UNIVERZA V NOVI GORICI

FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

UČINKI HERBICIDA GLIFOSATA V ČISTI OBLIKI IN V

PRIPRAVKU NA DEŽEVNIKE (Eisenia andrei)

DIPLOMSKO DELO

Sandra DUKIĆ

Mentor: doc. dr. Suzana Žižek

Nova Gorica, 2016

II

IZJAVA

Izjavljam, da je diplomsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela. Rezultati, ki so nastali v okviru skupnega raziskovanja z drugimi raziskovalci ali so jih prispevali drugi strokovnjaki, so v diplomskem delu jasno prikazani oziroma navedeni (citirani).

Sandra Dukić

III

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Suzani Žižek za vso strokovno pomoč in napotke pri izdelavi diplomske naloge. Velika zahvala gre mojima staršema, ki sta me ves čas študija finančno podpirala, me spodbujala in mi svetovala. Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem, ki so mi v času študija stali ob strani in me s pogovori dodatno motivirali k doseganju študijskih ciljev.

IV

DIPLOMSKO DELO

Učinki herbicida glifosata v čisti obliki in v pripravku na deževnike (Eisenia

andrei)

IZVLEČEK

Zaradi naraščanja svetovnega prebivalstva prihaja do vse večjih potreb po pridelavi hrane, posledično pa so tla izpostavljena vse večjim pritiskom izrabe ter različnim onesnaževalom, med katerimi prevladujejo pesticidi. Najbolj razširjen razred pesticidov v kmetijstvu so herbicidi, od katerih je najpogosteje uporabljen glifosat. Ker imajo pesticidi mnogokrat učinke na netarčne organizme, se zanje izvajajo ocene tveganj. Učinke na organizme se preverja s standardiziranimi ekotoksikološkimi testi. V okviru sledečega diplomskega dela se je raziskovalo oziroma primerjalo učinke dveh različnih oblik glifosata na deževnike vrste Eisenia andrei, Bouché, 1972. Uporabljen je bil glifosat v pripravku ter glifosat v obliki čiste aktivne učinkovine. Po podatkih iz literature naj bi bili pripravki zaradi vsebnosti pomožnih sredstev za talne organizme bolj strupeni. Pri ugotavljanju vpliva na rast deževnikov je prišlo do ugotovitve, da je glifosat v pripravku res bistveno bolj vplival na spremembo mas živali, saj so se v mnogih primerih znižale. Medtem so se pri čistem glifosatu povečale pri vseh uporabljenih koncentracijah pesticida. Na umrljivost v obeh primerih ni bilo vpliva, saj so preživele vse živali. Pri ugotavljanju vpliva na razmnoževanje je bil test s čistim glifosatom po kriterijih OECD neveljaven, zato ni bilo mogoče primerjati rezultatov. Vseeno je iz vseh dobljenih rezultatov mogoče sklepati, da glifosat za deževnike ni zelo strupen.

KLJUČNE BESEDE

Glifosat, pesticidi, deževniki, Eisenia andrei, strupenost, ekotoksikologija.

V

BACHELOR THESIS

The effects of the herbicide glyphosate in its pure form and in formulation on

earthworms (Eisenia andrei)

ABSTRACT

Due to increasing world population there is an increasing demand for the production of food and, consequently, soil is exposed to increasing pressures and various types of pollutants, among which pesticides prevail. The most widespread class of pesticides in agriculture are herbicides, of which glyphosate is the most widely used. Since pesticides often have negative effects on non-target organisms, they are subjected to risk assessment. Effects on organisms are reviewed by standardized ecotoxicological tests. Within the framework of this diploma thesis the effects of two different forms of glyphosate on earthworms of the species Eisenia andrei, Bouché, 1972, were investigated and compared. A commercial formulation of glyphosate and glyphosate as a pure active ingredient were used. According to literature data, formulations are expected to be more toxic for soil organisms due to the presence of adjuvants. In determining the influence on the growth of earthworms, it was found that the formulation had indeed affected the change in masses of the animals considerably more than the active ingredient, because in many cases, masses decreased while at all concentrations of the pure active ingredient the animals' masses increased. Mortality was not affected, since all animals survived trough both experiments. In determining the effect on reproduction, the test with pure glyphosate was invalid due to OECD criteria, so it was not possible to compare the results. However, overall it can be concluded that glyphosate is not very toxic for earthworms.

KEY WORDS

Glyphosate, pesticides, earthworms, Eisenia andrei, toxicity, exotoxicology.

VI

KAZALO VSEBINE

1 UVOD .................................................................................................................... 1

1.1 Delovna hipoteza .............................................................................................. 2

2 TEORETIČNE OSNOVE ....................................................................................... 3

2.1 Glifosat .............................................................................................................. 3 2.1.1 Lastnosti glifosata ........................................................................................... 3 2.1.2 Zgodovina uporabe glifosata ........................................................................... 4 2.1.3 Način uporabe glifosata .................................................................................. 5 2.1.4 Način delovanja na rastline ............................................................................. 6 2.1.5 Pripravki ......................................................................................................... 6 2.1.6 Zakonsko določene vrednosti glifosata v hrani ................................................ 7 2.1.7 Koncentracije v prsti ....................................................................................... 7 2.1.8 Obstojnost v okolju ......................................................................................... 8 2.1.9 Mikrobna razgradnja glifosata ......................................................................... 8 2.1.10 Negativni vplivi glifosata .............................................................................. 9

2.1.10.1 Vplivi na neciljne organizme in okolje .................................................... 10 2.1.10.2 Vplivi na zdravje ljudi ............................................................................. 11

2.1.11 Kdaj je tveganje največje ........................................................................... 13

2.2 Deževniki ........................................................................................................ 14 2.2.1 Proces razmnoževanja pri deževnikih ........................................................... 14 2.2.2 Eisenia andrei, Bouché, 1972 in Eisenia fetida (Savigny, 1826).................... 15 2.2.3 Ekosistemske storitve in pomen deževnikov ................................................. 16 2.2.4 Testni organizmi ........................................................................................... 18 2.2.5 Možni neželeni učinki na deževnike .............................................................. 18

2.3 Ekotoksikološki testi z deževniki .................................................................. 20 2.3.1 Vrste ekotoksikoloških testov ........................................................................ 20 2.3.2 Izbira vrste deževnikov ................................................................................. 21

3 MATERIALI IN METODE .................................................................................... 22

3.1 Uporabljeni materiali in kemikalije ................................................................ 22 3.1.1 Standardizirana prst ...................................................................................... 22 3.1.2 Kemikalije ..................................................................................................... 22 3.1.3 Poskusne živali ............................................................................................. 23 3.1.4 Materiali ........................................................................................................ 23

3.2 Izvedba testov ................................................................................................ 23 3.2.1 Priprava poskusnih živali .............................................................................. 23 3.2.2 Priprava prsti ................................................................................................ 24 3.2.3 Test z glifosatom v pripravku ........................................................................ 24 3.2.4 Test z glifosatom v čisti obliki ........................................................................ 26

4 REZULTATI IN RAZPRAVA................................................................................ 27

VII

4.1 Vplivi na umrljivost deževnikov .................................................................... 27

4.2 Vplivi na rast deževnikov ............................................................................... 27

4.3 Vplivi na razmnoževanje deževnikov ............................................................ 29

5 ZAKLJUČKI ........................................................................................................ 31

6 VIRI ..................................................................................................................... 32

VIII

SEZNAM TABEL

Tabela 1: Herbicidi z aktivno snovjo glifosat, ki se prodajajo v Sloveniji ........................ 4

IX

SEZNAM SLIK

Slika 1: Molekulska struktura glifosata .......................................................................... 3 Slika 2: Kopičenje in prenos glifosata v prsti ................................................................. 5 Slika 3: Delovanje glifosata na rastline po šikimatni poti ............................................... 6 Slika 4: Razpadna pot glifosata ..................................................................................... 9 Slika 5: Deževnik in kokon .......................................................................................... 14 Slika 6: E. fetida .......................................................................................................... 15 Slika 7: E. andrei ......................................................................................................... 16 Slika 8: Levo na sliki je pripravek, ki smo ga uporabili pri prvem testu, desno na sliki pa čisti glifosat ................................................................................................................. 22 Slika 9: Zgoraj: primer spolno zrelega deževnika s sedlom, spodaj: deževnik, ki še ni spolno dozorel, oziroma je brez sedla ......................................................................... 24 Slika 10: Mladi deževniki, ki so se sprijeli med sabo – zgoraj v posodi, spodaj pa na pladnju, pred štetjem................................................................................................... 25 Slika 11: Dodajanje mešanice glifosata in 2 x deionizirane vode v prst Lufa 2.2 ......... 26 Slika 12: Vpliv glifosata v pripravku na rast deževnikov .............................................. 27 Slika 13: Vpliv čistega glifosata na rast deževnikov .................................................... 28 Slika 14: Vpliv glifosata v pripravku na razmnoževanje deževnikov. ........................... 29 Slika 15: Vpliv čistega glifosata na razmnoževanje deževnikov .................................. 30

X

KRATICE IN OKRAJŠAVE

AMPA – Aminomethyl phosphonic acid ECHA – European Chemicals Agency ECx – Effective concentration EEC – European Economic Community EPA – Environmental Protection Agency EPSPS – 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase ERA – Environmental Risk Assessment FIFRA – Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act IARC – International Agency for Research on Cancer ISO – International Organization for Standardization LCx – Lethal concentration OECD – Organisation for Economic Co-operation and Development POEA – Polyethoxylated tallow amine WHC – Water holding capacity

XI

SIMBOLI

® - Registered trademark ™ - Trademark

1

1 UVOD Ker tla nastajajo izredno počasi (en centimeter tal nastaja okrog sto do dvesto let), so predvsem iz človeškega vidika relativno neobnovljiv vir. Njihovo ohranjanje je zato ključnega pomena za trajnostno prihodnost (Velki in Ečimović, 2015). V zadnjih desetletjih je intenzivna kmetijska pridelava pripeljala do poslabšanja kakovosti tal (Pelosi idr., 2013a). Zaradi naraščanja prebivalstva prihaja do vse večjih potreb po pridelavi hrane in posledično so tla izpostavljena vse večjim pritiskom ter različnim onesnaževalom. Ta lahko izhajajo iz različnih virov, najpomembnejšega pa predstavljajo pesticidi (Velki in Ečimović, 2015). Pesticidi so snovi ali mešanice snovi, namenjene preprečevanju, uničenju, odvračanju ali lajšanju posledic škodljivih organizmov (Wang idr., 2012; Velki in Ečimović, 2015; Newman idr., 2016). Razdelimo jih lahko v skupine glede na tarčne (ciljne) skupine organizmov, na katere delujejo. Najpogostejši so insekticidi, fungicidi in herbicidi. Čeprav je vsaka skupina pesticidov namenjena posebej določenim organizmom, ima lahko vsak izmed njih strupene učinke na različne talne organizme (Velki in Ečimović, 2015; Newman idr., 2016). Pesticidi se v kmetijski dejavnosti uporabljajo za izboljšanje donosa in kakovosti pridelka, kar pa posledično poveča tudi tržni dobiček (Zhou idr., 2013; Givaudan idr., 2014b; Yang idr., 2015a; Newman idr., 2016). Najbolj razširjen razred pesticidov v kmetijstvu so herbicidi, od katerih ima glifosat največjo svetovno uporabo (Newman idr., 2016). Čeprav so pesticidi v intenzivnem poljedelstvu ključnega pomena, obstajajo resni pomisleki glede potenciala teh snovi za onesnaževanje okolja (Alves idr., 2013). Tudi če so prisotni v majhnih količinah, imajo lahko njihova raznolikost, strupenost in obstojnost v okolju številne škodljive vplive na ekosisteme (Chakra idr., 2008). Pesticidi imajo negativen vpliv na talno favno ter na številne biološke procese, ki vključujejo talno favno (Alves idr., 2013). Poleg smrti in zmanjšane plodnosti lahko zaradi izpostavljenosti pesticidom pride do več subletalnih učinkov, kot so skrajšana življenjska doba, mutacije potomcev, zmanjšano prehranjevanje in izguba mase, spremembe v plodnosti, spremembe v odlaganju jajčec in spremenjeni razvojni časi (Schneider idr., 2009). V zadnjih nekaj desetletjih so posledice pesticidov postale globalni problem. Pesticidi, ki se uporabljajo na kmetijskih zemljiščih, se lahko kopičijo v območjih, kamor so bili naneseni, ali pa se prenesejo na druga območja. Registracija, proizvodnja in uporaba pesticidov so zato nadzorovane in celo omejene na podlagi njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti, tj. molekularnih oblik, topnosti v vodi, mehanizmov razgradnje in razpadnih produktov (metabolitov) ter na podlagi ekotoksikologije v ekosistemih in vpliva na človeško zdravje (Yang idr., 2015a). Da bi omejili okoljske vplive pesticidov ter zagotovili znanstveno podporo deležnikov pred izdajo dovoljenj za promet s pesticidi, se s strani nacionalnih in evropskih agencij za varno hrano izvajajo ocene tveganj za posamezne pesticide. Tovrstne ocene tveganj vključujejo teste, namenjene merjenju vpliva pesticidov na različne vodne in kopenske organizme (Pelosi idr., 2013a). Okoljska ocena tveganja je namenjena sledenju poti, po katerih se onesnaževala razširjajo in razgrajujejo v okolju ter razumevanju interakcij onesnaževal z neciljnimi organizmi v vodi in tleh. Oceno učinkov onesnaževal na organizme preverjamo z ekotoksikološkimi testi, ki se po vsem svetu izvajajo že vsaj tri desetletja, v mnogih primerih z uporabo standardiziranih protokolov (npr. EPA, OECD, ISO) ter organizmov, gojenih v laboratorijskem okolju. Večina ekotoksikoloških študij tal temelji na

