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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO Y FRACCIONES SEMIPURIFICADAS DE LA ESPONJA
Aplysina gerardogreeni.
TESIS
QUE COMO UNO DE LOS REQUISISTOS PARA OBTENER EL TITULO DE:
BIOLOGO MARINO
PRESENTA:
Sonia Scheherazad Valencia Agamí
La Paz Baja California Sur, México OCTUBRE de 2010
La presente tesis se realizó en el Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas
(CICIMAR-IPN) bajo la dirección de la Dr. Claudia Judith Hernández Guerrero, dentro
de los proyectos “Bioactividad de metabolitos secundarios derivados de macroalgas y
esponjas y su papel ecológico en un arrecife rocoso del Golfo de California”. CONACYT
79707, y “Variación temporal de la bioactividad y comunidad microbiana asociada la
esponja Aplysina spp.” SIP20090866 y SIP 20100862.
III
DEDICATORIA
Les dedico esta tesis a todas las personas que me ayudaron a seguir este sueño.
Comenzando por mi familia en general por siempre confiar y creer en mí, en especial
A mi madre Raquel Agami quien me ha apoyado desde el día que nací.
A mis tíos Sandra Agami y Sansón Minquiz por siempre estar a mi lado
en los buenos y en los malos momentos.
A mis hermanos Ari, Angélica y Jorge quienes me han brindado una
profunda alegría con cada tontería y momento compartido, a mi sobrino Ángel
por ser una alegría que complementa mi vida y a mi cuñado Israel.
A mis amigos quienes me han apoyado y acompañado en este viaje y en cada locura
muchas gracias chicos y chicas. En especial a las gordas (Abi, Tony, Susy y Mare)
por todas y cada una de las experiencias vividas y las que faltan por vivir.
A la familia Fita-Andrade por el apoyo que me ha brindado durante mi estancia en La
Paz.
A Claudia Hernández por la paciencia y tiempo invertido en esta tesis y en mí.
IV
AGRADECIMIENTOS
Quiero comenzar agradeciendo a la institución del CICIMAR-IPN que prestó sus
instalaciones para la realización de esta tesis.
A Claudia Hernández por aceptarme en este proyecto, y dedicar parte de su tiempo
para que saliera bien.
A la Dra. Bárbara González Acosta por ayudarnos con las pruebas de actividad
antibacteriana.
A la Dra. Eva Zubia Mendoza por su ayuda en la realización de los espectros de
Resonancia Magnética Nuclear en la Universidad de Cádiz.
A todos los que facilitaron la realización de esta tesis muchas gracias.
V
INDICE
RELACION DE TABLAS Y FIGURAS ...................................................................................... VI GLOSARIO ............................................................................................................................. VIII ABREVIATURAS ...................................................................................................................... XI RESUMEN. .............................................................................................................................. XII INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 4
BIOLOGÍA DE LA ESPECIE Y TAXONOMIA ........................................................................... 12
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ |3
HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 14 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 14
METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 15
Área de estudio................................................................................................................. 15
Obtención del material biológico .................................................................................... 16 Extracción y fraccionamiento .......................................................................................... 16
Ensayos de actividad de extractos y fracciones frente a bacterias patógenas para el hombre. .............................................................................................. 18
Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones obtenidas..21
RESULTADOS.......................................................................................................................... 22
Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni. ......................... 22
Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A. gerardogreeni. .................................................................................................................. 24
Fracciones F1 y F2. ................................................................................................. 25
Fracción F3 .............................................................................................................. 27
Fracción F4 y F5. ..................................................................................................... 28
VI
DISCUSIÓN. ............................................................................................................................. 30
Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni .......................... 30
Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A. gerardogreeni ................................................................................................................... 32
Fracciones F1 y F2………………………..………………………………………………33
Fracción F3 .............................................................................................................. 35
Fracción F4 y F5. ..................................................................................................... 35
CONCLUSIONES. .................................................................................................................... 36
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 37
VII
RELACION DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Compuestos derivados de la dibromotirosina aislados a partir de esponjas del genero Aplysina ......................................................................... 7
Figura 2. Área de estudio en la zona de Punta Arena de la Ventana, B.C.S. ............... 15
Figura.3 fraccionamiento del extracto NI ...................................................................... 17
Figura 4. Fracciones que fueron probadas frente a las cepas bacterianas................... 20
Figura 5. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a S.aureus. .......................................................................................... 22
Figura 6. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a E.coli. . ............................................................................................. 23
Figura 7. Espectro de 1H-RMN del producto 1 en CDCl3 .............................................. 26
Figura 8. Espectro de 1H-RMN de la fracción F3 en CDCl3. ......................................... 28
Figura 9. Espectro de 1H-RMN de las fracciones F4 y F5 en CDCl3. ............................ 29
Figura 10. Estructura química de la aerothionina ........................................................ 34
Tabla 1. Actividad antibacteriana de diversos compuestos aislados de esponjas del género Aplysina. .......................................................................... 8
Tabla I. promedio de los halos y desviación estándar del extracto a diferentes concentraciones.. ........................................................................... 24
Tabla II. Halos para el primer fraccionamiento del extracto. Se muestra el promedio y la desviación estándar. ............................................................. 25
VIII
Tabla III. Halos de las fracciones correspondientes al fraccionamiento de la alícuota 1. .............................................................................................. 27
Tabla IV. Desplazamientos químicos de 1H-RMN del compuesto aerothionina en acetona y cloroformo deuterado .............................................................. 33
IX
GLOSARIO
Actividad Antimicrobiana: capacidad de una sustancia que es efectiva contra
microorganismos, ya sea porque suprime su crecimiento o eventualmente puede
destruirlos.
Alelopatia: fenómeno que implica la inhibición directa de una especie por otra ya sea
vegetal o animal usando sustancias toxicas o disuasivas.
Antibiotico: sustancia química producida por un ser vivo o sintetizada por métodos de
laboratorio que a determinada concentración mata o impide el crecimiento de
ciertas clases de microorganismos sensibles.
Bioensayo: Proceso experimental mediante el cual se determinan las características y
la fuerza de una sustancia potencialmente tóxica o de un desecho metabolito, a
través del estudio de sus efectos sobre organismos cuidadosamente escogidos y
bajo condiciones específicas de laboratorio.
Biotoxina: Sustancia tóxica producida por animales y derivados de plantas
Cabeza de serie: Primero de una serie de fármacos de estructura química y perfil
farmacológico similares.
Cepa: variante genotípica de una especie o, incluso, de un taxón inferior, usualmente
propagada clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades
definitorias.
Citotóxico: Agente o sustancia que daña o destruye cualquier variedad de célula o
tejido.
Deuterado: compuesto orgánico en el que los hidrógenos fueron reemplazados por
deuterio.
Fármaco: sustancia química purificada utilizada en la prevención, diagnóstico,
tratamiento, mitigación y cura de una enfermedad; para evitar la aparición de un
X
proceso fisiológico no deseado; o para modificar condiciones fisiológicas con
fines específicos.
