Étude de la fonctionnalité et des propriétés des ...
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© Daphné Govare-Monroe, 2020
Étude de la fonctionnalité et des propriétés des transporteurs d'influx Lsi1 du silicium chez les
plantes
Mémoire
Daphné Govare-Monroe
Maîtrise en biologie végétale - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
i
ii
Résumé
Le silicium (Si) ne figure pas parmi les éléments essentiels des plantes, mais son effet
prophylactique contre divers stress biotiques et abiotiques a été rapporté chez plusieurs
espèces. Il existe toutefois une grande variabilité du taux d’absorption du Si au sein du règne
végétal, qui est corrélée avec la protection que les plantes en retirent. Cette variabilité
s’explique par un transporteur d’influx (Lsi1), une aquaporine de la famille des NIPIII qui
assure la perméabilité du Si au niveau des cellules racinaires. Un filtre sélectif
aromatique/arginine (ar/R) de type G-S-G-R est aujourd’hui reconnu comme étant essentiel
pour la sélectivité du Si, bien que de nouvelles données suggèrent autrement. L’objectif a été
d’étudier la fonctionnalité du transporteur Lsi1 afin de déterminer le premier résidu clé du
filtre sélectif impliqué dans la sélectivité du Si. Différentes substitutions d'acides aminés ont
été étudiées dans le filtre ar/R chez les Lsi1 afin d’évaluer l’impact de ces mutations sur la
perméabilité au Si. L’étude a révélé que le résidu glycine à la première position du filtre
sélectif n’est pas essentiel à la sélectivité du Si. L’acide aminé glycine adjacent, très conservé
au sein des transporteurs de Si, a semblé en revanche plus décisif dans l’accumulation. Ces
résultats apportent une meilleure compréhension de la fonctionnalité du transporteur Lsi1
pour mieux exploiter ses propriétés bénéfiques. L’espèce Brassica napus figure parmi les
faibles accumulateurs de Si en raison de l’absence du gène Lsi1. Le deuxième objectif a été
de mesurer l’effet du Si chez les plants de canola transformés avec le gène Lsi1. Alors que
les plants transformés ont accumulé significativement plus de Si, il ne semble pas que la
différence ait été suffisante pour contrer la maladie causée par Leptosphaeria maculans. Des
études supplémentaires sont nécessaires en vue d’améliorer le taux d’absorption du Si chez
le canola.
iii
Abstract
Silicon (Si) is not considered an essential element for higher plants despite its prophylactic
role against many biotic and abiotic stresses. One of the most puzzling properties of Si is its
differential absorption by plants, which is correlated with the level of protection. This
variability would be explained by the presence or absence of an influx transporter (Lsi1), a
NIPIII aquaporin that allows Si absorption in roots cells. A selectivity filter aromatic/arginine
(ar/R) composed of four amino acids G-S-G-R is known to determine the selectivity for
silicic acid although new data suggest otherwise. The first objective of this project was to
determine the first key residue in the ar/R filter to optimize Si accumulation in plants. For
this purpose, we conducted several substitutions of residues within the filter and evaluated
the impact of each mutation on Si permeability. Our results revealed that the first glycine in
the filter is not required for permeability. On the other hand, the adjacent glycine, highly
conserved in many aquaporins, plays an essential role. These findings bring new insights into
the functionality of Lsi1 transporters that can be applied to better exploit the beneficial
properties of Si in agriculture. Brassica napus is considered as a low Si accumulator due to
the absence of a functional Lsi1. The second objective was to measure the effects of Si
absorption in canola plants transformed with the Lsi1 gene. Even if the transformants were
able to accumulate more Si, it seems that the difference was not enough to give a protection
against Leptosphaeria maculans. Additional studies are needed to improve Si absorption in
canola.
iv
Table des matières Résumé ................................................................................................................................... ii
Abstract ................................................................................................................................ iii
Liste des tableaux ................................................................................................................ vi
Liste des figures .................................................................................................................. vii
Remerciements ................................................................................................................... viii
Introduction .......................................................................................................................... 1
Hypothèses et objectifs ......................................................................................................... 3
Chapitre 1 : Revue de littérature ........................................................................................ 4
Le silicium ............................................................................................................................. 5
Le silicium dans l’environnement et chez les plantes .................................................... 5
Effets bénéfiques du Si chez les plantes .......................................................................... 6
Mécanismes d’action du Silicium .................................................................................... 9
Hypothèse mécanique ................................................................................................... 9
Hypothèse du Si soluble ................................................................................................ 9
Les transporteurs de Si ................................................................................................... 10
Les aquaporines ........................................................................................................... 11
Les transporteurs d’efflux Lsi2 .................................................................................. 15
Expression des transporteurs ..................................................................................... 16
Le canola (Brassica napus) ................................................................................................. 16
Leptosphaeria maculans ...................................................................................................... 17
Chapitre 2 : Étude fonctionnelle des transporteurs d’influx Lsi1 du silicium chez les
plantes .................................................................................................................................. 20
Introduction ........................................................................................................................ 21
Matériels et méthodes ......................................................................................................... 23
Résultats .............................................................................................................................. 29
Activité de transport en influx du Si chez les mutants de OsLsi1 dans les oocytes de
Xenopus ............................................................................................................................ 29
Activité de transport en influx du Si chez les mutants de EaLsi1 dans les oocytes de
Xenopus ............................................................................................................................ 30
Immunofluorescence ....................................................................................................... 31
Test de perméabilité à l’eau ........................................................................................... 33
Discussion ............................................................................................................................ 34
Chapitre 3 : Étude de l’accumulation en silicium et de la résistance à Leptosphaeria
maculans chez Brassica napus génétiquement modifié avec le gène Lsi1 ...................... 38
v
Introduction ........................................................................................................................ 39
Matériels et méthodes ......................................................................................................... 41
Résultats .............................................................................................................................. 44
Caractérisation des plantes transgéniques ................................................................... 44
Accumulation de Si chez le canola transformé avec VaLsi1 ....................................... 45
Accumulation de Si chez le canola transformé avec CaLsi1 ....................................... 46
Sévérité de la maladie causée par Leptosphaeria maculans chez les plants de canola
transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 et fertilisés en Si. ................................................. 47
Discussion ............................................................................................................................ 50
Conclusions générales ........................................................................................................ 55
Bibliographie ....................................................................................................................... 59
vi
Liste des tableaux Tableau 1 Amorces utilisées pour insérer le gène Lsi1 dans le vecteur Pol1 ...................... 24
Tableau 2 Amorces utilisées pour la mutagénèse dirigée ................................................... 25
Tableau 3 Amorces utilisées pour insérer l'épitope Myc dans les gènes Lsi1 ..................... 27
Tableau 4 Amorces utilisées pour détecter le transgène VaNIP2-1 ou CaNIP2-1 chez le
canola transgénique. ............................................................................................................. 42
vii
Liste des figures Figure 1 Activité en influx des transporteurs OsLsi1 et de ses mutants mesurée chez les
oocytes de Xenopus laevis. ................................................................................................... 30
Figure 2 Activité en influx des transporteurs EaLsi1 et de ses mutants mesurée chez les
oocytes de Xenopus laevis .................................................................................................... 31
Figure 3 Localisation des aquaporines et leurs mutants par immunofluorescence. ............ 32
Figure 4 Activité en influx des transporteurs de silicium (Si) contenant un tag Myc chez les
oocytes de Xenopus laevis. ................................................................................................... 33
Figure 5 Test de perméabilité à l’eau chez différentes aquaporines. ................................... 34
Figure 6 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert VaLsi1 chez les différents
plants de canola issus d’une transformation. ........................................................................ 44
Figure 7 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert CaLsi1 chez les différents
plants de canola issus d’une transformation. ........................................................................ 45
Figure 8 Contenu en silicium (Si) des feuilles de plants de canola Westar WT et de plants
transformés avec le gène VaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7
mM). ..................................................................................................................................... 46
Figure 9 Contenu en Si dans les feuilles chez les plants de canola Westar WT et les plants
transformés avec le gène CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7
mM). ..................................................................................................................................... 47
Figure 10 Aire des lésions causées par Leptosphaeria maculans sur les feuilles de plants de
canola Westar WT, de plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 fertilisés (Si+) ou
non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). ........................................................................ 48
Figure 11 Lésions causées par Leptosphaeria maculans chez des plants de canola non
transgéniques (WT), transformés avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou avec le
gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) traités ou non avec le silicium (Si) ........................ 49
Figure 12 Contenu en Si dans les feuilles centrales des plants inoculés avec Leptosphaeria
maculans chez le canola transgénique et non transgénique. ................................................. 50
viii
Remerciements
Ce projet, qui m’a permis d’acquérir une quantité considérable de connaissances et
d’aptitudes, n’aurait jamais été possible sans la confiance et le support offerts par mon
directeur Richard Bélanger. Vous êtes un professeur à l’écoute de vos étudiants, un excellent
conférencier et un chercheur d’une grande rigueur et passionné. Je dois avouer m’être
considérée particulièrement chanceuse de travailler dans votre laboratoire. Toutes les
conditions étaient rassemblées pour se sentir bien et pour progresser dans mes travaux et
apprentissages en toute confiance. Merci de m’avoir encouragée et conseillée tout au long de
mon projet. Votre disponibilité et votre appui ont fait une immense différence et je vous en
remercie. Ces deux dernières années ont été non seulement extrêmement enrichissantes d’un
point de vue professionnel, mais je garde également de très bons souvenirs du quotidien au
laboratoire.
