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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISION: CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.

CARRERA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL.

SEMINARIO DE INVESTIGACION III CLAVE: 234184

COMPROBACIÓN DEL EFECTO DEL AUMENTO DE LA DÓSIS GÉNICA (GENES pcbC Y penDE) EN Penicillium chrysogenum SOBRE LA

PRODUCCIÓN DE PENICILINA G EN FERMENTACIÓN LÍQUIDA Y SÓLIDA.

Asesores: Dr. Javier Barrios González. Dr. Francisco José Fernández Perrino

Alumno:

Brito Robles Julio César.

LABORATORIO DE METABOLITOS SECUNDARIOS E INGENIERIA GENETICA

México, D.F. a 12 de abril del 2004.

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COMPROBACIÓN DEL EFECTO DEL AUMENTO DE LA DÓSIS GÉNICA (GENES pcbC Y penDE) EN Penicillium chrysogenum SOBRE LA PRODUCCIÓN DE PENICILINA G EN

FERMENTACIÓN LÍQUIDA Y SÓLIDA.

INTRODUCCION:

• GENERALIDADES: Las sustancias medicinales tienen el poder de destruir o detener el crecimiento de organismos

infecciosos en el cuerpo. Un grupo particular de estos agentes lo constituyen las drogas llamadas

antibióticos, del griego "anti" (contra) y "bios" (vida). Algunos antibióticos se producen a partir de

organismos vivientes, tales como bacterias y hongos. Otros son producidos artificialmente.

El término antibiótico fue propuesto por Warksman, descubridor de la estreptomicina, para definir

sustancias dotadas de actividad antimicrobiana y extraídas de estructuras orgánicas vivientes. En

1889 Vulleimin, en un trabajo titulado “Antibiose et symbiose”, crea el término antibiosis para

describir la lucha entre seres vivos por la supervivencia. Más tarde, Ward adopta esta palabra para

describir el antagonismo microbiano.

Los antibióticos pueden ser bacteriostaticos (detienen el crecimiento de las bacterias) o bactericidas

(matan a las bacterias). El modo de acción de los distintos antibióticos es diverso, pero todos ellos

tienen como requisito un contacto físico entre antibiótico y microorganismo susceptible. En algunos

casos aún no se conoce bien su modo de acción, en otros afecta a la superficie celular impidiendo el

crecimiento, imposibilitan la biosíntesis de proteínas microbianas.

La penicilina un producto del hongo Penicillium notatum es quizás el antibiótico mejor conocido.

Su descubrimiento y posterior desarrollo ha permitido tratar efectivamente muchas infecciones

mortales. Se descubrió de forma accidental en 1928 por Alexander Fleming, demostrando su

eficacia frente a cultivos de laboratorio de algunas bacterias patógenas como las responsables de la

gonorrea, meningitis o septicemia. Es un compuesto muy activo sobre estafilococos, estreptococos

y neumococos, así como sobre la mayor parte de los microorganismos gram positivos, (presentando

escasa acción sobre los gram negativos). El descubrimiento de esta sustancia permitió el desarrollo

de posteriores compuestos antibacterianos producidos por organismos vivos.

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Existen diversos tipos de penicilinas, entre las cuales las bencil penicilinas son las únicas que se

producen de manera natural. La penicilina G y la ampicilina son los mejores representantes de esta

clase de antibióticos fúngicos.

La penicilina es un producto del metabolismo secundario fuertemente regulada por los factores

ambientales en los que crece el microorganismo. Proporciona a los hongos filamentosos una ventaja

evolutiva muy clara, ya que pueden competir con las bacterias de su entorno usando un arma a la

que ellos mismos no son sensibles, (lo que permite la supervivencia del microorganismo).

Howard Florey y Ernst Chain (1940) fueron los primeros en tratar a seres humanos con la

penicilina, consiguiendo producirla y presentarla en forma utilizable. Una serie de empresas del

Reino Unido reconocieron su utilidad para el tratamiento de heridas de guerra y comenzaron a

fabricarla a partir de cultivos de Penicillium desarrollados en botellas de vidrio. La penicilina

producida era insuficiente para satisfacer la demanda, por lo tanto se realizaron grandes esfuerzos

para desarrollar nuevas formas de tratamiento de las cepas para aumentar la producción del

metabolito secundario.

• ESTRUCTURA DE LA PENICILINA Y BIOSINTESIS.

En 1943 Edward Abraham y Ernst Chain consiguieron cristalizar la penicilina F obtenida en Oxford

en forma de sal sódica y la compararon con la penicilina G. La estructura química del compuesto

contenía cuatro componentes principales: un aminoácido (la penicilamina), un aldehído, una β-

lactama y CO2.

La estructura de las penicilinas las cuales son miembros del grupo de los antibióticos de tipo β-

lactámico contienen modificaciones estructurales de los antibióticos de tipo peptídico. Martín J.F. y

Gutiérrez, S. (1992). Todos estos antibióticos contienen un anillo β-lactámico unido a un segundo

anillo de cinco miembros. La presencia de un átomo de azufre en este segundo anillo proporciona

características diferenciales a las penicilinas con respecto a las otras clases de antibióticos β-

lactámicos. La biosíntesis de éstos es un proceso que requiere de una serie de precursores, como

aminoácidos o compuestos que van a dar lugar a la cadena lateral y cofactores.

