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Universidad Autónoma de Durango
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA
LICENCIATURA EN NUTRICION
PROFESOR: MC. MIGUEL ANGEL SANCHEZ RODRIGUEZ
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
1. PARA INGRESAR AL LABORATORIO:
a) Deberá portar bata blanca larga.
b) Manual de prácticas de microbiología.
c) Deberá traer guantes de látex estériles, cofia y cubrebocas.
d) Presentación personal de acuerdo a los reglamentos de la Universidad.
e) Solamente entrarán al laboratorio los alumnos que tengan práctica (no se permiten visitas
en horas de prácticas).
2. DENTRO DE LOS LABORATORIOS:
a) No se permite fumar ni tomar alimentos.
b) No sentarse en las mesas de trabajo.
c) Solamente se saldrá del laboratorio cuando todo el grupo correspondiente termine su
trabajo y tenga firmada su práctica.
3. RECOMENDACIONES:
a) Reporte inmediatamente a su profesor cualquier daño personal por leve que sea.
b) Cuide de no contaminar los reactivos de trabajo.
c) No sacuda las pipetas.
d) Si utiliza ácido o álcalis fuertes, es mejor no pipetear directamente.
e) Mantenga siempre limpio su material de trabajo.
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PRÁCTICA No. 1 LAVADO Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE LABORATORIO
INTRODUCCIÓN:
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OBJETIVOS: Conocer el tipo de material requerido para llevar a cabo las prácticas del laboratorio así
como las diversas técnicas y aparatos utilizados para la esterilización del mismo.
MATERIAL: Horno de esterilización
Olla de presión
Cajas Petri
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 mL
Portapipetero de metal
Matraces Erlenmeyer
Papel de envoltura (estraza)
Agua destilada
Papel aluminio, Masking Tape (sencillo y testigo), Algodón
Material de seguridad (guantes, cubrebocas, cofia y bata)
PROCEDIMIENTO:
LIMPIEZA
1. Lavar el material con agua y jabón.
2. Enjuagar con abundante agua de la llave.
3. Enjuagar con agua destilada y escurrir.
4. Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado.
Nota1: Si el material no se limpia bien, hay que enjuagarlo con mezcla crómica y continuar
con el paso 3.
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Mezcla cómica: Disolver 20 ml de ácido sulfúrico concentrado en un poco de agua destilada
lentamente, adicionar 20 g de dicromato de potasio y finalmente aforar a 250 ml con agua
destilada.
EMPACADO DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO
Una vez seco el material empaque de la siguiente manera:
CAJAS DE PETRI:
Corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad de 2 a 3 cajas.
Colócalas en la parte central y Envuélvelas según te indique tu profesor. Se toman los
extremos de Papel y se unen, se hace un nuevo doblez recargando ligeramente en la caja
para marcarlo. Los extremos se doblan en forma triangular. Ya en forma triangular se
doblan hacia atrás quedando listas para esterilizar.
PIPETAS:
Introduce una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando que quede
lo suficientemente apretada. Con tiras de papel en forma de rectángulo del tamaño de la
pipeta envuélvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el
final de la pipeta.
MATRACES.
Tapa el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para evitar que se
destape. Como protección coloca un gorrito de papel estraza y átalo con cinta.
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EMPACADO DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
El material es empacado de la misma forma que el material empacado para esterilización
por calor húmedo, a diferencia que en lugar de papel estraza, se usará papel aluminio, en
tanto que el algodón no será usado.
Nota 1: Las pipetas de vidrio pueden ser metidas a esterilizar en el portapipetero de metal
sin ningún tipo de envoltura.
Nota 2: Coloque cinta testigo en algunos materiales empacados para asegurase de la
esterilización.
Nota 3: En cuanto al material como lo son las asas de platino no es necesario empacarlo
para su esterilización, ya que se pueden hacer directamente con el mechero Bunsen antes
de su utilización
ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO
Una vez listo el material para su esterilización por calor húmedo, proseguir de la siguiente
forma.
1. Coloca el agua necesaria en la olla de presión hasta la marca e introduce el material a
esterilizar, evitando que el material toque las paredes.
2. Cierra la autoclave, cuidando de dejar abierta la válvula de salida de vapor que ayudará a
expulsar el aire contenido dentro y que éste es desplazado por el vapor que se produce.
3. Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de 105ºC indica que está
libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120ºC, mantenla durante 15 minutos
para que se efectúe la esterilización (15 libras de presión). Transcurrido este tiempo se
corta la fuente de calor.
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4. Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida de vapor,
para expulsar el vapor restante. Abre la olla de presión y retira el material.
5. Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a la salida de
vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión las hace hervir o bien
saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfríe perfectamente.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Una vez listo el material para su esterilización por calor seco, proseguir de la siguiente
forma.
1. El material a esterilizar se deberá colocaren la estufa con esta fría, teniendo en cuenta
las siguientes recomendaciones: Cada unidad deberá quedar separada de las vecinas
Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del
esterilizador
La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad
total de la cámara.
2. Encender el Esterilizador, Verificar que los instrumentos de control de temperatura
(170ºC) se encuentren en la posición correcta.
3. Cuando se alcance la temperatura de 170ºC, se comenzará a contar el tiempo de
esterilización (1 hora). Cumplido el tiempo de exposición se apagará el Esterilizador
La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya enfriado.
4. Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del Esterilizador porque ello
implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, además de que el
cambio de temperatura rompería la cristalería.
Nota: Si la esterilización se realiza a 160ºC se tomara 2 horas como tiempo de esterilización.
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OBSERVACIONES:
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Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el lavado y secado del
material de laboratorio.
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Dibuja los diferentes materiales y equipos que se usan en microbiología:
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CUESTIONARIO:
1. ¿Que finalidad tiene el lavar el material que se empleará en la realización de prácticas de
microbiología?
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2. ¿Que proceso de limpieza empleaste en esta práctica para eliminar los microorganismos
presente en el material muy sucio o contaminado?
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3. ¿Que diferencia existe entre el lavado del material y la esterilización de este?
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4. ¿Porque es importante dejar abierta la válvula de salida de vapor en la olla de presión que
ayudará a expulsar el aire contenido?
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6. ¿Porque se recomienda que la temperatura de esterilización por calor seco sea de 170ºC
por 1 hora?
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CONCLUSIONES:
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PRACTICA No. 2 CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA
(MESOFILOS AEROBIOS)
INTRODUCCIÓN:
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OBJETIVO:
Estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, por la cuenta de
colonias en un medio sólido, incubado aeróbicamente.
MATERIAL Y EQUIPO:
Equipo:
Incubadora capaz de mantener una temperatura entre 35 ± 2 °C
Olla de presión con manómetro.
Balanza analítica, con sensibilidad de ± 0.01 g.
Contador de colonias.
Plancha de agitación.
Material:
Encendedor
2 Mecheros Bunsen
Agitador magnético
Papel estraza,
Papel aluminio
Algodón
Cinta Masking
Cinta testigo.
Pinzas de crisol
1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL.
Material de seguridad (Bata, guantes estériles, crubebocas y cofia).
Alcohol al 70% o Fenol al 6 % como desinfectante.
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Material y soluciones estériles:
1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL.
6 Pipetas bacteriológicas de 1ml.
1 Mortero y pistilo.
7 Cajas de Petri de vidrio.
1 espátula.
1 probeta de vidrio estéril o vaso de precipitado (100 ml).
Agar para cuenta estándar (Cuenta Placa).
Sol. Buffer de fosfatos Butterfield. Disolver 34 g. de fosfato de potasio en 500 mL de
agua, ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1N y aforar a 1000 mL con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. Conservarse en refrigeración.
Sol. de fosfatos diluida. Se toma 1.25 mL de la sol. de fosfatos de Butterfield y se diluye a
1000 mL con agua, distribuir en frascos con tapa de rosca en volúmenes de 450 mL y en
tubos con tapas de rosca en volúmenes de 9 mL y se esteriliza por 15 min. a 121 °C.
Finalmente conservarse en refrigeración.
PROCEDIMIENTO:
PREPARACION DE MUESTRAS.
1. El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su
colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que
transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 2 a 8ºC,
con objeto de inhibir la actividad bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos.
Es importante señalar que cuando el examen se practica dos horas después de tomar la
muestra, los resultados pueden ser inciertos.
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PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO
1. Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el
área de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol,
Fenol, Cloro).
2. Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos
como máximo.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS MESOFILICOS AEROBIOS
1. Tomar 50 g. de muestra de alimento y colocarlo en el mortero con pistilo estéril, adicionar
50 mL de sol. de fosfatos diluida y moler, posteriormente vaciarla en un matraz de 500
mL y colocar 400 mL sol. de fosfato diluido (esta sería una dilución de 0.1 o -1). Si se
presume que la muestra esta contaminada, es necesario hacer las diluciones decimales
requeridas, realizarlas con relación 1:9, Ejemplo: Dilución 0.01: tomar 1 mL de la dilución
de 0.1 y transferir a un tubo que contenga 9 mL sol. de fosfatos diluida. Dilución 0.001:
tomar 1 mL de la dilución de 0.01 y transferir a un tubo que contenga 9 mL sol. de
fosfatos diluida. Agitar las diluciones vigorosamente, en un lapso de 20 segundos.
