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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTOS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
Sheyla Maria Rondon Caixeta Bonfim Quitinase de Paracoccidioides brasiliensis:
clonagem molecular e análise estrutural, filogenética, expressão e atividade
Orientadora:
Profa. Dra. Maristela Pereira
Dissertação de mestrado
Goiânia-Go, 2005
Quitinase de Paracoccidioides brasiliensis: clonagem molecular e análise estrutural, filogenética, expressão e atividade
_________________________________________________________________Sheyla Maria Rondon Caixeta Bonfim
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
Sheyla Maria Rondon Caixeta Bonfim
Quitinase de Paracoccidioides brasiliensis: clonagem
molecular e análise estrutural, filogenética,
expressão e atividade
Orientadora:
Profa. Dra. Maristela Pereira
Dissertação desenvolvida no
Laboratório de Biologia Molecular, do
Departamento de Ciências Fisiológicas,
da Universidade Federal de Goiás,
como requisito parcial para obtenção de
Título de Mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração
Bioquímica e Biologia Molecular.
Goiânia-Go, 2005
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BBAANNCCAA EEXXAAMMIINNAADDOORRAA
TITULARES:
Profa. Dra. Maristela Pereira
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
Profa. Dra. Maria José Soares Mendes-Giannini
Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP-Araraquara
SUPLENTES:
Prof. Dr. Cirano J. Ulhoa
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
Profa. Dra. Rosália Santos Amorim Jesuíno
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
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Aos meus filhos Mariana e Gabriel
Que eles também possam acreditar que seus
sonhos podem se tornar realidade e com
perseverança lutar para que eles se realizem!
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Ao meu marido Djaniro Júnior
Presença constante em todos os momentos, grande
companheiro e incentivador da realização deste
trabalho.
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Piensa que puedas y podrás
Piensa en grande y tus hechos crecerán
Piensa en pequeño y quedarás atrás
Piensa que puedas y podrás
La batalla de la vida no siempre la gana el hombre
más fuerte
Tarde o temprano el hombre que gana es aquel que
cree poder hacerlo
Piensa que puedas y podrás
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É maravilhoso: amar, viver, sorrir, sonhar!
É maravilhoso Senhor ter tão pouco a pedir, tanto a
agradecer!
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Michael Quoist
À Profa. Dra. Maristela Pereira
Meus sinceros agradecimentos pelo empenho, pelo
espírito de abertura com que coordenou o trabalho e
com quem aprendi a cultivar o amor à pesquisa por
seu exemplo de extrema dedicação!
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS pela oportunidade de realizar este trabalho neste
momento, e por ter convivido com pessoas especiais com as quais eu
aprendi muito!
Aos meus pais Lázaro e Lívia por estarem sempre presentes em todos os
momentos!
À minha família: Djaniro Júnior, Mariana e Gabriel que sempre me
apoiaram e me incentivaram a seguir adiante na realização de um grande
sonho.
Ao meu irmão André, grande amigo e companheiro, pelo incentivo e pela
presença constante!
Às Profas. Célia, Fabrícia, Rosália e Úrsula pelos ensinamentos e preciosas
sugestões que vieram a enriquecer o trabalho.
Aos professores do Curso de Mestrado que contribuíram para o
aprimoramento da minha formação profissional e que sem dúvida
nortearam os rumos para o êxito deste trabalho.
Aos amigos Bruno, Lílian, Moniquinha e Nádia, com os quais dividi
momentos de alegrias e também de tristezas, que fizeram com que nossos
laços de amizade se estreitassem ainda mais!
Às colegas e colaboradoras da equipe: Aline, Cristielly, Ludier Kesser,
Glaciane, Lidiane, Patrícia Kott e Patrícia Zambuzzi.
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A todos os colegas do Laboratório de Biologia Molecular pela colaboração
e ensinamentos.
À Dona Zildete sempre carinhosa, prestativa e zelosa com todos os colegas
que fazem parte do grupo de trabalho do LBM.
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho.
Muito Obrigada!
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SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................14
ABSTRACT................................................................................................................15
I. INTRODUÇÃO.....................................................................................................17
I.1. O FUNGO Paracoccidioides brasiliensis...............................................................17
I.2. A PARACOCCIDIOIDOMICOSE.......................................................................18
I.2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS.................................................................18
I.2.2. EPIDEMIOLOGIA..................................................................................19
I.2.3. PATOGÊNESE E PATOGENIA.............................................................19
I.2.4. TRATAMENTO......................................................................................21
I.3. PAREDE CELULAR..............................................................................................22
I.3.1. ESTRUTURA DA PAREDE CELULAR...............................................22
I.3.2. DIMORFISMO CELULAR.....................................................................23
I.4. ENZIMAS HIDROLÍTICAS DE FUNGOS.........................................................24
I.5. QUITINASES..........................................................................................................25
I.5.1. ASPECTOS GERAIS..............................................................................25
I.5.2. CLASSIFICAÇÃO..................................................................................27
I.5.3. CARACTERÍSTICAS.............................................................................32
I.5.3.1. ESTRUTURA.........................................................................32
I.5.3.2. REGULAÇÃO........................................................................33
I.5.3.3. ATIVIDADE...........................................................................34
I.5.3.4. INIBIDORES..........................................................................36
I.5.4. APLICAÇÕES...........................................................................37
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II. JUSTIFICATIVA...............................................................................................38
III. OBJETIVOS.......................................................................................................40
IV. MANUSCRITO.................................................................................................42
V. PERSPECTIVAS................................................................................................91
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................93
VII. ANEXOS..........................................................................................................117 ANEXO I. PRODUÇÃO CIENTÍFICA DO MESTRADO...........................118
ANEXO II. NORMAS DA REVISTA...........................................................120
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LISTA DE ABREVIATURAS
[α-32P]-dCTP Deoxicitosina trifosfato marcada com fósforo 32 na posição α
bp: base pair - pares de bases
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
DNAse Desoxirribonuclease
EST Expressed Sequence Tags
GlcNac N-Acetilglicosamina
gp43 Glicoproteína de 43 kDa
Kb Kilobases
Kda Kilodaltons
L Litro
MAPK Mitogen-activated protein kinase- Proteína quinase ativada por mitógeno
Mpb Mega pares de bases
Mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
ng Nanograma
ORF Open Reading Frame- Quadro aberto de leitura
Pb Paracoccidioides brasiliensis
PBS Phosphate Buffer Solution
PCM Paracoccidioidomicose
PCR Polimerase Chain Reaction- Reação da Polimerase em Cadeia
pH Potencial hidrogeniônico
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
Ug Micrograma
uL Microlitro
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RESUMO
Um cDNA codificante de uma quitinase (Pbcts1) foi clonado por
rastreamento de uma biblioteca de células leveduriformes de
Paracoccidioides brasiliensis . O cDNA consiste de 1888 pares de bases e
codifica uma ORF de 1218 pares de bases correspondente à uma proteína de
45 kDa com 406 resíduos de aminoácidos. Pbcts1 é composta de duas
assinaturas no domínio catalítico da família 18 e parece pertencer à classe
fungo/bactéria. Análise de Southern Blott indicou que Pbcts1 está em cópia
única. Análise filogenética de Pbcts1 e outras quitinases apontam a
possibilidade de parálogos de várias quitinases estarem agrupados, baseado
em funções especializadas as quais refletem diversos e múltiplos papéis
desempenhados por quitinases de fungos. Análises computacionais revelaram
que Pbcts1 apresenta uma estrutura complexa de domínios que podem
implicar em multifuncionalidade. Embora Pbcts1 não apresente domínio de
ligação à quitina (CBD) e regiões ricas em serina/ treonina/ prolina, o domínio
imunoglobulina tipo C (Igc1) propicia a interação com a cadeia de quitina
durante a catálise. Atividade glicosil hidrolase foi avaliada e os resultados
demonstraram que P. brasiliensis é capaz de produzir e secretar estas enzimas
principalmente durante a transição levedura para micélio. Desta maneira, P.
brasiliensis deve ser capaz de usar quitina como fonte de carbono. Em adição,
Pbcts1 apresenta um domínio Aamy, indicando a possibilidade de atividade
alfa amilase. A presença de um sinal endocítico na proteína deduzida sugere
que ela pode ser secretada por um mecanismo de exportação vesicular não
clássico. A expressão de Pbcts1 em micélio, levedura, durante diferenciação
de micélio para levedura e em células leveduriformes obtidas de ratos
infectados, sugere a relevância desta molécula em P. brasiliensis, elegendo
PbCTS1 como um atrativo alvo de drogas.
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ABSTRACT
A full-length cDNA encoding a chitinase (Pbcts1) was cloned by screening
a cDNA library from the yeast cells of Paracoccidioides brasiliensis. The
cDNA consists of 1888 bp and encodes an ORF of 1218 bp corresponding
to a protein of 45 kDa with 406 amino acid residues. The deduced PbCTS1
is composed of two signature family 18 catalytic domains and seems to
belong to fungal/bacterial class. Southern blot analysis indicated that
Pbcts1 is a single copy. Phylogenetic analysis with PbCTS1 and other
chitinases point to the possibility of paralogous of several chitinases to be
grouped based in specialized functions, which may reflect the multiple and
diverse roles played by fungi chitinases. Computer-based sequence analysis
revealed that PbCTS1 presents a complex structure of domains that could
imply in multi functionality. Although PbCTS1 does not seem to present
chitin-binding domains (CBD) and serine/threonine/proline-rich regions
(STP), the immunoglobulin C-Type domain could propitiate interaction
with the chitin chain during catalysis. Glycosyl hydrolase activity was
evaluated and the results demonstrated that P. brasiliensis is able to
produce and secrete these enzymes mainly during transition from yeast to
mycelium. In this way, P. brasiliensis should be able to use chitin as a
carbon source. In addition, PbCTS1 presents an Aamy domain, indicating
the possibility of alpha amylase activity. The presence of an endocytic
signal in the deduced protein suggests that it could be secreted by a
vesicular nonclassical export pathway. The Pbcts1 expression in mycelium,
yeast, during differentiation from mycelium to yeast and in yeast cells
obtained from infected mice suggests the relevance of this molecule in P.
brasiliensis electing PbCTS1 as an attractive drug target.
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I. INTRODUÇÃO
I.1. O FUNGO Paracoccidioides brasiliensis
Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano
causador da micose sistêmica denominada paracoccidioidomicose (PCM). Sabe-se que
o fungo adapta-se bem em solos úmidos, com pH ácido e ricos em vegetação e matéria
orgânica, em regiões de temperatura moderada com curto período de seca, onde pode
crescer sob a forma miceliana e produzir conídeos (Restrepo 1985).
O fungo cresce como micélio à 23ºC - 25ºC no meio ambiente e como levedura
à 35ºC - 37ºC nos tecidos do hospedeiro (Kanetsuna et al. 1972) caracterizando o
dimorfismo celular. Esse dimorfismo pode ser reproduzido em laboratório através do
cultivo do fungo nas respectivas temperaturas (Salem-Izaac etg al. 1997).
O fungo já foi isolado de animais como o morcego Artibeus lituratus (Grosse
et al. 1965), o macaco Saimiri sciureus (Johnson et al. 1977), o pingüim Pygoscelis
adeliae (Gezuele et al. 1989) e o tatu Dasypus novemcinctus (Silva-Vergara et al. 1999).
A relação entre o fungo e o meio ambiente não está totalmente definida, apesar do seu
isolamento de solo do Brasil (Silva-Vergara et al. 1998), da Argentina (Negroni et al.
1966) e da Venezuela (Albornoz et al. 1971). P. brasiliensis isolados do tatu têm sido
analisados quanto à virulência (Peracoli et al. 1999), antigenicidade e aspectos
moleculares (Sano et al. 1999) evidenciando a similaridade entre eles. Embora o P.
brasiliensis tenha sido isolado do solo, do trato digestivo e das fezes de alguns animais,
seu habitat natural ainda permanece desconhecido (Lacaz et al. 1999) devido à
dificuldade de um número maior de isolamentos.
A caracterização genômica de diferentes isolados do fungo tem sido possível
através da utilização da técnica de eletroforese em gel de pulso alternado PGFE (“Pulse
Field Gel Electroforesis”) (Feitosa et al. 2003). Alguns isolados apresentam um padrão
de quatro bandas cromossomais variando entre 2-10 Mpb, embora outros apresentem
variações entre 23.0-27.6 Mpb. Ainda, a microfluorimetria por microscopia confocal
indicou o conteúdo de DNA de P brasiliensis como sendo de 45.7 a 60,9 Mpb (Cano et
al. 1998). Montoya et al. (1999) estimaram que o tamanho estaria entre 23-31 Mpb,
indicando a presença de 10.000 a 15.000 genes dispostos em 4-5 cromossomos,
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evidenciando que significativas diferenças têm sido relatadas em relação ao tamanho do
genoma apresentado pelo fungo.
O fungo foi inicialmente caracterizado por Almeida (1930) como sendo do
gênero Paracoccidioides e da espécie brasiliensis. Atualmente o fungo P. brasiliensis é
classificado como pertencente ao reino Fungi, ao filo Ascomycota, à ordem Onygenales,
à família Onygenaceae, ao gênero Paracoccidioides e à espécie brasiliensis (San-Blas et
al. 2002).