2

nevretenčarjih. Kot bioindikatorje se najpogosteje uporablja deževnike (Lumbricidae), skakače (Collembola) ter enhitreje (Encytraeidae). Uporaba teh skupin je postala standardna zaradi njihove razširjenosti, pomembne ekološke vloge, stalnega stika s tlemi, hitrega razmnoževanja in enostavnega vzdrževanja v laboratorijih (Cardoso in Alves, 2012). Agencija za zaščito okolja v ZDA na 15 let preveri vsak registriran pesticid in na tak način določi, ali še naprej izpolnjuje standarde listine FIFRA (Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act). Ponovna registracija glifosata v ZDA se je zgodila leta 2015. V EU mora ponoven pregled in registracijo pesticidov izvesti Evropska komisija (Mesnage idr., 2015). Ta je pred kratkim (junija 2016) za 18 mesecev podaljšala dovoljenje za uporabo glifosata, čeprav članice unije niso dosegle potrebne večine za ta korak. Zaradi vse bolj razširjene uporabe glifosata je raziskovanje njegovih morebitnih negativnih vplivov na koristne talne organizme vse pomembnejše. S pomočjo znanstvene literature sem se seznanila z lastnostmi glifosata in njegovih pripravkov, z biologijo oziroma ekologijo deževnikov ter s standardiziranimi ekotoksikološkimi testi, ki se uporabljajo pri odkrivanju učinkov kemikalij na organizme. V okviru svojega dela sem uporabila standardiziran OECD test št. 222 (OECD, 2015). Deževnike, gojene v Laboratoriju za raziskave o okolju Univerze v Novi Gorici, sem v standardizirani prsti Lufa 2.2 (Lufa Speyer, 2014) izpostavila različnim koncentracijam glifosata v pripravku in nato še čisti aktivni sestavini glifosat. V prvem delu testov sem spremljala učinke na rast in preživetje, v drugem delu pa učinke na razmnoževanje deževnikov. Izračunala sem statistično značilne razlike med skupinami izpostavitev z analizo variance ter Dunnettovim post-hoc testom. Koncentracije izpostavitev sem izbrala glede na rezultate iz strokovne literature ter glede na dejanske koncentracije, ki se uporabljajo v kmetijstvu.

1.1 Delovna hipoteza Moja delovna hipoteza je bila, da bodo pri uporabi pripravka vidni večji učinki, saj pripravki vsebujejo snovi, ki pospešujejo delovanje pesticidov. Namen diplomske naloge je bil izvesti strupenostni test vpliva glifosata v čisti obliki in v pripravku na preživetje, rast in razmnoževanje deževnikov ter ugotoviti, ali ima glifosat v pripravku večje učinke na preživetje, rast in razmnoževanje deževnikov kot glifosat v obliki čiste aktivne učinkovine.

3

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 Glifosat Proizvodnja in razširjanje ksenobiotikov v okolju danes hitro naraščata. Ljudje so vsakodnevno izpostavljeni mnogim od njih in njihovim razpadnim produktom (proizvodom). Ko so te spojine v okolju prisotne ena ob drugi, lahko delujejo kot mešanice s sinergističnimi (sinergizem - istočasno delovanje) ali antagonističnimi (antagonizem - nasprotno delovanje) učinki. Med njimi so herbicidi, osnovani na glifosatu, eni prvih herbicidov, ki so se začeli uporabljati po vsem svetu (Gasnier idr., 2009). Herbicidi, ki temeljijo na glifosatu, so zastopani predvsem s pripravkom Roundup®, ki ga proizvaja podjetje Monsanto (Mink idr., 2012; Mesnage idr., 2015). Gre za najpogosteje uporabljane komercialne pripravke pesticidov po vsem svetu. Glifosat je aktivna sestavina več kot 750 različnih širokospektralnih herbicidov. Tovrstni herbicidi se uporabljajo na pridelkih, namenjenih prehrani ljudi ter krmi za živali (Mesnage idr., 2015), glavni cilj njihovega delovanja pa je neselektivno (neizbirno) zatiranje plevela med pridelkom (Ghisi idr., 2016). V Evropski uniji trenutno potekajo debate o uporabi glifosata. Dovoljenje za uporabo glifosata v EU je poteklo konec junija 2016, vendar ga je Evropska komisija podaljšala še za naslednjih 18 mesecev, torej do konca leta 2017. V tem času bo morala Evropska agencija za kemikalije (ECHA) oceniti tveganje za rakotvornost herbicida.

2.1.1 Lastnosti glifosata Glifosat ([N-fosfonometil glicin], kemijska formula C3H8NO5P) je poceni, visoko učinkovit, sistemski, širokospektralen in neselektiven herbicid, ki ga povsod po svetu uporabljajo v kmetijstvu, vrtnarstvu, parkih, domačih vrtovih, še posebej pa pri gojenju gensko spremenjenih pridelkov (Araújo idr., 2003; Contardo-Jara idr., 2009; Helander idr., 2012; Piola idr., 2013; Yang idr., 2015a; Yang idr., 2015b; Ghisi idr., 2016; Nguyen idr., 2016). Prednost glifosata je tudi njegova relativno nizka ekološka strupenost ter relativno nizka strupenost za sesalce (Nguyen idr., 2016). Je visoko polaren (Busse idr., 2001; Schrübbers idr., 2016) ter posledično zelo vodotopen (Contardo-Jara idr., 2009; Zhou idr., 2013). Zaradi svoje polarnosti se v tleh močno adsorbira na železove in aluminijeve okside ter na glino (Busse idr., 2001).

Slika 1: Molekulska struktura glifosata (https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Glyphosate.svg/1000px-

Glyphosate.svg.png, pridobljeno 2. 6. 2016) Glifosat je organofosfatni herbicid, ki se na delce tal adsorbira podobno kot naravne organofosfatne spojine in sicer z izmenjavo ligandov preko dela molekule fosfonske

4

kisline (Yang idr., 2015a), s Kd 1 vrednostmi do 900 l/kg. Zaradi te lastnosti ter dejstva,

da ga talni mikroorganizmi relativno hitro razgradijo, na splošno velja, da ima glifosat nizek potencial za onesnaženje površinskih vod in podtalnice (Contardo-Jara idr., 2009). Vezani ostanki glifosata niso biodostopni in zato na mestu nanosa niso škodljivi za okolje. V primeru erozije tal je možen prenos v površinske vode (proces erozije namreč delce tal z adsorbiranim herbicidom prenaša do vodnih teles) zaradi česar lahko ostanki pesticida vstopijo v vodne prehranjevalne verige. Potrebno je tudi omeniti, da sta biodostopnost herbicida za kopenske organizme ter biodostopnost herbicida za vodne organizme različni. Na mobilnost (gibljivost) in interakcije glifosata lahko vplivajo tudi lastnosti prsti ter podnebje (Yang idr., 2015b).

2.1.2 Zgodovina uporabe glifosata Prehod od tradicionalnih kmetijskih praks k intenzivnemu, kemijsko usmerjenem kmetijstvu, je po 2. svetovni vojni vplival na sisteme kmetovanja v zahodnem svetu. Uvedba glifosata je leta 1970 predstavljala začetek nove dobe zatiranja plevela (Helander idr., 2012). Njegova uporaba je od takrat izjemno narasla, najprej predvsem zaradi nizke cene, danes pa v glavnem na račun porasta pridelave gensko spremenjenih pridelkov, kot so koruza, soja in oljna repica, od katerih je vsaj 90 % odpornih na glifosat (Allegrini idr., 2015; Nguyen idr., 2016). V Združenih državah Amerike so pripravki z glifosatom v prodaji že od leta 1974, in sicer se prodajajo predvsem pod tržnimi imeni Roundup®, Roundup Pro®, Roundup PowerMAX™, Roundup WeatherMAX® in AquaMaster® (Mink idr., 2011; 2012). Po podatkih ameriške Agencije za zaščito okolja je trenutno v prodaji več kot 400 različnih pripravkov glifosata v več kot 100 državah po vsem svetu (Ghisi idr., 2016). V Sloveniji je trenutno v prodaji 14 različnih pripravkov z aktivno snovjo glifosat v različnih oblikah (Tabela 1). Izmed naštetih sta pri nas najpogosteje uporabljena herbicida BOOM EFEKT ter BQM. Od vseh herbicidov je glifosat najpogosteje uporabljen, s predvideno svetovno uporabo 1,35 milijonov ton do leta 2017 (Newman idr., 2016). Tabela 1: Herbicidi z aktivno snovjo glifosat, ki se prodajajo v Sloveniji (www.fito-info.si, pridobljeno 2. 7. 2016)

Tržno ime herbicida Aktivna snov Prodajno mesto

CHIKARA DUO Glifosat specializirane prodajalne

FFS

HELOSATE 450 SL Glifosat specializirane prodajalne

FFS

HELOSATE 450 TF Glifosat specializirane prodajalne

FFS

KYLEO Glifosat specializirane prodajalne

FFS

ROUNDUP ALPHEÉ Glifosat cvetličarne in prodajalne z

neživilskim blagom

TOUCHDOWN SYSTEM 4 Glifosat (amonijeva sol) specializirane prodajalne

FFS

BIOTIP UNIČEVALEC Gllifosat (izopropilamino cvetličarne in prodajalne z

1 Porazdelitveni koeficient. Kd (l/kg) je ravnotežno razmerje med sorbirano koncentracijo kemikalije (mg/kg) in

raztopljeno koncentracijo kemikalije (mg/l). Torej; Kd(l/kg) = (sorbirana koncentracija (mg/kg)) / (raztopljena koncentracija (mg/l))

5

PLEVELA sol) neživilskim blagom

BOOM EFEKT Gllifosat (izopropilamino

sol) specializirane prodajalne

FFS

BQM Gllifosat (izopropilamino

sol) specializirane prodajalne

FFS

BQM SUPER Gllifosat (izopropilamino

sol) specializirane prodajalne

FFS

CLEANESS Gllifosat (izopropilamino

sol) cvetličarne in prodajalne z

neživilskim blagom

ROUNDUP ENERGY Glifosat (kalijeva sol) specializirane prodajalne

FFS

ROUNDUP FLEX Glifosat (kalijeva sol) specializirane prodajalne

FFS

ROUNDUP MAX Glifosat (kalijeva sol) specializirane prodajalne

FFS

2.1.3 Način uporabe glifosata Herbicid lahko površino tal doseže preko neposrednega prestrezanja v obdobju pred sajenjem pridelka, v zgodnjih fazah rasti na glifosat odpornih gensko spremenjenih pridelkov ali pa po sami žetvi (Allegrini idr., 2015). Nanese se ga na zelene liste ciljnih rastlin, od koder se prenaša po celotni rastlini, zlasti do apikalnih meristemov in korenin (Slika 2). Na tak način pride v stik s talnimi mikroorganizmi, ki ga uporabljajo kot vir hranil (Ratcliff idr., 2006; Helander idr., 2012). Ker se glifosat ne razgradi znotraj rastline, so ga nekatere vrste plevela z velikim koreninskim sistemom zmožne prenesti do globokih plasti tal, kjer je mikrobna dejavnost relativno nizka in je tam zato obstojen dlje. Obstojnost in prenos glifosata v tleh sta odvisna od sestave tal, podnebnih razmer in mikrobne dejavnosti, pa tudi kmetijskih praks (Helander idr., 2012).

Slika 2: Kopičenje in prenos glifosata v prsti (Helander idr., 2012)

6

2.1.4 Način delovanja na rastline Glifosat preprečuje rast rastlin z zaviranjem biosinteze (spajanja) bistvenih aromatskih aminokislin, ki so potrebne za njihovo preživetje. Zavira delovanje 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfatne sintaze oziroma EPSPS, ključnega encima v piruvilšikimatni poti (Slika 3). To prepreči sintezo aromatskih aminokislin fenilalanin, tirozin in triptofan, ki omogočajo nastanek celičnih sten, spojin za regulacijo rasti ter beljakovin, vključno s tistimi, ki so vključene v rastlinsko samoobrambo (Schneider idr., 2009; Helander idr., 2012; Piola idr., 2013; Mesnage idr., 2015; Yang idr., 2015b; Ghisi idr., 2016; Nguyen idr., 2016). Zaviranje delovanja EPSPS torej povzroči primanjkljaj beljakovin in posledično smrt rastlin (Mesnage idr., 2015). Nekateri avtorji navajajo, da naj bi bil glifosat relativno varen za sesalce, saj ta biokemijska pot v vretenčarjih ne obstaja (Busse idr., 2001; Helander idr., 2012; Mesnage idr., 2015), vseeno pa se v zadnjem času porajajo dvomi glede varnosti uporabe glifosata in njegovih pripravkov (Helander idr., 2012). Gensko spremenjene poljščine za razliko od ciljnih rastlin ne presnavljajo ali izločajo glifosata, ampak ga v času rasti kopičijo v svojih tkivih (Mesnage idr., 2015).