2. Inocular por cada dilución 1 mL de muestra en la caja de Petri aplicando la punta de la
pipeta al fondo de la caja y agregar de 12 a 15 mL de agar cuenta placa fundido y
conservado a 45 °C, (hacerlo por duplicado). Incluir una caja sin inóculo y 1 ml de
solución de fosfato diluido preparado como testigo de esterilidad (Ver figura 1).
3. Finalmente homogeneizar las cajas de Petri, con 6 movimientos de izquierda a derecha y
6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante,
sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo
en el medio. Cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
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4. Dejar solidificar. No debe transcurrir más de 20 min. desde el depósito de la muestra en
el diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo en las cajas.
5. Incubar las placas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la
temperatura que se requieran, según el tipo de microorganismo de que se trate.
Grupo bacteriano
Temperatura
Tiempo de incubación
Termofílicos aerobios 55 ± 2 °C 48 ± 2 h
Mesofílicos aerobios 35 ± 2 °C 24 ± 2 h
Psicotróficos 20 ± 2 °C 3 – 5 días
Psicrofílicos 5 ± 2 °C 7 – 10 días
6. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y
posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %. Así también, deberá desinfectarse el
área de trabajo con el desinfectante utilizado al inicio.
CALCULOS:
LINEAMIENTOS PARA CALCULAR LA CUENTA TOTAL AERÓBICA.
1. En la lectura se seleccionan aquellas placas donde aparecen entre 25 –250 UFC
(Unidades Formadoras de Colonias), para disminuir en error en la cuenta. Se cuentan
todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (sin contar las de mohos y
levaduras).
2. Después de contabilizar las colonias en cada caja, se promedia las dos cajas de la
misma dilución.
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3. La cifra obtenida en la cuenta se redondea de tal forma que solo aparezcan dos dígitos
significativos al inicio de esta cifra. El redondeo se realiza elevando el segundo dígito al
número inmediato superior, cuando el tercer dígito de la derecha sea 5 o mayor
(Ejemplo: 128 redondear a 130), o si el tercer dígito es 4 o menos se reemplaza este
tercer dígito con cero y el segundo dígito queda igual (Ejemplo; 2417 a 2400).
4. Multiplica el número total de colonias por el factor de dilución para obtener el número de
la UFC/g de la muestra. Ejemplo: cuenta de 180 en la dilución –3 = 180,000 UFC/g.
Dilución Forma 1 Forma 2 Multiplicar el dato por
1:10 10 10 0.1
1:1 1 1 1
1:10 -1 0.1 10
1:100 -2 0.01 100
1:1000 -3 0.001 1000
1:10000 -4 0.0001 10000
1:100000 -5 0.00001 100000
1:1000000 -6 0.000001 1000000
1:10000000 -7 .00000001 10000000
5. Cuando dos diluciones estén en el intervalo apropiado, hay que promediar la cuenta de
las 2 diluciones, para obtener así la cuenta en placa por gramo o mililitro. Ejemplo:
cuentas de 220 y 233 en la dilución 1:1000 (-3) y cuentas de 25 y 28 en la dilución
1:10000(-4), da el resultado de 250,000 UFC/g.
PLACA CON MENOS DE 25 COLONIAS:
Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran cuentas de menos de 25
colonias, se cuenta el número de colonias presentes en dicha dilución, se promedia el
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número de colonias y se multiplica por el factor de dilución para obtener el resultado como
“Valor estimado”. Por ejemplo: cuentas de 18 y 14 UFC en la dilución de 1:100 dan como
resultado 1600 UFC/g.
PLACAS CON MÁS DE 250 COLONIAS:
Cuando el número de UFC/placa excede las 250 colonias para todas las diluciones, contar
las colonias en aquella porción de placa que sea más representativa de la distribución de
colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la placa y multiplicar
el valor obtenido por 4 o 2 respectivamente. Aclarar en el informe esta situación agregando
la leyenda “valor estimado”. Por ejemplo; placas promedio 500 UFC en la dilución 1:10000,
da como resultado 5,000, 000 UFC/g.
PLACAS SIN COLONIAS (UFC):
Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, se reporta la correspondiente
dilución más baja. Por ejemplo: en cuentas de 0 UFC en la dilución 1:10, se contabiliza
como <10 UFC/g.
