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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
REGIONAL JATAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE UMA HIDRAZONA E SEUS COMPLEXOS METÁLICOS
JÉSSIKA VIEIRA DOS REIS
JATAÍ – GO
JUL/2018
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JÉSSIKA VIEIRA DOS REIS
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE UMA HIDRAZONA E SEUS COMPLEXOS METÁLICOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde
da Universidade Federal de Goiás como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientador: Dr. Sauli dos Santos Júnior
JATAÍ – GO
JUL/2018
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que me ouviu, me reconfortou e me deu forças para chegar
onde agora estou.
À minha família, minha eterna gratidão. Mãe, seu cuidado е dedicação me deram а
esperança para seguir. Pai, sua presença significou segurança е certeza de que não estou sozinha
nessa caminhada. Irmã, sua paciência e companheirismo foram essenciais em mais esta jornada.
Agradeço ao meu noivo que sempre esteve ao meu lado desde o início desta jornada,
aguentando minhas crises de choro, meu estresse e por sempre acreditar em mim e por agora estar
compartilhando a alegria de ter chegado até onde estou.
A todos os meus familiares, avós, padrinhos, madrinhas, tios, tias e primos, que mesmo de
longe sempre me incentivaram e acreditaram mim.
Ao meu orientador Dr. Sauli dos Santos Junior por seus conhecimentos a mim transmitidos
e por estar sempre disposto a me ajudar em meio a tantos afazeres. Sou imensamente grata pela sua
contribuição tanto profissional quanto pessoal. Obrigada pela sua amizade ao longo desta
caminhada.
Ao professor Dr. Alexandre Braoios pela disponibilização das cepas ATCC e de seu espaço
no Laboratório de Bacteriologia e Micologia para a realização de parte dos experimentos.
Ao professor Dr. Ricardo de Mattos Santa Rita pela ajuda nas etapas dos testes biológicos.
Obrigada pelo apoio e dedicação.
À Karina, que tanto me ajudou nos experimentos e sempre me fazendo companhia no
laboratório e congressos.
À todos os meus colegas de pós-graduação que fizeram parte desta etapa tão importante em
minha vida. Um agradecimento especial aos meus amigos Thaynara, Laura, Camila, Vanessa e
Divaloyanne, obrigada pela amizade e companheirismo.
Aos colegas do Laboratório de Desenvolvimento de Novos Fármacos, Tracy, Taric e Isadora
pela ajuda e companhia.
À todos vocês, meu muito obrigada!
vii
“Desde o início dos tempos, o homem pressentia
que havia nele algo especial... algo a mais. Ele
ansiava por poderes que não possuía. Havia
sonhado em voar, em curar e em transformar seu
mundo de todas as formas possíveis.
E foi exatamente isso que fez.”
Dan Brown
viii
RESUMO
Com o crescente aumento da resistência de microrganismos aos fármacos disponíveis,
principalmente em ambiente hospitalar, as indústrias farmacêuticas têm concentrado esforços
na pesquisa de novos fármacos. Diversas classes de compostos orgânicos despertam o interesse
de pesquisadores devido à versatilidade de suas estruturas moleculares e seus efeitos biológicos
alcançados. As hidrazonas pertencem a uma classe importante pois apresentam um amplo perfil
farmacológico cujas propriedades têm sido extensivamente estudadas na Química Medicinal
em razão de sua capacidade quelante e do papel da coordenação no seu mecanismo bioquímico
de ação. Neste trabalho foi sintetizado um ligante químico denominado J3 o qual foi
complexado com Nitrato de Cobre (II), Nitrato de Níquel, Nitrato de Cádmio, Perclorato de
Cobalto e Dicloreto de difenilestanho, sendo denominados de: J3Cu, J3Ni, J3Cd, J3Co e J3Sn,
respectivamente. A partir da formação dos cristais, os mesmos foram submetidos a análises
espectroscópicas de difração de raios x em monocristal e espectroscopia na região do
infravermelho, que confirmaram as estruturas químicas obtidas do ligante e seus complexos.
Foi avaliada a atividade biológica dos seis compostos sintetizados através do método de
microdiluição em placas de 96 poços, e a determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) foi determinada através da medida de densidade em leitor de ELISA após incubações de
24, 48, 72 e 96 horas em bactérias das espécies Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Foi
determinada a concentração bactericida mínima para os compostos que apresentaram CIM
contra as bactérias testadas. Os compostos J3Cu, J3Cd e J3Sn apresentaram atividade moderada
para as bactérias testadas, ao passo que o ligante J3 e seus complexos J3Co e J3Ni não inibiram
100% dos microrganismos nas concentrações testadas. Através dos testes de determinação da
concentração bactericida mínima, concluiu-se que os complexos J3Sn e J3Cd apresentaram
atividade bacteriostática e bactericida, o complexo J3Cu apresentou atividade bacteriostática.
Palavras-chave: Hidrazonas, Difração de raios X em monocristal, Complexos metálicos, E.
coli, S. aureus.
ix
ABSTRACT
With the increasing resistance of microrganisms to available drugs, mainly in hospital
environments, the pharmaceutical industries have concentrated efforts in the research of new
versatility of their molecular structures and their biological effects achieved. The hydrazones
belong to an important class as they present a broad pharmacological profile whose properties
have been extensively studied in medicinal chemistry because of their chelating capacity and
the role of coordination in their biochemical mechanism of action. In this work a chemical
ligand called J3 was synthesized which was complexed with copper nitrate (II), nickel nitrate,
cadmium nitrate, cobalt perchlorate and diphenyltin dichloride, being called: J3Cu, J3Ni, J3Cd,
J3Co and J3Sn, respectively. From the formation of the crystals, they were subjected to
spectroscopic analysis of single crystal X-ray diffraction and infrared spectroscopy, which
confirmed the chemical structures obtained from the ligand and its complexes. The biological
activity of the six synthesized compounds was evaluated through the microdilution method on
96 wells plates, and the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) was
determined by the density measurement in ELISA reader after incubations of 24, 48, 72 and 96
hours in bacteria of the species Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The J3Cu, J3Cd
and J3Sn compounds presented moderate activity for the tested bacteria, whereas the J3 ligand
and its J3Co and J3Ni complexes did not inhibit 100% of the microrganisms in the tested
concentrations. Through the tests of determination of the minimum bactericidal concentration
(MBC), it was concluded that the complexes J3Sn and J3Cd presented bacteriostatic and
bactericidal activity and J3Cu complex presented activity bacteriostatic.
Keywords: Hydrazones, single crystal X-ray diffraction, metallic complexes, E. coli, S.
aureus.
x
LISTA DE SIGLAS
ATCC American Type Culture Collection (Coleção de tipo de cultura
americana)
BHI Brain Heart Infusion (Infusão Cérebro e Coração)
CBM Concentração Bactericida Mínima
CIM Concentração Inibitória Mínima
DMSO Dimetilsulfóxido
E. coli Escherichia coli
EAEC Escherichia coli enteroagregativa
EHEC Escherichia coli enterohemorágica
EIEC Escherichia coli enteroinvasora
EPEC Escherichia coli enteropatogênica
ESBL Beta-lactamase de Espectro Estendido
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica
ExPEC Escherichia coli patogênica extraintestinal
FAR Far Infrared (Infravermelho Distante)
FT/IR Fourier Transform/Infrared Spectrometrer (Espectrofotômetro de
Infravermelho por Transformada de Fourier)
GLASS Global Antimicrobial Resistance Surveillance System (Sistema global
de vigilância de resistência antibacteriana)
IPCS Infecções primárias de Corrente Sanguínea
ITU Infecção do Trato Urinário
J3 N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida
J3Cd Complexo de N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida com
Cádmio
J3Co Complexo de N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida com
Cobalto
J3Cu Cobre(ii)-catena-[(μ2-tiocianato)-(nitrato-o)-(n’-(1-(piridina-2-yl)
etilideno)acetohidrazida)
J3Ni Bis (n’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida)-níquel
J3Sn Complexo de N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida com
Estanho
xi
K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae
KBr Brometo de Potássio
LPS Lipopolissacarídeo
MID Middle Infrared (Infravermelho Médio)
MRSA Staphylococcus aureus Meticilina Resistente
MβLs Metalo-β-lactamases
NIR Near Infrared (Infravermelho Próximo)
S. aureus Staphylococcus aureus
SCoN Staphylococcus Coagulase Negativa
UFC Unidades Formadoras de Colônia
UPEC E. coli uropatogênica
UTI Unidade de Terapia Intensiva
WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Principais formas das bactérias 01
Figura 2 Diferenças na composição da parece celular de bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas
02
Figura 3 Estrutura química geral das hidrazonas 07
Figura 4 Reação geral da formação de hidrazonas 07
Figura 5 Esquema da lei de Bragg 09
Figura 6 Rota de síntese para obtenção da hidrazona a partir da reação de 2-
acetilpiridina e acetil hidrazida, formando o composto N’-(1-(piridina-2-
yl)etilideno)acetohidrazida (J3)
13
Figura 7 Rota de síntese para obtenção de complexo metálico a partir da reação de J3
com Nitrato de cobre (II) tri-hidratado e tiocianato de sódio formando
Cobre(II)-catena-[(μ2-tiocianato)-(nitrato-O)-(N’-(1-(piridina-2-yl)etiliden
o)acetohidrazida) (J3Cu)
14
Figura 8 Rota de síntese para obtenção de complexo metálico a partir da reação de J3
com Nitrato de níquel hexa-hidratado formando Bis (N’-(1-(piridina-2-
yl)etilideno)acetohidrazida)-níquel (J3Ni).
15
Figura 9 Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3
com perclorato de cobalto e tiocianato de sódio formando o complexo J3Co
16
Figura 10 Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3
com nitrato de cádmio e tiocianato de sódio formando J3Cd
17
Figura 11 Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3
com dicloreto de difenilestanho, trietilamina e trietilamina formando J3Sn
18
Figura 12 Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 em pastilha
de brometo de potássio (KBr). ν(N-H): 3193 cm-1; ν (C=O): 1677 cm-1; ν
(C=N): 1617 cm-1; ν (C=N)py: 625 cm-1
22
Figura 13 Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu
complexo com Cobre II (J3Cu) em pastilha de brometo de potássio (KBr).
J3Cu: ν(N-H): 3100 cm-1; ν(-N=C=S): 2108 cm-1; ν(C=O): 1611 cm-1;
ν(C=N): 1544 cm-1; ν(C=N)py: 572 cm-1
23
Figura 14 Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu
complexo com Níquel (J3Ni) em pastilha de brometo de potássio (KBr).
24
xiii
J3Ni: ν(N-H): 3064 cm-1; ν (-N=C=S): 2118 cm-1; ν (C=O): 1640 cm-1; ν
(C=N): 1607 cm-1; ν (C=N)py: 575 cm-1
Figura 15 Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu
complexo com Cádmio J3Cd em pastilha de brometo de potássio (KBr).
J3Cd: ν(N-H): 3195 cm-1; ν (N=C=S): 2109 cm-1; ν (C=O): 1640 cm-1; ν
(C=N): 1592 cm-1; ν (C=N)py: 596 cm-1
25
Figura 16 Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu
complexo com Cobalto J3Co em pastilha de brometo de potássio (KBr).
