(ultra)vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Izolační a separační metody, 2018

2

Přehled chromatografických metod

Papírová chromatografie (PC)

Tenkovrstvá chromatografie (TLC)

Plynová chromatografie (GC)

Kapalinová chromatografie (LC) Superkritická fluidní

chromatografie (SFC)

Chromatografie

3

Vývoj vysokoúčinné kapalinové chromatografie

HPLC - High Performance Liquid Chromatography vysokoúčinná kapalinová chromatografie

RRLC - Rapid Resolution Liquid Chromatography rychle rozlišovací kapalinová chromatografie

UPLC - Ultra Performance Liquid Chromatography extrémně účinná kapalinová chromatografie

UHPLC - Ultra High Pressure Liquid Chromatography extrémně vysokotlaká kapalinová chromatografie

velikost částic

tlak

HPLC

RRLC

UPLC

UHPLC

3-10 mm 400 bar

1,8 mm 600 bar

1,7 mm 1000 bar

1,0 mm 5000 bar

4

Princip kapalinové chromatografie

Dělení (separace, rozlišování) sloučenin na základě různé zádrže (retence) v chromatografickém systému : sorbent (stacionární fáze) a eluent (mobilní fáze).

Princip:

Členění metod:

• uspořádání: kolonová, na tenké vrstvě ...

• separační parametry: účinnost, rychlost ...

• stacionární fáze: eluční, ionexová, chirální ...

tenkovrstvá kolonová

5

Separační parametry

Rozlišení

nebo

Separace na základní linii (baseline separace)

od

ezva

det

ekto

ru

čas

´

´

k´- kapacitní (retenční) faktor:

a - separační faktor:

N – počet teoretických pater - účinnost efficiency -výkonnost

6

Separační parametry o

dez

va d

ete

kto

ru

čas (min)

k´- kapacitní (retenční) faktor:

od

ezva

det

ekt

oru

čas (min)

a - separační faktor:

7

Separační parametry o

dez

va d

ete

kto

ru

čas (min)

výška píku (h)

šířka píku v základně

šířka píku v polovině výšky

šířka píku v 0,607 výšky

8

Van Deemeterova křivka

výškový ekvivalent teoretického patra

průtok mobilní fáze (ml/min)

průtok mobilní fáze

výškový ekvivalent teoretického patra (H) = délka kolony připadající na 1 teoretické patro

L … délka kolony

N … počet teoretických pater

9

Interpretace separačních parametrů

k´- kapacitní (retenční) faktor:

a - separační faktor:

N - počet teoretických pater:

je ovlivněn: složením stacionární a mobilní fáze, teplotou, průtokem, délkou kolony

charakterizuje retenci za daných podmínek

faktor retence (doby analýzy)

je ovlivněn: složením stacionární a mobilní fáze, teplotou, průtokem

charakterizuje separaci složek (porovnáváme k´)

faktor selektivity separace (rozdělení analytů)

je ovlivněn: kvalitou stacionární fáze – zrněním a tříděním, složením mobilní fáze, průtokem, délkou kolony, teplotou charakterizuje kvalitu eluční zóny – šířka, symetrie …

faktor kvality eluční zóny (tvar píku) R – rozlišení:

sjednocující veličina, kombinuje všechny parametry separace

10

Interpretace separačních parametrů Si

gn

ál

Sig

ná

l

Sig

ná

l Si

gn

ál

čas

čas

čas

čas

Slabá selektivita

Dobrá selektivita Dobrá účinnést

Slabá účinnost

Faktory ovlivňující rozlišení Selektivita a účinnost kolony

11

Typy kapalinové chromatografie

Mo

lecu

lar

we

igh

t

Non-ionic polar

Non-polar Ionic

Water-insoluble Water-soluble

Increasing polarity

Partition

Adsorption Ion exchange

(Reversed phase

partition)

(Normal phase

partition)

Exclusion

(Gel permeation) (Gel filtration)

102

103

104

105

106

Normální fáze LC

Reverzní fáze LC

Výběr chromatografického systému závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech analytu:

• rozpustnost analytu

• polarita analytu

• molekulová hmotnost analytu

Jsou vyžadovány pouze slabé interakce se stacionární fází

(analyty musí projít kolonou)

HILIC

Ion exchange

12

Typy kapalinové chromatografie Výběr chromatografického systému:

