Udział w badaniach w celu walki z miaŝdŝycą

InŜynieria genetyczna Udział w badaniach w celu walki z miaŜdŜycą

PROTOKÓŁ

Warsztaty doświadczalne

InŜynieria genetyczna - 2 -

InŜynieria genetyczna Poszukiwanie miejsca docelowego dla leku na miaŜdŜycę

Wprowadzenie

Badania biomedyczne dotyczą procesów fizycznych i chemicznych, które

przebiegają we wnętrzu organizmów Ŝywych, a takŜe procesów wywołujących

choroby. Jednym z głównych celów tej dziedziny badań jest określenie miejsc

docelowych działania leków, czyli np. części ciała, w które moŜna skierować nowe

leki, czego wynikiem będzie uzyskanie odpowiedzi i pomoc w walce z chorobą.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi naukowych badań biomedycznych

dotyczącymi badania potencjalnego miejsca docelowego, które mogłoby zostać

rozpoznane przez lek na miaŜdŜycę.

Co powoduje miaŜdŜycę?

MiaŜdŜyca jest chorobą naczyń spowodowaną nagromadzeniem się tłuszczy na ścianach naczyń

krwionośnych. Istnieje wiele róŜnych oznak i stopni cięŜkości choroby zaleŜnie od tego, gdzie znajdują

się chore naczynia i jak bardzo choroba się rozwinęła. SpoŜywanie pokarmów bogatych w tłuszcze

nasycone doprowadziło w naszym społeczeństwie do znacznego wzrostu ryzyka rozwoju chorób

układu sercowo-naczyniowego. Ten nadmiar tłuszczu w naszym organizmie moŜe się odłoŜyć i

zgromadzić w niektórych miejscach ścian tętnic w postaci blaszek zwanych blaszkami

miaŜdŜycowymi, które następnie powodują zahamowanie przepływu krwi.

-----� Tętnica prawidłowa

-----� MiaŜdŜyca umiarkowana

-----� MiaŜdŜyca cięŜka


Cholesterol i makrofagi

Cholesterol jest jednym z wielu lipidów wchodzących w skład blaszek miaŜdŜycowych. Aby nie

dopuścić do odkładania się cholesterolu na ścianach naczyń, nasz organizm jest wyposaŜony w układ

„oczyszczający”, czyli makrofagi, które są komórkami krąŜącymi we krwi i wychwytującymi cząsteczki

złego cholesterolu znanego jako LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości).

Makrofagi rozpoznają te cząsteczki dzięki

znajdującym się na ich błonach receptorom. Układ

oczyszczający jest wydajny, jeŜeli stęŜenie

cholesterolu nie jest nadmiernie podwyŜszone.

JeŜeli stęŜenie cholesterolu jest zbyt wysokie,

makrofagi nadal będą wychwytywać LDL, ale gdy

pochłoną zbyt duŜe ich ilości, przekształcą się w tak

zwane komórki „piankowe”. Takie komórki wytwarzają

substancje indukujące stan zapalny i proliferację

komórek w ścianach tętnic (komórek śródbłonka),

czego wynikiem jest powstanie blaszek

miaŜdŜycowych blokujących przepływ krwi.

Obecnie grupy naukowców na całym świecie, w tym

takŜe grupa zajmująca się badaniem receptorów

jądrowych na uniwersytecie w Barcelonie, starają się

lepiej zrozumieć mechanizm, za pośrednictwem

którego makrofagi są zaangaŜowane w regulację

stęŜenia cholesterolu i rozwój miaŜdŜycy.

Naukowcy badają w szczególności rolę znajdującego

się w makrofagach białka, noszącego nazwę MYLIP.

Główną funkcją tego białka jest rozkładanie receptora błonowego makrofagów odpowiedzialnego za

rozpoznawanie LDL. Naukowcy zaobserwowali, Ŝe jeŜeli to białko jest wytwarzane w duŜych ilościach,

LDL

Utleniony LDL

Utlenianie LDL

Proliferacja komórek śródbłonka Aktywacja

układu immunolo-gicznego

Utlenianie LDL

LDL

Komórka piankowa


makrofagi wchłaniają mniej cholesterolu. Niemniej jednak jego rola w kontekście miaŜdŜycy nadal nie

jest w pełni poznana.

PoniewaŜ zaobserwowano, Ŝe białko MYLIP jest

związane z regulacją stęŜenia złego cholesterolu,

naukowcy uwaŜają, Ŝe moŜe to być nowe w

procesie regulacji miejsce docelowe dla leków na

miaŜdŜycę.