Je souhaite également remercier Dr. Paul Isenring pour ses conseils et ses ressources offertes
dans son laboratoire qui ont été essentielles à l’avancement de mes travaux. Un grand merci
particulièrement à Marie-Jeanne qui a été spécialement présente auprès de moi tous les jours
lors de mes travaux dans votre laboratoire. Sa patience, son ouverture, ses encouragements
quotidiens ont rendu mes journées plus faciles et particulièrement agréables sans compter
toute l’aide qu’elle m’a apportée!
Merci à Devrim Coskun pour le temps accordé à me montrer tous les travaux liés aux
transporteurs. Il fut un mentor soucieux de ma compréhension et de ma réussite. Je remercie
aussi Partha Santhanam pour sa grande générosité et son aide en biologie moléculaire.
Évidemment, un immense merci à Caroline Labbé toujours disponible et ouverte à m’aider
autant lors de petites difficultés ou pour m’accompagner dans des tâches plus laborieuses.
Son travail a apporté une grande stabilité dans mes travaux au quotidien. Elle est étonnante
à voir aller avec une mémoire sans faille et une impressionnante polyvalence!
Merci aussi à tous les membres du laboratoire, avec lesquels j’ai adoré partager mes journées.
Merci à Amandine Lebreton pour son aide et son soutien moral. Merci à Matteo, Chloé,
Vanessa et Maxime et Geneviève pour nos discussions divertissantes et votre bonne humeur
constante. Finalement, je tiens à remercier mon conjoint Benjamin pour son écoute, ses
conseils et surtout sa patience.
1
Introduction
Parmi les nombreux défis auxquels est confrontée l’agriculture, on retrouve entre autres la
nécessité d’augmenter la production et les rendements tout en diminuant les impacts
environnementaux. Pourtant, cette augmentation de la demande alimentaire n’est pas sans
conséquences puisque cela entraine le recours aux pratiques intensives et l’utilisation à
grande échelle de pesticides chimiques. Dans un contexte planétaire de changements
climatiques, les cultures doivent souvent subir et résister à des stress supplémentaires comme
des sécheresse prolongées, l’arrivée massive d’insectes ravageurs ou le développement
sévère de maladies, entrainant par le fait même une augmentation des pesticides dans
l’environnement. La nécessité de développer de nouvelles stratégies de lutte durables pour la
protection des cultures figure donc parmi les priorités. Les recherches sur le silicium (Si) en
agriculture s’inscrivent directement dans cette perspective. Les effets bénéfiques du Si sur la
croissance, le développement, le rendement et en particulier sur la résistance aux maladies
ont été observés chez une grande variété d’espèces végétales. Cet élément est connu pour
apporter des effets positifs sur la croissance des plantes particulièrement lorsqu’elles sont
exposées à des conditions de stress. De plus, en dépit des concentrations auxquelles sont
exposées les plantes, le Si est l’unique élément qui ne cause jamais de phytotoxicité.
Le rôle prophylactique du Si chez les plantes fait de la fertilisation en cet élément une
approche de lutte contre les agents pathogènes en agriculture et a le potentiel de diminuer
l’utilisation de composés de synthèses souvent nuisible pour l’environnement (Liang et al.,
2015). Les études révèlent que certaines espèces végétales comme le riz, le concombre et la
prêle répondent très fortement à une fertilisation en Si, tandis que d’autres espèces, incluant
plusieurs dicotylédones, ne semblent pas répondre au traitement. En réalité, il existe une
variabilité d’absorption en Si chez les plantes et l’importance des effets bénéfiques est
directement liée au taux d’accumulation dans les tissus (Coskun et al., 2019). La découverte
des gènes Lsi1 et Lsi2, responsables de l’entrée de l’acide silicique dans les cellules racinaires
et du transport vers le xylème, expliquent aujourd’hui cette variabilité (Ma et al., 2006; 2007).
En effet, il a été reconnu que l’absence d’un transporteur Lsi1 fonctionnel était en cause dans
la faible accumulation en Si chez plusieurs espèces (Sonah et al., 2017). Ces observations
confirment que le Lsi1 est un déterminant clé pour l’entrée du Si dans les plantes. Ce premier
2
transporteur Lsi1 est une aquaporine de la sous-famille des Nodulin-26-like intrinsic
proteins-III (NIPIII). Chez ce type de protéine membranaire, un canal composé d’un
mécanisme de filtre, appelé le filtre ar/R, contrôle la sélectivité des molécules transportées.
Ce filtre sélectif est composé de quatre résidus participant directement au mécanisme de
contrôle du passage des solutés. Il est aujourd’hui reconnu que le transporteur Lsi1 des
plantes supérieures possède une signature moléculaire de type G-S-G-R au niveau de son
filtre ar/R (Coskun et al., 2019). Or, certaines plantes possèdent un Lsi1 fonctionnel composé
d’un filtre A-S-G-R permettant un transport élevé en Si (Trembath-Reichert et al., 2015).
Bien que l’identification des deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 soulève la possibilité
d’améliorer le taux d’absorption du Si chez les plantes, une meilleure compréhension des
déterminants moléculaires impliqués dans le transport de l’élément est nécessaire. La
première partie de ce mémoire est consacrée à l’étude du premier résidu du filtre ar/R
impliqué dans le contrôle du passage du Si chez l’aquaporine Lsi1.
Parmi les dicotylédones, la famille des Brassicacées comporte de nombreuses espèces
d’importance économique par la production d’huile et de légumes pour la consommation
humaine. La production de ces cultures est cependant affectée par une grande variété de stress
biotiques et abiotiques. Les membres de la famille des Brassicacées sont considérés comme
étant de faibles accumulateurs de Si, les empêchant ainsi de bénéficier des effets protecteurs
de cet élément. En outre, il a été démonté que des plantes ne possédant pas naturellement de
Lsi1, comme Arabidopsis, pouvaient devenir des accumulatrices de Si via l’introduction d’un
transporteur Lsi1 d’une autre espèce (Montpetit et al., 2012; Vivancos et al., 2015). La
deuxième partie du présent projet vise à mesurer l’effet d’un ajout du transporteur Lsi1 chez
le canola. L’espèce Brassica napus figure aujourd’hui comme l’une des principales cultures
d’oléagineux au monde (Canola Council of Canada, 2019). Au Canada, la superficie
ensemencée en canola a presque doublé au cours des 20 dernières années (Statistique-
Canada, 2018). Une capacité d’absorption en Si supérieure chez le canola pourrait constituer
une stratégie prometteuse pour améliorer la résistance aux divers stress. Cela permettrait au
secteur de demeurer compétitif sur le marché par le maintien ou l'amélioration de leur
rendement tout en diminuant l'utilisation de pesticides.
3
Hypothèses et objectifs
Ce projet se divise en deux parties distinctes ayant pour objectif commun d’approfondir les
connaissances sur le transport du Si par le transporteur Lsi1 en vue d’améliorer son
accumulation chez les plantes. Dans la première partie du projet, nous avons étudié le rôle de
certains résidus dans la sélectivité au Si chez les aquaporines Lsi1. Nous avons énoncé
l’hypothèse que le filtre sélectif permettant la perméabilité du Si chez les Lsi1 n’est pas basé
sur le modèle actuel de filtre GSGR. L’objectif a consisté à étudier la fonctionnalité du
transporteur Lsi1 afin de déterminer le premier résidu clé du filtre sélectif impliqué dans la
sélectivité du Si. Différentes substitutions d'acides aminés ont été étudiées dans le filtre ar/R
chez les transporteurs de Si afin d’évaluer l’impact de ces mutations sur la perméabilité au
Si.
Dans la deuxième partie du projet, nous nous sommes intéressés à mesurer l’effet du Si chez
les plants de canola (Brassica napus) transformés avec le gène Lsi1. Nous avons posé la
première hypothèse que les plants de canola transformés avec Lsi1 accumulaient des
quantités supérieures de Si dans leurs parties aériennes comparativement aux plants non
transformés. Nous avons ensuite émis l’hypothèse que les plants transformés avec Lsi1
étaient plus résistants au champignon hémibiotrophe Leptosphaeria maculans. L’objectif
sous-jacent visait à démontrer que les plants de canola génétiquement modifiés avec le gène
Lsi1 bénéficient d’apports supérieurs en Si.
4
Chapitre 1 : Revue de littérature
5
Le silicium
Le silicium dans l’environnement et chez les plantes
Le silicium (Si) est un métalloïde tétravalent omniprésent dans l’environnement. En
représentant environ 28 % de la croûte terrestre, il se positionne comme le deuxième élément
le plus abondant sur terre (Liang et al., 2015). Chimiquement, le Si forme des liaisons à une
très faible variété d’atomes et produit principalement des silicates ainsi que des polymères
de dioxyde de silicium (SiO2). L’importance du Si se reflète au travers du sol, dont sa masse
est composée entre 50 et 70 % de SiO2 (Ma et Yamaji, 2008). Malgré cette prépondérance,
le Si n’est pas considéré comme un élément essentiel pour les plantes en raison de l’absence
d’évidences sur son implication dans le métabolisme de base des plantes (Arnon et Stout,
1939). En revanche, Epstein et Bloom redéfinissent l’essentialité en indiquant qu’un élément
est essentiel s’il respecte l’un des deux critères suivants : 1. l’élément fait partie d’une
molécule qui elle-même est un composé structural intrinsèque ou un composé impliqué dans
le métabolisme de la plante. 2. Une trop faible quantité de l’élément peut affecter la plante
de manière à démontrer une faiblesse de sa performance comparativement aux plantes y ayant
accès en plus grande quantité (Epstein et Bloom, 2005). Puisque l’absence de Si peut affecter
la performance de nombreuses espèces végétales, on peut le qualifier de « quasi-essentiel »
pour la croissance des plantes supérieures (Ma et Yamaji, 2008).