J3Co: ν(N-H): 3095 cm-1; ν (N=C=S): 2052 cm-1; ν (C=O): 1603 cm-1; ν
(C=N): 1559 cm-1; ν (C=N)py: 528 cm-1
26
Figura 17 Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu
complexo com Estanho J3Sn em pastilha de brometo de potássio (KBr).
J3Co: ν(N-H): 3194 cm-1; ν (C=O): 1674 cm-1; ν (C=N): 1595 cm-1; ν
(C=N)py: 576 cm-1
27
Figura 18 Diagrama ORTEP do ligante J3 28
Figura 19 Diagrama ORTEP do complexo J3Cu 29
Figura 20 Diagrama ORTEP do complexo J3Ni 29
Figura 21 Atividade de J3 sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas.
30
Figura 22 Ensaio referente a CBM do ligante J3 frente a E. coli (A): Controle 72h para
E. coli em ágar MacConkey; (B): 1000μg/mL de J3 após 72h para E. coli em
ágar MacConkey
32
Figura 23 Atividade de J3Cu sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas
34
Figura 24 Ensaio referente a CBM do complexo J3Cu frente a E. coli e S. aureus. (A):
Controle 72h para E. coli em ágar MacConkey; (B): 1000μg/mL de J3Cu
após 72h para E. coli em ágar MacConkey
35
Figura 25 Ensaio referente a CBM do complexo J3Cu frente a S. aureus. (A): Controle
24h para S. aureus em ágar Manitol; (B) 1000μg/mL de J3Cu após 24h para
S. aureus em ágar Manitol; (C): Controle 72h para S. aureus em ágar
Manitol; (D) 1000μg/mL de J3Cu após 72h para S. aureus em ágar Manitol
36
Figura 26 Atividade de J3Cd sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas
38
xiv
Figura 27 Ensaio referente a CBM do complexo J3Cd frente a E. coli. (A): Controle
24h em ágar MacConkey; (B): 250μg/mL de J3Cd após 24h em ágar
MacConkey; (C): Controle 72h em ágar MacConkey; (D) 250μg/mL de J3Cd
após 72h em ágar MacConkey
39
Figura 28 Ensaio referente a CBM do complexo J3Cd frente a S. aureus. (A): Controle
24h em ágar Manitol; (B): 1000μg/mL de J3Cd após 24h em ágar Manitol;
(C): Controle 72h em ágar Manitol; (D) 1000μg/mL de J3Cd após 72h em
ágar Manitol
39
Figura 29 Atividade de J3Sn sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas
41
Figura 30 Ensaio referente a CBM do complexo J3Sn frente a E. coli. (A): Controle
24h em ágar MacConkey; (B): 125μg/mL de J3Sn após 24h em ágar
MacConkey; (C): Controle 72h em ágar MacConkey; (D) 125μg/mL de J3Sn
após 72h em ágar MacConkey
42
Figura 31 Ensaio referente a CBM do complexo J3Sn frente a S.aureus. (A): Controle
24h em ágar Manitol; (B): 250μg/mL de J3Sn após 24h em ágar Manitol;
(C): Controle 72h em ágar Manitol; (D) 250μg/mL de J3Sn após 72h em ágar
Manitol
43
Figura 32 Atividade de J3Ni sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas
44
Figura 33 Atividade de J3Co sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação
de 24, 48,72 e 96 horas
45
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Bandas nos espectros de infravermelho (cm-1) do composto J3 e seus
complexos com Cobre (II) e Níquel
27
Tabela 2 Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do ligante J3 para as bactérias S. aureus
e E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação
30
Tabela 3 Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Cu para as bactérias S.
aureus e E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação
33
Tabela 4 Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Cd para as bactérias S.
aureus e E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação
36
Tabela 5 Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Sn para as bactérias S.
aureus e E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação
40
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 01
1.1 BACTÉRIAS DE INTERESSE MÉDICO 01
1.2 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA 02
1.3 TIPOS DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS 03
1.4 Escherichia coli 04
1.5 Staphylococcus aureus 05
1.6 HIDRAZONAS 06
1.7 COMPLEXOS METÁLICOS 06
1.8 DIFRAÇÃO DE RAIOS X 08
1.9 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO 09
2 JUSTIFICATIVA 11
3 OBJETIVOS 12
3.1 OBJETIVO GERAL 12
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12
4 MATERIAL E MÉTODOS 13
4.1 SÍNTESE DOS COMPOSTOS 13
4.1.1 N’-(1-(Piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida (J3) 13
4.1.2 Complexação De Cobre(II)-Catena-[(μ2-Tiocianato)-(Nitrato-O)-(N’-(1-
(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida) (J3Cu)
14
4.1.3 Complexação de Bis (n’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida)-Níquel
(J3Ni)
15
4.1.4 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Cobalto (J3Co) 16
4.1.5 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Cádmio (J3Cd) 16
4.1.6 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Estanho (J3Sn) 17
4.2 CARACTERIZAÇÕES ESPECTROSCÓPICAS E ESTRUTURAIS 18
4.2.1 Espectroscopia Na Região Do Infravermelho 18
4.2.3 Difração De Raios X 19
4.3 DILUIÇÃO DOS COMPOSTOS 19
4.4 OBTENÇÃO DAS CEPAS 19
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA 19
4.5.1 Padronização Da Suspensão Bacteriana
19
4.5.2 Avaliação Da Atividade Antibacteriana Por Método De Microdiluição 20
4.5.3 Determinação Da Concentração Inibitória Mínima (CIM) Do Ligante E Seus
Complexos Frente Às Bactérias Testadas
20
4.5.4 Determinação Da Concentração Bactericida Mínima (CBM) 20
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 22
5.1 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO 22
5.2 DIFRAÇÃO DE RAIOS X 28
5.2.1 Caracterização Estrutural Do Ligante n’-(1-(piridina-2-
yl)etilideno)acetohidrazida (J3)
28
5.2.2 Caracterização Estrutural Do Complexo Cobre(II)-Catena-[(μ2-tiocianato)-
(nitrato-o)-(n’-(1-(piridina-2-yl) etilideno)acetohidrazida) (J3Cu)
29
5.2.3 Caracterização Estrutural Do Complexo Bis (n’-(1-(piridina-2-
yl)etilideno)acetohidrazida)-níquel (J3Ni)
29
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA 30
5.3.1 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima para o
Ligante J3
30
5.3.2 Concentração Mínima Inibitória e Concentração Bactericida Mínima para o
Complexo J3Cu
33
5.3.3 Concentração Mínima Inibitória e Concentração Bactericida Mínima para o
complexo J3Cd
36
5.3.4 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima Para o
Complexo J3Sn
40
5.3.5 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima para os
Complexos J3Co e J3Ni
43
6 CONCLUSÕES 46
ANEXO A - Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para
a Hidrazona J3
48
ANEXO B - Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para
o Complexo J3Cu
49
ANEXO C - Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para
o Complexo J3Ni
50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 BACTÉRIAS DE INTERESSE MÉDICO
Os microrganismos presentes na microbiota humana podem existir como: mutualistas,
comensais e oportunistas. Os microrganismos mutualistas protegem o hospedeiro competindo
por microambientes de forma mais eficiente que patógenos comuns, produzindo nutrientes
importantes e contribuindo para o desenvolvimento do sistema imunológico. Os
microrganismos comensais, por sua vez, mantêm associações aparentemente neutras sem
benefícios ou malefícios detectáveis. Já os microrganismos oportunistas, causam doenças em
indivíduos que se encontram com o sistema imunológico comprometido, como a infecção
pelo vírus da imunodeficiência humana, terapia imunossupressora de transplantados,
radioterapia, quimioterapia anticâncer, queimaduras extensas ou qualquer tratamento ou fato
que suprima o sistema imunológico (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
As bactérias de interesse médico podem ser observadas ao microscópio óptico em
formas esféricas, que são comumente denominadas de cocos; forma cilíndrica que é conhecida
como bacilo; cocobacilo, que tem estrutura intermediária entre coco e bacilo; vibrião, que
possuem forma de vírgula; ou ainda em formato espiral, denominados de espirilo, ou
espiroquetas (mais flexíveis) representados na figura 1 (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
Figura 1 – Principais formas das bactérias.
Fonte: TRABULSI; ALTERTHUM, 2008.
Uma vez que os microrganismos são transparentes, é necessário o uso de técnicas de
coloração para a visualização de suas estruturas em microscópio óptico. A técnica mais
empregada é a coloração de gram, que classifica as bactérias em dois grandes grupos: Gram-
2
positivas e Gram-negativas. As bactérias Gram-positivas possuem uma parede celular mais
simples, porém mais espessa, composta principalmente de peptidoglicano, cerca de 70% de sua
composição, onde as bactérias pertencentes a este grupo são observadas no microscópio óptico
na cor violeta. Por outro lado, a parede bacteriana das Gram-negativas possui somente cerca de
5% de peptidoglicano e possuem uma membrana externa à esta camada. São observadas ao
microscópio óptico na cor rósea (figura 2) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
Figura 2 – Diferenças na composição da parece celular de bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas.
Fonte: Disponível em: <https://i.ytimg.com/vi/Y_qUeQMcH9I/maxresdefault.jpg> Acesso em: 12 jul. 2018
Dentre os microrganismos de interesse médico, dois grandes grupos podem classifica-
los em relação ao seu potencial patogênico: os microrganismos patogênicos e os oportunistas.
A patogenicidade é definida como a capacidade que um microrganismo tem de causar doença.
Os microrganismos patogênicos se distinguem de outros da mesma espécie pelo fato de
possuírem e expressarem genes que codificam fatores de virulência, isto é, fatores que
propiciam a colonização e ocorrência de diversos eventos que subvertem a fisiologia
hospedeira, ocasionando o aparecimento de sinais e sintomas anormais, que irão, finalmente,
definir o estado de doença (VIEIRA, 2009). Já os microrganismos oportunistas ocasionam um
quadro infeccioso quando ocorrem falhas ou supressão no sistema imunológico do hospedeiro.
1.2 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
3
O desenvolvimento de antibióticos proporcionou grandes melhorias para a saúde
pública. No entanto, observou-se que as bactérias foram se tornando resistentes aos tratamentos
realizados com estes medicamentos. Este problema foi amenizado durante algumas décadas,
devido a constante introdução de novos antibióticos. Entretanto, o aumento do número de
microrganismos resistentes tem sido maior que a introdução de novas alternativas terapêuticas
(MARTINEZ, 2014).
De acordo com a primeira divulgação de dados do novo sistema global de vigilância de
resistência antimicrobiana da organização mundial da saúde (GLASS - WHO), observa-se uma
ocorrência generalizada de resistência a antibióticos em 22 dos 45 países que disponibilizaram
os dados referentes ao ano de 2016. As bactérias resistentes mais comuns relatadas em infecções
sanguíneas foram: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Acinetobacter spp. e Streptococcus pneumoniae. Foi observada resistência nas espécies
Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae tanto em infecções sanguíneas como urinárias em 18
países. Microrganismos como E. coli, K. pneumoniae, Acinetobacter spp. e S. aureus
apresentaram perfis de múltipla resistência em diferentes países (WHO, 2018).