PLACAS CONTAMINADAS O DAÑADAS:
Cuando las placas de una muestra se contaminan o presentan alguna forma
insatisfactoriamente, se registra el resultado como accidente de laboratorio (AL).
PRECAUCION
Al terminar la prueba, todo el material utilizado y cultivos generados deben ser esterilizados
y posteriormente ser desechados.
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OBSERVACIONES:
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INFORME DE LA PRUEBA: El resultado se reporta como: Unidades Formadoras de Colonias, ___________ UFC/g de
bacterias aeróbias en placa en agar para cuenta estándar, incubadas _________ horas a
_______ °C.
Además incluir en su reporte la forma, borde, elevación y el tipo de superficie de cada
colonia, como se muestra en la figura 2.
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REPORTE SUS RESULTADOS:
Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el cultivo bacteriano.
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CUESTIONARIO:
1. ¿Defina el concepto de UFC (Unidad Formadora de Colonia)?
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2. ¿En el proceso de desinfección del área de trabajo es importante utilizar diferentes
desinfectantes, si o no y porque?
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3. ¿Indique que tipos de medios existen y explique cual es su diferencia?
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4. ¿Mencione 3 bacterias mesófilas aerobias?
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5. ¿Porque es importante voltear las cajas de petri una vez que se mete a incubar el cultivo?
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6. ¿Porque se recomienda que la temperatura de incubación de mesófilos aerobios sea de
35±2ºC?
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CONCLUSIONES:
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ANEXOS
Figura 1. Siembra por dilución en agar
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Figura 2. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas en un medio sólido
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PRÁCTICA No. 3 MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
INTRODUCCIÓN:
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO Sistema óptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
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Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Pueden ser monocular o
binocular.
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico
que consigue el enfoque correcto.
OBJETIVOS: La presente práctica tiene por objetivos:
1. Identificar las partes del microscopio y comprender sus características y la visión
con él.
2. Manejar el microscopio correctamente.
3. Realizar una observación con este instrumento.
MATERIAL: Microscopio óptico
Portaobjetos
Cubreobjetos
Aceite de inmersión
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PROCEDIMIENTO:
MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de
10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a) Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular,
ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose
dañar alguno de ellos o ambos.
b) Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de
la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra,
girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar
con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x
enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos
tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones
anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya
se enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión:
a) Bajar totalmente la platina.
b) Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos
indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c) Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y
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el de x40.
d) Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e) Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de
inmersión.
f) Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente
toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se
adosara a la lente.
g) Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el
objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x
por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
h) Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede
volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por
tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación
desde el paso 3.
i) Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca
el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede
retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de
inmersión en posición de observación.
j) Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para
óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición
de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del
borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
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3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el
microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y
con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que
limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este
tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar
las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico,
platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de
objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a
través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún
líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño
humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de
los mismos.
OBSERVACIONES:
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CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la importancia del microscopio en la microbiología?
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2. ¿Puedo observar virus en el microscopio óptico?
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3. ¿Mencione que diferentes tipos de microscopios existen?
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4. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?
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CONCLUSIONES:
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PRÁCTICA No. 4 TINCION DE GRAM
INTRODUCCIÓN:
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OBJETIVOS: Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos: cultivo, tinción y morfología.
MATERIAL: Cultivo de bacterias o levaduras.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).
Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico en 100 cc de agua destilada).
Fucsina básica (1 g de fucsina básica en 100 cc de agua destilada).
Aceite de inmersión.
Microscopio
Portaobjetos
Asas de inoculación
Mechero
Caja de Petri
Tubos de ensayo
Papel secante
Material de seguridad (guantes, cubrebocas, cofia y bata)
PROCEDIMIENTO:
Preparación de Frotis. 1. En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de
agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.
2. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por
el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
33
Coloración: 1. Se adicionan unas 4 gotas de cristal violeta (colorante inicial) y se deja por 1 minuto.
2. Se lava con agua destilada.
3. Se adicionan unas 4 gotas de lugol (mordiente) y se deja por 1 minuto.
4. Se decolora con alcohol de 95° (decolorante).
5. Se lava con agua destilada.
6. Se adicionan unas 4 gotas de fucsina básica (colorante de contraste) y se deja por 1
minuto.
7. Se lava con agua corriente
8. Se seca suavemente y se coloca el portaobjetos.
34
Observación 1. Debe utilizarse el objetivo de inmersión (100X).
2. Se coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparación. Se enfoca,
preferentemente, con el micrométrico.
3. Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol .
4. Anotar las observaciones a continuación considerando las formas y coloraciones de
las bacterias, si parecen aisladas o agrupadas, etc.