Comme l’ensemble des éléments, le Si n’est pas toujours assimilable par les plantes. C’est
sous la forme d’acide silicique (Si(OH)4) qu’il se retrouve disponible dans le sol. Cette
molécule non chargée peut être absorbée par la plante à des pH inférieurs à 9 et est soluble
dans l’eau jusqu’à 2 mM à 25°C (Ma et al., 2001). À de plus hautes concentrations, le Si
commence à se polymériser sous forme de gel (Takahashi, 1978). C’est d’ailleurs grâce à
cette polymérisation que le Si présent en forte concentration ne montre aucun signe de
toxicité chez les plantes, une caractéristique distinctive par rapport aux autres minéraux (Ma
et Takahashi, 2002). Dans la solution du sol, l’acide silicique se retrouve généralement à des
concentrations allant de 0,1 à 0,6 mM (Ma et al., 2001). Une fois absorbée par les racines, la
molécule doit d’abord passer au travers de la zone corticale, elle est ensuite transportée vers
les parties aériennes via le xylème pour y être déposée sous forme de silice amorphe ou de
gel de silice (SiO2 + nH20). Comme le Si est un élément peu mobile, il s’accumule avant tout
6
dans les tissus plus âgés de la plante (Ma et Yamaji, 2006). Sa déposition sous forme
polymérisée a lieu sous la cuticule dans l’apoplasme des cellules des feuilles, des tiges et des
gousses et forme une double couche SiO2/cuticule. Chez certaines espèces comme le riz et le
blé, la déposition se fait dans des cellules spécifiques appelées « cellules silicaphiles » (Côté-
Beaulieu et al., 2009; Ma et Takahashi, 2002).
Toutes les plantes terrestres possèdent du Si dans leurs tissus, mais la proportion de cet
élément varie, allant de 0,1 % jusqu’à 10 % du poids sec (Liang et al., 2015). Cette très grande
variabilité s’explique par la capacité relative des plantes à absorber l’élément. On divise
celles-ci en trois catégories selon leur teneur en Si, soit les faibles accumulateurs (< 0,5 %),
les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5 %), et les forts accumulateurs (˃ 1,5 % du poids
sec) (Hodson et al., 2005). Chez les monocotylédones, les Poacées et les Cyperacées
accumulent des taux de Si élevés (Hodson et al., 2005). Parmi elles, le riz, l’orge et le blé
sont de très forts accumulateurs. Le riz est d’ailleurs l’une des espèces les plus fortement
accumulatrices connues à ce jour dans le règne végétal. Les dicotylédones, quant à elles,
accumulent généralement que de très faibles quantités de Si. À titre d’exemple, le Si contenu
chez les Brassicaceae et les Solanaceae est quasi négligeable, bien que l’on retrouve des
niveaux modérés chez les Urticales et les Cucurbitales. Puis, en dehors des angiospermes, de
forts accumulateurs se retrouvent chez l’embranchement des Bryophyta ainsi que chez les
classes des Lycopsida, des Sphenopsida et des Equisetopsida provenant de la division des
Pteridophyta (Ma et Takahashi, 2002). Comme l’ensemble des Gymnospermes et la majorité
des Angiospermes n’accumulent pas ou peu de Si, cette capacité demeure restreinte au sein
du règne végétal. Il est reconnu à ce jour que la présence de Si a de nombreux effets positifs
chez les plantes et l’importance de ces effets est directement liée au taux d’accumulation dans
la plante (Coskun et al., 2019).
Effets bénéfiques du Si chez les plantes
Depuis deux décennies, des centaines d’études rapportent les conséquences positives du Si
autant au niveau physiologique que physique. Ces effets bénéfiques sont retrouvés
spécifiquement chez les espèces ayant la capacité d’accumuler le Si dans leurs parties
aériennes. On constate également que son influence se fait remarquer uniquement en
condition de stress. D’un point de vue physique, le Si contribue à augmenter la force
7
mécanique des plantes, affecte les propriétés de la surface des plantes, favorise l’élongation
des cellules et augmente la rigidité des parois cellulaires. Cependant, c’est du côté
physiologique que la majorité des études sur le Si se sont concentrées en démontrant une
meilleure résistance à divers stress abiotiques et biotiques.
Le Si influence de nombreux aspects physiologiques majeurs chez les plantes. Notamment,
plusieurs éléments dont le manganèse, le fer, l’aluminium, de cadmium, l’arsénique, le
chrome le plomb, le cuivre et le zinc occasionnent des problèmes de phytotoxicité moins
importants en présence de Si (Liang et al., 2015). À titre d’exemple, l’ajout de Si dans la
fertilisation du haricot a fait passer le seuil de toxicité du manganèse dans la solution nutritive
de 0,5 μM à 5,10 μM (Horst et Marschner, 1978). Une meilleure tolérance à la toxicité des
métaux est donc engendrée par une accumulation en Si, mais les mécanismes y étant liés sont
encore incompris.
Un nombre considérable d’études démontrent également que le Si participe à une
augmentation de la tolérance aux stress de salinité. Les plantes sous stress salin se voient
bénéficier du Si par ses effets d’augmentation de l’activité photosynthétique, de la surface
foliaire et du contenu en chlorophylle, soit des paramètres généralement affectés à la baisse
dans de telles conditions. Le Si joue un rôle dans le maintien de la turgescence à travers
l’inhibition du taux de transpiration et d’une réduction des pertes en eau permis grâce aux
dépôts de silice sous les cellules épidermiques des feuilles et des tiges (Bélanger et al., 1995).
Ce sont donc principalement les répercussions de l’amélioration par le Si du taux
d’assimilation en CO2 dans la plante qui expliquent une meilleure tolérance aux stress salins,
mais plusieurs autres mécanismes sont en cause et demeurent peu connus (Liang et al., 2015).
Le Si améliore également la tolérance à la sécheresse et aux basses températures chez les
plantes. Les plants stressés par ce type de conditions montrent des taux de photosynthèse
supérieurs lorsqu’ils ont été fertilisés en Si. Gong et al. (2005) rapportent en effet que les
plants de blé sous stress hydrique et fertilisés en Si montrent des taux d’assimilation en CO2
supérieurs comparativement aux plants sans Si (Gong et al., 2005). Les mécanismes y étant
reliés sont principalement les mêmes que ceux en cause dans la tolérance au stress de salinité.
Ceux-ci incluent une meilleure activité des enzymes de la photosynthèse, une diminution des
pertes par transpiration, une augmentation de l’absorption en eau ainsi que le nettoyage des
8
dérivés réactifs de l’oxygène via l’amélioration de l’activité antioxydante (Liang et al., 2015).
Divers autres effets ont été rapportés en lien avec des stress abiotiques. On retrouve entre
autres une meilleure résistance aux déséquilibres nutritifs, aux extrêmes de températures et
aux radiations UV.
L’effet du Si le plus étudié chez les végétaux demeure de loin la tolérance aux stress
biotiques. Bien que certaines recherches mesurent l’impact du Si en cas d’infection
bactérienne, virale ou par des nématodes, c’est particulièrement au niveau des infections
fongiques que le rôle prophylactique de cet élément se fait remarquer. Ce sont plus
précisément les champignons biotrophes et hémibiotrophes qui se voient le plus affectés par
le Si chez les plantes. Les blancs poudreux, des champignons strictement biotrophes, sont
rapidement identifiés comme des espèces largement affectées par la présence de Si chez les
plantes (Miyake et Takahashi, 1983). C’est d’ailleurs dès 1991 que l’équipe de Menzies et
al. révèle une taille de colonies et un taux de germination des conidies de Sphaerotheca
fuliginea significativement plus faibles chez le concombre fertilisé en Si (Menzies, Ehret,
Glass, Helmer, et al., 1991). La littérature présente un nombre important de plantes
bénéficiant de l’accumulation du Si dans la lutte contre cette maladie. Le blé, l’orge, le rosier,
le raisin, le pissenlit, le fraisier ainsi que plusieurs cucurbitacées ont en effet été décrits (Liang
et al., 2015). Deux maladies d’importance chez le riz causées par les champignons
pathogènes Magnaporthe grisea, (Rodrigues et al., 2004) et Bipolaris oryzae (Ning et al.,
2014) sont des espèces hémibiotrophes significativement réprimées par le Si. Malgré le faible
effectif de champignons nécrotrophes influencés par le Si, on retrouve tout de même quelques
espèces pathogènes d’importance comme Rhizoctonia solani (Rodrigues et al., 2003) chez le
riz et Pythium ultinum chez le concombre (Chérif et al., 1992). Ainsi, un ensemble d’espèces
fongiques démontrent être affectées par l’accumulation de Si chez une multitude de plantes
accumulatrices (Wang et al., 2017).
