), conforme foi comentado nos
achados de celularidade da cavidade peritoneal (Figura 5B). Segundo este grupo, há um
aumento de T CD4+ e CD8
+ no peritônio de camundongos infectados por T. cruzi, como
também observamos (Figuras 7C e D). Eles notaram que o número absoluto de células
B CD19+ peritoneais diminuiu significativamente após 15 dias de infecção, sendo esse
perfil de redução também aplicado às subpopulações de B. No entanto, não encontramos
alteração do número de células B-1 e B-2 na cavidade peritoneal (Figura 8C e D) de
camundongos infectados por T. cruzi. Eles demonstraram ao mesmo tempo, que a
infecção por T. cruzi não induz uma forte apoptose das células B-1 e B-2 peritoneais,
contrariando o aumento de morte celular como causa da redução do número destas
células na cavidade peritoneal. E ainda, concluíram, que na verdade, essa redução
ocorria devido à diferenciação destas células em plasmócitos secretores de
imunoglobulinas, sendo observado em 15 dpi uma secreção significativa de IgM, IgG1,
IgG2a, IgG2b e IgG3, contribuindo para o controle do parasita. A redução do número de
células B-1 e B-2 peritoneais apresentaram cinéticas diferentes, iniciando com 4 dpi
para as B-2 e 12-15 dpi para as B-1, deste modo, com 15 dpi, ambas já estavam
reduzidas. (Merino et al., 2010). Portanto, na infecção murina por T. cruzi houve
variações não somente na celularidade, mas também na composição celular dos
diferentes compartimentos observados.
Vale ressaltar para o estudo das subpopulações de células B na doença de
Chagas, seria importante incluir as CD5+ para uma melhor definição em relação à
APRIL, pois no camundongo transgênico foi visto um aumento do número de células B-
1 CD5+ (Planelles et al., 2004). Porém, não foi possível obter resultados conclusivos
com essa molécula em nossos ensaios. O que teria sido interessante, pois sabemos que o
fenótipo da superfície celular pode alterar dependendo do microambiente (modulação de
citocinas, quimiocinas e sinalização do BCR), e a expressão de determinadas moléculas
de superfície que irá indicar a subpopulação funcional específica (Hardy, 2006).
36
A partir da definição das subpopulações de células T e B avaliamos a presença
de TACI, receptor de APRIL e BAFF, na superfície destas células para saber se a
infecção modulava a expressão desta molécula. De acordo com a literatura, sabe-se que
ele é expresso principalmente em células B (cerca de 31% em B-1 e 21% em B-2 na
cavidade peritoneal) e recentemente foi demonstrado que linfócitos T CD4+ e CD8
+ de
baço, linfonodos mesentéricos e subcutâneos, assim como de lavado peritoneal,
expressam o receptor TACI constitutivamente. Nos linfonodos e no baço cerca de 2%
das células T expressam TACI e na cavidade peritoneal, essa expressão é em cerca de
20% destas células (Revisado por Salzer et al., 2007; Hardenberg et al., 2008). Ao
observarmos o percentual de expressão de TACI nos compartimentos estudados sem
diferenciarmos as supopulações de T e B, vimos que não apresentou grandes variações
nos linfonodos subcutâneos, mesentéricos e baço, enquanto na cavidade peritoneal o
percentual teve uma tendência a diminuir (Fig. 9). Analisando essa expressão
especificamente nas subpopulações de interesse neste trabalho, pode-se notar que apesar
desses percentuais gerais não terem variado muito, dentro das subpopulações aparece
uma tendência de variação. Nos linfonodos subcutâneos, parece ter ocorrido uma
tendência de modulação positiva de TACI na infecção, mesmo que discreta, em todas as
subpopulações celulares estudadas, exceto nas células T CD4+ (Figura 11). No entanto,
acreditamos que o número de animais utilizados não nos permitiu a ter uma estatística
significativa nos ensaios. Nos linfonodos mesentéricos, nenhuma das subpopulações
apresentou variação da expressão de TACI (Figura 11). Contudo, na cavidade peritoneal
houve uma tendência de aumento de TACI em todas as subpopulações de T, e tendeu a
reduzir em B-1 (Figura 11C). No baço, praticamente, não houve marcação de TACI em
células T, para T CD4+ encontrou-se uma positividade muito baixa apenas no controle e
para T CD8+, ao contrário, apenas no infectado (Figura 11A e B). Como foi revisado
por Mackay e colaboradores (2008), TACI era principalmente expresso em células B,
mas já foi relatada a expressão também em células T, e dois estudos separados
confirmaram uma forte expressão de TACI no baço e no timo. No entanto, anticorpos
monoclonais específicos para TACI tanto humano como de camundongo falharam na
detecção de TACI na superfície de células T humanas e murinas (Mackay et al., 2006).