OBSERVACIONES:
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
Dibuja las observaciones hechas.
35
RESULTADOS (especifique que tipo de tinción obtuvo):
CUESTIONARIO:
1. ¿ Cuál es la función de la tinción Gram.?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. ¿ Qué pasa a nivel celular con los colorantes utilizados en la tinción Gram.?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. ¿Puede aplicar la tinción Gram. en levaduras?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
36
CONCLUSIONES:
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFÍA:
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
37
PRACTICA No. 5 DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TÉCNICA DEL
NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
INTRODUCCIÓN:
38
OBJETIVO:
Determinación de coliformes totales y coliformes fecales por el método de fermentación en
tubo (NMP) en un producto alimenticio.
MATERIAL Y EQUIPO:
Equipo:
Incubadora capaz de mantener una temperatura entre 35 ± 2 °C
Incubadora capaz de mantener una temperatura de 44 ± 0.5 °C.
Balanza analítica, con sensibilidad de ± 0.01 g.
Olla de presión con manómetro.
Plancha de agitación.
Material:
Encendedor
2 Mecheros Fisher
Papel estraza.
Papel aluminio
Cinta Masking
Cinta testigo.
Algodón
Pinzas para crisol
Tubos de ensaye de cristal refractario de 15 mm x 150 mm con tapón de baquelita.
Tubos de fermentación (Durham).
Asas de inoculación.
3 Matraces Erlenmeyer de 500 mL.
1 Matraz de 50 mL.
3 Agitadores de vidrio
Material de seguridad (Bata, guantes estériles, crubebocas y cofia).
39
Medios:
Caldo lactosado.
Caldo verde brillante de bilis deshidratada de buey.
Medio E. C. (E. coli).
Disolución de fosfato: disolver 34 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) en 500
mL de agua. Ajustar a pH 7.2 ± 0.5 con solución de hidróxido de sodio 0.1 N y aforar a
1000 mL con agua.
Disolución de cloruro de magnesio: disolver 38 g de cloruro de magnesio en 1000 mL de
agua.
Agua de dilución: añadir 1.25 mL de la disolución de fosfato y 5.0 mL de la disolución de
cloruro de magnesio y aforar a 1000 mL de agua. Distribuir 9 mL de esta solución en
tubos con tapón de rosca, cerrarlos hasta una media vuelta antes de su tope y esterilizar
en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos y una presión manométrica de 15 lb/in2.
Material estéril:
5 Pipetas bacteriológicas de 1ml
1 Pipeta bacteriológica de 10ml.
1 Mortero y pistilo.
1 Embudo.
1 Espátula o agitador de vidrio.
1 Probeta de vidrio de 250 ml.
1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL.
PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DE MEDIOS:
1. Utilizar medios deshidratados y para su preparación seguir las recomendaciones del
fabricante.
40
2. Se colocan 10 mL del medio de cultivo en tubos de ensaye de tapón de rosca de
15 x 150 mm. Se requieren 12 tubos para el caldo lactosado (si se va utilizar la dilución
10, 3 de estos tubos deberán prepararse a doble concentración), 9 para el caldo verde
brillante de bilis y 9 para el medio E.C.
3. Se introduce un tubo Durham invertido, no es necesario que en este paso se llene con
medio el tubo Durham, ya que siempre presentará aire dentro de él. Este problema se
elimina al realizar la esterilización.
4. Cerrar los tubos hasta una media vuelta antes de su tope. Colocar cintas indicadoras de
esterilización en alguno que otro tubo, para verificar el esterilizado.
5. Los tubos se esterilizan en la olla de presión; de acuerdo al tiempo y presión que se
indique en la etiqueta del medio a esterilizar.
PREPARACION DE MUESTRAS.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su
colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que transcurre
del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 2 a 8 °C, con objeto
de inhibir la actividad bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos. Es importante
señalar que cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los
resultados pueden ser inciertos.
PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO
Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el área
de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol, Fenol,
Cloro).
Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos como
máximo.
41
PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES
1. Cuando se trate de agua potable, pozo o cuyo origen indique que no existe una alta
contaminación en la muestra, se utilizarán únicamente 9 tubos para las diluciones de 10,
1.0 y 0.1 mL (3 para cada dilución), tomando como nota importante que para la dilución
de 10, el tubo de siembra debe estar preparado al doble de la concentración normal de
caldo lactosado.
2. Cuando se trate de muestras de agua contaminada utilizar hasta 15 tubos para las
diluciones -3, -4, -5, -6 y -7.