Normální fáze Reverzní fáze HILIC Ion Exchange

Stacionární fáze

Polární (silikagel, alumina, florisil, MgO)

Nepolární – modifikovaný silikagel (CN, C8, C18, fenyl)

Polární (silikagel, modifikovaný silikagel (aminopropyl, CN))

Iontové (zakotvené kationty nebo anionty)

Mobilní fáze

Nepolární (hexan, dichlormethan, tetrahydrofuran, ethylacetát)

Polární (voda, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran)

Polární (voda, acetonitril)

Voda s přídavkem iontů (směs až s 50% organického rozpouštědla) s pufrem (NaHCO3, NaOH…)

Analyty Nepolární a ve vodě nerozpustné

Nepolární i polární Iontové i neiontové polární sloučeniny ve vodě rozpustné

Iontové organické i anorganické báze a kyseliny

13

Typy kapalinové chromatografie

Dělení dle typu stacionární fáze stacionární fáze ovlivňuje především separační selektivitu a retenci

analyzovaných látek Rozdělovací chromatografie

• NORMÁLNÍ FÁZE (klasická nebo HILIC)

• REVERZNÍ FÁZE (klasická nebo semipolární)

• IONTOVĚ PÁROVÁ (na reverzní fázi)

Iontově výměnná chromatografie (ion exchange, IE)

• katex, anex (anorganické/organické, přírodní/syntetické, pevné/kapalné/pelikulární*)

Chirální chromatografie • cyklodextrinové fáze

Afinitní chromatografie

*tenká vrstva ionexu je nanesena na povrchu inertního nosiče

Katex (mění kationty): slabě kyselé obsahují karboxy(methyl) skupinu: -COO- a -O-CH2-COO-, silně kyselé obsahují sulfoskupinu: -SO3

- a –(CH2)4SO3-

Anex (mění anionty): slabě bazické obsahují amino skupiny: -R-NH2 , -N(CH3)2, -C2H5N(C2H5)2 (DEAE), silně bazické obsahují kvarterní aminy: -CH2N

+(CH3)3, -C6H4N+(CH3)3

14

Hlavní typy interakcí při separaci

van der Waalsovy síly disperzní - London indukovaný dipól – indukovaný dipól

van der Waalsovy síly orientační - Keesom dipól – dipól

van der Waalsovy síly indukční - Debye dipól – indukovaný dipól

elektrostatické síly - Coulomb

vodíková vazba p - p interakce

R2 R1

C N

O H

R1

R2

R2

C N

C H

R1 H

H

O - S R2 O

O

N +

R1

R2 R1 H

H O

O

R1

15

Chromatografie na normální fázi (NP-LC)

Stacionární fáze – polární: silikagel, modifikovaný silikagel

Mobilní fáze – nepolární: nepolární rozpouštědlo (cyklohexan, hexan, toluen, tetrahydrofuran (THF), …) nebo směs nepolárních rozpouštědel (retence podle složení mobilní fáze)

Vysokou afinitu k polární stacionární fázi mají polární analyty (budou mít největší retenci). Přibližné pořadí retence tříd organických látek:

sulfokyseliny > karboxylové kyseliny > fenoly > alkoholy > amidy karboxylových kyseliny > primární aminy > aldehydy > ketony > estery karboxylových kyselin > nitrosloučeniny > nitrily > terc. aminy > ethery > halogenderiváty > aromatické uhlovodíky > alifatické uhlovodíky

Eluční sílu mobilní fáze lze odhadnout podle postavení příslušného rozpouštědla v tzv. eluotropní řadě rozpouštědel

16

Eluotropní řadě rozpouštědel

rozpouštědlo index polarity P´ eluční síla

(SiO2) t.v. (°C) lmin (nm)

