Tutora de TFM: María Isabel González-Siso
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Naolli Anaid Barradas
Cruz
Tutora de TFM: María Isabel González-Siso
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Purificación y caracterización bioquímica de una β-galactosidasa térmofila
· Purificación e caracterización bioquímica dunha β-galactosidasa termófila
· Purification and biochemical caracterization of a thermophilic β-galactosidase
GONZALEZ SISO
MARIA ISABEL -
DNI 32754332D
Firmado digitalmente
por GONZALEZ SISO
MARIA ISABEL - DNI
32754332D
Fecha: 2019.09.04
09:53:00 +02'00'
ÍNDICE
Introducción 2
Objetivos 4
Materiales y métodos 5
E. coli T7 Express (New England Biolabs) 5
Plásmido pET-21a-d(+) (Novagen) 5
Medio LB 5
ONPG 5
Preparación de células competentes 6
Expresión inducida por IPTG 6
Extracción y purificación de proteínas 7
Cromatografía de afinidad (Sistema ÁKTA) 7
Cuantificación de proteínas por el medio Bradford 8
SDS-PAGE 8
Ensayo de pH óptimo 9
Ensayo de temperatura óptima 9
Ensayo de cinética enzimática 9
Ensayo de iones 10
Resultados y discusión 11
Crecimiento celular e inducción de la proteína 11
Purificación 12
Cuantificación de la concentración de proteína por el método de Bradford
13
Temperatura y pH óptimos 14
Ensayos de cinética enzimática 16
Ensayo de iones 17
Conclusiones 17
Bibliografía 18
Introducción
Los hábitats extremos son un gran reservorio de vida, donde quedan por
descubrir organismos que podrían tener un gran interés biotecnológico, ya que
presentan genes y metabolitos que permiten su supervivencia en estos
ecosistemas extremos. Por ello, en los últimos años las fuentes geotermales se
han convertido en objeto de investigación en la búsqueda de productos
microbianos para su utilización en las diferentes áreas de la industria, por
rentabilidad y sostenibilidad (Arias Factos, 2016).
La metagenómica es una rama de la biología que ayuda a hacer el análisis de
una comunidad microbiana desde una perspectiva nueva, se encarga de estudiar
el ADN de todos los organismos que componen un hábitat, (metagenoma)
(Handelsman, 2004). Con este ADN se crean bibliotecas genómicas para su
estudio se emplean análisis funcionales y de secuencias de los genomas
microbianos contenidos en una muestra ambiental, basándose ya sea en
expresión o secuenciación (Bonilla-Rosso et al., 2008). Al estudiar el
metagenoma de un ambiente en particular, es probable que se descubran
bacterias u otros organismos no cultivables, que no podrían aislarse en
condiciones de laboratorio.
El ADN metagenómico obtenido se puede clonar en vectores y expresar en
diversos huéspedes procariotas, lo que ha permitido la identificación de nuevos
microorganismos y sus funciones. Todo este material genético nos brinda una
oportunidad de encontrar una serie de genes, antes inaccesibles, que podrían
codificar nuevos o mejores productos metabólicos. De la misma manera, la
secuenciación masiva es un método que se está empleando para generarán
genomas completos de organismos que no se pueden cultivar, (Hernández-
León et al., 2010).
El conocimiento del ADN metagenómico de un ambiente en particular, permite
conocer diversos aspectos de la vida microbiana que allí se está generando,
genes y proteínas que se solo se expresan bajo esas condiciones (Hernández-
León et al., 2010).
Las enzimas obtenidas a partir de microorganismos termófilos o termoenzimas
presentan mejores cualidades que sus homólogas procedentes de mesófilos, no
sólo frente a la temperatura, sino también frente a otros agentes
desnaturalizantes como cosolventes, agentes caotrópicos y detergentes,
además no requieren una refrigeración a temperaturas bajas para mantener su
forma activa y presentan vidas medias más largas (Helene Chautard, Emilio
Blas-Galindo, Thierry Menguy, Laure Grand’Moursel, Felipe Cava, 2008).
Las β-galactosidasas (EC.3.2.1.23) son enzimas que catalizan la hidrólisis de
enlaces galactosídicos beta-1,4 pero también pueden catalizar la síntesis de
oligosacáridos. Estas enzimas, se han encontrado distribuidas en toda la
naturaleza presentes en una multitud de microorganismos, plantas y animales.