De acordo com o Boletim de Segurança do Paciente e Qualidade em Serviços de Saúde
nº 16, das 16.949 notificações de identificações de microrganismos causadores das infecções
primárias de corrente sanguíneas (IPCS) em Unidade de Terapia Intensiva (UTI) adulto, os
microrganismos mais frequentemente isolados foram: Staphylococcus Coagulase Negativo
(SCoN) (18,9%; n=3.211), seguido de Klebsiella Pneumoniae (18,2%; n=3.085),
Staphylococcus aureus (14,1%; n=2.390), Acinetobacter spp. (12,6%; n=2.129) e
Pseudomonas aeruginosa (8,5%; n=1.447). Essa frequência de distribuição varia dependendo
da região, sendo alguns microrganismos mais frequentes em uma região que em outra
(BRASIL, 2017).
Quanto ao perfil fenotípico dos microrganismos em UTIs adulto, entre os cocos Gram
positivos, a resistência à oxacilina foi observada em 78,7% das amostras de SCoN e 63,1% das
amostras de S. aureus e a resistência à vancomicina foi observada em 25,8% dos Enterococcus
spp. Nos bacilos Gram-negativos, a resistência aos carbapenêmicos foi reportada em 85% dos
Acinetobacter spp. e 42,9% de Pseudomonas aeruginosa. Nos Gram negativos pertencentes à
família Enterobacteriaceae, as taxas de resistência aos carbapenêmicos e às cefalosporinas de
amplo espectro (terceira e/ou quarta gerações) foi de 9,9% para Escherichia coli, 46,8% para
Klebsiella Pneumoniae (BRASIL, 2017).
1.3 TIPOS DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS
4
A resistência antimicrobiana pode ser vista como uma equação com dois componentes
principais: o antibiótico ou antimicrobiano, que inibe organismos suscetíveis e seleciona os
resistentes; e a determinante da resistência genética (LEVY; MARSHALL, 2004).
Existem três tipos principais de resistência a antimicrobianos: resistência intrínseca,
resistência adquirida e resistência adaptativa. A resistência intrínseca compreende todas as
propriedades inerentes a determinado microrganismo que limitam a ação dos antimicrobianos.
Neste caso, todas as cepas daquela espécie serão igualmente resistentes. Na resistência
adquirida, microrganismos primariamente resistentes podem adquirir resistência pela
incorporação de materiais genéticos de microrganismos resistentes através de plasmídeos ou
mutações genéticas. Na resistência adaptativa ocorre alteração genética do microrganismo
como resultado da exposição a uma determinada condição, como níveis sub-inibitórios de um
antimicrobiano (OLIVEIRA; SILVA 2008; PEREIRA, 2014).
As resistências adquirida e adaptativa são de fato as mais preocupantes, já que
microrganismos inicialmente susceptíveis podem tornar-se resistentes a um ou mais agente
antimicrobiano, principalmente em ambiente hospitalar, diminuindo a possibilidade de
tratamento de determinada infecção.
1.4 Escherichia coli
Escherichia coli é um bacilo gram-negativo, pertencente à família Enterobacteriaceae,
não esporulado, a maioria é móvel, devido a existência de flagelos. A temperatura ótima de
crescimento é por volta dos 37 ºC. Escherichia coli, de maneira geral, aparece como um
microrganismo comensal, no entanto, frequentemente causam infecções extra intestinais.
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2008; DA SILVA; MENDONCA, 2012).
Escherichia coli de interesse médico podem ser classificadas por critérios clínicos e
genéticos em três grupos principais: comensal, patogênica (entéricas ou diarreiogênicas) e
patogênica extra intestinal (ExPEC).
Os patógenos intestinais induzem gastroenterite quando o hospedeiro ingere alimento
ou água contaminados, transmissão via fecal-oral. Eles possuem diversos mecanismos de
patogenicidade de acordo com os seus genes de virulência, que eles adquirem principalmente
através da transferência de plasmídeos mantidos estáveis na célula hospedeira ou por fagos. Os
patotipos diarreiogênicos típicos incluem: E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli
enteroinvasora (EIEC), E. coli enterohemorágica (EHEC), E. coli enteropatogênica (EPEC) e
E. coli enteroagregativa (EAEC) (DA SILVA; MENDONCA, 2012).
5
As infecções extra intestinais por E. coli são frequentemente associadas a infecções em
indivíduos hospitalizados. E. coli é capaz de causar infecção em quase todos os órgãos. No
entanto, o trato urinário é o local extra intestinal mais frequente, causando 85-95% dos casos
de cistite e pielonefrite não complicadas em mulheres pré-menopáusicas sendo o patotipo
UPEC (E. coli uropatogênica), o mais prevalente nestes casos (DA SILVA; MENDONCA,
2012).
O seu principal mecanismo de resistência, assim como para todos os membros da família
Enterobacteriaceae, é a produção de enzimas que conferem resistência aos antibióticos β-
lactâmicos, como as chamadas β-lactamases de espectro estendido (ESBL), que conferem
resistência às penicilinas, cefalosporinas de terceira geração e monobactâmicos (DA SILVA;
MENDONCA, 2012). A resistência às fluoroquinolonas, comumente utilizadas no tratamento
de ITU se dá principalmente por alterações nas enzimas alvo ou mudanças na expressão de
porinas ou através das bombas de efluxo, prejudicando a chegada do antibiótico ao seu alvo
(PATERSON, 2006 ; DA SILVA; MENDONCA, 2012). Resistência aos carbapenêmicos em
E. coli era mais rara e geralmente estava associada a produção de β-lactamase com a diminuição
da expressão dos canais de porinas (PATERSON, 2006), no entanto, em 2010 foi publicado o
primeiro relato de E. coli produtora de carbapenemase no Brasil (CARVALHO-ASSEF et al.,
2010).
1.5 Staphylococcus aureus
Microrganismos do gênero Staphylococcus são cocos gram-positivos, imóveis, não
formadores de esporos, que dão origem a células arredondadas. Quando observados em
microscopia óptica, aparecem geralmente como células únicas, pares ou agrupadas, com
aparência de cacho de uvas (BASTOS et al., 2013).
A maioria das espécies é benigna ou tem simbiose do tipo comensalismo com o
hospedeiro. Espécies do gênero Staphylococcus são capazes de provocar hemólise, coagulação
do plasma e produzir enzimas e toxinas extracelulares (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
Staphylococcus aureus é considerado um dos principais patógenos causadores de um
grande número de manifestações clínicas que compreendem: infecções em ferimentos,
pneumonias, endocardites e até septicemias. Com a introdução da meticilina na terapêutica
dessas infecções, ocorreu um aumento constante de cepas Staphylococcus aureus meticilina
resistente (MRSA), especialmente em hospitais, o que se tornou um problema sério no mundo
inteiro (LOWY, 1998).
6
É comum encontrá-lo na região nasofaríngea de adultos saudáveis (aproximadamente
25%), e com maior incidência entre hospitalizados e equipe de saúde. Sua dispersão é comum,
sendo responsável por diversas infecções hospitalares. Ocorre contaminação por contato direto,
ou transmissão através da poluição de superfícies (ALGHALTHY et al., 2000; TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008). A frequência dos portadores nasais é maior entre os que trabalham em
hospitais. As infecções estafilocócicas, geralmente superficiais e leves na maioria dos
pacientes, podem tornar-se graves em recém-nascidos, pacientes cirúrgicos, carcinomatosos,
diabéticos ou portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida. Cepas multirresistentes
são mais comuns em ambientes hospitalares (CAVALCANTI, 2006).
De acordo com levantamentos anteriores, os problemas enfrentados com bactérias com
expressão de resistência a múltiplos antimicrobianos são antigos. No âmbito hospitalar, a
primeira bactéria multirresistente relatada foi o S. aureus resistente a oxacilina (meticilina),
seguida por enterobactérias produtoras de uma enzima com capacidade de promover a digestão
de diversos antimicrobianos. Mais recentemente, houve relatos de S. aureus resistentes à
vancomicina e diversas bactérias gram-negativas produtoras de uma enzima com propriedade
de digerir antibióticos carbapenêmicos (DEL PELOSO et al., 2010).
1.6 HIDRAZONAS
Diversas classes de compostos orgânicos despertam o interesse de pesquisadores devido
à versatilidade de suas estruturas moleculares e seus efeitos biológicos alcançados (OLIVEIRA
et al., 2013). Os compostos pertencentes à classe das hidrazonas (Figura 3), vêm ganhado
destaque, pois apresentam um amplo perfil farmacológico cujas propriedades têm sido
extensivamente estudadas na química medicinal, em razão de sua capacidade quelante e do
papel da coordenação no seu mecanismo bioquímico de ação (BERALDO, 2004; SOUZA,
2017).
7
Figura 3 – Estrutura química geral das hidrazonas.
Fonte: Adaptado de SOUZA, 2017.
As hidrazonas pertencem a uma classe de compostos com estrutura geral –C=N–NH–,
sendo obtidas normalmente pela condensação de hidrazinas ou hidrazidas com cetonas ou
aldeídos, como representado na figura 4 (BERALDO, 2004; GUIMARÃES, 2017).
Figura 4 – Reação geral da formação de hidrazonas.
Fonte: Adaptado de GUIMARÃES, 2017.
Dentre as principais propriedades biológicas destes compostos destacam-se suas ações
antibacteriana, antifúngica, antichagásica, antiviral, anticonvulsivante, antituberculose,
antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral, antidepressiva, dentre muitas outras. As variadas
atividades biológicas de derivados hidrazônicos envolvem uma série de mecanismos, como
inibição enzimática, quelação de íons biologicamente importantes, interação com o DNA,
eliminação de radicais livres, dentre outros (BERALDO, 2004; GUIMARÃES et al, 2017).
1.7 COMPLEXOS METÁLICOS
Por muito tempo predominou a crença de que apenas os compostos orgânicos e as
reações que os envolviam eram indispensáveis para a vida, devido à predominância de
hidrogênio, oxigênio, carbono e nitrogênio nos seres vivos (PARRILHA, 2012). Vários
processos biológicos requerem proteínas, enzimas e cofatores, onde são encontrados diversos
metais. Um exemplo é a hemoglobina, a qual possui um complexo porfirínico de ferro utilizado
8
no transporte de oxigênio. O cobalto, por sua vez, é encontrado na coenzima B12, que é
essencial para a transferência de grupos alquil de uma molécula a outra em sistemas biológicos
(OKUDA, 1999). Outros metais como cobre, zinco e manganês também são incorporados em
proteínas catalíticas (metaloenzimas), as quais participam de reações químicas necessárias à
vida (DOMINGOS et al., 2003).
As propriedades biológicas de hidrazonas estão frequentemente relacionadas com a
coordenação de íons metálicos. A lipofilicidade, que é um dos mecanismos de controle de
entrada na célula, pode ser modificada por essa coordenação (FARREL, 2002). Além disso, o
complexo de metal pode ser mais ativo e apresentar atividades biológicas que não foram
apresentadas pelo ligante livre (BERALDO; GAMBINO, 2004).
