Turbidimetri og nefelometri
Transcript of Turbidimetri og nefelometri
![Page 1: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/1.jpg)
Turbidimetri og nefelometri
Olav KlingenbergOverlege, dr.med
Avdeling for medisinsk biokjemiOUS-Rikshospitalet
![Page 2: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/2.jpg)
Nefelometri
Turbidimetri
Partikler
![Page 3: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/3.jpg)
Hva slags partikler sprer lys?• Molekyler
– Gassmolekyler (<1 nm)– Proteiner (albumin 7 nM, IgG 10-15 nM)
• Immunkomplekser
• Latexpartikler, agglutinerteAktuellefor oss
![Page 4: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/4.jpg)
Hva slags lys?
• Ofte laser, ulike kilder• Nefelometri krever intenst lys• Spenn i bølgelengder, synlig lys (++)• BN ProSpec: 840 nm
![Page 5: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/5.jpg)
Lysspredning -Rayleigh spredning• små partikler i forhold
til bølgelengde (<λ/10)
-Rayleigh-Debye • (λ-λ/10)
-Mie spredning• store partikler i forhold
til bølgelengde (>λ)
![Page 6: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/6.jpg)
Derfor er himmelen blå.(Vårt øye er mindrefølsomt for fiolett lys)
Rayleigh spredning
• Intensitet omvendt proporsjonal med lysets bølgelengde i 4. potens
• Proporsjonal med partikkeldiameter i 6. potens• Mie-spredning mer kompleks matematikk...
![Page 7: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/7.jpg)
NefelometriKan måle ved 90 grader (<λ/10) eller mindre vinkler (>λ)Liten målevinkel teknisk krevende, skilles fra innfallende lysBN ProSpec: Immunkomplekser (latex-partikler) >1000 nM
→Mie spredning, måler ved 13-28 graders vinkelNefelometri - lav partikkelkonsentrasjon
![Page 8: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/8.jpg)
Optikk - BN ProSpec
![Page 9: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/9.jpg)
Turbidimetri
• Måler reduksjon i gjennomfallende lys– Absorpsjon, lysspredning– Enklere instrumentering, spektrofotometer– På klinisk kjemiske storinstrumenter– Relativt høy partikkelkonsentrasjon
![Page 10: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/10.jpg)
Type analyse
• Endepunktsanalyse• ”Fixed-time” analyse• Kinetisk analyse
Tid
![Page 11: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/11.jpg)
Endepunktsanalyse• Enkel• Uavhengig av
matriks betingede ulikheter i kinetikk
• Lang analysetid• Monitorerer ikke
reaksjon
![Page 12: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/12.jpg)
”Fixed-time” analyse
• Teknisk enkelt• Bakgrunn fratrukket
The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or the image may have been corrupted. Restart your computer, and then open the file again. If the red x still appears, you may have to delete the image and then insert it again.
t2t1
t2-t1• Ulik kinetikk i prøve og
kalibrator (ag-kons.avh.)• Ganske lang analysetid• Ikke monitorering
![Page 13: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/13.jpg)
Kinetisk analyse(VLinIntegral metode)
Topphastighet proporsjonal med analyttkonsentrasjon
• Kort analysetid• Monitorere → muligheter• Spesifisitet (høyaffinitets-ast.)
Hyppig/kontinuerlig måling
• Litt lavere sensitivitet• Krever mer av instrument, tidspunkt
varierer med konsentrasjon• Mer følsomt for pH, effekt av ioner
![Page 14: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/14.jpg)
Reagens-betraktninger
• Buffer– Ioner -
• Chaotrope: hemmer Ag-Ast-binding– Polyetylenglykol -
• øker reaksjonshastighet (ekskluderer andre molekyler fra >8x sitt eget volum)
Chaotrope Antichaotrope
![Page 15: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/15.jpg)
Reagens-betraktninger
• Antistoff– Monoklonalt (epitoptall, mix) - polyklonalt
![Page 16: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/16.jpg)
• Heidelberger-Kendall kurveAntistoff overskudd Antigen overskuddEkvivalens
Antigen excess
Lys-spredning
AntigenkonsentrasjonNB! Dette er ikke en reaksjonskurve, men måling av prøver med ulik konsentrasjon
![Page 17: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/17.jpg)
Antistoff overskudd Ekvivalens Antigen overskuddTilstand
Reaksjon
Signal
Ved antigen excess binder antistoffmolekylene hver sine antigenmolekyler. Det dannes lite kryssbindinger,partikkeldiameteren blir liten, og lysspredning lav.
![Page 18: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/18.jpg)
Deteksjon av antigen excess- Prereaksjon
• Liten del av prøvevolum tilsettes først. Hvis signal høyere enn terskel →antigen excess →høyere fortynning
Prereaksjonstid
Fraksjon tilsatt
Lysspredning
Prereaksjonsterskel
Reaksjonstid
Hele tilsatt
Antigen excess
Ikkeantigen excess
![Page 19: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/19.jpg)
Deteksjon av antigen excess-Tilsats av kalibrator
• Evt. mer prøve tilsettes i stedet for kalibrator
Reaksjons-hastighet
![Page 20: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/20.jpg)
Deteksjon av antigen excess- Vurdering av kinetikk
• Tidlig vs. sen økning
• F.eks. Ratio First/Second First/ Third
Hvilken kurve representererantigen excess?
![Page 21: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/21.jpg)
Deteksjon av antigen excess...siste utvei
• Reanalyse av alle prøver i høyere prøvefortynning– dyrt– tidkrevende
![Page 22: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/22.jpg)
Interferens
• Gunstig med høy prøvefortynning• Lipemi - sentrifugere/rensende substans
– hemolyse, hyperbilirubinemi, medikamenter -lite problem ved nefelometri
• Heterofile antistoffer / RF– fortynning– blokkerende substanser– Fc-frie reagenser
![Page 23: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/23.jpg)
Partikkelforsterkede assays
• Gir høyere sensitivitet(x 100-1000)
• Både turbidimetri og nefelometri• Små partikler (20- 700 nm)
– Diameter - bølgelengde– FLC: 184 nm– CRP: 180 nm
• Mulighet for ulike assays...
Polystyren-kjerne
Lag med reaktive grupper
Antistoff
![Page 24: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/24.jpg)
Direkte agglutinasjon
Partikler dekket medantistoff
Prøve medeller utenanalytt
Agglutinasjon (positiv)
Ikke agglutinasjon (negativ)
![Page 25: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/25.jpg)
Konkurrerende hemming
Partikler dekket medantigen (analytt)
Prøve medeller utenanalytt
Ikke agglutinasjon (positiv)
Antistoff
Agglutinasjon (negativ)
Særlig aktuelt formonovalent antigen
![Page 26: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/26.jpg)
Konkurrerende hemming, dobbel partikkel
To typer partikler, dekket medantigen ellerantistoff
Prøve medeller utenanalytt
Ikke agglutinasjon (positiv)
Agglutinasjon (negativ)
![Page 27: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/27.jpg)
Nefelometri
Turbidimetri
![Page 28: Turbidimetri og nefelometri](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022012309/58888bfe1a28abe02d8c00bc/html5/thumbnails/28.jpg)
Nefelometri
Turbidimetri