Las β-galactosidasas pueden llevar a cabo tres actividades enzimáticas, primero,
pueden escindir el disacárido lactosa para formar glucosa y galactosa. En
segundo lugar, la enzima puede catalizar la transgalactosilación de la lactosa a
alolactosa, un isómero de la lactosa, que consiste en los monosacáridos D-
galactosa y D-glucosa unidos por un enlace glucosídico β1-6, en lugar de β1-4,
y que genera la expresión de un operón o un gen. Es la alolactosa que se une al
represor lac Z y crea el circuito de retroalimentación positiva que regula la
cantidad de β-galactosidasa en la célula de Escherichia coli. En tercer lugar, las
β-galactosidasas pueden catalizar la síntesis de galacto-oligosacáridos o GOS
(Corral García, 2005).
Las β-galactosidasas se dividen en familias, siendo las más importantes la 1, 2,
35 y 42. A la familia 2 pertenece la β-galactosidasa Lac Z de E. coli. El gen LacZ
está presente como parte del operón lac que es activado en presencia de lactosa
con niveles bajos de glucosa (Zavaleta et al., 2013).
Los genes en el operón lac especifican las proteínas que ayudan a la célula a
utilizar la lactosa. El gen lacZ codifica una enzima que divide la lactosa en
monosacáridos. Dos reguladores encienden y apagan el operón en respuesta a
los niveles de lactosa y de glucosa: el represor lac y la proteína activadora por
catabolito (CAP). Estas proteínas se fijan al ADN del operón lac y regulan su
transcripción con base en los niveles de lactosa y de glucosa (Juers et al., 2012).
La β-galactosidasa de E.coli es un tetrámero de cuatro cadenas polipeptídicas
idénticas, cada una de 1023 aminoácidos. Dentro de cada monómero, los 1023
aminoácidos forman cinco dominios estructurales bien definidos. El tercer
dominio (central) es lo que se denomina triosa fosfato isomerasa (TIM) o barril
α-8-β-8, y el sitio activo forma un foso profundo en el extremo C-terminal de este
barril, su peso molecular es alrededor de los 100 000 KD por unidad (Jacobson
et al., 1994; Juers et al., 2012).
La industria láctea se encuentra en la constante búsqueda de enzimas β-
galactosidasas, que hidrolicen la lactosa a altas temperaturas de entre 55-60° C,
para poder utilizarla en el proceso de hidrolisis de la lactosa, y que esta pueda
agregarse inmediatamente después de la esterilización, para así evitar la
contaminación de le leche y de sus derivados; la enzima para considerarse
optima, tendrá que dejar inalterados los componentes lácticos, lograr elevadas
velocidades de reacción y alargar el periodo de utilización de los derivados, por
ello se están haciendo más investigaciones en el campo de la metagenómica
para encontrar β-galactosidasas termoestables que cumplan con todos los
requerimientos en el campo industrial (Chitunda Pessela, 2002).
La sobre-expresión de enzimas de termófilos como proteínas recombinantes
extracelulares en hospedantes mesófilos, facilita su obtención y purificación, esto
ha permitido la obtención β-galactosidasas con excelente termoestabilidad y su
uso en bioprocesos industriales, como la hidrólisis de la lactosa, para aumentar
la digestibilidad de la leche y la mejora de las propiedades de los productos
lácteos (Zavaleta et al., 2013).
La enzima p37, objeto de este trabajo, es una β-galactosidasa termoestable
procedente de una búsqueda funcional en una metagenoteca en plásmido
construida a partir del ADN metagenómico de la fuente termal de As Burgas
(Ourense).
Objetivos
· Expresión heteróloga en E. coli de una β-galactosidasa termoestable de
origen metagenómico (p37).
· Purificación por métodos cromatográficos.
· Cinética enzimática: Determinación de parámetros cinéticos con ONPG
y el sustrato natural lactosa
· Determinación de pH óptimo.
· Determinación de temperatura óptima.
· Determinación de actividad con diferentes iones.
Materiales y Métodos
E. coli T7 Express (New England Biolabs)
Son células de E. coli químicamente competentes de alta eficiencia adecuadas
para la expresión de la proteína p37.
Plásmido pET-21a-d(+) (Novagen)
El gen de interés se insertó en el plásmido pET-21a-d(+), que tiene un gen de
resistencia a antibióticos, un gen Lacl que codifica para para el represor Lacl, el
gen de interés insertado después de la secuencia de ADN del promotor T7, la
secuencia de ADN del operador lac y el sitio de unión del ribosoma (para el
comienzo de la transcripción).