Este achado, não excluiu a possibilidade de expressão de TACI em subpopulações de
células T (Revisado por Mackay et al., 2008). Há dados na literatura de que TACI tem
sua expressão fortemente aumentada em células B após ativação destas, e no contexto
da infecção chagásica ocorre principalmente nos linfonodos subcutâneos e no baço
37
(Revisado por Salzer et al., 2007; Revisado por De Meis et al., 2009). Assim, nossos
dados sugerem um possível aumento de TACI em B-1 e B-2 de animais infectados,
estando assim compatíveis com o estado de ativação das células nesses tecidos.
Buscando uma melhor compreensão da participação de TACI na infecção
chagásica realizamos PCR em tempo real para quantificar a expressão gênica destas
moléculas, assim como de BCMA, outro possível receptor envolvido, e dos ligantes
APRIL e BAFF em células totais dos compartimentos linfoides utilizados neste
trabalho.
A quantidade de mRNA para TACI nos linfonodos subcutâneos e mesentéricos
não apresentou modulação, mas houve redução na cavidade peritoneal dos animais
infectados em relação ao controles. No baço, ao contrário do que vimos na citometria
(onde os animais infectados apresentaram uma expressão de TACI similar aos não
infectados), houve um aumento na expressão gênica deste receptor. Entretanto, quanto à
relevante redução da expressão gênica de TACI nas células totais da cavidade peritoneal
não se pode discutir se era nas células B-1, conforme observamos através da marcação
para esta subpopulação pelas análises citofluorimétricas. A separação das
subpopulações de B e T não foi feita antes da análise por PCR em tempo real, então,
não é possível afirmar que são as B-1, características da cavidade peritoneal, que
estariam com a expressão gênica de TACI sendo modulada (Ray et al., 2010). Para
avaliar se as células destes órgãos/regiões poderiam ter APRIL e BAFF, assim como
seu outro receptor, BCMA modulados a nível transcricional, nós quantificamos também
a produção de mRNA destas moléculas. Para BCMA encontramos que os linfonodos
subcutâneos dos animais infectados apresentaram um aumento desta, mas para TACI
houve uma redução. Os dados, portanto, sugeriram que neste compartimento o receptor
modulado na infecção poderia ser BCMA. Nos linfonodos mesentéricos e na cavidade
peritoneal a variação dos níveis de mRNA de BCMA nos infectados apresentou um
perfil de redução semelhante ao TACI, sendo a redução nos linfonodos mesentéricos
mais discreta. No baço, não houve grandes variações na expressão gênica de BCMA
diferentemente como havíamos dito para TACI. Vale ressaltar que também se tem
discutido a ligação de APRIL a proteoglicanas de heparan sulfato (HSPG) (Revisado
por Kimberley et al., 2009b).
Ao analisarmos a quantificação de mRNA para APRIL e BAFF nos linfonodos
subcutâneos, observamos um discreto aumento de mRNA de BAFF. Por outro lado,
APRIL não apresentou variação nestes gânglios, sugerindo que BAFF, e não APRIL,
38
possa ser relevante na hiperplasia dos linfonodos subcutâneos. Nos linfonodos
mesentéricos, BAFF não apresentou grandes variações e APRIL, teve uma ligeira
redução. Curiosamente, a expressão gênica de BAFF na cavidade peritoneal aumentou
quatro vezes, mas para APRIL observamos uma pequena diminuição. No entanto, o
baço apresentou uma diminuição da expressão gênica de BAFF na infecção, enquanto
que para APRIL esse efeito foi menos evidente.