fluoroalkany ˂ -2 -0.2 200

cyklohexan 0.04 0.03 80.7 200

n-hexan 0.1 0.01 69 200

tertachlormethan 1.6 0.11 76 265

diisopropylether 2.4 0.22 67.8 220

toluen 2.4 0.22 111 285

diethylether 2.8 0.38 35 202

dichlormethan 3.1 0.34 40 233

tetrahydrofuran 4 0.35 66 230

chloroform 4.1 0.26 61 245

ethanol 4.3 0.68 78 205

octová kyselina 4.4 0.38 118 230

dioxan 4.8 0.49 101 215

methanol 5.1 0.73 65 208

acetonitril 5.8 0.5 82 212

nitromethan 6 0.49 101 380

voda 10.2 vysoká 100 190

17

Příklady sorbentů s.f. pro NP-LC

O Si

O

Si

O

Si O

OH

OH

OH

O Si

O

Si

O

Si O

CH2CH2CH2NH2

CH2CH2CH2NH2

CH2CH2CH2NH2

O Si

O

Si

O

Si O

CH2CH2CH2OCH2CH-CH2 OH OH

O Si

O

Si

O

Si O

CH2CH2CH2CN

CH2CH2CH2CN

CH2CH2CH2CN

silikagel

modifikovaný silikagel

modifikovaný silikagel modifikovaný silikagel

DIOL = 2,3-dihydroxypropoxyproyl-

NH2 aminopropyl-

CN kyanopropyl- CH2CH2CH2OCH2CH-CH2

OH OH

CH2CH2CH2OCH2CH-CH2 OH OH

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

18

Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography - HILIC

O Si

O

Si

O

Si O

OH

OH

OH

silikagel

O

O

O

O H

H

O H

H

O H

H

-CH2-CH2-CH2-SO3 -N

_ _

CH3

CH3

CH2 + -

voda

acetonitril/voda (90:10)

ANALYT

ANALYT ANALYT

ANALYT slabé

elektrostatické interakce

slabé elektrostatické

interakce

distribuce na základě

hydrofilních interakcí

modifikovaný silikagel

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O pevná stacionární fáze

pseudostacionární vodná fáze

mobilní fáze

19

Polarita látek – afinita ke stacionární fázi

Log P -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

chromatografie na normální fázi

chromatografie na reverzní fázi

kolona s hydrofilním povrchem (s.f.) kolona s hydrofobním povrchem (s.f.)

HILIC normální fáze reverzní fáze

MeCN/H2O hexan/EtOH

CO2/MeOH H2O/MeCN

H2O/MeOH

erytritol guanin o-fenylendiamin chloramfenicol

fenol toluen benzen

Log P = -4 Log P = -1,7 Log P = -0,06 Log P = 0,62 Log P = 1,12 Log P = 2,45 Log P = 3,32

20

Polarita látek – afinita ke stacionární fázi

Log P -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

chromatografie na normální fázi

chromatografie na reverzní fázi

erytritol guanin o-fenylendiamin chloramfenicol

fenol toluen benzen

Log P = -4 Log P = -1,7 Log P = -0,06 Log P = 0,62 Log P = 1,12 Log P = 2,45 Log P = 3,32

Log P = míra lipofility sloučeniny

P … rozdělovací (distribuční) koeficient - poměr rovnovážných koncentrací sloučeniny ve dvou navzájem nemísitelných fázích, obvykle oktanol-voda.

Látky s vysokým rozdělovacím koeficientem v systému oktanol/voda jsou hydrofobní, nepolární, s nízkým rozdělovacím koeficientem v systému oktanol/voda jsou hydrofilní, polární.

21

Chromatografie na reverzní fázi (RP-LC)

Stacionární fáze – nepolární: modifikovaný silikagel – nejčastěji „oktadecylovaný“ (C18), dále může být např. C4, C8, C30

Mobilní fáze – polární: polární rozpouštědlo (voda, methanol, acetonitril, isopropanol) nebo směs polárních rozpouštědel (retence podle složení mobilní fáze)

Vysokou afinitu k nepolární stacionární fázi mají nepolární analyty (budou mít největší retenci). Obrácená eluce látek ve srovnání s normální fází.

Eluční sílu mobilní fáze lze odhadnout podle postavení příslušného rozpouštědla v tzv. eluotropní řadě rozpouštědel

modifikovaný silikagel C18

modifikovaný silikagel phenyl-hexyl

22

Modifikace reverzní stacionární fáze

Endcapping Embedding Klasická C18

Endcapping: Malá molekula (typicky tří uhlíkatá sloučenina) je využívána jako „klobouček“ (cap) pro volné hydroxylové skupině, které nezreagovaly s oktadecylem (C18). Výsledkem je změna vlastností stacionární fáze.