Medio LB
Se prepara el medio LB (Peptona 1%, Extracto de levadura 0,5%, NaCl 0,5%) en
matraces de 2 L, en 200 mL de agua destilada y ampicilina en una concentración
final de 100 µg/mL.
ONPG
Es posible una prueba rápida de actividad galactosidasa, utilizando orto-
nitrofenil-β-galactósido (ONPG) como sustrato, debido a que éste entra
rápidamente en las células, la β-galactosidasa hidroliza al sustrato ONPG
(incoloro), liberando o-nitrofenol que en medio alcalino produce una coloración
amarilla y que presenta absorbancia a longitud de onda 420nm.
Se prepara en 10 mL de Buffer Z (100mM Na2HPO4, 40mM NaH2PO4, 10mM
KCl, 1,6mM MgSO4) a una concentración de 4 mg/mL de ONPG.
Preparación de células competentes
Para la expresión de la secuencia clonada que tiene actividad β-galactosidasa,
se utilizó el plasmido pET-21a-d(+) del kit comercial Novagen y se transformó en
las células competentes XL1blue, para más tarde usar células de expresión. Para
determinar la concentración de ADN, se cuantificó la absorbancia a 260 nm en
el espectrofotómetro y el cociente 260/280 para conocer su grado de pureza.
Para la expresión de la proteína, se utilizarón las E. coli T7 express C2566 (New
England Biolabs), porque son células altamente eficientes.
Para preparar las células competentes se utilizó el Mix and go E. Coli
transformation kit & buffer (Zymo Research).
A continuación, el ADN plasmídico que contenía la ORF codificante para la
proteína p37 (pET21ap37) se transformó en estas células competentes
siguiendo el protocolo de transformación exprés de 5 minutos recomendado para
las células C2566 (New England Biolabs).
Expresión inducida por IPTG
El isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) es una molécula que se usa como
análogo no hidrolizable de la alolactosa, para inducir la expresión del operón Lac
en E. coli, ya que esta molécula es fácilmente trasportada al interior de la célula
donde se va a inhibir la proteína represora Lacl y activar la expresión Lac, su uso
se ha hecho común en los laboratorios de biología molecular (Borralho et al.,
2002).
El IPTG contiene un átomo de azufre (S) que crea un enlace covalente no
hidrolizable por β-galactosidasa, lo que evita que el IPTG sea degradado con lo
cual acumulando progresivamente, así que va a actuar como activador constante
del operón Lac, lo que permite la actividad enzimática (Borralho et al., 2002).
Se preparo un pre-inóculo de las células T7 Express C2566 con la construcción,
en 200 mL de medio LBA (100 µg/μL ampicilina), dejándose crecer toda la noche
a 37°C con agitación.
Pasado el tiempo, se midió la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD600), lo
que permite determinar la densidad celular y, con ello, el crecimiento del cultivo.
A partir del pre-inóculo, se hace una dilución en LBA para comenzar el
crecimiento del inóculo a una OD600 de 0,2. Cada hora, se mide la OD600 del
cultivo (Figura 1) y se deja crecer el inóculo hasta que alcance una OD600 de 0.8.
Una vez alcanzada, se procede a la inducción mediante la adición de IPTG a una
concentración final de 0,4mM, y se deja 2h a 37ºC. Pasado este tiempo, se
centrifuga a 5000 rpm 4ºC 10min. Se congelan las células a -20ºC hasta su
posterior utilización.
Extracción y purificación de proteínas
Las proteínas recombinantes en E.coli pueden ser expresadas de dos formas,
secretadas en el medio extracelular (solubles) o expresadas en el interior de la
célula, para este último caso es necesario la ruptura de las células para extraer
las proteínas de su interior (García et al., 2013).
Las células se descongelan a temperatura ambiente, se resuspenden en 10mL
de tampón fosfato sódico 20mM (pH7,4, NaCl 500mM) y se añaden inhibidores
de proteasas (impidiendo que actúen proteasas para que no se rompa la
proteína): fluoruro de fenilmetilsulfonilo PMSF 1M (2µL por mL), Benzamidina
0,5M (2µL por mL) y Pepstatina 1mM (5µL por mL).