Slika 3: Delovanje glifosata na rastline po šikimatni poti (Helander idr., 2012)

2.1.5 Pripravki V kmetijstvu se uporablja komercialne pripravke z glifosatom in ne le aktivne sestavine (Newman idr., 2016). Pripravki herbicidov na osnovi glifosata so kompleksne in spremenljive mešanice – aktivni sestavini so z namenom povečanja njene absorpcije in učinkovitosti dodane razne pomožne in površinsko aktivne snovi (Ghisi idr., 2016). Površinsko aktivne snovi v pripravkih olajšajo prenos polarnega glifosata in drugih sestavin skozi voskasto povrhnjico listov (Piola idr., 2013). Pripravki običajno vsebujejo približno 36 – 48 % glifosata, vodo, soli ter pomožne snovi, kot so etoksilirani alkilamini (Mesnage idr., 2015). Izvirni pripravek Roundup je vseboval 41 % izopropilamin glifosatne soli ter površinsko aktivno sredstvo - 15,4 % POEA (ang. polyethoxylated tallow amine). Danes večinoma ni več v prodaji, pač pa se pod blagovno znamko

7

Roundup prodajajo pripravki glifosata z različnimi sestavami, z različnimi oblikami glifosata, koncentracijami in površinsko aktivnimi snovmi (Ghisi idr., 2016). Glifosat se nikoli ne uporablja brez pomožnih sredstev, saj ta s spodbujanjem njegove strupenosti omogočajo in povečujejo herbicidno delovanje (Mesnage idr., 2015). Površinsko aktivne snovi so lahko nekajkrat bolj strupene kot sam glifosat, zaradi česar so pripravki lahko bolj strupeni od aktivne sestavine (Ghisi idr., 2016). Glede na to, da se strupenost komercialnih pripravkov razlikuje od čistega glifosata, je pomembno, da se v raziskavah, ki preiskujejo učinke na glifosatu osnovanih pesticidov, uporabljajo pripravki (Newman idr., 2016). Ti se med različnimi blagovnimi znamkami ter v različnih državah razlikujejo. Kot posledica raznolikosti v vsebnosti pomožnih snovi, in ker večina od njih ni obvezno navedenih, so učinki na glifosatu osnovanih herbicidov kompleksni in rezultat učinkov mešanic. Posledično se opisani učinki v literaturi zelo razlikujejo (Mesnage idr., 2015). Glifosat in njegov razpadni produkt aminometil fosfonska kislina (AMPA) sta bila zaznana tako v pridelkih kot tudi v vodi (Pandey idr., 2015). Naraščajoče število dokazov o kopičenju, prenosu ter interakcijah s ciljnimi rastlinami (pleveli), neciljnimi rastlinami (poljščine) in drugimi organizmi (ljudje, živali in mikroorganizmi) je sprožilo resne pomisleke glede nadaljevanja in vse pogostejše uporabe glifosata kot poglavitne strategije obvladovanja plevela. Poleg glifosata so tveganja pri uporabi na glifosatu osnovanih herbicidov lahko povezana z AMPA ter površinsko aktivnimi snovmi, ki so potencialno bolj strupene kot sam glifosat. Strupeni učinki glifosata, njegovega glavnega metabolita AMPA in površinsko aktivnih snovi, ki se uporabljajo v pripravkih, so bili dokumentirani pri mnogih vrstah bakterij in gliv, kakor tudi pri kopenskih in vodnih nevretenčarjih ter vretenčarjih (Helander idr., 2012).

2.1.6 Zakonsko določene vrednosti glifosata v hrani Medtem ko so drugi pesticidi v užitnih rastlinah dovoljeni na ravneh od približno 10-5 do 10-4 mg/kg, imata glifosat in AMPA ene izmed najvišjih dovoljenih mejnih vrednosti ostankov (MRL) v rastlinski hrani (Mesnage idr., 2015). Dovoljene mejne vrednosti so odvisne od vrste hrane, segajo pa od 0,05 mg/kg (nekatere vrste sadja (kaki, liči, pasijonka ...), nekatere vrste zelenjave (česen, čebula ...)), 0,1 mg/kg (začimbe, nekatere vrste sadja (npr. grenivke, jagode, fige, kivi...), oreščki, nekatere vrste zelenjave (paradižnik, jajčevec, kumare), riž ...), 0,5 mg/kg (pomaranče, mandarine, grozdje ...), 1 mg/kg (olive za olje, koruza), 2 mg/kg (različne vrste fižola, čaji), 3 mg/kg (mlada koruza), 10 mg/kg (leča, grah, lanena semena, gorčična semena, pšenica ...), 15 mg/kg (sladkorna pesa), 20 mg/kg (sočnična semena, soja, ječmen, oves, rž ...) pa vse do 50 mg/kg (gobe) (European Commission - MRL data, Glyphosate, 2013). Dejanske skupne izmerjene vrednosti glifosata in AMPA pa v resnici v nekaterih pridelkih dosegajo celo 500 mg/kg (Mesnage idr., 2015).

2.1.7 Koncentracije v prsti

V prsti se koncentracije glifosata nad 10 mg/kg pojavijo le v plasti zgornjih 5 milimetrov, če je seveda nanesen, kot je navedeno v navodilih na etiketi (Nguyen idr., 2016). Poleg tega so mnoge raziskave pokazale, da se glifosat ne prenaša v globlje plasti prsti, temveč se prvotno absorbira predvsem v zgornjih 2 centimetrih tal (Yang idr., 2015a).

8

2.1.8 Obstojnost v okolju Razpolovni čas razpada kemikalije je pomemben parameter za oceno okoljskih tveganj (Yang idr., 2015b). Razpolovni čas glifosata tako na terenu kot v laboratoriju niha od nekaj dni do nekaj mesecev ali celo let (Yang idr., 2015b; Cassigneul idr., 2016). Contardo-Jara, idr. (2009) navajajo, da se glifosat po nanosu pojavlja v najvišjih koncentracijah, ki zaradi mikrobne razgradnje in vezave na delce prsti hitro upadejo. Yang idr. (2015b) ugotavljajo, da je razpolovna doba glifosata odvisna predvsem od značilnosti prsti in eksperimentalnih pogojev.

2.1.9 Mikrobna razgradnja glifosata Mikrobna razgradnja je najpomembnejši proces pretvorbe herbicidov v tleh. Mineralizacija glifosata je povezana z dejavnostjo ter biomaso talnih mikroorganizmov (Araújo idr., 2003). Na mikrobne združbe in posledično na usodo, razgradnjo ter vezavo glifosata in njegovih razpadnih produktov imajo velik vpliv struktura, mineralogija, pH tal ter vsebnost organske snovi v njih (Newman idr., 2016). Mikrobna razgradnja igra pomembno vlogo pri razpadu glifosata. Biorazgradljivost glifosata v tleh gre po dveh poteh z encimskimi reakcijami (Slika 4): prva je oksidativna cepitev vezi C-N, pri čemer nastane glavni razpadni produkt mikrobne razgradnje glifosata, aminometil fosfonska kislina ((2-amino-3-(5-metil-3-okso-1,2-oksazol-4-il), propanojska kislina oziroma AMPA), druga pa je cepitev C-P vezi, kar vodi do nastanka sarkozina ter glicina (Helander idr., 2012; Yang idr., 2015a; Yang idr., 2015b). Mikrobna razgradnja glifosata proizvede glioksilat in glavni metabolit AMPA. Glioksilat se nadalje razgradi v aminokisline, ogljikove hidrate, organske kisline ter ogljikov dioksid, iz AMPA pa nastanejo voda, ogljikov dioksid, fosfat ter amonijev ion (Schuette, 1998; Araújo idr., 2003). Domneva se, da je razgradnja glifosata povezana z razgradnjo rastlinske biomase, kjer ga mikroorganizmi uporabljajo kot vir ogljika (Cassigneul idr., 2016). Prisotnost glifosata v tleh lahko zato celo poveča mikrobno dejavnost ter mikrobno biomaso (Araújo idr., 2003). Z zagotavljanjem ustreznih razmer za razmnoževanje mikroorganizmov se učinkovitost biološke razgradnje lahko še izboljša (Yang idr., 2015a). Eden izmed dejavnikov, ki lahko povečajo dejavnost talnih mikroorganizmov, odgovornih za razgradnjo glifosata, so tudi deževniki. Dejavnost deževnikov lahko stimulira mikrobno dejavnost, kar pospešuje mineralizacijo glifosata v prsti (Givaudan idr., 2014b). Številne raziskave kažejo, da iztrebki deževnikov delujejo kot "vroče točke" mikrobne dejavnosti (Sanchez-Hernandez idr., 2014a). Domneva se tudi, da deževniki povečajo stik med onesnaževalom in mikroorganizmi, kar pospešuje odstranitev onesnaževala iz tal (Rodriguez-Campos idr., 2014).

9

Slika 4: Razpadna pot glifosata

(http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/pubs/fatememo/glyphos.pdf, pridobljeno 10. 8. 2016)

2.1.10 Negativni vplivi glifosata Glifosat in njegovi pripravki se lahko zaradi vse pogostejše uporabe obravnavajo kot pomembna nevarnost za okolje. Ekološka ocena tveganja (ERA) za pesticide zahteva podatke v zvezi z njihovo strupenostjo za vodne in kopenske neciljne organizme. Raziskave se običajno osredotočajo na škodljive učinke aktivne sestavine, pri čemer se morebitna strupenost komercialnih pripravkov običajno ne upošteva. Vseeno je preizkušanje strupenosti pripravkov izredno pomembno, saj takšni testi zagotavljajo zanesljivejše in resničnejše podatke (Piola idr., 2013). Oceno tveganja za zdravje ljudi izvajajo vladne agencije, znanstveniki, najeti s strani podjetij, ki prodajajo tovrstne herbicide ali neodvisni znanstveniki. Rezultat so nasprotujoča si mnenja, zlasti glede dolgoročnih učinkov glifosata ter njegovih pripravkov. Kot že predhodno omenjeno so, poleg samega glifosata, tveganja pri uporabi tovrstnih herbicidov lahko povezana z glavnim presnovkom razgradnje, AMPA ali površinsko aktivnimi snovmi, ki so lahko bolj strupene kot sam glifosat (Helander idr., 2012). Sestava pomožnih sredstev v različnih pripravkih je precej raznolika, poleg tega pa je večina teh sredstev nepopolno testiranih. Manjkajo namreč testi kronične strupenosti kot tudi informacije o nevroloških, razmnoževalnih in dednih učinkih. Tudi strupenost dodatkov je zelo spremenljiva. Nekateri so razmeroma varni (sorbinska kislina, pelargonska kislina, glicerin), medtem ko so drugi izjemno strupeni (etoksilirana pomožna sredstva) in se obravnavajo celo kot potencialni kancerogeni (metilparaben, natrijev o-fenil fenat, 1,4-dioksan ali formaldehid) ter hormonski motilci. Kljub temu imajo v pripravkih vsi enako

10

strupenostno uvrstitev (inertne sestavine), ne pa tudi, ko so prisotni kot aktivne sestavine v drugih proizvodih (Mesnage idr., 2015). Vprašanje aktivnega strupenega praga teh snovi v živih organizmih (in-vivo) je še vedno odprto, vendar je sedaj tudi dokazano, da mešanice z glifosatom in pomožnimi sredstvi niso varne za okolje, zlasti za vodne organizme (Gasnier idr., 2009). Okrepijo lahko celo strupenost težkih kovin (Tsui idr., 2005). Pomožne snovi, kot je POEA, pa na primer povečujejo strupenost pripravkov s povečanjem privzema glifosata v celice (Mesnage idr., 2015).