Zlepšuje tvar píku, redukuje tzv. tailing píku, zvyšuje rozlišení a selektivitu

(vložení)

Embedding: Do dlouhého nepolárního uhlíkatého řetězce se vloží určitá funkční skupina, skladba atomů, která pozmění charakter stacionární fáze. Např. vnesená polární skupina potlačuje hydrofobní interakce a snižuje aktivitu volných silanolových skupin.

23

Chirální kapalinové chromatografie

Určená pro separaci stereoisomerů (enantiomery, diastereoisomery, …)

kyselina mléčná

stacionární fáze na bázi nejčastěji cyklodextrinů

a-cyklodextrin b-cyklodextrin -cyklodextrin

24

Chirální kapalinové chromatografie

cyklodextrin analyt Inkluzní komplex

Mechanismus:

25

Iontově párová chromatografie Využívá se v případě potřeby analyzovat iontové sloučeniny (např. silné kyseliny nebo silné báze). Tyto sloučeniny jsou velmi hydrofilní a nemají takřka žádnou zádrž na reverzní (nepolární) fázi. Pomocí vhodného protiontu (tzv. counter ion) vytvoří komplex, který vykazuje lepší retenci na reverzní fázi a umožní tak jejich stanovení.

analyt reverzní fáze

reverzní fáze analyt protiont

iontový pár

polární analyt polární činidlo

RP-LC

26

Iontově párová chromatografie

- + - + + analyt protiont

iontový pár

+ + + - - analyt protiont

iontový pár

Iontové pára jsou na reverzní fázi

separovány jakou neutrální částice.

Příslušné protionty jsou přítomny v mobilní fázi.

Tvorbou iontového páru dojde ke zvýšení hydrofobicity analyzované látky a zvýší se retence na reverzní fázi.

CF3-CF2-CF2-COO- + H3N-CH-COOH

R

+ iontový pár

heptafluorobutanová kyselina aminokyselina

27

Iontově výměnná chromatografie Určena pro analýzu pouze nabitých molekul, iontů.

Stacionární fáze = zakotvené kationty nebo anionty, opačné ionty jsou používány jako mobilní fáze.

čas (min)

signál (eluce píků)

extrakt vzorku

zakotvený (imobilizovaný) povrch

s kationty

tok m.f. navázání negativně

nabitých analytů eluce pozitivně nabitých koextraktů

změna mobilní fáze, změna pH, eluce slabě negativně

nabitých analytů

nárůst koncentrace pufru, změna pH, eluce silně

negativně nabitých analytů

Podstatou jsou elektrostaticke interakce

Využívá rozdílné výměnné adsorpce analytů na povrchu ionexu

Nejdůležitější je povaha stacionární fáze a pH a iontová síla mobilní fáze

Mechanismus:

28

Iontově výměnná chromatografie

Ionexy = obecně jsou to nerozpustné látky, ve styku s vodnou fází uvolňují disociované ionty

Stacionární fáze jsou obvykle na bázi silikagelu, který je modifikovaný iontově výměnnými skupinami

SO3-

SO3-

SO3-

SO3-

X+

X+ X+

X+ SO3- SO3

-

SO3-

H+

H+ H+

H+

SO3-

SO3- SO3

-

SO3-

H+

H+ H+

H+

SO3-

X+

X+ X+

X+

H+ H+

H+ H+ X+

X+ X+

X+

analyt

zakotvení analytů na stacionární fázi

výměnou za iony původní

mobilní fáze

uvolnění analytů změnou mobilní fáze, zpětná výměna iontů,

eluce analytů

analyt

29

Afinitní chromatografie

Princip:

Separace probíhá pomocí imobilizovaných (navázaných) ligandů (biologicky aktivních sloučenin) na povrchu stacionární fáze. Vzorek se naváže do komplexu, ze kterého je uvolněn změnou složení mobilní fáze.

stacionární fáze

ligandy

nečistoty (koextrakty)

analyt

analyt je navázán a posléze uvolněn

změnou m.f.

koextrakty prochází kolonou bez zádrže,

neinteragují s ligandy

30

Mobilní fáze – polarita, iontová síla, technika eluce

O volbě m.f. rozhoduje: • rozpustnost vzorku v m.f.

• kompatibilita m.f. se s.f. a celým systémem

Separaci lze provádět za podmínek:

• isokratické eluce – konstantní složení a průtok m.f.