W jaki sposób moŜemy badać białko MYLIP zaangaŜowane w regulację stęŜenia cholesterolu?

Aby naukowcy mogli zbadać to potencjalne miejsce docelowe, muszą wytworzyć w laboratorium

znaczne ilości tego białka. W tym celu wykorzystują metodę inŜynierii genetycznej, tak zwaną

transformację bakteryjną, za pomocą której przenoszą DNA z organizmu do bakterii, dzięki czemu

bakterie będą wytwarzać duŜe ilości DNA, które następnie moŜna wprowadzić do innych komórek,

aby produkowały one białko docelowe dla celów badania.

Naukowcy zaczynają od oczyszczonej postaci genu produkującego białko MYLIP. Następnie łączą je

z kolistym fragmentem DNA zwanym plazmidem i wprowadzają go do bakterii, aby mogły one

produkować repliki materiału genetycznego.

W ramach tego protokołu zapraszamy Was do pracy w roli biotechników i przeprowadzenia

transformacji bakteryjnej!

� Makrofag

� Utleniony LDL

�Utlenianie LDL


Organizacja warsztatów:

1. Rozpoczniemy od przeprowadzenia transformacji bakteryjnej obejmującej wprowadzenie DNA

odpowiedzialnego za wytwarzanie białka MYLIP, aby bakterie mogły pełnić funkcję bioreaktorów

i wytwarzać materiał genetyczny w znacznych ilościach.

2. Następnie umoŜliwimy hodowlę bakterii na odpowiedniej poŜywce i wybierzemy te bakterie,

które wbudowały gen.

3. Oczyścimy materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie białka MYLIP tak, aby moŜna

go było wprowadzić do innych typów komórek, które następnie będą wytwarzać białko (*).

(*) PoniewaŜ wzrost bakterii trwa półtora dnia, oczyszczanie zostanie przeprowadzone z wykorzystaniem hodowli bakteryjnej

przygotowanej wcześniej przez monitorów


Sprzęt i materiały wymagane dla kaŜdej grupy/tabela

2 probówki z

bakteriami na lodzie,

oznaczone nr 1 i 2.

(A) pudełko

polistyrenowe +

lód

1 probówka na lodzie

z kolistym DNA,

plazmid

pCR2.1-MYLIP.

(B)

1 probówka z poŜywką

„LB” do hodowli bakterii

(C)

Mikropipety o

pojemności 20 µl i

200 µl

Końcówki do

mikropipet o


200 µl

Końcówki do

mikropipet o


200 µl

2 szalki Petriego z

agarem i

antybiotykiem:

(D) ampicyliną

Ezy plastikowe

Łaźnia wodna z wodą

destylowaną

Pływak na probówki

stoper

Zlewka na odpady

stałe

Zlewki na odpady

płynne

Plaster

Trwały marker

1 probówka z 1 ml

hodowli bakteryjnej

(E)

1 probówka z

„roztworem 1” Mini-

prep (F)

1 probówka z


prep (G)

1 probówka z


prep (H)

1 probówka z

„chloropanem” (I)

1 probówka z

„etanolem”

1 probówka z wodą

ultraczystą (milliQ).


(A) Bakterie, do których moŜna wprowadzić DNA (zwane komórkami kompetentnymi XL1-blue)

(B) Koliste DNA zwane plazmidem (pCR2.1)

(C) PoŜywka hodowlana LB (Luria-Bertani): ekstrakt z droŜdŜy 5 g/l, Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l.

Sterylizować w autoklawie. Przechowywać w chłodnym miejscu.

(D) Płytki z poŜywką LB/ampicyliną: PoŜywka hodowlana LB, agar 1,6%, ampicylina 100 µg/ml.

(E) Bakterie hodowane w poŜywce 2XYT, przez noc (16 h)

(F) Roztwór 1: 50 mM glukozy/25 mM Tris-HCl pH 8,0/10 mM EDTA/Rozcieńczyć wodą destylowaną.

(G) Roztwór 2: 20 µl detergentu SDS (siarczan dodecylosodowy) 10%/4 µl NaOH 10N/176 µl H2O

mQ/dla kaŜdej próbki. Sporządzić duplikat w dniu warsztatów.

(H) Roztwór 3 Mini-prep: 73,60 g octanu potasu/28,75 ml kwasu octowego/Rozcieńczyć w H2O mQ do

końcowej objętości 250 ml.

(I) Chloropan: 25 ml zrównowaŜonego fenolu/24 ml chloroformu/1 ml alkoholu izoamylowego.

Wirować przez 10 min przy 3000 obr./min.