Gram Negativa: bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue. Esta característica está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular.
Gram Positiva: bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.
Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular.
Halogenado: compuestos orgánicos sintéticos, y algunos naturales que contienen
halógenos.
Hemoaglutinación: Aglutinación de las células sanguíneas.
Hemolisis: fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o hematíes).
Lecounoide: Organización de mayor complejidad que presentan la mayoría de las
esponjas de la clase Demoespongia.
Metabolito Secundario: compuestos orgánicos sintetizados por el organismo que no
tienen un rol directo en el crecimiento o reproducción del mismo.
Morbilidad: proporción de personas que enferman en un sitio y tiempo determinado.
Olefínico: compuestos con doble enlaces.
Porifero (porífera): filo de animales invertebrados acuáticos que se encuentran dentro
del subreino Parazoa. Son mayoritariamente marinos, sésiles y carecen de
auténticos tejidos.
Resistencia Bacteriana: fenómeno creciente caracterizado por una refractariedad
parcial o total de los microorganismos al efecto del antibiótico generado
principalmente por el uso indiscriminado e irracional de éstos y/o sólo por la
presión evolutiva que se ejerce en el uso terapéutico.
XI
Sensidisco: Disco de papel filtro de poro grueso y de diámetro variable, impregnado
con el antibiótico de prueba.
Tirosina: uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas. Se clasifica como un
aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su síntesis se produce a partir
de la hidroxilación de otro aminoácido: la fenilalanina.
XII
ABREVIATURAS
AcOEt: Acetato de etilo
(CD3)2CO: Acetona
1H-RMN: RMN de protón
CC: Cromatografía en columna
CHCl3: Cloroformo
d : Doblete (tipo de desdoblamiento de una señal de RMN)
HEX: Hexano
J: Coeficiente de acoplamiento (ayuda a explicar los espectros de los compuestos)
MeOH: Metanol
Rf: Factor de retención
RMN: Resonancia magnética Nuclear
s : singlete (tipo de desdoblamiento de una señal de RMN)
TSA: Agar soya Tripticasa
UV: Ultra violeta
δ : Desplazamiento químico (ayuda a explicar los espectros de los compuestos)
XIII
RESUMEN.
La mayoría de los productos bioactivos de origen marino se han aislado a partir de
invertebrados, siendo las esponjas una de las fuentes más prometedoras de nuevas
sustancias para el desarrollo de fármacos. A partir de esponjas del género Aplysina se
han descrito diversos compuestos que han mostrado actividad antimicrobiana,
antitumoral, antiadherente, antiparasitaria, antihistamínica y como inhibidores de
diversas enzimas. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad
antibacteriana del extracto y fracciones semi-purificadas de la esponja Aplysina
gerardogreeni del arrecife rocoso de Punta Arena, B.C.S., México. La recolección de
los ejemplares se realizó en septiembre de 2008, en el arrecife de Punta Arena de la
Ventana, B.C.S., empleando equipo de buceo SCUBA. Los cuales se trasladaron en
hielo al Departamento de Desarrollo de Tecnologías del CICIMAR, donde se
mantuvieron a -30°C hasta su utilización. A partir de los ejemplares se realizó una
extracción con acetona-MeOH 1:1 y posteriormente metanol. El extracto obtenido fue
sometido a fraccionamiento mediante cromatografía en columna (CC). Se obtuvieron
3 fracciones, donde solo la Fracción 1 fue activa, por lo que fue sometida a un
segundo fraccionamiento hasta la obtención de varias fracciones semipurificadas. A
cada una de las fracciones se les sometió a un análisis de cromatografía en capa fina
y de RMN, dando lugar a la obtención del compuesto aereothionina y las fracciones
semipurificadas F3, F4 y F5. Los resultados de actividad antibacteriana del extracto
crudo, mostraron que fue activo con una concentración mínima inhibitoria (MIC) de 40
mg mL-1 frente a las cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Con respecto a
las fracciones, F4 fue la más activa presentando a una concentración de 0.5 mg, halos
de inhibición de 17.2 y 18.2 mm frente a S.aureus y E.coli respectivamente.
Palabras Clave. Esponjas, Aplysina, actividad antibacteriana, MIC.
1
INTRODUCCIÓN
La búsqueda de productos naturales de origen marino tienen gran interés
debido a varios factores, como son la extraordinaria biodiversidad que existe en los
ecosistemas marinos que cubren aproximadamente el 70% de la superficie del
planeta, la capacidad de los organismos para sintetizar metabolitos secundarios
bioactivos como mecanismos de defensa química (Pawlik, 1993), así como las
novedosas y variadas estructuras químicas que presentan estos metabolitos
(Faulker, 2002; Blunt, 2006).
La mayoría de los productos bioactivos de origen marino se han aislado a
partir de invertebrados, siendo las esponjas las fuentes más prometedoras de nuevas
sustancias para el desarrollo de fármacos (Munro, 1999). A partir de ellas se han
aislado compuestos pertenecientes a muy diversos tipos estructurales incluyendo
terpenos, esteroides, poliacetilenos, alcaloides, nucleosidos y péptidos, muchos de
los cuales tienen interés biomédico debido a sus propiedades antivirales,
antimicrobianas, antiinflamatorias o antitumorales (Faulker, 2002; Blunt, 2006) .
Las esponjas del orden Verongida (Phylum Porífera; Clase Demospongia)
constituyen la principal fuente natural de metabolitos bromados biogenéticamente
relacionados con la tirosina. Este orden incluye los géneros Aplysina, Ianthella,
Psammaplysilla, Pseudoceratina y Verongula entre otros (León, 2000). Las especies
del género Aplysina contienen altas concentraciones de metabolitos bromados (hasta
el 13% del peso seco), los cuales le confieren a la esponja características
2
antidepredatorias y por otra parte algunos de estos compuestos presentan actividad
antimicrobiana y citotóxica (Sharma y Burkholder 1967, Kreuter et al. 1990, Weiss et
al. 1996, citados por Hentschel et al. 2001; Kazanjian & Fariñas, 2006).
En México, los padecimientos infecciosos producidos por bacterias, en
particular diarreas e infecciones respiratorias agudas, propician elevados índices de
mortalidad en los menores de 5 años (Programa Nacional de Salud, 2007). Desde
los años cuarentas se han obtenido, comercializado y utilizado una gran cantidad de
antimicrobianos (Daza-Pérez, 1998), pero estos no han sido cien por ciento
eficientes debido a que las cepas bacterianas han presentado resistencia a algunos
de estos fármacos. A partir de 1950 se comenzaron a ver manifiestos de que las
bacterias eran capaces de desarrollar mecanismos de resistencia, los casos más
conocidos fueron los de las cepas de S. aureus resistentes a la penicilina. (Daza-
Pérez, 1998). De tal forma que las infecciones causadas por bacterias resistentes
se asocian a una mayor morbilidad y costos que las causadas por bacterias
sensibles de la misma especie (Daza-Pérez, 1998).