Se lisan las células mediante sonicación durante 15 min a 100% amplitud (2”on/
8” off) en frío. A continuación, se centrifuga a 14000 rpm 15min a 4°C. Como
primer paso de purificación para desnaturalizar las proteínas mesofílicas de
E.coli, el sobrenadante recuperado se calienta a 70°C durante 10 min, se
centrifuga a 14000 rpm 15min a 4ºC y el sobrenadante resultante, que será el
extracto crudo (EC), se filtra con un filtro de 0,22µm.
Cromatografía de afinidad (Sistema ÄKTA)
La cromatografía de afinidad es una técnica ampliamente usada como método
de purificación de proteínas, ya que es un método relativamente sencillo de
aplicar, y no modifica la proteína objeto de estudio.
La cromatografía de afinidad por histidinas se basa en la unión directa, específica
y reversible entre la proteína etiquetada y un ligando, los residuos de histidina
quedan unidos covalentemente a una resina que contiene níquel, la proteína se
purifica de forma selectiva, ya que sólo aquellas proteínas que contengan la
etiqueta de histidina van a quedar ligadas a la matriz, cuando se añade el tampón
de elución, que contiene imidazol, éste hará que la proteína se separe de la
histidina unida a la matriz por medio del níquel, y por lo tanto la proteína eluya.
El extracto crudo se carga en una columna de afinidad de histidinas HiTrap 5mL
(GE Healthcare), equilibrada previamente con el tampón de equilibrado (fosfato
sódico 20mM, 20mM imidazol y 0,5M NaCl pH7,4) utilizando el sistema
ÄKTAprime plus (GE Healthcare). Se lava la columna con el tampón de
equilibrado hasta que las proteínas inespecíficas eluyen y finalmente se eluye
nuestra proteína de interés mediante un gradiente con el tampón de elución
(fosfato sódico 20mM, 500mM imidazol y 0,5M NaCl pH7,4) de 0 hasta el 100%
de imidazol, tomándose facciones de 2mL.
Las proteínas presentes en las fracciones seleccionadas están en imidazol y, por
tanto, se dializan pasándolas a tampón fosfato sódico 20mM, y 0,5M NaCl pH7,4
mediante una columna Amicon Ultracel 3k (Millipore) siguiendo las instrucciones
del fabricante.
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Para realizar la medida de la concentración proteica se utilizó el método de
Bradford (Bradford, 1976). Se cuantifican las muestras obtenidas de las
diferentes etapas de purificación, utilizando el kit Bio-Rad Protein Assay
(BioRad). Una vez realizada la mezcla de la muestra con el reactivo Bradford, se
espera 15 minutos y se lee la absorbancia a 595nm en el lector Bio Tek Synergy
H1 Hybrid Reader. Los valores de absorbancia son interpolados a una recta
patrón, previamente hecha con un rango de concentraciones de 0,05 mg/mL a
0,5 mg/mL de seroalbúmina bovina (BSA).
SDS-PAGE
Se realizó un gel desnaturalizante SDS-PAGE (electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) al 10% de acrilamida, para ver la
eficiencia de las diferentes etapas de purificación (Raol et al., 2015). Para ello,
las muestras se calientan a 95°C con el tampón de carga durante 10 min, se
carga el gel con una concentración de proteína de 15µg para cada muestra, se
deja correr por aproximadamente 1h a 150 mA, pasado el tiempo el gel se tiñe
con azul de Coomassie durante 10min en agitación constante. Después, se hace
un lavado con agua y se deja 12h a temperatura ambiente en agitación, se
visualiza en una cámara de UV.
Ensayo de pH óptimo
En este ensayo se van a realizar medidas de actividad a diferentes niveles de
pH utilizando ONPG como sustrato. Se realiza una dilución 1:100 de la enzima,
en 150 µL de Britton-Robinson buffer (se va a trabajar con pH de 5, 5.5, 6, 6.5,
7, 7.5, y 8) (Wierzbicka-Woś et al., 2013). La mezcla se calienta durante 5 min a
80ºC, y se agregan 150µL de ONPG (4 mg/mL). Cuando se observa una
coloración amarilla, se retira y se ponen 100µL de la muestra más 100µL de
Na2CO3 (1M), se anota el tiempo que tardó en tomar la coloración amarilla. El
blanco lleva 150µL de Britton-Robinson buffer con el pH correspondiente, se
hacen triplicados y se mide a la absorbancia a 440nm.