Considerando que não há dados publicados envolvendo APRIL e seus
receptores, TACI e BCMA, na infecção por T. cruzi experimental e humana, este
trabalho tem uma especial importância, pois esta sendo pioneiro no que diz respeito às
análises destas moléculas no contexto da doença de Chagas murina. Por outro lado, foi
descrito recentemente que BAFF encontrava-se elevado no soro de camundongos
infectados a partir de 11 dpi, e que BAFF é crucial para a sobrevivência de células B
periféricas (Bermejo et al., 2010). Porém, esta citocina em excesso leva ao
desenvolvimento de autoimunidades em modelos animais (Revisado por Bermejo et al.,
2010). Segundo estes autores, BAFF pode estar participando da resposta policlonal de
células B observada na doença de Chagas. Esse grupo observou as células provenientes
do baço e medula óssea obtidos de camundongos infectados por T. cruzi com 15 dias de
infecção, mas não as dos linfonodos e cavidade peritoneal, que quando cultivadas na
ausência de estímulo, secretavam maiores concentrações de BAFF em comparação com
os controles. Nossos resultados corroboram com essa hipótese, uma vez que BAFF foi a
proteína mais modulada nos nossos ensaios. Além disso, no que se refere a APRIL, esta
modulação não foi tão evidente na infecção.
Atualmente, ainda não somos capazes de concluir se as alterações observadas
por citometria de fluxo e/ou RT-PCR representam mudanças na função de TACI e
BCMA nestes órgãos, uma vez que não foram realizados ensaios funcionais com seus
respectivos ligantes.
39
Linfonodos
subcutâneos
Linfonodos
mesentéricos
Cavidade
peritoneal
Baço
Celularidade
-
TCRβ+CD4
+
TCRβ+CD8
+
B-1
B-2
-
TCRβ+CD4
+
TACI+
-
-
-
TCRβ+CD8
+
TACI+
-
-
-
B-1 TACI+
-
-
B-2 TACI+
-
-
mRNA TACI
-
-
mRNA BCMA
-
-
mRNA APRIL
-
mRNA BAFF
-
Tabela 4. Variações nos compartimentos linfoides na infecção chagásica murina. Seta
pequena indica variação discreta. Seta média, variação. Seta grande e vermelha, variação
evidente.
40
7. CONCLUSÃO
Nossas conclusões indicam uma resposta diferenciada entre linfonodos
subcutâneos, mesentéricos, cavidade peritoneal e baço de camundongos infectados por
T. cruzi. Com relação à expressão de TACI, BCMA, APRIL e BAFF, podemos sugerir
que BAFF, mais que APRIL, possivelmente é o principal ligante modulado na infecção
e a cavidade peritoneal apresentou variações mais evidentes de todas essas moléculas.
41
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abrahamsohn, I. A. e R. L. Coffman. Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN-gamma,
and IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. Exp Parasitol, v.84, n.2,
Nov, p.231-44. 1996.
Abbas, A. K., Lichtman, A. H. et al. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition -
International Edition. Elsevier, 2007.
Acosta Rodriguez, E. V., E. I. Zuniga, et al. Trypanosoma cruzi infection beats the B-
cell compartment favouring parasite establishment: can we strike first? Scand J
Immunol, v.66, n.2-3, Aug-Sep, p.137-42. 2007.
Aliberti, J. C., J. T. Souto, et al. Modulation of chemokine production and inflammatory
responses in interferon-gamma- and tumor necrosis factor-R1-deficient mice during
Trypanosoma cruzi infection. Am J Pathol, v.158, n.4, Apr, p.1433-40. 2001.
Aggarwal BB. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat
Rev Immunol. v. 3, n. 9, Sep; p. 745-56. 2003.
Almeida, I. C., S. R. Milani, et al. Complement-mediated lysis of Trypanosoma cruzi
trypomastigotes by human anti-alpha-galactosyl antibodies. J Immunol, v.146, n.7, Apr
1, p.2394-400. 1991.
Antunez, M. I., R. E. Feinstein, et al. Trypanosoma cruzi: T cell subpopulations in the
Peyer's patches of BALB/c infected mice. Exp Parasitol, v.87, n.1, Sep, p.58-64. 1997.
Barbosa De Oliveira, L. C., M. A. Curotto De Lafaille, et al. Antigen-specific Il-4- and
IL-10-secreting CD4+ lymphocytes increase in vivo susceptibility to Trypanosoma
cruzi infection. Cell Immunol, v.170, n.1, May 25, p.41-53. 1996.
Belnoue, E., M. Pihlgren, et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone
marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood, v.111,
n.5, Mar 1, p.2755-64. 2008.
