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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ – UNIVALI
CENTRO DE CIÊNCIAS DA TERRA E DO MAR – Cttmar
Curso de Oceanografia
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE LINHAGENS SIMILARES À Bacillus stratosphericus ISOLADAS DE AMBIENTES MARINHOS PROFUNDOS
Etieli Amiel Cortez
ORIENTADOR: Msc. Marcus Adonai Castro da Silva
Modalidade: Pesquisa
Área de conhecimento: Oceanografia Biológica
ITAJAÍ
NOV/2012
ii
ETIELI AMIEL CORTEZ
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE LINHAGENS SIMILARES À Bacillus stratosphericus ISOLADAS DE AMBIENTES MARINHOS PROFUNDOS
Monografia apresentada como requisito parcial para a obtenção do titulo de oceanógrafo na Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar.
ORIENTADOR: Msc. Marcus Adonai Castro da Silva
ITAJAÍ
NOV/2012
iii
DEDICATÓRIA
DEDICO A TODOS QUE ME APOIARAM NESSA
ETAPA DA MINHA VIDA, PRINCIPALMENTE
AOS MEUS PAIS E FAMILIARES.
iv
“Ser feliz é sentir o sabor da água, a brisa no rosto, o cheiro de terra molhada,
É extrair das pequenas coisas, grandes emoções
É encontrar motivos para sorrir, mesmo quando não existam grandes fatos
É rir de suas própria tolices. É não desistir de quem se ama, é ter amigos
É agradecer,a cada dia, pelo milagre que é viver!”
Augusto Cury
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos os professores que contribuíram para a minha formação
dentro desse curso.
Ao meu orientador Marcos Adonai Castro da Silva pela oportunidade de
desenvolver esse trabalho. Pelo apoio e confiança que depositou em mim, afim de
realizar um trabalho importante dentro do LAMA em tão pouco tempo.
Agradeço a equipe do Laboratório de Microbiologia aplicada e do Laboratório
Genética Molecular da UNIVALI pela ajuda na realização dos experimentos .
Ao meu namorado Marcos Dulor, por ser uma pessoa compreensiva,
paciente, por me apoiar e me ajudar nos momentos mais difíceis e acima de tudo por
me aguentar nos momentos de stress e compreender que tudo era por um bem maior
e necessário. Agradeço também pelo simples fato de estar presente na minha vida
sempre cuidando de mim com muito carinho e atenção.
A minha irmã de alma Tássia que já é formada em oceano e já fez
intercambio sem sair de Uruguayork. Obrigada mesmo pelas noites de conversa,
conselhos e as ajudas que me destes durante esse tempo. Tenho certeza de que
amigos são uma família que podemos escolher, e nos escolher por vários motivos.
A todos os amigos, que por muitas vezes foram incansáveis e nunca me
deixaram desistir, logo acabaram por viver todas as conquistas e os fracassos junto
comigo.
Agradeço também as meninas do LAMA pelas tardes engraçadas, pelas
conversas, conselhos e ajuda,
Aos meus pais pelo apoio integral desde o momento em que escolhi minha
futura profissão sem ter a certeza de que era a certa, pela força e por serem os
responsáveis pela minha formação, educação e caráter. Devo a eles tudo que sou
hoje e sem eles eu não seria nada.
De um modo mais geral agradeço a toda a minha família pela compreensão e
apoio nesses anos de estudo, pela ajuda e apoio.
vi
RESUMO
Bacillus stratosphericus é uma espécie de bactéria descrita originalmente em amostras
de ar de grandes altitudes. Recentemente nosso grupo de pesquisa realizou o
isolamento de seis linhagens filogeneticamente similares a esta espécie, a partir de
amostras de sedimentos marinhos de grandes profundidades (em torno de 5000m), o
que nos levou ao questionamento sobre a posição taxonômica destas linhagens
marinhas. Neste contexto, o objetivo principal foi caracterizar fenotipicamente as seis
linhagens isoladas da espécie em questão de ambientes marinhos. As características
analisadas incluem caracteres morfológicos como forma da célula e motilidade,
fisiológicos como crescimento em diferentes temperaturas, bioquímicos como
utilização de açucares, e resistência a antibióticos. Estes resultados permitem,
juntamente com os estudos que já vem sendo realizados nos Laboratórios de
Microbiologia Aplicada e Genética Molecular da UNIVALI, comprovar que estas
linhagens de B. stratosphericus são organismos similares/idênticos ou apenas
adaptados ao ambiente de onde foram coletadas, quando comparadas com a
descrição da linhagem encontrada na estratosfera. Com a realização dos testes
citados anteriormente pode-se verificar que nos testes morfológicos as linhagens
estudadas foram semelhantes a linhagem tipo. Já nos testes fisiológicos e bioquimicos
as linhagens originadas de sedimentos marinhos profundos, de um modo geral,
apresentaram algumas diferenças quando comparadas a linhagem tipo, descrita por
Shivajii et al(2006). O amplo espectro de temperaturas de crescimento e as
concentrações de salinidade apresentados pelas seis linhagens do estudo, o fato de
não ter a capacidade de realizar a hidrolise da ureia, gelatina e amido, a não utilização
de acido a partir da maltose e a não produção de acetoina foram as principais
diferenças observadas, fazendo com que exista uma restrição de locais, onde seria
possível a presença destes micro-organismos. Outros resultados importantes dizem
respeito a maior sensibilidade a antibióticos apresentados pelas linhagens utilizadas
neste trabalho. Com bases nesses resultados e utilizando análises estatísticas foi
possível verificar uma diferença entre as linhagens originadas de sedimentos
profundos e da Bacillus stratosphericus LAMA 736, que é pelágica. Podemos concluir
que as espécies isoladas de ambientes marinhos profundos eram mais similares
dentre si do que com a linhagem tipo, que possivelmente trata-se de um micro-
organismo terrestre e de uma espécie diferente da descrita por Shivajii et al (2006).
