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Centro Médico Nacional Siglo XXI IMSS
Universidad Autónoma MetropolitanaUnidad Iztapalapa
Licenciatura en Biología Experimental
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Análisis de la expresión del complejo Sarcoglicano-Sarsocpan y de proteínas asociadas en pacientes
que sufren Distrofia Muscular
Dr. José Luis Gómez OlivaresDr. Fabio Salamanca Gómez
Dr. Ramón M. Coral Vázquez (Tutor Principal)
Alumna: K. Angélica Hernández Varela
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• Son un grupo diverso de enfermedades, caracterizadas por debilidad y atrofia muscular progresiva.
• El defecto primario se hace evidente en el músculo esquelético, donde ocurren procesos de degeneración de fibras, núcleos centrales, necrosis muscular y reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposo.
Distrofias Musculares
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A:Tipo Duchenne y Becker
B: Emery- Dreifuss
C: Cintura
D: Facioescapulohumeral
E: Distal
F: Oculofaringea
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Complejo de Proteínas Asociadas a distrofina
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•Músculos involucrados• Edad de inicio• Progresión de la enfermedad• Modelo de herencia• Proteína(s) anómala(s) o deficiente(s)
Criterios de clasificación
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Analizar la expresión génica y proteica del complejo distrofina-glicoproteínasen biopsias de pacientes diagnosticados con distrofia muscular
Objetivo General
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a) Clasificar a un grupo de pacientes con distrofia muscular.b) Creación de un banco de muestras DNA y biopsias musculares.c) Análisis inmunohistoquímicos de biopsias musculares.d) Identificación de las mutaciones alguno(s) gene(s) que codifica(n) para proteínas ausentes o anómalas.
Objetivos Particulares
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Estrategia Experimental
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Diagnóstico clínico de distrofia muscular
Biopsias de músculo esquelético
Inmunodetección por flourescencia
No detección de proteína de interés
Detección de proteína de interés
Preservación de la biopsia
Análisis de DNA
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Criterios de inclusión
•Exploración física por el médico-genetista:•Fuerza •Sensibilidad•Historia clínica (antecedentes familiares)
•Examen de laboratorio•Creatinina-fosfato cinasa (CPK 200-400 U/I)•Electromiografía•Electrocardiograma
•Biopsia•Tinción de Hematoxilina y Eosina•Fibras hipertróficas•Núcleos centrales•Reemplazo de tejido muscular por conjuntivo y adiposo
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Anticuerpos-primarios conjugados con fluorocromos
Biopsias
Congelación
Criostato7-10 µm
Portaobjetos
C M1 M2 M3
Microscopio de Epi-fluorescencia
Inmunoflourescencia indirecta
Distrofina, α-, β-, γ-, y δ-Sarcoglicanos, Laminina, Lamina A/C, Teletonina, Emerina
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Resultados de inmunofluorescencia
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92 pacientes estudiados
Distribución según tipo de distrofia:
10 Pacientes con ausencia de distrofina12 Pacientes con disminución de distrofina
4 Pacientes con disminución de Sarcoglicanos
56 Pacientes con presencia de todas las proteínas estudiadas
7 Pacientes sin fibras musculares.2 Pacientes con ausencia de disferlina
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Deficiencia en distrofina
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Reducción en la expresión en distrofina
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Positivo para todas las proteínas
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Disminución en expresión de sarcoglicanos
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Reducción en la expresión γ-sarcoglicano
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Deficiencia en Laminina
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Número de fibras musculares reducidas
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Análisis de fenotipo y relación familiar
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Pedigree familiar P-57
Músculos afectados distalesEscápulas aladasFatigaCamina de puntasHiperlordosis
Disferlina Dys-3 Dys-2C P C P C P
25 22 20
Consanguinidad
I
II
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Pedigree familiar P-77
CPK de 460022 añosDebilidad MuscularH.E. Reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposoEdad de inicio 14 añosCamina con fatiga
Dys-3 Dys-2Disferlina
C P C P C P
I
II
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Pedigree familiar P-24
Masculino 31 añosCPK 3961
Se han aplicado otrasproteínas, Lamina,Emerina,Teletonina +
Progreso Lenta6 años-31 años
DX Cinturas, DMB
I
II
III
IV
V
VI
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Pedigree familiar P-85
Femenino 3 añosCPK 979CaídasHiperlordosisGowersElectromiografíaNormalAutosómica DominanteProbarLamina A/C, caveolina
I
II
III
IV
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Análisis de DNA
DNA
Amplificaciónpor PCR
Electroforesis
Secuenciación del gen LAMA2 y
comparación conbase de datos
Sangre
Purificación
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Conclusiones
• El análisis de inmunofluorescencia en las biopsias de 92 pacientes que sufrían con distrofia muscular mostró había una asociación entre la deficiencia y/o disminución en algunas proteínas del complejo de glucoproteínas asociadas a distrofina.
• El estudio permitió constituir un banco de biopsias musculares de un grupo de pacientes con éste tipo de sindromes.
• En una paciente se identificó una mutación en el gen que codifica para la proteína merosina (Lamma2) que permitió identificar a los portadores dentro de la familia.
• Se identificó deficiencia de γ−sg para un paciente y de Disferlina para dos pacientes, siendo candidatos para análisis de DNA.
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• En algunos pacientes que resultaron positivos en las proteínas analizadas, se realizaráanálisis de inmunotransferencia de gel a membrana o inmunofluorescencia para otras proteínas.
• En los pacientes que resultaron con deficiencia o reducción en la expresión de distrofina se les podrá realizar análisis de deleciones.
Perspectivas