Puesto que no se puede evitar la resistencia ni predecir con fiabilidad la
irrupción de nuevos agentes infecciosos, la forma de mitigar estos efectos es la
búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos que se constituyan en “cabezas de
serie” por su estructura química o por su mecanismo de acción. En este sentido los
extractos orgánicos de la esponja Aplysina gerardogreeni, han demostrado que
presentan una interesante actividad antibacteriana frente a cepas de bacterias
resistentes (Montes-Plascencia et al., 2010) y en el área de Punta Arena de la
3
Ventana esta esponja es abundante, por lo que resulta interesante continuar con el
estudio de esta especie con la finalidad de fraccionar el extracto hasta aislar y
caracterizar ya sea las fracciones activas o los compuestos responsables de la
actividad antibacteriana.
4
ANTECEDENTES
La información sobre el uso de los productos naturales con fines medicinales
data de por lo menos 4000 años, aunque se considera que su aplicación es tan
antigua como el hombre mismo (Bongiorni & Pietra, 1996).
Los estudios realizados en las últimas décadas muestran que las esponjas
producen una gran variedad de biotoxinas, algunas de ellas bastante potentes. Las
Investigaciones sobre la bioquímica de las esponjas han puesto de manifiesto que
los antibióticos también son frecuentes en el cuerpo de una gran variedad de estos
organismos. Las diferentes especies de esponjas han desarrollado compuestos
químicos llamados sustancias alelopáticas, que pueden ser disuasorias específicas
o incluso “armas letales” contra competidores por el espacio; por lo tanto muchas de
las sustancias químicas que producen, están siendo estudiadas por los
farmacéuticos, químicos y biólogos por su interés como productos naturales con
una posible utilización en la industria farmacéutica (Brusca y Brusca, 2005).
Los poríferos constituyen uno de los grupos más biodiversos y abundantes
de invertebrados con más de 7000 especies descritas, aunque se ha estimado que
el número real podría superar las 15000 especies (Hooper & Van Soest 2002;
Carballo, 2008), las cuales están clasificadas dentro del phylum Porifera, que está
compuesto de tres grupos distintos: Hexactinelidae, Demospongiae y Calcarea
(Dembitsky, et al., 2005).
5
Las esponjas, son uno de los grupos marinos con mayor cantidad y variedad
de compuestos químicos secundarios con potencial farmacológico (Blunt et al.,
2006; Fenical, 1982; Rodriguez & Piña, 1993 en Lanza et al., 2006). Hasta 1999 se
habían aislado 12,000 compuestos procedentes de organismos marinos, de los
cuáles, una tercera parte tiene su origen a partir de las esponjas (Garson, 1994 en
Navarro, 2005; Dembitsky et al., 2005).
Las esponjas pertenecientes al orden Verongida contienen una gran cantidad
de metabolitos derivados de la dibromotirosina. Estos alcaloides presentan una
bioactividad muy variada que incluye actividad antimicrobiana, citotóxica,
antiincrustante, antiviral, reguladora de ATPasas y moduladora de canales de calcio
(Peng et al., 2005; Alvarez, 2007).
Existen diversos trabajos relacionados con la búsqueda de actividad biológica
a partir de extractos de esponjas del género Aplysina. Keer (1988), que realizó una
selección de organismos con actividad antimicrobiana utilizando esponjas, cnidarios
y equinodermos marinos; las pruebas de actividad se realizaron frente a Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis (bacterias Gram positiva),
Escherichia coli (Gram negativa) y Candida albicas. De los extractos etanólicos
analizados, se encontró que una esponja del género Aplysina presento actividad
antimicrobiana, al igual que seis especies más de cnidarios. Por otra parte a partir del
extracto acuoso de la esponja Aplysina lacunosa, se analizaron sus actividades
biológicas, tales como, la hemoaglutinación, la hemolisis, actividad antibacterial y
antifungal. Los ensayos de actividad antibacteriana resultaron positivos frente a
6
Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, y Salmonella enteritidis, ésta
actividad fue atribuida a la presencia de saponinas, alcaloides, taninos y polifenoles
(Kazanjian y Fariñas, 2006). Bonay y Fresno (2000), realizaron la purificación y
caracterización de lectinas a partir de extractos de diferentes especies del género
Aplysina, (Aplysina archeri, A. lacunosa, y A. cauliformis); las cuales fueron
altamente reactivas y con actividad panaglutinante frente al panel de células rojas
probadas. Un estudio realizado con el extracto de la esponja A. caissara recolectada
en Brasil, permitió evaluar su efecto antiinflamatorio y analgésico en ratones, los
resultados indicaron un efecto significativo para aliviar el dolor y la inflamación de las
constricciones abdominales (Azevedo et al., 2008). Estudios de la variación
estacional de la actividad antibacteriana de extractos de Aplysina fistularis, mostraron
que la esponja presenta actividad, la cual se ve modificada en función de la cantidad
de organismos asociados a la esponja (Betancourt et al., 1998).
A partir de esponjas del género Aplysina se han aislado compuestos que se
derivan de modificaciones que se generan en el anillo aromático de la tirosina y en
su cadena lateral, así como de la unión de varios restos derivados de la
bromotirosina entre sí y/o con otras unidades, que frecuentemente derivan de otros
aminoácidos. Dando lugar a compuestos desde monómeros simples como la
aeroplysinina-1 o con cadenas laterales como la aerophobina-1, hasta compuestos
formados por dos restos derivados de la tirosina enlazados a través de una unidad
central de naturaleza y extensión variable, como la aerothionina o la fistularina-3
(Fig. 1).
7
aeroplysinina-1 Aerophobina-1
tirosina tirosina histamina
Aerothionina
tirosina tirosina
11-desoxifistularina-3 O
N
O
NH
O
OHHN
O
NO OH
OMeBr
MeO
Br
Br
Br
BrOH
Br
tirosina tirosina tirosina
Figura 1. Compuestos derivados de la dibromotirosina aislados a partir de esponjas del genero Aplysina.
Este tipo de compuestos presentan diversos tipos de actividades biológicas,
entre las cuales se puede mencionar que son inhibidores enzimáticos (Koulman et
al., 1996), presentan actividad frente a cepas resistentes de Plasmodium falciparum
y Trypanosoma cruzi (Gutiérrez et al., 2005), inmunosupresores (Gunasekera et al.,
1991), actividad citotóxica frente a diferentes líneas de células humanas (Ciminiello
MeO
Br
Br
OHO N
O
NH
NH
N
ON
O
NH
HN
O
NO
OH
BrBr
MeO
OHBr
Br OMe
8
et al., 1999; Compagnone et al., 1999) y actividad antibacteriana, que es una de las
más significativas. En la tabla 1 se muestran los compuestos aislados de este
género que presentan actividad antibacteriana.