Palavras Chave: Bacillus stratosphericus; ambiente marinho profundo; fenótipo
vii
Lista de figuras
Figura 1: Mapa de localização dos pontos de coleta ..................................................... 8
Figura 2: Ilustração de resultados de resistência a antibióticos ................................... 13
Figura 3: Dendograma dos dados da caracterização das linhagens ........................... 14
viii
Lista de tabelas
Tabela 1: Micro-organismos utilizados neste trabalho ................................................... 7
Tabela 2: Caracterização morfologia dos micro-organismos ....................................... 10
Tabela 3: Caracterização fisiológica dos micro-organismos ........................................ 11
Tabela 4: Caracterização bioquímica dos micro-organismos ...................................... 12
Tabela 5: Resistência à antibióticos ............................................................................ 13
ix
SUMÁRIO
Resumo ...................................................................................................................... vi
Lista de figuras ......................................................................................................... vii
Lista de tabelas ........................................................................................................ viii
1 Introdução ................................................................................................................ 1
2 Objetivos .................................................................................................................. 3
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 3
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 3
3 Fundamentação teórica ........................................................................................... 4
3.1.Métodos de taxonomia bacteriana ....................................................................... 4
3.2.Biologia da espécie Bacillus stratosphericus ....................................................... 5
4 Metodologia .............................................................................................................. 7
4.1 Micro-organismos utilizados no estudo ................................................................ 7
4.2 Caracterização morfológica ................................................................................. 8
4.3 Caracterização bioquímica e fisiológica ............................................................... 7
4.4 Avaliação da resistência a antibióticos ................................................................ 9
4.5 Analise estatística ............................................................................................... 9
6 Resultados ............................................................................................................. 10
6.1 Características morfológicas ............................................................................. 10
6.2 Características fisiológicas ................................................................................ 10
6.3 Características bioquímicas ............................................................................... 11
6.4 Resistência a antibióticos .................................................................................. 12
6.5 Análise estatística ............................................................................................. 13
7 Discussão ............................................................................................................... 15
8 Conclusão .............................................................................................................. 19
9 Referencias ............................................................................................................ 20
10 Anexos .................................................................................................................. 24
1
1.Introdução
A microbiologia tem como definição clássica a área da ciência que se dedica ao
estudo de organismos que somente podem ser visualizados ao microscópio. Tendo
esse conceito como base, a microbiologia aborda um vasto e diverso grupo de
organismos, que podem ser encontrados como células isoladas ou agrupadas em
diferentes arranjos. Assim, a microbiologia envolve o estudo de organismos
procarióticos (bactérias, archaeas), eucarióticos (algas, protozoários, fungos) e
também seres acelulares (vírus) (ALTERTHUM, 2008).
Pode-se dizer que uma das principais áreas da microbiologia é a classificação
(taxonomia) microbiana; essa permite que os cientistas observem as relações entre os
organismos e torna possível a determinação de uma linha evolutiva. Na taxonomia
bacteriana, várias características são analisadas e em seguida utilizadas para reunir
os organismos em uma escala taxonômica, de espécie a domínio. Aspectos
morfológicos, nutricionais, fisiológicos e de habitat são exemplos de características de
importância taxonômica e amplamente utilizados (MADIGAN et al, 2004).
Os ecossistemas marinhos, especialmente os mares profundos, abrigam uma
grande diversidade filogenética de micro-organismos. Estes podem ter grande
importância ecológica e biotecnológica. Sua capacidade de sobreviver e manter suas
atividades mesmo sob condições de baixa temperatura e alta pressão despertaram o
interesse da comunidade cientifica sobre os micro-organismos de mares profundos.
No entanto, as dificuldades de acesso a esses locais e a manutenção desses
organismos em laboratório, tornaram seu entendimento bastante complexo.
Em termos topográficos, os mares profundos se iniciam na quebra da
plataforma, que geralmente ocorre a 200m de profundidade. Além disso, podem-se
definir os mares profundos em termos hidrográficos como as regiões localizadas
abaixo da termoclina permanente, o que normalmente ocorre abaixo dos 800m de
profundidade (GAGE; TYLER, 1996).
Como o organismo alvo deste estudo foi encontrado em amostras de ar de
grandes altitudes é bom lembrar que estudos realizados na troposfera e estratosfera
(10-85 km de altitude), são importantes para determinar a existência de micro-
organismos no espaço (HOYLE; WICKRAMASINGHE, 1986, 1993, 1999). No entanto,
hoje já é bem reconhecido que os mesmos podem sobreviver às duras condições da
atmosfera superior e os rigores do espaço exterior (revisado por BRUCH, 1967), mas
existem poucos estudos publicados sobre a quantidade e a natureza desses
2
organismos (BRUCH, 1967; GREENE et al, 1964;. LYSENKO, 1979; ROGERS;
MEIER, 1936).
A espécie utilizada neste trabalho é Bacillus stratosphericus. A sua escolha se
deve às diferenças existentes entre os ambientes onde essa bactéria foi encontrada.
Harris et al. (2001) detectou, a partir de amostras coletadas à 41 km de altitude,
usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e técnicas de epifluorescência, a
existência de bactérias. Wainwright et al. (2003), utilizando as mesmas amostras,
descreveram a existência de duas espécies bacterinas (Bacillus simplex e
Staphylococcus pasteurii) e um fungo (Engyotontium). Além de ser encontrada em
altas altitudes, B. stratosphericus também foi detectado em sedimentos estuarinos no
recente trabalho de Zhang e colaboradores (2012). O presente trabalho visa servir
como complemento dos estudos que são realizados no Laboratório de Microbiologia
Aplicada em linhagens desta espécie, obtidas de amostras de sedimentos marinhos de
profundidade. A união deste trabalho fornecerá dados de extrema relevância para o
processo de identificação destes micro-organismos, tornando a mesma mais completa
e segura.