• gradientové eluce – mění se složení, případně i průtok m.f. během separace

BAZICKÁ

KYSELÁ DIPOLÁRNÍ

Aminy

Ethery

THF Alkoholy

Glykoly Voda

RCOOH

Fluoroalkany CHCl3 CH2Cl2

31

Mobilní fáze – volba podle eluční síly

Polarita (snyderův polaritní index) …..P´

Eluotropní hodnota – eluční síla (typ stacionární fáze, primárně pro NP) …. e0

Rozpustnostní parametr ….. d

rozpouštědlo P´ e0 (silikagel) e0 (C18) d

n-hexan 0.1 0 - 7.3

aceton 5.1 0.53 8.8 9.6

acetonitril 5.8 0.52 3.1 12.7

methanol 5.1 0.7 1 14.5

voda 10.2 - - 23.5

Se vzrůstající hodnotou roste polarita rozpouštědla.

Se vzrůstající hodnotou roste rozpustnost analytu v mobilní fázi, tedy eluce.

Vyjadřuje odhad stupně interakce s jiným „materiálem“, resp. rozpouštědla s podobnou hodnotou jsou dobře mísitelná.

32

Typické kolony a sorbenty – technické parametry

rozměry kolony zrnění průtok m.f. typ chromatografie

10-25 cm x 3-4.6 mm 3-10 mm 0.1-2 ml/min klasická

0.5-7.5 cm x 3-4.6 mm 3-10 mm 0.1-2 ml/min rychlá

5-25 cm x ± 2 mm 3-10 mm 0.05-1 ml/min narrow x micro-bore 2

15-100 cm x ± 1mm 3-10 mm 30-60 ml/min narrow x micro-bore 1

10-200 cm x 0.2-0.5 mm 1-5 mm 1-10 ml/min kapilární (s náplní)

100-200 cm x 0.04-0.08 --------- ˂ 1 ml/min kapilární (open tubular)

0.5-2 cm x 2 mm 1.8 mm 0.5-2.5 ml/min RRLC

5-15 cm x 2 mm 1.7 mm 0.1-1.0 ml/min UPLC

5-15 cm x ˂ 1-2 mm 1.0 mm ˂ 0.1-0.5 ml/min UHPLC

drážky na čipu 2.5-10 mm ˂ 1ml/min nano-LC (Lab on Chip)

analýza pomocí čipů

33

Třídění sorbentu – vliv na back pressure

sorbent

vstupní frita výstupní frita

větší propustnost = porozita musí být větší než

zrnění sorbentu

menší propustnost = porozita musí být menší

než zrnění sorbentu

Zrnitost sorbentu i propustnost frit a složení a průtok m.f. má vliv na celkový tlak systému.

Tlak v systému vytváří chromatografická kolona, resp. odpor který klade při průtoku m.f.

kolona

průřez kolonou

34

Aplikace sorbentů o nízkém zrnění

výhoda použití kolony se sorbentem z malých částic

Nár

ůst

úči

nn

ost

i se

par

ace

chro

mat

ogr

afic

ké k

olo

ny

Průtok mobilní fáze

optimální rychlost mobilní fáze

35

Aplikace rychlé separace (RRLC)

36

Aplikace UPLC – multireziduální analýza pesticidů

UPLC-ESI(+)-MS/MS analýza standardu cca 350 reziduí pesticidů reverzní fáze

37

Aplikace UPLC – multireziduální analýza pesticidů

Tlak se může mění v závislosti na typu použité mobilní fáze a i v rámci gradientu v závislosti na

aktuálním složením mobilní fáze a průtoku mobilní fáze a také typu stacionární fáze (velikosti

částic).

HPLC UHPLC vs

Průtok mobilní fáze: 0.3-0.7 ml/min 0.4-0.6 ml/min

Tlak kolem 1 000 psi kolem 10 000 psi

rychlejší analýza

užší píky

HPLC vs UHPLC

39

Výběr stacionární fáze

Je analyt polární?

Je analyt zadržen na

reverzní fázi?

Je analyt báze? Je analyt eluován z

reverzní fáze?

Použij normální fázi.

Použij anion Exchange

chromatografii

Použij reverzní fázi

Je analyt zadržen na

HILIC?