I.2. A PARACOCCIDIOIDOMICOSE
I.2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Inicialmente descrita por Adolpho Lutz em 1908, a PCM causa a morte em
homens adultos, trabalhadores da área rural, em idade produtiva, de camada social de
baixa renda e pacientes com deficiência imunológica (Coutinho et al. 2002). Essa
doença é mais freqüente em indivíduos do sexo masculino, sendo que os baixos índices
de casos na população feminina são atribuídos ao efeito inibitório do hormônio 17 β-
estradiol na transição micélio-levedura. A apresentação clínica e o curso da infecção
dependem do paciente e do isolado e o aparecimento de lesões secundárias nas mucosas,
pele, linfonodos e glândulas adrenais é freqüente (Restrepo-Moreno 1993).
A infecção no hospedeiro humano geralmente ocorre pela inalação de
microconídeos, os quais alcançam o epitélio alveolar pulmonar onde se transformam na
forma parasitária de levedura podendo disseminar-se para outros órgãos (Restrepo et al.
2001).
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I.2.2. EPIDEMIOLOGIA
A PCM é uma micose endêmica com alta prevalência na América Latina
(Franco et al. 1987) onde se estima que cerca de dez milhões de pessoas estejam
infectadas, embora somente cerca de 2% apresentam predisposição para desenvolver a
doença (McEwen et al. 1995). Dados epidemiológicos indicam uma distribuição que se
extende desde o México até a Argentina (San-Blas et al. 2002). A distribuição da PCM
é heterogênea e os países que se destacam por apresentar o maior número de casos
relatados são o Brasil, Colômbia e a Venezuela. No Brasil, as regiões Sul, Sudeste e
Centro-Oeste apresentam maior incidência, apresentando o estado de Goiás os maiores
números de casos (Wanke & Londero 1994).
Coutinho et al. (2002) avaliaram 3.181 óbitos por PCM no Brasil no período de
1980 a 1995. Esta micose mostrou grande magnitude, destacando-se como a oitava
causa de mortalidade entre as doenças predominantemente crônicas e como a detentora
da maior taxa de mortalidade entre as micoses sistêmicas. A taxa de mortalidade média
anual foi de 1.45/milhão de habitantes, sendo que a região Sul apresentou maior taxa
seguida da região Centro-Oeste, a qual apresentou tendência à ascensão. O estudo
mostrou que a taxa de mortalidade pode ser considerada como indicador para definir a
doença como importante agravo de saúde no Brasil. A doença prevaleceu como
endêmica nas áreas não metropolitanas, onde a proporção homens/mulheres foi de 562
homens/100 mulheres acometidos. O grupo etário entre 30-59 anos foi o mais atingido,
seguido dos pacientes com 60 anos ou mais. A taxa de mortalidade predominou em
indivíduos do sexo masculino, com 84,75% dos óbitos. Blotta et al. (1999) relataram
que a incidência de PCM na infância está em torno de 5% e o tipo adulto de PCM
totaliza 90% dos casos relatados.
I.2.3. PATOGÊNESE E PATOGENIA
A PCM é uma doença granulomatosa caracterizada pela formação de
aglomerados de células epiteliais com áreas centrais de necrose e agregados de
leucócitos polimorfonucleares. Evidências indicam que o granuloma está intimamente
relacionado à resposta imune do hospedeiro e deve representar uma resposta tecido-
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específica ao fungo na tentativa de destruí-lo e prevenir a sua multiplicação (De Brito et
al. 1994).
A inalação de propágulos do fungo pelo hospedeiro humano é a principal via de
entrada do parasita (Lacaz et al. 1991) propiciando o início da infecção pelos pulmões e a
disseminação para outros órgãos através dos linfonodos e da corrente sanguínea. No
homem, micélios ou conídeos se convertem em leveduras, que se reproduzem por
brotamentos múltiplos ou simples, nos tecidos infectados, sendo fagocitados por
macrófagos (Brummer et al. 1989). A fase leveduriforme sintetiza moléculas antigênicas
que são capazes de interagir com o sistema imune do hospedeiro e contribuir para a
patogênese da doença. Dessa maneira, o processo de transição é o primeiro requerimento
para o estabelecimento da PCM no hospedeiro (Lacaz et al. 1991).
A maioria dos indivíduos infectados desenvolve a forma assintomática ou
subclínica, a qual progride para doença com uma diversidade de formas clínicas em função
de fatores do hospedeiro, níveis de virulência das linhagens e condições ambientais (San-
Blas et al. 2002). Duas formas da doença são reconhecidas: a forma sub-aguda ou aguda e a
forma crônica. As formas disseminada sub-aguda e pulmonar aguda têm sido descritas
como a forma juvenil encontrada em crianças. As formas disseminada e pulmonar crônica
têm sido encontradas em adultos jovens (Franco et al. 1987).
As manifestações clínicas da PCM são classificadas em duas formas polares
principais (Franco et al. 1994). A forma polar positiva é caracterizada pela presença de
lesões generalizadas, pelo elevado título de anticorpos específicos aos antígenos de P.
brasiliensis, imunidade celular enfraquecida e presença de reação inflamatória
granulomatosa, contendo muitos fungos viáveis. Na forma polar negativa, as lesões são
localizadas, o título de anticorpos específicos ao P. brasiliensis é baixo ou ausente, a
imunidade celular é preservada e as lesões granulomatosas são compactas e com baixo
número de fungos. Ambas formas clínicas da doença estão associadas com extensas
seqüelas mediadas por infecções sistêmicas, incluindo lesões e uma resposta anormal
mediada por células.
Assim, as formas severas da doença com intenso envolvimento de vários
órgãos com lesões progressivas conduzem à morte, podendo ser acompanhadas por
perda gradual de respostas imunes celulares específicas e títulos altos de anticorpos
específicos. As formas moderadas da doença, apresentando poucas lesões localizadas,
conduzem à cura e paralelamente mantêm as respostas imunes e baixos níveis de
anticorpos específicos (Fava- Netto 1995).
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I.2.4 TRATAMENTO
O tratamento de PCM é prolongado, sendo que os pacientes recebem terapia
entre um e dois anos, e na ausência de terapia a doença pode ser fatal.
Alguns antifúngicos estão disponíveis comercialmente, com atuação a nível de
envelope celular (parede e membrana plasmática) e particularmente de esteróis que
compõem a membrana do fungo: ergosterol e a sua biossíntese. As drogas antifúngicas
correntes têm sido os polienos e os azoles.
A anfotericina B tem sido o principal polieno administrado sistematicamente
para tratar infecção visceral. Ela atua através da ligação ao ergosterol prejudicando as
funções da membrana, causando o extravazamento de conteúdos celulares e
apresentando alta toxicidade para células de mamíferos, principalmente nefrotoxicidade
(Odds et al. 2003).
Avanços recentes foram obtidos no desenvolvimento da terceira geração de
azoles (Tkacz & Didomenico 2001). Os azoles, posaconazole, ravuconazole e
voriconazole, apresentam como principal efeito a inibição da demetilação do lanosterol
em ergosterol durante o mecanismo de biossíntese. Voriconazole e ravuconazole são
relacionados ao fluconazol, que é um agente antifúngico com desejáveis propriedades
farmacológicas (Hahn et al. 2000), e que de acordo com testes de susceptibilidade,
demonstrou ser mais eficaz in vivo do que in vitro (Kurita et al. 2003). Atualmente o
cetoconazol e o itraconazol têm sido as drogas de escolha.
Em 2001 -pela primeira vez em trinta anos- um membro de uma nova classe de
drogas terapêuticas antifúngicas, caspofungina ingressou na clínica. A caspofungina
pertence à classe das equinocandinas (anidulafungina, caspofungina e micafungina) que
inibem a síntese de polissacarídeos da parede celular como a β-1,3 glucana (Denning 2002).
As limitações terapêuticas das duas classes de drogas antifúngicas correntes,
polienos e azoles, os quais apresentam toxicidade e um limitado espectro de eficácia,
respectivamente, e o aumento de incidência de infecções fúngicas ameaçadoras
(Georgopapadakou & Tkacz 1995), bem como o surgimento de isolados clínicos
resistentes a drogas (Rex et al. 1994) tem se tornado preocupante. Entretanto, pela
impossibilidade de dar ampla cobertura a resistência a drogas e prover tratamentos mais
eficazes e seguros de infecções fúngicas, novas abordagens para identificação e
desenvolvimento das mesmas se faz necessário.
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I.3. PAREDE CELULAR
A parede celular está envolvida em vários processos vitais para a célula, tais
como crescimento vegetativo, morfogênese, divisão celular, secreção de
macromoléculas e proteção contra alterações osmóticas e tem servido como aparato
através do qual a informação extracelular é transmitida e integrada nos processos
intracelulares (Qadota et al. 1996).
A parede celular está em contato com células do hospedeiro e atua como
reservatório de moléculas como antígenos e enzimas, que têm um papel ativo durante a
infecção (Latgé 1999). Estudos sugerem que a parede celular é uma estrutura dinâmica
onde polímeros constitutivos são continuamente modificados e rearranjados durante a
biossíntese (Popolo et al. 2001); os mecanismos de biossíntese têm sido reconhecidos
como específicos alvos para drogas capazes de bloqueiar a síntese de componentes da
parede sem interferir em qualquer outro processo metabólico do hospedeiro.
I.3.1. ESTRUTURA DA PAREDE CELULAR
Os principais constituintes da parede celular de ambas as formas miceliana e
leveduriforme do fungo P. brasiliensis são quitina, glucanas e proteínas. A parede de
micélio tem uma grande concentração de proteínas (24 a 41%) quando comparada com
células leveduriformes (7 a 14%) (Kanetsuna et al. 1969). O principal polissacarídeo da
parede celular de leveduras de P.brasiliensis é a α-glucana, enquanto que em micélio
são as β-glucanas e as galactomananas (aproximadamente 6%). As α-glucanas de
leveduras contêm pequenas concentrações de ligações glicosídicas α-1,3 ou α-1,6,
sendo que as β-glucanas de micélio contêm ligações glicosídicas β-1,3. Estudos de
microscopia eletrônica têm mostrado que em micélio a parede celular apresenta uma
única camada contendo quitina e β-glucana (Carbonell & Rodriguez 1968) enquanto
que foram observadas três camadas em levedura; a camada interna é formada de β-
glucana e a externa de α-glucana (Carbonell 1972).
Esse estudo possibilitou a identificação de genes envolvidos no metabolismo
da parede celular de P. brasiliensis. Entre eles estão as sintases (β-1,3 glucana sintases,
α-1,3 glucana sintases e quitina sintases) e as enzimas envolvidas na remodelagem da
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parede celular (manosiltransferases e hidrolases). A rede de laboratórios da região
Centro Oeste do Brasil desenvolveu o projeto Genoma EST entitulado"Genoma
Funcional e Diferencial de P. brasiliensis" (http:/www.biomol.unb.br/Pb) com o
principal objetivo de gerar informações sobre o transcriptoma das fases de micélio e
levedura deste fungo, onde 3938 ESTs e 1040 genes dos transcriptomas foram anotados
(Felipe et al. 2003).
A parede celular apresenta um papel essencial na patobiologia de P.
brasiliensis. As mudanças morfogenéticas estão diretamente associadas com o ciclo de
vida deste fungo gerando um rearranjo molecular (Da Silva et al. 1994). Os
polissacarídeos da parede celular α-1,3-glucana e β-1,3-glucana têm sido sugeridos
como possíveis fatores de virulência durante a transição dimórfica de P. brasiliensis,
pois um baixo conteúdo de α-1,3-glucana na parede celular de leveduras tem sido
correlacionado com baixa virulência (San-Blas et al. 1994). Em adição, o cultivo, in
vitro, de isolados de P. brasiliensis por um longo período de tempo leva à perda da
virulência e a um baixo conteúdo de α-1,3 glucana na parede celular (San-Blas et al.
1994). A α-1,3 glucana presente na superfície pode atuar como uma camada de
proteção contra mecanismos de defesa do hospedeiro devido à incapacidade de células
fagocíticas do hospedeiro em digerirem a α-1,3 glucana (San-Blas et al. 1994).
A transição dimórfica do P. brasiliensis ocorre simultaneamente com
mudanças na composição da parede celular, envolvendo alterações estruturais nos
polímeros de carboidratos (San-Blas et al. 1994) e reorganização dos lipídeos de
membrana, especialmente glicoesfingolipídeos (Toledo et al. 1999). Quando o fungo
adota a forma leveduriforme, o aumento do conteúdo de quitina é observado na parede
celular seguido por alteração na estrutura anomérica da glucana de um polímero de β-
1,3 para α-1,3 (San-Blas & Niño Vega 2002).
I.3.2. DIMORFISMO CELULAR
O termo dimorfismo refere-se à habilidade apresentada por alguns fungos
patógenos como H. capsulatum, Blastomyces dermatitidis e P. brasiliensis de
apresentarem mudanças reversíveis entre as formas miceliana e leveduriforme . Em P.
brasiliensis este processo de diferenciação é reversível e dependente da regulação da
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enzima glucana sintase levando à produção de β-1,3 glucanas na fase miceliana e α-1,3
glucanas na fase leveduriforme (San-Blas 1993).
Embora a base molecular do dimorfismo de P. brasiliensis ainda permaneça
desconhecida, vários genes expressos diferencialmente nas fases leveduriforme e
miceliana deste fungo (Costa et al. 2002, Felipe et al. 2005). A identificação de genes
diferencialmente expressos necessários para a transição dimórfica é de suma
importância para o melhor entendimento a cerca dos eventos decorrentes do
estabelecimento da infecção e doença (Hensel et al. 1996).