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La mayoría de los pasos implicados en la vía biosintética de las penicilinas ha sido caracterizada en

el ámbito bioquímico, aunque los mecanismos relacionados con las reacciones llevadas a cabo por

las diferentes enzimas aún se mantienen dentro del campo de las hipótesis.

Los primeros estudios realizados acerca de la biosíntesis de β-lactamas fúngicas, en los que se

utilizaron extractos acelulares, condujeron a la observación de un tripéptido que contiene cisteína

(el δ-(L-α- aminoadipil)-L - cisteinil - D- valina ó ACV), como el precursor directo en la biosíntesis

de penicilina por P. chrysogenum. (Arnstein, y Morris 1960), y de otras β-lactámas en bacterias,

(Jensen, y col, 1982). El tripéptido ACV es posteriormente ciclado para formar isopenicilina N,

primer intermediario de la ruta con actividad antibiótica y que posee una cadena lateral de α-

aminoadipilo unida al anillo β-lactámico, en una reacción que fue descrita por primera vez en P.

chrysogenum (Fawcett. y col. 1976). En este microorganismo, la isopenicilina N es convertida en

penicilina tras el intercambio de la cadena lateral de α-aminoadipilo, por otra de fenilacetilo

(penicilina G) o fenoxiacetilo (penicilina V) activada en forma de acil- CoA. Esta reacción de

transacilación es característica solamente de los microorganismos productores de penicilina.

El gen que codifica para la síntesis de la isopenicilina N sintasa, enzima responsable de la ciclación

del tripéptido se denomina pcbC. El gen pcbC de A. chrysogenum fue el primero de los genes

biosintéticos de antibióticos β-lactámicos estudiado a nivel molecular. Los genes que codifican para

la isopenicilina N sintasa en procariontes son muy parecidos entre ellos y también lo son a los genes

fúngicos.

El gen penDE codifica para la isopenicilina N aciltranferasa responsable del intercambio de la

cadena lateral. Esta última parte de la vía, solo esta presente en aquellos hongos con capacidad para

originar penicilinas de carácter hidrofóbico (como es el caso de P. chrysogenum y A. Nidulans).

Estos microorganismos son capaces de sintetizar penicilinas con cadenas laterales procedentes de

una gran variedad de ácidos carboxílicos presentes en el interior de la célula o aportados de forma

exógena.

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Figura 1. Ruta de biosíntesis de la penicilina.

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• PRODUCCION INDUSTRIAL DE LAS PENICILINAS.

En 1953 se consiguió por primera vez la síntesis de penicilina por métodos químicos (Sheehan y

col. 1959), sin embargo este sistema y otros desarrollados con posterioridad, no han resultado ser lo

suficientemente rentables desde el punto de vista económico para poder competir con las técnicas

de fermentación en la producción de penicilina a escala comercial.

El hongo utilizado industrialmente para la producción de penicilina pertenece a la especie de P.

chrysogenum, a la penicilina producida comercialmente se le llama penicilina G (bencil penicilina).

Existen diversos factores que determinan la eficacia, y por lo tanto la rentabilidad o viabilidad

económica, del proceso de fermentación encaminado a la obtención de penicilina. Uno de ellos lo

constituye la capacidad de producción de penicilina de la cepa industrial utilizada, determinada de

forma genética otro aspecto importante es la composición del medio de cultivo.

El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz, añadiendo de un 2

a un 3% de lactosa, y compuestos inorgánicos que contienen hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre,

potasio, magnesio, nitrógeno, y trazas de hierro, cobre y zinc.

La producción de penicilina es un ejemplo típico del proceso de obtención de antibióticos, el cuál

tiene las siguientes fases:

Fermentación. (Sólida y/o Líquida)

Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio de

disolventes.

Purificación con disolventes y formación de la sal sódica de la penicilina.

Ensayos de control.

Tanto la Fermentación Sólida (FS) como la Fermentación Líquida (FL), tienen ventajas y

desventajas para distintos propósitos.

La FS es un sistema de cultivo microbiano antiguo que está siendo transformado actualmente para

nuevos enfoques de microbiología, bioquímica e ingeniería bioquímica. La FS es muy útil para

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estudios básicos debido a que el medio líquido, puede ser usado con la composición deseada, y el

caldo de fermentación puede extraerse y analizarse al mismo tiempo. Los sistemas de FS se pueden

definir como un cultivo microbiano que se desarrolla sobre la superficie y en el interior de una

matriz sólida en ausencia de agua libre. La matriz porosa puede ser un sustrato humedecido o un

soporte inerte capaz de absorber nutrientes disueltos en la solución.

Se emplean dos tipos de FS:

Cultivo sólido de una fase soporte-sustrato: La fase sólida esta constituida por materiales que

asumen, simultáneamente, las funciones de soporte y fuente de nutrientes. Este material es

generalmente de almidón o lignocelulosa.

Cultivo en estado sólido de dos fases soporte-sustrato: son cultivos sólidos de un soporte inerte

impregnado con un medio líquido. En este tipo de fermentación, la fase sólida se considera

como un soporte inerte que sirve de reservorio para una solución nutritiva.