Tabla 1. Actividad antibacteriana de diversos compuestos aislados de esponjas del género
Aplysina.
compuestos Especie (Localidad)
Actividad antibacteriana
(Cita)
Aereoplisinina-2
OMe
BrBr
OHO
O
H
A. Aerophoba (Panamá)
Streptococcus aureus S. pyogenes Samonella typhi Shigella sonnei (Minale et al., 1972)
Aeroplisinina-1
A. aerophoba S. albus B. cerus B. subtilis (Fattorusso et al., 1972)
Aplisinadieno
A. aerophoba S. aureus Streptococuss pyogenes Samonella typhi Shigella sonnei (Norte & Fernández, 1987)
Aplisinamisina-I
A. cauliformis
Venezuela
P.aeruginosa (Ávila-Nuñes, 2000)
E. coli P.aeruginosa S.aureus
(Rodríguez & Piña, 1993)
OMe
BrBr
HOHO
CN
O
O
Br
HO
Br
MeO
Br
Br
OHO N
O
NH
N
NH
NH2
9
ON
O
NH
OH
O
OHHN
O
NO OH
OMeBr
MeO
Br
Br
Br
BrOH
Br
Aplisinamisina II
A. cauliformis Puerto rico
E. coli P.aeruginosa S.aureus (Rodríguez & Piña, 1993)
11-oxoaereothionina
A. lacunosa Puerto rico
E. coli P.aeruginosa S.aureus
Mic=30µg/ml
(Acosta & Rodríguez,
1992)
Aerofobina-2
A. lacunosa
Venezuela
E.coli (Ávila-Nuñes, 2000)
11-desoxifistularina-3
ON
O
NH
O
OHHN
O
NO OH
OMeBr
MeO
Br
Br
Br
BrOH
Br
A. lacunosa
Venezuela
P.aeruginosa S.aureus (Ávila-Nuñes, 2000)
Fistularina-3
A. caissara
Brasil
E. coli P.aeruginosa S.aureus (De Lira et al., 2006)
MeO
Br
Br
OHO N
O
NH
N
NH
NH2
ON
O
NH
HN
O
NO
OH
OMe
Br
Br
Br
MeO
OH
O
Br
MeO
Br
Br
OHO N
O
NH NH
N NH2
10
11-hidroxiaereothionina
B. caissara Brasil
E. coli P.aeruginosa S.aureus (De Lira et al., 2006)
Aerothionina
A. gerardogreeni
México
M. tuberculosis H37Rv
monoresistentes Mic= 12.5 µg/ml (Encarnacion-Dimayuga et al., 2003)
Calafianina
ON
O
NH
HN
O
NO
OBr
Br
OO
O
A. gerardogreeni
México
M. tuberculosis H37Rv
multiresistentes Mic= 6.5 µg/ml (Encarnacion-Dimayuga et al., 2000)
2-hidroxi-3,5-dibromo-4-metoxifenil A. gerardogreeni
México
S. aureus MIC=250µg/ml
A. subtilis
Mic= 250 µg/ml Streptococuss fecalis
Mic= 62.5 µg/ml E.coli Mic= 500 µg/ml Vibrio harveyi
Mic= 500 µg/ml Candida albicans.
Mic= 500 µg/ml (León, 2003)
En lo referente a la esponja Aplysina gerardogreeni, Se han aislado diversos
compuestos con actividad antibacteriana, antimicobacteriana y citotóxica.
Encarnación et al. (2000) realizaron el aislamiento de los compuestos, aerothionina,
el ácido 3,5-dibromo-2-hidroxi-4-metoxifenilacético y el nuevo compuesto
ON
O
NH
HN
O
NO
OH
BrBr
MeO
OHBr
Br OMe
ON
O
NH
HN
O
NO
OH
OMe
Br
Br
Br
MeO
OH
OH
Br
11
calafianina. La estructura de este último fue determinada por análisis de RMN y
espectrometría de masas y en 2006 Ogamino y Nishiyama realizaron una revisión
de la estructura de la calafianina, la cual revela una relación trans de dos átomos de
oxigeno entre el epioxido y la isoxazolina. Tanto la calafianina como la aerothionina
presentaron actividad frente a diferentes variantes de M. tuberculosis (Tabla 1)
(Encarnación et al., 2003). Por otra parte el compuesto 2-hidroxi-3,5-dibromo-4-
metoxifenil presentó actividad antibacteriana (Tabla 1) (León, 2003). Posteriormente
Hernández-Guerrero et al. (2007) aislaron 18 compuestos derivados de la
dibromotirosina, de los cuales cuatro fueron descritos por primera vez, las
aplysinonas A-D, las cuales mostraron actividad citotóxica frente a las líneas de
células tumorales humanas MDA-MB-3231, A-549 y HT-29.
A partir de extractos de A. gerardogreeni, se ha realizado una evaluación de la
variación estacional de la actividad antibacteriana de los extractos frente a las cepas
de S. aureus y E.coli. Donde se encontró que la mayor actividad se presentó en
otoño, con halos de inhibición de 24.6mm y 24.4mm para cada cepa a una
concentración de 80mg mL-1 (Montes-Plascencia et al., 2010).
12
BIOLOGIA DE LA ESPECIE Y TAXONOMIA
Aplysina gerardogreeni (Gómez & Bakus, 1992) es una esponja tipo
Leuconoide, su color natural es amarillo- ocre en la base y rojiza en la parte superior.
Es de constitución masiva, provista de tubos pequeños en la cima, la superficie es
finamente conulosa, con conulos no menores a 1mm de alto. La dermis mide entre
60 a 278µm de grosor. Los canales excurrentes miden de 1 - 2mm de diámetro. Las
cámaras de coanocitos varían de 12 – 17 µm de diámetro. Presenta una
fibroreticulación poligonal irregular, sin distinción entre primarias y secundarias, el
diámetro de la fibra es de 200-2000 µm. A. gerardogreeni habita en las comunidades
rocosas y se distribuye a lo largo de la costa del Pacifico Mexicano hasta los 33m de
profundidad. Es muy frecuente encontrar a esta esponja asociada a moluscos
opistobranquios del genero Tylodina, los cuales se alimentan activamente de la
esponja e incluso depositan sobre ella las puestas para que la siguiente generación
eclosione directamente sobre su alimento (Suarez, 2002).
Phyllum: porífera
Clase: Demospongia
Subclase: Ceranctinomorpha
Orden: Verongida (Bergquist, 1978)
Familia: Aplysinidae (Carter, 1875)
Género: Aplysina (Nardo, 1813)
Aplysina gerardogreeni (Gómez y Bakus, 1992).