Ensayo de temperatura óptima
El en el ensayo de temperatura óptima, la enzima se diluye 1:100 en 150 µL de
buffer Z. Se calienta la muestra durante 5 min a un rango de temperaturas de
65ºC-90ºC. Pasado el tiempo, se agregan 150µL de ONPG (4mg/mL) para
iniciar la reacción. Cuando se observe la coloración amarilla se toman 100µL de
la muestra y se agregan 100µL de Na2CO3 (1M), para parar la reacción. Como
blanco se utiliza 150µL de buffer Z. Se mide la absorbancia a 440nm. Todas las
medidas se hacen por triplicado.
Ensayos de cinética enzimática
· ONPG
El sustrato artificial o-nitrofenil-D-galactopiranósido (ONPG) es comúnmente
utilizado para cuantificar la actividad beta-galactosidasa (Wang et al., 2014;
Zhang et al., 2013).
Para este ensayo, la proteína previamente purificada se diluye en 150 µL de
buffer Z (100mM de Na2HPO4, 40mM de NaH2PO4, 10mM de KCl, 1,6 de MgSO4)
y se incuba durante 5 min a 80°C. La reacción se inicia cuando se agregan los
150µL de ONPG (4mg/mL). A continuación, se espera a que se presente una
coloración amarilla, momento en el que se saca y se ponen 100µL de la muestra
en una placa y se le adicionan 100µL de Na2CO3 (1M) que detienen la reacción.
El o-nitrofenol liberado se mide por absorbancia a 440 nm. Las mediciones se
hacen por triplicado.
La actividad β-galactosidasa es expresada en unidades enzimáticas (U),
definidas como la cantidad de enzima capaz de liberar un µmol de producto (o-
nitrofenol) por minuto (µmol*min-1*mL-1) en las condiciones experimentales. El
ajuste no lineal se basó en los mínimos cuadrados para inferir los parámetros
cinéticos enzimáticos de los gráficos de Michaelis-Menten, utilizando Prime 6.00
para Windows (GraphPad Software Inc.).
· Lactosa
La cinética de hidrólisis de la lactosa se determina por la glucosa producida por
la enzima a diferentes concentraciones de lactosa. Las muestras purificadas se
diluyen en buffer Z y la velocidad inicial se mide por triplicado con 4,188 µg mL-1
de enzima y una concentración de lactosa de 0 a 80 mM. Se utilizan tiempos de
reacción de 6-10 min a 80°C. Posteriormente, la reacción se detiene calentando
a 96ºC durante 5 min. La actividad β-galactosidasa se expresa en unidades
enzimáticas (U), definidas como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µmol
de producto (D-glucosa) por minuto en las condiciones experimentales
(µmol*min-1*mL-1). La concentración de glucosa liberada se mide utilizando el kit
comercial D-Glucose GOD-POD (Nzytech). Finalmente se realiza el ajuste no
lineal mediante el método de los mínimos cuadrados para inferir los parámetros
cinéticos enzimáticos de los gráficos de Michaelis-Menten (a través de Prism 6).
Ensayo de iones
Se lleva a cabo este ensayo con la finalidad de saber el comportamiento de la
enzima p37 en unión con diferentes iones metálicos (Adalberto et al., 2010). Para
ello, se toman 500µL de la enzima p37 purificada y se diluye hasta 5mL de
TrisHCl (100mM pH7 con EDTA 10mM pH7) y se deja 1h a 4°C con agitación
continua. A continuación, se lleva a cabo una cromatografía de exclusión con
tampón TrisHCl 100mM pH7 con el fin de eliminar el EDTA. Para ello, se utilizó
una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare) acoplada al sistema
ÄKTAprime plus (GE Healthcare).
Se concentra la proteína con una columna Amicon Ultracel 3k (Millipore),
siguiendo las instrucciones del fabricante, resultando en p37+EDTA purificada.
Se llevan a cabo los ensayos de actividad de la proteína con ONPG (4mg/ml) y
los iones a las siguientes concentraciones finales en tampón TrisHCl 100mM
pH7: MgCl2 10mM, KCl 10mM, NaCl 10mM, MgCl 10mM, ZnSO4 1mM y CuSO4
1mM. Para ello se siguió el mismo protocolo descrito en los apartados anteriores:
incubación 5 min a 80ºC, adición de 150 µL de ONPG y parada de la reacción
con 100µL de Na2CO3 (1M). Se mide por absorbancia a 440 nm. Las reacciones
se hacen por triplicado.
