Typning av virulensfaktorer och lite om MALDI-TOF · • Streptococcus pneumonia och S....

Typning av virulensfaktoreroch lite om MALDI-TOF

Bo NilsonKlinisk mikrobiologi

Laboratoriemedicin Skåne

Identifiering

• Proteinet– Ag – ak

• Agglutination• Elisa• Elisa• Immunokromatografi• Array

• Nukleinsyra– DNA– mRNA

Kliniskt bruk

• Kit– Oxiod (Denka Seiken)

• TSST-1• TSST-1• Stafylokock Enterotoxin A, B , C, D

– Denka Seiken• Exfoliatin A och B (SSSS)

Latexagglutination

• Uppodlade bakterier, 2 dygn– Anrikning och rening– Reaktion och avläsning– Sensitivitet 0,5 – 2 ng/ml

ELISA

• Federal office for civil protection, Spiez Laboratory, Schweiz

Immunokromatografi• 9/11 – Bioterrorism

– Anthrax– Ricin– Botulinumtoxin A, B– Botulinumtoxin A, B– SEB

• Sens 15 ng/ml

– Yersinia pestis– Tularemi– Brucella

BioThreat Alert®, Tetracore

Nukleinsyradetektion

• PCR Single- eller multiplex– Gelelektrofores– Realtid med smältkurva– Realtid med specifika prober– Array

• Fast form• Beads• Kromatografiskt

PCR Singleplex + IAC

• Panton-Valentin leukocidin (PVL)– lukS-lukF

• Nekrotiserande pneumoni (indikator)• Nekrotiserande pneumoni (indikator)

• TSST-1– tst-1

�

Spa-typning av S. aureus

Sekvensanalys av spa-genen för Protein A

• Repetitiva

F R

S E D A B C X

� • Repetitivasegment (RS)

• 1 – 19• “Unik” sekvens

t690 – 07-12-21-17-13-13-34-34-34-33-34

www.Ridom.de www.SeqNet.org

Fördelning av SAg gener, agr typer, and eta and etd gener för olika spa-typer

Holtfreter S et al. J. Clin. Microbiol. 2007;45:266 9-2680

emm-typning av grupp A streptokocker

Sekvensanalys av emm-genen för M protein

Två isolat har samma emm-typ om deras sekvens är > 95% identiska

F R

www.cdc.gov

Multiplex – Detektion av många gener

• Array– Fast

• Chip

– Beads• Luminex

– Kromatografisk • Hain Lifescience m fl

Vad kommer – Nanoteknik

Mishra et al, Lab chip 2008, 8:868-871.

Point-of-care

Gerdes et al, CLI 2008, 5:22-25

IDMALDI-TOF” ”” ”

En ny, snabb och generell metod för artbestämning av bakterier och svamp med

masspektrometri

IDMALDI-TOF” ”

mass fingerprint

Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi

Övernattodling av bakterier på agarplattor

Snabba metoder Morfologi (makro / mikroskopisk)Snabbtester (katalas, oxidas, pasturex etc)Selektiva och differentierande plattor (chromagar)

Metoder som används för artbestämning idag

Problem:Långtifrån alla prov artbestäms dag 1.Snabbare metoder behövs!Selektiva och differentierande plattor (chromagar)

Direkt antibiotika resistens …

Långsamma metoderFenotypiska (API, “Jäsningar”) Genotypiska (16S sekvensering) …≥ 1 dag


Snabbare metoder behövs!

MALDI-TOF

Arbetsflöde MALDI Biotyper

Okändmikroorganism

Identifierad art

Plocka en koloni

Preparera provet på MALDI-platta

art

Databas sökning

Automatiserad spektruminsamling


MALDI target

Provberedning

MALDI target

Tillsätt matrixlösning (1 µµµµl)

Överför celler till provplattan

Matrix:

UV-absorberande protondonator

Automatiserad MS-analys

Avdunstning av lösningsmedel vid rumstemperatur


OkändMikroorganism

Identifierad art

Plocka en koloni

Preparera prov på MALDI-platta

Arbetsflöde MALDI Biotyper

art

Databas sökning30-60 sek

Automatiserad spektrum-insamling 15-30 sek


UV-LaserIon detector

Principle of MALDI-TOF Mass SpectrometryMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight MS

Acceleration

+++

Target plate + + +

Drift

+ + +

20 kV+ -

Vacuum

AccelerationAnalyte in matrix crystals

Drift

Time-of-Flight

m/z

Intensity

Desorption/Ionization

++ +

UV-Laser

20 kV

≈300-500 laser shots≈15-30 sec. per sample

Svamp, jäst, gram+ and gram- bakterier

Aspergillus fumigatus

Candida albicans

Bred tillämpning av MALDI-TOF MS profil

Bacillus subtilis

3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

Escherichia coli

m/z


Hur fungerar det?

MALDI-TOF profil (rådata) Pinnspektrum (processad data)

Okänt prov

Det erhållna spektrat konverteras till ett “pinnspektra” och alignas sedan till det spektra i referensdatabasen som matchar bäst.