3
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Caracterizar fenotipicamente seis linhagens de Bacillus stratosphericus
isoladas de amostras de sedimentos de ambientes marinhos profundos da porção
leste do Oceano Atlântico Sul
2.2. Objetivos específicos
Caracterizar morfologicamente as seis linhagens estudadas de B.
stratosphericus;
Caracterizar em termos fisiológicos e bioquímicos as seis linhagens estudadas
de B. stratosphericus;
Avaliar a resistência das seis linhagens estudadas a diferentes antibióticos:
ampicilina, penicilina, canamicina, norfloxacina, ácido nalidíxico e cloranfenicol.
Resumir as características avaliadas, visando analisar a similaridade entre os
organismos isolados.
4
3. Fundamentação teórica
3.1.Métodos de taxonomia bacteriana
A taxonomia é a ciência da classificação e é composta por duas etapas
principais: identificação e nomenclatura. A taxonomia bacteriana tradicionalmente
empregou análises fenotípicas (levando em conta a aparência e o metabolismo dos
organismos, por exemplo) como base para a classificação. Devido ao seu tamanho, as
bactérias nos fornecem poucas pistas das suas raízes evolutivas, a análise genotípica
surgiu para auxiliar os microbiologistas a identificarem com maior precisão os micro-
organismos (TORTORA, 2005)
Dentre as técnicas desenvolvidas para a identificação das bactérias estão às
baseadas nas características fenotípicas e a quimiotaxonomia, que se baseia na
análise molecular de biomoléculas presentes na célula. Existem algumas
características fenotípicas que apresentam importância taxonômica, tais como,
morfologia (forma, tamanho e a reação de Gram), motilidade (por flagelos,
deslizamento, por vesícula de gás ou imóveis), nutrição e fisiologia (mecanismos de
conservação de energia – fototrofia), quimiorganotrofia, quimiolitotrofia; relação com o
oxigênio, exigência/tolerância a temperaturas, pH e sal), e outros fatores (pigmentos,
inclusões celulares ou camadas superficiais, patogenicidade e sensibilidade a
antibióticos). Já no que se trata de taxonomia molecular podemos citar a composição
do DNA base, hibridização do DNA:DNA, ribotipagem (rRNA 16S) e análise de ácidos
graxos: MEAG (de metil éster de ácido graxo) (TRÜPER, 2006).
Hansen et al (1991) escreveram sobre a metodologia para a caracterização
fenotípica de bactérias, dizem que tais características são determinadas
essencialmente por métodos convencionais. Muitas vezes esses não são os métodos
mais adequados para a caracterização de bactérias ambientais isoladas, assim como
as marinhas; isso devido os kits utilizados terem sido projetados para uso clínico, logo,
bactérias comuns, muitas vezes de origem humana.
As bactérias marinhas em geral, são de crescimento mais lento e
bioquimicamente versáteis, muitos delas não são capazes de crescer, ou apenas
apresentam um leve crescimento nos métodos convencionais. Além disso, muitas
apresentam alguns fatores fundamentais, como a presença de vários sais e fatores
que influenciam no crescimento que não são satisfeitas pela adição de compostos
simples (por exemplo, NaCl). Em muitos casos, essas exigências podem ser
satisfeitas usando água do mar. A temperatura também é um fator importante, a
5
temperatura dos testes convencionais é 37ºC enquanto a das bactérias marinha sita-
se no intervalo de 12-20ºC, o tempo de incubação das bactérias marinhas tambem é
diferenciado do utilizado nos kits disponiveis, geralmente um tempo curto não é o
suficiente para as bactérias marinhas expressarem seu fenótipo num grau observável.
3.2. Biologia da espécie Bacillus stratosphericus
Em um trabalho recente, Shivaji et al, (2006) realizaram um estudo taxonômico
de cepas bacterianas isoladas a partir de tubos criogênicos utilizados para coleta de
amostras de ar em grandes altitudes. Como resultado estes autores descreveram
quatro novas bactérias do gênero Bacillus, dentre as quais B. stratosphericus, utilizada
nesse trabalho.
As características de B. stratosphericus incluem a produção de colônias de
coloração branca, crescimento entre 8 e 37ºC, entre pH 6 e 10, com tolerância de até
17,4% de NaCl. São resistentes a radiação UV, e apresenta crescimento em peptona.
Os principais ácidos graxos são iso-C17:0, anteiso-C15:0, iso-C15:0, C16:111cis e
C16:0. Os lipídios são fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerol, difosfodiacilglicerol e
dois fosfolipídios desconhecidos (SHIVAJI et al., 2006).
Zhang e colaboradores (2012) publicaram um artigo no qual eles descrevem
um ambiente estuarino, onde foi também foi encontrada a bactéria alvo desde
trabalho. Neste trabalho os autores discutem a possibilidade desta bactéria de produzir
energia. Cooper et al. (2010) realizaram um experimento para testar as respostas
biológicas de Bacillus stratosphericus às descargas dielétricas. Os autores obtiveram
fenômenos semelhantes às demais bactérias, como perda e desintegração da
membrana, e danos ao DNA com o tratamento com plasma de ar seco. Além disso,
quando tratadas no estado líquido, as espécies reativas de oxigenio são capazes de
inativar as bactérias testadas através de danos letais e subletais.