No intuito de entender os mecanismos de controle morfogenético,
pesquisadores têm estudado a estrutura da parede celular, processos metabólicos e
cascatas de sinalização, além de utilizar métodos clássicos para detecção enzimática e
quantificação bioquímica de uma grande variedade de metabólitos. Estudos têm
revelado que os mecanismos de sinalização celular que regulam a patogenicidade são
controlados por AMPc (Adenosina monofosfato cíclico) e MAPK (Proteína quinase
ativada por mitógeno), visto que o AMPc exógeno inibe a transição levedura-micélio,
mantendo a forma patogênica do fungo (Borges-Walmsley et al. 2000). Drogas
inibidoras do mecanismo de sinalização cálcio/calmodulina foram capazes de inibir a
transição micélio-levedura de P. brasiliensis, sendo que a calmodulina se liga ao cálcio
alterando sua conformação e participando na diferenciação do fungo P. brasiliensis
(Carvalho et al. 2003).
I.4. ENZIMAS HIDROLÍTICAS DE FUNGOS
As enzimas hidrolíticas glucanases, quitinases e N-acetyl-β-D-
glicosaminidases (NAGs) têm sido associadas à patogenicidade e virulência (Kurokawa
et al. 1998), podendo estar associadas também à manutenção da estrutura da parede
celular (Gow et al. 1993) e morfogênese de fungos durante o crescimento apical, divisão
e diferenciação celulares (Isaac & Gokhale 1982), bem como na liberação de esporos
(Papavizas 1985) e elongamento de hifas (Kuranda & Robbins 1991). As enzimas
hidrolíticas são responsáveis pelo afrouxamento da estrutura da parede celular (Wessels
1988). A maioria das hidrolases caracterizadas apresentam atividade de quitinase, de
glucanase e também de transglicosilase estando envolvidas na remodelagem da parede
celular durante o crescimento e morfogênese, bem como contribuindo para a digestão e
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utilização de quitina exógena como fonte de nutrientes orgânicos para produção de
energia e biossíntese.
De acordo com a nomenclatura sugerida por Sahai et al. (1993), as enzimas
quitinolíticas são divididas em dois principais tipos: as quitinases (EC 3.2.1.14) que
podem ser endoquitinases ou exoquitinases e NAGs (EC 3.2.1.30). Endoquitinases são
definidas como enzimas que catalizam a hidrólise randômica de ligações β-1,4 de N-
acetilglicosamina (GlcNac) produzindo produtos solúveis como quitotetraose,
quitotriose e diacetilquitobiose. Exoquitinases podem ser sub-divididas em duas sub-
categorias: quitobiosidases que catalizam a liberação progressiva de diacetilquitobiose
do final não redutor da cadeia de quitina (Harman et al. 1993) e NAG que hidroliza
quitobiose ou libera N-β-D-acetilglicosamina do polímero de quitina.
A quitina, um polissacarídeo de N-acetilglicosamina (GlcNac) unidas por
ligações glicosídicas tipo β 1-4, é um componente estrutural da parede celular de
fungos e de exoesqueleto de invertebrados, como insetos e crustáceos (Flach 1992),
sendo considerado o segundo mais abundante biopolímero natural depois da celulose
(Haki et al. 2003). A manutenção da parede celular envolve a ação coordenada de
síntese (quitina sintases) e hidrólise (quitinases), sendo que o equilíbrio deve ser
regulado para manter a plasticidade durante o crescimento celular e separação das
células mãe e células filhas (Martín-Cuadrado et al. 2003). As enzimas quitina sintase e
quitinase apresentam-se reguladas durante a transição levedura-micélio em C. albicans
como mostrado por Selvaggini et al. (2004).
I.5. QUITINASES
I.5.1. ASPECTOS GERAIS
As quitinases são enzimas que hidrolizam a quitina a oligossacarídeos através
da clivagem de ligações glicosídicas entre os carbonos C1 e C4 de GlcNac consecutivas
presentes no polímero de quitina. Essas enzimas estão amplamente dispersas na
natureza e têm sido encontradas em uma grande variedade de organismos, incluindo
plantas (Mitsunaga et al. 2004) bactérias (Yuli et al. 2004), fungos (Selvaggini et al.
2004), algumas classes de invertebrados, como insetos e parasitas (Ramalho-Ortigão et
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al. 2003), vertebrados (Suzuki et al. 2001) e até mesmo em organismos que não
produzem quitina (Watanabe et al. 1999).
Em plantas, as quitinases atuam na defesa contra fungos patogênicos que
contêm quitina (John 1997), inibindo crescimento de fungos e gerando oligossacarídeos
que atuam como elicitores, moléculas-sinal que regulam o crescimento e
desenvolvimento em plantas (Kasprzewska 2003). Em Dioscorea opposita Thunb a
presença de uma seqüência de aminoácidos C-terminal envolvida no endereçamento
para vacúolos intracelulares, pode auxiliar no entendimento do mecanismo de defesa
associado à proteólise (Mitsunaga et al. 2004).
As bactérias produzem várias quitinases, provavelmente para hidrolizar a
diversidade de moléculas de quitina encontradas na natureza e utilizá-la como fonte de
carbono, sendo expressas diferencialmente em função da disponibilidade de nutrientes
no ambiente (Svitil et al. 1997). As quitinases de bactérias têm sido isoladas de
Enterobacter sp. (Park et al. 1997), Clostridium paraputrificum (Morimoto et al. 1997),
Streptomyces thermoviolaceus (Tsujibo et al. 1998), Streptomyces sp. (Patil et al. 2000),
Chromobacterium violaceum (Chernin et al. 1998), Bacillus sp. (Yuli et al. 2004),
Vibrio fuernisii e Vibrio cholerae (Li et al. 2004).
Em fungos, a quitinase atua na degradação da parede celular (Kitamura et al.
2002), atuando no crescimento de hifas, diferenciação em esporos, assimilação de
quitina e micoparasitismo (Gooday et al. 1997) como demonstrado em Gliocladium
virens, Aphanocladium album e Trichoderma spp. (Di Pietro et al. 1993).
Em insetos, a quitina associa-se a proteínas para formar a cutícula do
exoesqueleto e matriz peritrófica, a qual contém uma mistura de glicosaminoglicanos,
glicoproteínas e quitina (Lehane et al. 1996). A matriz peritrófica serve como barreira
contra patógenos (Shahabuddin et al. 1996), além de atuar na digestão em insetos
hematófagos (Shao et al. 2001) e também como substrato para a ligação do grupo heme
como ocorre em Aedes aegypti (Pascoa et al. 2002). As quitinases são importantes na
degradação da matriz peritrófica do intestino de insetos por permitir uma absorção
eficiente de nutrientes. Em crustáceos essa localização da quitinase permite a
degradação parcial do seu exoesqueleto durante o desenvolvimento, através de um
mecanismo de controle hormonal (Spindler-Barth 1993).
Estudos moleculares têm mostrado a presença de genes de quitinases
caracterizados de uma variedade de parasitas eucariotos incluindo Plasmodium
(Shahabuddin et al. 1999), o nematoda Brugia malayi (Fuhramn et al. 1992) e
Leishmania (Shakarian et al. 1998). É interessante ressaltar que as quitinases secretadas
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por parasitas como Plasmodium falciparum (Vinetz et al. 1999) e Plasmodium
gallinaceum (Vinetz et al. 2000) estão associadas com a ruptura da matriz peritrófica.
Em vertebrados, as quitinases são encontradas no trato digestivo, participando
do metabolismo de carboidratos (Boot et al. 2001). Em mamíferos, a quitinase
quitotriosidase está presente no soro humano e em macrófagos (Boot et al. 1995), sendo
secretada em mamíferos conforme mostrado em trabalhos de Suzuki et al. (2001). A
enzima quitotriosidase é um membro da família de quitinases capaz de hidrolizar
quitina. Embora apresente homologia com outras quitinases de plantas, bactérias,
fungos, nematodas e insetos; esta enzima é utilizada como marcador de ativação em
doenças como Gaucher e é particularmente aumentada em indivíduos com
arteriosclerose (Hollak et al. 1994).
I.5.2. CLASSIFICAÇÃO
As quitinases são enzimas que pertencem à superfamília das glicosilhidrolases
e apresentam-se distribuídas em duas famílias, 18 e 19, de acordo com a homologia
existente entre as seqüências de aminoácidos e diferenças nos mecanismos de reação
(Brameld & Goddard III 1998) (Tabela 1).
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A família 18 tem sido encontrada em bactérias, fungos, animais e plantas das
classes III e V. O domínio catalítico da família 18 apresenta uma estrutura em forma de
α/β 8- TIM BARRIL (Hollis et al. 2002), hidroliza as pontes glicosídicas, produzindo
fragmentos ß-anoméricos (Iseli et al. 1996), apresenta sensibilidade a alosamidina e
possui a seqüência consenso característica DXDXE, com exceção da glicoproteína
humana GP39 (Hakal et al. 1993), da lecitina concanavalina B isolada da planta
Canavalia ensiforms (Henning et al. 1995) e de fatores de crescimento dependentes de
insulina em Drosophila melanogaster (Kawamura et al. 1999).
A catálise assistida pelo substrato é o modelo aceito para o mecanismo
catalítico da família 18 (Brameld et al. 1998) o qual envolve resíduos conservados no
motivo DXDXE e o grupo N-acetil do açúcar. Vaaje-Kolstad (2004) propõe o seguinte
modelo descrito na Figura 1: A- ligação do substrato, B- distorção do substrato e
protonação da ligação glicosídica e ataque nucleofílico do grupo N-acetil no carbono
anomérico, C- formação do intermediário íon oxazolinium e partida do grupo, sendo
que uma molécula de água é destinada a hidrólise do íon; é dirigida ao carbono
anomérico. A catálise é denominada ácida porque depende de um grupo ácido que
posiciona-se próximo ao domínio catalítico. Em C. immitis experimentos de mutagênese
sítio-dirigida demonstraram que o resíduo Glu171 é o grupo ácido catalítico (Hollis et
al. 2000).
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Fig. 1 Mecanismo catalítico das glicosil hidrolases da família 18. A figura mostra o seguinte mecanismo A- Ligação ao substrato B- Distorção do substrato e protonação da ligação glicosídica C- Formação do íon intermediário oxazolinium e partida do grupo .
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Na família 19 estão incluídas as quitinases de plantas das classes I, II e IV
(Neuhaus et al. 1996), bactérias do gênero Streptomyces sp (Saito et al. 1999),
Streptomyces griseus (Ohno et al. 1996) e Aeromonas sp. (Ueda et al. 2003). A presença
dessas quitinases em bactérias tem sido atribuída a uma possível transferência vertical
desses genes provenientes de plantas superiores durante associação em um mesmo
habitat (Watanabe et al. 1999).
A classificação das quitinases de plantas é baseada na estrutura do domínio
catalítico e no mecanismo de ação. Entretanto algumas informações adicionais têm sido
feitas. As classes I e IV de plantas possuem um domínio com core altamente conservado
situado na região N-terminal rico em cisteína envolvido na ligação ao substrato, seguido
de peptídeo sinal (Shinshi et al. 1990). As quitinases da classe IV são menores que as da
classe I. As da classe III homólogas às da classe I e as da classe II são homólogas às da
classe I e IV, mas não apresentam o domínio rico em cisteína.
De acordo com análises da estrutura cristalográfica de enzimas da família 19,
estas apresentam um alto conteúdo α- hélice com core conservado em seu domínio
catalítico (Monzingo et al. 1996). O mecanismo de hidrólise envolve inversão com
produção de fragmentos α-anoméricos (Ohno et al. 1996) utilizando um mecanismo
catalítico ácido-básico (Garcia-Casado et al. 1998). O resíduo Glu 315 tem sido
identificado como o resíduo doador de prótons envolvidos na catálise e apresenta-se
conservado em domínios catalíticos da família 18. Em Clostridium paratrificum, este
resíduo Glu é conservado como Glu 184 (Morimoto et al. 1997).
O sequenciamento do genoma de A. fumigatus, A. nidulans e C. immitis
permitiu identificar um grande número de genes que codificam quitinases. As quitinases
foram classificadas como quitinases fungo/bactéria devido à similaridade encontrada em
relação às quitinases de bactérias, com massa molecular de aproximadamente 46-48
kDa e não apresentando papel morfogenético. As quitinases fungo/planta similares
àquelas descritas em plantas apresentaram massa molecular de 83-97 kDa atuando
durante o crescimento e morfogênese (Jaques et al. 2003).
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I.5.3. CARACTERÍSTICAS
I.5.3.1 ESTRUTURA
Uma das principais características observadas em quitinases de vários
organismos é a presença de uma arquitetura em multidomínio, que inclui um domínio
catalítico, um domínio rico em serina-treonina glicosilado e um domínio de ligação à
quitina rico em cisteína (Yan et al. 2002).
O domínio catalítico está envolvido na catálise da hidrólise de ligações
glicosídicas e o domínio de ligação ao polissacarídeo é responsável pela mediação da
ligação da enzima ao substrato. Entretanto, alguns organismos, como o inseto Glossina
morsitans morsitans não apresentam o domínio rico em serina-treonina (Yan et al.
2002).
O domínio catalítico das quitinases da família 18 apresenta uma estrutura em
forma de α/β 8- TIM BARRIL em Vibrio carchariae (Suginta et al. 2004) e em C.
immitis (Hollis et al. 2000) além de apresentarem a seqüência característica DXDXE, de
acordo com análises de similaridades estruturais entre eles.