Les insectes et autres types d’arthropodes figurent aussi parmi les types de stress biotiques
pouvant être contrôlés par le Si. Les premiers chercheurs proposant un effet du Si dans
l’attaque des plantes par les insectes herbivores sont l’équipe de McColloch et Salmon en
1923 en indiquant qu’une accumulation de l’élément chez le maïs induirait une meilleure
résistance à la mouche de Hesse (McColloch et Salmon, 1923). Depuis, les études révélant
9
l’influence du Si dans la tolérance des plantes aux insectes piqueurs-suceurs et aux broyeurs
sont retrouvées en abondance dans la littérature (Reynolds et al., 2009).
Finalement, les effets bénéfiques du Si s’observent en état de stress des plantes. Sans compter
les effets physiques, le Si permet principalement une meilleure résistance aux stress biotiques
et abiotiques, incluant particulièrement un rôle prophylactique dans la lutte contre les
infections fongiques. Plus une plante absorbe des quantités élevées de Si, plus les
conséquences positives seront importantes (Ma, 2004). Ainsi, les plantes n’ayant pas la
capacité d’absorber le Si ne peuvent pas bénéficier de ses répercussions, d’où la pertinence
de mieux comprendre les mécanismes d’action de cet élément.
Mécanismes d’action du silicium
Hypothèse mécanique
Encore à ce jour, les mécanismes d’action du Si demeurent incompris. La première théorie
proposée par la communauté scientifique pour expliquer ses effets chez les plantes est celui
de la barrière physique (Wagner, 1940). La double couche cuticule-SiO2 déposée dans les
tissus âgés des parties aériennes agirait comme obstacle mécanique. Cette double couche de
Si polymérisé contribuerait à ralentir le processus d’infection par les agents pathogènes et
augmenterait la rigidité des tissus. La pénétration des tissus par les champignons pathogènes
et la mastication par les insectes seraient plus difficiles et protègeraient par conséquent la
plante de manière passive en lui offrant un arsenal de défense supplémentaire. (Ma et Yamaji,
2006).
Hypothèse du Si soluble
Au début des années 90, Samuel et al. (1991) et Chérif et al. (1992) réfutent l’hypothèse
voulant que le Si agirait simplement comme barrière physique. Ils sont les premiers à lier la
présence de Si soluble à des changements métaboliques et à l’accumulation de composés de
défense dans les plantes. Il est aujourd’hui démontré que le Si ne joue pas strictement un rôle
mécanique, mais qu’il a également un rôle actif dans la résistance. En réaction à une infection
fongique, plusieurs réponses biochimiques comme la production accrue de phytoalexines, de
composés phénoliques, de chitinases, de peroxidases, de glucanases, de protéines PR-1 ont
été liées au traitement en Si (Fauteux et al., 2005; Rodrigues et al., 2005; Rodrigues et al.,
10
2004). En constatant que ces molécules étaient mesurées uniquement en présence de Si sous
forme soluble, l’hypothèse indique que l’acide silicique serait impliqué activement dans son
effet prophylactique en agissant comme modulateur de composés clés du signal de stress.
Le concept de « priming » des réactions de défenses a d’abord été suggéré par Fawe et al.
(1998; 2001). Le Si aurait un rôle de « primer », c’est-à-dire qu’il ferait office d’activateur
du système de défense, permettant ainsi une réponse plus rapide et efficace aux divers stress
tout en ayant un coût métabolique minimal. En 2015, Vivancos et al. indiquent toutefois que
le Si activerait d’autres mécanismes de défense qui ne dépendent pas de ce composé.
Les études plus récentes sur les effecteurs ont ensuite amené une autre hypothèse sur le
mécanisme d’action du Si. Les effecteurs sont des molécules sécrétées par le champignon et
sont impliquées dans la pathogénicité chez les plantes. Comme le site de déposition du Si a
lieu au même endroit que la cible de nombreux effecteurs, soit dans l’apoplasme sous la
cuticule, il est suggéré que le Si interfèrerait aussi avec les effecteurs libérés par les agents
pathogènes. Cette interaction empêcherait les effecteurs d’atteindre leur cible, priverait ainsi
le pathogène d’aller moduler les défenses de la plante et préviendrait l’invasion fongique.
Rasoolizadeh et al. (2018; 2020) appuient cette hypothèse en démontrant que l’expression
des gènes codant pour les effecteurs de P. sojae était significativement réduite lors de
l’interaction avec des plants de soya fertilisés au Si.
Les transporteurs de Si
Anciennement, on estimait que seule la transpiration dictait l’accumulation de Si chez les
plantes. La découverte en 2006 et 2007 de deux transporteurs de Si nommés Lsi1 et Lsi2,
apporte les premières explications quant à la grande variation du taux de Si retrouvée chez
les plantes supérieures (Ma et al., 2006; Ma et al., 2007). La translocation du Si est bel et
bien facilitée par la transpiration, mais il est aujourd’hui reconnu que les transporteurs jouent
le rôle décisif dans l’accumulation de cet élément. Les transporteurs Lsi1 et Lsi2 agissent de
concert pour permettre au Si de pénétrer au travers des cellules racinaires et être envoyé dans
le xylème pour atteindre les parties aériennes.
11
Les aquaporines
Les aquaporines (AQPs) sont des canaux protéiques retrouvés au niveau de la membrane
plasmique et de plusieurs autres membranes intracellulaires autant chez les archées, les
bactéries que chez les eucaryotes (Wu et Beitz, 2007). Initialement identifiées chez l’humain
par l’équipe de Peter Agre (Borgnia et al., 1999), il a été découvert par la suite qu’une
diversité nettement supérieure d’aquaporines était présente chez les plantes. Ces importantes
protéines, appartenant à la famille des Major Intrinsic Proteins (MIPs), jouent un rôle
fondamental dans le transport des molécules d’eau et d’éléments nutritifs, ce qui les rend
essentielles à la survie des plantes (Hove et Bhave, 2011). Une variabilité considérable de
substrats, de profils d’expression, de régulation et de localisation existe au sein des MIPs,
leur attribuant des fonctions diverses dans la plante (Hove et Bhave, 2011). Par exemple, les
aquaporines peuvent être perméables à l’eau, au glycérol, au dioxyde de carbone (CO2), à
l’oxyde nitrique (NO), à l’ammoniac (NH3), au peroxyde d’hydrogène (H2O2), à l’arsénite
(As(OH)3), à l’urée (CH4N2O) et à l’acide silicique (Si(OH)4) (Wu et Beitz, 2007). Cette
diversité chez les aquaporines végétales a permis leur subdivision en sept familles en fonction
de leur localisation intracellulaire et de leur séquences homologues. On y retrouve les Plasma
membrane intrinsic proteins (PIPs), les Tonoplast intrinsic proteins (TIPs), les Nodulin-26-
like-intrinsic proteins (NIPs), les Small basic intrinsic proteins (SIPs), les GlpF-like intrinsic
proteins (GIPs), les Hybrid intrinsic proteins (HIPs) et les Uncategorized X intrinsic proteins
(XIPs). Cependant, les GIP et les HIP sont retrouvées uniquement chez les plantes primitives
(Deshmukh et al., 2015). Les PIP et les TIP, quant à elles, jouent essentiellement un rôle de
transport de l’eau et sont généralement exprimés dans les racines et les tissus végétatifs
(Deshmukh et al., 2017). Le présent projet s’intéresse plus particulièrement aux NIP
puisqu’on y retrouve parmi elles une sous-famille fortement perméable au Si.
Structurellement, les MIP sont des tétramères dont chaque monomère possède un pore
permettant le passage des molécules de substrat. En effet, la conformation tridimensionnelle
des aquaporines forme un canal servant de barrière ou de porte d’entrée des différentes
molécules. Ce pore joue un rôle sélectif dans le passage des différents solutés afin de
contrôler l’osmolarité selon les besoins de la plante. Les monomères se caractérisent par la
présence de six hélices alpha transmembranaires (TM1-TM6) reliées par trois boucles
extracytoplasmiques (LA, LC et LE) et deux boucles intracytoplasmiques (LB et LD) (Hove
12
et Bhave, 2011). La présence de deux motifs Asn-Pro-Ala (NPA) dans les boucles LB et LE
permet le repliement du monomère et la formation d’une première constriction. Une seconde
constriction composée de quatre résidus, forme le filtre aromatique/arginine (ar/R)
permettant le passage sélectif du substrat dans le canal. Le premier résidu de ce filtre se trouve
dans l’hélice H2, le deuxième est dans l’hélice H5 et les deux derniers sont dans les boucles
LE. L’acide aminé le plus conservé du filtre ar/R est le dernier résidu arginine (R) et servirait
de donneur de liaisons hydrogènes permettant le transport de l’eau ou de molécules de
glycérol (Jensen et al., 2003). Quant aux trois premiers acides aminés du filtre sélectif, ils
sont spécifiques aux sous-familles d’aquaporines et permettent la formation des liaisons Van
der Waals avec les molécules de substrat (Hove et Bhave, 2011).