42
Bermejo, D. A., M. C. Amezcua-Vesely, et al. BAFF mediates splenic B cell response
and antibody production in experimental Chagas disease. PLoS Negl Trop Dis, v.4, n.5,
p.e679. 2010.
Bilate, A. M. e E. Cunha-Neto. Chagas disease cardiomyopathy: current concepts of an
old disease. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, v.50, n.2, Mar-Apr, p.67-74. 2008.
Bilate, A. M., V. M. Salemi, et al. TNF blockade aggravates experimental chronic
Chagas disease cardiomyopathy. Microbes Infect, v.9, n.9, Jul, p.1104-13. 2007.
Boes, M., A. P. Prodeus, et al. A critical role of natural immunoglobulin M in
immediate defense against systemic bacterial infection. J Exp Med, v.188, n.12, Dec 21,
p.2381-6. 1998.
Buscaglia, C. A. e J. M. Di Noia. Trypanosoma cruzi clonal diversity and the
epidemiology of Chagas' disease. Microbes Infect, v.5, n.5, Apr, p.419-27. 2003.
Caraujo-Jorge, T., A. El Bouhdidi, et al. Trypanosoma cruzi infection in mice enhances
the membrane expression of low-affinity Fc receptors for IgG and the release of their
soluble forms. Parasite Immunol, v.15, n.9, Sep, p.539-46. 1993.
De Meis, J., L. M. Ferreira, et al. Apoptosis differentially regulates mesenteric and
subcutaneous lymph node immune responses to Trypanosoma cruzi. Eur J Immunol,
v.38, n.1, Jan, p.139-46. 2008.
De Meis, J., D. A. Mendes-Da-Cruz, et al. Atrophy of mesenteric lymph nodes in
experimental Chagas' disease: differential role of Fas/Fas-L and TNFRI/TNF pathways.
Microbes Infect, v.8, n.1, Jan, p.221-31. 2006.
De Meis, J., A. Morrot, et al. Differential regional immune response in Chagas disease.
PLoS Negl Trop Dis, v.3, n.7, p.e417. 2009.
43
Devera, R., O. Fernandes, et al. Should Trypanosoma cruzi be called "cruzi" complex?
a review of the parasite diversity and the potential of selecting population after in vitro
culturing and mice infection. Mem Inst Oswaldo Cruz, v.98, n.1, Jan, p.1-12. 2003.
Dias, J. C., E. M. Machado, et al. [General situation and perspectives of chagas disease
in Northeastern Region, Brazil]. Cad Saude Publica, v.16 Suppl 2, p.13-34. 2000.
Dias, J. P., C. Bastos, et al. Acute Chagas disease outbreak associated with oral
transmission. Rev Soc Bras Med Trop, v.41, n.3, May-Jun, p.296-300. 2008.
Dillon, S. R., J. A. Gross, et al. An APRIL to remember: novel TNF ligands as
therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov, v.5, n.3, Mar, p.235-46. 2006.
Dorn, P., P. Buekens, et al. Whac-a-mole: future trends in Chagas transmission and the
importance of a global perspective on disease control. Future Microbiol, v.2, Aug,
p.365-7. 2007.
Dorshkind, K. e E. Montecino-Rodriguez. Fetal B-cell lymphopoiesis and the
emergence of B-1-cell potential. Nat Rev Immunol, v.7, n.3, Mar, p.213-9. 2007.
El Bouhdidi, A., C. Truyens, et al. Trypanosoma cruzi infection in mice induces a
polyisotypic hypergammaglobulinaemia and parasite-specific response involving high
IgG2a concentrations and highly avid IgG1 antibodies. Parasite Immunol, v.16, n.2,
Feb, p.69-76. 1994.
Fu, Y. X. e D. D. Chaplin. Development and maturation of secondary lymphoid tissues.
Annu Rev Immunol, v.17, p.399-433. 1999.
Garcia, E. S. e P. Azambuja. Development and interactions of Trypanosoma cruzi
within the insect vector. Parasitol Today, v.7, n.9, Sep, p.240-4. 1991.
Gascon, J., P. Albajar, et al. [Diagnosis, management and treatment of chronic Chagas'
heart disease in areas where Trypanosoma cruzi infection is not endemic]. Rev Esp
Cardiol, v.60, n.3, Mar, p.285-93. 2007.
44
Gutierrez, F. R., P. M. Guedes, et al. The role of parasite persistence in pathogenesis of
Chagas heart disease. Parasite Immunol, v.31, n.11, Nov, p.673-85. 2009.