Použij kation Exchange

chromatografii

Použij HILIC ano

ne

ne

ano

ano

ne ano

ne

ano

40

HILIC

Eluce látek na HILIC vs RP

41

Výběr vhodné kolony Kolona

Kolona je nejdůležitější věc při chromatografické separaci:

Výběr stacionární fáze záleží na povaze vzorku a vlastnostech analytu (rozpustnost, polarita, …)

Faktory důležité pro výběr vhodné kolony / stacionární fáze:

Separační účinnost, symetrie píku

Životnost kolony, stabilita stacionární fáze

Reprodukovatelnost

doba separace / analýzy

Selektivita

Délka kolony: Rozlišení Separační účinnost Tlak Spotřeba mobilní fáze Doba analýzy

Vnitřní průměr kolony: Tlak Citlivost Separační účinnost Kapacita kolony Spotřeba mobilní

fáze

Roste s délkou kolony

Roste s průměrem kolony

Klesá s průměrem kolony

42

HPLC Systém

Kolony a stacionární fáze

Spotřeba rozpouštědla: Použití úzké kolony vede ke

značnému snížení spotřeby mobilní fáze.

Citlivost / intenzita Úžší kolony poskytují vyšší sensitivitu

/ intenzitu (při stejném objemu nástřiku).

Nástřik 1 ml směsi uhlovodíků na kolony s různým vnitřním průměrem.

43

Vliv pH na separaci látek Separace iontových sloučenin - kyseliny

O-

O

R

O-

O

R

OH O

R

OH O

R

Disociovaný (polární) analyt vykazuje špatnou retenci a tvar píku

pKA < pH pKa ≈ pH pKa > pH

Nedisociovaná látka poskytuje lepší retenci a dobrý tvar píku.

pokles pH

Citlivost za podmínek ESI- (polarita, ve které většina kyselin poskytují ionty) může být snížena, když se používá mobilní fáze s nízkým pH.

Reverzní fáze

Při pH podobném hodnotě pak analytu jsou přítomny jak

disociované, tak nedisociované formy. Pík je rozdělený a

široký. NEJHORŠÍ PŘÍPAD!

44

Vliv pH na separaci látek

Separace iontových sloučenin - báze

Vysoce polární (disociovaný) analyt vykazuje špatnou retenci a tvar píku.

pKa > pH pKa ≈ pH pKa < pH

Při pH podobném hodnotě pak analytu jsou přítomny jak

disociované, tak nedisociované formy. Pík je rozdělený a široký.

NEJHORŠÍ PŘÍPAD!

Nedisociovaný analyt poskytuje lepší retenci slabá iontová interakce stále hraje roli (pík mírně rozmytý).

nárůst pH

NH3+

R

NH3+

R

NH2

R

NH2

R

Citlivost za podmínek ESI + (polarita, ve které většina bází poskytují ionty) může být snížena při použití mobilní fáze s vysokým pH.

Reverzní fáze

45

Volba gradientu mobilní fáze Optimalizace gradientu

Separace všech analytů na základní linii v multi-metodě (velký počet analytů) není vyžadována (není možná). Funkce gradientu jsou různé:

• Vzájemná separace analytů, tak aby mohly být detekovány v pouze omezeném počtu analytů najednou.

• Separace matričních ko-extraktů pro minimalizaci matičních efektů.

Pomalý táhlý gradient Vysoké rozlišení Nízká intenzita píků

Strmý gradient Nižší rozlišení Vyšší intenzita píků

46

Volba gradientu mobilní fáze Optimalizace gradientu

Reálný gradient je vždy opožděn oproti nastavenému programu.

Binární pumpy poskytují mnohem přesnější shodu s naprogramovaným gradientem než pumpy kvarterní pumpy.

vstup na kolonu

výstup z kolonu

nastavený program

pozdržení

analytů

5-20%

70-100%

% silného

rozpouštědla

čas (min)

hlavní separační

část

eluce látek se silnou retencí, čištění kolony

rekondicionace

Finální gradient je

výsledkem optimalizace

metody.

Vliv gradientu na separaci látek

Může být různě dlouhá v závislosti na typu

chromatografie a povaze analyzovaného vzorku

Silné rozpouštědlo

Nastavení počátečních podmínek gradientu

Separační číst může mít několik různých úseků s

různými změnami gradientu (jak složení mobilní

fáze, tak i změna průtoku)

LC-MS/MS systém

10%

60%

% H2O

čas (min)

10%

60%

% H2O

tčas (min)

inte

nzita

in

ten

zita

POZVOLNÝ

GRADIENT

STRMĚJŠÍ

GRADIENT

Strmější gradient poskytuje

užší a intenzivnější píky a

zrychlení eluce látek, ale

někdy může vést k

nedokonalé separaci látek =

koeluce cílových analytů.