3. Para muestras de alimento tomar 25 g. de muestra y colocarlo en el mortero con pistilo
estériles, adicionar 25 ml de sol. de fosfatos diluida y moler, posteriormente vaciarla en
un matras de 500 mL y colocar 200 mL sol. de fosfatos diluida (esta sería una dilución de
0.1 o -1). Si se presume que la muestra esta contaminada, es necesario hacer las
diluciones decimales requeridas, realizarlas con relación 1:9.
Inoculación de la muestra en caldo lactosado:
Cuando se trate de muestras liquidas no contaminadas:
1. Inoculación de la dilución de 10: tomar 10 mL de la muestra y transferirlos a un tubo que
contenga 10 mL de caldo lactosado doble concentración. Para el inóculo, utilizar una
pipeta estéril de 10 mL.
2. Inoculación de la dilución de 1: tomar 1 mL de la muestra y transferir a un tubo que
contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1 mL.
3. Inoculación de la dilución de 0.1 o -1: tomar 1 mL de muestra y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente y transferir 1 mL a un tubo que
contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1 mL.
42
Cuando se trate de muestras liquidas contaminadas:
1. Prepara las diluciones de la -1 y -2:
Dilución -1: tomar 1 mL de muestra y colocarla en un tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos
diluida, agitar vigorosamente.
Dilución -2: tomar 1 mL de la dilución -1 y colocarla en un tubo con 9 mL de Sol. de
fosfatos diluida, agitar vigorosamente.
2. Inoculación de la dilución de - 3: tomar 1 mL de la dilución – 2 y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -3) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
3. Inoculación de la dilución de - 4: tomar 1 mL de la dilución – 3 y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -4) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
4. Inoculación de la dilución de - 5: tomar 1 mL de la dilución – 4 y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -5) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
5. Inoculación de la dilución de - 6: tomar 1 mL de la dilución – 5 y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -6) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
6. Inoculación de la dilución de - 7: tomar 1 mL de la dilución – 6 y colocarla en un tubo con
9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -7) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
43
Cuando se trate de muestras de alimento:
1. Inoculación de la dilución de 0.1 ( -1 ): tomar 1 mL de la dilución -1 y transferir a un tubo
que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1
mL.
2. Inoculación de la dilución de 0.01 ( -2 ): tomar 1 mL de la dilución –1 y colocarla en un
tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -2) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
3. Inoculación de la dilución de 0.001 ( -3 ): tomar 1 mL de la dilución –2 y colocarla en un
tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -3) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
4. Inoculación de la dilución de 0.0001 ( -4 ): tomar 1 mL de la dilución –3 y colocarla en un
tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -4) y
transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar
una pipeta estéril de 1 mL.
Incubación de tubos
1. Incubar los tubos de fermentación inoculados a 35 ó 37 ± 1°C. Se debe registrar en la
bitácora de la incubadora utilizada, la temperatura que presenta por medio del
termómetro colocado en ella y que sea trazable a un termómetro calibrado. Anotar en la
misma bitácora el número de código del termómetro utilizado.
2. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas de incubación. Los tubos que presenten
formación de gas, se consideran positivos. Incubar de nuevo los tubos otras 24 ± 2
horas. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este procedimiento.
3. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y
posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %.
44
PRECAUCIONA: verificar la producción de gas en los tubos inoculados, debe asegurarse de
no confundir burbujas de aire con el gas resultante de una fermentación. Si el gas fue
producido por una fermentación, el medio de cultivo tendrá una apariencia turbia, lo cual
significa que el gas se desprende del medio, debido a la acción de los microorganismos.
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES
1. Resembrar los tubos que resulten positivos de la prueba presuntiva, tomando de una a
tres veces con el asa de inoculación en caldo lactosado al verde brillante de bilis e
incubar a 35 ó 37 ± 1°C.
2. Se debe registrar en la bitácora de la incubadora utilizada, la temperatura que presenta,
la cual será medida por el termómetro colocado en ella y que sea trazable a un
termómetro calibrado. Anotar en la misma bitácora el número de código del termómetro
utilizado.
3. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. Los tubos que presenten formación de gas se
consideran positivos. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este
procedimiento.
4. Incubar los tubos que no presenten formación de gas otras 24 ± 2 horas.
5. La formación de gas dentro de 48 ± 3 horas de incubación total, constituye una prueba
confirmativa de la presencia de coliformes totales.
6. La ausencia de gas dentro de 48 ± 3 horas, de incubación total constituye una prueba de
la ausencia de coliformes totales.
7. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y
posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %.
45
Fig. 1. Inoculación de tubos
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES.