La Fermentación Líquida es mas utilizada en la actualidad, debido al gran éxito comercial de las

instalaciones a gran escala empleadas en muchos campos de la biotecnología.

• MEJORAMIENTO GENETICO

La utilización de las técnicas de ingeniería genética ha permitido dar un nuevo impulso al desarrollo

de cepas de mayor producción de antibióticos. Una de las formas de aumentar la producción

consiste en el incremento de la dosis génica es decir, el aumento del número de copias de los genes

que codifican para una proteína determinada dentro del microorganismo.

En el laboratorio de Ingeniería Genética y Metabolitos Secundario de la UAM-I, se ha utilizado una

estrategia de mejora de la producción de penicilina mediante el aumento de la dosis de los genes

pcbC y penDE implicados en los dos últimos pasos de la vía biosíntetica en P. chrysogenum. Se

obtuvieron transformantes de P. chrysogenum derivados de la cepa P2-32 (de alta producción) y

Wisconsin 54-1255 (de baja producción), utilizando un vector de clonación construido para probar

el efecto de introducir una o más copias extras de estos dos genes en las dos cepas mencionadas. En

la construcción de este vector bifuncional fueron incluidas secuencias de ADN del plásmido pC43,

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con el origen de replicación colE1, el gen Cm para la resistencia al cloranfenicol y el módulo de

resistencia a fleomicina.

En el presente trabajo se pretende comprobar el efecto del aumento de la dosis génica en P.

chrysogenum, comparando el aumento de la producción de penicilina de las cepas transformadas.

OBJETIVOS

Cuantificar la producción de penicilina en fermentación sólida y líquida de las cepas P2-32 y

Wisconsin 54-1255 y de sus respectivas transformantes.

HIPOTESIS.

El aumento del número de copias de los genes que intervienen en la ruta de biosíntesis de penicilina

se traducirá en un incremento en la producción de dicho antibiótico.

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DISEÑO

Determinar la producción de penicilina de las cepas de P. chrysogenum, Wisconsin 54-1155 y P2-

32 transformadas con sobredosis de los genes pcbC y penDE.

P. chrysogenum: Cepas P2-32 Wisconsin 54-1255.

Seleccionar transformantes con plásmido pUAMJC1.

REALIZAR FERMENTACION: • SOLIDA. • LIQUIDA.

CUANTIFICAR PRODUCCION DE PENICILINA POR BIOENSAYO.

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METODOLOGIA

SELECCIONAR TRANSFORMANTES DE

P. chrysogenum. WISCONSIN 54-1255 Y P2-32

PRODUCCION DE PENICILINA POR FERMENTACION SOLIDA Y

LIQUIDA

COSECHAR

SEMBRAR

REALIZAR BIOENSAYOS

CUANTIFICAR PRODUCCION DE PENICILINA EN MEDIO SÓLIDO Y LÍQUIDO.

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CONDICIONES Y DETERMINACIÓN DE CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS.

Crecimiento de las cepas bacterianas:

Como medios sólidos para el crecimiento de las bacterias se utilizan normalmente los medios LA y

TSA, con una concentración de agar al 2% (p/v), mientras que para su uso como medio líquido se

utilizan LB o TSB. La temperatura y tiempo de incubación para el crecimiento de las cepas

bacterianas es de 37 oC y de 14 a 18 horas, respectivamente. En medio líquido es necesaria la

agitación, con una velocidad de 200 r.p.m.

Condiciones para la esporulación de Penicillium.

Para obtener las esporas, tanto parentales como transformantes de Penicillium chrysogenum, se

siembran los microorganismos en medio PW y se incuban a 25 oC durante 10 - 15 días. Estas

esporas, serán cuantificadas posteriormente mediante una cámara de Neubauer.

Cosecha de esporas:

Para la cosecha de esporas se siembran por extensión, los microorganismos en medio PW y se

incuban a 25 oC durante 8 a 15 días o hasta el momento en que aparezcan las esporas en forma de

césped (depende de la cepa). Las esporas se recogen con H2Od estéril con solución Tween 80 al 0.1

%, raspando la superficie de la placa con una asa bacteriológica, cuidando de no desprender

micelio. La suspensión se homogeniza, se filtra con una gasa estéril a través de un embudo y se

cuantifican las esporas en una cámara Neubauer.

PROCESO DE SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES DE Penicillium chrysogenum.

Después de obtener los transformantes de P. chrysogenum se corrobora su identidad resembrando

por picadura cada uno de ellos en placa con medio Czapek más fleomicina, antibiótico de selección

contenido en el plásmido utilizado en la transformación. Estos transformantes serán analizados por

bioensayos mediante el método de cobertera y por el método de cilindros de agar.

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Para confirmar la transformación y la identidad de los transformantes generados, cada una de las

colonias resistentes a fleomicina que son capaces de crecer en las placas de transformación se

replican en medio Czapek con 30 µl/mg de fleomicina, incubándose a 25 oC de 5 a 7 días. Los

transformantes que confirmen su resistencia al antibiótico se seleccionan y se inoculan por

extensión en placa con medio PW para obtener esporas.

BIOENSAYO POR EL METODO DE COBERTERA.