Color coded identification

Stam från databasen med känd ID

Analyte Analyte Organism Score Organism Score

Name ID (best match) Value (second best match) Value

E1

BAT09-276 Enterococcus faecium 2,468 Enterococcus faecium 2,466( +++ )

E2

BB107/09 Enterococcus faecalis 2,431 Enterococcus faecalis 2,319( +++ )

E3

BAT09-1037 Enterobacter cloacae 2,362 Enterobacter cloacae 2,232( +++ )

E4

BAT09-1205 Klebsiella pneumoniae 2,408 Klebsiella pneumoniae 2,17( +++ )

E5

MALDI Biotyper 2.0 – result table

BB2337/09 Clostridium perfringens 2,386 Clostridium perfringens 2,267( +++ )

E6

BS7547/09

Corynebacterium

diphtheriae 2,15

Corynebacterium

diphtheriae 2,096( ++ )

E7

BAT09-194 Corynebacterium striatum 2,365 Corynebacterium striatum 2,254( +++ )

E8

BAT09-1475 Eikenella corrodens 1,937 not reliable identification 1,401( + )

E9

BNL1800/09 Legionella pneumophila 2,367 Legionella pneumophila 1,921( +++ )


Begränsningar– Vissa närbesläktade arter kan ej särskilja

• Shigella-arter inte i databasen– Identifieras som E. coli

• Streptococcus pneumonia och S. mitis-gruppen kan inte säkert separeras.

• Arter som ingår i Burkohlderia cepacia-komplexet kan inte särskiljas.�

• och några andra – Arter som inte finns i databasen kan inte identifieras– Arter som inte finns i databasen kan inte identifieras

MALDI-TOF:

Microflex

MALDI-TOF-TOF:

UltrafleXtreme

Hårdvara:

Två nya MS-system från Bruker

Mjukvara: MALDI Biotyper Artidentifiering av mikroorganismer


Exempel på långsamma metoderDagar

Kortjäsning (KJ) 1Kortjäsning OL (KJOL) 1Långjäsning (LJ) 1Shigellajäsning (SHIGJ) 1Yersiniajäsning (YERSJ) 1API 20 C AUX (20CAUX) >1API svamp (ID32C) >1API 20E (20E) 1API CORYNE (CORYNE) 1API NE (NE) 1API STREP (20STRE) 1

MALDI-TOF

MALDI-TOF är en snabb och generell metod

Man behöver inte välja vilken metod som ska användasAPI STREP (20STRE) 1

API NH (NH) 2Pseudplatta (PSE) 1Tweenplatta (TW80) 1XVplatta (XV) 1Tellurit (TEL) 1Camptest (CAMP) 1Omvänd camp (OMCAMP) 1Rörkoagulas (COA) 1Optochin (OPTO) 1Rapidana (RAPID) 1Deferoxamine (DEFER) 1Salmonella fag (FAG) 1VA CO KA GALLA (VCKGA) 2

2 min – 2 tim

metod som ska användas

Artidentifikation

Fram till nu• Biokemiska

tester

I framtiden• MALDI-TOF

• Nukleinsyraanalys• Antigenpåvisning

• Nukleinsyraanalys

• MALDI-TOF

• Nukleinsyraanalys

• Antigenpåvisning

• Biokemiska tester


Två olika sätt

antingen– att odla ut på platta och plocka kolonier så fort de är

synliga >5h

Snabb artidentifiering av positiva blododlingar med MALDI-TOF

synligaeller

– att använda ett förprotokoll som tvättar bort blodprodukterna från bakterierna i provet

och sedan använda standardprotokollet för MALDI

>5h

<1h


Schubert et al.,

ECCMID 2010

Snabb artidentifiering av positiva blododlingar med MALDI-TOF&

Total tid för isolering av bakterier: ~5 min!

Prestanda: >80% korrekt IDinga falskt-positiva ID


Kombinera snabb artidentifiering med MALDI-TOF med resistensbestämning�� med

Phoenix eller Vitek 2

Phoenix (BD)

MALDI-TOF, Bruker

Vitek 2 (Biomerieux)

Identifiering av antibiotikaresistenta bakterier

• Analysera skillnader i massprofiler

• Detektion av resistensmarkörer

Ampicillin-resistenta E. coliToppen m/z 29,000 är β-lactamase

• Funktionell MALDI-assay där produkter from resistensenzymer detekteras

Camara et al 2007


Bestämning av antibiotikaresistens för Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL)Funktionell MALDI-assay för detektion av hydrolyserat ampicillin

Sparbier et al JCM 2012

Identifiering av virulenta bakterier

Påvisa• Shiga-/verotoxiner

–stx1 och/eller stx2• Virulensgener

–eaeA –uidA (O157) Stx2

Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC)

Fagerqvist 2011

• Generell metod • Identifierar de allra flesta kliniskt

relevanta bakterier och svampar• Kan detektera mixade kolonier• Minimal och enkel provberedning• Enkelt köra instrumentet

Samanfattning av MALDI-TOF

• Enkelt köra instrumentet • Snabb analys till låg kostnad• Miljövinster• Ny plattform för utveckling och forskning

Sabbare artbestämning med MALDI-TOF kommer att sänka svarstiderna betydligt


Typning av virulensfaktorer och lite om MALDI-TOF · • Streptococcus pneumonia och S....

Documents

Transcript of Typning av virulensfaktorer och lite om MALDI-TOF · • Streptococcus pneumonia och S....