1.8 DIFRAÇÃO DE RAIOS X
Dentre as várias técnicas de caracterização de materiais, a difração de raios X é a mais
indicada na determinação das fases cristalinas. Isto é possível porque na maior parte dos sólidos
(cristais), os átomos se ordenam em planos cristalinos separados entre si por distâncias da
mesma ordem de grandeza do comprimento de onda dos raios X (ALBERS et al., 2002).
A contribuição fundamental para a descoberta da difração de raios X veio de Max von
de Laue em 1912, através da observação do fenômeno de difração de raios X em um monocristal
de Sulfato de Cobre (ECKERT, 2012).
Em 1912, Willian Lawrence Bragg explicou os resultados de Laue, em termos da
“reflexão de ondas por planos atômicos do cristal”, tornando mais simples a compreensão do
fenômeno. A Lei de Bragg pode ser deduzida considerando a Figura 5, nas qual as retas
paralelas representam um conjunto de planos cristalinos que são equidistantes. Ao incidir uma
frente de onda monocromática de comprimento de onda λ sobre este conjunto de planos o
mesmo difrata pelos planos cristalinos originando o fenômeno de difração (CAVALCANTE;
TAVOLARO, 2007).
Isto é:
nλ = 2d sen θ
9
Figura 5 – Esquema da lei de Bragg.
Fonte: Disponível em <http://pt.slideshare.net/guilhermecuzzuol9/estrutura-cristalina-37503063> (Acesso em:
22 mai. 2018)
A lei de Bragg envolve três variáveis: λ (comprimento de onda), θ (ângulo de difração) e
d (distância interplanar). Em difração, conhece-se o λ (usa-se geralmente radiação
monocromática), mede-se θ e determina-se d (que é específica para cada cristal)
(CAVALCANTE; TAVOLARO, 2007).
Dentre as vantagens da técnica de difração de raios X, destacam-se a precisão do método
e a confiabilidade dos resultados obtidos, pois o perfil de difração obtido é característico para
cada fase cristalina (ALBERS et al., 2002).
1.9 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
A região espectral que corresponde ao infravermelho compreende a radiação com
números de onda no intervalo de aproximadamente 12800 a 10 cm-1. A condição para que
ocorra absorção da radiação infravermelha é que haja variação do momento de dipolo elétrico
da molécula, como consequência de seu movimento vibracional ou rotacional (o momento de
dipolo é determinado pela magnitude da diferença de carga e a distância entre dois centros de
carga). Somente nessas circunstâncias, o campo elétrico alternante da radiação incidente
interage com a molécula, originando os espectros. A vibração dos átomos no interior de uma
molécula apresenta energia coerente com a região do espectro eletromagnético correspondente
ao infravermelho (10000 a 100 cm-1) (SKOOG et al., 2002).
Do ponto de vista da aplicação, como dos instrumentos empregados, o espectro
infravermelho é dividido em infravermelho próximo (NIR – do inglês, Near Infrared), médio
(MID – do inglês, Middle Infrared) e distante (FAR – do inglês, Far Infrared) (SKOOG et al.,
2002).
10
Na região do infravermelho próximo, que compreende o intervalo de número de ondas
entre 12800 a 4000 cm-1, as principais aplicações encontram-se na análise quantitativa de
materiais industriais e agrícolas e no controle de processos, destacando as aplicações
farmacêuticas e petroquímicas, sendo também uma ferramenta valiosa para a identificação e
determinação de aminas primárias e secundárias na presença de aminas terciárias em misturas
(SKOOG et al., 2002).
A região do infravermelho médio, que compreende o intervalo de números de ondas
entre 4000 e 200 cm-1, é provavelmente onde se encontra a maioria das pesquisas desenvolvidas
e o maior número de aplicações. A maioria das aplicações do MID consiste na identificação de
compostos orgânicos, pois nessa região ocorrem essencialmente transições fundamentais e
existe uma faixa espectral conhecida como região de impressão digital (1200 a 700 cm-1). Nessa
região pequenas alterações na estrutura e na constituição de uma molécula resultam em
mudanças significativas na distribuição dos picos de absorção do espectro que são relacionados
com a estrutura da molécula. De posse destas informações, a identificação de compostos pode
ser realizada pela comparação do seu espectro MID com bancos de dados existentes (SKOOG
et al., 2002).
A utilização da região do infravermelho distante, que compreende o intervalo de
números de ondas entre 200 e 10 cm-1, teve seu uso limitado em tempos passados devido às
limitações instrumentais, pois são poucas as fontes para este tipo de radiação e, ainda, para essa
região, é necessária a utilização de filtros de interferência para evitar que radiações de ordens
superiores atinjam o detector. O desenvolvimento dos espectrofotômetros com Transformada
de Fourier resolve grande parte do problema encontrado nessa região e a tornou mais acessível
para o desenvolvimento de aplicações e pesquisas. O FAR é útil principalmente para estudos
de compostos inorgânicos, onde as absorções devido às vibrações de estiramento e deformação
angular de átomos metálicos e ligantes, tanto inorgânicos como orgânicos, podem ser
observados abaixo de 650 cm-1 (SKOOG et al., 2002).
11
2 JUSTIFICATIVA
O crescente aumento da resistência de microrganismos aos fármacos disponíveis no
mercado, principalmente em ambiente hospitalar, tem se tornado uma preocupação de saúde
pública. A partir deste cenário, pesquisadores têm concentrado esforços na descoberta de novos
fármacos antimicrobianos para aumentar as possibilidades terapêuticas, principalmente contra
microrganismos multirresistentes (BRASIL, 2017; WHO, 2018).
Compostos pertencentes à classe das hidrazonas, estão sendo amplamente pesquisados
e surgem como candidatos a fármacos com potencial comercial, por ter um custo baixo para
sua obtenção e por apresentarem atividades biológicas com diversas funções que incluem
propriedades antibacteriana, antitumorais, antimaláricas, antifúngica, entre outras (DOMAGK,
1947; CASINI et al., 2008; NAVARRO et al., 2011; PARRILHA, 2012).
Os complexos sintetizados e caracterizados neste trabalho são derivados de um ligante
de classe das hidrazonas e a maior parte de suas estruturas químicas não estão descritas na
literatura.
12
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem por objetivo geral a síntese, caracterizações química,
espectroscópica e estrutural e avaliação do potencial biológico de moléculas da classe hidrazona
isoladamente e complexadas com metais.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Sintetizar compostos da classe hidrazona;
2. Complexar os compostos sintetizados com os metais: Cobre, Níquel, Estanho,
Cádmio e Cobalto;
3. Realizar as caracterizações espectroscópica e estrutural dos compostos obtidos
através da espectroscopia na região do infravermelho e difração de raios X, respectivamente;
4. Investigar o efeito dos compostos sobre a cepa bacteriana gram-positiva: S. aureus.
5. Investigar o efeito dos compostos sobre a cepa bacteriana gram-negativa: E. coli.
6. Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) para as espécies bacterianas
testadas.
7. Determinar a concentração bactericida mínima (CBM) para as espécies bacterianas
testadas.
13
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 SÍNTESE DOS COMPOSTOS
As sínteses dos compostos e seus complexos com metais para este trabalho foram
realizadas no Laboratório de Desenvolvimento de Novos Fármacos situado na Universidade
Federal de Goiás, Regional Jataí.
4.1.1 N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida (J3)
O ligante N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida foi preparado através de reação
de condensação entre os compostos 2-acetilpiridina e acetil hidrazida na proporção de 1:1
(figura 6). Em solução etanólica diluiu-se o composto 2-acetilpiridina, formando uma solução
amarelada. O composto acetil hidrazida, por sua vez, foi diluído em água destilada, formando
uma solução transparente. Após a mistura das duas soluções, a solução final foi aquecida em
refluxo durante duas horas. Após o refluxo a solução foi filtrada com papel filtro e deixada para
evaporar lentamente.
Os cristais resultantes, de cor transparente, foram retirados da solução e lavados com
éter de petróleo e em seguida deixados para secagem espontânea.
Figura 6 – Rota de síntese para obtenção da hidrazona a partir da reação de 2-acetilpiridina e
acetil hidrazida, formando o composto N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida (J3).
Fonte: Elaborado pela autora.
14
4.1.2 Complexação de Cobre(II)-Catena-[(μ2-tiocianato)-(nitrato-o)-(n’-(1-(piridina-2-yl)
etilideno)acetohidrazida) (J3Cu)
O complexo foi preparado utilizando o ligante J3 previamente sintetizado, nitrato de
cobre (II) tri-hidratado e tiocianato de sódio na proporção 1:1:1 (Figura 7). O ligante J3 e o
nitrato de cobre (II) tri-hidratado foram dissolvidos em álcool metílico separadamente
formando soluções transparente e azul-claro, respectivamente. O tiocianato de sódio, por sua
vez, foi dissolvido em água destilada, formando uma solução transparente.
Após total dissolução de todos os compostos, gotejou-se a solução de nitrato de cobre
na solução de J3 e posteriormente adicionou-se a solução de tiocianato de sódio. Uma solução
de cor verde escura formou-se instantaneamente e foi deixada para evaporação lenta.
Os cristais verde escuros, imersos em solução, foram retirados, lavados com éter de
petróleo e deixados para secagem espontânea.
Figura 7 – Rota de síntese para obtenção de complexo metálico a partir da reação de J3 com
Nitrato de cobre (II) tri-hidratado e tiocianato de sódio formando Cobre(II)-catena-[(μ2-
tiocianato)-(nitrato-O)-(N’-(1-(piridina-2-yl) etilideno)acetohidrazida) (J3Cu).
Fonte: Elaborado pela autora.
15
4.1.3 Complexação de Bis (n’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida)-Níquel (J3Ni)
O complexo foi preparado proporção de 1:1:1. O ligante J3 e o nitrato de níquel foram
dissolvidos em álcool metílico (metanol), formando soluções transparente e verde claro,
respectivamente. O tiocianato de sódio, por sua vez, foi dissolvido em água destilada, formando
uma solução transparente.
Após total dissolução de todos os compostos, gotejou-se a solução de nitrato de níquel
na solução do ligante J3 e posteriormente adicionou-se a solução de tiocianato de sódio. Uma
solução de cor verde claro formou-se instantaneamente e foi deixada para evaporação lenta. Os
cristais verdes, imersos em solução, foram retirados, lavados em éter de petróleo e deixados
para secagem à temperatura ambiente.
Figura 8 – Rota de síntese para obtenção de complexo metálico a partir da reação de J3 com
Nitrato de níquel hexa-hidratado formando Bis (N’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida)-
níquel (J3Ni).
Fonte: Elaborado pela autora.
16
4.1.4 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Cobalto (J3Co)
O complexo foi preparado proporção de 1:1:1 (figura 9). O ligante J3 e o perclorato de
cobalto foram dissolvidos em álcool metílico (metanol), formando soluções transparente e rosa,
respectivamente. O tiocianato de sódio, por sua vez, foi dissolvido em água destilada, formando
uma solução transparente.
Após total dissolução de todos os compostos, gotejou-se a solução de tiocianato de sódio
na solução do ligante J3 e posteriormente adicionou-se a solução de perclorato de cobalto. Uma
solução de cor vermelha é formada gradativamente e deixada para evaporação lenta. Os cristais
vermelhos, imersos em solução, foram retirados, lavados em éter de petróleo e deixados para
secagem à temperatura ambiente.