Plus d’un rôle et bénéfice sont attribués à la présence d’aquaporines chez les plantes. Non
seulement elles sont reconnues pour permettre le mouvement des nutriments, mais elles
jouent également un rôle dans l’élongation des parties aériennes et des racines. Les
aquaporines participent au développement optimal des graines, à l’hydratation du pollen et à
sa germination. Ces protéines membranaires sont aussi impliquées dans le mouvement des
stomates, renforçant la tolérance des plantes à la sécheresse (Deshmukh et al., 2017). Leur
grande diversité et leur régulation permettent aux plantes une meilleure adaptation aux
diverses conditions environnementales (Maurel et al., 2008). Aux vues des perturbations
climatiques à venir, il semble primordial de mieux comprendre le fonctionnement de ces
protéines membranaires. Malgré l’intérêt majeur que porte la communauté scientifique sur la
question du rôle des aquaporines en conditions de stress, ce sujet demeure largement
incompris.
Les transporteurs d’influx du Si
La découverte des transporteurs de Si marque un point tournant dans l’étude du mécanisme
d’absorption de cet élément chez les plantes. Le transporteur Lsi1 (Low silicon rice 1), est
une aquaporine (AQP) appartenant à la sous-famille des Nodulin 26-like intrinsic protein-III
(NIPIII) permettant l’entrée en influx de l’acide silicique du sol vers les cellules racinaires.
Cette protéine membranaire contrôle de manière passive l’accumulation du Si (Ma et Yamaji,
2006). D’abord découvert chez le riz (Oryza sativa) (Ma et al., 2006), ce transporteur a par
la suite été identifié chez plusieurs autres plantes. Il n’est pas retrouvé chez toutes les espèces
13
végétales et sa présence explique en grande partie la forte accumulation de Si possible chez
ces plantes. En effet, les espèces faiblement accumulatrices étudiées à ce jour ne possèdent
pas de Lsi1. À titre d’exemple, Arabidopsis thaliana, Brassica napus et Eruca vesicaria, tous
de faibles accumulateurs de Si, ne possèdent pas le gène Lsi1 (Sonah et al., 2017). À l’inverse
Cucumis sativus, Glycine max, Oryza sativa, et plusieurs autres sont à la fois de forts
accumulateurs et porteurs du gène Lsi1. Plusieurs homologues ont été identifiés jusqu’à
maintenant chez l’orge (HvLsi1), le blé (TaLsi1), le maïs (ZmLsi1), le concombre (CSiT-1),
la citrouille (CmLsi1) et le soya (GmLsi1) (Ma et Yamaji, 2015). Le transporteur Lsi1 est non
seulement perméable à l’acide silicique mais également à l’eau en plus d’agir de manière
bidirectionnelle en influx et en efflux (Mitani et al., 2008a).
La localisation du Lsi1 varie selon les espèces. Chez le riz, l’aquaporine est située dans la
membrane plasmique à l’extrémité distale des cellules de l’exoderme et de l’endoderme au
niveau de la bande de Caspari. Tandis que chez le l’orge et le maïs, elle est localisée du côté
distal des cellules épidermiques et corticales (Chiba et al., 2009; Ma et al., 2006). À l’inverse,
le CmLsi1 chez la citrouille est localisé dans toutes les cellules racinaires et ne montre aucune
disposition polaire (Mitani et al., 2011). Physiquement, le Lsi1 est retrouvé dans les régions
matures des racines principales et secondaires, mais est très peu présent dans les extrémités
racinaires comme l’apex (Ma et al., 2006).
Comme expliqué précédemment, chaque aquaporine possède une signature moléculaire
spécifique contenant les deux domaines NPA ainsi que le filtre sélectif composé de quatre
acides aminés. Dans le cas du transporteur Lsi1, une étude indique que les deux domaines
NPA semblent devoir être séparés par 108 acides aminés pour que les NIPIII puissent laisser
passer le Si. Chez la tomate par exemple, une plante faiblement accumulatrice, la séparation
de 109 acides aminés entre les deux domaines NPA explique l’incapacité de cette espèce à
absorber le Si (Deshmukh et al., 2015). Malgré le fait que ces deux domaines soient fortement
conservés au sein des NIPIII, ils semblent cependant n’avoir qu’un rôle restreint dans le
passage sélectif du Si. En effet, OsNIP1;1 et OsNIP2;1 possèdent les deux domaines NPA
alors qu’uniquement OsNIP2;1 transporte l’acide silicique (Mitani et al., 2008a). Quant au
filtre sélectif ar/R, une signature moléculaire spécifiquement liée à l’acide silicique semble
caractériser les NIPIIIs. Plus précisément, les résidus du filtre de type Gly88, Ser207, Gly216
14
et Arg222 semblent largement conservés chez les transporteurs Lsi1. Une constriction plus
large (≥6Å) permise par les résidus G-S rendrait possible le passage de l’acide silicique (4.38
Å) (Hove et Bhave, 2011). Ces quatre acides aminés G-S-G-R, de position bien précise dans
la séquence protéique, semblent être le critère actuel pour déterminer la capacité d’une
aquaporine à transporter le Si. C’est le cas pour les transporteurs OsNIP2;1 (Ma et al., 2006)
du riz, TaNIP2;1 du blé (Montpetit et al., 2012), GmNIP2;1 du soya (Deshmukh et al., 2013),
ZmNIP2;1 du maïs (Mitani et al., 2008b), HvNIP2;1 de l’orge (Chiba et al., 2009) et pour la
majorité des aquaporines de type Lsi1 décrites à ce jour. Une étude révèle même que la
mutation d’un acide aminé du filtre GSGR occasionne une diminution marquée du transport
du Si par l’aquaporine (Mitani-Ueno, Yamaji, Zhao, et al., 2011).
Lsi1 chez le riz comme transporteur modèle
Le premier transporteur d’influx du Si a été identifié chez le riz (Oryza sativa) par Ma et al.
en 2006 où l’inhibition de l’expression de OsNIP2;1 résultait en une réduction de l’absorption
de Si (Ma et al., 2006). Ce sont d’ailleurs les résultats de ces expérimentations qui ont mené
au nom de Low silicon rice (Lsi1) donné au gène responsable de l’absorption du Si chez les
plantes. Chez cette espèce, le gène Lsi1 est situé sur le chromosome 2 et inclut 5 exons et 4
introns. La séquence codante du gène (cDNA) est de 1409 pb et la protéine qui en résulte est
composée de 298 acides aminés. Sa signature moléculaire est bien composée des deux
domaines NPA et du filtre ar/R de type GSGR comme l’ensemble des plantes supérieures
étudiées jusqu’à maintenant. Les connaissances acquises sur le transporteur OsLsi1 autant au
niveau de sa composition moléculaire, de son expression et de son activité facilitent les études
de fonctionnalité des transporteurs et le rendent un transporteur modèle idéal.
Lsi1 chez la prêle comme transporteur modèle
Parmi les transporteurs d’influx du Si caractérisés à ce jour, une espèce présente certaines
exceptions. La prêle (Equisetum arvense), une plante ancestrale dont la survie dépend du Si,
possède des aquaporines perméables au Si. Ces dernières font partie de la famille
d’aquaporines des NIPII, contrairement aux NIPIII chez plantes supérieures. Bien qu’ils
appartiennent à des familles différentes, leurs séquences présentent toute de même une
homologie élevée. Reconnues pour être perméables à l’acide borique, les NIPII ont été
décrites chez Arabidopsis (Takano et al., 2006). Contrairement aux aquaporines perméables
15
au Si chez les plantes supérieures, la signature moléculaire de EaNIP3 au niveau du filtre
sélectif n’est pas constituée des résidus GSGR, mais plutôt des résidus STAR. Il s’agit en
réalité d’une différence majeure. Les deux domaines NPA sont, quant à eux, bien présents
(Grégoire et al., 2012). Comme les Equisetum sont d’origine ancestrale, il se pourrait que
leurs transporteurs de Si aient évolué indépendamment des angiospermes. Malgré leurs
différences, l’efficacité des EaNIP3 à transporter le Si les rend des modèles intéressants pour
l’étude des mécanismes d’absorption du Si chez les plantes.
Les transporteurs d’efflux Lsi2
Les transporteurs Lsi2 sont responsables du passage du Si en efflux, faisant sortir l’élément
des cellules racinaires vers l’apoplasme et permettant de charger le xylème. Ce sont des
protéines appartenant à une classe non caractérisée de transporteurs d’anions putatifs qui
possèderaient 11 domaines transmembranaires. Bien que les Lsi2 se retrouvent aussi au
niveau de la membrane plasmique, ils sont généralement positionnés du côté proximal,
contrairement aux Lsi1 (Ma et al., 2007). Cette localisation polaire entre le Lsi1 et le Lsi2
démontre bien que ces deux transporteurs agissent de manière complémentaire afin de
permettre l’entrée efficace de l’acide silicique dans le xylème chez les espèces fortement
accumulatrices. À l’origine identifiés chez le riz, de nombreux homologues ont par la suite
été identifiés chez d’autres espèces dont l’orge (HvLsi2), le maïs (ZmLsi2), la prêle
(Vivancos et al., 2016) et la citrouille (CmLsi2) (Mitani-Ueno, Yamaji, et Ma, 2011; Mitani
et al., 2009). Cependant, il existe une certaine variation dans le type de cellules racinaires où
se trouvent ces transporteurs. Chez le riz, le Lsi2 est présent du côté proximal de l’exoderme
et de l’endoderme des racines, tandis que chez l’orge et le maïs il est uniquement situé à
l’endoderme (Mitani et al., 2009). Ces variations seraient probablement dues aux structures
racinaires distinctes au sein des espèces. On retrouve les transporteurs d’efflux dans les
racines principales et latérales, mais aucune expression n’a lieu au niveau des radicelles et
des apex racinaires (Ma et al., 2007). Malgré ces ressemblances avec le transporteur d’efflux
de l’arsénite des bactéries et des archées ainsi que sa capacité à transporter le Si chez le riz,
peu de connaissances sur le Lsi2 sont disponibles. En effet, le type de transport membranaire
effectué par le Lsi2 reste encore à étudier, en marge du processus actif et anti porteur
Si(OH)4/H+ suggéré par Ma et al. (2007). Il est aujourd’hui reconnu que les transporteurs
Lsi1 et Lsi2 agissent de concert pour permettre une accumulation supérieure et efficace du
16
Si dans les tissus de la plante. En dépit de leurs différences importantes, une comparaison
des régions promotrices révèle que ces deux transporteurs possèdent des domaines communs
(Ma et al., 2007).