2.1.10.1 Vplivi na neciljne organizme in okolje Velika uporaba in splošna razširjenost izdelkov na osnovi glifosata povečuje potrebo po toksikoloških (strupenostnih) študijah, ki določajo raven okoljskih tveganj teh proizvodov in njihovih učinkov na neciljne organizme. V zvezi s tem so bile v zadnjih letih izvedene številne raziskave z različnimi testnimi sistemi za oceno škodljivih učinkov glifosata, tako samega kot tudi v pripravkih, vendar so si rezultati teh študij izredno nasprotujoči (povzeto v Ghisi idr., 2016). Po eni strani so na glifosatu osnovani herbicidi zelo učinkoviti pri obvladovanju neželenega rastja, poleg tega njihovi proizvajalci trdijo, da imajo nizko strupenost in dobro okoljsko skladnost, velja pa tudi prepričanje, da so manj strupeni kot ostali pesticidi. Vendar pa so mnoge raziskave pokazale, da je glifosat zmerno obstojen v vodi pod slabimi svetlobnimi pogoji in visoko obstojen v temi. Zato lahko potencialno onesnaži reke, površinske vode in prsti, pri čemer so izmerjene koncentracije sorazmerne z uporabljenim odmerkom (Ghisi idr., 2016). Uporaba glifosata spreminja biotsko raznovrstnost (redna uporaba glifosata naj bi med drugim sčasoma povzročila pojav odpornih vrst plevela) in s tem ekosistemske funkcije ter storitve. Poleg ciljnih rastlin (pleveli) vpliva glifosat tudi na neciljne rastline (poljščine in rastline izven kmetijskih območij) ter druge organizme (mikrobi in živali) tako v kopenskih kot tudi vodnih okoljih (Helander idr., 2012). Domneva se torej, da je glifosat manj strupen za ekosisteme kot drugi herbicidi. Transgene rastline (tj. rastline v katere je bil prenešen določen gen neke druge vrste), odporne na to spojino, so bile razvite sledeč tej trditvi. Vendar pa so neciljni organizmi lahko kljub temu izpostavljeni ostankom herbicidov v okolju (Piola idr., 2013). Tako so se v zadnjem času začeli pojavljati dvomi o njegovem dejanskem delovanju v okolju (Helander idr., 2012). Učinki glifosata na mikroorganizme v tleh in njihove procese kot so sodelovanje pri kroženju hranil in vzdrževanje strukture tal, so zaskrbljujoči in so bili obsežno prepoznani (Ratcliff idr., 2006; Schneider idr., 2009). Glifosat namreč zavira sintezo beljakovin po poti šikimske kisline tudi v bakterijah in glivah in ena izmed površinsko aktivnih snovi, POEA, je strupena za mnoge vrste bakterij in praživali (Ratcliff idr., 2006). Če nanos glifosata negativno vpliva na mikrobne združbe v prsti, odgovorne za razkroj organskega materiala, se lahko posledično spremeni hitrost razpada biomase in kroženja hranil. Poleg tega lahko ponavljajoči se nanosi glifosata zmanjšajo število in raznolikost talnih mikroorganizmov, kar posledično upočasni razgradnjo glifosata v tleh in poveča odtok herbicida v površinske vode (Helander idr., 2012). Busse in sod. (2001) navajajo, da dodatek glifosata negativno vpliva na število bakterij in gliv. Tudi Schneider in sod. (2009) menijo, da imajo ponavljajoči se nanosi herbicida negativne dolgoročne učinke na populacije v tleh. Rezultati številnih raziskav, izvedenih v zadnjem desetletju, so pokazali, da glifosat povzroča razvojne, morfološke, fiziološke, imunološke in biokemične spremembe pri višjih rastlinah, deževnikih, polžih, hroščih, zlasti plenilskih krešičih, ribah, dvoživkah, itd. (Schneider idr., 2009; Piola idr., 2013). Zaradi visoke topnosti pripravkov v vodi in njihove razširjene uporabe v kmetijskem okolju so ti herbicidi velika skrb za vodne

11

ekosisteme. Negativni učinki herbicidov v ekosistemih celinskih voda so med drugim povečanje populacij strupenih, cvetočih cianobakterij, ki so zmožne uporabljati glifosat kot vir fosforja, zmanjšano preživetje alg ter zmanjšana stopnja razmnoževanja pri ribah in žabah (Helander idr., 2012). Poleg tega naj bi razširjena uporaba glifosata v nekaterih primerih koristila patogenim mikroorganizmom, ki so odgovorni za pojav rastlinskih bolezni. Predvideva se, da je glifosat med najpomembnejšimi kmetijskimi dejavniki, ki prispevajo k večji pojavnosti bolezni pšenice (Triticum aestivum (Linnaeus)) in ječmena (Hordeum vulgare (Linnaeus)). Subletalni odmerki glifosata lahko zmanjšajo odpornost rastlin na povzročitelje bolezni ter rastlinojede z zmanjšanjem njihove proizvodnje sekundarnih metabolitov (presnovkov) in privzema mikroelementov (na primer mangana (Mn)), kar privede do simptomov pomanjkanja teh elementov pri neciljnih rastlinah (Helander idr., 2012).

2.1.10.2 Vplivi na zdravje ljudi Tudi vplivov na ljudi ne smemo zanemariti – glifosatu bi lahko bili izpostavljeni pri ravnanju s herbicidom, pri ravnanju s pridelkom, na katerega je bil nanesen, če bi vstopil v prehranjevalno verigo skozi poljščine (predhodno izpostavljene ostankom glifosata v prsti) ali pa preko pitja onesnažene vode. Laboratorijski testi so pokazali, da človeške popkovne, zarodne in placentalne celice pod vplivom glifosata trpijo apoptozo (programirana smrt celic), nekrozo (odmiranje) in druge strupene učinke. Vendar pa natančnih študij o možnih učinkih ostankov glifosata v človeški prehrani primanjkuje, saj se predpostavlja, da se v prsti razmeroma hitro razgradi (Helander idr., 2012). Mehanizem delovanja glifosata v sesalcih še ni razjasnjen. Predlagana sta bila dva različna biokemijska mehanizma: razklop oksidativne fosforilacije in zaviranje jetrnih oksidaz (Piola idr., 2013). Glifosat in njegovi komercialni pripravki povzročijo oksidativni stres, ki vodi do poškodbe organov (Larsen idr., 2012; Larsen idr., 2014; Séralini idr., 2014; Mesnage idr., 2015). Oksidativni stres nastane zaradi neravnovesja med dejavniki, ki ustvarjajo prooksidativno okolje ter celičnim antioksidantnim obrambnim sistemom. Reaktivne kisikove spojine so visoko reaktivne molekule, ki lahko poškodujejo biološke molekule, kot so lipidi, proteini in DNK. Prekomerna količina kisikovih prostih radikalov posledično privede do poškodbe celic. Glifosat je tudi močan kelator kovinskih kationov, kot so baker, mangan, kobalt, železo in cink, kot tudi kalcija in magnezija (Mesnage idr., 2015). Nevrotoksični (strupenost za živčevje) učinki glifosata in njegovih pripravkov so še vedno negotovi, zlasti za okoljsko pomembne odmerke, vendar so številne raziskave na živalih (razen sesalcih) pokazale zaviranje holinesteraze zaradi glifosata (Mesnage idr., 2015). Glifosat je na primer zaviral delovanje acetilholinesteraze pri nekaterih vrstah rib (Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842), Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758), Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836), Leporinus obtusidens (Valenciennes, 1847)) ter pri paglavcih dvoživk (Glusczak idr., 2006; Modesto in Martinez, 2010; Salbego idr., 2010; Cattaneo idr., 2011; Lajmanovich idr., 2011; Menendez-Helman idr., 2012). Glifosat je derivat glicina (pridobljen iz glicina). Posledično bi lahko zaviral dejavnosti encima serin hidroksimetil transferaze, glavnega vira znotrajceličnega glicina. Poraba glicina je znak hitro razraščajočih se celic. Nasprotujoč privzem in biosinteza glicina pa prednostno oslabita hitro razraščajoče se celice. Iz teh razlogov je bilo tudi predlagano,

12

da glifosat zavira rast celic preko osiromašenja glicina. Dejstvo, da glicin in druge aminokisline (na primer glutamat) delujejo kot nevrotransmitorji in imajo pomembno vlogo pri delovanju možganov, sproža vprašanje o možnih nevroloških učinkih glifosata. Potencial glifosata, da deluje kot nevrotransmitor, podpirajo strukturne podobnosti z agonisti (spojine, ki se selektivno vežejo na posebne receptorje in v celici sprožijo biološki odziv) glutamatnega receptorja 2-amino-3-fosfono propionske kisline (Mesnage idr., 2015).

2.1.10.2.1 Kancerogenost, genotoksičnost in mutagenost Sprožitev, napredek in razvoj raka je dolgoročen proces, ki vključuje številne presnovne poti in lahko traja več let in v tem času lahko nekateri tumorji postanejo rakasti. Raziskave zato zahtevajo veliko sredstev za financiranje, ki jih samostojni javni laboratoriji običajno nimajo. Zato so večino tovrstnih raziskav financirala razna podjetja, le nekaj izmed njih so izvedle neodvisne raziskovalne ustanove. Da bi dosegli ponovno odobritev herbicida, so plačani svetovalci podjetja Monsanto objavili ocene štirinajstih raziskav na temo rakotvornosti. Devet izmed njih je bilo izvedenih na podganah, pet pa na miših, in sicer so z eksperimenti začeli na mladih testnih živalih, zaključili pa po dveh letih. Na splošno so ocenili, da ni dokazov o rakotvornem učinku glifosata. V nasprotju s tem pa je Mednarodna agencija za raziskave raka (IARC) na podlagi delno enakih podatkov glifosat opredelila kot verjetno rakotvorno snov za ljudi (2A). Zaradi učinkov motenja presnove in endokrinega sistema naj bi deloval celo kot promotor (tj. pospešuje nastanek) tumorjev (Mesnage idr., 2015). Nedavna raziskava je pokazala, da naj bi glifosat preko estrogenskih receptorjev sprožil nastanek rakastih celic v dojkah ljudi, spodbudil pa naj bi tudi nastanek tumorjev pri miših (Ghisi idr., 2016). Mink idr. (2012) pa po drugi strani navajajo, da je ameriška Agencija za zaščito okolja glifosat razvrstila kot kancerogen E skupine, oziroma ga je opredelila kot snov brez kancerogenega potenciala in sicer zato, ker naj bi primanjkovalo zadostnih dokazov o njegovi rakotvornosti. Sklenili so, da je v odsotnosti rakotvornih učinkov pri živalih in glede na pomanjkanje genotoksičnosti (tj. sposobnosti poškodovanja DNK) v standardnih testih malo verjetno, da glifosat in njegovi pripravki predstavljajo nevarnost za razvoj raka pri ljudeh. Rak lahko nastane tudi zaradi prisotnosti negenotoksičnih spojin, tumorji pa pogosto nastanejo zaradi izpostavitve negenotoksičnim hormonskim motilcem (Mesnage idr., 2015). Dokazi analiz glifosata in pripravka Roundup kažejo, da nista niti genotoksična niti mutagena (Mink idr., 2011; Ghisi idr., 2016). Poleg tega so raziskave pokazale, da glifosat nima škodljivih učinkov na sposobnost parjenja, zanositve, nošenja in rojstva mladičev podgan. Ameriška Agencija za zaščito okolja je zato zaključila, da izpostavljenost ostankom glifosata ne bo povzročila škode pri splošni populaciji in otrocih (Mink idr., 2011). Raziskave o rakotvornosti glifosata sicer še vedno potekajo, rezultati pa trenutno še niso znani.

13

2.1.10.2.2 Drugi vplivi na zdravje ljudi

Najpogostejši simptom, zabeležen po 4000 nezgodnih akutnih izpostavljenostih pripravkom glifosata, je blaga prehodna oslabitev prebavil. Na glifosatu osnovani herbicidi pri akutnih odmerkih vplivajo tudi na srčno-žilni sistem. Smrt je močno povezana z višjo starostjo, večjim zaužitjem in visokimi koncentracijami glifosata v plazmi (> 734 mg/ml). Posledica ekstremne izpostavljenosti (okoli 100 – 200 ml čiste zaužite spojine) so bolezni dihal, srca in hepatorenalne (jetrne in ledvične) poškodbe. V sklopu nekaterih epidemioloških raziskav so preučili tudi možne učinke pripravkov glifosata na razmnoževanje. Čeprav so raziskave na podganah pokazale neškodljivost glifosata na sposobnost parjenja, zanositve, nošenja in rojstva mladičev (Mink idr., 2011), pa so na kmetijah v Kanadi ugotovili, da je bilo vsaj 20 % zmanjšane plodnosti žensk povezane z njihovo izpostavljenostjo pripravkom glifosata (Mesnage idr., 2015).

2.1.11 Kdaj je tveganje največje Če glifosat ni pravilno uporabljen, se poveča tveganje za ljudi in okolje zaradi onesnaženja živil, vode in zraka (Ghisi idr., 2016). Prav tako je tveganje za prenos glifosata po prsti večje po obilnejših padavinah. Intenziven dež namreč povzroči erozijo tal, ta pa vodi k izgubam vode in prsti. Površinski odtok zaradi padavin torej med drugim povzroči prenos glifosata od vplivnih območij v površinske vode, zaradi česar so ogroženi vodni ekosistemi (Helander idr., 2012; Ghisi idr., 2016). Tveganje je večje tudi v primerih, ko se glifosat nanaša na golo prst pred ali tik po setvi, saj herbicid takrat neposredno doseže tla, to pa predstavlja povečano tveganje za prenos s površinskim odtokom ali erozijo (Yang idr., 2016b). Če primerjamo različne ekosisteme, je glifosat nevarnejši, ko se ga nanaša na prsti v hladnejših območjih. Tam je namreč manjša biodiverziteta in počasnejša rast talnih mikrobov, ki razgrajujejo glifosat, zaradi česar je v prsti obstojen dalj časa (Helander idr., 2012).