Hahne, M., T. Kataoka, et al. APRIL, a new ligand of the tumor necrosis factor family,
stimulates tumor cell growth. J Exp Med, v.188, n.6, Sep 21, p.1185-90. 1998.
Hardenberg, G., L. Fernandez, et al. APRIL facilitates viral-induced erythroleukemia
but is dispensable for T cell immunity and lymphomagenesis. J Leukoc Biol, v.84, n.2,
Aug, p.380-8. 2008.
Hardy, R. R. B-1 B cell development. J Immunol, v.177, n.5, Sep 1, p.2749-54. 2006.
Hatzoglou, A., J. Roussel, et al. TNF receptor family member BCMA (B cell
maturation) associates with TNF receptor-associated factor (TRAF) 1, TRAF2, and
TRAF3 and activates NF-kappa B, elk-1, c-Jun N-terminal kinase, and p38 mitogen-
activated protein kinase. J Immunol, v.165, n.3, Aug 1, p.1322-30. 2000.
He, B., A. Chadburn, et al. Lymphoma B cells evade apoptosis through the TNF family
members BAFF/BLyS and APRIL. J Immunol, v.172, n.5, Mar 1, p.3268-79. 2004.
He, B., W. Xu, et al. Intestinal bacteria trigger T cell-independent immunoglobulin A(2)
class switching by inducing epithelial-cell secretion of the cytokine APRIL. Immunity,
v.26, n.6, Jun, p.812-26. 2007.
Hehlgans, T. e K. Pfeffer. The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour
necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology, v.115,
n.1, May, p.1-20. 2005.
Hendriks, J., L. Planelles, et al. Heparan sulfate proteoglycan binding promotes APRIL-
induced tumor cell proliferation. Cell Death Differ, v.12, n.6, Jun, p.637-48. 2005.
Higuchi, M. L., Benvenuti, L.A., et al. Pathophysiology of the heart in Chagas' disease:
current status and new developments. Cardiovasc Res.; v.60, p.1, Oct, p. 96-107. 2003.
45
Holscher, C., M. Mohrs, et al. Tumor necrosis factor alpha-mediated toxic shock in
Trypanosoma cruzi-infected interleukin 10-deficient mice. Infect Immun, v.68, n.7, Jul,
p.4075-83. 2000.
Hotez, P. J. e M. T. Ferris. The antipoverty vaccines. Vaccine, v.24, n.31-32, Jul 26,
p.5787-99. 2006.
Hotez, P. J., D. H. Molyneux, et al. Neglected tropical diseases and HIV/AIDS. Lancet,
v.368, n.9550, Nov 25, p.1865-6. 2006.
Ingold, K., A. Zumsteg, et al. Identification of proteoglycans as the APRIL-specific
binding partners. J Exp Med, v.201, n.9, May 2, p.1375-83. 2005.
Janeway, C. A.; Travers, P., et al. Imunobiologia: o sistema imune na saúde e na
doença. 6. ed. – Porto Alegre. Artmed, 2007.
Kern, C., J. F. Cornuel, et al. Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to
apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway. Blood, v.103, n.2, Jan 15, p.679-88.
2004.
Kierszenbaum, F. e J. G. Howard. Mechanisms of resistance against experimental
Trypanosoma cruzi infection: the importance of antibodies and antibody-forming
capacity in the Biozzi high and low responder mice. J Immunol, v.116, n.5, May,
p.1208-11. 1976.
Kierszenbaum, F. e M. B. Sztein. Mechanisms underlying immunosuppression induced
by Trypanosoma cruzi. Parasitol Today, v.6, n.8, Aug, p.261-4. 1990.
Kimberley, F. C., M. Hahne, et al. "APRIL hath put a spring of youth in everything":
Relevance of APRIL for survival. J Cell Physiol, v.218, n.1, Jan, p.1-8. 2009a.
46
Kimberley, F. C., L. Van Bostelen, et al. The proteoglycan (heparan sulfate
proteoglycan) binding domain of APRIL serves as a platform for ligand multimerization
and cross-linking. FASEB J, v.23, n.5, May, p.1584-95. 2009b.
Kumar, S. e R. L. Tarleton. The relative contribution of antibody production and CD8+
T cell function to immune control of Trypanosoma cruzi. Parasite Immunol, v.20, n.5,
May, p.207-16. 1998.