1. Resembrar los tubos que resulten positivos de la prueba presuntiva (caldo lactosado) o
de la prueba confirmativa (medio verde bilis brillante), tomando de una a tres veces con
el asa de inoculación en el medio E. coli e incubar a 44 ± 0.5 °C.
2. Se debe registrar la temperatura que presenta la incubadora, la cual será medida por el
termómetro colocado en ella y que sea trazable a un termómetro calibrado (registrarlo en
la bitácora de la incubadora).
3. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. Los tubos que presenten formación de gas se
consideran positivos. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este
procedimiento.
4. Incubar los tubos que no presenten formación de gas otras 24 ± 2 horas.
5. La formación de gas dentro de 48 ± 3 horas de incubación total, constituye una prueba
confirmativa de la presencia de coliformes fecales.
6. La ausencia de gas dentro de 48 ± 3 horas, de incubación total constituye una prueba de
la ausencia de coliformes fecales.
7. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y
posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %.
46
PRECAUCION: Al terminar la prueba, todo el material utilizado y cultivos generados deben
ser esterilizados y posteriormente ser desechados.
OBSERVACIONES:
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
CALCULOS:
1. Anotar el número de tubos positivos de cada una de las diluciones sembradas para la
prueba presuntiva y confirmativa de coliformes totales y fecales la hoja de REPORTE DE
RESULTADOS.
2. A partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios presuntivos y
confirmativos, calcular el número más probable (NMP) de organismos Coliformes totales
y fecales en 100 mL de muestra, de acuerdo a la Tabla 1 para las diluciones de 10, 1 y
0.1.
3. En caso de que las diluciones sean mas grandes que las anteriores, es necesario para la
interpretación, multiplicar al valor obtenido en la tabla 1, por el factor de dilución para
hacerlo equivalente, es decir, seleccionar las tres diluciones y multiplicar el valor de la
tabla por el factor de la dilución intermedia, como se muestra en la tabla siguientes.
47
Dilución Forma 1 Forma 2 Multiplicar el dato por
1:10 10 10 0.1
1:1 1 1 1
1:10 -1 0.1 10
1:100 -2 0.01 100
1:1000 -3 0.001 1000
1:10000 -4 0.0001 10000
1:100000 -5 0.00001 100000
1:1000000 -6 0.000001 1000000
1:10000000 -7 .00000001 10000000
4. Para la interpretación de resultados se utilizan tres series de la prueba confirmativa del
total de diluciones utilizadas.
5. Otra forma de calcular el resultado es aplicando la formula siguiente.
NMP/100 mL = 10 x NMP (Tabla 1)
Volumen más grande en dilución
6. Reportar los Coliformes totales y fecales en caso de muestras positivas como NMP/100
mL. Para muestras negativas reportar como Ausentes.
REPORTE SUS RESULTADOS:
48
Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el cultivo bacteriano.
49
CUESTIONARIO:
1. ¿Defina al grupo de bacterias coliformes?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. ¿Cuáles son los limites máximos permisibles de Coliformes totales y fecales en muestras
de alimentos?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. ¿Defina que es un limite máximo permisible?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
4. ¿Porque es importante incubar Coliformes totales a 35 ± 1ºC?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
5. ¿Por qué es importante hacer diluciones de la muestras?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
50
CONCLUSIONES:
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFÍA:
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
51
REPORTE DE RESULTADOS
Fecha
No. De Hoja
Procedencia de la muestra
Nombre del Técnico
Presuntiva Confirmativa
Coliformes Totales Confirmativa
Coliformes Fecales
Dilución
24 horas
48 horas
Código
Índice NMP / 100 mL Índice NMP / 100 mL
52
Tabla 1
Índice del NMP y límite confiable de 95 % para varias combinaciones de resultados positivos
y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 mL, 3 porciones de 1 mL y
porciones de 0.1 mL. No. de tubos con reacciones
positivas Índice del NMP
por 100 mL Limite confiable de 95%
3 tubos con 10mL
3 tubos con 1mL
3 tubos con 0.1mL
Inferior
Superior
0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3
0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3
<3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 = > 2400
< 0.5 < 0.5 < 5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150
- 9 13 20 21 23 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 280 380 440 470 1300 2400 4800
* (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2000)
53
PRACTICA No. 6 DETERMINACION DE SALMONELLA Y SHIGELLA
INTRODUCCIÓN:
54
OBJETIVO:
Determinación de Salmonella presente en agua o alimento.
MATERIAL:
Equipo:
Incubadora capaz de mantener una temperatura entre 35 ± 2 °C
Balanza analítica, con sensibilidad de ± 0.01 g.
Plancha de agitación
Material:
1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL.