13
JUSTIFICACION
En la actualidad existe una evidente problemática con el uso de agentes
antibacterianos, debido a la resistencia por parte de las bacterias hacia los fármacos
existentes. Diversas cepas de bacterias Gram positivas (Streptococcus pneumoniae,
Enterococcus spp, Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Klebsiella spp y
Escherichia coli) presentan una resistencia creciente. Por lo que la industria
farmacéutica ha dirigido sus esfuerzos a la investigación de nuevos medicamentos.
Mucha de esta investigación está orientada principalmente hacia bacterias Gram
positivas, que son las que afectan en mayor medida a Norteamérica y Europa y
menos peso se le ha dado a bacterias Gram negativas, que presentan mayores
problemas en América Latina (Sader, 2002).
La búsqueda de nuevas sustancias bioactivas con actividad farmacológica, a partir
de organismos marinos representa un gran potencial económico, en este sentido las
esponjas del género Aplysina, presentan una gran cantidad de metabolitos bromados
derivados de la tirosina que se han caracterizado por presentar interesantes
actividades y dado que en el arrecife rocoso de Punta Arena, dentro del Golfo de
California, Aplysina gerardogreeni se encuentran ampliamente representada y se ha
observado que presenta actividad antibacteriana, resultaría de gran importancia
determinar la concentración mínima que inhibe el crecimiento bacteriano de una
cepa Gram positiva y una Gram negativa y tratar de identificar a las fracciones o
metabolitos secundarios responsables de dicha actividad biológica.
14
HIPOTESIS
El extracto orgánico de A. gerardogreeni del arrecife rocoso de Punta Arena
de la ventana puede inhibir el crecimiento de las cepas S. aureus (Gram positiva) y
E. coli (Gram negativa) a concentraciones menores de 80 mg mL-1 y las fracciones
semipurificadas presentaran una mayor actividad que el extracto.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antibacteriana del extracto y fracciones semi-purificadas
de la esponja Aplysina gerardogreeni (Gómez y Bakus, 1992) del arrecife
rocoso de Punta Arena, B.C.S., México.
OBJETIVOS PARTICULARES
Obtención del extracto orgánico y separación de fracciones de la esponja A.
gerardogreeni.
Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones
obtenidas.
Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto y fracciones frente a las
cepas patógenas Staphyloccocus aureus y Escherichia coli.
15
METODOLOGIA
Área de estudio
La recolección de los ejemplares se llevo a cabo en la localidad conocida
como Punta Arena de la Ventana, localizada en el litoral de Baja California Sur, entre
los 24°02’ N y los 109° 49’ W (Fig. 2). El área está formada por un macizo batolítico
llamado bloque de los cabos, constituido principalmente de rocas graníticas
metamórficas y clásticas originadas en el cretácico (Suárez, 2002).
En Punta Arena se observa una plataforma rocosa submarina y paralela a la
costa, que tienen por su parte más ancha 70m y una profundidad máxima de 3m;
donde termina la plataforma se advierte un borde vertical que desciende a una
profundidad no mayor a 7 m (Suárez, 2002).
Figura 2. Área de estudio en la zona de Punta Arena de la Ventana, B.C.S.
16
Obtención del material biológico.
Los ejemplares de Aplysina gerardogreeni se recolectaron a mano mediante
buceo SCUBA en Punta Arena de la Ventana (Fig. 2) por el grupo de Productos
Naturales Marinos del CICIMAR. La recolecta se realizó en el mes de septiembre de
2008 a una profundidad de 2m. Las esponjas debidamente etiquetados se
trasladaron en hielo al laboratorio de microbiología del CICIMAR, donde se
mantuvieron a -30 °C hasta su estudio químico. Una muestra de la esponja fue
preservada debidamente y se envió al Laboratorio de Ecología del Bentos a cargo
del Dr. José Luis Carballo, en el Instituto de Ciencias del Mar y Limnología (Campus
Mazatlán) para su identificación taxonómica.
Extracción y fraccionamiento.
Se registró el peso de los organismos y posteriormente se realizó una
extracción con una mezcla de acetona/metanol 1:1 a temperatura ambiente, el
volumen de disolvente utilizado fue 940 ml. La disolución restante se filtro y el
disolvente se evaporó a presión reducida, a este extracto se le añadió repetidamente
metanol y se separó la parte del extracto soluble en metanol. Esta disolución se
evaporó a presión reducida y se obtuvieron 7.23 g de extracto de color marrón. El
rendimiento del extracto se calculó mediante la siguiente fórmula:
Peso fresco del organismo (g) = Rendimiento del extracto 100%
Peso del extracto (g)
17
El extracto de MeOH se sometió a fraccionamiento mediante cromatografía en
columna de gel de sílice compactada con CHCl3/MeOH (9:1), usando como eluyente
mezclas de CHCl3/MeOH de polaridad creciente (9:1, 8:2, 7:3, 1:1, 4:6, 3,7) y MeOH.
Con base en el estudio de cromatografía en capa fina (CCF), las diferentes alícuotas
se agruparon en cuatro fracciones (A, 1, 2, 3) (Figura 3).
Figura.3 fraccionamiento del extracto NI
18
De acuerdo al análisis de CCF, se decidió continuar con el estudio de la
fracción 1, la cual fue sometida al proceso de purificación mediante cromatografía de
columna de gel de sílice compactada con He/AcOEt (6.5:3.5) y eluida con mezclas
de He/AcOEt de polaridad creciente (6.5:3.5, 6:4, 1:1, 4:6, 3:7, 2:8), AcOEt y MeOH.
A partir de esta columna se obtuvieron 69 alicuotas y mediante análisis de CCF se
agruparon en 10 fracciones (FA, FB, FC, F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7). La fracción F1
fue sometida a CC, para lo cual la cabeza de la columna se monto con CHCl3/MeOH
(96:4), usando como eluyente mezclas de CHCl3/MeOH de polaridad creciente (96:4,
95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9) y MeOH, obteniéndose 8 fracciones (de la A1 a la A8).
La fracción F2 también fue sometida a CC bajo las mismas condiciones que F1,
obteniéndose 6 fracciones (B1, B2, B3, B4, B5, B6) (Fig. 3).
Ensayos de actividad de extractos y fracciones frente a bacterias patógenas
para el hombre.
Tanto el extracto como algunas de las fracciones obtenidas fueron sometidos
a pruebas de actividad antibacteriana, la selección de las fracciones se realizó con
base en un análisis previo de CCF (Fig. 4).
Los ensayos se llevaron a cabo mediante el método de difusión en agar frente
a las cepas Staphyloccocus aureus (Gram positiva) y Escherichia coli (Gram
negativa). A partir de la cepa patógena se realizó una resiembra en medio TSA para
tener un inoculo de 12 hrs. Para los ensayos de actividad se utilizó medio Müeller
Hinton, el cual se preparo y se colocó en alícuotas de 12 mL en tubos de ensaye, los
19
cuales posteriormente fueron esterilizadas a 15 libras durante 15 minutos. En
ambiente estéril cada alícuota fue vaciado en cajas petri de 10cm de diámetro, para
tener una capa de agar de un mismo espesor, esto permitió estandarizar la
susceptibilidad del bioensayo, ya que se sabe que este es uno de los factores que
pueden modificar la difusión de las sustancias sobre el agar (Washington, 1988).