14

2.2 Deževniki Deblo: Annelida (kolobarniki) Razred: Clitellata (sedlaši) Podrazred: Oligochaeta (maloščetinci) Red: Haplotaxida Družina: Lumbricidae (deževniki) Telo deževnikov je cevaste oblike in razdeljeno na več segmentov (kolobarjev). Dihajo preko kože, hrano pa uživajo skozi ustni aparat. Njihov prebavni sistem poteka vzdolž celotne dolžine telesa. Imajo preprosto lestvičasto živčevje, kjer sta po dva in dva ganglija povezana vzdolžno in prečno (tako, da se oblikuje letev) ter obgolti žolč. Za deževnike je značilen tudi preprost, zaprt krvni obtok. So obojespolniki, kar pomeni, da ima vsak osebek v telesu tako spermije kot tudi jajčeca, vendar se parijo izključno navzkrižno. Deževniki pogosto predstavljajo največjo biomaso med talnimi organizmi. Ker aktivno spreminjajo fizikalne, kemijske in biološke lastnosti tal, jih imenujemo tudi ekosistemski inženirji (Givaudan idr., 2014a, b). Deževniki so pomembni razkrojevalci, saj bistveno prispevajo k razgradnji organskih snovi, kroženju hranil in nastanku prsti (Wang idr., 2012). Poleg tega, da delujejo kot razkrojevalci, deževniki z oblikovanjem biopor ter biogenih agregatov spreminjajo razpoložljivost virov za druge živalske vrste (Jouquet idr., 2014). Med drugim vplivajo tudi na ključne parametre prsti, kot so dostopnost hranil, poroznost in struktura tal ter mikrobna dejavnost. Biotska raznovrstnost deževnikov je na intenzivno obdelanih kmetijskih površinah manjša, kar lahko pripišemo predvsem veliki porabi pesticidov (Givaudan idr., 2014b). Zaradi njihovega ekološkega pomena, velike biomase v tleh in pogoste občutljivosti na razmeroma nizke koncentracije okoljskih onesnaževal so deževniki eni izmed najprimernejših bioindikatorskih organizmov za oceno tveganja v tleh (Løkke idr., 1998; Wang idr., 2012). Številčnost deževnikov v tleh nakazuje na zdravje talnih ekosistemov in stopnjo okoljske varnosti (Wang idr., 2012; Sanchez-Hernandez idr., 2014b).

2.2.1 Proces razmnoževanja pri deževnikih Pri deževnikih sta proces parjenja in proces oploditve časovno ločena. Deževnika se parita tako, da v nasprotni smeri prekrijeta spodnja sprednja dela telesa, oziroma se združita pri sedlih (v predelu kliteluma). Nato vsak izmed njiju izloči sluz, ki okoli njunih teles tvori tako imenovano sluznato cev. Vanjo oba deževnika iz svojih spolnih organov izločita spermije. Sperma enega deževnika je odložena v sluznem ovoju drugega deževnika.

Slika 5: Deževnik in kokon

(https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b5/Eisenia_fetida_%2B_cocon.JPG/1280px-Eisenia_fetida_%2B_cocon.JPG, pridobljeno 27. 7. 2016)

15

Parjenje traja od 1 do približno 3 ur. Ko se deževnika ločita, se pri vsakem od njiju iz kliteluma (sedla) izloči albumin, ki sluz utrdi v kokon. Deževnik se potem počasi umakne iz kokona (ga "sleče"). Med tem postopkom se v kokon izločijo jajčeca in spermiji, ki so bili prej shranjeni v majhnih porah na površini deževnika. Kokon se nato odlepi od deževnika. Do oploditve pride v kokonu. Običajno se v posameznem kokonu razvije dva do pet mladičev, ki se v ustreznih razmerah izvalijo v približno mesecu dni.

2.2.2 Eisenia andrei, Bouché, 1972 in Eisenia fetida (Savigny, 1826) Ker imata podoben videz in ekološke zahteve, sta bili vrsti Eisenia fetida (Savigny, 1826) in Eisenia andrei, Bouché, 1972, dolgo opredeljeni kot ena vrsta. Bouché (1972), ki ju je opredelil kot podvrsti, ju je ločil na rahlo progasto (E. fetida) in enakomerno obarvano različico (E. andrei). V zadnjem času pa so z biokemijskimi metodami potrdili, da gre za dve različni vrsti. To razlikovanje je pomembno predvsem zaradi uporabe v ekotoksikoloških testih, saj se vplivi kemikalij na posamezno vrsto lahko razlikujejo (Alves idr., 2016).

Slika 6: E. fetida

(https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b5/Eisenia_foetida_R.H._(7).JPG/640px-Eisenia_foetida_R.H._(7).JPG, pridobljeno 14. 6. 2016)

16

Slika 7: E. andrei (Foto: Dukić S., 2016)

Vrsti nista značilni za kmetijske površine, saj se običajno pojavljata v tleh, bogatih z organsko snovjo. V idealnih pogojih je, v primerjavi z drugimi vrstami, njun življenjski cikel od nedavno odloženega kokona do odrasle faze razmeroma kratek (med 45 in 51 dni). Po parjenju živali odlagajo kokone in iz vsakega uspešnega kokona se izleže od dva do pet mladičev. Odvisno od temperature gojenja in substrata (podlage) se njihova življenjska doba giblje od štiri in pol do pet let (Alves idr., 2016).

2.2.3 Ekosistemske storitve in pomen deževnikov Človeške družbe od ekosistemov pridobivajo številne bistvene okoljske dobrine in storitve, tako imenovane ekosistemske storitve. Te vključujejo naravne procese, ki podpirajo proizvodnjo hrane, urejanje količine in kakovosti vode, emisije toplogrednih plinov itd. Ekosistemske storitve so odvisne od štirih ključnih ekosistemskih funkcij, tj. pretvorb ogljika, kroženja hranil, strukture in vzdrževanja tal ter biološkega uravnavanja populacij. Na te štiri funkcije v kopenskih ekosistemih v glavnem vpliva biološka raznovrstnost tal. Med nevretenčarji imajo v tleh najpomembnejšo vlogo talni inženirji 2. Deževniki so zaradi svoje prevladujoče številčnosti in biomase v zmernih in tropskih tleh glavni in eni izmed najbolj preučevanih talnih inženirjev (Jouquet idr., 2014). Z izboljševanjem strukture tal in sodelovanjem pri kroženju hranil vzdržujejo več ključnih ekosistemskih storitev, poleg tega pa sodelujejo tudi pri ekosistemskih storitvah, kot so uravnavanje voda, sanacija onesnaževanja in primarna produkcija (Givaudan idr., 2014a).

2 Ekosistemski inženirji so vrste, ki soustvarjajo, preoblikujejo ali vzdržujejo določen habitat. S svojim delovanjem

posredno vplivajo na biodiverziteto ter geografsko raznolikost nekega območja. Kot takšni so ključnega pomena pri vzdrževanju zdravja in stabilnosti okolja v katerem živijo. Med ekosistemske inženirje spadajo tudi deževnki, ki jim pravimo tudi talni inženirji, saj aktivno spreminjajo strukturo tal in sodelujejo pri kroženju hranil v ekosistemih.

17

Deževniki delujejo kot primarni razkrojevalci. V svoje rove povlečejo rastlinsko steljo in pomembno vplivajo na razdrobljenost tega organskega materiala. S svojo dejavnostjo mešajo organske in anorganske frakcije tal. Deževniki v svojem prebavnem traktu z intenzivnim mešanjem različnih frakcij tal, rastlinske stelje in mikroorganizmov izločajo iztrebke (ang. casts), ki so izjemno bogati s hranili in encimsko dejavnostjo. To je zelo pomembno pri vzdrževanju rodovitnosti in stabilnosti tal. Rove deževnikov običajno obdaja plast sluzi, kjer je največja mikrobna dejavnost v tleh, pa tudi dejavnost drugih talnih organizmov. Deževniki so izjemno pomembni tudi pri zračenju in odvodnjavanju tal ter omejevanju več rastlinskih bolezni, zlasti glivičnih. Deževniki so običajno prevladujoča sestavina talne favne z 10 do 200 grami sveže mase na kvadratni meter. Njihova ogromna biomasa je pomemben vir hrane za mnoge plenilske talne organizme, kot so krešiči, kratkokrilci in nekatere stonoge. Drugi pomembni plenilci deževnikov so ptice in sesalci (Løkke idr., 1998). Deževniki za preživetje v tleh potrebujejo specifične razmere. Za svojo dejavnost potrebujejo dovolj hrane. Poleg tega se izogibajo ekstremnim razmeram v tleh. Izjemno nizek oziroma visok pH, visoka vsebnost soli, težkih kovin in visoke koncentracije organskih onesnaževal zato lahko zavirajo njihovo dejavnost, kar posledično vpliva na strukturo celotne talne združbe. Za njihovo nemoteno delovanje je potrebna tudi zmerna temperatura in zadostna vsebnost vode, tj. 8 – 57 % poljske kapacitete tal (Rodriguez-Campos idr., 2014). Pri deževnikih ločimo tri različne ekološke strategije, in sicer jih delimo na kompostne vrste (nadzemne vrste, kot na primer Eisenia fetida ali Eisenia andrei), navpično rijoče vrste, ki se prehranjujejo predvsem pri površju (na primer Lumbricus terrestris (Linnaeus, 1758)) in vodoravno rijoče vrste v mineralnih prsteh (podzemne vrste, na primer Aporrectodea caliginosa (Orley, 1855)). Različne ekološke strategije med drugim vplivajo na izpostavljenost deževnikov kemikalijam v tleh (Løkke idr., 1998). Rodriguez-Campos idr. (2014) menijo, da bi deževnike lahko uporabljali v namene bioremediacije onesnaženih prsti. Dodatek deževnikov v prst naj bi namreč na različne načine spodbudil razgradnjo organskih onesnaževal. Posredno bi izločanje sluzi lahko spodbudilo rast mikroorganizmov, odgovornih za razgradnjo ogljikovodikov. Koristni mikrobi, kot so na primer dušik fiksirajoče bakterije, bi se lahko kopičili v iztrebkih deževnikov, kar bi pomenilo dodatna hranila za razkrojevalce in nato hitrejšo razgradnjo organskih onesnaževal. Poleg tega pa njihovo ritje po prsti prispeva k zračenju ter mešanju prsti in povečuje površino za mikrobne interakcije (Rodriguez-Campos idr., 2014). Deževniki kot talni inženirji na določene funkcije vplivajo ugodno, vendar imajo na nekatere tudi negativen vpliv. Primer je začasno skladiščenje organskih snovi v njihovih iztrebkih in rovih (shranjevanje ogljika, uravnavanje podnebja), s čimer se posledično zniža stopnja sproščanja mineralnih hranil, ki so sicer na voljo rastlinam (funkcija kroženja hranil, storitev oskrbe s hrano) (Jouquet idr., 2014). Deževniki lahko z bioturbacijo (tj. mešanjem sedimentov ali prsti, predvsem z vrtanjem in ritjem) na različne načine vplivajo na usodo pesticidov v tleh. S svojim delovanjem med drugim povečujejo njihovo vezavo na talne delce, zaradi česar so ti obstojnejši v tleh (Givaudan idr., 2014a).

18

2.2.4 Testni organizmi Deževniki so iz več razlogov standardni organizmi za teste strupenosti prsti ter eni izmed najboljših kazalcev kakovosti tal (Lanno idr., 2004; Cardoso idr., 2012). Prvič, deževniki prebivajo v prsti in so bolj ali manj v nenehnem stiku s talnimi delci. Poleg tega pogosto živijo v onesnaženih območjih, kar omogoča terensko vrednotenje biodostopnosti in strupenosti kemikalij (Lanno idr., 2004). Nahajajo se v različnih tipih tal in talnih profilov, v raznolikih ekosistemih ter podnebjih in imajo izreden pomen v prehranjevalnih verigah (Lanno idr., 2004; Cardoso idr., 2012). Njihova zunanja površina je dobro prekrvavljena in brez povrhnjice, kar omogoča vnos onesnaževal v organizem neposredno iz tal. Deževniki med ritjem uživajo talne delce, kar predstavlja drugo pot vnosa onesnaževal v njihov organizem. Poleg tega imajo veliko maso, kar omogoča določanje koncentracij onesnaževal pri posameznih organizmih. Eden izmed razlogov je tudi dobro poznavanje njihove fiziologije in presnove kovin. Na voljo so standardizirani protokoli testiranja strupenosti ter številni postopki za oceno učinkov na nivoju populacij, organizmov, organov, tkiv in celic. Nekatere vrste (na primer Eisenia fetida in Eisenia andrei) lahko pri kontroliranih pogojih gojimo v laboratoriju, poleg tega pa so zmožne preživeti v različnih prsteh, kar omogoča testiranje več tipov prsti (Lanno idr., 2004; Pelosi idr., 2013a). Deževniki so tudi sorazmerno enostavni za vzorčenje in prepoznavanje na terenu (Cardoso idr., 2012; Pelosi idr., 2013b). Poleg vsega naštetega pa obstaja še obsežna literatura o ekologiji, fiziologiji in ekotoksikologiji deževnikov, zaradi česar so odličen modelni organizem za oceno strupenosti in biološke razpoložljivosti kemikalij v talnih sistemih (Lanno idr., 2004). Deževniki so pomembni kazalci tako kakovosti tal kot njihove vitalnosti, saj na njihovo vedenje in preživetje močno vplivajo različne kmetijske prakse (Cardoso idr., 2012). Stopnji umrljivosti in razmnoževanja vrste E. fetida/E. andrei se trenutno uporabljata pri ocenah učinkov pesticidov v laboratorijskih razmerah pred izdajo dovoljenja za prodajo (Pelosi idr., 2013a).