O domínio de ligação à quitina deve definir a localizacão da enzima na parede
celular (Kuranda et al. 1991). Algumas enzimas de fungos possuem este domínio
(Kuranda et al. 1991) enquanto que outras não possuem (Hayes et al. 1994). Em
mamíferos a ausência deste domínio não impede a hidrólise do substrato solúvel, mas
leva à perda da capacidade de hidrólise de quitina insolúvel (Tjoelker et al. 2000). As
quitinases de nematodas e insetos têm como função ancorar a enzima ao substrato
facilitando o processo de hidrólise. Essa capacidade é dada pela presença de um
domínio rico em cisteína na região C-terminal (Barry et al. 1999).
Variações na estrutura usual já descrita para quitinase podem ocorrer, como a
estrutura apresentada por Tenebrio molitor em que a análise da seqüência mostrou cinco
unidades de quitinase de aproximadamente 480 aminoácidos com similaridade às
quitinases da família 18. Estas unidades são separadas por regiões menos conservadas
contendo seqüências ricas em prolina, ácido glutâmico, serina e treonina, domínios de
ligação à quitina e domínios de ligação à mucina (Royer et al. 2002). Essas quitinases
estão envolvidas na lise de mucina, uma glicoproteína de alto peso molecular, sendo
80% deste determinado por carboidratos, com a função de fornecer energia para o
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metabolismo de parasitas. Este fato também pode ser observado em Trichomonas
vaginalis (Loiseau et al 2002).
A organização estrutural de quitinases (Sasaki et al.2002) define-se por
módulos em função da associação dos domínios e sub-sítios catalíticos de acordo coma
família. Embora sejam bactérias, as Aeromonas sp, pertencentes à família 19, possuem
quitinases com sub-sítios característicos da família 18, definindo um novo tipo de
quitinase da família 19 com propriedades estruturais e funcionais (Ueda et al. 2003).
As quitinases das classes I e IV de plantas apresentam peptídeo sinal de
direcionamento extracelular (Shinshi et al. 1990). Em Vibrio cholerae este peptídeo
sinal está localizado entre os aminoácidos 75 e 555 (Folster et al. 2002). Em
Onchocerca volvulus (Wu et al. 2003), Entamoeba histolytica (Ghosh et al. 1999), Bufo
japonicus (Oshima et al. 2002), Glossina morsitans morsitans, Heterodera glycines
(Gao et al. 2002) e Sacccharomyces cerevisae (Kuranda &Robbins 1991) o número de
aminoácidos que compõem este domínio varia de 12 a 24. A quitinase de Trichoderma
harzianum possui dois peptídeos, sendo um com 22 aminoácidos e outro com 12
aminoácidos (Garcia et al. 1994).
I.5.3.2 REGULAÇÃO
A síntese e a hidrólise de quitina são processos regulados durante a transição
levedura-micélio em fungos dimórficos. Em Candida albicans a enzima mostra-se ativa
na fase leveduriforme (Selvaggini et al. 2004).
Em fungos, os genes de quitinase são induzidos na presença de quitina e
reprimidos na presença de glicose (Mach et al. 1999). Este comportamento tem sido
descrito para quitinases de Aphanocladium álbum (Blaiseau et al. 1992), Trichoderma
harzianum (Carsolio et al 1999), Streptomyces thermoviolaceus (Tsujibo et al 1998) e
Enterobacter sp. Neste último, uma seqüência localizada na porção acima da região
promotora está envolvida na regulação do gene de quitinase (Park et al. 1997). A
regulação da expressão dos maiores genes de quitinase ech42 e nag1 de T. harzianum
foi avaliada e significante expressão de ech42 foi observada após prolongada limitação
de fontes de carbono (Mach et al. 1999).
Vários genes de quitinase têm sido isolados de linhagens de S. cerevisae,
Trichoderma spp., Metahirzium anisopliae, Histoplasma capsulatum, T. harzianum e os
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níveis de expressão, bem como condições limitantes in vivo e in vitro (Baek et al. 1999)
têm sido avaliados. A expressão de quitinase e os seus efeitos na morfologia da levedura
de S. pombe foram mostrados por Shimono et al. (2002), indicando que o sistema de
expressão é eficiente pela presença de um gene regulador Ace2p que controla a
produção de pseudohifas.
As bactérias sintetizam uma grande variedade de enzimas quitinolíticas, dentre
elas duas endoquitinases presentes em C. violaceum reguladas por um sistema de
“quórum-sensing” induzido por AHL (N-acyl homoserine lactone), que apresenta-se
como uma molécula sinal capaz de controlar a produção enzimática de quitinase
(Chernin et al. 1998). Em Pseudomonas aeruginosa o mesmo sistema regula a
produção de quitinase no sobrenadante do filtrado celular (Thompson et al. 2001).
I.5.3.3 ATIVIDADE
A atividade enzimática das quitinases tem sido avaliada através de métodos de
detecção que incluem ensaios colorimétricos (Reissig et al. 1955), ensaios radioativos
(Molano et al. 1977), detecção direta utilizando a eletroforese em gel de poliacrilamida
(Pan et al. 1991), HPLC-Cromatografia Líquida de Alta Performance (Koga et al. 1999)
e espectroscopia (Roberts et al. 1994).
Um método típico para avaliar a atividade de quitinases e que permite selecionar
microrganismos quitinolíticos, envolve a incubação com o substrato e a quantificação
colorimétrica de quitooligossacarídeos produzidos pela reação diagnóstica com ácido
dinitrosalicílico (DNAS) e que se baseia na avaliação de açúcares redutores liberados
(Monreal & Reese 1969). Esta técnica apresenta pouca sensibilidade e não é facilmente
aplicável a microrganismos fracamente quitinolíticos.
O uso de quitina coloidal como substrato marcada com Remazol brilhante (CC-
RBB) tem melhorado a detecção e aumentado a sensibilidade por apresentar
solubilidade mais rápida, ausência de toxicidade para microrganismos podendo ser
utilizado como fonte de carbono e indutor de quitinases em meio de cultura (Ramirez
et al. 2004).
A quitinase extracelular produzida hidroliza o substato, liberando
proporcionalmente o substrato corado que não foi utilizado, o qual é dosado em
espectrofotômetro (Ramírez et al. 2004). As quitinases secretadas também podem ser
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detectadas utilizando um substrato fluorescente 4-Methylumbelliferil sintético (4-MU),
como mostrado para quitinases de G. morsitans morsitans (Yan et al. 2002), Aspergillus
fumigatus (Overdijk et al. 1999) e em Pseudomonas aeruginosa (Thompson et al. 2001).
O método mais recente é baseado na associação de outras substâncias ao
substrato ligado ao calcofluor. Este método foi utilizado para avaliação da atividade
enzimática em plantas (Velasquez et al. 2004). Um outro método, o qual utiliza quitina
azure como substrato apresenta vantagens com relação`a linearidade apresentada pelos
resultados detectados (Guo et al. 2004).
Como já foi descrito, as quitinases podem apresentar atividade de
endoquitinase, exoquitinase e de transglicosilação. Kang et al. (1999) detectaram uma
quitinase de Metahirzium anisopliae com atividade endo e exo, baseado na degradação
de oligômeros de quitina e vários compostos químicos. O polímero de quitina foi
utilizado como substrato para detectar a atividade endo e a enzima purificada exibiu alta
atividade quitinolítica em presença do substrato Pnp-nag2, indicando que esta enzima
tem uma caraterística de quitobiase (exoquitinase). Em Aspergillus fumigatus foi
identificada uma quitinase que possui atividade de endoquitinase, exoquitinase e
transglicosilase com um único modo de ação (Xia et al. 2001).
As quitinases e as quitinas sintases estão associadas com N-
acetilglicosaminidases formando um sistema integrado triplo que parece estar envolvido
na extensão apical e ramificação da levedura (Rast et al. 2000). Um pequeno número
destas hidrolases deve ser necessário para modificações da parede celular em
organismos que apresentam dimorfismo como mostrado em S. cerevisae que contém
somente dois genes de quitinases CTS I e CTS2 (Giaver et al 2002) e em C. albicans
que contém quatro ou cinco genes de quitinases. Além disso, pode haver uma interação
de enzimas hidrolíticas como quitinases e glucanases que podem atuar sinergisticamente
envolvendo diferentes isoformas de quitinases e ß-1,3 glucanases como demonstrado
em Nicotiana tabacum (Buurlage et al. 1993).
As quitinases de microrganismos apresentam termoestabilidade, pois após três
horas a 60°C as mesmas se encontram ativas (Yuli et al. 2004, Wen et al. 2002). Em A.
fumigatus essa condição é explicada pela presença de 10,22% de leucina em sua
composição (Xia et al. 2001).
A quitinase de P. aeruginosa 385 é constitutiva e dosagens da atividade
quitinolítica mostraram uma maior atividade no citoplasma (66%), do que em frações de
membrana (2%). Nenhuma atividade foi verificada no meio de cultura, indicando que a
enzima não é secretada (Loiseau et al.2002). Sabe-se que esta bactéria possui um
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sistema regulador “quórum-sensing” que controla a secreção mas não a produção
enzimática. Este fato pode ser explicado pela ausência nesta linhagem deste sistema de
regulação (Thompson et al. 2001).
I.5.3.4. INIBIDORES
A enzima quitinase pode ter sua atividade bloqueada por drogas inibidoras.
Embora a alosamidina seja de alto custo e de difícil síntese, é o inibidor mais potente
em estudo. Atualmente a alosamidina, derivado de Streptomyces (Nishhimoto et al.
1991) é capaz de inibir a atividade de quitinase proveniente de Candida (Milewski et al.
1992). Esse glicosídeo é um inibidor competitivo da quitinase do fungo apresentando
afinidade com quitinase de S.cerevisae e similaridade com intermediários da reação
(Bortone et al. 2002). Estudos têm mostrado que a alosamidina é capaz de inibir todas
as quitinases da família 18 atuando através de um mecanismo de inibição competitiva
(Blattner et al. 1996). Em T. vaginalis entre as atividades qutinolíticas, N-
acetilhexosaminidase (NH-ase), quitotriosidase (endo) quitotobiosidase (exo) descritas
(Sanon et al. 1998), apenas a atividade de NHA-se não foi afetada pela alosamidina
(Loiseau et al. 2002).
A demetilalosamidina, um dos derivados da alosamidina, é um potente inibidor
de quitinase de S. cerevisae afetando o crescimento de leveduras (Sakuda et al. 1990).
Atualmente os peptídeos argifina e argadina, os quais apresentam modificações como a
acetilação e ciclização, têm sido estudados como inibidores (Houston et al. 2002). Outro
inibidor sintetizado recentemente, HM508 (N,N'-diacetylchitobionoxime-N-
phenylcarbamate ), foi capaz de inibir a atividade de quitinases em S. marcescens .
Recentemente um peptídeo mais simples CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)],
produzido pela bactéria marinha Pseudomonas, foi identificado como um inibidor
natural de quitinase (Houston et al. 2002). Ensaios in vitro mostraram que CI-4 inibe a
separação de células filhas de S. cerevisae e impede a diferenciação de C. albicans para
a forma leveduriforme (Izumida et al. 1996). Em S. marcescens a estrutura de CI-4
revela que esse dipeptídeo cíclico inibe a atividade da enzima por apresentar
simularidade estrutural a um intermediário da reação (Houston et al. 2002). Os
dipeptídeos cíclicos derivados de CI-4 [(cyclo-l-Arg-Pro),(cyclo-l-Gly-Pro),(cyclo-l-
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Hys-Pro), (cyclo-l-Tyr-Pro)] testados para quitinases de S. marcescens apresentaram um
valor de inibição quatro vezes menor em relação a alosamidina (Houston et al. 2004).
I.5.4. APLICAÇÕES
A principal aplicação das quitinases é a produção industrial de quitosana a
partir de quitinas. Esse processo envolve uma reação de deacetilação que consome 40%
de solução de hidróxido de sódio, liberando um resíduo tóxico, e o uso do processo
catalítico eliminaria este inconveniente. A quitosana obtida por catálise pode ser
utilizada para os mais diversos fins. Como exemplos podemos citar o desenvolvimento
de membranas sintéticas para imobilização de poluentes orgânicos em ambientes
aquáticos em áreas industriais, conservante de alimentos, obtenção de películas e
membranas artificiais e até manufatura de cosméticos. É necessário considerar que
existem limitações no uso de enzimas industriais com relação ao custo do isolamento
das mesmas provenientes dos recursos naturais e a dificuldade da manutenção da
atividade que deve ser mantida em condições de temperatura e pH ideais.
Ainda recentemente, as quitinases de Brugyia malayi, Wuchereria bancrofti e
O. volvulus têm sido apontadas como candidatas a vacinas, esta estratégia tem
apresentado complicações pós-imunização (Harrison et al. 2000).
As quitinases têm sido aplicadas em processos de bioconversão. Após o
consumo de camarões, principalmente em países costeiros, o exoesqueleto é descartado.
Em alguns países são produzidos mais de 2,5 milhões de toneladas de lixo dessa
natureza. Assim o desenvolvimento de métodos de conversão desse lixo em produtos
derivados de quitina é de grande importância (Deshpande et al. 1986).
Na agricultura, as quitinases têm sido utilizadas como agentes antifúngicos no
controle biológico (Chernin et al. 1995).
