Unidad 5: Metodología general para el estudio de los microorganismos.

Lic. Josè Soria

EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

• Requiere la utilización de una serie de técnicas que permitan su aislamiento y su crecimiento bajo condiciones controladas.

• Esto nos permitirá después aplicar una serie de técnicas que nos permitirán identificarlo y clasificarlo

EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

• Aislamiento y cultivo

• Identificación fenotípica:

Coloración diferenciales (Gram y demás)

Pruebas metabólicas

Manual Bergey

• Identificación genotípica

PCR y estudios genéticos

Muestras

• La muestra que contiene el microorganismo a estudiar puede provenir de diversos orígenes

• Alimenticias

• Biológica

• Ambiental

Aislamiento y cultivo

• MEDIO DE CULTIVO es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para la síntesis y mantenimiento de su protoplasma.

• Luego de la toma de muestra se requerirá de un medio de cultivo apropiado, que favorecerá el crecimiento

del microorganismo que buscamos

Muestra inicial

Enriquecimiento del microorganismo

Aislamiento de microorganismo

Almacenamiento

Medio de Enriquecimiento

Medio Selectivo (solido)

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su composición

comunes: incluyen una fórmula

nutritiva básica que permite el

crecimiento de microorganismos

poco exigentes.

enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo, líquido ascítico, extracto proteico de cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes

Agar Nutritivo

Peptona de carne ………….. 0.5 g

Extracto de carne ………….. 0.3 g

NaCl ………………………… 0.5 g

Agar ……………………… 1.5 – 2 g

Agua destilada ……………. 100 ml

+ sangre de carnero al 5%

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Por su función:

Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes.

Medios selectivos: son medios sólidos que de manera parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros.

Para funcionar de esta manera incluyen

compuestos químicos específicos

(antibióticos, colorantes,inhibidores) o

requieren condiciones físicas especiales

(temperatura, pH, atmosfera)

Cómo se puede lograr la selectividad en un medio de cultivo?

cambiando el pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un género implicado en la producción de yogur, se puede agregar ácido acético a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente inadecuado para muchas bacterias acompañantes.

altas concentraciones osmóticas: en agar manitol salado con una concentración de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como Staphylococcus aureus.

agregando antisépticos: se adicionan sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos

agregando antibióticos: En Microbiología Clínica, se usan antibióticos de espectro de acción reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio no interesa

Identificación Fenotípica

• 1.- Estudio morfológico:

Tinciones o Coloraciones

• 2- Pruebas Bioquímicas

• 3. Uso del Manual Bergey

• Muestra inicial

• Aislamiento del

microorganismo

Coloraciones Pruebas Bioquímicas Pruebas genéticas

Estudio morfológico: observación

• El termino morfología hace referencia a la forma de un microorganismo.

• Los microorganismos presentan morfologías y tamaños variables, así como diversos sistemas de agrupaciones que permiten distribuirlas en grupos para facilitar su estudio

Forma • Las tres principales formas microbianas son las

siguientes:

• Esférica u ovoides: son llamados “cocos”

• Bacilar o cilíndrica: son llamados “bacilos”

• Espiral o helicoidal: son llamados “espirilos”

Estas tres formas básicas también pueden presentar algunas modificaciones en ciertas bacterias

Agrupaciones bacterianas

Las bacterias pueden presentar

distintas agrupaciones, según el

plano de división celular.

Esto ocurre tanto con cocos,

Como con los bacilos

Estudio morfológico: Tinciones o Coloraciones

• El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple

de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

• Los Colorantes pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes

de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc

Coloraciones

Observación de

los microorganismos

Teñidos con colorantes Vivos sin teñir o en fresco

Ventajas del uso de colorantes: • Proporciona el contraste suficiente entre el microorganismo y el medio que los rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.

• Permite el estudio de estructuras de la célula bacteriana.

• Se puede obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del microscopio.

¿Que es un colorante?

• Los colorantes son, generalmente, sales en las que uno de sus iones tiene color. Una sal es un compuesto formado por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente.

ClAM CL- + AM+

• Los colorantes se pueden dividir en 2 grupos: básicos y ácidos.

Si el colorante reside en el ión positivo, se dice que es un colorante básico.

Si el color reside en el ión cargado negativamente, se dice que es un colorante ácido.

Pasos a seguir para realizar una coloración

Como realizar un extendido

Coloración diferenciales

• Son coloraciones que no tiñen de manera homogénea a todos los tipos de células y estructuras bacterianas

• Las mas comunes son:

Tinción de Gram: Pared celular

Tinción de burri para cápsula

Técnica de moelller para esporas

impregnación argéntica para flagelos

coloracion de ziehl-neelsen (baar)

• La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción para la visualización de la morfología celular bacteriana, permite realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa o rojo .

• Esta diferencia en la tinción se basa en las diferencias en la estructura y composición de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Coloración de Gram

Pared Celular

Gram positivos Gram Negativos

Coloración de Gram

Permite diferenciar

microorganismos

en dos grandes grupos

Gram positivos

Gram Negativos

Pasos

de la

coloración

Alcohol disuelve los lípidos de la pared bacteriana deshidratación del peptidoglicano

¿Cómo se observan las bacterias y esporas según la coloración de Gram?