Expression des transporteurs
Tel que rapporté plus tôt, les deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 sont localisés au niveau de la
membrane plasmique, mais leur expression varie selon les espèces, le type de tissus et de
cellules (Ma et Yamaji, 2015). Les spécificités de localisation cellulaire et d’expression de
chacun de ces transporteurs démontrent qu’ils sont impliqués dans des étapes distinctes mais
complémentaires dans le processus d’accumulation du Si. Un knockout de l’un ou l’autre des
gènes a occasionné une diminution significative de l’accumulation en Si (Ma et al., 2006).
En d’autres termes, la présence conjointe de ces deux transporteurs serait le facteur clé pour
une accumulation optimale du Si chez les plantes. Des études réalisées chez le riz indiquent
qu’il y aurait une relation inverse entre le niveau d’expression des transporteurs de Si et le
niveau d’accumulation de l’élément dans les feuilles. Plus précisément, un taux
d’accumulation en Si élevé dans les feuilles induit une régulation négative de l’expression
des transporteurs dans les racines (Mitani-Ueno et al., 2016). L’expression de ces deux
transporteurs est également régulée négativement par l’indication d’un stress comme une
sécheresse ou la présence d’acide abscissique (Yamaji et Ma, 2007). Aucun consensus sur
l’expression des transporteurs n’a cependant été établie.
Le canola (Brassica napus)
L’espèce Brassica napus, appartenant à la famille des Brassicaceae, est connu sous le nom
commun de colza ou de canola. Cette espèce amphidiploïde serait dérivée des espèces
diploïdes B. nigra, B. rapa et B. oleracea. Le terme canola est spécifiquement employé pour
les variétés de B. napus issues d’un processus d’amélioration génétique visant à améliorer
les propriétés de l’huile en la rendant plus saine pour la consommation humaine et animale.
Plus spécifiquement, l’appellation contrôlée « canola » doit être employée uniquement pour
les variétés à faible teneur en acide érucique et en glucosinolate dont les teneurs ne doivent
pas excéder des seuils bien précis. Cette variété, développée dans les années 1970 par la
recherche d’Agriculture et Agroalimentaire Canada, est depuis devenue l’une des cultures
d’oléagineux la plus importante mondialement et largement cultivée au Canada (Canola
17
Council of Canada, 2019). La production mondiale de canola était estimée à 68 millions de
tonnes en 2016 (USDA, 2017). Au Canada, la superficie ensemencée en canola a presque
doublé au cours des 20 dernières années passant de 12 millions d’acres en 1997 à 23 millions
d’acres en 2017 (Statistique-Canada, 2018). La culture intensive de canola fait aujourd’hui
face à plusieurs difficultés comme le développement de maladies, la compétition des
mauvaises herbes et des problèmes de sécheresse majeurs. Pour affronter ces défis, de
nouvelles variétés de canola ont été développées par l’introduction de gènes de résistance.
Par exemple, différents cultivars plus résistants au champignon pathogène Leptosphaeria
maculans ont été développés (Zhang et al., 2016). Le cultivar Westar, performant mais sans
aucun gène de résistance à la maladie, est rapidement devenu moins intéressant à cultiver.
Pour cette raison, de nouveaux cultivars rendus résistants à L. maculans grâce au gène de
résistance Rlm3 ont été introduits à grande échelle dans les années 90. Toutefois, l’efficacité
de ces cultivars a rapidement été anéantie au début des années 2000 par le développement de
races fongiques résistantes (Zhang et al., 2016). Malgré la mise en place de variétés possédant
plus d’un gène de résistance, les problèmes liés aux maladies chez le canola demeurent des
enjeux majeurs.
Tel que mentionné, les Brassicacées ne possèdent pas de transporteurs Lsi1. Des études ont
cependant démontré qu’en transformant une plante faiblement accumulatrice comme
Arabidopsis avec un gène d’absorption du Si du blé (TaLsi1), la plante devenait plus tolérante
au blanc poudreux en présence de Si (Vivancos et al., 2015). Sachant qu’Arabidopsis fait
partie de la même famille que le canola, une telle transformation serait éventuellement
possible chez ce dernier. La facilité à manipuler génétiquement le canola en laboratoire rend
plus aisée l’amélioration génétique et la création de cultivars plus performants et polyvalents.
Leptosphaeria maculans
La maladie de la jambe noire (blackleg) est causée par un champignon pathogène
hémibiotrophe des Brassicaceae. Leptosphaeria maculans, faisant partie de la famille des
ascomycètes, correspond à la forme sexuée de la maladie, tandis que Phoma lingam est sa
forme asexuée. Cette maladie peut entraîner des dommages majeurs en particulier chez le
canola. C’est d’ailleurs devenu dans l’Ouest canadien l’agent pathogène engendrant les
pertes économiques les plus importantes dans cette culture au cours de la dernière décennie
18
(Canola Council of Canada, 2019). Géographiquement, il se retrouve principalement en
Australie, en Nouvelle-Zélande, au Canada, en Europe, en Afrique du Sud et aux États-Unis
(West et al., 2001). Les pertes de rendements à la récolte engendrées par L. maculans sont
généralement supérieures à 10 % et peuvent atteindre 30 à 50 % (West et al., 2001). Les
principales raisons expliquant l’accélération des problèmes liés à cette maladie sont
l’augmentation des surfaces cultivées, l’absence de rotations de cultures ainsi que la perte
d’efficacité des gènes de résistance utilisés à ce jour (Zhang et Fernando, 2018). La forme
anamorphe du champignon produit des spores de type pycnidiospores (3-5 x 1.5-2 μm)
contenues dans une matrice hygroscopique noire appelée pycnide (Williams, 1992). Ces
pycnides sont produites dans les tissus infectés et nouvellement morts de la plante et libèrent
les pycnidiospores pouvant être disséminées sur quelques mètres grâce aux éclaboussures de
la pluie. La forme téléomorphe, quant à elle, produit des structures fructifères noires et
globuleuse appelées des pseudothèces. Ces ascocarpes contiennent de nombreux asques où
se retrouvent les spores de type ascospores de forme cylindrique à ellipsoïdale (35-70 x 5-8
μm) (Williams, 1992). Contrairement aux spores asexuées, les ascospores se propagent par
le vent sur plusieurs kilomètres (West et al., 2001).
Peu importe le stade sexué ou asexué, l’infection est initiée par la pénétration des spores via
les stomates ou les blessures. Leptosphaeria maculans est donc susceptible d’attaquer
presque toutes les parties de la plante incluant les cotylédons, les feuilles, les tiges, les racines
et les siliques. Les premiers symptômes sont généralement des lésions foliaires circulaires de
couleur blanc à gris où apparaissent ensuite des points noirs représentant les pycnides. Durant
la phase biotrophe, les hyphes se développent dans les tissus via les espaces intercellulaires
et accèdent aux pétioles où elles peuvent atteindre la tige. Une fois les vaisseaux atteints, la
croissance du champignon peut générer un contour noir à la base de la tige et former un
chancre. Ces chancres peuvent affecter le transport de l’eau, engendrer un remplissage
prématuré des siliques, des graines échaudées et peuvent même finir par sectionner la base
du plant. Bien que le chancre soit le stade le plus sévère de la maladie, la présence importante
de lésions foliaires peut également affecter la maturité des plants et la qualité des siliques
(West et al., 2001).
19
Après la récolte, le champignon entre dans sa phase nécrotrophe où les tissus morts sont
colonisés d’abord par la forme asexuée qui produira des pycnides ou entrera dans la phase
sexuée, participant ainsi à l’augmentation du degré d’inoculum. Cet agent pathogène peut
survivre sur les débris végétaux ou les graines de canola pendant plusieurs années sous forme
de mycélium, de pycnides ou de pseudothèces. Sa survie est favorisée par des conditions
estivales sèches et des hivers froids (Howlett et al., 2001). Il existe plusieurs groupes de
pathogénicité de ce champignon (PG); soit PG1 qui englobe les races faiblement virulentes
tandis que PG2, PG3 et PG4 comprennent les races très virulentes (Chen et Fernando, 2006).
20
Chapitre 2 : Étude fonctionnelle des transporteurs d’influx Lsi1
du silicium chez les plantes
21
Introduction
Le silicium (Si) est un élément appartenant aux métalloïdes qui est présent en abondance
dans l’environnement. Il correspond à environ 28 % de la croûte terrestre, ce qui le positionne
comme le deuxième élément le plus abondant sur terre (Liang et al., 2015). Les taux élevés
en SiO2 du sol, généralement entre 50 et 70 % de la masse, exposent les plantes à de grandes
quantités de cet élément (Ma et Yamaji, 2008). Malgré cette omniprésence, le Si ne figure
pas parmi les éléments essentiels des plantes. En réalité, toutes les plantes terrestres possèdent
du Si dans leurs tissus, mais les taux varient de 0,1 à 10 % du poids sec (Liang et al., 2015).