1 Agitador magnético
Encendedor
2 Mecheros Fisher
Asas de inoculación.
Papel estraza.
Papel aluminio
Pinza para crisol
Cinta Masking
Cinta testigo.
Algodón
Material de seguridad (Bata, guantes estériles, crubebocas y cofia).
Caldo lactosado
Agar Salmonella-Shigella
Alcohol al 70 % o Fenol al 6%
55
Material estéril:
1 Cajas de Petri estériles por persona.
Tubos de caldo lactosado positivos de la práctica 3.
Licuadora con vaso
Probeta de 100 mL.
PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DE AGAR Salmonella- Shigella:
1. Utilizar medios deshidratados y para su preparación seguir las recomendaciones del
fabricante.
2. Se colocan 10-15 mL del Agar en una caja previamente esterilizada (Preparar 1 caja
por alumno).
3. Dejar enfriar hasta que solidifique el Agar y voltear la caja.
PREPARACION DE MUESTRAS:
1. El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su
colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que
transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 0 a 4 °C
hasta un límite máximo de 36 horas, para la muestra de agua potable, conservarla
máximo 24 horas y 6 horas para otro tipo de agua, con objeto de inhibir la actividad
bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos.
56
PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO:
1. Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el
área de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol al
70 % o Fenol al 6%).
2. Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos
como máximo.
ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO:
Muestras sólidas:
1. Pesar asépticamente 25 g. de muestra de alimento en un vaso estéril de licuadora y
adicionar 225 mL de caldo lactosado concentración normal estéril.
2. Licuar durante 1 min. y transferir la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de
boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min. a temperatura ambiente con
la tapa bien enroscada.
3. Mezclar bien, determinar el pH y ajustar si es necesario a un pH entre 6.8 ± 0.2 con
hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Finalmente mezclar y cerrar el
recipiente sin sellar.
4. Incubar por 24 ± 2 h a 35 °C.
Muestras líquidas:
1. Tomar asépticamente 25 mL de muestra de agua y vaciarlos en 225 mL de caldo
lactosado concentración normal estéril.
2. Agitar y dejar reposar por 60 min. a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.
3. Mezclar bien, determinar el pH y ajustar si es necesario a un pH entre 6.8 ± 0.2 con
hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Finalmente mezclar y cerrar el
recipiente sin sellar.
4. Incubar por 24 ± 2 h a 35 °C.
57
ETAPA DE AISLAMIENTO:
1. Mezclar cada tubo con los cultivos de enriquecimiento en un vortex e inocular por estría
en placa en Agar Salmonella-Shigella (SS), como se muestra en la 1.
2. Incubar las placas por 24 ± 2 h a 35 °C.
3. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y
posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %.
Figura 1. Técnica de sembrado por estría en placa.
OBSERVACIONES:
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
58
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1. Las Salmonellas y Shigellas, se encuentran en el medio ambiente y se pueden detectar
en los concentraciones bajos en la mayoría de las aguas superficiales comparadas con
los coliformes
2. Examinar las placas para detectar la presencia de colonias sospechosas de Salmonella y
Shigella, de acuerdo a las características morfológicas presentadas en la siguiente tabla.
COLONIAS MICROORGANISMOS Incoloras, transparentes y a veces
cremosas. Shigella, y la mayoría de las Salmonellas
Transparentes, con centro negro Proteus, y algunas Salmonellas
De rosadas hasta rojo Escherichia coli
Mayores que las E. coli rosadas,
hasta de color cremoso
blanquecinas, opacas y mucosa.
Enterobacter aerogenes
Tabla 1: Características morfológicas de las colonia desarrolladas en Agar SS
INFORME DE LA PRUEBA:
1. El resultado de esta prueba se expresa por la presencia o ausencia de Salmonella,
estudiado como patógeno cuando se encuentra presente en alimentos y agua.
2. Se informa como presencia o ausencia de Salmonella spp. en ________ g, mL o cm2 de
muestra.
59
REPORTE SUS RESULTADOS: Dibuje las diferentes colonias observadas en las cajas de Salmonella-Shigella:
60
CUESTIONARIO:
1. ¿cuál es la finalidad de enriquecer la muestra?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. ¿Por qué el Agar Salmonella-Shigella no es esterilizado?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. ¿Por qué el resultado de Salmonella-Shigella se reporta como ausencia o presencia?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
4. ¿Debido a que algunas colonias de Salmonella presentan un centro negro como se
menciona en la figura 1?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
5. ¿En que alimentos es común encontrar la bacteria de Salmonella?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
61
CONCLUSIONES:
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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BIBLIOGRAFÍA:
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