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II. JUSTIFICATIVA
P. brasiliensis apresenta um teor de quitina duas vezes maior na fase
leveduriforme parasítica quando comparado à fase miceliana saprofítica. O estudo de
enzimas que degradam um dos principais componentes estruturais da parede celular, a
quitina, possibilita um maior entendimento sobre o ciclo biológico do fungo e a sua
importância em processos como o crescimento e divisão celular.
Nosso grupo tem trabalhado na caracterização e expressão de proteínas/genes
envolvidos no metabolismo da parede celular de P. brasiliensis. Neste trabalho
realizamos a clonagem, caracterização, expressão e atividade de quitinase de P.
brasiliensis, visando, em uma próxima etapa, a obtenção da proteína recombinante.
Nosso objetivo final é estudar a importância da quitinase de P. brasiliensis e selecionar
inibidores da mesma. Esperamos que inibidores de moléculas envolvidas no
metabolismo de parede celular do fungo apresentem baixa ou nenhuma toxicidade ao
homem.
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III. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivos:
1- Clonagem e caracterização do cDNA completo codificante para a enzima
quitinase de P. brasiliensis (PbCTS I) através do rastreamento da biblioteca de cDNA.
2- Análises filogenéticas das quitinases de vários organismos.
3- Determinação do número de cópias do gene PbctsI .
4- Avaliação da expressão do gene Pbcts1 através de Northern blot e RT-PCR,
nas formas de levedura e micélio, bem como durante os processos de diferenciação
celular e infecção em camundongo.
5- Avaliação da atividade de N-acetylglucosaminidase (NAGase), quitobiase e
quitinase em frações celulares de P. brasiliensis.
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Chitinase from Paracoccidioides brasiliensis: Molecular
cloning, structural, phylogenetic, expression and
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Artigo submetido à publicação na revista FEMS Immunology
and Medical Microbiology
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15-Jul-2005 Dear Dr. Maristela Pereira, The manuscript you submitted to our journal, Chitinase from Paracoccidioides brasiliensis: Molecular cloning, structural, phylogenetic, expression and activity analysis, by Bonfim, Sheyla; Cruz, Aline; Jesuino, Rosalia; Ulhoa, Cirano; Molinari-Madlum, Eugenia; Soares, Celia; Pereira, Maristela, has been uploaded to Manuscript Central. As the submitting author, you will receive future communications via e-mail. Your manuscript number is FEMSIM-05-07-0156. We thank you for submitting your work for publication in one of the FEMS Microbiology journals. Please be sure to save the word processing and graphics files from your manuscript. You may need them later again for production purposes if your manuscript is accepted. You can keep track of your manuscript by logging on periodically to our site (http://mc.manuscriptcentral.com/femsim ), where the status will be displayed in your Submitting Author Center. Again, thank you for the submission of your manuscript. Kindest regards, Dr Montserrat Blázquez-Domingo FEMS Editorial Administrator On behalf of Chief Editor, Dr Alex van Belkum FEMS Immunology & Medical Microbiology Note: It is the responsibility of the corresponding author (or submitting author if different) that all authors of this submitted manuscript are informed about the submission and its progress.
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Chitinase from Paracoccidioides brasiliensis: Molecular cloning,
structural, phylogenetic, expression and activity analysis
Sheyla M.R.C.Bonfim a, Aline H.S.Cruz a, Rosália S.A. Jesuíno a, Cirano
J.Ulhoa b,
Eugênia E.W.I. Molinari-Madlum c, Célia M.A. Soares a , Maristela Pereira a
aLaboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-Goiás, Brazil
bLaboratório de Enzimologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-Goiás, Brazil
cLaboratório de Imunopatologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública, Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-Goiás, Brazil
Corresponding author: Dr. M. Pereira, Laboratório de Biologia Molecular, ICB II,
Campus II - Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-Goiás, Brazil
Tel/fax: 55-62-521-1110
E-mail address: [email protected]
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Abstract
A full-length cDNA encoding a chitinase (Pbcts1) was cloned by screening
a cDNA library from the yeast cells of Paracoccidioides brasiliensis. The cDNA
consists of 1888 bp and encodes an ORF of 1218 bp corresponding to a protein
of 45 kDa with 406 amino acid residues. The deduced PbCTS1 is composed of
two signature family 18 catalytic domains and seems to belong to
fungal/bacterial class. Southern blot analysis indicated that Pbcts1 is a single
copy. Phylogenetic analysis with PbCTS1 and other chitinases point to the
possibility of paralogous of several chitinases to be grouped based in
specialized functions, which may reflect the multiple and diverse roles played by
fungi chitinases. Computer-based sequence analysis revealed that PbCTS1
presents a complex structure of domains that could imply in multi functionality.
Although PbCTS1 does not seem to present chitin-binding domains (CBD) and
serine/threonine/proline-rich regions (STP), the immunoglobulin C-Type domain
could propitiate interaction with the chitin chain during catalysis. Glycosyl
hydrolase activity was evaluated and the results demonstrated that P.
brasiliensis is able to produce and secrete these enzymes mainly during
transition from yeast to mycelium. In this way, P. brasiliensis should be able to
use chitin as a carbon source. In addition, PbCTS1 presents an Aamy domain,
indicating the possibility of alpha amylase activity. The presence of an endocytic
signal in the deduced protein suggests that it could be secreted by a vesicular
nonclassical export pathway. The Pbcts1 expression in mycelium, yeast, during
differentiation from mycelium to yeast and in yeast cells obtained from infected
mice suggests the relevance of this molecule in P. brasiliensis electing PbCTS1
as an attractive drug target.
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Key words: Paracoccidioides brasiliensis, chitinase, enzymatic activity, cellular
differentiation.
1. Introduction
Fungi are the causative agents of a wide range of human pathogenesis. Indeed, the
last two decades has witnessed a remarkable increase in the incidence of deep-seated,
disseminated mycoses [1]. Immune-compromised patients and the development of
fungal resistance to conventional treatments have contributed for this scenario [2,3,4,
5,6]. In this way, the search for new drug targets has been necessary. One of the most
prevalent fungi in Latin America is Paracoccidioides brasiliensis. Over ten million
people are estimated to be infected, but only up to 2% develop the disease [7].
Enzymes involved on the cell wall metabolism have been approached as
interesting targets to be explored to the design of specific antifungal agents, since this
structure is absent in human [8]. Chitin, a β-1,4-linked polymer of N-acetylglucosamine
(GlcNAc), is a major component of fungal cell walls [9]. Chitin synthases, chitinases
and N-acetyl-β-D-glucosaminidases are hydrolytic enzymes involved in the cell wall
metabolism and required for cell growth [9,10]. In dimorphic fungi, the transition of
phases involves changes in the cell wall composition. An increase in chitin levels in
parasitic phases is detected in Candida albicans [11] and P. brasiliensis [12], hyphae
and yeast-like, respectively, defining a cell wall thickness to the fungus inside the host.
O-Glycosyl hydrolases (EC 3.2.1.-) are a widespread group of enzymes that
hydrolyze the glycosidic bond between two or more carbohydrates, or between a
carbohydrate and a non-carbohydrate moiety. A classification system for glycosyl
hydrolases, based on sequence similarity, has led to the definition of 85 different
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families. This classification is available on the CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes)
web site. Because the fold of proteins is better conserved than their sequences, some of
the families can be grouped in “clans” [13].
Chitinases (EC 3.2.1.14) cleave the β-1,4-linkage between GlcNAc residues in the
chitin homopolymer. Genes encoding chitinases have been cloned from a wide variety
of organisms, for instance bacteria, fungi, insects, plants and animals. Henrissat and
Bairoch [14] classified chitinases into two families 18 and 19, based on amino acid
sequence similarities. Family 18 includes chitinases found in bacteria, fungi, viruses,
animals and class III and V of plant chitinases. Family 19 include class I, II and IV
chitinases of plant origin only, except chitinase C from Streptomyces griseus HUT 6037
[15], and chitinases F and G from Streptomyces coelicolor [16]. Within family 18 two
distinct classes of chitinases may be identified based on the similarity of the enzymes to
family 18 chitinases from plants or bacteria [17,18]. Chitinases of the plant class have
been detected in dimorphic, yeast and filamentous fungi and play roles during growth
and morphogenesis in fungi. Chitinases of the bacterial class have been found in
filamentous fungi, but not in yeasts. The role of these chitinases has not yet been
demonstrated.
Our group has finished the transcriptome of P. brasiliensis in mycelium and yeast
cells (http://www.biomol.unb.br/Pb). By using bioinformatics tools we have identified
new genes of P. brasiliensis that could be used as targets for new antibiotics discoveries
[19,20]. Open reading frames (ORFs) homologous to genes involved in the construction
and maintenance of the polymers of the cell wall and cell-wall-associated molecules of
P. brasiliensis were detected [21]. Here we report the molecular cloning, structural and
phylogenetic analysis, as well as the expression and activity analysis of a chitinase P.
brasiliensis, PbCTS1, which is expressed in mycelium, yeast, during differentiation
from mycelium to yeast and in yeast cells obtained from infected mice. In addition
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PbCTS1 presents motifs that indicate its probable bifunctionality and secretion to into
the medium.
2. Materials and methods
2.1. Growth conditions and phase transition
P. brasiliensis strain Pb01 (ATCC MYA 826) was used throughout this study.
Yeast cells were grown at 36°C in semi-solid Fava-Netto medium (1% w/v peptone;
0.5% w/v yeast extract; 0.3% w/v proteose peptone; 0.5% beef extract; 0.5% w/v NaCl;
4% w/v glucose, and 1.4% w/v agar, pH 7.2) [22] and subcultured every 7 days.
Mycelium was grown at 22°C in this same medium, by sub culturing every 15 days.
The differentiation was performed in liquid medium (Fava-Netto medium) by
changing the temperature from 22°C to 36°C, to the mycelium to yeast and from 36°C
to 22°C, to the yeast to mycelium transition [23]. The differentiation was visualized by
optic microscopy and evaluated daily by counting the yeast cells remaining in the
culture at 22°C, or the yeast cells in the culture transferred to the 36 °C. After cells
growth at 0, 12, 24 and 120 h the cellular and medium fractions were harvested to the
processing of proteins extracts.
2.2. Generation of a cDNA probe by PCR
cDNA library from yeast was used as a template for the PCR amplification of a
partial fragment encoding the chitinase. Oligonucleotide primers were designed based on
the ORF encoding the Pbcts1 cDNA from the transcriptome of P. brasiliensis. The
CHIT1 (5’- GTCAACTGGGCGATCTAC -3’) and the CHIT2 (5’-
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CCGATGGAGAGGAGCACA -3’) primers were used in a PCR reaction that was
conducted in a total volume of 50 µL. The resulting 257 bp product was subcloned into
pGEM-T-Easy (Promega. Madison, USA). The sequence was determined on both strands
by automated DNA sequencing, applying the Sanger DNA sequencing method [24].
2.3. Cloning of the cDNA encoding Pbcts1
A cDNA library from yeast cells was constructed in EcoRI and XhoI sites of
Lambda ZAP II (Stratagene Inc., LaJolla, CA, USA). Approximately 5x106 recombinant
phage plaques from the cDNA library were plated, according to standard procedures
[25]. Duplicate filters of the plates were hybridized overnight with the 257 bp probe
labeled with [α-32P]-dCTP at 45°C, in solution containing 50% formamide. Eight
positive clones were obtained and phage particles were plaque purified. The in vivo
excision of pBluescript SK+ phagemids in Escherichia coli XL1-Blue MRF’ cells was
performed by using the exassist/SOLR protocol (Stratagene).
2.4. Sequencing and Computer-based sequence analysis
Nucleotide sequence of the cDNAs were determined on both strands, by using
primer walking by the double-strand dideoxy-chain terminator method using a
MegaBace 1000 sequencer (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) for automated
sequence analysis.
cDNA sequence analysis was carried out by using the following programs
available at various sites at the World Wide Web: predicted protein sequence analysis
were performed with the ExPaSy programs: ScanProsite
(http://us.expasy.org/tools/scanprosite/) [26], PSORT (http://www.psort.org/) [27], DAS
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(http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/tmdas.cgi) [28], SMART (http://smart.embl-
heidelberg.de/) [29], Pfam (http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml) [30], Signal P
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) [31], ELM (http://elm.eu.org/) [32], InterPro
Scan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/) [33], PSIPRED
(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) [34], PROSCAN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/pattern_prosite.pl) [35], YinOYang (http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)
and Compute pI/Mw (http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html) [36]. Blast database
searches were proceed using the NCBI server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
[37]. The antigenic determinants of the deduced protein were predicted by using the
algorithm described by Kolaskar and Tongaonkar [38]
(http://www.bioweb.pasteur.fr/seganal/interfaces/antigenic.html). Multiple sequence
alignments were performed using Clustal X [39].
2.5. Comparison of sequences and inferred phylogeny
The deduced amino acid sequence was aligned with putative homologues from the
GenBank database. The phylogenetic relationships of PbCTS1 were generated with 79
complete deduced fungal chitinases available at databases. A phylogenetic tree was
constructed by multiple sequence alignments using the CLUSTAL X program [39].
Tree was generated by the neighbor-joining method [40] and visualized using the Tree
View software. Robustness of branches was estimated using 100 bootstraped replicates
and indicates the percentage of times all species appear as a monophyletic cluster.
2.6. DNA extraction
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P. brasiliensis yeast cells were harvested, washed and frozen in liquid nitrogen.