______. Antigen-specific Th1 but not Th2 cells provide protection from lethal
Trypanosoma cruzi infection in mice. J Immunol, v.166, n.7, Apr 1, p.4596-603. 2001.
Lima-Martins, M. V., G. A. Sanchez, et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity
against Trypanosoma cruzi is only mediated by protective antibodies. Parasite Immunol,
v.7, n.4, Jul, p.367-76. 1985.
Lopez-Fraga, M., R. Fernandez, et al. Biologically active APRIL is secreted following
intracellular processing in the Golgi apparatus by furin convertase. EMBO Rep, v.2,
n.10, Oct, p.945-51. 2001.
Luppi, P., W. A. Rudert, et al. Idiopathic dilated cardiomyopathy: a superantigen-driven
autoimmune disease. Circulation, v.98, n.8, Aug 25, p.777-85. 1998.
Luster, A. D. The role of chemokines in linking innate and adaptive immunity. Curr
Opin Immunol, v.14, n.1, Feb, p.129-35. 2002.
Mackay, F. e H. Leung. The role of the BAFF/APRIL system on T cell function. Semin
Immunol, v.18, n.5, Oct, p.284-9. 2006.
Mackay, F. e P. Schneider. TACI, an enigmatic BAFF/APRIL receptor, with new
unappreciated biochemical and biological properties. Cytokine Growth Factor Rev,
v.19, n.3-4, Jun-Aug, p.263-76. 2008.
Mackay, F., P. Schneider, et al. BAFF AND APRIL: a tutorial on B cell survival. Annu
Rev Immunol, v.21, p.231-64. 2003.
47
Marcili, A., V. C. Valente, et al. Trypanosoma cruzi in Brazilian Amazonia: Lineages
TCI and TCIIa in wild primates, Rhodnius spp. and in humans with Chagas disease
associated with oral transmission. Int J Parasitol, v.39, n.5, Apr, p.615-23. 2009.
Marsters, S. A., M. Yan, et al. Interaction of the TNF homologues BLyS and APRIL
with the TNF receptor homologues BCMA and TACI. Curr Biol, v.10, n.13, Jun 29,
p.785-8. 2000.
Martins, G. A., L. Q. Vieira, et al. Gamma interferon modulates CD95 (Fas) and CD95
ligand (Fas-L) expression and nitric oxide-induced apoptosis during the acute phase of
Trypanosoma cruzi infection: a possible role in immune response control. Infect
Immun, v.67, n.8, Aug, p.3864-71. 1999.
Medema, J. P., L. Planelles-Carazo, et al. The uncertain glory of APRIL. Cell Death
Differ, v.10, n.10, Oct, p.1121-5. 2003.
Meneghelli, U. G., R. A. De Godoy, et al. Basal motility of dilated and non-dilated
sigmoid colon and rectum in Chagas' disease. Arq Gastroenterol, v.19, n.3, Jul-Sep,
p.127-32. 1982.
Mercolino, T. J., L. W. Arnold, et al. Normal mouse peritoneum contains a large
population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline. Relationship to
cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J Exp Med,
v.168, n.2, Aug 1, p.687-98. 1988.
Merino, M. C., C. L. Montes, et al. Peritoneum from Trypanosoma cruzi-infected mice
is a homing site of Syndecan-1 neg plasma cells which mainly provide non-parasite-
specific antibodies. Int Immunol, v.22, n.5, May, p.399-410. 2010.
Milei, J., R. A. Guerri-Guttenberg, et al. Prognostic impact of Chagas disease in the
United States. Am Heart J, v.157, n.1, Jan, p.22-9. 2009.
48
Minoprio, P. Parasite polyclonal activators: new targets for vaccination approaches? Int
J Parasitol, v.31, n.5-6, May 1, p.588-91. 2001.
Minoprio, P., A. Bandeira, et al. Preferential expansion of Ly-1 B and CD4- CD8- T
cells in the polyclonal lymphocyte responses to murine T. cruzi infection. Int Immunol,
v.1, n.2, p.176-84. 1989.
Minoprio, P., O. Burlen, et al. Most B cells in acute Trypanosoma cruzi infection lack
parasite specificity. Scand J Immunol, v.28, n.5, Nov, p.553-61. 1988.