C’est sous forme d’acide silicique (Si(OH)4) que le Si est disponible pour les plantes. Les
concentrations généralement retrouvées de cette molécule dans la solution du sol vont de 0,1
à 0,6 mM, mais elle est soluble dans l’eau jusqu’à 2mM (Ma et al., 2001). Étant un élément
peu mobile, le Si s’accumule avant tout dans les tissus plus âgés de la plante (Ma et Yamaji,
2006). Il se dépose sous forme polymérisée sous la cuticule dans l’apoplasme des cellules
des feuilles, des tiges et des gousses et forme une double couche SiO2/cuticule. Les plantes
sont subdivisées en trois grandes catégories selon leur teneur en Si dans leurs tissus. On
retrouve les faibles accumulateurs (< 0,5 %), les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5
%), et les forts accumulateurs (˃ 1,5 % du poids sec) (Hodson et al., 2005). La variabilité du
taux de Si dans les plantes est liée à leur capacité relative à accumuler l’élément dans leurs
tissus. Le riz (Oryza sativa) et la prêle des champs (Equisetum arvense) figurent parmi les
plus forts accumulateurs.
L’intérêt principal de la communauté scientifique porté sur le Si est lié à ses multiples effets
bénéfiques chez les plantes. Non seulement le Si augmente la rigidité des parois cellulaires
et favorise l’élongation des cellules végétales, mais de nombreux effets physiologiques ont
également été rapportés. Plusieurs de ces effets engendrent une tolérance accrue aux stress
biotiques et abiotiques (Liang et al., 2015). Pour ce qui est des stress abiotiques, une réduction
des problèmes de phytotoxicité des métaux, de salinité et de déséquilibres nutritifs sont
largement rapportés dans la littérature. Le Si contribue également à améliorer la tolérance
des plantes à la sécheresse, aux extrêmes de températures ainsi qu’aux radiations UV. L’effet
du Si le plus étudié chez les végétaux est de loin la tolérance aux stress biotiques. Des
centaines d’études démontrent une réduction des problèmes liés aux infections fongiques
chez une multitudes de plantes accumulatrices (Chérif et al., 1992; Menzies, Ehret, Glass, et
22
Samuels, 1991; Rodrigues et al., 2004). Les insectes et autres arthropodes figurent aussi
parmi les stress biotiques pouvant être réprimés par le Si (Reynolds et al., 2009). Ainsi,
l’influence du Si se fait uniquement remarquer en condition de stress. Il est aujourd’hui
reconnu que ses effets positifs et leur importance relative sont directement liés au taux
d’accumulation du Si dans la plante (Coskun et al., 2019). En d’autres termes, plus la plante
accumule de Si dans ses tissus, plus elle en bénéficie.
Les variations d’accumulation de Si au sein du règne végétal ont été expliquées grâce à la
découverte des transporteurs de Si chez les plantes, appelés Lsi1 et Lsi2 (Ma et al., 2006; Ma
et al., 2007). Ces transporteurs, situés au niveau de la membrane plasmique des cellules
racinaires, agissent ensemble afin de permettre l’accumulation efficace du Si dans les parties
aériennes. L’entrée de l’acide silicique de la solution du sol vers les cellules racinaires est
canalisée par le transporteur d’influx Lsi1. Le transporteur d’efflux Lsi2 agit ensuite de
manière à faire sortir le Si des cellules racinaires vers l’apoplasme afin de charger le xylème.
La présence de ces deux gènes est aujourd’hui l’explication moléculaire de la capacité
relative des plantes à accumuler le Si (Ma et Yamaji, 2015).
Le transporteur Lsi1 est en réalité une protéine appartenant à la grande famille des Major
intrinsic proteins (MIPs), aussi appelées sous le nom d’aquaporines (AQPs) (Hove et Bhave,
2011). Plus précisément, le Lsi1 appartient à la sous famille des Nodulin 26-like intrinsic
protein-III (NIPIII). Comme chez l’ensemble des aquaporines, la conformation
tridimensionnelle du Lsi1 forme deux constrictions impliquées dans le passage des
différentes molécules. La première constriction est composée de deux motifs Asn-Pro-Ala
(NPA), tandis que la seconde, formée de quatre acides aminés, constitue le filtre
aromatique/arginine (ar/R) permettant la sélectivité des molécules transportées. Dans le cas
du Lsi1, une étude indique qu’une séparation des deux domaines NPA par 108 acides aminées
serait un des critères permettant le passage du Si chez les NIPIII (Deshmukh et al., 2015).
Au niveau du filtre sélectif, les résidus Gly-Ser-Gly-Arg (GSGR) constituent la signature
moléculaire permettant le transport du Si chez les aquaporines Lsi1. Ces quatre acides aminés
de position bien précise dans la séquence protéique ainsi que la distance de 108 acides aminés
entre les domaines NPA, semblent être les critères actuels pour déterminer la capacité d’une
aquaporine à transporter le Si (Coskun et al., 2019).
23
Malgré le présent consensus quant aux quatre résidus GSGR impliqués dans la sélectivité du
Si, on retrouve au sein du règne végétal plusieurs espèces fortement accumulatrices de Si
présentant un filtre sélectif de type ASGR. À titre d’exemple, Phaseolus vulgaris, Vigna
radiata, et Vigna angularis sont toutes les trois de fortes accumulatrices de Si et possèdent
pourtant un Lsi1 composé d’un filtre ar/R de type Ala-Ser-Gly-Arg (ASGR). Des tests par
expression hétérologue dans les oocytes de Xenopus laevis révèlent que le transporteur Lsi1
de ces dernières espèces est bel et bien actif dans le transport du Si (données non publiées).
À partir de ces informations, la première position du filtre sélectif du Lsi1 permet le transport
du Si qu’elle soit composée de l’acide aminé Glycine ou Alanine. Il a d’autant plus été
remarqué que le résidu Glycine à la position adjacente au premier acide aminé du filtre
sélectif dans la séquence protéique (Gly88 chez OsLsi1) est davantage conservé au sein des
NIPIII que cette première position. Le transporteur de Si chez la prêle (EaLsi1), appartenant
à la sous-famille des NIPII, présente également une conservation de l’acide aminé Glycine à
la position adjacente de celle du premier résidu du filtre ar/R. Une question se pose ainsi
quant à l’implication dans la sélectivité du Si de ce résidu adjacent fortement conservé chez
les transporteurs Lsi1. Nous avons donc posé l’hypothèse que le filtre sélectif permettant la
perméabilité du Si chez les Lsi1 n’est pas basé sur le modèle actuel de filtre GSGR. Le présent
objectif est de déterminer le premier résidu clé du filtre sélectif impliqué dans la sélectivité
du Si au sein des Lsi1. L’activité de transport du Si chez des Lsi1 mutés au niveau de leur
filtre sélectif a ainsi été testé chez le riz et la prêle par le système d’expression hétérologue
d’oocytes de X. laevis afin de déterminer l’impact de la mutation sur la fonctionnalité du
transporteur.
Matériels et méthodes
Clonage des gènes et construction des plasmides pour l’expression hétérologue dans les
oocytes de Xenopus laevis
Pour le clonage des gènes d’intérêts, l’ARN des tissus de Oryza sativa et Equisetum arvense
a été préalablement isolé. L’ADNc a ensuite été synthétisé par transcription inverse et les
gènes OsLsi1 (numéro d’accession AB222272) et EaLsi1 (numéro d’accession HE858197)
ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN complémentaire (ADNc). Ces étapes ont été
réalisées préalablement à ce projet.
24
Pour faire les constructions, les séquences codantes de OsLsi1 et EaLsi1 ont été amplifiées
en utilisant des amorces PCR créées de manière à introduire les sites de restrictions SpeI/BglII
chez OsLsi1 et EcoRI/HindIII chez EaLsi1 aux extrémités. L’amplicon obtenu a été inséré
dans le vecteur d’expression de Xenopus laevis Pol1 comprenant un promoteur T7, la région
globuline non transcrite de X. laevis et une queue poly(A). Pour l’insertion, le vecteur Pol1 a
été prédigéré avec les enzymes respectives (SpeI/BglII pour OsLsi1 et EcoRI/HindIII pour
EaLsi1). Tous les vecteurs ont été clonés dans les souches compétentes E. coli TOP10 et
gardés à -80°.