Grinding disrupted cells to extract genomic DNA by the cationic hexadecyl trimethyl
ammonium bromide (CTAB) method according to Del Sal et al. [41]. The cell powered
was added of 10 mL of extraction buffer [2% (w/v) polyvinylpolypyrrolidone (PVP),
1.4 M NaCl, 0.1 M tris-HCl pH 8.0, 0.02 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA),
2% (w/v) CTAB]. The mixture was incubated at 65°C for 1 h, extracted with 50%
chloroform/50% isoamyl alcohol (v/v) and precipitated with 100% ethanol. After
treatment with RNase I and ethanol precipitation, the DNA was resuspended in water.
2.7. Southern blot analysis
Southern blot analysis was performed according to standard procedures [25]. The
DNA of P. brasiliensis was digested with selected restriction endonucleases PstI,
HaeIII and DraI. Digestion products were fractioned on a 1.0% (w/v) agarose gel and
blotted to a nylon membrane, after denaturation for 15 min in 0.5 M NaOH. The
homologous 257 bp probe was labeled with [α-32P]-dCTP by using a random primer
DNA labeling Kit RPN 1604 (Amersham Biosciences). Pre- hibridization and
hibridization reactions were performed at 42°C in a blocking reagent containing 50 %
(v/v) formamide. The blots were washed at 45°C with 0.1 x SSC (sodium saline citrate
0.015 M, NaCl 0.015 M), 0.1 % (w/v) SDS.
2.8. Preparation of inocula and infection of mice
Male mice, 8 to 12 weeks old, from the susceptible strain (B10.A), pathogen free,
were used for infection. Pb01 yeast cells were maintained by weekly subcultivation in
semi-solid Fava-Netto medium [22] at 36°C and used on the 7th day of culture. Yeast
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cells suspensions were washed in phosphate-buffered saline (PBS) and adjusted to 10 x
106 cells/mL based on haemocytometer counts. Viability was determined by the Janus
Green B vital stain (Merck, Germany) [42] and was always higher than 90%. Mice were
intraperitoneally inoculated with 5x106 yeast cells contained in 0.5 mL of PBS. Matched
groups of animals were injected with sterile PBS and used as normal controls.
2.9. Assay for colonies-forming units
The number of viable microorganisms in the liver of infected mice was
determined by counting the number of colonies forming units (CFU). Briefly, the
animals were sacrificed at 7th day after infection, and livers were removed asseptically,
weighed and homogenized in 5 mL of sterile PBS. The cellular suspensions were
washed three times in PBS, and the final pellets were resuspended in 1 mL of PBS.
Aliquots of 100 µL of the homogenate were plated on selective agar for pathogenic
fungi (Merck & Co., Inc.) supplemented with 10% fetal calf serum. Plates were
incubated at 36°C, and fungal growth and colonies counting were evaluated daily. After
14 days of plating the yeast cells were used to obtain the RNA.
2.10. RNA isolation
Total RNAs from yeast, from mycelium, from cells in differentiation and from
cells obtained of infected mice were obtained using the Trizol reagent (10 mL for 0.5-
1.0 g cells) according to the supplier’s instructions (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA).
To remove genomic DNA contamination, the RNA samples were treated with RNase
free DNase-I at room temperature for 15 min, followed by standard procedures.
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2.11. Northern blot analysis
10 µg of total RNA from mycelium and yeasts cells were separated by
electrophoresis on 1.2% agarose gel containing formaldehyde and blotted to a nylon
membrane (Amersham Biosciences). The RNAs were fixed on the membrane by UV-
cross-linking. Hybridizations with the radiolabeled cDNA probe (iten 2.2) were
performed under high-stringency conditions [25]. The filters were washed for 30 min at
55°C with 0.1 SSC (sodium saline citrate 0.015 M, NaCl 0.015 M), 0.1 % (w/v) SDS
and exposed to x-ray film.
2.12. RT-PCR analysis
First-strand cDNA synthesis was performed with 1 µg total RNA by using
SuperScript II reverse transcriptase (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) in the presence of
the synthetic oligonucleotide antisense primer CHIT2. Reverse transcription (RT)-PCR
reactions were amplified by PCR using the sense primer CHIT1 and antisense primer
CHIT2. The cDNA synthesis reaction was performed at 37°C for 60 min. The PCR was
subjected to an initial denaturation at 94°C for 3 min followed by 40 cycles at 94°C (1
min and 30 s), 55°C (1 min and 30 s), 72°C (1 min and 30 s) and a final extension at
72°C (10 min). The RT-PCR product of 257 bp was gel-purified, subcloned into
plasmid pGEM-T-Easy (Promega, Madison, WI, USA) and sequenced as described
above.
2.13. Obtaining cellular and secreted fractions of P. brasiliensis cells
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During transition from mycelium to yeast and vice-versa, medium containing cells
grown for 0, 12, 24 and 120 h were processed to obtain supernatants and cellular
fractions, using the method described by Flores-Carreón et al. [43] with modifications.
The secreted fractions were obtained by centrifugation at 5,000g for 15 min of the
cultures and the supernatant was dialyzed against 0.05 M acetate-sodium buffer pH 5.5,
lyophilized and kept at -80°C. The cellular fractions were obtained from cells collected
by centrifugation at 5,000g for 15 min. The cells were washed in cold homogenization
buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.8, 2 mM CaCl2), containing protease inhibitors [50
µg/mL N-α-ρ-tosyl-L-lysine chloromethylketone (TLCK); 1 mM 4-
chloromercuribenzoic acid (PCMB); 20 mM leupeptin; 20 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride (PMSF) and 5 mM iodoacetamide]. The mixture was frozen in liquid nitrogen
and the cells were disrupted until obtaining a fine powder. Finally, the mixture was
centrifuged at 12,000g for 10 min and the supernatant, corresponding to cellular
fraction, was kept at -80°C and used for the analysis. The secreted fraction of the
transition from yeast to mycelium, performed in Fava-Netto’s medium added of 0.5%
chitin (inducible medium) was also obtained at 24 h of incubation and the chitinase
activity was assayed.
2.14. Enzyme assays
N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) (EC 3.2.1.30) was assayed by
monitoring the rate of formation of p-nitrophenol from p-nitrophenyl-β-N-
acetylglucosamine, as previously described by Yabuki et al. [44]. One unit of activity
was defined as the amount of the enzyme that produced 1 µmol of p-nitrophenol . min-1
at 37°C. Chitinase activity was assayed with the swollen chitin substrate, as previously
described by Ulhoa and Peberdy [45]. One unit of activity was defined as the amount of
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the enzyme that produced 1 µmol of reducing sugar . h-1 at 37°C. Protein concentration
was determined by method of Bradford [46], using bovine serum albumin as standard
protein.
2.15. Nucleotide sequence accession number
The Pbcts1 nucleotide sequence and the deduced protein reported in this paper
have been submitted to GenBank database under accession number AAQ75798.
3. Results
3.1. Nucleotide and predicted amino acid sequence encoding of Pbcts1
In order to isolate the complete cDNA encoding Pbcts1, we obtained a 257 bp
PCR product using the primers CHIT1 and CHIT2 designed from an expressed
sequence tag (EST) arising from the P. brasiliensis database transcriptome. Homology
search analysis suggested that the 257 bp cDNA encoded a homologue of chitinase of P.
brasiliensis (data not shown). Screening of a cDNA library of the yeast phase of P.
brasiliensis yielded several potentially positives clones. One clone was selected for
further analysis. The cDNA sequence of 1888 bp contained an ORF of 1218 bp, and
presented 377 and 292 bases at the 5’ and 3’ untranslated regions (UTR), respectively.
A polyadenylation signal ATTAA was identified 99 nucleotides downstream of the
TAG termination codon. The deduced amino acid sequence presented 406 residues with
a predicted molecular mass of 45 kDa and pI of 6.0 (Fig. 1).
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3.2. Characterization of the deduced amino acid sequence
A BLASTP search of the GenBank database revealed that the deduced amino acid
sequence of the Pbcts1 displayed identity to chitinases. Alignment of the P. brasiliensis
predicted protein with reported sequences of chitinases was performed by using the
Clustal X program [39] and is shown in Fig. 2A. This analysis revealed the existence of
several conserved amino acid residues and a variety of domains (Fig. 2B). PbCTS1
presents domains within the query sequence (6-355), which characterize the Glyco 18
family (Gly 18). The two signatures sequences present on proteins belonging to the
family 18 class of chitinases were found in PbCTS1 (94-99; 132-140). The first
signature (LLSIGG) is inside a predictable barrel strand 2 (β2) and the second one
(LDGLDVDWE) is between α3 and α4 putative domains. In particular, the Glu residue
has been described as the key proton donor during hydrolysis of the glycosidic bond is
at position 140. In this region of the gene is present the DxxDxDxE motif described as
essential to the catalytic activity of the chitinases family 18 [47]. Although PbCTS1
seems not to have chitin-binding domains (CBD) found in class I chitinases, and
serine/threonine/proline-rich (STP), an enhancer to enzyme activity, it has an
immunoglobulin C-Type domain (Igc1) (6-54). It has been proposed that
immunoglobulin-like folds in chitinases are involved in interactions of the protein with
the chitin chain during catalysis [48].
PbCTS1 presents a variety of motifs. The predicted protein contains potentially
one tyrosine kinase and two protein kinase C phosphorylation sites (189-196 and 304-
306, 379-381), respectively, seven casein kinase II phosphorylation sites (54-57, 56-59,
66-69, 158-161, 371-374, 390-393, 394-397), one N-glycosylation site (365-368), nine
O-GlcNAc sites (111, 112, 219, 224, 226, 230, 234, 235 and 360), ten N-myristoylation
sites (209-214, 246-251, 247-252, 276-281, 278-283, 281-286, 311-316, 343-348, 361-
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366, 366-371) and one amidation site (168-171). The modular domains forkhead-
associated (FHA) (T..[ILA]) (379-382) and WW (...[ST]P) (109-114) found in PbCTS1
could mediate protein-protein interaction.
By using the PSORT program to analyze the deduced protein, PbCTS1 seems to
have no N-terminal signal peptide to endoplasmic reticulum targeting. The protein is
predicted as cytoplasmic (39% of probability). On the other hand, PbCTS1 presents the
Yxxphi sorting signal (SS) (Y..[LMVIF]) (326-329, 396-399) responsible in proteins for
the interaction with the mu subunit of AP (Adaptor Protein) complex. This motif is
present in the cytosolic tail of various membrane proteins, as an endocytic motif that
can direct traffic within the endossomal and the secretory pathways.
In addition, PbCTS1 presents an Endosome-Lysosome-Basolateral (ELB) sorting
signal ([DER]…L[LVI]) (150-155) which could function in sorting and internalization
signals directing type I transmembrane proteins from the cell surface or TGN (Trans
Golgi Network) to the lysosomal-endosomal-melanosomal compartments. This signal
Interact with adaptor protein complexes targeting to the endocytic pathway.
A Src homology 3 (SH3) (…[PV]..P) (267-273) domain was detected in PbCTS1.
This domain is found in proteins with enzymatic activity. The function of the SH3
domain is not well understood but they may mediate many diverse processes such as
increasing local concentration of protein, altering their subcellular location [49].
Although low threshold, GRAM (glucosyltransferases domain) (20-89) and Aamy
(Alpha-amylase domain) (41-400) domains were identified in PbCTS1, indicating that
the protein could present glucosyltransferase and alpha amylase activity. Alpha amylase
enzyme is classified as family 13 of the glycosyl hydrolases. The presence of a Src
Homology 2 (SH2) domain (Y[QDEVAIL][DENPYHI]) (205-208) in PbCTS1
indicates that it can have its enzymatic activity modified by interaction to other protein.
SH2 domains are able to bind specific motifs containing a phosphorylated tyrosine
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residue, modifying enzymatic activities [50]. PbCTS1 presents N-arginine dibasic
convertase (NDR) (.RK/RR[^KR]) (169-171) and subtilisin/kexin-like proprotein
convertase (PCSK) ([RK].[AILMFV][LTKF].) (79-83) cleavage sites. The convertases
are endopeptidases localized in the cytoplasm and at the cell surface, and process latent
precursor proteins into their biologically active products [51].
Glycosaminoglycan attachment (Glyc) site ([ED]{0,3}.(S)[GA].) (351-355) and
Laminin G domain (LamG) (74-279) were found in PbCTS1; this last domain is known
to bind to the heparin. Seventeen putative antigenic residues were found in PbCTS1.
The profile defined on the DAS program yielded an overall hydropathy index indicative
of a strongly hydrophilic protein where 91% of amino acids of PbCTS1 are hydrophilic.
3.3. Sequence similarity
The secondary structural elements for PbCTS1 were mapped by using the
PSIPRED program. It shows that PbCTS1 has an eight stranded conformation (β/α)8,
while the N-terminal domain is a discrete unit with a β-sandwich configuration (Fig. 2A).
A search of the public databases of the deduced amino acid sequence of the
PbCTS1 revealed that it displayed strong homology to chitinases of fungal and some
bacteria origin. Alignment of the predicted PbCTS1 with reported sequences of fungal
chitinases by Clustal X analysis revealed high levels of homology. The higher values of
similarity shifted between 79 to 69% and identity between 68 to 55%, in relation to
PbCTS1 (Fig. 2A). Among the compared chitinases, the highest identity was with
Ajellomyces capsulatus.
3.4 Phylogenetic analysis
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In order to approach phylogenetic analysis among glycosyl hydrolases family 18
fungal chitinases we searched for complete protein sequences in the Pfam, EMBL and
NCBI databases. A total of 79 chitinases sequences (all hits with an e value lower than
6e-18) were downloaded and aligned using the multiple alignments Clustal X program.