Odisi et al (2012) realizaram a caracterização da bactéria Bacillus
stratosphericus LAMA 585 nos seguintes quesitos: i) localização das enzimas (extra ou
intracelular), ii) temperatura otima de β -glucosidase, exoglucanase, endoxilanase,
esterase e lipase, e iii) crescimento específico e a produção de enzimas. De acordo
com eles a bacteria apresentava atividade extracelular, dessas enzimas integrada à
membrana, mais elevada que a intracelular, essa caracteristica pode ser associada
com o ambiente onde foram encontradas; a baixa temperatura pode causar
desnaturação das enzimas, devido às enzimas intracelulares apresentarem proteção à
desnaturação no frio, podendo ter sido viavel devido à produção e acumuação de
solutos compatives, como glutamato de postassio. A temperatura ótima foi estimada
6
em: 50ºC para β–glucosidase e exoglucanase, 40ºC para endoxilanase e lipases, 20ºC
para esterase. Por ultimo foi realizado o crescimento isolado em meio Luria Bertani e
Meio Mineral, avaliando em conjunto a produção de enzimas; respectivamente os
crescimentos específicos foram 0,388h-1 1e 0,253h-1, uma concentração mais elevada
de células tambem foi obtido em meio LB. A produção de celulases e lipases seguiram
basicamente o mesmo padrão, o que nos mostra que as enzimas são produzidas
constitutivamente e não necessitam de um indutor para a sua produção, que está
intimamente ligada com o crescimento.
Silva et al. (comunicação pessoal) realizaram o isolamento e o estudo
taxonomico e identificação de quatro das seis linhagens bacterianas utilizadas neste
trabalho, sendo elas LAMA 713, LAMA 762, LAMA 781 e LAMA 892. De acordo com o
estudo essas linhagens contêm genes 16S similares ao do micro-organismo estudado
por Lima et al. (comunicação pessoal). Todas estas seis linhagens foram provenientes
de amostras de sedimentos marinhos de profundidade, da porção leste do Oceano
Atlântico Sul, algo inesperado, considerando a espécie identificada e o habitat no qual
foi originalmente descrita.
1 h
-1, unidade usada pra expressar duplicação dos organismos por hora.
7
4. Metodologia
4.1. Micro-organismos utilizados no presente estudo
Neste trabalho foram utilizados os organismos LAMA 585, LAMA 713, LAMA
762, LAMA 781, LAMA 736 e LAMA 892, isolados previamente de sedimentos
marinhos profundos e pertencentes à espécie B. stratosphericus (Tabela 1). O
isolamento foi realizado por Castro-Silva (em preparo) e Odisi et al., (2012) como parte
do programa Programa MAR – ECO Atlântico Sul “Patterns and Processes of the
Ecosystems of the Southern Mid-Atlantic” – Census of Marine Life (CoML), sob
coordenação do prof. Dr. Angel Alvarez Perez. Durante o trabalho os organismos
foram mantidos no laboratório de Microbiologia Aplicada em placas de Petri contendo
o meio Agar Marinho, sendo repicadas mensalmente.
Tabela 1. Micro-organismos utilizados neste trabalho, local de origem, profundidade e
data de coleta.
Micro-organismo Local Data Profundidade
B. stratosphericus LAMA 585 Super Estação 2 3/11/2009 902
B. stratosphericus LAMA 713 Geológica 3, 70cm 24/11/2009 5200
B. stratosphericus LAMA 736 Planície Abissal da
Argentina 15/11/2009 1800
B. stratosphericus LAMA 762 Super Estação 10 23/11/2009 4400
B. stratosphericus LAMA 781 Geológica 3, 10cm 24/11/2009 5200
B. stratosphericus LAMA 892 Planície Abissal do
Cabo 25/11/2009 1107
8
Figura 1: Mapa com a localização dos pontos de coleta dos organismos: LAMA 585 marcador azul, LAMA
713 (70cm) e LAMA 781 (10cm) marcador amarelo, LAMA 736 marcador vermelho, LAMA 762 marcador verde e LAMA 892 marcador roxo
4.2. Caracterização morfológica dos micro-organismos
Os micro-organismos selecionados foram caracterizados em relação a sua
morfologia. As características morfológicas determinadas foram: morfologia e arranjo
celular, presença de inclusões e vacúolos, motilidade, produção dos endósporos
(cultura em crescimento exponencial e fase estacionária por microscopia de contraste
de fases) e tipo de parede celular, pelo método da lise do KOH (BUCK, 1982).
4.3. Caracterização bioquímica e fisiológica dos micro-organismos
Os micro-organismos também foram estudados em relação com suas
características fisiológicas e bioquímicas. Os testes fisiológicos realizados foram:
crescimento em anaerobiose (meio O/F com glicose), crescimento em diferentes
temperaturas (5, 8, 37 e 40ºC), feito em Agar marinho e crescimento a 0 e 17,4% de
NaCl utilizando caldo nutriente. Os valores escolhidos de concentração salina e de
temperatura baseiam-se na descrição original da espécie. Os testes bioquímicos
utilizados foram: teste de metabolismo oxidativo e/ou fermentativo (meio O/F), hidrólise
de amido, da gelatina, da caseína e da ureia (caldo ureia), redução de nitrato (caldo
nitrato), produção de acetoína (teste de Vorges-Proskauer), utilização de citrato,
9
acidificação do meio a partir de açucares como: manitol, lactose, glicose, xilose,
arabinose, maltose e frutose, produção de catalase e citocromo oxidase, e produção
de indol e H2S (meio sim). Os testes bioquímicos e fisiológicos foram realizados de
acordo com os métodos propostos por Claus e Berkeley (1986), Smibert e Krieg
(1994) e Hansen et al (1991), em meio contendo NaCl a 2%, exceto nos testes de
tolerância a salinidade.
Os testes realizados, só foram repetidos quanto a resposta não era conclusiva.