Este método es utilizado como una herramienta semicuantitativa de selección de transformantes que

presentan mejoras en la producción de penicilina con respecto a la cepa parental. Se basa en la

formación de un halo de inhibición del crecimiento de una cepa bacteriana sensible a la penicilina,

Bacillus subtilis ATCC 6633. El diámetro de inhibición es proporcional al logaritmo de la

concentración de penicilina. El protocolo es el siguiente:

1. Se inocula un matraz de 250 ml. con 100 ml de medio ME y una colonia aislada previamente en

medio agar nutritivo. El microorganismo se incuba a 30 oC durante 16-18 horas, con agitación

de 200 r.p.m., y se determina la densidad óptica de la suspensión a 340 nm.

2. Se preparan cajas de Petri de 90mm con 20 ml de medio MCFP y 2% de agar, niveladas.

3. Se inoculan por triplicado 103 esporas en un microlitro, procedentes de los transformantes y

cepas parentales de P. chrysogenum se incuban a 25 oC de 48 a 72 horas.

4. Transcurrido ese tiempo se cubre el medio base de cada placa con 5 ml de medio TSA al 1%

inoculado con 100 µl de B. subtilis, (teniendo cuidado de nivelar las cajas).,Se deja solidificar

de 10 a 15 minutos y se incuban a 30 oC durante 14 a 18 horas.

5. Para obtener una referencia se utilizan concentraciones conocidas de penicilina G. Sobre la

superficie del medio sólido se colocan, por triplicado, círculos de papel filtro estéril de 8 mm de

diámetro, en el centro de cada uno de ellos se le agregan 70 µl de diluciones de la penicilina G.

Se dejan reposar durante 1 hora, para que la penicilina difunda sobre la superficie del medio

base, y se cubre como se indica en el paso anterior.

6. Se mide el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de B. subtilis en cada placa. La

producción de penicilina se determina en función del tamaño del halo de inhibición que se

genera.

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BIOENSAYO POR EL METODO DE CILINDRO DE AGAR.

Esta técnica tambien esta basada en la obtención de un halo de inhibición de crecimiento de una

cepa bacteriana sensible a la penicilina, utilizada como método de selección de transformantes. El

procedimiento es como sigue:

1. Se preparan placas de 90mm con medio MCFP y 2% de agar, niveladas perfectamente, y se

dejan solidificar a temperatura ambiente. Después se sacan los cilindros con un sacabocados de

8 mm de diámetro. Cada uno de los cilindros se coloca en la superficie de una placa estéril y

por triplicado se inoculan en el centro 103 esporas en un microlitro, procedentes de los

transformantes y cepas parentales de P. chrysogenum, dejándose incubar a 25 oC durante 72 a

96 horas.

2. Utilizando cajas de acrílico de 30 x 30 cm2 o cajas de petri de 15 cm, niveladas perfectamente,

se agregan 200 ml o 50 ml de TSA respectivamente, a una temperatura no mayor a 50 oC,

inoculando con B. subtillis.

3. Después de solidificado, se depositan sobre el medio cada uno de los cilindros de agar con las

cepas crecidas. Como control se utilizan cilindros limpios a los que se les agrega en el centro 70

µl de diferentes diluciones de penicilina. Las placas se mantienen durante 60 minutos a 4 oC

para permitir la difusión del antibiótico y posteriormente se incuban a 30 oC durante 16 a 18

horas para permitir la formación de los halos de inhibición.

4. Pasado el tiempo de incubación se mide el diámetro de los halos de inhibición.

PRODUCCION DE PENICILINA EN MEDIO LÍQUIDO Y SÓLIDO.

Después de haber seleccionado las transformantes mejoradas de ambas cepas se procede a la

valoración de la producción de penicilina, tanto en fermentación líquida como en sólida.

CONDICIONES PARA LA PRODUCCIÓN DE PENICILINA G POR FERMENTACION

LIQUIDA.

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Después de obtener las esporas se inoculan por triplicado matraces de 250 ml Con 45 ml de medio

MCFP y 5 ml del microorganismo preinoculado en medio MCIP. Se incuban durante 120 horas a 25 oC con agitación de 250 r.p.m.

Se toman muestras de 1 ml en tubos Eppendorf previamente pesados, cada 24 horas con el objeto de

determinar la producción de penicilina a lo largo de la fermentación y cuantificar la producción de

biomasa por peso seco. Se centrifugan a 14000 r.p.m. durante 15 minutos y se recogen 200 µl del

sobrenadante. (70 µl de este sobrenadante se utilizan para los bioensayos correspondientes). El

precipitado formado corresponde al micelio y los restos de carbonato de calcio del medio de cultivo,

que se disuelve agregando 200 µl de HCl al 5%. Una vez disuelto el carbonato de calcio se repite la

centrifugación y se desecha el sobrenadante, el precipitado restante llevándose a peso constante para

cuantificar la biomasa.

CONDICIONES PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA G POR FERMENTACION

SOLIDA.

Pretratamiento del soporte sólido:

Como soporte se emplea bagacillo de caña de azúcar. El bagacillo se tamiza en mallas No. 30 y 50

utilizando como soporte únicamente las partículas retenidas entre estas dos mallas (correspondiendo

a un tamaño de entre 0.297 a 0.59 mm). El bagazo obtenido se mezcla con 50% de agua total que se

utiliza en el medio de producción y se lleva a 3 libras/pulgada2 de presión a 121 oC en un autoclave.