Pozvolný gradient může

způsobit rozšíření

chromatografických zón, ale

někdy je pomalejší gradient

vyžadován pro dobrou separaci

podobných látek.

Vliv gradientu na separaci látek HILIC

LC-MS/MS system

10%

60%

% H2O

čas (min)

inte

nzita

10%

60%

% H2O

čas (min)

inte

nzita

... na druhé straně...

Vliv gradientu na separaci látek HILIC

POZVOLNÝ

GRADIENT

STRMĚJŠÍ

GRADIENT

Strmější gradient poskytuje

užší a intenzivnější píky a

zrychlení eluce látek, ale

někdy může vést k

nedokonalé separaci látek =

koeluce cílových analytů.

Pozvolný gradient může

způsobit rozšíření

chromatografických zón, ale

někdy je pomalejší gradient

vyžadován pro dobrou separaci

podobných látek.

LC-MS/MS system

čas (min)

inte

nzita

čas (min)

inte

nzita

1 000

10 000

průtok mobilní fáze

0.2 ml/min

průtok mobilní fáze

0.4 ml/min

Zvýšení průtoku mobilní fáze způsobí:

posun retenčních časů analytů

rychlejší eluci látek

zaostření chromatografických zón,

užší píky

zvýšení celkového tlaku systému(!)

Vliv průtoku mobilní fáze

51

Vliv síly rozpouštědla na tvar píku Nástřik extraktu v silném rozpouštědle (rozpouštědlo, které má větší sílu eluce látek z kolony, typicky se využívá spíše ke konci gradientu) způsobí rozmytí píku brzy se eluujících látek s nízkou retencí na chromatografické koloně:

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100 Acetonitril (silné rozpouštědlo)

nástřik : 5µl

voda (slabé rozpouštědlo)

nástřik: 5µl

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100 Acetonitrile

(silné rozpouštědlo) nástřik : 2µl

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100

Acetonitrile (silné rozpouštědlo)

nástřik : 3µl

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100

Acetonitrile (silné rozpouštědlo)

nástřik : 4µl

změna rozpouštědla

Reverzní fáze: silné rozpouštědlo: acetonitril, methanol, …

52

Optimalizace gradientu

Úprava gradientu pro nástřik vzorku v silném rozpouštědle, první část gradientu velmi strmá, což vede k rychlejší eluci, ale lepší fokusaci chromatografické zóny.

Vliv síly rozpouštědla na tvar píku

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

time (min)

meth

an

ol (%

)

Optimalizovaný gradient

Lineární gradient

Zaostření polárních analytů

Separace nepolárních sloučenin

Time 1.50 2.00 2.50

%

0

100

2010-02-03 pest 20 1: TOF MS ES+ 184.019 20PPM

372

Time 1.00 1.50 2.00

%

0

100

2010-02-03 pest 15 1: TOF MS ES+ 184.02 20PPM

826

2.5× vyšší intenzita

Optimalizovaný gradient

Lineární gradient

53

HILIC

1. 5-Fluorouracil 2. Uracil 3. 5-Fluorocytosine 4. Cytosine

Tvar píku je zlepšen použitím vyššího procenta acetonitrilu (slabší rozpouštědlo) v mobilní fázi, což ale může způsobit menší rozpustnost látek v mobilní fázi. Nahrazení alespoň části vody polárním rozpouštědlem (acetonirilem) lze tento problém řešit.

Vliv nastřikovaného rozpouštědla na tvar píků:

54

Superkritická fluidní chromatografie

Mobilní fáze:

nepolární ~ hexan

chromatografie na normální fázi

55

Superkritická fluidní chromatografie - SFC

Vlastnostmi mezi kapalinou a plynem

Mobilní fáze: pouze nepolární látky: lipidy …

nepolární i polárnější látky: lipidy + polární lipidy, kanabinoidy, pesticidy, mykotoxiny …

Problém !

v mobilní fázi přídavek cca do 7%

nelze analyzovat vodné extrakty

SFC není vhodná pro příliš polární látky (ve vodě rozpustné)

56

Analýza/eluce lipidů pomocí SFC-HRMS vs LC-HRMS

Reverzní fáze LC

separace polární látky fosfolipidy triacylglyceroly

Normální fáze SFC

separace

triacylglyceroly fosfolipidy

diacylglyceroly a oxidované triacylglyceroly

% organického rozp.