Procedury

1- TRANSFORMACJA BAKTERYJNA

Transformacja bakteryjna jest procesem biotechnologicznym, w trakcie którego naukowcy

wprowadzają materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie danego białka do komórki

bakteryjnej. Taka komórka będzie następnie pełnić funkcję bioreaktora i wytwarzać kopie tego

materiału genetycznego, które w dalszej kolejności będzie moŜna wprowadzić do innego typu

komórek, aby mogły one wytwarzać białko docelowe. (*)

W trakcie tych warsztatów rozpoczniemy od wytworzenia oczyszczonego genu białka „MYLIP”, który

następnie wprowadzimy do plazmidu, czyli kolistej cząsteczki DNA.

Korzystając z tego materiału genetycznego, przeprowadzimy transformację bakteryjną, czyli

wprowadzimy do bakterii gen odpowiedzialny za wytwarzanie naszego białka, stosując metodę szoku

cieplnego – poddając próbkę działaniu róŜnych temperatur.

(*)W przypadkach gdy białko docelowe nie jest tak złoŜone, bakterie po transformacji same mogą pełnić rolę bioreaktorów i

wytwarzać to białko.


Protokół transformacji bakteryjnej

1. Mamy na lodzie dwie probówki zawierające bakterie. KaŜda probówka zawiera roztwór buforu,

który wspomoŜe transformację dzięki obecności kationów Ca2+

pochodzących z soli CaCl2

znajdującej się w buforze.

Co się dzieje? W zimnej temperaturze kationy Ca2+

wpływają

na błony komórek tak, Ŝe stają się one przepuszczalne dla

DNA. Jony Ca2+

wiąŜą się z fosfolipidami błony komórkowej,

chroniąc ich ujemny ładunek i tworząc niewielkie pory w błonie

bakterii.

2. Dodanie DNA w formie plazmidu do bakterii: za pomocą mikropipety 20 µl, odpipetować

10 µl plazmidu (probówka P) i dodać do probówki 2 zawierającej bakterie. Zamknąć probówkę i

delikatnie wymieszać, ostukując probówkę palcem. Probówka 1 będzie probówką kontrolną,

poniewaŜ zawiera bakterie bez plazmidu.


Co się dzieje? Jony Ca2+

wchodzą w reakcje z ujemnie naładowanymi grupami

fosforanowymi DNA, dzięki czemu mogą się znaleźć blisko błon bakteryjnych, ale

nie zostają od nich odepchnięte ze względu na ich ładunek elektryczny.

3. Pozostawić probówki na 15 minut w celu inkubacji

* W międzyczasie przeprowadzić pierwszy etap protokołu „Hodowla transformowanych bakterii” (page 12).

4. Po 15 minutach włoŜyć probówkę 1 i 2 do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC na dokładnie 1

minutę i 30 sekund.

Co się dzieje? Kolista cząsteczka DNA lub plazmid

przechodzi przez pory niektórych bakterii. W jaki sposób? W

temperaturze 42ºC elastyczność błony bakteryjnej rośnie,

dzięki czemu plazmid moŜe łatwiej przejść przez pory.


5. WłoŜyć probówki 1 i 2 z powrotem do lodu na 2 minuty.

Co się dzieje? Gdy temperatura spada, błony się

stabilizują i plazmid, który przeszedł przez pory,

pozostaje wewnątrz bakterii.


2- HODOWLA TRANSFORMOWANYCH BAKTERII

Po wprowadzeniu plazmidu do bakterii naleŜy doprowadzić do namnaŜania się bakterii, zapewniając

im odpowiednią poŜywkę i właściwą temperaturę. PoniewaŜ w wyniku transformacji bakteryjnej

powstaje zwykle niewiele komórek, w których zaszła transformacja, i wiele komórek bez transformacji,

potrzebna jest metoda do rozpoznania komórek, które wbudowały plazmid.

NaleŜy dopilnować, aby namnaŜać tylko bakterie stransformowane, co moŜna wykonać, prowadząc

hodowlę na płytkach hodowlanych zawierających antybiotyk. PoniewaŜ plazmid zawiera gen

odpowiedzialny za oporność bakterii na ten lek, jedynie stransformowane bakterie będą tworzyć

kolonie. Następnie pobierając bakterie z tych kolonii, będziemy mogli prowadzić hodowlę tylko tych

bakterii, które wytwarzają gen docelowy.

