7/22/2019 tugas TABM.docx

1/8

TEKNIK ANALISA BILOGI MOLEKULER

Tipe Modifikasi PCR dan Resume Jurnal

Ismi Nurjannah 125130101111058

2012-D

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2014

7/22/2019 tugas TABM.docx

2/8

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode

enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu

dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B.

Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Pada awal perkembangannya

metode PCR hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, namun kemudiandikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan

melakukan kuantitasi molekul mRNA. Saat ini metode PCR telah banyak digunakan untuk

berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.

Metode PCR tersebut sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk

melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan

gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Dengan menggunakan metode

PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 510 9 mol) sebesar

200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Mullis dan Fallona, 1989).

Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secaracepat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan menggunakan

komponen dalam jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan (template) yang diperlukan

hanya sekitar 5 g, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini bisa

dilakukan dalam volume 50100 l.

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu:

1. DNA cetakan / DNA targetMerupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA

target.2. Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan

basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak

sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan

primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :

a. Panjang primer : 15-30 pbb. Kandungan GC sekitar 50%c. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbedad. Urutan nukleotida yang sama harus dihindarie. Tidak boleh terjadiself dimmer, pair dimmer, atau hairpin

3. DNA PolimeraseMerupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq

DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi

DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air.

4. Buffer / DaparBuffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 Yang

mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase.

5. dNTPS

7/22/2019 tugas TABM.docx

3/8

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang

berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan

nukleotida dari DNA target

PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampumengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR

melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase

yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang

digunakan berasal dari bakteri Thermusaquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu

lebih dari 90 oC. Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR

yaitu

1. DenaturasiPada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94 oC yang menyebabkan

terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA

tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan Dibuat

2. Penempelan (Annealing)Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada

seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30

pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang

pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada

target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik.

3. Pemanjangan (Ektension)Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan

memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer,DNA cetakan dan nukleotida.

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk

akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA

menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi

DNA cetakan baru secara eksponensial.

Sejak pertama kali diperkenalkan, teknik PCR telah berkembang sangat pesat dan

diaplikasikan untuk bemacam-macam tujuan, baik untuk riset dasar maupun aplikasi praktis.

Pada aspek metodologinya, teknik PCR yang pertama kali diperkenalkan memerlukan banyak

kondisi khusus untuk menjamin keberhasilannya. Sebagai contoh, pada awalnya teknik PCR

hanya digunakan untuk mengamplifikasi molekul DNA dengan menggunakan DNA sebagai

bahan awal (starting material) yang akan digunakan sebagai cetakan.Dalam hal ini molekulDNA yang aakan diamplifikasi harus diisolasi terlebih dahulu dari sel atau jaringan.

Perkembangan lebih lanjut teknik ini memungkinkan para peneliti menggunakan molekul

RNA sebagai bahan awal, yaitu dengan berkembangnya teknik Reverse Trancriptase PCR

(RT-PCR). Selain itu, sekarang juga dikembangkan teknik PCR yang tidak memerlukan

langkah isolasi molekul DNA terlebih dahulu sebelum diamplifikasi. Dalam hal ini PCR

dapat dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan sebagai bahan awal tampa harus

melakukan isolasi DAN secara khusus. Dengan teknik ini, PCR dapat dilakukan di dalam sel

7/22/2019 tugas TABM.docx

4/8

atau jaringan tersebut sehingga teknik ini dikenal sebagai PCR In Situ. Selain itu, teknik PCR

sekarang juga dapat dilakukan secara efisien untuk amplifikasi molekul DNA yang

panjang.terdapat beberapa tipe danmodifikasi dari PCR yaitu :

1. REAL-TIME PCRTeknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasiltranskripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum

teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan

dengan metode hibridisasi In Situ, northern blot, dot blot, atau slot blot, analisis

menggunakan S1 nuklease, atau dengan metode pengujian proteksi RNAse

(RNAse protection assay). Teknik RT-PCR dikembangkan untuk mengatasi

kelemahan-kelemahan metode PCR yang lain. RNA tidak dapat digunakan

sebagai cetakan pada teknik PCR, oleh karena itu perlu dilakukan proses

transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul mRNA sehingga

diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebut

kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini

sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum

dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun

penyakit genetik. Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (DNA

polymerase) yang bisa menggunakan molekul DNA (cDNA) sebagai cetakan

untuk menyintesis molekul cDNA yang komplementer dengan molekul RNA

tersebut. Beberapa enzim yang bisa digunakan antara lain mesophilic viral reverse

transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun

oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA polymerase.

RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif danmampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA

polymerase mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1-2 kb.

Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV

mempunyai aktivitas RNAse H yang akan meyebabkan terjadinya degradasi RNA

dalam hybrid RNA-cDNA. Aktivitas semacam ini dapat merugikan jika

berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama

cDNA. Enzim RTase yang berasal dari M-MuLV mempunyai akyivitas RNase H

yang lebih rendah dibanding dengan yang berasal dari AMV.

Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37o C, sedangkan

enzim AMV pada suhu 42o C dan Tth DAN polymerase mencapai aktivitas

maksimum pada suhu 60-70o C. Penggunaan enzim M-M-MuLV kurang

menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur

sekunder yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang

menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn karena ion

Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian,

enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karena dapat digunakan

untuk reaksi transkripsi balik sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi.

Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam

primer yaitu :

7/22/2019 tugas TABM.docx

5/8

a. Oligo(dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang akna melekat pada ekor poli(A)pada ujung 3 mRNA mamalia. Primer semacam ini pada umumnya

akan menghasilkan cDNA yang lengkap.

b. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yangkomplementer pada bagian manapun. Primer semacam ini akanmenghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial).

c. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untukmenyalin mRNA tertentu.

2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction.

Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa.

Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus

tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA)

dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah

suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan

template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga

diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan

PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena

primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang

mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang

mempunyai poly(A) tail pada ujung 3, maka oligo dT, random heksamer, maupun

primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa

cDNA.

3. NestedPCRMerupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan

bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk

mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen

yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk

kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR

yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa

berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak.

Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa

hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA dari

nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu

yang diperlukan dalam reaksinested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena

pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1

kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan

kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer. Mekanisme

kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA

mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan. Fase Penempelan,

sepasang primer pertama melekat di ke dua utas tunggal DNA dan

mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk

PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan pada

proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan

7/22/2019 tugas TABM.docx

6/8

mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR

pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya

adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR

pertama.

4.

MULTIPLEX-PCRMultiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal

untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens

DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat

diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen

dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-

masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi

tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda

cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan

elektroforesis gel

5. PCR-ELISAPCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat

yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana

dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan

metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal

pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan

metode Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan

telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR.

Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequentersebut, ELISA

PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran darisequen yang diinginkan. ELISA PCR ini jugaberguna untuk screening beberapa

sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang

paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan

antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat

primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar

primer.

7/22/2019 tugas TABM.docx

7/8

Resume Jurnal

Judul jurnal : Identification of Meat Species by Polymerase Chain Reaction (PCR)

Technique

Banyak metode yang dapat digunakan dalam identifikasi asal spesies dari daging

mentah termasuk didalamnya sensor analisis, perbedaan histologi yang pada daging dapat

digunakan sebagai acuan dalam identifikasi asal daging dalam hal ini yang dimaksud asal

daging adalah jenis hewan ap, selain itu dapat juga menggunakan acuan jenis jaringan lemak,

level glikogen dan jaringan otot yang dgunakan dalam uji elektroforesis dan DNA hibridisasi.

Namun dua metode tersebut memilki kekurangan dalam spesifitas, compleksitas, biaya uji

yang mahal dan beberapa syarat data dasar tentang perbedaan komposisi protein sehingga

diperlukan metode yang lebih baik lagi.

Dalam biologi molekular terdapat beberapa teknik ang dapat digunakan dalamidentifikasi baik pada tumbuhan hewan ataupun pada bakteri diantaranya adalah PCR

(polymerase chain reaction), RLFP (restriction fragment length polymorphism), dan RAPD

(random amplified polymorphic DNA). Tehnik tersebut juga dapat digunakan dalam

indentifikasi asal daging mentah. Dengan menggunakan metode PCR identifikasi daging

dilakukan dengan menggunakan primer spesies spesifik yang menggunakan sensitifitas dari

uji sehingga hasil yang didapatkan lebih akurat.