4.4. Avaliação da resistência a antimicrobianos
A resistência a antibióticos foi avaliada através de antibiogramas (BENSON,
2002). Para a sua realização, a partir de culturas líquidas em Caldo Infusão de
Cérebro e Coração contendo NaCl a 2% (24 horas de cultivo a 30ºC), foram
inoculadas placas de Petri contendo Agar Muller Hinton (NaCl a 2%) de maneira a
obter crescimento por toda a superfície. Posteriormente discos de antibiótico com
concentrações padronizadas foram colocados sobre a superfície do meio de cultura e
as placas forão incubadas a 30ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo de incubação, o
diâmetro das zonas de inibição do crescimento foram medidos com o auxílio de um
paquímetro e os organismos foram classificados em resistentes ou suscetíveis ao
antibiótico, segundo uma tabela padrão de antibiograma. Foram testados os seguintes
antibióticos: ampicilina, penicilina, canamicina, norfloxacina, ácido nalidíxico e
cloranfenicol. Estes foram realizados apenas uma vez. A escolha destes se baseia nos
padrões de resistência observados na linhagem utilizada para a descrição da espécie.
4.5. Análise estatística
Para a analise dos dados foi utilizado o método estatístico de análise de
agrupamentos, também conhecida como análise de cluster ou de conglomerados, uma
técnica estatística multivariada que tenta sintetizar ou simplificar a estrutura de
variabilidade dos dados. Para isso os dados foram inicialmente codificados de forma
binária, sendo 0 = negativo e 1 = positivo, para cada um dos testes. Em seguida foram
calculados índices de similaridades de Jaccard entre os organismos e estes foram
agrupados pelo Método de Associação Média (UPGMA, Unweighted Pair Group
Method using Arithmetic Averages) e representados graficamente através de um
dendograma. Esta análise foi realizada utilizando-se o software Multivariate Statistical
Package (MVSP).
10
6. Resultados
6.1 Caracterização Morfológica
Após avaliação das características morfológicas das seis linhagens estudadas
foi possível verificar que todas apresentaram os mesmos resultados para os
caracteres morfológicos (Tabela 2) e não diferiram dos resultados relatados para a
linhagem tipo. Entretanto os autores que descreveram a espécie não realizam a
caracterização dos endósporos produzidos.
Tabela 2: Caracterização morfológica das seis linhagens estudadas e da linhagem
tipo, descrita por Shivaji et al (2006).
Organismo Morfologia Motilidade Endósporo
Forma Posição Distenção
Shivaji (41KF2aT)
Bastonete + NR* NR NR
LAMA 585 Bastonete + Elíptico Subterminal -
LAMA 713 Bastonete + Elíptico Subterminal -
LAMA 762 Bastonete + Elíptico Subterminal -
LAMA 781 Bastonete + Elíptico Subterminal -
LAMA 892 Bastonete + Elíptico Subterminal -
LAMA 736 Bastonete + Elíptico Subterminal -
*NR, não relatado.
6.2 Caracterização Fisiológica
Depois da realização dos testes e análise dos resultados, comparando-os com
os obtidos por Shivajii et al (2006), constatou-se que as seis linhagens do trabalho
apresentaram características fisiológicas similares (Tabela 3), mas em algumas
características ocorreu uma variação em relação aos dados originais, são elas: a
linhagem tipo não cresce a 40ºC e cresce com 17,4% de NaCl enquanto as linhagens
estudadas crescem a 40ºC e não crescem com NaCl à 17,4%
11
Tabela 3: dados fisiológicos das seis linhagens utilizadas no trabalho e as
características da linhagem tipo, retiradas do trabalho onde a espécie, B.
stratosphericus, foi descrita inicialmente.
Característica Shivaji
(41KF2aT) LAMA 585
LAMA 713
LAMA 762
LAMA 781
LAMA 892
LAMA 736
Anaerobiose - - - - - - -
5ºC - - - - - - -
8ºC + - - - - - -
37ºC + + + + + + +
40ºC - + + + + + +
0% NaCl + + + + + + +
17,4% NaCl + - - - - - -
6.3 Caracterização Bioquímica
No que se refere à caracterização bioquímica foi possível constatar que as seis
linhagens utilizadas no estudo apresentaram diferenças em algumas características
entre si e ao confrontarmos com os dados de Shivajii et al (2006) também
apresentaram discrepâncias (Tabela 4). Na descrição da espécie original consta que
ela tem a capacidade de produção da catalase, assim como de realizar a hidrólise do
amido, gelatina e uréia, também produz ácido a partir da maltose e produz acetoína.
Já as linhagens utilizadas neste trabalho não apresentam estas características, com
algumas exceções que serão descritas a seguir. O organismo B. stratosphericus
LAMA 713 apresentou resultados inversos para a produção de ácido a partir da frutose
e arabinose, e utilização do citrato. Já as linhagens B. stratosphericus LAMA762,
LAMA892 e LAMA781 os resultados foram diferentes para a produção de acido a partir
da xilose, a B. stratosphericus LAMA781, também apresentou resultado diferenciado
para hidrólise da ureia e a B. stratosphericus 736 não produz acido a partir da glicose
e da lactose. Os dados da hidrólise da caseína não foram relatados pelos autores na
descrição da espécie.
12
Tabela 4: Caracterização bioquímica das seis linhagens utilizadas no presente
trabalho e os dados bioquímicos relatados por Shivaji et al (2006) na descrição original
da linhagem tipo.