Figura 9 – Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3 com
perclorato de cobalto e tiocianato de sódio formando o complexo J3Co.
Fonte: Elaborado pela autora.
4.1.5 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Cádmio (J3Cd)
O complexo foi preparado proporção de 1:1:2 (figura 10). O ligante J3 e o nitrato de
cádmio foram dissolvidos em álcool metílico (metanol), formando soluções transparentes. O
17
tiocianato de sódio, por sua vez, foi dissolvido em água destilada, formando uma solução
transparente.
Após total dissolução de todos os compostos, gotejou-se a solução de tiocianato de sódio
na solução do ligante J3 e posteriormente adicionou-se a solução de nitrato de cádmio. A
solução transparente formada, foi aquecida em refluxo por 2 horas e deixada para evaporar
lentamente.
Os cristais transparentes, imersos em solução, foram retirados, lavados em éter de
petróleo e deixados para secagem à temperatura ambiente.
Figura 10 – Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3 com
nitrato de cádmio e tiocianato de sódio formando J3Cd.
Fonte: Elaborado pela autora.
4.1.6 Síntese do Complexo do Ligante J3 com Estanho (J3Sn)
O complexo foi preparado proporção de 1:1:1:1 (figura 11). O ligante J3 e o dicloreto
de difenilestanho foram dissolvidos em benzeno, formando soluções transparentes. Após total
dissolução de todos os compostos, gotejou-se a solução de dicloreto de difenilestanho na
solução do ligante J3. A esta solução transparente formada, sob agitação, adicionou-se a
dietilamina, formando uma solução de cor amarela. Posteriormente foi adicionada a
trietilamina. A solução adquiriu aspecto turvo após a adição do último composto e foi aquecida
em refluxo por 24 horas. Após o termino do refluxo, a solução, de cor amarelo âmbar, foi
18
deixada para secagem à vácuo. Formou-se uma solução oleosa, na qual foi adicionado éter
etílico e colocada em freezer, para a formação dos cristais.
Os cristais formados foram recristalizados utilizando álcool metílico como solvente e
então deixada para evaporar lentamente à temperatura ambiente. Os cristais transparentes,
imersos em solução, foram retirados, lavados em éter de petróleo e deixados para secagem à
temperatura ambiente.
Figura 11 – Rota de síntese para obtenção do complexo metálico a partir da reação de J3 com
dicloreto de difenilestanho, trietilamina e trietilamina formando J3Sn.
Fonte: Elaborado pela autora.
4.2 CARACTERIZAÇÕES ESPECTROSCÓPICAS E ESTRUTURAIS
4.2.1 Espectroscopia Na Região Do Infravermelho
As análises são realizadas em um equipamento FT/IR-4100 Fourier Transform Infrared
Spectrometer da marca comercial JASCO, localizado no laboratório de Desenvolvimento de
Novos Fármacos da Universidade Federal de Goiás/ Regional Jataí.
Para a realização da técnica, os cristais são macerados juntamente com brometo de
potássio (KBr) em uma proporção de 1:100 e em seguida prensada e introduzida no
equipamento para a análise.
19
4.2.2 Difração De Raios X
As análises de difração de raios x em monocristal foram realizadas no difratômetro
Kappa 2 Duo Bruker-AXS e um detector APEX II CCD com monocromador de espelhos de
multicamadas que possui micro fonte de radiação de molibdênio Mo-Kα (λ= 0,71 Å), à
temperatura ambiente (22°C). Este equipamento está localizado no Laboratório de
Cristalografia do Instituto de Física da Universidade Federal de Goiás – Regional Goiânia.
4.3 DILUIÇÃO DOS COMPOSTOS
Após caracterização estrutural, os compostos em sua forma cristalina, foram diluídos
em Dimetilsulfóxido (DMSO), para obtenção de solução estoque padronizada em concentração
de 20 mg/mL.
4.4 OBTENÇÃO DAS CEPAS
Foram utilizadas cepas de Escherichia coli ATCC 35218 e de Staphylococcus aureus
ATCC 25923 obtidas através da colaboração do professor Dr. Alexandre Braoios, pesquisador
responsável pelo Laboratório de Bacteriologia e Micologia do curso de Biomedicina da
Universidade Federal de Goiás, Regional Jataí.
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
4.5.1 Padronização Da Suspensão Bacteriana
As espécies bacterianas testadas foram reativadas segundo o protocolo M7-A6 da
Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI, 2003). A reativação foi feita através da
inoculação do microrganismo em caldo BHI e posterior incubação a 37°C por 18-24 horas.
Após verificar a turvação do meio de cultura, semeou-se E. coli em ágar MacConkey (utilizado
para crescimento de bactérias Gram-negativas) e S. aureus em ágar Manitol (utilizado para
isolamento de colônias de S. aureus). Após verificar o crescimento e aspectos das colônias,
estas foram inoculadas em caldo Mueller-Hinton e incubadas a 37 °C por 24 horas.
20
Após o período de incubação, uma alíquota foi adicionada em tubo estéril contendo
caldo Mueller-Hinton e ajustou-se à turvação do padrão McFarland 0,5 que corresponde a 108
UFC ml-1.
4.5.2 Avaliação Da Atividade Antibacteriana Por Método De Microdiluição
Os testes foram realizados em triplicata e repetido por três vezes em dias diferentes,
utilizando-se a metodologia de microdiluição em placas de 96 poços fundo plano descrita no
protocolo M07-A6 do Clinical and Laboratory Standarts institute (CLSI, 2003). Os compostos
foram diluídos em caldo Mueller-Hington, na proporção de 1:10 na primeira coluna da placa.
Posteriormente, executou-se a adição de 100 µL de meio de cultivo puro para os poços, exceto
na primeira coluna e fez-se a diluição seriada dos compostos na proporção de 1:2, perfazendo
uma série de microdiluições em 12 concentrações (1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,3; 15,6; 7,81;
3,91; 1,95; 0,98; 0,49 μg/ml).
Após a microdiluição seriada adicionou-se 100 μL suspensão bacteriana em todos os
poços, previamente ajustada. Foram executados seis controles positivos (meio de cultivo mais
micro-organismo 1:1) e seis controles negativos (somente meio de cultivo). A placa foi então
incubada em estufa a 37°C por 24 horas.
4.5.3 Determinação Da Concentração Inibitória Mínima (CIM) Do Ligante E Seus Complexos
Frente Às Bactérias Testadas
O valor da concentração inibitória mínima é definido como a menor concentração do
composto que demonstra a inibição visual de 100% dos microrganismos, após a incubação de
24 horas. As leituras para a determinação das CIMs dos compostos foram realizadas após 24h,
48h, 72h e 96h horas de incubação a 37ºC, feitas em leitor de Elisa a 630 nm. Os valores finais
do CIM foram determinados com a média dos três experimentos realizados em triplicata.
4.5.4 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
Foi retirada uma alíquota de 5 μL do poço com a menor concentração sem crescimento
visível para E. coli e S. aureus, e adicionada em ágar MacConkey e ágar Manitol,
21
respectivamente após a incubação das placas a 37 °C por 96 horas. O crescimento das colônias
foi avaliado em 24h, 48h e 72h durante o período de incubação.
22
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
Os espectros de infravermelho para os seis compostos foram determinados na região de
400 a 4000 cm-1 e estão representados nas figuras 12, 13, 14, 15, 16 e 17. As principais bandas
de absorção estão listadas na tabela 1.
Analisando o espectro de infravermelho para o composto J3, representado na figura 12,
encontrou-se uma vibração em 3193 cm-1 que é atribuída a ν(N-H). O pico largo de alta
intensidade encontrado na região de 1677 cm-1 é atribuído a ν(C=O). Próximo a esta região,
observou-se uma vibração em 1617 cm-1 que é atribuído a ν(C=N), confirmando que o radical
CH3 de 2-acetilpiridina se ligou ao grupo NH2 de acetilhidrazida. A presença do anel piridínico
pode ser atribuída pelo pico encontrado na região de 625 cm-1 que corresponde à vibração de
C=N em anel piridínico.
Em 2012, Despaigne realizou a síntese e caracterização desta hidrazona e encontrou
vibrações nas regiões de 3193 cm-1, 1676 cm-1, 1618 cm-1 e 624 cm-1 atribuídos a ν(N-H),
ν(C=O), ν(C=N) e C=N de anel piridínico, respectivamente, corroborando com os valores
encontrados neste trabalho.
Figura 12 – Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 em pastilha de
brometo de potássio (KBr). ν(N-H): 3193 cm-1; ν (C=O): 1677 cm-1; ν (C=N): 1617 cm-1; ν
(C=N)py: 625 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora.
3193
c 1677
c
1617
c
625
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
% T
RA
NS
MIT
ÂN
CIA
23
Os espectros de infravermelho para a hidrazona e seu complexo com cobre estão
ilustrados na figura 13. A vibração encontrada em 1617 cm-1, atribuída a ν(C=N) no espectro
da hidrazona livre, se desloca para 1544 cm-1, indicando a coordenação com nitrogênio. A
vibração ν(C=O), observada em 1677 cm-1 no espectro da hidrazona, desloca-se para 1611 cm-
1, sugerindo a coordenação pelo oxigênio carbonílico. A deformação do anel piridínico no
plano, que se encontra em 625 cm-1 no espectro da hidrazona, desloca-se para 572 cm-1,
sugerindo coordenação no nitrogênio aromático. Assim, o espectro de infravermelho indica a
coordenação do metal pelo sistema Npy-N-O. O pico de forte intensidade encontrados em 2108
cm-1, é atribuído ao tiocianato, indicando sua presença na coordenação com o metal.
Figura 13 – Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu complexo
com Cobre II (J3Cu) em pastilha de brometo de potássio (KBr). J3Cu: ν(N-H): 3100 cm-1; ν(-
N=C=S): 2108 cm-1; ν(C=O): 1611 cm-1; ν(C=N): 1544 cm-1; ν(C=N)py: 572 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora
Os espectros de infravermelho para a hidrazona e seu complexo com níquel estão
ilustrados na figura 14. A vibração encontrada em 1617 cm-1, atribuída a ν(C=N) no espectro
da hidrazona livre, se desloca para 1607 cm-1 no complexo com níquel, indicando a coordenação
3193
c 1677
c
1617
c
625
2108 1611
1544
572
3100
c
24
com nitrogênio. A vibração ν(C=O), observada em 1677 cm-1 no espectro da hidrazona,
desloca-se para 1640 cm-1, sugerindo a coordenação pelo oxigênio carbonílico. A deformação
do anel piridínico no plano, que se encontra em 625 cm-1 no espectro da hidrazona, desloca-se
para 575 cm-1, sugerindo coordenação no nitrogênio aromático. Assim, o espectro de
infravermelho indica a coordenação do metal pelo sistema Npy-N-O. O pico de forte
intensidade encontrado em 2118 cm-1 no complexo com níquel, é atribuído ao tiocianato,
indicando sua presença na coordenação com o níquel.