Dalam melakukan uji digunakan sampel dari jaringan otot(daging) dari berbagai

hewan yaitu kambing, babi, kuda,kucing, dan anjing. Yang dicampurkan pada daging sapi

dengan konsentrasi yang berbeda beda. Daging sebelumnya dihaluskan dan dicampur denganmerata

DNA diekstraksi dari sampel daging dengan sampel dihomogenkan dengan larutan

TNES 4 ml yang mengandung 20 mM Tris dengan pH 8,0, 150 M NaCl dan 10 M. Dalam

tabung poyprophilen kemudian 750 l hasil homogenisasi di mmasukan ke tabung ependorf

1,5 ml kemudian ditambahkan proteinase K dan 10 % SDS campuran itu kemudian di

homogenkan lalu disimpan pada suhu 58 c selama 8 jam kemudian ditambahkan Nacl 6 M

disentrifugasi kemudian lapisan teratasnya sebanyak 400 mikro liter dipindahkan ke tabung

lain dan ditambah dengan 300 l phenol choloroform isoamyl alcohol dan dilanjutkan pada

tahap-tahap selanjutnya hingga didapatkan ekstraksi DNA yang diinginkan. Kemudian DNA

yang telah di ekstraksi digunakan dalam PCR.

Dilakukan perbandingan antara DNA yang didapat dengan DNA asal masing masing

hewan dan didapatkan hasil yaitu tidak ada interaksi atau terjadinya reaksi antara DNA dari

masing masing jenis daging sehingga DNA dari tiap jenis daging hewan tetap terdetaksi

saling memisah. Tdak ada primer yang saling bereaksi silang dengan DNA dari spesies lain.

Uji ini berhasil pada pencampuran 5% 2,5% 1% dan 0,5% tapi tidak terbaca pada campuran

0,1 %.

7/22/2019 tugas TABM.docx

8/8

Identifikasi asal spesies daging dan produk asal daging penting dilakukan karena

sebab-sebab kesehatan, etika dan ekonomi. Jika dibandingkan dari beberapa teknik analisis

yang ada diantaranya adalah immunodifusi, immunoelektroforesis, isoelectric focusing, dan

hibridaisasi DNA dalam penentuan atau identifikasi spesies asal daging. Hibridisasi DNA

lebih dapat diandalkan karena lebih sensitif walaupun dalam pelaksanaannya lebih rumit danmembutuhkan wakktu yang lebih lama. Selain itu biaya yang diperlukan juga cukup besar.

Sedangkan dengan menggunakan teknik PCR dapat dilakukan identifikasi atau di deteksi

adanya campuran daging dari spesies lain pada daging sapi dengan kadar 0,5% dengan

menggunakan teknik duplex PCR. Hal ini menunjukan bahwa teknik PCR juga memiliki

spesifitas yang tinggi dan dapat mendeteksi adanya campuran lain dalam daging ataupun

bahan lainnya dalam jumlah kecil dan dapat digunakan dalam pemeriksaan pemalsuan bahan

makanan.

Dalam pengolahan daging dengan lebih dari 1 jenis spesies daging, bisa saja terjadi

kontaminasi yaitu tercampurnya sebagian daging ke jenis daging lainnya karena selamaproses menggunakan peralatan yang sama. Dengan alalisis PCR dapat dideteksi adanya

kontaminasi atau campuran pada daging ataupun pemalsuan produk karena spesifitasnya

yang tinggi maka walaupun kontaminasinya cukup rendat tetap dapat di identifikasi.

Teknik PCR bisa jadi sangat berguna untuk efektifitas kontrol konsumen terhadap

produk asal hewan khususnya daging dan pemalsuannya. Selain itu dapat juga digunakan

untuk monitoring pakan ternak ruminansia dari bahan asal hewan yang banyak dilarang di

berbagai negara karena dapat menyebabkan bovine spongiform enchephalophathy