Características Shivaji (41KF2aT)
LAMA 585
LAMA 713
LAMA 762
LAMA 781
LAMA 892
LAMA 736
Catalase + - - - - - -
Gram + + + + + + +
Citocromo oxidase + + + + + + +
Amido + - - - - - -
Indol e H2S - - - - - - -
Caseína NR* + + + + + +
Glicose + + + + + + -
Frutose + + - + + + +
Manitol + + + + + + +
Lactose + + + + + + -
Xilose + + + - - - +
Arabinose + + - + + + +
Maltose + - - - - - -
Redução Nitrato + + + + + + +
MR-VP + - - - - - -
Citrato de Simmons - - + - - - -
Gelatinase + - - - - - -
Ureia + - - - + - -
*NR, não relatado
6.4 Avaliação da Resistência a Antibióticos
Após determinar a sensibilidade ou resistência das linhagens utilizadas neste
estudo e posterior comparação com o trabalho de Shivajii et al., (2006) foi possível
estabelecer que assim como nos resultados anteriores, ocorreram algumas
similaridades entre as linhagens estudadas e diferenças com a linhagem tipo (Tabela
5). As seis linhagens apresentaram sensibilidade para os seis antibióticos utilizados,
com exceção de B. stratosphericus LAMA736 que apresentou resistência intermédia
para ampicilina, B. stratosphericus LAMA713 e B. stratosphericus LAMA736 que
apresentaram resistência à Penicilina e a B. stratosphericus LAMA892 que apresentou
sensibilidade intermediária ao Cloranfenicol.
Já ao compararmos os dados obtidos nas linhagens utilizadas neste trabalho
com os dados da descrição original podemos verificar que apenas dois dos antibióticos
apresentaram resultados similares, ambos sensíveis à Ampicilina e o Ácido nalidíxico,
os demais, Penicilina, Canamicina, Norfloxacina e Cloranfenicol os resultados foram
13
opostos, as linhagens do estudo são sensíveis a estes antibióticos enquanto a do
estudo é resistente.
Tabela 5: Resultados obtidos após a realização dos testes de resistência aos
antibióticos das seis linhagens estudadas e apresentação dos dados da linhagem tipo.
Antibiótico Shivaji
(41KF2aT) LAMA 585
LAMA 713
LAMA 762
LAMA 781
LAMA 892
LAMA 736
Ampicilina S S S S S S I
Penicilina R S R S S S R
Canamicina R S S S S S S
Norfloxacina R S S S S S S
Ácido nalidíxico S S S S S S S
Cloranfenicol R S S S S I S
Figura 2: Ilustração dos resultados dos testes de resistência à antibióticos: figura da esquerda:
Ampicilina, Penincilina e Norfloxacina. Fugura da direita Canamicina, Cloranfenicol e Ácido Nalidixico
6.5 Análise de agrupamentos
Pela análise de agrupamentos (Figura 3) verificou-se que as linhagens
originadas de ambientes marinhos profundos são mais similares entre si, em
comparação com a linhagem tipo, que formou um grupo mais separado. A única
linhagem originada de ambiente pelágico, B. stratosphericus LAMA 736, se distinguiu
entre os organismos de origem marinha.
14
Figura 3: Dendograma formada a partir dos dados obtidos da caracterização das linhagens estudadas e
dos dados fornecidos por Shivajii et al (2006) para a linhagem tipo, utilizando o método UPGMA e o índice de sensibilidade de Jaccard. Em azul está destacada a linhagem marinha de ambiente pelágico. Em
verde as linhagems originadas de sedimentos profundos. Em vermelho está destacada a linhagem tipo.
15
7. Discussão
Após a análise dos dados obtidos, foi possível constatar que nos aspectos
morfológicos, no presente trabalho foram obtidos resultados semelhantes aos da
linhagem tipo, conforme relatado por Shivajii et al. (2006), logo todas as linhagens tem
forma de bastonete e são móveis. O trabalho realizou a caracterização do endósporo
da espécie em questão, sendo esta uma contribuição importante para a caracterização
final da espécie, uma vez que na descrição original isto não foi realizado ou não foi
relatado. No que se refere ao formato do endósporo encontrado na B. stratosphericus
pode-se dizer que ele é similar aos demais Bacillus, alguns poucos apresentam
formato circular, mas, na sua grande maioria são elípticos; a posição deste dentro do
organismo é bem variável, não existindo uma posição preferencial, já a distensão não
é algo comum a todos a maior parte não apresenta distensão.
No presente trabalho as linhagens estudadas diferiram em duas características
fisiológicas, no crescimento a 40ºC e a ausência de crescimento a 17,4% de NaCl, em
relação com a linhagem tipo. Estes resultados não são esperados uma vez que o
ambiente de origem destas linhagens se caracteriza como frio, com temperaturas em
torno de 4ºC. Além disso, a linhagem tipo foi originalmente descrita de amostras de ar
da estratosfera e é inesperado o fato dela crescer em concentrações salinas mais
altas do que as linhagens estudadas, originadas de uma ambiente tipicamente
salgado.
Diante dessas características podemos sugerir duas hipóteses para a origem
desse organismo. Primeiramente como se trata de um organismo do filo Firmicutes
formador de endósporo, estrutura que tem como função principal garantir a
sobrevivência das bactérias por períodos de "stress" ambiental (PRIEST, 1993), estes
micro-organismos podem ser de origem terrestre que devido a fatores climáticos e
ambientais foram depositados no fundo do oceano. O endósporo por ser uma estrutura
de resistência, não se pode afirmar o tempo que este continua ativo, ou seja, não se
sabe por quanto tempo mantém suas condições de germinação. Greenblatt et al
(1999) encontraram um endósporos em âmbar datados de 120 milhões de anos, o que
corrobora com a hipótese de ser terreste e ter sido depositado no fundo do oceano
com o passar dos anos.
Como os organismos não têm dependência do sal para o seu crescimento, pois
crescem na ausência de NaCl, e não apresentam crescimento numa temperatura
semelhante a encontrada no fundo do mar, é possível que durante o isolamento estes
micro-organismos se encontravam latentes nas amostras, na forma de endósporos,
16
que germinaram assim que foram colocados nos meios de cultura (SILVA e
WEINGARTNER, 2008). De acordo com Beleneva (2008) a faixa ótima de crescimento
de bactérias marinhas varia entre 5ºC (espécies psicrófilas) e 30ºC (espécies
mesófilas), logo outro fator importante é a faixa de temperatura na qual as linhagens
estudadas crescem. Esta faixa é muito semelhante à encontrada no ambiente
terrestre, outra característica que corrobora a origem não marinha destas linhagens.