2.2.5 Možni neželeni učinki na deževnike

Eden od fizioloških indikatorjev, ki najbolje odražajo blagostanje organizma v svojem mediju, je rast. Rast je v bistvu neto rezultat številnih osnovnih življenjskih procesov, kot so prehranjevanje, izločanje in poraba energije. Onesnaževala lahko posredno zmanjšajo razpoložljive vire energije za rast, saj so procesi razstrupljanja energetsko zelo zahtevni (Piola idr., 2013). Poleg tega lahko pride tudi do sprememb v vedenju in morfologiji (zgradbi in obliki). Pri izpostavljenosti strupenim snovem se lahko deževniki pričnejo zvijati v kroglice, možna pa je tudi samoamputacija, napihnjenost posameznih segmentov, izločanje celomske tekočine, pretrganje črevesja ali celo razkroj telesa. Vse te spremembe so rezultat odziva na kemične, okoljske in biološke stresorje. Deževniki se na primer pogosto pod vplivom ekstremnih razmer, kot so ekstremne temperature, vsebnost vlage, pH in onesnaženost prsti, zvijajo v kroglice (Buch idr., 2013). Chakra idr. (2008) navajajo, da lahko zaradi izpostavljenosti glifosatu pri deževnikih vrste Pheretima elongata (Perrier, 1872) pride do hudih poškodb črevesja (razkroj celičnih membran, spoj celic, nabrekanje celičnih jeder epitelijskih celic ipd.). Schneider idr. (2009) pa pravijo, da pri deževnikih vrste E. fetida izpostavljenost glifosatu privede do zmanjšane plodnosti. Večina herbicidov je za deževnike manj strupenih, kot so na primer insekticidi ali fungicidi, vseeno pa se tudi med herbicidi najdejo takšni, ki so za deževnike smrtno nevarni (Edwards in Bohlen, 1992). Poleg tega lahko dolgoročna izpostavljenost

19

herbicidom (na primer iz ponavljajočih se nanosov ter dolgotrajne onesnaženosti tal) kot je glifosat privede do bioakumulacije (kopičenja) v tkivih, pa tudi do subletalnih učinkov, ki lahko vplivajo na razmnoževanje deževnikov in posledično negativno vplivajo na njihove populacije (Buch idr., 2013).

20

2.3 Ekotoksikološki testi z deževniki V Evropi je uporaba pesticidov regulirana s posebnimi zakoni, ti pa predpisujejo tudi ekotoksikološke in druge teste za oceno učinkov pesticidov na talne nevretenčarje (Alves idr., 2013). Za oceno okoljskega tveganja onesnaženih tal so bili razviti posebni standardizirani testi. Za opravljanje testov strupenosti tal sta smernice priporočili Organizacija za ekonomsko sodelovanje in razvoj (OECD) ter Mednarodna organizacija za standardizacijo (ISO). Tovrstni testi strupenosti se uporabljajo za napoved akutnih in/ali kroničnih učinkov kemikalij v okolju. Običajno se spremljajo preživetje, rast in razmnoževanje testnih organizmov. Poleg teh parametrov je pri deževnikih možna tudi ocena učinkovitosti njihovega delovanja v prsti, in sicer preko pristopa z biomarkerji na ravni tkiv in celic (Belmeskine idr., 2012). Teste strupenosti ločimo glede na čas izpostavljenosti organizmov na akutne in kronične. Učinki, ki jih lahko opazujemo, so umrljivost, količina zaužite hrane, zmanjšana rast ali razmnoževanje, bioakumulacija, vedenjske spremembe itd. Pri teh testih so organizmi izpostavljeni naraščajočim koncentracijam onesnaževala, njegovi učinki pa se lahko merijo pri eni vrsti ali pri več vrstah hkrati. Tako dobimo oceno razmerja med odmerkom in odzivom (Alves idr., 2016).

2.3.1 Vrste ekotoksikoloških testov Testi akutne strupenosti se uporabljajo za preverjanje učinka kratkotrajne izpostavljenosti visokim koncentracijam onesnaževal (Wang idr., 2012; Alves idr., 2013). Z njimi izmerimo koncentracije, ki so organizmom smrtne (LCx). Akutni testi ne upoštevajo posameznih faz življenjskega cikla testnih organizmov (rast, razmnoževanje, izleganje mladičev). Možno je namreč, da so organizmi v posamezni razvojni fazi bolj ali manj občutljivi na strupene snovi v okolju. S testi kronične strupenosti pa lahko zaznavamo bolj prikrite učinke, kot je na primer upočasnjen razvoj, zmanjšana plodnost in teratogeni učinki (tj. pojav nepravilnosti ali razvojnih napak zaradi izpostavljenosti ploda teratogenim dejavnikom), razkrivajo pa lahko tudi kvalitativne (kakovostne) in kvantitativne (številčne) spremembe v populacijah deževnikov, tudi če ne pride do umrljivosti (Alves idr., 2013). Testi kronične strupenosti so primernejši za ocenjevanje učinkov na ravni populacij (Alves idr., 2016), njihov rezultat pa so učinkovite koncentracije (ECx), pri katerih pride do učinka na določen delež izpostavljenih organizmov. Za testiranje strupenosti kemikalij in onesnaženih tal je bilo za deževnike razvitih več različnih protokolov, na primer imerzijski test, injicirni test, test nanosa na telesno površino, test s prisilnim hranjenjem, test hranjenja z obdelano hrano, kontaktni test na filter papirju, test izpostavljenosti v standardizirani naravni prsti in test izpostavljenosti v umetno pripravljeni prsti. Med naštetimi sta največ pozornosti prejela kontaktni test na filter papirju ter test izpostavljenosti v standardizirani prsti. Pri obeh se spremlja umrljivost organizmov, kot testno vrsto pa se najpogosteje uporabi E. fetida. Oba testa so sprejele Organizacija za ekonomsko sodelovanje in razvoj (OECD), Evropska ekonomska skupnost (EEC) ter ameriška Agencija za zaščito okolja (EPA). Kontaktni test na filter papirju je preprostejši, cenejši in hitrejši, zasnovan pa je tako, da so deževniki kemikaliji izpostavljeni preko neposrednega stika. Kontaktni test na filter papirju je izvrstna tehnika za oceno strupenosti. V nasprotju s tem je test izpostavljenosti v prsti bolj reprezentativen naravnemu okolju deževnikov, kemikalije pa se pri tej metodi v večjem delu absorbirajo v črevesju. Posledično je test v prsti bolj

21

praktičen pri oceni strupenosti pesticidov za deževnike (Wang idr., 2012). Kontaktni testi so agresivnejši do deževnikov, saj je njihova zunanja površina ves čas v neposrednem stiku z onesnaževalom. Zaradi tega testi na filter papirju niso dober kazatelj učinkov kemikalij v tleh (Rodriguez-Campos idr., 2014). Pri tovrstnih testih se odrasle posameznike na filter papirju ali v standardizirani prsti (OECD) izpostavi proučevani snovi v različnih koncentracijah (Alves idr., 2016). Vse pogostejši so tudi vedenjski testi s talnimi nevretenčarji, saj nudijo predhodno oceno odzivov na onesnaženost prsti in to v krajšem obdobju kot običajni testi strupenosti (Alves idr., 2016). Njihova prednost pred nekaterimi drugimi testi strupenosti je nizka cena, hitrost (48 ur) ter včasih celo večja občutljivost (Alves idr., 2013; Žižek idr., 2013). Testi izogibanja se na primer lahko uporabljajo pri oceni primernosti talnih habitatov, saj temeljijo na sposobnosti živali, da se ob izpostavitvi izognejo morebitno strupenim snovem (Alves idr., 2016).

2.3.2 Izbira vrste deževnikov Čeprav je bilo v kopenskih ekotoksikoloških testih uporabljenih več vrst deževnikov, sta bili v smernice ISO in OECD vključeni le E. fetida in E. andrei. Ti vrsti sta prednostni, ker sta prisotni po vsem svetu, uspevata v raznolikih organskih substratih, imata kratek generacijski čas, sta preprosti za gojenje in ravnanje v laboratoriju, preprosto ju je pridobiti na trgu oziroma iz drugih ekotoksikoloških laboratorijev (Belmeskine idr., 2012; Buch idr., 2013; Alves idr., 2016). Izbira vrste deževnikov lahko pomembno vpliva na izid ekotoksikoloških testov. Vrsti E. fetida in E. andrei sta bili predvsem zaradi enostavnosti gojenja v laboratoriju pogosto uporabljeni v testih akutne strupenosti, pa tudi v študijah kronične strupenosti, vključno s testom izogibanja. Vendar pa postaja njun ekološki pomen, zlasti pri študijah s subletalnimi izidi, vse bolj vprašljiv (Lowe idr., 2016). Izbor E. fetida in E. andrei za teste strupenosti je vprašljiv iz dveh razlogov. Prvič, v prsti nista naravno prisotni. Njun življenjski prostor so odmrlo listje oziroma listna stelja, kompost, gnoj in organski odpadki. Drugič, nekateri avtorji ugotavljajo, da sta manj občutljivi na onesnaževala kot druge vrste in lahko prenašata visoke koncentracije nekaterih snovi, ki jih druge vrste deževnikov ne (Rodriguez-Campos idr., 2014). Zato je uporaba teh vrst primerna le za predhodno oceno strupenosti, medtem ko je v nadaljnje ekotoksikološke preiskave potrebno vključiti še druge, okoljsko ustreznejše vrste (Velki in Ečimović, 2015).

22

3 MATERIALI IN METODE Uporabila sem standardiziran test OECD št. 222 (OECD, 2015). Test traja 56 dni. Odrasle deževnike sem izpostavila glifosatu v različnih koncentracijah in opazovala njihovo preživetje ter spremembo mase po 28 dneh. Nato sem preživele odrasle živali odstranila iz prsti in pustila, da so se iz kokonov izlegli mladi organizmi 3. Po naslednjih 28 dneh sem preštela izlegle mladiče.

3.1 Uporabljeni materiali in kemikalije

3.1.1 Standardizirana prst Uporabila sem standardizirano prst Lufa 2.2 s pH 5.5 ± 0.1, kationsko izmenjevalno kapaciteto 10.0 ± 0.7, 1.61 ± 0,15 % organskega ogljika, 0.17 ± 0.01 % dušika, zadrževalno kapaciteto vode 43.3 ± 2.6 g/100 g prsti in gostoto 1236 ± 32 g/l. Lufa 2.2 je ilovnati pesek (Lufa Speyer, 2014).

3.1.2 Kemikalije

Uporabila sem dvakrat deionizirano vodo, glifosat v pripravku Roundup Alphee® s 7,2 g/l glifosata ter čisto aktivno sestavino Glifosat Pestanal® (analitični standard) čistosti 98,7 %.

Slika 8: Levo na sliki je pripravek, ki smo ga uporabili pri prvem testu, desno na sliki pa

čisti glifosat (Foto: Dukić S., 2016)

3 Za namen tega dela smo uspešnost razmnoževanja definirali kot število preživelih mladičev po 56 dneh.

23

3.1.3 Poskusne živali Uporabljene živali so bili deževniki vrste Eisenia andrei, gojeni v Laboratoriju za raziskave v okolju Univerze v Novi Gorici. Med testom sem jih hranila s konjskim gnojem s kmetije z ekološko rejo konj, saj sem s tem zagotovila, da ni vseboval nobenih ostankov veterinarskih zdravil, hormonov ali podobnih snovi, ki bi lahko vplivale na deževnike in posledično na končne rezultate testa. Temperatura v laboratoriju je bila ves čas trajanja testa 22 ± 1 °C, dolžina svetlega in temnega obdobja pa je bila odvisna od naravnih zunanjih pogojev. Izbrala sem odrasle, spolno zrele živali, težke od 200 do 500 mg.

3.1.4 Materiali

Za izvedbo testov sem uporabila polietilenske posode za živila prostornine 1000 ml oz. 500 ml, po 4 za vsako koncentracijo pri posameznem testu. Za tehtanje čistega glifosata sem uporabila analitsko tehtnico. Za odmerjanje glifosata v pripravku sem uporabila mehansko ter merilno pipeto. Za tehtanje testnih živali pred začetkom testa in po 28 dneh od začetka testa sem uporabila analitsko tehtnico. Za tehtanje plastičnih posodic s prstjo in deževniki sem uporabila tehtnico z ločljivostjo 0,1 g. V zadnjem delu testa sem testne posode segrevala na 55 °C. To sem naredila v peščeni kopeli v primeru 1000 ml posod in v vodni kopeli v primeru 500 ml posod.

3.2 Izvedba testov

3.2.1 Priprava poskusnih živali

En dan pred začetkom testa sem iz laboratorijske kulture deževnikov odbrala po 120 testnih živali. Morale so imeti jasno izražen klitelum (sedlo), kar nakazuje spolno zrelost. Živali, namenjene za test, sem 24 ur hranila v prsti, v kateri je bil kasneje izvajan test, da so se prilagodile na okolje.