Para la preparación de los sensi-discos, se realizaron diluciones del extracto con
metanol para tener diferentes concentraciones (80, 60, 40, 20, 10 y 5 mg mL-1), a
partir de estas diluciones se colocaron 25µl sobre cada sensidisco de 6mm de
diámetro en condiciones estériles para obtener una concentración en cada disco de
2, 1.5, 1, 0.5, 0.25 y 0.125 mg. Las fracciones que mostraron señales de compuestos
en las placas de CCF fueron sometidas a los ensayos de actividad (Fig. 4). Estas se
diluyeron con cloroformo a una concentración de 20 mg mL-1 y se colocaron en los
discos, en alícuotas de 25µl. Para la inoculación de la cepa, se preparó una
suspensión de aproximadamente 1x108 cel/ml, esparciéndose en el medio con un
hisopo estéril. Posteriormente se colocaron los discos con el extracto y las fracciones
en las placas, así como un disco con Tetraciclina de 30µg como control positivo y un
disco con el disolvente utilizado como control negativo. De todas las pruebas se
realizaron cuatro replicas.
Las cajas de petri con los sensidiscos se colocaron en el refrigerador durante
40 min, con el fin de retardar el crecimiento microbiano mientras las sustancias
antibióticas se difunden sobre el agar. Posteriormente, las cajas de petri se
20
introdujeron en la incubadora a una temperatura de 35°C durante 24 hrs. Después se
midieron los diámetros de halos de inhibición (en mm).
Figura 4. Fracciones que fueron probadas frente a las cepas bacterianas.
21
Análisis cromatográfico y espectroscópico de las diferentes fracciones
obtenidas.
Los análisis de cromatografía en capa fina (CCF) se realizaron sobre placas
de gel de sílice Kiesegel 60 F254 (Merck) de 0.2 mm de espesor, con indicador
fluorescente. Las cromatografías se siguieron por UV (254 nm) y se revelaron
mediante pulverización con una disolución de ácido sulfúrico al 10% y calentamiento
de la placa. A los diferentes productos observados se les determino su factor de
retención (Rf) mediante la siguiente fórmula:
Rf= distancia que recorre la mancha del producto
Distancia recorrida por el disolvente.
Las diferentes fracciones se analizaron mediante espectros de Resonancia
Magnética Nuclear (RMN). Los espectros de protón (1H-RMN), se registraron en un
equipo Varian INOVA 400 del Servicio Central de Ciencia y Tecnología de la
Universidad de Cádiz. Como disolventes se utilizó cloroformo (CDCl3) y acetona
((CD3)2CO) deuterados. Los desplazamientos químicos se expresan en la escala δ
(ppm). Se utilizó como referencia interna la señal del disolvente residual no
deuterado, a δ 7.26 para el cloroformo y δ 2.04 para la acetona.
22
RESULTADOS
Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni.
A partir de los ejemplares de A. gerardogreeni se obtuvieron 7.2 g de extracto
de color café oscuro y aspecto oleoso, con un rendimiento de extracción con
acetona-MeOH 1:1 del 6.1%. Un análisis del extracto mediante CCF eluida con
CHCl3/MeOH 9:1 indicaba la presencia de varios compuestos fluorescentes al UV
con un Rf entre 0.8 y 0.2.
El ensayo de actividad antibacteriana del extracto mostró una evidente
actividad frente a las cepas S. aureus y E.coli, dando lugar a amplios y bien definidos
halos de inhibición a diferentes concentraciones (80, 60, 40, 20, 10 y 5 mg mL-1),
mientras que los discos de control negativo con disolvente no presentaron efectos
sobre el crecimiento microbiano (Fig. 5 y 6).
Figura 5. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a S.aureus. A: 80 mg mL-1, B: 60 mg mL-1, C: 40 mg mL-1, D: 20 mg mL-1, E: 10 mg mL-1, F: 5 mg mL-1, G: control positivo tetraciclina 30 µg y H: control negativo.
A
B
C D
E
F
G G
H H
23
Figura 6. Halos de inhibición del extracto de MeOH de A. gerardogreeni frente a E.coli. A: 80
mg mL-1, B: 60 mg mL-1, C: 40 mg mL-1, D: 20 mg mL-1, E: 10 mg mL-1, F: 5 mg mL-1, G: control positivo tetraciclina 30 µg y H: control negativo.
Frente a S. aureus se obtuvieron halos de inhibición de 38.8 mm a la
concentración más alta (80 mg mL-1) y de 17.5 mm a la concentración más baja
(0.125 mg) como se muestra en la tabla I.
Los resultados de actividad frente a E.coli mostraron que el extracto fue
menos activo frente a esta cepa en comparación con los valores obtenidos frente a
S. aureus. Los halos de inhibición fueron de 9.8 mm a una concentración de 0.125mg
y de 21.5 mm con la concentración de 2 mg (Tabla I).
Para ambos casos se considero que la concentración mínima inhibitoria (MIC)
es de 1mg donde se encuentran halos de 31.5 mm para S. aureus y de 18 mm para
E.coli.
G
H
H
G
.25mg
F
A
B
C
D
E
24
Tabla I. promedio de los halos y desviación estándar del extracto a diferentes
concentraciones. Superíndices (mayúscula) iguales indican que no hay diferencia significativa entre tratamientos ANDEVA, ≤ p 0.01.
S. aureus E.coli
concentacion del extracto Promedio (mm)
Desviación estándar
Promedio (mm)
Desviación estándar
80 mg mL-1 A 36.8
1.7 A 21.5 1.3
60 mg mL-1 AB 33.8
2.5 A 20.8 0.95
40 mg mL-1 B 31.3
0.95 B 18 0
20 mg mL-1 C 19.5 0.57 B 16 1
10 mg mL-1 C 18.8 0.95 C 13 0.81
5 mg mL-1 C 17.5 0.57 D 9.8 1.5
(Cp) Tetraciclina 30µg 36.9 3.7 29.4 1.8
Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A.
gerardogreeni.
El fraccionamiento del extracto crudo dio lugar a tres fracciones (1, 2 y 3), de
las cuales, la fracción 1 fue la mayoritaria con 200 mg y la única que presentaba
actividad antibacteriana (Tabla II).
25
Tabla II. Halos para el primer fraccionamiento del extracto. Se muestra el promedio y la desviación estándar.