O fato das linhagens estudadas diferirem na tolerância à salinidade, em relação
com a linhagem tipo, pode ser explicado pela capacidade de sintetize e acúmulo de
compostos de massa molecular pequena, como açucares álcoois, prolina e glicina
betaína (HELLEBUST, 1976; YANCEY et al., 1982), os quais são denominados de
osmólitos, osmoprotetores ou solutos compatíveis. A função exata desses compostos
está relacionada à proteção contra estresses abióticos, funcionando como uma
ferramenta para o ajustamento osmótico celular (HELLEBUST,
1976,FLOWERS,2004). Além dessa função principal no ajuste osmótico, os solutos
compatíveis podem contribuir para a estabilização de macromoléculas
(osmoprotetores) e proteção contra danos oxidativos sob condições adversas (YEO,
1998). A linhagem tipo deve apresentar uma maior capacidade de síntese e
acumulação de solutos compatíveis, em relação com as linhagens estudadas, o que
explicaria sua maior tolerância à salinidade.
Os microrganismos estudados neste trabalho em geral aparentam possuir
menor versatilidade bioquímica que a linhagem tipo, uma vez que apresentaram
resultados negativos para vários testes. Em particular as linhagens estudadas não
produziram enzimas hidrolíticas (amilase, gelatinase e urease), não utilizam a maltose
como fonte de carbono e energia, não produzem acetoína e catalase. Com base nos
resultados bioquímicos citados acima pode-se inferir que as linhagens estudadas
seriam mais restritas em relação com os ambientes passíveis de serem colonizados
por elas. Isso é corroborado novamente pelos dados fisiológicos obtidos para estas
linhagens.
A não produção de acetoína é condizente com o fato destes microrganismos só
crescerem na presença de oxigênio, uma vez que essa molécula indica a realização
de uma via fermentativa chamada de fermentação de ácidos mistos, caracterizada
pela liberação de diversos produtos ácidos (WHITE et al., 2011). Por outro lado, era
esperado que estes organismos produzissem catalase, uma vez que crescem em
ambientes aeróbios. A catalase atua na decomposição do peróxido de hidrogênio em
oxigênio e água (2 H2O2 → 2 H2O + O2 ). Uma hipótese que foi observada em outras
bactérias, é que estes organismos produzam outras enzimas que atuariam de forma
similar. Uma delas é a peroxidase que tem o papel de desintoxicação celular ao
17
eliminar o peróxido de hidrogênio em espécies reativas de oxigênio (MADIGAN et al,
2007).
Em relação com a resistência a antibióticos, foram obtidos resultados diferentes
dos apresentados para a linhagem tipo, a explicação para esse fato deve-se a uma
possível exposição prévia dos organismos testados por Shivajii et al (2006), fazendo
com que estes apresentassem uma resistência notável aos antibióticos testados
(MADIGAN et al, 2007). Essa resistência estaria ligada a produção de uma enzima
conhecida como β-lactamase.
De acordo com o estudos genéticos feitos por Lima et al (comunicação pessoal)
que sequenciaram o genoma da linhagem B. stratosphericus LAMA 585, foram
detectados genes que codificam a enzima de resistencia a antibióticos β-lactâmicos, a
β-lactamase. Esta enzima constitui um importante mecanismo de resistência a
antibióticos β-lactâmicos, hidrolisando o anel β-lactâmico pela quebra da ligação
amida, perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana
(WILLIAMS, 1999). Esta enzima tornaria esse micro-organismo resistente a
penincilina, o que não foi observado. Isto poderia ser explicado pela ausência de
expressão do gene da β-lactamase. Como os antibióticos agem fora das células, a não
expressão do gene citado acima pode estar relacionada com a ausência de um
mecanismo de percepção dos antibióticos pelas linhagens sensíveis de B.
Stratosphericus. Isso faria com que a enzima responsável pela quebra de antibióticos
β-lactâmicos não tivesse sua produção estimulada, tornando assim o micro-organismo
sensível a presença de antibióticos β-lactâmicos.
Entre os micro-organismos estudados a linhagem B. stratosphericus LAMA 736
diferiu das demais, conforme observado na análise de agrupamentos (figura 3). Isto
pode estar relacionado com a origem deste micro-organismo, o único proveniente de
ambiente pelágico. Algo similar foi descrito para cianobactérias da espécie
Prochlorococcus marinus, cujas linhagens diferem entre si, sendo umas adaptadas a
locais com alta luminosidade, o que faz com que elas habitem águas próximas à
superfície, e outras adaptadas a ambientes com menos luminosidade, fazendo com
que viva em camadas mais profundas (KIRCHMAN, 2008 cap 3). As adaptações que
permitiriam que os microrganismos estudados moldar-se a uma vida pelágica em vez
de sedimentar, uma vez que os testes realizados não foram direcionados para este
fim, mas sugere-se que isto seja alvo de um próximo trabalho.
Através da análise dos dados fisiológicos, bioquímicos e os de resistência a
antibióticos, pôde-se perceber uma distinção entre as linhagens de origem marinha e a
linhagem tipo. Duas hipóteses foram formuladas para explicar isso: a primeira delas é
que estaríamos lidando com uma espécie nova, com algumas características
18
semelhantes com a descrita por Shivajji et al (2006) e a segunda é que as linhagens
do estudo seriam na verdade uma subespécie de Bacillus stratosphericus. Para
finalizar esse estudo foi realizada uma análise de agrupamentos para tornar a
visualização das similaridades mais fácil (Figura 3). A partir dessa analise foi possível
verificar que as seis linhagens utilizadas no estudo eram mais semelhantes entre si do
que com a descrita por Shivajii et al (2006), e por isso é provável que as linhagens
estudadas pertençam na verdade a uma nova espécie.