Resultados y discusión
Crecimiento celular e inducción de la proteína
En la figura 1 se observa la curva de crecimiento del cultivo de E.coli T7Express
C2566 con la construcción pET21ap37. Esta curva es similar a la observada en
otros ensayos (Fujikawa et al., 2004).
Figura 1. Curva de crecimiento del cultivo de E.coli.
Purificación
De los pasos de purificación que se llevaron a cabo, se puede observar que el
paso previo de calentamiento a 70°C durante 10 minutos permite la
desnaturalización y precipitación de gran parte de las proteínas no termoestables
de E.coli (Figura 2), como ya había sido descrito por (Pessela et al., 2004). Por
ello, la proteína ya presentaba un grado de pureza adecuado tras el tratamiento
térmico, lo que lleva a pensar que en sucesivas purificaciones no sería necesaria
la purificación posterior por histidinas, ya que la proteína aguanta temperaturas
altas sin desnaturalizarse
Figura 2. Gel de electroforesis, M: Marcador, 1: Extracto Crudo sin calentar 2: Extracto crudo
calentado a 70°C 3: Flow through 4: P37 purificada en cromatografía de afinidad.
En la cromatografía de afinidad (Figura 3) se observa un solo pico que presenta
un grado elevado de pureza y concentración, como pudo comprobarse en el gel
de electroforesis (Figura2). La ausencia de banda de proteína p37 en el flow
through pone de manifiesto que la etiqueta de histidinas de la proteína ha
funcionado adecuadamente y que ésta es una técnica eficaz de purificación
(Figura 2).
Figura 3. Cromatografía de afinidad para p37.
Cuantificación de la concentración de proteína por el método de Bradford
Para determinar la concentración de la proteína, previamente se hace una recta
patrón, con un rango de concentración de 0,05 mg/mL a 0,5 mg/mL de
seroalbúmina bovina (BSA). Para esta recta se siguió el mismo protocolo que
para las muestras, determinándose la absorbancia a 595nm. Cuando se
obtuvieron las lecturas de absorbancia a 595nm de las muestras, se interpolaron
en la recta patrón y se calculó la actividad, concentración, actividad total y
rendimiento de la proteína, que se recogen en la tabla 1.
Tabla 1. Tabla de purificación de proteínas en cada una de las muestras analizadas.
Muestras
Actividad
(U/mL)
Concentración
proteína
(mg/mL)
Actividad
específica
(U/mg)
Factor de
purificación
Extracto
crudo
s/calentar
77.68 15,821 4.91 -
Extracto
crudo
calentado
70ºC
32.37 2,378 13,61 2,77
Flow
through
18,10 0,791 4,32 -
p37
purificada
274.50 4,189 65,53 13,35
Temperatura y pH óptimos
Por lo general, las proteínas termófilas presentan un conjunto de modificaciones
en su estructura que las convierten en una estructura mucho más compacta y
rígida, lo cual hace que tengan una mayor resistencia a la desnaturalización
térmica con respecto a las proteínas mesófilas (Helene Chautard, Emilio Blas-
Galindo, Thierry Menguy, Laure Grand’Moursel, Felipe Cava, 2008; Zhang et al.,
2013). Los resultados obtenidos en la determinación de la temperatura óptima
de la enzima p37 ponen de manifiesto que la mayor actividad enzimática tiene
lugar a 80°C, lo que demuestra el origen termófilo de la enzima (Figura 4). Esta
temperatura óptima es incluso superior a la descrita para otros microorganismos
termófilos como Bacillus stearothermophilus (Chen et al., 2008) o Deinococcus
geothermalis (Lee et al., 2011) y es comparable a la temperatura óptima de la β-
galactosidasa de Thermotoga maritima (Li et al., 2009).
Figura 4. Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima p37.