Minoprio, P. M., A. Coutinho, et al. Polyclonal lymphocyte responses to murine
Trypanosoma cruzi infection. II. Cytotoxic T lymphocytes. Scand J Immunol, v.24, n.6,
Dec, p.669-79. 1986.
Minoprio, P. M., H. Eisen, et al. Polyclonal lymphocyte responses to murine
Trypanosoma cruzi infection. I. Quantitation of both T- and B-cell responses. Scand J
Immunol, v.24, n.6, Dec, p.661-8. 1986.
Molloy, S. S., E. D. Anderson, et al. Bi-cycling the furin pathway: from TGN
localization to pathogen activation and embryogenesis. Trends Cell Biol, v.9, n.1, Jan,
p.28-35. 1999.
Mota, I. e L. F. Umekita. The effect of C3 depletion on the clearance of Trypanosoma
cruzi induced by IgG antibodies. Immunol Lett, v.21, n.3, Jun 1, p.223-5. 1989.
Mukhopadhyay, A., J. Ni, et al. Identification and characterization of a novel cytokine,
THANK, a TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-kappaB, and c-Jun
NH2-terminal kinase. J Biol Chem, v.274, n.23, Jun 4, p.15978-81. 1999.
Nobrega, A. A., M. H. Garcia, et al. Oral transmission of Chagas disease by
consumption of acai palm fruit, Brazil. Emerg Infect Dis, v.15, n.4, Apr, p.653-5. 2009.
O'garra, A., R. Chang, et al. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell-derived
interleukin 10. Eur J Immunol, v.22, n.3, Mar, p.711-7. 1992.
49
Planelles, L., C. E. Carvalho-Pinto, et al. APRIL promotes B-1 cell-associated
neoplasm. Cancer Cell, v.6, n.4, Oct, p.399-408. 2004.
Prata, A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet Infect Dis, v.1,
n.2, Sep, p.92-100. 2001.
Punukollu, G., R. M. Gowda, et al. Clinical aspects of the Chagas' heart disease. Int J
Cardiol, v.115, n.3, Feb 14, p.279-83. 2007.
Ray, A. e B. N. Dittel. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp, n.35.
Rennert, P., P. Schneider, et al. A soluble form of B cell maturation antigen, a receptor
for the tumor necrosis factor family member APRIL, inhibits tumor cell growth. J Exp
Med, v.192, n.11, Dec 4, p.1677-84. 2000.
Rey, Luís. Bases Da Parasitologia Médica. 2ª ed. Guanabara Koogan. 2002.
Roggero, E., A. Perez, et al. Differential susceptibility to acute Trypanosoma cruzi
infection in BALB/c and C57BL/6 mice is not associated with a distinct parasite load
but cytokine abnormalities. Clin Exp Immunol, v.128, n.3, Jun, p.421-8. 2002.
Salzer, U., S. Jennings, et al. To switch or not to switch--the opposing roles of TACI in
terminal B cell differentiation. Eur J Immunol, v.37, n.1, Jan, p.17-20. 2007.
Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog,
v.2, n.6, Jun, p.e62. 2006.
Savino, W., M. C. Leite-De-Moraes, et al. Studies on the thymus in Chagas' disease. I.
Changes in the thymic microenvironment in mice acutely infected with Trypanosoma
cruzi. Eur J Immunol, v.19, n.9, Sep, p.1727-33. 1989.
50
Savino, W., D. M. Villa-Verde, et al. Cytokines and cell adhesion receptors in the
regulation of immunity to Trypanosoma cruzi. Cytokine Growth Factor Rev, v.18, n.1-
2, Feb-Apr, p.107-24. 2007.
Scott, M. T. e L. Moyes. 75Se-methionine labelled Trypanosoma cruzi blood
trypomastigotes: opsonization by chronic infection serum facilitates killing in spleen
and liver. Clin Exp Immunol, v.48, n.3, Jun, p.754-7. 1982.
Silva, J. S., G. N. Vespa, et al. Tumor necrosis factor alpha mediates resistance to
Trypanosoma cruzi infection in mice by inducing nitric oxide production in infected
gamma interferon-activated macrophages. Infect Immun, v.63, n.12, Dec, p.4862-7.
1995.
Smith, C.A., Farrah, T. et al. The TNF receptor superfamily of cellular and viral
proteins: activation, costimulation, and death. Cell. v. 76, n6, Mar, p. 959-62. 1994.