Levaduras Esporas

TINCIÓN DE BURRI para cápsula

• Permite poner en evidencia la cápsula Bacteriana

CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE

FONDO OSCURO Y EL CUERPO

BACTERIANO TEÑIDO DE VIOLETA

Klebsiella pneuminiae

Como realizar un extendido

TÉCNICA DE MOELLLER para esporas

• Permite poner en visualizar la Espora Bacteriana

• La espora se observará de color rojo

• El cuerpo vegetativo se observará azul

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA para flagelos

• Permite visualizar los flagelos

• Los flagelos al ser tan finos (20 nm de diámetro), no pueden observarse mediante coloraciones comunes, sino que hay que recurrir a tinciones específicas que aumentan su diámetro

Pandoraea spp

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

• Permite identificar micobaterías.

• Por ejemplo: M. tuberculosis, agente causal de la tuberculosis y M. leprae, agente de la lepra.

• Se basa en la propiedad que tienen estas bacterias de resistir la decoloración con alcohol-ácido después de teñirlas con fucsina fenicada concentrada y en caliente

• Requiere preparación previa del frotis

M. tuberculosis

Pruebas Bioquímicas

• Son una serie de pruebas que permiten evidenciar una características determinada (ej: Física, metabólica) permitiendo formar un patrón que ayude a la identificación y diferenciación de un microorganismos de otros relacionados con el mismo,

•Se utilizan medios de cultivos diferenciales, ya que permiten discriminar entre diferentes tipos de bacterias basándose en características metabólicas particulares de cada uno

• Por ej.: el germen A puede fermentar glucosa y el germen B no puede hacerlo. Ambos podrían ser discriminados por esa propiedad.

• Si agregamos glucosa a un medio de cultivo sólido y un indicador de pH que evidencie un cambio de color cuando el azúcar ha sido fermentado.(amarillo)

B A Sin sembrar

Bacteria A:

Fermenta Glucosa

Bacteria B:

No Fermenta Glucosa

IMViC

IMViC: conjunto de pruebas bioquímicas que comprende:

I = Prueba del Indol

M = Prueba de Rojo de Metilo

V = Prueba de Voges-Proskauer

C = Prueba de utilización de Citrato

Permite la identificación por genero de entero bacterias (bacterias Gram negativas que provienen del intestino)

Prueba del Indol

• La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el aminoácido triptófano en Indol y otros metabolitos indólicos.

Prueba de Rojo de Metilo

• Detecta la fermentación ácido-mixta.

• Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.

Voges-Proskauer

• Detecta la fermentación butanodiólica.

• En esta fermentación se producen una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína).

Prueba de utilización de Citrato

• Detecta la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono

• El medio es de color verde, si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, el medio vira al azul por liberación de NaOH.

MANUAL BERGEY

• Su objetivo es asistir a la identificación de bacterias e indicar la relación que existen entre los distintos grupos

• El primer Manual Bergey de Bacteriología Determinativa fue publicado en 1923, bajo el auspicio de la Sociedad Americana de Bacteriólogos

• El último manual publicado en el 2000,

corresponde a la 2° edición y consta de

5 volúmenes, a diferencia de los anteriores

que presentaban un solo

A grandes rasgos los 5 subvolúmenes se dividen en:

• 1. Archaea, Cyanobacteria, Fotótrofos y Géneros ramificados.

• 2. Proteobacteria.

• 3. Bajo contenido en G+C. Gram positivas.

• 4. Alto contenido en G+C. Gram positivas.

• 5. Plantomicetes, Espiroquetales, Fibrobacter, Bacteroides y Fusobacteria.

Las claves para ingresar al manual Bergey e

identificar un microorganismo, son conocer :

•Tipo de metabolismo

•Forma y disposición celular

•Coloración de Gram

Esto conducirá a la acertada elección de uno de

Los 5 volúmenes

PARTE B: IDENTIFICACIÓN GENOTIPICA

Técnicas moleculares

• Han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos bacterianos.

• Se basan en las principales características que posee el ADN

por ej: Homología de cadenas, replicación, polimorfismo, etc

• Poseen las siguientes ventajas:

rapidez, sensibilidad, especificidad

no necesitan microorganismo vivos

Técnicas moleculares

• Las mas utilizadas en microbiología son las siguientes:

• PCR- Reacción en cadena de la polimerasa

• RFLP - Polimorfismo de largos fragmentos de restricción

• Hibridación de ADN

• PFGE- Electroforesis en gel de campo pulsado

PCR- Reacción en cadena de la polimerasa

• La PCR amplifica de manera exponencial un fragmento especifico de ADN.

• Se utiliza para:

Detección de enfermedades hereditarias,

Análisis forense del ADN

Detección de patógenos en el hombre

Análisis de Paternidad

La PCR utiliza una enzima ADN-Polimerasa, que se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y creando una hebra complementaria

Actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede de una bacteria termofílica que vive a temperaturas de 110°C La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas temperaturas

• Para un ciclo de PCR se necesita:

• Enzima Taq polimerasa: amplifica el ADN

• ADN blanco a amplificar

• Primers: Fragmentos de ADN especificos a amplificar

• dNTP (desoxinucleotidos: dATP, dTTP, dGTP y dCTP)

• Buffer y sales de MgCl2

Etapas de cada ciclo de PCR

Análisis de PCR

• El producto obtenido se somete a electroforesis en gel de agarosa. Que permite separar los fragmentos por tamaños e identificarlos utilizando un patrón de ADN