S. aureus E.coli
Fracción Promedio (mm)
Desviación estándar
Promedio (mm)
Desviación estándar
1 23.2 3.6 17.7 0.81
2 --- --- --- ---
3 ---
--- --- ---
Cp 35.8 1.5 24.9 1.9
El espectro de 1H-RMN de esta fracción mostraba varias señales
correspondientes a compuestos derivados de la dibromotirosina y el análisis de CCF
(eluido con He/AcOEt 6:4) mostraba la presencia de varios productos fluorescentes a
la luz UV y con valores de Rf de entre 0.1 y 0.8. La purificación de la fracción 1 dio
lugar a 10 fracciones, de las cuales se continúo con el estudio de cinco de ellas (F1-
F5) tomando como criterio su peso y análisis en CCF.
Fracciones F1 y F2.
A partir de las fracciones F1 y F2 se obtuvieron 7 y 10 mg respectivamente de
un compuesto (1) solido amorfo (subfracciones A2 y B2), que en CCF eluida con
He/AcOEt 3:7 mostraba la presencia de un compuesto fluorescente a la luz UV y con
un Rf= 0.9. El espectro de 1H-RMN de este compuesto (1) en CDCl3 (Figura 7)
mostraba las señales de un metoxilo a δH 3.75 (s), un metino olefínico a δH 6.33 (s),
26
un metileno a δH 3.95 (d, J=18.46 Hz) y a δH 3.01 (d, J=18.44 Hz), un metileno a δH
1.68 (m), también se observo el protón de hidroxilo a δH 4.43 (s), y de un grupo
amino a δH 6.66 (t).
Figura 7. Espectro de 1H-RMN del producto 1 en CDCl3.
Tanto las fracciones F1 y F2 como el producto 1 no fueron activos frente a S.
aureus y E. coli a una concentración de 0.5 mg (Tabla III)
27
Tabla III. Halos de las fracciones correspondientes al fraccionamiento de la alícuota 1. Se muestra el promedio y la desviación estándar.
S. aureus E.coli
Fracción Promedio (mm)
Desviación estándar
Promedio (mm)
Desviación estándar
F1
--- --- --- ---
F2 --- --- --- ---
F3 22.5 2.9 23.8 4.4
F4 17.2
2.7 18.2 .75
F5 11 0 12.7 0.81
Cp 35.8 1.5 24.9 1.9
Fracción F3.
El análisis mediante CCF de la fracción F3 mostraba la presencia de dos
compuestos con Rf=0.6 y 0.9, los cuales eran fluorescentes a la luz UV.
Por otra parte el espectro de 1H-RMN indicaba la presencia de señales de un
grupo metoxilo, un par de metilenos, un metino olefínico características de
compuestos derivados de la dibromotirosina (Fig. 8). Contrario a las fracciones
anteriores, F3 si presento actividad frente a las cepas de S. aureus y E. coli. En la
tabla III se muestra que esta fracción fue la más activa con halos de inhibición de
22.5 mm para S. aureus y para el caso de E. coli fueron de 23.8 mm a una
concentración de 0.5 mg.
28
Figura 8. Espectro de 1H-RMN de la fracción F3 en CDCl3.
Fracción F4 y F5.
El análisis en CCF de las fracciones F4 y F5 mostraba la presencia de dos
manchas fluorescentes a la luz UV con un Rf de 0.7 y 0.9 y de 0.7 y 0.8
respectivamente. Las señales en el espectro de 1H-RMN de estas fracciones
indicaron que se trataba de un compuesto similar, sin embargo, no se juntaron
debido a que la actividad antibacteriana fue diferente, siendo más activa F4 y de la
cual se muestra el espectro de RMN (Fig. 9).
29
Figura 9. Espectro de 1H-RMN de las fracciones F4 en CDCl3.
30
DISCUSIÓN.
Análisis y actividad antibacteriana del extracto de A. gerardogreeni
La esponja Aplysina gerardogreeni del Golfo de California presenta una
evidente actividad antibacteriana, ya sea a nivel de extractos orgánicos frente a
cepas de bacterias patógenas (Betancourt-Lozano, 1998; Montes-Plascencia, 2010),
o a nivel de compuestos puros frente a Mycobacterium tuberculosis (Encarnación et
al., 2000; Encarnación-Dimayuga et al., 2003) o cepas de s. aureus, B. subtilis,
Streptococuss fecalis, E.coli, Vibrio harveyi y Candida albicans (León, 2000). En este
trabajo se confirmo esta actividad antibacteriana y se estableció la concentración del
extracto de esta especie del área de Punta Arena de la Ventana con mejor actividad,
así como las fracciones con potencial para continuar con su estudio químico en la
búsqueda de compuestos antibacterianos.
En cuanto a los porcentajes de rendimiento del extracto se sabe que existe
una variación dependiendo de la época del año en que se recolectan los ejemplares,
siendo en verano cuando se obtienen los mejores rendimientos de extracción para A.
gerardogreeni (6.2%) (Montes-Plascencia et al., 2010), nuestros resultados
concuerdan con esto, ya que con ejemplares de septiembre se obtuvo un porcentaje
de rendimiento del 6.1 %. Por lo que puede decirse que verano es la mejor época de
recolecta para obtener los mejores rendimientos con ejemplares de esta localidad.
El extracto de MeOH de A. gerardogreeni de Punta Arena de la Ventana,
mostro actividad antibacteriana frente a S. aureus y se observó que 5 mg mL-1 fue la
mínima concentración (MIC) que inhibe el crecimiento de la cepa dando lugar a
31
halos de inhibición de 17.5 mm y frente a E. coli la MIC fue de 20 mg mL-1 con halos
de inhibición de 16 mm. Es evidente que el extracto fue más activo frente a S.
aureus, lo cual resulta interesante ya que esta cepa muta fácilmente e incorpora
genes de resistencia frente a los antibióticos (Walker, 2000). De igual modo el hecho
de que el extracto sea activo frente a una cepa Gram negativa como E. coli es de
interés ya que estas bacterias causantes del 90% de las infecciones en el tracto
urinario (Del Rio-Pérez, 1997; Daza-Pérez, 1998), presentan una membrana externa
que las protege de varios antibióticos, colorantes y detergentes que normalmente
dañarían la membrana interna o la pared celular de peptidoglicano. La membrana
externa proporciona a estas bacterias resistencia a la lisozima y a la penicilina. Por lo
que es importante conocer tratamientos alternativos para combatir la membrana
externa de protección de estos patógenos. Así como comprender el funcionamiento
de los metabolitos bromados con actividad biológica frente a bacterias Gram-
positivas y negativas in vitro e in vivo (Cruz et al, 1990; Rodríguez & Piña, 1993;
León, 2000).
Los extractos orgánicos son una mezcla de diversos componentes y en
determinadas ocasiones generan reacciones antagónicas entre los compuestos
activos, por lo que se puede observar la misma actividad a diferentes
concentraciones del extracto. Para el caso de A. gerardogreeni no ocurre esto, ya
que se observó que al incrementar la concentración del extracto, también se
incrementa la actividad antibacteriana.