Para llevar a cabo el proceso de pretratamiento y esterilización, la mezcla del bagazo y agua se

coloca en un vaso que se tapa perfectamente con celofán para impedir la pérdida o ganancia de

agua, de lo contrario la humedad final del medio se vería afectada.

Obtención del medio de cultivo:

Al bagacillo de caña tratado se le adiciona la cantidad adecuada de medio complejo de producción

2X. Inmediatamente se inocula con 2 x 106 esporas por mililitro de medio de cultivo cosechadas en

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las condiciones mencionadas anteriormente. Este soporte con una humedad inicial del 70% y un

30% de sólidos se emplea como soporte para llevar a cabo la producción de penicilina en medio

sólido.

PRODUCCIÓN.

La producción de penicilina se realiza empacando, por duplicado, columnas de vidrio con 12 g de

bagazo con medio y esporas a una densidad de empaque de 0.26 g/ml. Posteriormente las columnas

empacadas se sumergen dentro de una pecera con agua a una temperatura controlada de 25 oC y con

un flujo de aire húmedo de 2.4 L/h, durante aproximadamente 130 horas. En un humidificador

conectado a la parte inferior de cada columna, el aire se hace burbujear en agua antes de pasar por

cada una de ellas.

Extracción de las muestras en medio sólido.

Se toman dos columnas completas por cada transformante y parental cada 24 horas para determinar

la producción de penicilina a lo largo de la fermentación, para cuantificar la producción de biomasa

por peso seco y para determinar la humedad del medio.

Se desempaca totalmente cada columna, se pesa su contenido y se añaden 72 ml de amortiguador de

fosfatos a un pH de 5.5. Posteriormente, se mezcla perfectamente y se ajusta el pH entre 5 y 5.15,

con ácido fosfórico diluido. La mezcla anterior se centrifuga a 2700 r.p.m. durante 20 minutos, y un

volumen de 5 ml del sobrenadante se separa y se coloca en un tubo estéril. 70 µl de este

sobrenadante son suficientes para realizar los bioensayos correspondientes. El precipitado formado

se lava primero con 50 ml de una solución de HCl al 5% y después con 50 ml de NaCl al 0.9 %,

para eliminar restos de carbonato de calcio. El precipitado limpio se lleva a peso constante, para

cuantificar biomasa y porcentaje de humedad.

MEDIOS DE CULTIVO.

Medio TSA Peptona de caseína 17 g, peptona de soya 3 g, NaCl 5 g, K2HPO4 2.5g, glucosa 2.5 g,

agar bacteriológico 10 g, pH 7.3 Añadir agua destilada 1 litro y esterilizar.

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Medio Czapeck: Medio de esporulación y mantenimiento para Penicillium.

Sacarosa 30 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4-7H2O 0.5 g y FeSO4-7H2O 0.01 g. Se añade

agua destilada hasta 1 litro y agar al 2.0 % (p/v). Cuando se utiliza este medio para la regeneración

de protoplastos de P. chrysogenum se añade sorbitol en una concentración de 1M ó KCl a una

concentración de 0.7 M como estabilizadores osmóticos.

Medio PM1 (Lopez-Nieto y col. 1985) Medio de esporulación y mantenimiento.

Bacto-peptona 5 g, lactosa 5 g NaCl 4 g, sólidos de maceración de maíz 1 g. KH2PO4 60 mg,

FeSO4 7H2O 50 mg, FeCl3-6H2O 3 mg y CuSO4 5 H2O 1 mg. Se ajusta el pH a 5.5 con una solución

concentrada de H3PO4 y se añade agua destilada hasta 1 litro y agar al 2% (p/v) si se requiere en

forma sólida. Se esteriliza en autoclave.

Medio PW (POWER): Medio de crecimiento y esporulación.

Medio PM1 500 ml y medio Czapek - KCl 0.7 M 500 ml. Se añade agar al 2% (p/v).

Medio MCFP (Somerson y col. 1961): Medio complejo de fermentación de Penicillium.

lactosa 55 g, sólidos de maceración de maíz 35g CaCO3 35g, KH2PO4 7g, MgSO4 H2O 3g y

Fenilacetato potásico al 40% (p/v) 10 ml. Se ajusta el pH a 6.8 y se completa con agua destilada

hasta 1 litro.

MCFP 2x: Medio complejo de fermentación de Penicillium

Lactosa 110 g, Glucosa 14 g, Sólidos de maceración de maíz 70 g, CaCO3 20 g, KH2PO4 6 g,

MgSO4-7H2O 6 g, y Fenilacetato potásico al 40% (p/v) 10 ml. Se ajustó el pH a 6.5 y se añadió

agua destilada hasta completar un litro.

MCIP: Medio complejo de inóculo de Penicillium.

Sacarosa 20 g, NaNO3 2 g, K2HPO4 0.5g, MgSO4-7H2O 0.5 g, y FeSO4-7H2O 0.01 g. Se añadió

agua destilada hasta 1 litro y agar al 2.0 % (p/v).

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RESULTADOS Y DISCUSION: A continuación se muestran los resultados obtenidos en la fermentación liquida de la cepa Wisconsin 54-1255 y las transformantes TW-2 y TW-11.