Figura 14 – Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu complexo
com Níquel (J3Ni) em pastilha de brometo de potássio (KBr). J3Ni: ν(N-H): 3064 cm-1; ν (-
N=C=S): 2118 cm-1; ν (C=O): 1640 cm-1; ν (C=N): 1607 cm-1; ν (C=N)py: 575 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os espectros de infravermelho para a hidrazona e seu complexo com cádmio estão
ilustrados na figura 15. A vibração encontrada em 1598 cm-1 é atribuída a ν(C=N). A vibração
ν(C=O) é evidenciada pela absorção em 1618 cm-1, sugerindo a coordenação pelo oxigênio
carbonílico. A deformação do anel piridínico no plano, que se encontra em 625 cm-1 no espectro
da hidrazona, desloca-se para 523 cm-1, sugerindo coordenação no nitrogênio aromático. Assim,
o espectro de infravermelho indica a coordenação do metal pelo sistema Npy-N-O. O pico de
3193
c
1617
c
625
625
1640
1677
1640
c
3064
c
2118
c
1640
c
1607
c
575
c
25
forte intensidade encontrado em 2109 cm-1 é atribuído ao tiocianato, indicando sua presença na
coordenação com o Cádmio.
Figura 15 – Espectros de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu complexo
com Cádmio J3Cd em pastilha de brometo de potássio (KBr). J3Cd: ν(N-H): 3195 cm-1; ν
(N=C=S): 2109 cm-1; ν (C=O): 1640 cm-1; ν (C=N): 1592 cm-1; ν (C=N)py: 596 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os espectros de infravermelho para a hidrazona e seu complexo com cobalto estão
ilustrados na figura 16. A vibração encontrada em 1559 cm-1 é atribuída a ν(C=N). A vibração
ν(C=O) é evidenciada pela absorção em 1603 cm-1, sugerindo a coordenação pelo oxigênio
carbonílico. A deformação do anel piridínico no plano, que se encontra em 625 cm-1 no espectro
da hidrazona, desloca-se para 528 cm-1, sugerindo coordenação no nitrogênio aromático. Assim,
o espectro de infravermelho indica a coordenação do metal pelo sistema Npy-N-O
.
3193
c 1677
c
3195
c
2109
c
1640
c
1592
c
596
c
625
c 1617
c
26
Figura 16 – Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu complexo com
Cobalto J3Co em pastilha de brometo de potássio (KBr). J3Co: ν(N-H): 3095 cm-1; ν (N=C=S):
2052 cm-1; ν (C=O): 1603 cm-1; ν (C=N): 1559 cm-1; ν (C=N)py: 528 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os espectros de infravermelho para a hidrazona e seu complexo com estanho estão
ilustrados na figura 17. A vibração encontrada em 1595 cm-1 é atribuída a ν(C=N). A vibração
ν(C=O) é evidenciada pela absorção em 1674 cm-1, sugerindo a coordenação pelo oxigênio
carbonílico. A deformação do anel piridínico no plano, que se encontra em 625 cm-1 no espectro
da hidrazona, desloca-se para 576 cm-1, sugerindo coordenação no nitrogênio aromático. Assim,
o espectro de infravermelho indica a coordenação do metal pelo sistema Npy-N-O.
3095
c 2052
c
1603
c
1559
c 528
c
3193
c 1677
c
1617
c
625
c
27
Figura 17 – Espectro de absorção na região do infravermelho do ligante J3 e seu complexo com
Estanho J3Sn em pastilha de brometo de potássio (KBr). J3Sn: ν(N-H): 3194 cm-1; ν (C=O):
1674 cm-1; ν (C=N): 1595 cm-1; ν (C=N)py: 576 cm-1.
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 1 – Bandas nos espectros de infravermelho (cm-1) do composto J3 e seus complexos
com Cobre (II) e Níquel.
Compostos ν(N-H) ν(C=O) ν(C=N) ν(C=N)py ν(-N=C=S)
J3 3193 1677 1617 625 -
J3Cu 3100 1611 1544 572 2108
J3Ni 3064 1640 1607 575 2118
J3Cd 3195 1640 1592 596 2109
J3Co 3095 1603 1559 528 2052
J3Sn 3194 1674 1595 576 -
Fonte: Elaborado pela autora.
3193
c
1617
c 1677
c
625
c
3194
c 1674
c
1595
c
595
c
28
5.2 DIFRAÇÃO DE RAIOS X
Após a confirmação da presença de grupamentos funcionais desejados observados pela
análise dos dados de infravermelho, a confirmação estrutural da hidrazona e seus complexos
foi determinada por difração de raios x.
5.2.1 Caracterização Estrutural Do Ligante n’-(1-(piridina-2-yl)etilideno)acetohidrazida (J3)
A figura 18 mostra o diagrama ORTEP da estrutura do ligante J3, onde é possível
observar que houve a ligação entre os compostos 2-acetilpiridina e acetilhidrazida, através da
dupla ligação entre o carbono C3 e nitrogênio N2. Os dados cristalográficos e parâmetros de
refinamento estrutural da hidrazona J3 estão descritos no Anexo A.
Figura 18 – Diagrama ORTEP do ligante J3
Fonte: Elaborado pela autora.
5.2.2 Caracterização Estrutural Do Complexo Cobre(II)-Catena-[(μ2-tiocianato)-(nitrato-o)-
(n’-(1-(piridina-2-yl) etilideno)acetohidrazida) (J3Cu)
A figura 19 mostra o diagrama ORTEP da estrutura do complexo J3Cu, onde é possível
observar que houve coordenação do cobre com o nitrogênio piridínico N3, nitrogênio N2,
oxigênio do grupo carbonila O1 e nitrogênio do tiocianato N4. Os dados cristalográficos e
parâmetros de refinamento estrutural do complexo J3Cu estão descritos no Anexo B
29
Figura 19 – Diagrama ORTEP do complexo J3Cu
Fonte: Elaborado pela autora.
5.2.3 Caracterização Estrutural Do Complexo Bis (n’-(1-(piridina-2-
yl)etilideno)acetohidrazida)-níquel (J3Ni)
A figura 20 mostra o diagrama ORTEP da estrutura do complexo J3Ni, onde é possível
observar que houve coordenação do níquel com dois ligantes, sendo esta coordenação através
dos átomos de nitrogênio do anéis piridínicos N3 e N6, nitrogênios N2 e N5 e os oxigênios dos
grupos carbonila O1 e O2. Os dados cristalográficos e parâmetros de refinamento estrutural do
complexo J3Ni estão descritos no Anexo C.
Figura 20 – Diagrama ORTEP do complexo J3Ni
Fonte: Elaborado pela autora.
30
Foram realizadas as medidas de difração de raios X dos complexos de J3 com cádmio,
cobalto e estanho, entretanto o refinamento dos dados ainda não está completo. Por este motivo,
não foi possível desenhar suas estruturas.
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
5.3.1 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima para o Ligante J3
O composto J3 não apresentou 100% de inibição das bactérias nas concentrações
testadas, nos tempos de 24, 48 e 72 horas para E. coli. Entretanto, apresentou CIM de 1000
μg/mL no tempo de incubação de 96 horas. Para S. aureus o composto não inibiu 100% dos
microrganismos nas concentrações e tempos de incubação analisados. A CIM50 variou de 107
a 327 μg/mL para E. coli e de 232 a 457 μg/mL para S. aureus nos tempos analisados (tabela
2).
Al-Shaalan em 2011, testou a atividade de um ligante hidrazona em E. coli e S. aureus
e observou que ele não teve ação sobre S. aureus nas concentrações analisadas. Entretanto, o
ligante inibiu E. coli nas maiores concentrações testadas. No presente trabalho, o ligante foi
efetivo contra E. coli, porém necessitou de um tempo maior em contato com as células
bacterianas para exercer este efeito.
Um estudo feito por Sedaghat e cols. em 2014, testou a atividade de três ligantes
hidrazona com anel piridina contra bactérias Gram-positivas (S. aureus e B. subtilis) e Gram-
negativas (E. coli e P. aeruginosa) e observou-se que os ligantes foram mais citotóxicos para
as bactérias Gram-positivas em 24 horas de incubação.
Tabela 2 - Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do ligante J3 para as bactérias S. aureus e E. coli
em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação.
Tempo de incubação (horas)
24 48 72 96
S. aureus CIM >1000 >1000 >1000 >1000
CIM50 455 232 457 444
E. coli CIM >1000 >1000 >1000 1000
CIM50 107 124 318 327
Fonte: Elaborado pela autora.
31
O tempo de incubação no qual foi necessária menor concentração para atingir 50% de
inibição foi de 24 horas e 48 horas para E. coli e S. aureus, respectivamente. Sendo a
concentração observada para E. coli cerca de 4 vezes menor quando comparada com S. aureus
no tempo de incubação de 24 horas.
Conforme ilustrado na figura 21 (A), o ligante J3 mantém a porcentagem de inibição
para E. coli na faixa de 80% nas concentrações acima de 500 μg/mL. O efeito inibitório do
composto diminui conforme a concentração decresce e o tempo de incubação aumenta.
Ibrahim e cols. em 2013 testaram a atividade de uma hidrazona em E. coli. Os
pesquisadores observaram que o composto não inibiu a bactéria nas concentrações testadas,
porém apresentou efeito inibitório menor que o observado neste estudo, inibindo menos que
70% dos microrganismos na concentração de 1000 μg/mL e cerca de 80% de inibição na
concentração de 1500 μg/mL.
Já para S. aureus (figura 21 - B) o composto apresenta efeito inibitório maior no tempo
de incubação de 48 horas, quando comparado aos outros tempos analisados, porém menos ativo
quando comparada sua ação contra E. coli.
Figura 21 – Atividade de J3 sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de 24,
48,72 e 96 horas.
32
Fonte: Elaborado pela autora.
Os testes para análise da CBM sugerem efeito bacteriostático do ligante J3 sobre E. coli,
com crescimento de colônias semelhantes ao controle na ausência do composto (Figura 22).
Figura 22 – Ensaio referente a CBM do ligante J3 frente a E. coli (A): Controle 72h para E. coli
em ágar MacConkey; (B): 1000μg/mL de J3 após 72h para E. coli em ágar MacConkey.
Fonte: Elaborado pela autora.
A maior parte dos compostos antibacterianos são mais ativos contra bactérias Gram-
positivas, pelo fato de não possuírem membrana externa e por possuírem uma camada de
peptidoglicano porosa, fracamente empacotada por meio da qual a penetração da droga na
célula é facilitada em comparação com bactérias Gram-negativas (SHUJAH et al., 2017).
33
O ligante J3 não apresentou atividade inibitória satisfatória contra a bactéria Gram-
positiva testada, porém apresentou atividade moderada contra a cepa Gram-negativa após 96
horas de exposição. Pode-se sugerir que o ligante exerça sua ação em algum componente da
membrana externa presente nas bactérias Gram-negativas, como o lipopolissacarídeo (LPS).
5.3.2 Concentração Mínima Inibitória e Concentração Bactericida Mínima para o Complexo
J3Cu
O complexo J3Cu inibiu o crescimento de E. coli na concentração de 1000 μg/mL para
todos os tempos de incubação analisados e inibiu S. aureus na mesma concentração nos tempos
de 48, 72 e 96 horas. A CIM50 variou de 187 a 525 μg/mL para E. coli e de 121 a 418 μg/mL
para S. aureus.