Gen MYLIP

Gen oporności na ampicylinę

Ampicylina

Ampicylina


Protokół hodowli transformowanych bakterii

1. Oznaczyć płytki, na których będą hodowane bakterie. Jedna z nich będzie płytką kontrolną do

hodowli bakterii bez plazmidu, a druga będzie przeznaczona do hodowli bakterii z plazmidem.

2. Za pomocą mikropipety 200 µl dodać 500 µl poŜywki hodowlanej „LB” zawierającej składniki

odŜywcze do probówki 1 i 2. Zamknąć probówki i delikatnie wymieszać, ostukując probówki

palcem.

3. Inkubować mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37ºC przez 30 minut.

Co się dzieje? W tym okresie bakterie mają czas, aby się

namnaŜać, czyli podwajają swoje DNA i tworzą takŜe kopię

plazmidowego DNA zawierającego docelowy gen.

*Czekając na wzrost bakterii, moŜna przeprowadzić trzeci etap warsztatów obejmujący izolację materiału genetycznego z

bakterii (page 16).


4. Za pomocą mikropipety 200 µl (za kaŜdym razem naleŜy korzystać z nowej końcówki) dodać

bakterie (100-200 µl) z probówki 1 i 2 na płytki agarowe zawierające takŜe antybiotyk,

ampicylinę.

5. Rozmieścić bakterie na powierzchni kaŜdej płytki agarowej, za kaŜdym razem stosując nową,

sterylną plastikową ezę. Obracać płytkę w trakcie przesuwania ezy tam i z powrotem. Zakleić

płytki taśmą i napisać na niej swoje inicjały oraz datę i typ bakterii.


6. Odwrócić płytki i inkubować w temperaturze 37ºC i następnego dnia sprawdzić wyniki. JeŜeli

inkubator nie jest dostępny, wystarczy po prostu pozostawić bakterie do wzrostu przez kilka dni

w temperaturze pokojowej.


3- IZOLACJA UZYSKANEGO MATERIAŁU GENETYCZNEGO

Aby uzyskać duŜe ilości materiału, naukowcy pobierają próbkę transformowanych bakterii, które

utworzyły kolonie, i wprowadzają ją do innej poŜywki hodowlanej zawierającej składniki odŜywcze.

Materiał genetyczny wytworzony przez bakterie musi zostać wyizolowany, czyli naleŜy go oddzielić od

pozostałych części bakterii, takich jak RNA, DNA bakterii i białka. Aby wyizolować plazmid, naukowcy

przeprowadzają protokół o nazwie Mini-prep. Ta procedura pozwala na separację DNA w postaci

plazmidu dzięki wykorzystaniu róŜnych rozpuszczalników i cykli wirowania, w trakcie których

stopniowo są odrzucane róŜne składniki komórkowe.

Oczyszczone DNA jest bardzo przydatne dla naukowców, którzy mogą prowadzić dalsze

eksperymenty nad jego rolą w regulacji stęŜenia cholesterolu i w miaŜdŜycy oraz badania dotyczące

nowych leków.

PoniewaŜ proces hodowli większej ilości bakterii zajmuje około półtora dnia, w trakcie tych warsztatów

będzie wykorzystywana hodowla przygotowana wcześniej przez monitorów.

ROZTWÓR 2 ROZTWÓR 3 CHLOROPAN ETANOL gen MYLIP Gen oporności

na ampicylinę


Protokół oczyszczania plazmidowego DNA z hodowli bakteryjnej (Mini-prep)

1. Zwirować probówkę z hodowlą bakterii przy maksymalnej prędkości przez 30 sekund. Następnie

odrzucić supernatant.

Co się dzieje? Komórki zostają oddzielone od

poŜywki hodowlanej, w której wzrastały, zwykle

zawierającej odpady komórek i inne cząsteczki,

których się chcemy pozbyć.

2. Następnie naleŜy odrzucić supernatant i za pomocą mikropipety 200 µl zawiesić osad w 100 µl

roztworu 1 i wymieszać pipetą.

Co się dzieje? Bakterie zostają zawieszone w roztworze, dzięki czemu proces oczyszczania

moŜe postępować dalej, ale tym razem stęŜenie bakterii jest wyŜsze, poniewaŜ znajdują się w

mniejszej objętości. Roztwór 1 jest buforem zapobiegającym denaturacji kolistego DNA w

postaci plazmidu, która by nastąpiła, gdyby pH wzrosło powyŜej 12,6.