Gráfica 1. Producción de penicilina en Wisconsin 54-1255 contra pH y Biomasa En la gráfica 1 se muestra la producción de penicilina en FL de la cepa parental Wisconsin

54-1255. En esta gráfica se puede observar la relación que existe entre la producción de

penicilina y el valor de pH y la biomasa que se observan en cada tiempo. En ambos casos

se observa un aumento en los valores de las variables estimadas. Del mismo modo, se

observa una disminución de la producción de penicilina a las 120 horas.

Parental Wisconsin Produccion, pH y Biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Bio

mas

a en

g.

0

2

4

6

8

10

pH0

200400600800

10001200

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

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Gráfica 2. Producción de penicilina de transformante TW-2 con pH y biomasa. En la gráfica anterior se muestra la cinética de producción de penicilina de la transformante

TW-2, en la que se observa la mayor producción de penicilina a las 48 horas, disminuyendo

la producción en los dos tiempos siguientes e incrementándose ligeramente a las 120 horas.

El pH se comporta en relación inversa a la producción de penicilina: cuando ésta aumenta

el pH disminuye, observándose que el pH en el que se alcanza la mejor producción es de

alrededor de 7.

TW-2 Produccion de penicilina, pH y biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5B

iom

asa

en g

.

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

pH

0

500

1000

1500

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

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Gráfica 3. Producción de penicilina de TW-11 con pH y biomasa. En la gráfica 3 se muestra la cinética de producción de penicilina en FL de la transformante

TW-11, en la que se observa que la mayor producción se alcanza a las 120 horas (con

tendencia a aumentar aún más la producción). A las 96 horas se ve un decremento en la

producción, que puede ser debido al incremento del pH (superior a 7.2). A las 120 horas se

aprecia una disminución del pH y un aumento en la producción de penicilina. La

producción de biomasa es similar a la producción de penicilina, lo que nos indica que la

relación producción vs. biomasa es proporcional.

TW-11 Produccion de penicilina, pH y biomasa.

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50B

iom

asa

en g

.

6.6

6.8

7

7.2

7.4

pH

0

500

1000

1500

2000

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

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Grafica 4. Cinética de producción de penicilina de la parental Wisconsin y las transformantes TW-2 y TW-11.

En la gráfica anterior se muestran las tres cinéticas de producción de la cepa parental

(Wisconsin 54-1255) y las transformantes analizadas (TW-2 y TW-11), en las que se

observa que la máxima producción analizada se alcanza a distintos tiempos: la mayor

producción de penicilina de TW-2 es a las 48 horas y la de TW-11 a las 120 horas, con una

tendencia a aumentar la producción en tiempos posteriores.

Cepa % de aumento en la producción.

Wisconsin 54-1255 0 TW-2 34 TW-11 10

Tabla 1. Porcentaje de aumento de la producción de penicilina en FL de la cepa Wisconsin 54-1255 y las transformantes TW-2 y TW-11. En la tabla 1 se observa el incremento obtenido con las transformantes de Wisconsin 54-

1255 en la FL. Se obtuvo un mayor aumento en la transformante TW-2 a las 48 horas de

producción, mientras que con la transformante TW-11 el aumento se obtuvo hasta las 120

horas.

Produccion de penicilina en F.L. de Wisconsin 54-1255 y transformantes.

0500

100015002000

24 48 72 96 120Tiempo en horas

Con

cent

raci

on d

e pe

n en

g/ m

L. WisconsinTW-2TW-11

21

Los siguientes resultados se obtuvieron de la FS en la cepa Wisconsin 54-1255 y las

transformantes TW-2 y TW-11 analizadas.

Gráfica 5. Producción de penicilina y registro pH de la Cepa Wisconsin 54-1255 en FS.

En la gráfica 5 se observa la cinética de producción de penicilina en FS de la parental

Wisconsin 54-1255, en la que se observa que la producción aumenta desde las 72 horas

hasta las 120 horas. En este caso la producción máxima registrada se da a las 120 horas,

aunque la ausencia de decrementos en los tiempos analizados sugiere que la producción

podría haber tenido un mayor aumento de continuarse la fermentación. Con respecto al pH,

en el punto máximo de producción tiene un valor de 7.03, lo que es un valor muy cercano al

pH reportado como óptimo para la producción de penicilina en FL.

Produccion de penicilina y pH. Wisconsin 54-1255.

6.60

6.70

6.80

6.90

7.00

7.10

pH.

0500

10001500200025003000

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

22

Grafica 6. Produccion de penicilina y registro de pH de TW-2 en FS.

En la grafica 6 se refleja la producción de penicilina por la transformante TW-2 en FS. Se

puede observar una tendencia de aumento en la producción desde las 72 horas hasta las 120

horas, con la mayor producción a las 120 horas. El pH a las 120 horas tiene un valor de

7.32.

Produccion de penicilina y pH de TW-2

6.20

6.40

6.60

6.80

7.00

7.20

7.40

pH.

0500

1000150020002500

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

23

Gráfica 7. Producción de penicilina y registro de pH de la cinética de la transformante TW-11.