32
Estudios de actividad antibacteriana con ejemplares de la misma zona durante
otoño mostraron una menor actividad frente a S. aureus (halos de 22.6 mm) y muy
similar frente a E. coli (halos de 22.4 mm) a una concentración de 80 mg mL-1
(Montes-Plascencia et al., 2010). Por otro lado, al comparar los resultados con los
obtenidos a partir de un extracto de A. fistularis se observa que a una concentración
de 40mg/mL-1 se obtuvieron halos similares frente a S. aureus (31mm), por otra parte
frente a E. coli, el extracto de A. fistularis presento una mayor actividad con halos de
23mm (Vilma-lanza et al., 2006) Al comparar la actividad frente a S. aureus de otros
géneros de esponjas como Dragmacidon reticulata, Xetospongia próxima, Petromica
ciocalyptoides y Halichondria sp. que presentaron halos de inhibición de entre 10 y
12.7 mm con concentraciones de 500 mg mL-1 (Mora-Cristancho et al., 2008), se
observa que Aplysina tiene una mayor actividad frente a esta cepa.
Análisis químico y actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas de A.
gerardogreeni
Al fraccionar el extracto crudo de A. gerardogreeni se observo que de las tres
primeras fracciones obtenidas, sólo una fue activa, y a la concentración de 20 mg
mL-1 presento mayor actividad que el extracto crudo (S. aureus: 19.5mm, E.coli:
16mm), un comportamiento similar se observó en un estudio químico del extracto de
A. fistularis de Brasil donde conforme se purificaba el extracto la actividad
antimicrobiana fue mayor y aun con una concentración menor a la probada
inicialmente los halos de inhibición fueron mayores (Lanza et al., 2006).
33
Conforme esta fracción activa se fue purificando, se realizó el estudio de
cinco fracciones, que se discuten a continuación.
Fracciones F1 y F2.
Al analizar las fracciones F1 y F2, por medio de la placa de CCF y el espectro
de 1H-RMN, se observó que se trataba de un compuesto puro (1). Al comparar los
desplazamientos químicos de los espectros en cloroformo y acetona deuterados con
los obtenidos por Shingeru, 1985 (Tabla IV) se determino que el compuesto (1)
correspondía con la aerothionina (Figura 10).
Tabla IV. Desplazamientos químicos de 1H-RMN del compuesto aerothionina en acetona y
cloroformo deuterado.
δ 1H (mult., J en Hz)
# H Shingeru, 1985
Acetona d6
Acetona d6 CDCL3
1/ 1’ 4.18 (7.5) 4.18
5/ 5´ 6.53 6.51 6.33
7/ 7’ 3.15 (18)
3.85 (18)
3.16 (18)
3.82 (18)
3.01 (18)
3.85 (18)
10/ 10’ 3.2-3.5 3.32 3.3
3.45
11 / 11’ 1.62 1.61 1.68
OCH3 3.77 (s) 3.77 (s) 3.75 (s)
OH 5.40 (7.5) 5.42 (7.5) 4.43
NH 7.60 7.60 6.66
34
ON
O
NH
HN
O
NO
OH
BrBr
MeO
OHBr
Br OMe
27
Figura 10. Estructura química de la Aerothionina.
La aerothionina fue aislada originalmente de las esponjas Aplysina aerophoba
y Verongia thiona (Fattorusso, 1970). Desde entonces ha sido re-aislada en diversas
especies del género Aplysina (Moody et al., 1972; Andersen y Faulkner 1973;
Gopichand y Schmitz, 1979; McMillan et al., 1981; Acosta y Rodríguez, 1992;
Ciminiello et al., 1994; Compagnone et al., 1999; Encarnación et al., 2000; Payuana
et al. 2002; Thoms et al., 2004; Hernández-Guerrero et al., 2007), lo cual confirma
que es uno de los principales componentes de estas esponjas aportando
aproximadamente el 10% (Minale, 1976). Este compuesto es un derivado de la 3,5-
dibromotirosina y la cadena central C4N2 se deriva de la ornitina (Peng et al., 2005).
Los resultados obtenidos en este estudio indicaron que la aerothionina no
presentó actividad antibacteriana frente a las cepas probadas, resultados similares
fueron obtenidos por León (2003). Sin embargo, existe un registro de que presentó
actividad frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Candida albicans (Peng
et al., 2005 citado en Alvarez, 2007). Cabe mencionar que en una de las replicas del
bioensayo de este trabajo, se presentó un halo pequeño, pero debido al tamaño no
1
3 5
7
9
10
11
1’
3´
5´
7’
9’
10’ 11´
35
fue considerado como activo. Este compuesto ha presentado actividad
antimicobacteriana frente a Mycobacterium tuberculosis, (Encarnación et al., 2003)
así como actividad neuroprotectora y como inhibidor del incremento de la
concentración de calcio intracelular (Álvarez 2007).
Fracción F3
Esta fracción fue la más activa y además se observó que la actividad frente a
E. coli se incremento. Lo cual sugiere que los productos presentes en esta fracción
tienen mayor selectividad frente a bacterias Gram negativas. Los compuestos
pueden actuar de diferentes formas en la pared celular de una bacteria, una forma
podría ser que estos compuestos posean una importante actividad antibacteriana,
debido a que reducen la tensión superficial y actúan sobre los lípidos de la
membrana provocando alteraciones de las mismas, lo que conlleva a la muerte
celular; para ello se sugiere la formación de complejos con el colesterol presente en
la membrana, otro caso podría ser la desnaturalización de las proteínas (Marcano &
Hasegawa 2002; Kazanjian & Fariñas, 2006).
Fracción F4 y F5.
Las fracciones F4 y F5, a pesar de ser muy similares en CCF y en el espectro de 1H-
RMN, mostraron diferencias en los valores de actividad, siendo F4 más activo, lo cual
podría deberse a que el producto se encuentre más puro y por lo tanto la
concentración a la que se probaron ambas fracciones no fuera la misma.
36
CONCLUSIONES.
El extracto de la esponja Aplysina gerardogreeni presento actividad
antibacteriana frente a las cepas de S.aureus y E.coli y la concentración
mínima inhibitoria fue de 40 mg mL-1 presentando halos de inhibición de 31 y
18 mm respectivamente.
El análisis químico del extracto de A. gerardogreeni dio lugar al aislamiento de
un compuesto puro y varias fracciones semipurificadas.
El compuesto puro fue identificado mediante la comparación de sus señales
de RMN como la aerothionina, la cual no presento actividad frente a las cepas
de S.aureus y E.coli a una concentración de 0.5 mg.
De las fracciones semipurificadas (F3, F4 y F5), F4 fue la más activa
presentando a una concentración de 0.5 mg, halos de inhibición de 17.2 y 18.2
mm frente a S.aureus y E.coli respectivamente. Por lo que se recomienda
continuar con el estudio químico de esta fracción para identificar el compuesto
responsable de esta actividad.
37
BIBLIOGRAFÍA
Acosta A.L., A.D. Rodríguez. 1992. 11-oxoaerothionin: a cytotoxic antitumor
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