% organického rozp.

klesá % CO2

57

Aplikace SFC

Necílová analýza

Metabolomika Lipodomika –

sledování oxidace lipidů

Lipidické složky Kanabinoidy Mykotoxiny

Pesticidy Přírodní látky

…

Alternativní technika pro LC/MC, GC/MS – zejména

pro matrice s vyšším obsahem tuku

S výhodou lze využít dvojího způsobu detekce:

PDA a následné MS

SFC lze velmi dobře využít pro separaci

izomerních látek

58

Aplikace SFC-MS

Necílová analýza -

fingerprinting ˃ cílová analýza

Analýza lidské stravy ˃ analýza lidské tukové tkáně

59

Analýza lipidů lidské celodenní diety

Metabolismus Tuková tkáň Strava

Lipidický profil lidské stravy TAGy

CHOLESTERYL ESTERY

OXIDOVANÉ TAGy, DIACYLGLYCEROLY (DAGy) FOSFOLIPIDY

60

Fingerprinting – lidská tuková tkáň

……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….

TAGy

OXIDOVANÉ DAGy, (hydroperoxidy)

OXIDOVANÉ TAGy, DAGy, (epoxidy) TAGy

CHOLESTERYL ESTERY

zoom

zoom

OXIDOVANÉ TAGy, DIACYLGLYCEROLY (DAGy)

zoom

FOSFOLIPIDY

OXIDOVANÉ TAGy (hydroperoxidy)

CHOLESTERYL ESTERY

61

Aplikace SFC-MS

Cílová analýza -

alternativa k RPLC metodám

Analýza kanabinoidů, mykotoxinů a pesticidů

SFC-HRMS je možno s výhodou použít pro cílovou analýzu kanabinoidů, mykotoxinů, pesticidů především v matricích s vyšším obsahem tuku

62

Cílová analýza - kanabinoidy

Proč superkritická fluidní chromatografie?

Není nutná derivatizace (× GC)

Vhodná pro nepolární látky (kanabinoidy)

Vhodná pro lipofilní látky (× HPLC na reverzní fázi) – tučné matrice

Možnost stanovení polohových izomerů

Extrakce (rozpuštění) ethanolem Konopná semena Konopný olej Konopné vrcholky

Chromatograf Acquity UPC2 (Waters, USA) Hmotnostní spektrometr Synapt G2-Si (Waters, USA)

63

SFC-MS chromatogramy konopného oleje

ESI+

ESI- eluční oblast kanabinoidů

triacylglyceroly

64

SFC-MS chromatogramy konopného oleje

CB

C

ESI-

ESI-

matrice

kanabinoidy

mastné kyseliny

65

Porovnání SFC-MS a LC-MS metod

konec SFC-MS chromatogramu

konec SFC-MS chromatogramu

hlavně triacylglyceroly LC-MS

SFC-MS

hlavně triacylglyceroly

doba analýzy = 60 min

ESI+

ESI+

eluce kanabinoidů

doba analýzy = 12 min

66

Cílová analýza - aflatoxiny

B1

B2

G1 G2

QuEChERS extrakt (navážka 2g)

Matriční kalibrace (aflatoxin B1) výtěžnost

opakovatelnost (RSD)

LOQ = 2,5 mg/kg

Aflatoxin B1

Aflatoxin G1

Aflatoxin B2

Aflatoxin G2

84% 9%

96% 8%

84% 10%

84% 10%

6 opakování hladina 10 mg/kg

AFB1 = 2 mg/kg

∑AF = 4 mg/kg

Legislativní limity

67

Cílová analýza - pesticidy

metconazole QuEChERS extrakt (navážka 10g)

Matriční kalibrace (metconazole)

výtěžnost opakovatelnost

(RSD)

metconazole

imazalil

flutriafol

tebuconazole

88% 2%

87% 2%

86% 6%

86% 1%

6 opakování hladina 0,020 mg/kg

0,02 mg/kg

MLR

0,4 mg/kg

0,3 mg/kg

2 mg/kg LOQ = 0,002 mg/kg