En la gráfica anterior se observa la cinética de producción de penicilina y el pH registrado

en cada uno de los tiempos para la transformante TW-11. Se observa un incremento en la

producción en cada uno de los tiempos, siendo máxima a las 120 horas (tiempo final de

desarrollo del experimento). En ese tiempo, el valor de pH fue de alrededor de 7.1.

Produccion de penicilina y pH en FS de TW-11.

6.46.56.66.76.86.97.07.17.2

pH.

0

500

1000

1500

2000

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

24

Gráfica 8. Producción de penicilina de la cepa Wisconsin 54-1255 y las transformantes TW-2 y TW-11 en FS.

En la gráfica 8 se muestra un comparativo de la producción en FS de la cepa Wisconsin 54-

1255 y las transformantes TW-2 y TW-11, en el que se observa que la mejor producción

alcanzada fue de la cepa parental Wisconsin 54-1255. Las producciones registradas de la

parental y de TW-2 a las 120 horas aun tienen una tendencia a crecer mientras que la TW-

11 a las 120 horas ya tiene una tendencia a decaer.

Cepa % de aumento Wisconsin 0 TW-2 -20 TW-11 -39

Tabla 2. % de aumento en la producción en FS de Wisconsin 54-1255 y las transformantes TW-2 y TW-11.

En la tabla anterior se observa un decremento en la producción de penicilina en la FS de las

transformantes TW-2 y TW-11, tomándose como un 100% de producción la de la cepa

Wisconsin 54-1255.

Produccion de penicilina en F.S.

0500

10001500200025003000

72 96 120Tiempo en horas

Con

cent

raci

on d

e pe

n en

/ gs

sWisconsinTW-2TW-11

25

RESULTADOS de P2-32 EN FL Y FS:

A continuación se muestran los resultados obtenidos en la fermentación liquida de la cepa

P2-32 y las transformantes TP-20, TP-21 y TP-W26.

Gráfica 9. Cinética de producción de penicilina en FL de P2-32, con pH y Biomasa. En la gráfica 9 se observa la representación gráfica de la cinética de producción de la cepa

parental P2-32, en la que observamos que se alcanzo un máximo de producción a las 72

horas decreciendo ésta en el siguiente tiempo registrado y volviendo a aumentar a las 120

horas. En esta cinética de producción se observa una relación inversa con respecto al pH,

ya que cuando el valor de pH aumenta la producción disminuye y cuando el pH está a un

valor de alrededor de 7 la producción de penicilina aumenta. La biomasa aumentó con

respecto al tiempo, presentando una ligera disminución a las 48 horas.

Produccion de penicilina, en P2-32 pH y biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Bio

mas

a en

g.

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

pH

0500

10001500200025003000

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

26

Gráfica 10. Cinética de producción en FL de TP-20 con pH y biomasa. En la gráfica 10 se muestra la cinética de producción de la transformante TP-20, en la que

se observa que alcanza su punto máximo de producción a las 72 horas, registrándose un

decremento al siguiente tiempo (en este punto se observa un aumento en el pH). A las 120

horas se observa otro incremento en la producción, también con un decremento en el pH.

Respecto de la biomasa, se observa un constante incremento en cada uno de los tiempos

registrados de la cinética de producción.

Produccion de penicilina TP-20, pH y Biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Bio

mas

a en

g.

66.26.46.66.877.27.47.6

pH

0

500

1000

1500

2000

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

27

Gráfica 11. Cinética de producción de penicilina en FL. En la gráfica 11 se observa que el punto en el que se alcanzó la mayor producción de

penicilina es a las 96 horas. La producción de penicilina es, sin embargo, muy pequeña en

este punto, lo que puede ser debido a los altos valores de pH registrados (muy altos desde el

inicio). La biomasa se incrementa en cada uno de los tiempos.

Producción de penicilina TP-21, con pH y Biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Bio

mas

a en

g.

6

6.5

7

7.5

8

pH

0500

10001500200025003000

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

28

Gráfica 12. Cinética de producción de penicilina de la transformante TP-26 en FL. En la gráfica 12 se muestra la cinética de producción de penicilina de la transformante TP-

26, en la que tenemos una producción máxima a las 96 horas, decreciendo a las 120 horas.

En esta gráfica encontramos que la producción máxima se obtiene a un pH muy alto,

observándose que en este caso el incremento del pH es proporcional al aumento en la

producción de penicilina. La biomasa se encuentra en un aumento constante.

Producción de penicilina, TP-26 pH y biomasa.

0

0.5

1

1.5

2

Bio

mas

a en

g.

6.26.46.66.877.27.47.6

pH

0500

10001500200025003000

24 48 72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

29

Gráfica 13. Comparación de las cinéticas de producción de la parental P2-32 y de las transformantes.

En la gráfica anterior se muestra las cinéticas de producción de penicilina de la parental P2-

32 y de las transformantes TP-20, TP-21 y TP-26. En ella se puede observar una pequeña

mejoría en la producción de penicilina en dos de las transformantes con respecto a la

parental (que logró tener una producción similar a las transformantes con mayor producción

a las 120 horas). A las 72 horas es la cepa parental la que logra una mejor producción que

las transformantes, aunque en el siguiente punto la situación se invierte.

Cepa Incremento P2-32 0 TP-20 -34 TP-21 2 TP-26 13

Tabla 3. Porcentaje de incremento en la producción de penicilina.