Spinella, S., P. Liegeard, et al. Trypanosoma cruzi: predominance of IgG2a in
nonspecific humoral response during experimental Chagas' disease. Exp Parasitol, v.74,
n.1, Feb, p.46-56. 1992.
Stein, J. V., M. Lopez-Fraga, et al. APRIL modulates B and T cell immunity. J Clin
Invest, v.109, n.12, Jun, p.1587-98. 2002.
Tanowitz, H. B., J. P. Gumprecht, et al. Cytokine gene expression of endothelial cells
infected with Trypanosoma cruzi. J Infect Dis, v.166, n.3, Sep, p.598-603. 1992.
Tarleton, R. L. Trypanosoma cruzi-induced suppression of IL-2 production. I. Evidence
for the presence of IL-2-producing cells. J Immunol, v.140, n.8, Apr 15, p.2763-8.
1988a.
______. Trypanosoma cruzi-induced suppression of IL-2 production. II. Evidence for a
role for suppressor cells. J Immunol, v.140, n.8, Apr 15, p.2769-73. 1988b.
51
______. Immune system recognition of Trypanosoma cruzi. Curr Opin Immunol, v.19,
n.4, Aug, p.430-4. 2007.
Tarleton, R. L., R. Reithinger, et al. The challenges of Chagas Disease-- grim outlook or
glimmer of hope. PLoS Med, v.4, n.12, Dec, p.e332. 2007.
Teixeira, A. R., N. Nitz, et al. Chagas disease. Postgrad Med J, v.82, n.974, Dec, p.788-
98. 2006.
Thompson, J. S., S. A. Bixler, et al. BAFF-R, a newly identified TNF receptor that
specifically interacts with BAFF. Science, v.293, n.5537, Sep 14, p.2108-11. 2001.
Valente, V. Potential for domestication of Panstrongylus geniculatus (Latreille, 1811)
(Liemiptera, reduviidae, triatominae) in the municipality of Muana, Marajo island, state
of Para, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, v.94 Suppl 1, p.399-400. 1999.
Van Der Valk, P. e C. J. Meijer. The histology of reactive lymph nodes. Am J Surg
Pathol, v.11, n.11, Nov, p.866-82. 1987.
Van Eijk, M., J. P. Medema, et al. Cutting edge: cellular Fas-associated death domain-
like IL-1-converting enzyme-inhibitory protein protects germinal center B cells from
apoptosis during germinal center reactions. J Immunol, v.166, n.11, Jun 1, p.6473-6.
2001.
Vitelli-Avelar, D. M., R. Sathler-Avelar, et al. Are increased frequency of macrophage-
like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and CD4+CD25high
T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease morbidity?
Clin Exp Immunol, v.145, n.1, Jul, p.81-92. 2006.
Von Bulow, G. U. e R. J. Bram. NF-AT activation induced by a CAML-interacting
member of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Science, v.278, n.5335, Oct
3, p.138-41. 1997.
52
Waghabi, M. C., M. Keramidas, et al. SB-431542, a transforming growth factor beta
inhibitor, impairs Trypanosoma cruzi infection in cardiomyocytes and parasite cycle
completion. Antimicrob Agents Chemother, v.51, n.8, Aug, p.2905-10. 2007.
Xia, X. Z., J. Treanor, et al. TACI is a TRAF-interacting receptor for TALL-1, a tumor
necrosis factor family member involved in B cell regulation. J Exp Med, v.192, n.1, Jul
3, p.137-43. 2000.
Yang, M., H. Hase, et al. B cell maturation antigen, the receptor for a proliferation-
inducing ligand and B cell-activating factor of the TNF family, induces antigen
presentation in B cells. J Immunol, v.175, n.5, Sep 1, p.2814-24. 2005.
Yu, G., T. Boone, et al. APRIL and TALL-I and receptors BCMA and TACI: system
for regulating humoral immunity. Nat Immunol, v.1, n.3, Sep, p.252-6. 2000.
Zhang, X., R. Goncalves, et al. The isolation and characterization of murine
macrophages. Curr Protoc Immunol, v.Chapter 14, Nov, p.Unit 14 1. 2008.
![(Présentation Altivar 32 [Mode de compatibilité]) - RPMI](https://static.fdocument.pub/doc/165x107/586e15f51a28ab3f0a8c4652/presentation-altivar-32-mode-de-compatibilite-rpmi.jpg)