3. Dodać 200 µl roztworu 2 i delikatnie wymieszać, odwracając.

Co się dzieje? Roztwór 2 zawierający

detergent niszczy błony fosfolipidowe bakterii,

uwalniając całą zawartość komórek do poŜywki

w trakcie procesu zwanego lizą bakteryjną. Ten

roztwór zawiera takŜe silną zasadę

(wodorotlenek sodu, NaOH) denaturującą

białka podtrzymujące strukturę błony

komórkowej i własne DNA bakterii. Niemniej

jednak plazmidowe DNA pozostaje

nienaruszone, poniewaŜ pH wynosi poniŜej

12,6.

ROZTWÓR 2


4. Dodać 150 µl roztworu 3 i wymieszać, odwracając.

Co się dzieje? Roztwór 3 jest kwaśnym roztworem

octanu sodu, który neutralizuje pH roztworu i

zatrzymuje proces lizy. Na tym etapie większość

zawartości komórek – białka, fosfolipidy błon i własne

DNA bakterii – wytrąca się, tworząc białą zawiesinę.

Własne DNA bakterii, teraz zdenaturowane, tworzy

nierozpuszczalny kompleks, który się wytrąca,

poniewaŜ jony K+ wiąŜą się z grupami fosforanowymi DNA i w ten sposób neutralizują ich ujemny

ładunek.

5. Dodać 300 µl chloropanu, dobrze wymieszać, odwracając i wirować przez 3 minuty przy

maksymalnej prędkości, aby oddzielić plazmid zawarty w genie od MYLIP.

Co się dzieje? W tym etapie plazmidowe DNA zostaje

oddzielone od pozostałości komórkowych – białek,

lipidów i innych kwasów nukleinowych. Chloropan jest

mieszaniną rozpuszczalników organicznych

zawierającą fenol i chloroform. Te rozpuszczalniki

rozpuszczają cząsteczki hydrofilne, takie jak błony

lipidowe, i denaturują białka, w wyniku czego stają się

one nierozpuszczalne w wodzie. Dzięki wirowaniu

mieszanina zostaje podzielona na dwie fazy: fosfolipidy i białka komórkowe pozostają w roztworze w

dolnej fazie z chloropanem lub znajdują się na powierzchni między fazami w postaci białej, wytrąconej

zawiesiny. Plazmidowe DNA będzie się znajdować się w górnej fazie wodnej, poniewaŜ jego ładunki

elektryczne nie zostały zneutralizowane i tym samym jest rozpuszczalne w wodzie.

6. Za pomocą pipety 200 µl naleŜy przenieść górną, przezroczystą fazę wodną do nowej

probówki.

ROZTWÓR 3

CHLOROPAN


7. Za pomocą pipety 200 µl dodać 900 µl 100% etanolu i dobrze wymieszać. Po dodaniu etanolu

plazmidowe DNA wytrąca się z roztworu wodnego.

8. Wirować przez 5 minut przy maksymalnej prędkości. Widoczny wytrącony osad będzie

zawierać DNA w postaci plazmidu.

9. Pipetą 200 µl odciągnąć CAŁY etanol.

10. Zawiesić osad z plazmidowym DNA w 20 µl oczyszczonej H2O.

gen oporności na ampicylinę


Wyniki i omówienie

1. Wykonaj diagram procesu transformacji bakteryjnej i objaśnij, jaką pełni rolę w badaniach nad

poszukiwaniem nowych leków w celu walki z miaŜdŜycą.

2. Korzystając z diagramu, objaśnij, czym jest szok cieplny.

3. W celu prowadzenia hodowli bakterii korzystałeś z płytki hodowlanej zawierającej antybiotyk.

Dlaczego?

4. Czym jest kolonia bakteryjna?

5. Na której z dwóch płytek z naniesionymi bakteriami będą widoczne kolonie – na płytce kontrolnej

czy na płytce zawierającej stransformowane bakterie? Dlaczego?


6. W jaki sposób otrzymywanych jest wiele kopii docelowego genu z wykorzystaniem powstałych

kolonii?

7. W jaki sposób wytrąca się bakteryjne DNA i docelowe DNA? Objaśnienie naleŜy podeprzeć

diagramem.

8. Stosując metodę separacji o nazwie Mini-prep, wyizolowałeś wiele kopii docelowego DNA. Co

naukowcy robią, gdy otrzymają takie DNA?

Badacze, którzy pracowali nad przygotowaniem tego protokołu: Theresa León, Jonathan

Matalonga, Uniwersytet w Barcelonie

Niniejszy produkt jest udostępniany na licencji Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported. Kopię licencji przedstawiono na stronie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

FINANSOWANIE PARTNERZY PROJEKTU: AUTOR:

Udział w badaniach w celu walki z miaŝdŝycą

Education

Transcript of Udział w badaniach w celu walki z miaŝdŝycą