En la tabla 3 se puede observar el porcentaje que se logró incrementar en la producción de

penicilina de algunas de las cepas transformantes comparándolo con la producción de

penicilina de la cepa parental (tomada como el 100% de producción). Como se puede

observar, sólo en una transformante se pudo lograr incrementar (en un 13%) la producción

de penicilina.

Produccion de penicilina en F.L.

0500

10001500200025003000

24 48 72 96 120Tiempo en horas

Con

cent

raci

on d

e pe

n en

g/

mL.

P2-32TP-20TP-21TP-26

30

Los siguientes resultados se obtuvieron de la FS en la cepa P2-32 y las transformantes TP-

20, TP-21 y TP-26 analizadas.

Gráfica 14. Cinética de producción de penicilina en FS de P2-32, con pH. En la cinética de FS de la gráfica 14 se observa la producción mayor en las 120 horas de

cultivo, con una tendencia a seguir creciendo. El pH registrado no alcanza el valor de 6.8,

representando un valor menor a los observados en casos anteriores. Se puede deducir,

también en este caso, que la producción probablemente sería superior si se analizara en

periodos más prolongados de tiempo.

Producción de penicilina de P2-32 en FS, con pH.

6.69

6.70

6.71

6.72

6.73

6.74pH

0500

1000150020002500

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

31

Gráfica 15. Cinética de producción de la transformante TP-20 y pH.

En la gráfica 15 se observa una curva similar a la de la cepa parental, en la que la

producción se encuentra en aumento sin haber alcanzado su punto máximo de producción

(probablemente mayor a las 120 horas). El pH también se encuentra en valores menores a

7.0, como en el caso anterior.

Producción de penicilina TP-20 y pH.

6.65

6.70

6.75

6.80

6.85

pH

0500

1000150020002500

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

32

Gráfica 16. Cinética de producción de penicilina en FS de TP-21 y pH. En la gráfica 16 se observa la cinética de producción de penicilina de la transformante TP-

21, en la que se observa la mayor producción a las 120 horas. En este caso, sin embargo, ya

no se aprecia una tendencia a seguir incrementándose la producción. El pH a las 120 horas

es de 6.84 y la producción de penicilina no es muy grande en esta transformante.

Producción de penicilina de TP-21, y pH.

6.55

6.60

6.65

6.70

6.75

6.80

6.85

pH

0200400600800

10001200

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

33

Gráfica 17. Cinética de producción de penicilina de TP-26 y pH.

En la gráfica 17 se observa la cinética de producción de penicilina por la transformante TP-

26 en FS, en la que se tiene una tendencia similar a la cinética de producción de P2-32 y

TP-20: a las 120 horas todavía no se alcanza el punto máximo de producción.

Producción de penicilina de TP-26, y pH.

6.406.456.506.556.606.656.706.756.80

pH

0

500

1000

1500

72 96 120

Tiempo en horas

Peni

cilin

a m

icro

gram

os/g

ss.

34

Gráfica 18. Comparación de la producción de la cepa P2-32, TP-20, TP-21 y TP-26.

En la gráfica anterior se observa la comparación de las cinéticas de producción en FS de la

cepa P2-32 y de las transformantes. En ella se observa que sólo una transformante alcanzó a

producir un poco más que la cepa parental, mientras que las otras dos transformantes

produjeron casi la mitad de lo que produce la parental.

Cepa % de aumento en la producción

P2-32 0 TP-20 5 TP-21 -49 TP-26 -43

Tabla 4. Porcentaje de aumento en la producción de penicilina de P2-32 y transformantes.

En la tabla 4 se observan los porcentajes de aumento y disminución en la producción de

penicilina de la cepa P2-32 y de las transformantes sometidas a FS. En ella se observa que

sólo en una de éstas se consiguen mejoras, de sólo un 5%, en la producción de penicilina

mientras que en las otras dos el decremento en las producción es casi del 50%, en una de

ellas, y del 43% en la otra.

Produccion de penicilina en F.S.

0500

1000150020002500

72 96 120Tiempo en horas

Con

cent

raci

on d

e pe

n en

/ gs

s

P2-32TP-20TP-21TP-26

35

CONCLUSION: • Aplicando las técnicas de ingeniería genética la producción de penicilina se incrementó

solo en la FL en ambas transformantes, el incremento de la producción fue mejor en la

cepa Wisconsin 54-1255 mientras que en la cepa P2-32 solo en dos transformantes se

aumento la producción de penicilina, pero el incremento no fue tan substancial como en

la cepa Wisconsin.

• En la FS la producción de penicilina no se logro incrementar ya que solo encontramos

un pequeño incremento en la transformante TP-20 de 5% que es la que produce menos

en FL:

Cepa Producción µG/Ml. Incremento %

FS FL FS FL P2-32 2182 2484 0 0 TP-20 2281 1385 5 -34 TP-21 1115 2552 -49 2 TP-26 1250 2809 -43 13

WISCONSIN 54-1255 2581 1050 0 0 TW-2 2053 1410 -20 34 TW-11 1575 1160 -38 10

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regulación en la biosíntesis de penicilina en Penicillium chrysogenum DogR5. Tesis de

Maestría. UAM-I. (Mencionado en 1)

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