24

Slika 9: Zgoraj: primer spolno zrelega deževnika s sedlom, spodaj: deževnik, ki še ni

spolno dozorel, oziroma je brez sedla (Foto: Dukić S., 2016)

3.2.2 Priprava prsti Pred začetkom testa sem izračunala količino kemikalije ter količino vode, ki sem jo kasneje dodala v prst, glede na maksimalno zadrževalno kapaciteto prsti za vodo (ang. water holding capacity, WHC) ter glede na predhodno vsebnost vlage. Prst sem pripravila s 50 % WHC.

3.2.3 Test z glifosatom v pripravku Za posamezne koncentracije sem izračunala količino pripravka v ml, ki jo je bilo potrebno dodati v prst. Končne koncentracije glifosata v prsti so bile 10, 50, 100, 250 in 500 mg/kg. V kontrole nisem dala pripravka. Nato je sledil izračun količine vode, ki jo je bilo potrebno dodati v prst (50 % WHC). Pri tem sem morala upoštevati vlago, ki jo je prst že predhodno vsebovala (količina vlage v prsti je bila navedena v navodilih dobavitelja). Na 2000 g prsti sem dodala 370,65 g vode. Potrebno je bilo upoštevati tudi vodo, ki jo je vseboval pripravek. Pripravek sem nato zmešala z vodo in ga dodala v prst. Prst sem premešala, da se je mešanica vode in pripravka enakomerno porazdelila. Potem sem v vsako posodo natehtala po 500 g prsti. Preden sem živali dodala v prst, sem jih stehtala. Najprej sem jih sprala z 2 x deionizirano vodo in jih osušila na filter papirju. Sledilo je tehtanje, da sem lahko po 28 dneh od začetka testa primerjala njihove nove mase z začetnimi in tako ugotavljala vpliv kemikalije na njihovo rast. Potem sem deževnike dodala v prst. V vsako posodico sem dodala od 5 do 10 gramov konjskega gnoja za hrano. Sledilo je tehtanje posod ter zapisovanje njihovih začetnih mas. V naslednjih 28 dneh sem enkrat na teden ob istem času v vsako od posodic dodala po približno 5 gramov gnoja ter toliko vode, za kolikor

25

se je v zadnjem tednu zmanjšala njena količina v posodi (v povprečju približno 7 ml na posodo). Vsak teden sem po dodatku iztrebkov in vode posode ponovno stehtala.

Slika 10: Mladi deževniki, ki so se sprijeli med sabo – zgoraj v posodi, spodaj pa na

pladnju, pred štetjem (Foto: Dukić S., 2016) Po končanem akutnem testu oziroma po 28 dneh od začetka testa sem odrasle živali odstranila iz posod, tako da so v njih ostali le še kokoni in vlažna prst. Nato sem v vsako posodo dodala po 5 gramov gnoja in spet približno 7 ml vode. V naslednjih štirih tednih hrane nisem več dodajala. Enkrat tedensko sem dodala toliko vode, za kolikor se je zmanjšala masa posode v zadnjih 7 dneh. Po 56 dneh od začetka testa sem iz posod odstranila izlegle deževnike. Posode sem dala v peščeno kopel, katere temperaturo sem naravnala na 55 °C. To je eksperimentalno določena standardizirana temperatura, ki omogoča, da deževniki še ostanejo mobilni in da lahko pridejo na površino. Ko so prišli na površje, so se med

26

sabo sprijeli v kroglico (na tak način zadržujejo vlago). Deževnike sem nato odstranila iz posod, jih dala na pladenj in preštela.

3.2.4 Test z glifosatom v čisti obliki Za ta test sem za posamezne koncentracije izračunala količino glifosata v gramih, saj je v tem primeru šlo za prah. Tokrat sem uporabila koncentracije 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg in 250 mg/kg. V kontrole glifosata nisem dala. Nato je, kot pri prvem testu, sledil izračun količine vode, ki jo je bilo potrebno dati v prst (50 % WHC). Kot predhodno sem morala upoštevati količino vlage, ki jo je prst že vsebovala. Glifosat sem zmešala z vodo in ga dodala v prst. Nato sem prst premešala, da se je mešanica vode in glifosata enakomerno porazdelila po masi prsti. Prst sem odtehtala na 4 dele, in sicer sem uporabila 300 g na posodo. Nadaljevanje testa je potekalo po enakem postopku kot test z glifosatom v pripravku.

Slika 11: Dodajanje mešanice glifosata in 2 x deionizirane vode v prst Lufa 2.2 (Foto:

Vid Bahor, 2016)

27

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Vplivi na umrljivost deževnikov Pri obeh testih sem v prvem delu, tj. po 28 dneh spremljala učinke obeh oblik glifosata na umrljivost deževnikov. Preživeli so prav vsi deževniki v vseh koncentracijah med obema testoma, zato lahko sklepam, da glifosat v pripravku in glifosat v čisti obliki nimata učinkov na umrljivost oziroma preživetje teh živali.

4.2 Vplivi na rast deževnikov Rezultati vpliva na rast deževnikov so prikazani na slikah 12 in 13.

Slika 12: Vpliv glifosata v pripravku na rast deževnikov. Modre oznake prikazujejo spremembe mas v posameznih posodah z enako koncentracijo glifosata, rdeče oznake

pa povprečne vrednosti teh sprememb. Iz rezultatov lahko razberemo, da so deževniki v primerjavi s kontrolo manj pridobili na masi pri nižjih koncentracijah, tj. 10 mg/kg ter 50 mg/kg in več pri višji koncentraciji, tj. 250 mg/kg. Pri koncentraciji 250 mg/kg se je masa živali zmanjšala le v eni izmed posod, v eni pa se je celo izjemno povišala in sicer za kar 600 mg. Vsekakor koncentracija 250 mg/kg po vrednostih izstopa, saj se je skupna masa v povprečju povišala za 240 mg, kar je več kot pri kontrolnih živalih. Pri koncentraciji 100 mg/kg se je masa deževnikov zmanjšala v dveh posodah, v povprečju pa se je povečala za 22 mg. Pri koncentraciji 50 mg/kg se je masa deževnikom zmanjšala le v eni posodi, v povprečju pa se je povečala za 92 mg. Pri koncentraciji 10 mg/kg imamo v treh posodah povišanje mas za slabih 200 mg, razen v eni, kjer se je zmanjšala za 87 mg.

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200 250 300

Sp

rem

em

ba m

ase (

g)

Koncentracija glifosata (mg/kg)

28

Najbolj so se povečale deževnikom v kontrolah. Izjema je le ena posoda, v kateri se je njihova skupna masa zmanjšala za 146 mg. Z uporabo analize variance (ANOVA) sem izračunala, da med izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik v primerjavi s kontrolo (p > 0,05).

Slika 13: Vpliv čistega glifosata na rast deževnikov. Modre oznake prikazujejo spremembe mas v posameznih posodah z enako koncentracijo glifosata, rdeče oznake

pa povprečne vrednosti teh sprememb. Da bi potrdila začetno hipotezo, tj. da je glifosat v pripravku bolj strupen kot glifosat v obliki čiste aktivne učinkovine, bi morali deževniki v tem testu bolj pridobivati na masi kot tisti, izpostavljeni pripravku. Rezultati kažejo, da so se skupne mase deževnikov povečale v vseh posodah pri vseh koncentracijah glifosata. Najmanj so zrasli deževniki pri eni izmed nižjih koncentracij, 10 mg/kg, kjer se jim je masa povišala za povprečno 160 mg. Najbolj opazno pa so zrasli deževniki pri najvišjih koncentracijah, in sicer pri 100 mg/kg se jim je masa v povprečju povečala za 480 mg, pri 250 mg/kg pa za 400 mg. V kontrolah se je skupna masa deževnikov v povprečju povečala za 360 mg. Sklepamo lahko, da čista aktivna učinkovina glifosat pri uporabljenih koncentracijah nima opaznih vplivov na rast deževnikov, kar delno potrjuje našo hipotezo. Z analizo variance sem ugotovila, da pri najnižji koncentraciji (10 mg/kg) obstaja statistično značilna razlika. Ta verjetno ni nastala kot posledica učinka glifosata, pač pa so razlog najverjetneje določeni drugi pogoji, ki deževnikom niso ustrezali. Piola idr. (2013) so izmerili LC50 vrednosti za dva različna pripravka glifosata, in sicer so bile LC50 z ustreznim 95 % intervalom zaupanja 66 µg/cm2 za Roundup FG ter 293,9 µg/cm2 za Mon 8750. Enot zaradi neznanega podatka o gostoti uporabljene prsti ni mogoče preračunati v mg/kg.

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200 250 300

Sp

rem

em

ba m

ase (

g)

Koncentracija glifosata (mg/kg)

29

4.3 Vplivi na razmnoževanje deževnikov V drugem delu obeh testov sem ugotavljala učinke obeh oblik glifosata na razmnoževanje deževnikov. Odrasli deževniki so kokone proizvedli v prvem delu testa, vendar so se mlade živali izlegle šele med 28. in 56. dnevom obeh testov. Glede na število izleženih živali po posameznih koncentracijah lahko sklepamo o učinkih kemikalije na razmnoževanje teh živali.

Slika 14: Vpliv glifosata v pripravku na razmnoževanje deževnikov. Modre oznake prikazujejo število izleženih deževnikov po posameznih posodah, rdeče pa povprečno

število izleglih deževnikov. V kontrolah se je izleglo največ organizmov, v povprečju 63,8. Ob prisotnosti glifosata je bilo v vseh skupinah povprečno število izleženih živali manjše kot v kontrolnih izpostavitvah. Pri najvišji koncentraciji 500 mg/kg sem naštela več živali (v povprečju 42) kot pri polovici vrednosti kontrol (tj. 32). Iz tega razloga nisem mogla izračunati vrednosti EC50 – v nobeni koncentraciji namreč ni bilo manj kot 32 mladih deževnikov. EC50 je torej višji od 500 mg/kg. Mérey idr. (2016) so prav tako ugotovili, da je EC50 za glifosat višji od 500 mg/kg in sega celo nad 1000 mg/kg. Z uporabo analize variance sem tudi za ta primer izračunala, da med izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 100 200 300 400 500 600

Št.

ju

ven

iln

ih ž

ivali

Koncentracija glifosata (mg/kg)

30

Slika 15: Vpliv čistega glifosata na razmnoževanje deževnikov. Modre oznake prikazujejo število izleženih deževnikov po posameznih posodah, rdeče pa povprečno

število izleglih deževnikov. Test z glifosatom v čisti obliki po kriterijih OECD ni bil veljaven, saj bi morali v vseh kontrolah dobiti vsaj 15 mladih organizmov. Izleglo se jih je manj, razlog za to pa ni znan, saj sem s prstjo in živalmi ravnala enako kot pri prvem testu. Tudi v tem primeru EC50 ni mogoče izračunati. Število izleženih živali je bilo namreč pri najvišji koncentraciji previsoko, torej več kot 50 % glede na kontrolo (EC50 > 250 mg/kg). Kljub temu je iz rezultatov razvidno, da tudi ta oblika glifosata vpliva na razmnoževanje deževnikov E. andrei. Med izpostavitvami tudi v tem primeru ni bilo statistično značilnih razlik.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150 200 250 300

Št.

ju

ven

iln

ih ž

ivali

Koncentracija glifosata (mg/kg)

31

5 ZAKLJUČKI Izvedla sem ekotoksikološki test učinka na razmnoževanje deževnikov z glifosatom v pripravku ter s čistim glifosatom. Testa sta trajala po 56 dni, razdeljena pa sta bila na dva dela, od tega je vsak trajal po 28 dni. V prvem delu sem ugotavljala učinke glifosata na rast ter umrljivost deževnikov. Ugotovila sem, da je imel večji vpliv na rast deževnikov glifosat v pripravku, saj so se mase deževnikov zmanjšale glede na kontrolo. Pri čistem glifosatu se masa ni zmanjšala v nobeni posodi, kar je delno potrdilo delovno hipotezo. V drugem delu testov sem ugotavljala učinke na razmnoževanje deževnikov. Test s čistim glifosatom po kriterijih OECD ni bil veljaven. V vseh kontrolah bi namreč morala našteti vsaj 15 živali, vendar sem jih toliko našla le v eni izmed kontrolnih posod. Pri obeh testih je bila vrednost EC50 višja od najvišje uporabljene koncentracije. Postavljeno hipotezo lahko delno potrdimo, saj je imel glifosat v pripravku večje učinke na rast odraslih deževnikov kot glifosat v čisti obliki. V nobeni obliki pa ni imel opaznejšega učinka na razmnoževanje in umrljivost deževnikov. Poleg tega so dejanske koncentracije v okolju nižje od koncentracij, ki sem jih uporabila v okviru svojega raziskovanja, in sicer so Schribner idr. (2007) izmerili maksimalno koncentracijo v prsti 476 µg/kg, oziroma 0,476 mg/kg. Najnižja koncentracija, ki sem jo uporabila sama, pa je bila 10 mg/kg, torej višja, kot so povrečne koncentracije v okolju. Tudi zato lahko sklepam, da glifosat v naravnem okolju ne vpliva na razmnoževanje deževnikov. Posledično ne vpliva na njihove populacije in zato ekosistemske storitve, ki jih deževniki opravljajo v naravi, niso prizadete.