From this alignment a neighbor-joining tree was constructed to examine the distances
among these sequences. A tree was then inferred and the tree topology was analyzed
using bootstrapping (100 replicates) (Fig. 3). Several groups were formed.
P. brasiliensis enclosed with others eurotiomycetes pathogenic fungi (E. nidulans
1, C. posadasii 2, A. capsulata 1, A. capsulata 2 and A. dermatitidis). The others
eurotiomycetes clustered inside of the several ascomycota clades (sordariomycetes,
saccharomycetes classes).
3.5. Genomic organization
In order to estimate the number of Pbcts1 copies the genomic DNA was digested
with the restriction enzymes PstI, HaeIII and DraI, which do have or not recognition
sites within the Pbcts1 cDNA sequence. The digested DNA was fractionated on a 0.8%
agarose gel and hybridized to the probe encoding Pbcts1 as shown in Fig. 4A. Hae III
digestion produced fragments consistent in number and sizes with, at least, three
restriction sites presumed to be in Pbcts1. The restriction patterns suggest that, Pbcts1 is
a single copy gene.
3.6. In vitro expression analysis of Pbcts1
The presence of the mRNA transcript encoding the PbCTS1chitinase protein was
determined by Northern blot analysis. Hybridization of total RNA with the 32P-labeled
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chitinase cDNA probe revealed a single band with a molecular mass of 1.9 kb (Fig. 4B).
This size of the transcript is in agreement with that of the cloned cDNA (Fig. 1). The
transcript was detected only in the yeast phase (Fig. 4B).
In order to investigate the expression profile of the Pbcts1 RT-PCR analysis was
performed on total RNAs from mycelium, yeast cells, from cells in differentiation from
mycelium to yeast, and from yeast cells obtained in infection conditions (Fig. 4C).
Products of 257 bp were obtained and sequenced, showing 100% identity to Pbcts1. The
results indicated that Pbcts1 is a gene expressed in mycelium, yeast, during
differentiation from mycelium to yeast and in yeast cells obtained from infected mice.
3.7. Detection of enzymatic activity in P. Brasiliensis
In this study, the specific activity of NAGase was measured in mycelium, yeast
and during the differentiation of P. brasilensis. The time course of NAGase activity
when grown in Fava-Netto medium is shown in Fig. 5. According to our results, the
morphological change from yeast to mycelium is accompanied by an increase in the
amount of NAGase (Fig. 5A) until 24 hours of cellular differentiation. During the
transition from mycelium to yeast the NAGase activity was maintained constant (Fig.
5B). Cellular and secreted specific activity was found in all time tested, with maximal
activity at 24 hours incubation during the yeast to mycelium transition. After this peak
there was a significant reduction activity in the enzyme activity, suggesting that most of
the chitin was degraded (Fig. 5A).
The secreted chitinase activity at 24 hours of incubation during the yeast to
mycelium transition also was determined after growth of P. brasiliensis in Fava-Netto
medium containing 0.5 % chitin, as carbon and nitrogen sources (inducible medium).
Activity of 0.089 U/min and 0.043 U/min was found in the inducible and non-inducible
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medium, respectively. However, the specific activity in non-inducible medium (13.6
U/mg) is higher than in the inducible medium (7.4 U/mg) due the high amount of
protein secreted at last.
4. Discussion
By searching in the transcriptome of P. brasiliensis, we identified an ORF related
to a chitinase homologue of this fungus. Using a homologue probe we have screened a
P. brasiliensis yeast cDNA library. In this present study, we report the molecular
cloning, structural and phylogenetic analysis of the deduced protein. The expression of
the Pbcts1 gene was investigated in mycelium, yeast and in cells during the fungus
differentiation. The transcript was also analyzed in yeast cells obtained from infected
mice. In addition we performed enzymatic analysis of chitinase in cells of P.
brasiliensis during the transition of phases.
Pbcts1 encodes a protein with a predicted molecular mass of 45 kDa and
calculated pI of 6.0. The deduced protein PbCTS1 contains 406 amino acid residues,
enclosing in its sequence regions identified as the catalytic residues of the chitinases
[52]. Chitinases are classified into two families, named, families 18 and 19, on the basis
of the amino acid sequence similarity of their catalytic domain [53]. Family 18
chitinases present motif DxxDxDxE at catalytic domain. Among these chitinases, two
catalytic amino acid residues (Glu-315 and Asp-391) are considered to be essential for
chitinase activity [54,55] and are conserved in P. brasiliensis. PbCTS1 seems to belong
to the family 18 chitinases; this and the other signature of family 18 (LLSIGG) were
found in PbCTS1. In the chitinase hevamine from Hevea brasiliensis, both signatures
help to form the attractive site cleft [56]. Also, the sequence analysis of the deduced
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protein showed very conserved amino acid residues that may form the (β/α)8 barrel
structure characteristic of Glyco 18 family. On the basis of those structural similarities,
and based on the homology with other sequences we were able to suggest that the
cDNA encoding the chitinase of P. brasiliensis has been cloned.
The alignment of the deduced amino acid of PbCTS1 with sequences of the
chitinases of various fungi reveals a high degree of homology. The highest identity
values of 68%, 67% and 60%, were with chitinases from A. dermatitidis, A. capsulatus
and C. posadasii, respectively. High identities of amino acids residues at the catalytic
site were noted.
A large number of chitinase-encoding sequences have been published on database.
Here we approached phylogenetic analysis among 79 glycosyl hydrolases family 18
complete chitinase of fungi. Identity and similarity values ranging between 68-31% and
79-46%, respectively, were found when comparing PbCTS1 with all those fungal
chitinases. Several groups were formed. P. brasiliensis enclosed with others
eurotiomycetes pathogenic fungi (E. nidulans 1, C. posadasii 2, A. capsulata 1, A.
capsulata 2 and A. dermatitidis). Although the eurotiomycetes, the sordariomycetes and
the saccharomycetes classes have been grouped inside several sub-clades, other
chitinases from these families were mixed themselves. The majority of fungi encode
chitinases as multigene families. Some of these paralogous were grouped in the same
clade, indicating possible gene duplication. Others were distributed in different groups,
pointing to a closer relationship among the chitinases from different fungal species and
suggesting interphylum horizontal transfer. Possibly, these paralogous were grouped
based in specialized function, which may reflect the multiple and diverse roles played
by fungal chitinases.
Southern blot analysis performed at high stringency indicated that Pbcts1 is
probable present as a single copy in the P. brasiliensis genome. Northern blot analysis
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showed a single transcript migrating as a mRNA species of 1.9 kb, reinforcing the
presence of only one gene in the fungal genome. The Pbcts1 expression was analyzed
by RT-PCR in mycelium and yeast phases, during transition from mycelium to yeast
and in cells obtained from infected mice. Although the Northern blot analysis showed
the presence of the Pbcts1 transcript only in the yeast phase, RT-PCR assay shows the
presence of transcript in yeast ( Fig. 3C) and also in the mycelium phase.
In order to analyze if Pbcts1 transcripts were present in yeast cells obtained from
infected mice, RNA processed from yeast cells of P. brasiliensis removed from liver of
infected mice were used in RT-PCR reaction. The presence of amplification shows that
Pbcts1 is present during infection of host tissues and could be important for the process.
Chitinases have been reported to be involved in the infectious process as virulence
factors [57] and have been studied as an attractive target to the development of vaccines
and drugs [58, 59]. In parasites, such as Acanthocheilonema viteae and Onchocerca
volvulus chitinases expressed in the larvae stage, which is not known to contain chitin,
has been suggested playing a role in the infection of host tissues [60,61]. The expression
of chitinase by the parasite in conditions without the presence of chitin [62], associated
to cases that chitinase is identified as an immunodominant antigen [60], suggest that
chitinases may be able to act on substrates other than chitin [63,62].
Although PbCTS1 seems not to have N-terminal signal peptide, and has been
predicted as a cytoplasmic molecule, it presents an endocytic signal that can also direct
traffic within the endossomal and the secretory pathways. The presence of this motif
suggests that PbCTS1 could use nonclassical protein secretion pathways. In this sense,
chitinases have been found inside secretory vesicules in Entamoeba invadens and
Entamoeba histolytica [64]. Many proteins have been demonstrated to be secreted by
unconventional secretion pathways [65]. IL-1β is secreted by a vesicular nonclassical
export pathway [66]. HMG (high mobility group) chromatin-binding protein, HMGB1,
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localizes to an endolysosomal compartment from which secretion can be triggered by
stimuli known to promote lysosomal exocytosis [67]. Strong evidences in tobacco cells
suggest that chitinase can be secreted into the medium by a novel secretion pathway by
passing through the vacuolar compartment. In this system, although pro-chitinase has
reached the vacuole, only mature chitinase are exported to the medium by a mechanism
time and hormonal-dependent [68].
PbCTS1 presents an Endosome-Lysosome-Basolateral sorting signal, which sort
and internalize signals of proteins to the lysosomal-endosomal-melanosomal
compartments. This signal Interact with adaptor protein complexes targeting to the
endocytic pathway. The presence of this signal could suggest that the enzyme could be
endocytosed from the basolateral surface of the plasma membrane and delivered to the
apical recycling compartment, a central sorting station, underneath the apical surface in
a process regulated by kinases. In this way, PbCTS1 could reach periplasmic space, cell
wall or the external medium. Although PbCTS1 does not seem to have CBD and STP
binding sites it has an immunoglobulin C-Type domain, which could propitiate
interactions of chitinase with the chitin chain during catalysis [48]. It has to be pointed
that truncated chitinases lacking CBD retained or enhanced the rate of chitin hydrolysis
[69,70], indicating different functions of the CBD in individual chitinases.
PbCTS1 has Aamy domain, indicating the possibility of presenting alpha amylase
activity. PbCTS1 could be used by the saprophytic form of P. brasiliensis for
acquisition of energy from polysaccharides found in the nature. PbCTS1 presents
homology to endochitinases although the Transglycosidase domain has been detected.
Chitinase of A. fumigatus have shown endo-, exo- and trans-hydrolytic activities [71].
Bifunctional Glycosyl hydrolase has been described at literature. The secreted
endoglycosidase from Enterococcus faecalis consists of a α-domain with a family 18
glycosyl hydrolase motif and a β-domain similar to family 20 glycosyl hydrolases. This
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enzyme by two distinct activities hydrolyzes the glycans on RNase B and IgG. Both
activities could be important for the molecular pathogenesis and persistence of E.
faecalis during human infections [72]. The presence of the SH2 domain in PbCTS1
indicates that the enzyme could have modified enzymatic activity by interaction to other
proteins [50].
Glycosaminoglycan (GAG) attachment site and Laminin G, a domain of binding
to heparin, were found in PbCTS1. GAGs are ubiquitous molecules expressed on both
in cell surfaces and in extracellular matrix (ECM). GAGs have emerged as critical
regulators of most events involving cell response to its external environment. Heparin is
a class of GAG. Laminin G domain has been shown to mediate mycobacterial adhesion
to lung epithelial cells and macrophages [73, 74]. In this way, PbCTS1 could mediate
adhesion of P. brasiliensis to different targets tissues by binding to ECM components
rolling a play during the natural course of infection. Moreover, the supposed capacity of
PbCTS1 to bind GAGs extends its potential role in P. brasiliensis virulence beyond a
function as a mere adhesion. Indeed it has lately been described that the interaction
between GAG and bacteria plays a role in multiple aspects of microbial pathogenesis
participating not only in adherence and tissue colonization and cell invasion, but also
contributing to systemic dissemination and potentially affecting functions of the host
cell itself [75].
The presence of several putative antigenic residues and high hydrophilic index of
PbCTS1 suggest its antigenic nature. Chitinases from Bombyx mori [76] and
Acanthocheilonema viteae [60] has been described as antigens. Moonlighting proteins
have been described at literature. The function of these proteins can vary as a
consequence of changes in cellular localization, cell type, oligomeric state, or the
cellular concentration of a ligand, substrate, cofactor or product. These different
mechanisms are not mutually exclusive and, in many cases, a protein uses a
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combination of methods to switch between functions [77]. SH3 domain was detected in
PbCTS1 that could have its subcellular location and consequently function altered.
Chitinases of glycosyl hydrolase family 18 may be divided into fungal/bacterial
chitinases, similar to chitinases found in bacteria, and fungal/plant chitinases, which are
similar to chitinases from plants. Fungal/bacterial chitinases have deduced molecular
masses of approximately 46-48 kDa, have no effect on growth or morphogenesis, are
secreted and may contribute to the digestion and utilization of exogenous chitin as a
source of organic nutrients for energy and biosynthesis. The fungal/plant chitinases are
bigger, contain serine/threonine-rich domain, GPI anchor and cleavage sites and may
have roles during growth and morphogenesis (for review see [78]). PbCTS1 have a
small-deduced molecular mass, is present in mycelium, yeast, during differentiation
from mycelium to yeast and in yeast cells obtained from infected mice. In addition it
presents endocytic motifs, signals that sort, internalization and direct traffic within the
endossomal and the secretory pathways, suggesting nonclassical secretion. Also, the
deduced protein presents an immunoglobulin C-Type domain, which could propitiate
interactions of chitinase with the chitin chain during catalysis. Altogether those findings
suggest that PbCTS1 could belong to the fungal/bacterial class. PbCTS1 presents a
complex structure of domains and sites that could convey to several pos transduction
modifications and could be involved in many cellular processes in different subcellular
location. Those suggestions cited here must be confirmed by further experiments.