Ibrahim e cols. em 2013, complexaram um ligante hidrazona com cobre e observaram
que o complexo potencializou a ação do ligante contra E. coli, que não apresentou atividade
inibitória isoladamente em 24 horas de incubação, corroborando portanto, com os resultados
encontrados neste estudo. Entretanto, o complexo estudado neste trabalho apresentou CIM 1,5
vezes menor que a CIM apresentada por Ibrahim e cols.
Tabela 3 - Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Cu para as bactérias S. aureus e
E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação.
Tempo de incubação (horas)
24 48 72 96
S. aureus CIM >1000 1000 1000 1000
CIM50 113 314 334 426
E. coli CIM 1000 1000 1000 1000
CIM50 198 459 458 498
Fonte: Elaborado pela autora.
Como mostrado na figura 23 (B), para S. aureus o complexo manteve sua atividade
acima de 80% nas concentrações superiores a 125 μg/mL, além de inibir 100% dos
microrganismos desta espécie na concentração de 1000 μg/mL, aumentando, portanto, a
atividade inibitória do ligante isolado.
34
Al-Shaalan em 2011, estudou a atividade inibitória de um ligante hidrazona e seu
complexo com cobre sobre E. coli e S. aureus. Assim como observado neste trabalho, o ligante
não apresentou 100% de atividade em 24 horas para nenhuma das espécies e concentrações
testadas, porém o complexo com cobre inibiu as cepas de E. coli. Entretanto, para S. aureus Al-
Shaalan observou inibição de 100% nas maiores concentrações em 24 horas de incubação,
discordando com os resultados encontrados neste trabalho. Porém, o complexo J3Cu inibiu os
microrganismos após 48, 72 e 96 horas, sugerindo que um maior tempo de contato do complexo
com o microrganismo potencializa sua ação.
Figura 23 – Atividade de J3Cu sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de
24, 48,72 e 96 horas.
Fonte: Elaborado pela autora.
35
Despaigne em 2012, sintetizou e testou uma hidrazona de mesma estrutura do ligante J3
sintetizado neste trabalho e avaliou sua atividade biológica contra S. aureus, e as bactérias
Gram-negativas E. faecalis e P. aeruginosa. Além da hidrazona, avaliou a atividade de
complexos com cobre e zinco. O autor verificou que o ligante não apresentou 100% de inibição
nas concentrações testadas para nenhum dos microrganismos analisados. O complexo com
cobre também não apresentou inibição contra os microrganismos testados em 24 horas.
Entretanto, neste trabalho, o complexo J3Cu inibiu a bactéria Gram-negativa E. coli em 24
horas de incubação e manteve a inibição após 48, 72 e 96 horas.
Os testes para análise da CBM apontaram para efeito bacteriostático do complexo J3Cu
sobre E. coli, o qual pode-se observar que o crescimento da bactéria que estava em contato com
o complexo (figura 24 – B) foi semelhante ao crescimento observado para a bactéria que não
entrou em contato com o complexo analisado (Figura 24 - A).
Figura 24 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Cu frente a E. coli e S. aureus. (A): Controle
72h para E. coli em ágar MacConkey; (B): 1000μg/mL de J3Cu após 72h para E. coli em ágar
MacConkey.
Fonte: Elaborado pela autora.
Para S. aureus observou-se crescimento escasso de colônias quando comparada ao
controle na ausência da droga após 24 horas (figura 25 - B) e 72 horas (figura 25 - D) de
incubação em placa, o que sugere efeito bacteriostático e bactericida.
36
Figura 25 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Cu frente a S. aureus. (A): Controle 24h
para S. aureus em ágar Manitol; (B) 1000μg/mL de J3Cu após 24h para S. aureus em ágar
Manitol; (C): Controle 72h para S. aureus em ágar Manitol; (D) 1000μg/mL de J3Cu após
72h para S. aureus em ágar Manitol.
Fonte: Elaborado pela autora.
5.3.3 Concentração Mínima Inibitória e Concentração Bactericida Mínima para o complexo
J3Cd
A tabela 4 mostra que o complexo J3Cd inibiu S. aureus na concentração de 1000 μg/mL
em todos os tempos de incubação analisados. Para a bactéria E. coli nos tempos de 48, 72 e 96
horas o complexo apresentou CIM de 250 μg/mL e 1000 μg/mL em 24 horas de incubação. A
CIM50 variou de 95 a 128 μg/mL para E. coli e de 96 a 184 μg/mL para S. aureus.
Tabela 4 - Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Cd para as bactérias S. aureus e
E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação.
Tempo de incubação (horas)
24 48 72 96
S. aureus CIM 1000 1000 1000 1000
CIM50 173 100 108 116
E. coli CIM 1000 250 250 250
CIM50 95 104 125 125
Fonte: Elaborado pela autora.
37
Ao analisar a figura 26, observa-se que a atividade do ligante foi potencializada com
sua coordenação com Cádmio, contra E. coli (A) e S. aureus (B). O complexo se mostrou mais
potente contra E. coli em comparação com sua ação contra S. aureus, mantendo a porcentagem
de inibição acima de 90% nas concentrações maiores que 250 μg/mL. Para S. aureus, o
composto conseguiu manter esta atividade apenas nas concentrações acima de 800 μg/mL.
Um estudo de Adly e Taha em 2013, analisou a atividade de um ligante hidrazona e
alguns complexos com os metais Cadmio, Cobalto, Cobre, Níquel e Zinco e observou-se que
complexo com cadmio demonstrou maior atividade contra bactérias gram-negativas, quando
comparada com o ligante livre e os outros complexos testados, que demonstraram atividade
moderada (ADLY; TAHA, 2013). Estes resultados corroboram com os encontrados neste
trabalho, onde no complexo com cádmio foi observada maior atividade inibitória dos
microrganismos testados, quando comparados com as atividades do ligante J3 e seus complexos
com cobalto, cobre e níquel.
O incremento da atividade antimicrobiana com a coordenação das hidrazonas com
metais poderia ser explicado pelo fato de que essa classe de ligante se comportaria como um
carreador do metal para o interior dos microrganismos (DESPAIGNE, 2012). A quelação de
metais reduz a polaridade do íon metálico devido ao compartilhamento parcial de carga positiva
com os grupos doadores e possivelmente ao deslocamento do elétron π dentro do sistema de
coordenação. Estes fatores aumentam a natureza lipofílica do átomo central de metal
favorecendo sua permeabilização através da camada lipídica bacteriana (SHAKDOFA et al.,
2014).
38
Figura 26 – Atividade de J3Cd sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de
24, 48,72 e 96 horas.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os testes para análise da CBM apontaram para o efeito bacteriostático e bactericida do
complexo J3Cd sobre E. coli na concentração referente à CIM, que é de 250 μg/mL. Observou-
se crescimento escasso das cepas em contato com a droga em relação ao crescimento observado
no controle positivo após 72 horas de incubação em placa de petri, como observado na figura
27 (D).
39
Figura 27 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Cd frente a E. coli. (A): Controle 24h em
ágar MacConkey; (B): 250μg/mL de J3Cd após 24h em ágar MacConkey; (C): Controle 72h
em ágar MacConkey; (D) 250μg/mL de J3Cd após 72h em ágar MacConkey.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os testes para análise da CBM apontaram para o efeito bacteriostático do complexo
J3Cd sobre S. aureus na concentração referente à CIM, que é de 1000 μg/mL. Não observando-
se diferença do crescimento das cepas em contato com o complexo em relação ao controle de
crescimento bacteriano, após 72 horas de incubação em ágar manitol, como observado na figura
28 (B).
Figura 28 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Cd frente a S. aureus. (A): Controle 24h
em ágar Manitol; (B): 1000μg/mL de J3Cd após 24h em ágar Manitol; (C): Controle 72h em
ágar Manitol; (D) 1000μg/mL de J3Cd após 72h em ágar Manitol.
Fonte: Elaborado pela autora.
40
5.3.4 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima Para o Complexo
J3Sn
O complexo J3Sn apresentou CIM de 250 μg/mL para S. aureus em todos os tempos de
incubação analisados. Para E. coli, o complexo apresentou CIM de 250 μg/mL no tempo de 24
horas, e 125 μg/mL nos tempos de 48, 72 e 96 horas. A CIM50 variou de 47 a 63 μg/mL para E.
coli e de 11 a 13 μg/mL para S. aureus.
Tabela 5 - Valores das CIM e CIM50 (μg/mL) do complexo J3Sn para as bactérias S. aureus e
E. coli em 24, 48, 72 e 96 horas de incubação.
Tempo de incubação (horas)
24 48 72 96
S. aureus CIM 250 250 250 250
CIM50 11 14 13 13
E. coli CIM 250 125 125 125
CIM50 47 48 62 62
Fonte: Elaborado pela autora.
A atividade apresentada pelo complexo J3Sn para E. coli e S. aureus está representada
na figura 29 (A) e (B), respectivamente. Para E. coli, o complexo não exibiu efeito concentração
dependente em 24 horas, já que não inibiu 100% dos microrganismos nas concentrações de
1000 e 500 μg/mL e apresentou CIM de 250 μg/mL e manteve alta inibição nas concentrações
acima de 125 μg/mL. Em 48, 72 e 96 horas de incubação, o composto manteve a inibição em
100% nas concentrações a partir de 125 μg/mL, potencializando, então, a ação do ligante
isolado. A atividade do complexo para S. aureus (B) potencializou a ação do ligante,
apresentando CIM de 250 μg/mL para todos os tempos de incubação analisados e manteve as
taxas de inibição acima de 80% nas concentrações a partir de 125 μg/mL.
Um estudo avaliou a atividade de 3 hidrazonas e 7 complexos utilizando sais de estanho
contra bactérias Gram-positivas e negativas, entre elas E. coli e S. aureus. Os complexos se
mostraram mais ativos contra S. aureus, não apresentando atividade inibitória contra E. coli
(SEDAGHAT et al., 2014). No presente estudo, o complexo inibiu E. coli e S. aureus na mesma
concentração após 24 horas de incubação.
41
O estanho geralmente não é tóxico ou apresenta baixa toxidade frente a mamíferos,
insetos, bactérias e fungos. Entretanto, compostos de estanho contendo uma porção orgânica
mostram variadas atividades biológicas de acordo com os ligantes e o tipo de sal de estanho
utilizado na síntese (SEDAGHAT et al., 2014; SHAH, et al., 2015).
Figura 29 – Atividade de J3Sn sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de
24, 48,72 e 96 horas.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os testes para análise da CBM apontaram para o efeito bacteriostático e bactericida do
complexo J3Sn sobre E. coli na concentração referente à CIM de 96 horas, que foi de 125
μg/mL. Observou-se crescimento escasso das cepas que tiveram contato com o complexo
42
(figura 33 B e D) em relação às cepas que cresceram somente em meio de cultura (figura 30 A
e C).
Figura 30 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Sn frente a E. coli. (A): Controle 24h em
ágar MacConkey; (B): 125μg/mL de J3Sn após 24h em ágar MacConkey; (C): Controle 72h
em ágar MacConkey; (D) 125μg/mL de J3Sn após 72h em ágar MacConkey.