De acordo com a definição de espécie bacteriana, um grupo de linhagens com
mais que 70% de similaridade em seu material genético e suficiente divergência
fenotípica em relação com organismos geneticamente próximos, pertencem a uma
mesma espécie bacteriana (MADIGAN et al 2007). Portanto, para confirmar a hipótese
de que as linhagens marinhas estudadas constituem uma espécie distinta é
necessário o estudo destes micro-organismos pela técnica de hibridização do
DNA:DNA, uma técnica que determina o grau de semelhança genética entre linhagens
de micro-organismos, geralmente usada para determinar a distância genética entre
duas espécies.
19
8. Conclusão
Com todos os dados analisados e todas a hipóteses estudas podemos dizer que a
partir desse trabalho é possível concluir:
Possivelmente é uma bactéria de origem terrestre, mas de uma localidade
diferente da linhagem tipo.
Após as analises estatísticas é possível dizer que trata-se de uma espécie
nova, com características semelhantes a descrita por Shivajii et al(2006)
20
9. Referências
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24
10. Anexos
Anexo 1: Ilustração dos resultados do Teste da
hidrolise da caseína
Anexo 2: Ilustração dos resultados do Teste da
hidrolise do amido
Anexo 3: Ilustração dos resultados do teste da
utilização do Citrato de Simmons. Verde (negativo) e Azul (positivo)
Anexo 4: Ilustração dos resultados da hidrólise
da gelatina
Anexo 5: Ilustração do resultado da redução do
nitrato. Depois da adição do α-nafitil e sulfanilamida Rosa(positivo) e Incolor (negativo).
Traço de zinco incolor (positivo)
Anexo 6: Ilustração do resultado da produção
de acetoina (MR-VP). Depois da adição do α-naftol e KOH
Vermelho(positivo) e Amarelo (negativo)
25
Anexo 7: Ilustração dos resultados de Indol
Reativo de Kovacs rosa(positivo) e amarelo (negativo), produção de H2S, preto(positivo,
amarelo(negativo)
Anexo 8: Ilustração dos resultados da
produção de ácido a partir: do manitol, da xilose, lactose arabinose, maltose e frutose.
Amarelo (positivo) e Rosa (negativo)
Anexo 9: Ilustração dos resultados obtidos no
Teste da hidrólise da ureia. Laranja (negativo) e Rosa (positivo)
Anexo 10: Ilustração dos resultados obtidos na
produção de acido a partir da glicose e do crescimento em aerobiose.
Amarelo (positivo) e Rosa (negativo)
Anexo 11: Ilustração da ausência de
crescimento à 5ºC
Anexo 12: Ilustração da ausência de
crescimento à 8ºC
26
Anexo 13: Ilustração do crescimento à 37ºC Anexo 14: Ilustração do crescimento à 40ºC
Anexo 15: Ilustração da ausência de crescimento em anaerobiose
Anexo 16: alo de inibição dos micro-organismos em milímetros, a partir desde foi possível determinar o
nível de resistência com base nos dados de BENSON (2002)
Antibiótico LAMA 585 LAMA 713 LAMA 762 LAMA 781 LAMA 892 LAMA 736
Ampicilina 32 18 30 29 35 25
Penicilina 35 15 31 32 37 20
Canamicina 18 19 19 20 19 15
Norfloxacina 34 36 32 34 36 20
Ácido nalidíxico 20 20 20 19 20 33
Cloranfenicol 22 22 18 20 17 21
Anexo 17: formulação do meio Agar marinho para 1L
Componentes Quantidade
Peptona 5g
Extrato de Levedura 1g
Citráto Férrico (após autoclavação) 10ml
Agua do mar 740ml
Agua destilada 250ml
Agar 15g
27
Anexo 18: formulação do meio para teste da hidrólise do amido
Componentes Quantidade
Amido 5g
Agar marinho 1000ml
Anexo 19: formulação do meio para teste de produção do Indol e H2S
Componentes Quantidade
Meio Sim 30g
Agua destilada 1000ml
NaCl 20g
Anexo 19: formulação do meio para teste da hidrólise da caseína
Componentes Quantidade
Agar marinho com concentração dobrada Só com água do mar
500ml
Leite desnatado 500ml
Anexo 20: formulação do meio para teste de redução do nitrato
Componentes Quantidade
Caldo Nitrato 9g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
Anexo 21: formulação do meio para teste MR-VP
Componentes Quantidade
Caldo MR-VP 17g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
Anexo 22: formulação do meio para teste de utilização do citrato
Componentes Quantidade
Citrato Simmos 22,5g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
28
Anexo 23: formulação do meio para teste da Gelatinase
Componentes Quantidade
Gelatinase 120g
Peptona 5g
Extrato de carne 3g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
Anexo 24: formulação do meio para teste da hidrólise da Uréia
Componentes Quantidade
Caldo Ureia 38,7g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
Anexo 25: formulação do meio para teste do crescimento em 17,4% de NaCl
Componentes Quantidade
Caldo Nutriente 8g
NaCl 174 g
Agua destilada 1000ml
Anexo 26: formulação do meio para teste de produção de ácido
Componentes Quantidade
Caldo Marinho Sem ágar
940ml
Tris 4,7g
Ágar 3g
Solução Vermelho de fenol 10ml
Açucar 50ml
Anexo 27: formulação de cada uma das soluções dos açucares para 100ml
Componentes Quantidade
Glucose 20g
Manitol 20g
Lactose 20g
Xilose 20g
Arabinose 20g
Maltose 20g
Frutose 20g
29
Anexo 28: formulação do caldo infusão de cérebro e coração
Componentes Quantidade
Caldo BHI 37g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml
Anexo 29: formulação do meio para teste de resistência a antibióticos
Componentes Quantidade
Agar Muller Hinton 34g
NaCl 20g
Agua destilada 1000ml