32

6 VIRI Allegrini, M., Zabaloy, M., C., del Gómez, E. V. 2015. Ecotoxicological assessment of soil microbial community tolerance to glyphosate. Science of the Total Environment, 533: 60–68. Alves, P. R. L., Cardoso, E. J. B. N., Martines, A. M., Sousa, J. P., Pasini, A. 2013. Earthworm ecotoxicological assessments of pesticides used to treat seeds under tropical conditions. Chemosphere, 90: 2674–2682. Alves, P. R. L., Cardoso, E. J. B. N. 2016. Overview of the Standard Methods for Soil Ecotoxicology Testing. 35–49. Araújo, A. S. F., Monteiro, R. T. R., Abarkeli, R. B. 2003. Effect of glyphosate on the microbial activity of two Brazilian soils. Chemosphere, 52: 799–804. Belmeskine, H., Haddad, S., Vandelac, L., Sauvé, S., Fournier, M. 2012. Toxic effects of PCDD/Fs mixtures on Eisenia andrei earthworms. Ecotoxicology and Environmental Safety, 80: 54–59. Buch, A. C., Brown, G. G., Niva, C. C., Sautter, D. K., Sousa, J. P. 2013. Toxicity of three pesticides commonly used in Brazil to Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857) and Eisenia andrei (Bouché, 1972). Applied Soil Ecology: 69: 32–38. Busse, M. D., Ratcliff, A. W., Shestak, C. J., Powers, R. F. 2001. Glyphosate toxicity and the effects of long-term vegetation control on soil microbial communities. Soil Biology & Biochemistry, 33: 1777–1789. Cardoso, E. J. B. N., Alves, P. R. L. 2016. Soil Ecotoxicology, 2nd chapter. 27–41. Cassigneul, A., Benoit, P., Bergheaud, V., Dumeny, V., Etiévant, V., Goubard, Y., Maylin, A., Justes, E., Alletto, L. 2016. Fate of glyphosate and degradates in cover crop residues and underlying soil: A laboratory study. Science of the Total Environment, 545–546: 582–590. Cattaneo, R., Clasen, B., Loro, V. L., de Menezes, C. C., Pretto, A., Baldisserotto, B., Santi, A., de Avila, L. A. 2011. Toxicological responses of Cyprinus carpio exposed to a commercial formulation containing glyphosate. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 87: 597–602. Chakra, N. R., Venkateswara, J. R. 2008. Biological response of earthworm, Eisenia foetida (Savigny) to an organophosphorous pesticide, profenofos. Ecotoxicology and Environmental Safety, 71: 574–582. Contardo-Jara, V., Klingelmann, E., Wiegand, C. 2009. Bioaccumulation of glyphosate and its formulation Roundup Ultra in Lumbriculus variegatus and its effects on biotransformation and antioxidant enzymes. Environmental Pollution, 157: 57–63. Edwards, C. A., Bohlen, P. J. 1992. The effects of toxic chemicals on earthworms. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 125: 23–99.

33

EU Pesticides database: MRLs data, G to L, Glyphosate, 6.4.2013. European Commission (nazadnje posodobljeno 17. feb. 2016). http://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database-redirect/index_en.htm (pridobljeno 8. avg. 2016) Gasnier, C., Dumont, C., Benachour, N., Clair, E., Chagnon, M. C., Séralini, G. E. 2009. Glyphosate-based herbicides are toxic and endocrine disruptors in human cell lines. Toxicology, 262: 184–191. Ghisi, N. C., Celton, E. O., Prioli, A., J. 2016. Does exposure to glyphosate lead to an increase in the micronuclei frequency? A systematic and meta-analytic review. Chemosphere, 145: 42–54. Givaudan, N., Binet, F., Le Bot, B., Wiegand, C. 2014a. Earthworm tolerance to residual agricultural pesticide contamination: Field and experimental assessment of detoxification capabilities. Environmental Pollution, 192: 9–18. Givaudan, N., Wiegand, C., Le Bot, B., Renault, D., Pallois, F., Llopis, S., Binet, F. 2014b. Acclimation of earthworms to chemicals in anthropogenic landscapes, physiological mechanisms and soil ecological implications. Soil Biology & Biochemistry, 73: 49–58. Glusczak, L., dos Santos Miron, D., Crestani, M., Braga da Fonseca, M., de Araujo Pedron, F., Duarte, M. F., Vieira, V. L. 2006. Effect of glyphosate herbicide on acetylcholinesterase activity and metabolic and hematological parameters in piava (Leporinus obtusidens). Ecotoxicology and Environmental Safety, 65: 237–241. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. 2012. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science, 17, 10: 569–574. Jouquet, P., Blanchart, E., Capowiez, Y. 2014. Utilization of earthworms and termites for the restoration of ecosystem functioning. Applied Soil Ecology, 73: 34–40. Lajmanovich, R. C., Attademo, A. M., Peltzer, P. M., Junges, C. M., Cabagna, M. C., 2011. Toxicity of four herbicide formulations with glyphosate on Rhinella arenarum (anura: bufonidae) tadpoles: B-esterases and glutathione S-transferase inhibitors. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 60: 681–689. Lanno, R., Wells, J., Conder, J., Bradham, K., Basta, N. 2004. The bioavailability of chemicals in soil for earthworms. Ecotoxicology and Environmental Safety, 57: 39–47. Larsen, K., Najle, R., Lifschitz, A., Mate, M. L., Lanusse, C., Virkel, G. L. 2014. Effects of Sublethal exposure to a glyphosate-based herbicide formulation on metabolic activities of different xenobiotic-metabolizing enzymes in rats. International Journal of Toxicology, 33: 307–318. Larsen, K., Najle, R., Lifschitz, A., Virkel, G. 2012. Effects of sub-lethal exposure of rats to the herbicide glyphosate in drinking water: glutathione transferase enzyme activities, levels of reduced glutathione and lipid peroxidation in liver, kidneys and small intestine. Environmental Toxicology and Pharmacology, 34: 811–818.

34

Lowe, C. N., Butt, K. R., Cheynier, K. 2016. Assessment of avoidance behaviour by earthworms (Lumbricus rubellus and Octolasion cyaneum) in linear pollution gradients. Ecotoxicology and Environmental Safety, 124: 324–328. Løkke, H., van Gestel, C. A. M. 1998. Handbook of Soil Invertebrate Toxicity Tests. University of Michigan, John Wiley and Sons Ltd.: 350 str. Lufa Speyer, 2014. Analysis Data Sheet for Standard Soils according to GLP. Menendez-Helman, R. J., Ferreyroa, G. V., Dos Santos Afonso, M., Salibian, A. 2012. Glyphosate as an Acetylcholinesterase inhibitor in Cnesterodon decemmaculatus. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 88: 6–9. Mérey, G., Manson, S. P., Mehrsheikh, A., Sutton, P., Levine, L. S. 2016. Glyphosate and aminomethylphosphonic acid chronic risk assessment for soil biota. Environonmental Toxicology and Chemistry. Mesnage, R., Defarge, N., Spiroux de Vendômois, J., Seralini, G., E. 2015. Potential toxic effects of glyphosate and its commercial formulations below regulatory limits. Food and Chemical Toxicology, 84: 133–153. Mink, P. J., Mandel, J. S., Sceurman, B. K., Lundin, J. I. 2011. Epidemiologic studies of glyphosate and non-cancer health outcomes: A review. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 61: 172–184. Mink, P. J., Mandel, J. S., Sceurman, B. K., Lundin, J. I. 2012. Epidemiologic studies of glyphosate and cancer: A review. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 63: 440–452. Modesto, K. A., Martinez, C. B., 2010. Effects of Roundup Transorb on fish: hematology, antioxidant defenses and acetylcholinesterase activity. Chemosphere 81, 781–787. Newman, M. M., Hoilett, N., Lorenz, N., Dick, R. P., Liles, M. R., Ramsier, C., Kloepper, J. W. 2016. Glyphosate effects on soil rhizosphere-associated bacterial communities. Science of the Total Environment, 543: 155–160. Nguyen, D. B., Rose, M. T., Rose, T. J., Morris, S. G., van Zwieten, L. 2016. Impact of glyphosate on soil microbial biomass and respiration: A meta-analysis. Soil Biology & Biochemistry, 92: 50–57. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2; Effects on Biotic Systems. Test No. 222 (2015): Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Pandey, A., Rudraiah, M. 2015. Analysis of endocrine disruption effect of Roundup® in adrenal gland of male rats. Toxicology Reports, 2: 1075–1085. Pelosi, C., Joimel, S., Makowski, D. 2013a. Searching for a more sensitive earthworm species to be used in pesticide homologation tests – A meta-analysis. Chemosphere, 90: 895–900. Pelosi, C., Barot, S., Capowiez, Y., Hedde, M., Vandenbulcke, F. 2013b. Pesticides and earthworms: A review. Agronomy for Sustainable Development, 34: 199–228.

35

Piola, L., Fuchs, J., Oneto, M. L., Basack, S., Kesten, E., Casabé, N. 2013. Comparative toxicity of two glyphosate-based formulations to Eisenia andrei under laboratory conditions. Chemosphere, 91: 545–551. Ratcliff, A. W., Busse, M. D., Shestak, C. J. 2006. Changes in microbial community structure following herbicide (glyphosate) additions to forest soils. Applied Soil Ecology, 34: 114–124. Rodriguez-Campos, J., Dendooven, L., Bernal, A. D., Ramos, C. M. S. 2014. Potential of earthworms to accelerate removal of organic contaminants from soil: A review. Applied Soil Ecology, 79: 10–25. Salbego, J., Pretto, A., Gioda, C. R., de Menezes, C. C., Lazzari, R., Radunz Neto, J., Baldisserotto, B., Loro, V. L., 2010. Herbicide formulation with glyphosate affects growth, acetylcholinesterase activity, and metabolic and hematological parameters in piava (Leporinus obtusidens). Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 58: 740–745. Sanchez-Hernandez, J. C., Morcillo, S. M., del Pino, N. J., Ruiz, P. 2014a. Earthworm activity increases pesticide-sensitive esterases in soil. Soil Biology & Biochemistry, 75: 186–196. Sanchez-Hernandez, J. C., Narvaez, C., Sabat, P., Martínez, S. M. 2014b. Integrated biomarker analysis of chlorpyrifos metabolism and toxicity in the earthworm Aporrectodea caliginosa. Science of the Total Environment, 490: 445–455. Schneider, M. I., Sanchez, N., Pineda, S., Chi, H., Ronco, A. 2009. Impact of glyphosate on the development, fertility and demography of Chrysoperla externa (Neuroptera: Chrysopidae): Ecological approach. Chemosphere, 76: 1451–1455. Schribner, E. A., Battaglin, W. A., Gilliom, R. J., Meyer, M. T. 2007. Concentrations of Glyphosate, Its degradation Product, Aminomethylphosphonic Acid, and Glufosinate in Ground- and Surface Water, Rainfall, and Soil Samples Collected in the United States, 2001-06. U.S. Geological Survey. Schrübbers, L. C., Masís-Mora, M., Carazo-Rojas, E., Valverde, B. E., Christensen, J. H., Cedergreen, N. 2016. Analysis of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in leaves from Coffea arabica using high performance liquid chromatography with quadrupole mass spectrometry detection. Talanta, 146: 609–620. Schuette, J. 1998. Environmental Fate of Glyphosate. Environmental Monitoring & Pest Management, Department of Pesticide Regulation. Séralini, G. E., Clair, E., Mesnage, R., Gress, S., Defarge, N., Malatesta, M., Hennequin, D., de Vendomois, J. 2014. Republished study: long-term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modified maize. Environmental Sciences Europe, 26: 14. Tsui, M. T. K., Wang, W. X., Chu, L. M. 2005. Influence of glyphosate and its formulation (Roundup (R)) on the toxicity and bioavailability of metals to Ceriodaphnia dubia. Environmental Pollution 138, 59–68.

36

Velki, M., Ečimović, S. 2015. Changes in exposure temperature lead to changes in pesticide toxicity to earthworms: A preliminary study. Environmental Toxicology and Pharmacology, 40: 774–784. Wang, Y., Wu, S., Chen, L., Wu, C., Yu R., Wang, Q., Zhao, X. 2012. Toxicity assessment of 45 pesticides to the epigeic earthworm Eisenia fetida. Chemosphere, 88: 484–491. Yang, X., Wang, F., Bento, C. P. M., Meng, L., van Dam, R., Mol, H., Liu, G., Ritsema, C. J., Geissen, V. 2015a. Decay characteristics and erosion-related transport of glyphosate in Chinese loess soil under field conditions. Science of the Total Environment, 530–531: 87–95. Yang, X., Wang, F., Bento, C. P. M., Xue, S., Gai, L., van Dam, R., Mol, H., Ritsema, C. J., Geissen, V. 2015b. Short-term transport of glyphosate with erosion in Chinese loess soil – A flume experiment. Science of the Total Environment, 512–513: 406–414. Zhou, C. F., Wang, Y. J., Li, C. C., Sun, R. J., Yu, Y. C., Zhou, D. M. 2013. Subacute toxicity of copper and glyphosate and their interaction to earthworm (Eisenia fetida). Environmental Pollution, 180: 71–77. Žižek, S., Zidar, P., 2013. Toxicity of the ionophore antibiotic lasalocid to soil-dwelling invertebrates: Avoidance tests in comparison to classic sublethal tests. Chemosphere, 92: 570–575.