Fonte: Elaborado pela autora.
Os testes para análise da CBM apontaram para o efeito bactericida e bacteriostático do
complexo J3Cd sobre S. aureus na concentração referente à CIM, que é de 250 μg/mL. Observa-
se que em 24 horas de incubação em ágar Manitol, não observa-se o crescimento de colônias
(figura 31 (B)). Após 72 horas de incubação, observa-se crescimento de colônias, porém com
crescimento limitado, quando comparado ao controle de crescimento sem o complexo, como
observado na figura 31 (D).
43
Figura 31 - Ensaio referente a CBM do complexo J3Sn frente a S.aureus. (A): Controle 24h em
ágar Manitol; (B): 250μg/mL de J3Sn após 24h em ágar Manitol; (C): Controle 72h em ágar
Manitol; (D) 250μg/mL de J3Sn após 72h em ágar Manitol.
Fonte: Elaborado pela autora.
5.3.5 Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima para os Complexos
J3Co e J3Ni
Para os complexos J3Ni e J3Co não foi possível determinar as CIM e CIM50 nas
concentrações e tempo testados. Não observou-se diferença no crescimento das cepas nos testes
de CBM para nenhum dos complexos com níquel e cobalto.
Sogukomerogullari e cols. analisaram, em 2016, a atividade inibitória de um ligante
hidrazona e complexos com cobalto e níquel sobre S. aureus e E. coli. Todos os compostos
apresentaram atividade moderada sobre as bactérias testadas, com CIM de 80 μg/mL para todos
os compostos sobre as duas bactérias
Ao analisar os gráficos referentes à atividade do complexo J3Ni contra E. coli (Figura
32 - A) e S. aureus (Figura 32 - B), nota-se que a complexação de J3 com níquel diminuiu a
atividade do ligante, atingindo o máximo de 40% de inibição para S. aureus e cerca de 20%
para E. coli, nas concentrações e tempos de incubação analisados.
44
Figura 32 - Atividade de J3Ni sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de 24,
48,72 e 96 horas.
Fonte: Elaborado pela autora.
Ao analisar os gráficos referentes à atividade do complexo J3Co contra E. coli (Figura
33 - A) e S. aureus (Figura x - B), nota-se que a complexação de J3 com cobalto diminuiu a
atividade do ligante, atingindo atividade máxima em cerca de 50% de inibição para S. aureus e
cerca de 40% para E. coli, nas concentrações e tempos de incubação analisados.
45
Figura 33 – Atividade de J3Co sobre E. coli (A) e S. aureus (B) nos tempos de incubação de
24, 48,72 e 96 horas.
Fonte: Elaborado pela autora.
46
6 CONCLUSÕES
No presente trabalho foi proposta a síntese e caracterização de novos compostos com o
objetivo de avaliar suas propriedades biológicas em bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas. Um total de 6 compostos foram sintetizados, sendo um ligante hidrazona (J3) e cinco
complexos metálicos com cobre, níquel, cádmio, cobalto e estanho.
Os dados da espectroscopia na região do infravermelho para J3 sugerem que ocorreu a
formação do ligante através da reação de condensação entre os compostos 2-acetilpiridina e
acetilhidrazida pela observação da banda referente à vibração da ligação C=N no espectro
gerado.
Os dados da espectroscopia na região do infravermelho para os complexos J3Cu, J3Ni,
J3Cd, J3Co e J3Sn sugerem que o ligante J3 está presente em suas estruturas, pela observação
da banda referente à vibração de C=N, do anel piridínico e do grupamento carbonila.
Foram determinadas as estruturas cristalográficas dos 6 compostos sintetizados, sendo
3 totalmente e 3 parcialmente. Destes, cinco não estão descritos na literatura
Os resultados de avaliação da atividade biológica dos compostos sugerem que o ligante
isolado não apresentou atividade inibitória contra S. aureus. Porém apresentou atividade
inibitória moderada contra E. coli após 96 horas de incubação, com CIM de 1000 μg/mL.
Observou-se que, para os complexos de J3 com níquel e cobalto, os quais possuem 2
ligantes em um sistema com 6 coordenações no metal, a atividade inibitória mostrou-se mais
fraca quando comparada ao ligante J3 isolado, sugerindo que esta coordenação não contribui
para o aumento da atividade inibitória do ligante.
O complexo J3Cu apresentou atividade inibitória contra E. coli na concentração de 1000
μg/mL para todos os tempos analisados e inibiu S. aureus na mesma concentração em 48, 72 e
96 horas de incubação. Os testes de CBM apontaram para o efeito bacteriostático do complexo
contra S. aureus e efeito bacteriostático e bactericida contra E. coli.
O complexo J3Cd apresentou atividade inibitória contra as duas espécies testadas,
porém os melhores resultados foram observados contra E. coli, que apresentou CIM de 250
μg/mL nos tempos de 48, 72 e 96 horas, 4 vezes menor que a CIM apresentada para S. aureus
nos mesmos tempos de incubação. A análise dos testes de CBM demostraram efeito bactericida
e bacteriostático contra E. coli e efeito bacteriostático contra S. aureus.
O complexo J3Sn apresentou CIM de 250 μg/mL contra S. aureus em todos os tempos
de incubação analisados e as CIM50 variaram entre 11 e 13 μg/mL. Observou-se atividades
47
bactericida e bacteriostática após análise dos testes de CBM. Para a espécie E. coli, o complexo
J3Sn apresentou CIM de 250 μg/mL em 24 horas de incubação e CIM de 125 μg/mL em 48, 72
e 96 horas de incubação. Os testes de CBM mostraram efeitos bactericida e bacteriostático
contra a espécie. Este complexo foi, portanto, o mais ativo contra as duas espécies bacterianas
testadas.
A atividade inibitória do ligante J3 foi melhorada a partir da coordenação com os metais
estanho, cádmio e cobre para E. coli e S. aureus, sendo as menores concentrações inibitórias
observadas contra E. coli. Sugerindo que ação do ligante e os complexos J3Sn, J3Cd e J3Cu
possa ocorrer na membrana externa da parede celular, ausente em espécies gram-positivas.
A partir dos resultados encontrados neste estudo, tem-se como perspectivas a avaliação
da atividade biológica destes compostos em fungos e verificar a citotoxidade em células de
mamíferos.
48
ANEXO A – Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para a
Hidrazona J3
Composto J3
Fórmula Empírica C9 H10 N3 O
Peso Molecular 176.20 g/Mol
Temperatura 296(2) K
Comprimento de Onda 0.71073 Å
Sistema Cristalino Monoclinico
Grupo Espacial P 21/c
Dimensões da Célula Unitária a = 3.9908(9) Å α = 90°.
b = 12.458(2) Å β = 94.680(12)°.
c = 18.187(4) Å γ = 90°.
Volume 901.2(3) Å3
Z 4
Densidade (Calculada) 1.299 Mg/m3
Coeficiente de Absorção 0.089 mm-1
F(000) 372
Tamanho do Cristal 0,126 x 0,129 x 0,464 mm3
Intervalo de θ para Coleta de Dados 1.98 to 27.16°.
Intervalo dos Índices de Miller -5<=h<=4; -15<=k<=15; -23<=l<=23.
Reflexões Coletadas 6327
Reflexões Independentes 1918 [R(int) = 0.4063]
Completeza para θ = 27.16° 96.3 %
Método de Refinamento Mínimos Quadrados de Matriz Completa em F2
Dados / Restrições / Parâmetros 1918 / 0 / 121
“Goodness-of-fit” em F2 1.136
Índices R Finais [I>2sigma(I)] R1 = 0.1491, wR2 = 0.3357
Índices R (Todos os Dados) R1 = 0.2325, wR2 = 0.3905
Coeficiente de Extinção 0.12(3)
Maior Diferença Entre Pico e Buraco 0.522 and -0.378 e.Å-3
49
ANEXO B - Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para o
Complexo J3Cu
Composto J3Cu
Fórmula Empírica C10 H11 Cu N6 O7 S
Peso Molecular 422.85 g/Mol
Temperatura 296(2) K
Comprimento de Onda 0.71073 Å
Sistema Cristalino Monoclinic
Grupo Espacial C2/c
Dimensões da Célula Unitária a = 26.2687(4) Å α = 90°.
b = 7.73350(10) Å β = 115.0600(10)°.
c = 16.0523(3) Å γ = 90°.
Volume 2954.03(8) Å3
Z 8
Densidade (Calculada) 1.902 Mg/m3
Coeficiente de Absorção 1.673 mm-1
F(000) 1712
Tamanho do Cristal 0,074 x 0,364 x 0,625 mm3
Intervalo de θ para Coleta de Dados 1.71 to 28.90°.
Intervalo dos Índices de Miller -28<=h<=35; -10<=k<=10; -21<=l<=20.
Reflexões Coletadas 12539
Reflexões Independentes 3819 [R(int) = 0.0284]
Completeza para θ = 28.90° 98.1 %
Correção de Absorção Numérica
Método de Refinamento Mínimos Quadrados de Matriz Completa em F2
Dados / Restrições / Parâmetros 3819 / 0 / 229
“Goodness-of-fit” em F2 1.446
Índices R Finais [I>2sigma(I)] R1 = 0.0689, wR2 = 0.1970
Índices R (Todos os Dados) R1 = 0.0887, wR2 = 0.2113
Coeficiente de Extinção 0.0013(5)
Maior Diferença Entre Pico e Buraco 1.178 and -1.124 e.Å-3
50
ANEXO C - Dados Cristalográficos e Parâmetros de Refinamento Estrutural para o
Complexo J3Ni
Composto J3Ni
Fórmula Empírica C18 H22 N9 Ni1.50 O14
Peso Molecular 676.51 g/Mol
Temperatura 296(2) K
Comprimento de Onda 0.71073 Å
Sistema Cristalino Triclínico
Grupo Espacial P-1
Dimensões da Célula Unitária a = 8.0850(5) Å α = 76.193(3)°.
b = 13.3995(8) Å β = 75.388(3)°.
c = 13.7914(9) Å γ = 82.637(3)°.
Volume 1400.32(15) Å3
Z 2
Densidade (Calculada) 1.604 Mg/m3
Coeficiente de Absorção 1.101 mm-1
F(000) 694
Tamanho do Cristal 0,090 x 0,143 x 0,243 mm3
Intervalo de θ para Coleta de Dados 1.56 to 26.42°.
Intervalo dos Índices de Miller -10<=h<=10; -15<=k<=16; -17<=l<=17.
Reflexões Coletadas 20186
Reflexões Independentes 5714 [R(int) = 0.0241]
Completeza de θ = 26.42° 99.1 %
Correção de Absorção Numérica
Método de Refinamento Mínimos Quadrados de Matriz Completa em F2
Dados / Restrições / Parâmetros 5714 / 0 / 389
“Goodness-of-fit” em F2 1.519
Índices R Finais [I>2sigma(I)] R1 = 0.0553, wR2 = 0.1885
Índices R (Todos os Dados) R1 = 0.0670, wR2 = 0.2010
Maior Diferença entre Pico e Buraco 1.302 and -0.901 e.Å-3
51
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