Una vez determinada la temperatura óptima, se ha estudiado el efecto del pH en
la actividad de la enzima p37 con el fin de determinar su pH óptimo. En la figura
5 se observa que la máxima actividad enzimática tiene lugar a pH 7. Este
resultado es comparable con los valores de pH óptimo de otras β-galactosidasas
de origen termófilo como la de Lactobacillus thermophilus (Mlichová and
Rosenberg, 2006), la de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii
ssp. Bulgaricus (Ustok et al., 2010), Saccharomyces fragilis (Wendorff and
Amundson, 1971) o la del mesófilo Kluyveromyces lactis (Ramírez Matheus and
Rivas, 2003) que tienen un pH óptimo de 7. Estos valores nos señalan que la
enzima tiene características idóneas para poder utilizarse en la industria láctea,
ya que se trata de una enzima termoestable y con pH neutro que podría servir
para realizar procesos lácticos sin alterar la calidad del producto, la enzima p37
puede soportar temperaturas altas, y mantenerse estable con un funcionamiento
normal, sin que haya pérdida de actividad.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
55 60 65 70 75 80 85 90
% A
ctiv
ida
d
Temperatura (ºC)
Figura 5. Efecto del pH en la actividad de la enzima p37.
Ensayos de cinética enzimática
La proteína p37 tiene mayor afinidad hacia el sustrato ONPG que con la lactosa,
en función de Km como se puede ver en la tabla 2, con una velocidad máxima
de 42,74 U/mg con ONPG y 25,86 U/mg en lactosa, este resultado en lactosa es
muy parecido al de la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis (Rico-Díaz et al.,
2017). La constante de especificidad (Vmax/Km) es de 36,85 con ONPG, lo que
demuestra el alto poder catalítico de la enzima con el sustrato ONPG, este da un
valor superior al de Aspergillus tubingensis (Raol et al., 2015), y mayor que el de
la lactosa donde da un valor de 1,98.
Tabla 2. Actividad de p37 con ONPG y Lactosa
ONPG Lactosa
Km (mM) 1,16±0,421 13,05±1,694
Vmax (U/mg) 42,74±3,93 25,86±1,034
Vmax/Km 36,85 1,98
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
55 60 65 70 75 80 85 90
% A
ctiv
ida
d
Temperatura (ºC)
Ensayo de iones
Se tomó como 100% de actividad la medida con la enzima p37 sin EDTA, cuando
se le adicionó el EDTA como quelante a 10mM se vio que la actividad no había
disminuido, así que se decidió por subirlo a una concentración de 250mM, se
observó una disminución drástica en la actividad de la proteína en este caso. La
proteína tratada con EDTA 10mM en presencia de NaCl, mantiene el 100% de
su actividad, mientras que con CuSO4 y ZnSO4, se ve disminuida. Como se ha
comprobado los iones CaCl2, NaCl, MgCl2 son activadores de la reacción de
hidrólisis en la β-galactosidasa de Kluyveromyces fragilis y Lactobacillus reuteri,
y los iones CuSO4 y ZnSO4 bajan la actividad de la β-galactosidasa de Bacillus
licheniformis resultados que concuerdan con los de la enzima p37 (Akcan, 2011;
Bzdrenga et al., 2014; Mlichová and Rosenberg, 2006; Zolnere et al., 2017).
Tabla 2. Determinación del efecto de diferentes iones sobre la actividad enzimática de p37.
Muestra % Actividad
Sin EDTA 100
EDTA (10mM) 101.11
NaCl (10mM) 100.78
CaCl2(10mM) 94.68
MgCl2(10mM) 91.92
KCl (10mM) 92.86
CuSO4 (1mM) 0.29
ZnSO4 (1mM) 0.24
EDTA (250mM) 30.21
Conclusiones
En el presente estudio se ha llevado a cabo con éxito la sobre-expresión de la
proteína p37, de origen metagenómico, en células E.coli T7 express C2566. Tras
la lisis celular y obtención del extracto crudo, gran parte de las proteínas de E.coli
se han eliminado eficientemente por calentamiento térmico a 70ºC pasando a un
o factor de purificación de 2,77. A continuación, se ha concentrado y purificado
más la proteína p37 mediante cromatografía de afinidad, obteniéndose un factor
de purificación de 13,35 y una actividad específica de 65,53 U/mg. Los ensayos
del efecto del pH óptimo y la temperatura sobre la actividad β-galactosidasa de
la enzima ponen de manifiesto que presenta un pH óptimo de 7 y una
temperatura óptima de hidrólisis de ONPG de 80ºC. Asimismo, se han
determinado las constantes enzimáticas de la proteína determinándose una Km
de 1,16 mM demostrando una alta afinidad por ONPG y una Km de 13,05 mM
que determina una menor afinidad por la lactosa. En cuanto al efecto de los
iones, se observa una clara inhibición de la actividad por la adición de CuSO4
(1mM) y ZnSO4 (1mM).
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