However the presence during infection process elects PbCTS1 as an attractive drug
target.
According to our results, yeast secretes a high quantity of NAGase compared to
mycelium. This data is in accordance with the higher quantity of chitin present in yeast
when compared to mycelium. Yeasts have to disrupt the chitin of the cell wall to growth
and originate a new bud. Adverse results found to strain IVIC Pb9 [43] can be due to
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different substrates used at enzymatic activity assay. The morphological change from
yeast to mycelium is accompanied by an increase in the amount of NAGase, which is
highest 24 h after transition. After this peak there was a significant reduction in the
enzyme activity, suggesting that most of the chitin was degraded. Addition of chitin
increased the activity of chitinase found in the medium (item 3.7). In this way, P.
brasiliensis is able to use chitin to its maintenance. Small values in the transition from
mycelium to yeast suggest housekeeping NAGase activity.
Acknowledgments
This work was supported by grants from IFS (International Foundation for Science),
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) and
FUNAPE/UFG (Fundação de Apoio a Pesquisa/Universidade Federal de Goiás). Sheyla
M.R.C.Bonfim and Aline H.S.Cruz were recipients of fellowships from CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Our thanks also go to
Maria Sueli Soares Felipe from Universidade de Brasília (UnB) to make available the
transcriptome database of P. brasiliensis.
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Figure Legends
Fig.1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of P. brasiliensis cDNA encoding
the PbCTS1 homologue. Arrows mark CHIT1 and CHIT2 oligonucleotides. Numbering
of the amino acid sequence begins at the methionine encoded by the first initiation
codon and end at the first termination codon, both underlined. The deduced amino acid
sequence is shown above the nucleotide sequence. Amino acids inside gray boxes
indicate the two signatures present on protein belonging to the class family 18. The
polyadenylation signal AATAA is double underlined preceding the 3’ end poly (A)
stretch. Brackets indicate predicted antigenic determinants. The sites putatively formed
by amino acid residues are represented by following symbols: ● N-myristoylation sites,
■ tyrosine kinase phosphorylation site, ▼ N-glicosylation site, ^ casein kinase II
phosphorylation site, * protein kinase C phosphorylation site, × amidation site.
Fig. 2. (A) Alignment of the deduced amino acid sequence of PbCTS1 with those of
chitinases from fungi. Conserved regions are shaded in the dark and asterisks indicate
conserved amino acid residues. The symbols (:, .) denote a decreasing order of matching
similarity between each corresponding amino acid pair. Positions in which a gap was
introduced to optimize homology are shown as dashes. The boxed region shows the
consensus sequence in family 18 Glycosyl hydrolases. Accession numbers were as
follows: A. dermatitidis (AAF80371); C. posadasii (AAR18252); C. immitis
(AAB48567). The secondary structure elements are those observed in the PSIPRED
program. ─: α-helix, →: β-strand. (B) Schematic diagram of the deduced PbCTS1
protein. The deduced α-helixes are represented in dark boxes with amino acid positions
indicated above. β-strands are represented in gray box with amino acid positions
indicated below. The domains Gly 18 (Glyco 18 family), Aamy (Alpha-amylase
domain), GRAM (Glucosyltransferases domain), LamG (Laminin G domain), Igc1
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(Immunoglobulin C-Type domain), PCSK (Subtilisin/kexin-like proprotein convertase),
WW, ELB (Endosome-Lysosome-Basolateral), NDR (N-arginine dibasic convertase),
SH2 (Src Homology 2), SH3 (Src Homology 3), Glyc (Glycosaminoglycan attachment
site), FHA (Forkhead-associated) and SS (Yxxphi sorting signal) are represented in the
boxes. The amino acid positions are indicated above.
Fig. 3. Phylogenetic tree illustrating the relationship of PbCTS1 to other fungi
chitinases. Sequences were aligned and subjected to phylogenetic analysis using
maximum parsimony and minimum evolution (neighbour-joining). The numbers on
branches indicate bootstrap values obtained for 100 replications. The species (named
with binomial name) and the respective EMBL accession numbers are shown.
Fig. 4. Analysis of the P. brasiliensis Pbcts1 gene organization and of the transcript. (A)
Southern blot analysis. Twenty micrograms of total DNA was digested with the
following restriction enzymes: PstI, HaeIII and DraI. The blot was hybridized to the
radiolabeled Pbcts1 cDNA probe. The position of the size markers is indicated. (B)
Northern blot of total RNA yeast (Y) and mycelium (M) cells. Total RNA from yeast
and mycelium was fractionated on a 1,2% formaldehyde agarose gel and hybridized to
the cDNA insert encoding chitinase. The RNA size was calculated by using the 0.24-9,5
kb marker RNA ladder (InvitrogenTM Life Technologies). The amount of loaded RNA
was standardized by ethidium bromide staining of the agarose gels, showing the major
and minor ribosomal RNAs of about 3.2 and 1.6 kb, respectively. (C) RT-PCR analysis
of the Pbcts1 transcripts in P. brasiliensis. Total RNAs were obtained from mycelium,
yeast cells, cells 24 after h the mycelium to yeast differentiation and from yeast cells
harvest from infected mice. The reactions were primed with oligonucleotides antisense,
CHIT2 and sense CHIT1. The RT-PCR products were separated on a 1.0% agarose gel
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and stained with ethidium bromide. Lanes 1, 3, 5 and 7 control reactions without RT
and lanes 2, 4, 6 and 8 RT-PCR of the mycelium, yeast cells, cells after 24 h from
mycelium to yeast differentiation and from yeast cells harvest from infected mice,
respectively. Lane 9 control reaction without RT and RNA. Size in base pairs is
indicated on left. The amount of loaded RNA was standardized by ethidium bromide
staining of the agarose gels, showing the major and minor ribosomal RNAs of about 3.2
and 1.6 kb, respectively.
Fig. 5. NAGase activity during differentiation of P. brasiliensis. Yeast and mycelium
were grown at 37°C and 22°C, respectively in semi-solid medium and transferred to
liquid medium. The yeast cultures were incubated at 22°C and those of mycelium were
incubated at 37°C for several time intervals, denoted on the bottom of the graphic. The
cellular extracts were obtained and the NAGase activity was measured. Measurements
were also performed in the secreted fraction (A) NAGase activity during yeast to
mycelium and (B) mycelium to yeast transition. White, dotted and black bars
corresponding to secreted, cellular and total NAGase activity, respectively. Errors bars
represent standard errors calculated on three replicates.
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ORGANISMS EMBL Ajellomyces capsulata 1 Q9P4Q1 Ajellomyces capsulata 2 Q9HEW6 Ajellomyces dermatitidis Q9P4Q0 Amanita muscaria Q9C199 Aspergillus fumigatus 1 Q873Y0 Aspergillus fumigatus 2 Q6Q121 Aspergillus fumigatus 3 Q873X9 Aspergillus fumigatus 4 Q870C0 Ashbhya gosssypii Q75CT5 Beauveria bassiana Q8J1Y3 Blumeria graminis Q96VN1 Botrytis cinerea 1 Q8NJP7 Botrytis cinerea 2 Q8NJP5 Candida albicans 1 Q6SYY8 Candida albicans 2 Q9HEQ6 Candida glabrata 1 Q6FJ23 Candida glabrata 2 Q6FY50 Coccidioides immitis 1 Q7ZA41 Coccidioides immitis 2 Q7Z962 Coccidioides posadassi 1 Q5VHW7 Coccidioides posadassi 2 Q5VHW8 Coniothyrium minitans Q9HGU5 Debaryomyces robertisae Q707V9 Debaryomyces hansenni 1 Q6BTF9 Debaryomyces hansenni 2 Q6BJ14 Debaryomyces hansenni 3 Q6BL38 Debaryomyces hansenni 4 Q6BIN9 Debaryomyces hansenni 5 Q6BWH2 Emericella nidulans 1 Q92223 Emericella nidulans 2 Q9HFQ9 Emericella nidulans 3 Q92222 Hypocrea pseudokoningii Q9C1T4 Kluyveromyces lactis 1 Q6CUCH9 Kluyveromyces lactis 2 Q6CPT6 Metarhizium anisopliae 1 O14456 Metarhizium anisopliae 2 O74199 Metarhizium anisopliae 3 Q9HFL9 Neurospora crassa 1 Q7SGZO Neurospora crassa 2 Q871X2 Neurospora crassa 3 Q7SGW0
ORGANISMS EMBL Neurospora crassa 4 Q7S062 Neurospora crassa 5 Q7SC26 Neurospora crassa 6 Q7S8L7 Neurospora crassa 7 Q7RYA7 Neurospora crassa 8 Q7SG57 Neurospora crassa 9 Q7RWD7 Neurospora crassa 10 Q7SE00 Neurospora crassa 11 Q7S4F8 Neurospora crassa 12 Q7S9A1 Nomuraea rileyi Q6WZ15 Paracoccidioides brasiliensis Q5YLCO Pichia acaciae Q707V5 Puccinia triticina Q7ZA28 Rhizopus oligosporus Q92270 Trichoderma atroviride 1 Q7Z8C9 Trichoderma atroviride 2 Q7Z998 Trichoderma hamatum 1 Q99006 Trichoderma hamatum 2 Q9C1T6 Trichoderma hamatum 3 O43111 Trichoderma harzianum 1 Q61VXO Trichoderma harzianum 2 Q9C1T8 Trichoderma harzianum 3 Q8NK36 Trichoderma harzianum 4 Q70B22 Trichoderma harzianum 5 Q9C1T7 Trichoderma harzianum 6 Q6GV13 Trichoderma reesei Q65YQ7 Trichoderma virens 1 O59928 Trichoderma virens 2 Q8TG96 Trichoderma virens 3 Q8TF88 Trichoderma virens 4 Q8TGW8 Trichoderma virens 5 Q9C1T9 Trichoderma viride Q9UV43 Ustilago maydis Q9HEQ7 Verticillium fungicola 1 Q7ZA13 Verticillium lecanii 1 Q5MNU2 Verticillium lecanii 2 Q5MNU1 Yarrowia lipolitica 1 Q6CI44 Yarrowia lipolitica 2 Q6C863 Yarrowia lipolitica 3 Q6C2W7
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V. PERSPECTIVAS As seguintes perspectivas são propostas: 1- Validação dos motivos encontrados na seqüência predita de CTS1 através de ensaios específicos. 2- Continuação do processo de purificação das quitinases de P. brasiliensis. 3- Expressão de CTS1 em E. coli. 4-Produção de anticorpo policlonal para CTS1. 5-Avaliação da citolocalização de CTS1. 6-Avaliação de CTS1 quanto à secreção em P. brasiliensis.
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Quitinase de Paracoccidioides brasiliensis: clonagem molecular e análise estrutural, filogenética, expressão e atividade
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VII. ANEXOS
ANEXO I. PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O MESTRADO
I- Publicação de artigo:
1)- Tomazett PK, Cruz AHS, Bonfim SMRC, Soares CMA and Pereira M
2004. The cell wall of P. brasiliensis. Genetics and molecular research,
Brasil, 2005.
II- Trabalhos apresentados em eventos:
1)- Bonfim SMRC, Cruz AHS, Tomazett PK, Jesuino RSA, Felipe MMS,
Soares CMA, Pereira M 2004. Molecular cloning and characterization of a
cDNA encoding the chitinase from Paracoccidioides brasiliensis. Anais da
XXIV Reunião Genética de Microorganismos, Gramado.
2)-Cruz AHS, Bonfim SMRC, Tomazett PK, Felipe MSS, Soares CMA,
Pereira M 2004. Molecular cloning of a cDNA encoding the 1,3-ß-
endoglucanase from Paracoccidioides brasiliensis. Anais da XXIV
Reunião Genética de Microorganismos, Gramado 152pp.
3)-Tomazett PK, Faria FP, Bonfim SMRC, Cruz AHS, Soares CMA,
Pereira M 2004. Solubilization of the recombinant catalytic subunit of β-
1.3-glucan synthase gene from Paracoccidioides brasiliensis. Anais da
XXIV Reunião Genética de Microorganismos, Gramado 175pp.
4)- Bonfim SMRC, Cruz AHS, Tomazett PK, Jesuíno RSA, Felipe MSS,
Soares CMA, Pereira M 2003. Clonagem e caracterização do cDNA de
Quitinase de Paracoccidioides brasiliensis: clonagem molecular e análise estrutural, filogenética, expressão e atividade
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quitinase do fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis.
Anais da XIII Semana Científica Farmacêutica, Goiânia 35 pp.
5)- Tomazett PK, Faria FP, Bonfim SMRC, Cruz AHS, Soares CMA,
Pereira M 2003. Heterologous expression of the 1,3-glucan synthase gene
from Paracoccidioides brasiliensis. Anais do XXII Congresso Brasileiro de
Microbiologia, Florianópolis.
6)- Cruz AHS, Bonfim SMRC, Tomazett PK, Felipe MSS, Soares CMA,
Pereira M 2003. Clonagem do cDNA de 1,3-endoglucanase de
Paracoccidioides brasiliensis. Anais da XIII Semana Farmacêutica,
Goiânia 27 pp.
7)- Zambuzzi PF, Bonfim SMRC, Cruz AHS, Soares CMA, Pereira M
2005. Clonagem, caracterização do cDNA codificante para malato sintase
do fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis e produção
heteróloga da proteína recombinante. Anais do I Congresso de pesquisa,
ensino e extensão Conpeex/UFG/Goiânia.