Tableau 1 Amorces utilisées pour insérer le gène Lsi1 dans le vecteur Pol1
Nom de
l’amorce Direction Séquence Commentaire
OsLsi1-
Bgl2-F F
CTATAGATCTATGGCCAGCAACAACT
CGAG
Pour intégrer le gène
OsLsi1 dans le
vecteur Pol1
OsLsi1-
Spe1-R R
GTTAACTAGTTCACACTTGGATGTTCT
C
Pour intégrer le gène
OsLsi1 dans le
vecteur Pol1
EaLsi1-
EcoRI-F F
AGTGGAATTCATGACGAAAGGGGAG
ATATCGATTC
Pour intégrer le gène
EaLsi1 dans le
vecteur Pol1
EaLsi1-
HindIII-R R
CCCAAGCTTTTAAGTGCTTTCATCTTC
TAGTTTGAG
Pour intégrer le gène
EaLsi1 dans le
vecteur Pol1
Mutagénèse dirigée
En se basant sur un large alignement de séquences d’acide aminés provenant d’homologues
Lsi1 (NIP2), l’analyse a révélé que le résidu glycine (G) adjacent à la première position du
filtre sélectif est conservé au sein des Lsi1 de toutes les espèces (données non publiées). Le
logiciel PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer) a été utilisé pour prédire l’effet d’un
changement d’acide aminé à ces positions sur la fonctionnalité de la protéine (Choi et al.,
2012). À la lumière de ces analyses, le résidu glycine à la position 88 remplacé avec l’alanine
(G88A) ainsi que le résidu glycine à la position 89 remplacé avec la valine (G89V) ont été
ciblés pour l’étude de fonctionnalité chez OsLsi1. Chez EaLsi1, le résidu sérine à la position
25
70 remplacé par le résidu glycine ou thréonine (S70G et S70T) ainsi que le résidu glycine à
la position 71 remplacé par le résidu alanine (G71A) ont été ciblés.
La méthode de mutagénèse dirigée par PCR a été utilisée pour réaliser les substitutions
spécifiques grâce aux amorces créées pour induire la mutation désirée. Les amorces utilisées
pour générer chaque mutant sont indiquées au Tableau 2. Les mutagénèses ont été réalisées
avec l’ADN polymérase Phusion Taq polymerase (New England Biolabs). Les produits issus
de la réaction PCR ont ensuite été digérés avec l’enzyme DpnI pour dégrader l’ADN
génomique méthylé. Puis la transformation dans des cellules compétentes E. coli TOP10 a
été réalisée. Toutes les séquences ont été confirmées par séquençage des plasmides.
Tableau 2 Amorces utilisées pour la mutagénèse dirigée
Nom de
l’amorce Direction Séquence Commentaires
OsLsi1-
G88A-F F
GTCGATCGCCGCTGGCCTCATCGT
GACGGTGATG
Mutagénèse dirigée du
mutant OsLsi1 G88A
OsLsi1-
G88A-R R
CGATGAGGCCAGCGGCGATCGAC
TGTCCCAGCTG
Mutagénèse dirigée du
mutant OsLsi1 G88A
OsLsi1-
G89V-F F CGATCGCCGGTGCCCTCATCGTGACGGTGATGATC
Mutagénèse dirigée du
mutant OsLsi1 G89V
OsLsi1-
G89V-R R
CACGATGAGGACACCGGCGATCG
ACTGTCCCAGC
Mutagénèse dirigée du
mutant OsLsi1 G89V
EaLsi1G7
1A-F F
AGCAGCTTCTGCCTTGGCGGTCAT
GATGATAATTC
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 G71A
EaLsi1G7
1A-R R
TGACCGCCAAGGCAGAAGCTGCT
GCTAAACCAAATG
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 G71A
F-EaLsi1-
S70T F
AGCAGCAGCTACTGGCTTGGCGG
TCATGATGATAA
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 S70T
R-EaLsi1-
S70T R
CCGCCAAGCCAGTAGCTGCTGCT
AAACCAAATGAGC
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 S70T
F-EaLsi1-
S70G F
TAGCAGCAGCTGGTGGCTTGGCG
GTCATGATGATAA
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 S70G
R-EaLsi1-
S70G R
ACCGCCAAGCCACCAGCTGCTGC
TAAACCAAATGAG
Mutagénèse dirigée du
mutant EaLsi1 S70G
Préparation de l’ARNc
À partir des cellules compétentes E. coli TOP 10 préalablement transformées avec les
différentes constructions et entreposées à -80°C, une culture bactérienne fraîche a été faite.
Les plasmides ont été récupérés en utilisant le kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). La
26
linéarisation des plasmides contenant le gène d’intérêt a été faite par une digestion avec
l’enzyme SphI. Les produits de digestion ont ensuite été purifiés avec le kit QIAquick PCR
purification (QIAGEN). L’ADN linéaire purifié de chaque construction a été transcrit in vitro
pour obtenir l’ARN complémentaire (ARNc) en utilisant le kit mMESSAGE mMACHINE
T7 ULTRA (Thermo Fisher Scientific). L’ARN complémentaire a finalement été précipité
au phénol-chloroforme et ensuite solubilisé dans l’eau ultra-pure.
Préparation des oocytes et micro-injection
Les oocytes de Xenopus laevis ont été récupérés à leur stade 5 ou 6 grâce à une chirurgie de
la grenouille et transférés dans une solution saline de Barth (voir annexe 1). Un traitement
des oocytes a ensuite été fait avec une solution de 0,1 % de collagénase pendant 1,5 h pour
digérer le collagène retenant les oocytes ensemble. Puis, les oocytes ont été nettoyés 5 fois
avec une solution de Barth sans collagénase et triés pour ne sélectionner que ceux de même
taille et en bonne santé. Ils ont ensuite été incubés 24 h dans la solution de Barth à 18°C. Les
oocytes sélectionnés ont été injectés de 25 nL/oocyte d’ARNc d’une construction à 2 μg/μL
en utilisant l’injecteur Nanoject II. Comme témoin négatif, des oocytes ont été injectés de 25
nL/oocyte d’eau MilliQ RNa-free. Finalement, les oocytes ont été incubés à 18°C pendant
24 h dans la solution de Barth (MBS: 88 mM NaCl, 15 mM HEPES, 2.4 mM NaHCO3, 1
mM KCl, 0.82 mM MgSO4, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca(NO3)2∙4H2O, pH 7.4) contenant
de la pénicilline/streptomycine à 100 μM. Ces oocytes ont été utilisés pour le test d’influx du
Si.
Test d’activité de transport en influx du Si par expression hétérologue chez les oocytes de
Xenopus laevis
Les oocytes préalablement injectés selon la méthode présentée (10 oocytes/réplica) ont été
incubés dans la solution MBS supplémentée en Si 2 mM (Carpentier et al., 2016) pour 10 et
30 minutes à la température ambiante. Les oocytes ont ensuite été nettoyés trois fois dans
une solution à 4°C de 0,32 M sucrose et 5 mM HEPES (pH 7,4). Après les lavages, 25 μL
d’acide nitrique concentré ont été ajoutés à chaque réplica de 10 oocytes puis ces derniers
ont été mis à sécher à 82°C pendant 5 heures. Après l’étape de dégradation des oocytes par
l’acide nitrique, 100μl d’eau milliQ a été ajouté à chaque culot obtenu, puis les tubes ont été
vortexés et centrifugés à 14 500 g pendant 10 minutes. La concentration en Si intracellulaire
27
a ensuite été mesurée dans 10 μL de surnageant avec le spectromètre par absorption Zeeman
atomic AA240Z (Varian) équipé d’un tube atomiseur de graphite Zeeman GTA120. La
courbe standard a été obtenue en utilisant une solution 1000 ppm d’hexafluorosilicate
d’ammonium (Thermo Fisher Scientific). Les données ont été analysées avec le logiciel
SpectrA (Varian). Pour la présentation des résultats, les données ont été exprimées en
moyenne ± erreur-type (SE) provenant de quatre expériences indépendantes contenant
minimalement quatre réplicas.
Ajout d’un tag aux protéines
L’ajout de l’épitope Myc en C-terminal à chacune des constructions OsLsi1WT,G88A,G89V et
EaLsi1WT,S70G,S70T,G71A a été fait pour effectuer une analyse par immunofluorescence. L’ajout
du tag cMyc a été réalisé par amplification de OsLsi1 et EaLsi1 avec des amorces
spécifiquement créées afin d’introduire la séquence du tag Myc en C-terminal avant le codon
stop, en plus d’ajouter les sites de restriction permettant l’insertion dans le plasmide. Une
double digestion du plasmide BamHI/XbaI chez les constructions OsLsi1 et BamHI/HindIII
chez les EaLsi1 a été effectuée afin de permettre l’insertion du gène. Après la ligation du
gène étiqueté dans le plasmide Pol1, une transformation a été faite chez les cellules
compétentes E. coli TOP10 et les plasmides ont été récupérés en utilisant le kit QIAprep Spin
Miniprep (QIAGEN). Les séquences de chacune des constructions ont été confirmées par
séquençage.
Tableau 3 Amorces utilisées pour insérer l'épitope Myc dans les gènes Lsi1
Nom de
l’amorce Direction Séquence Commentaires
OsLsi1-
MycStop-F F
AGTCGGATCCGAATTCATGGCCAGCA
ACAACTCGAG
Pour amplifier
OsLsi1 et ajouter une
séquence tag Myc tag
OsLsi1-
MycStop-R R
CAGTTCTAGATCACAGATCCTCTTCTG
AGATGAGTTTTTGTTCCACTTGGATGT
TCTCCATCTCG
Pour amplifier
OsLsi1 et ajouter une
séquence tag Myc tag
EaLsi1-
MycStop-F F
AGTCGGATCCGAATTCATGACGAAAG
GGGAGATATC
Pour amplifier
EaLsi1 et ajouter une
séquence tag Myc tag
EaLsi1-
MycStop-R-
bon
R
AGTCAAGCTTTCACAGATCCTCTTCTG
AGATGAGTTTTTGTTCAGTGCTTTCAT
CTTCTAGTTTGAG
Pour amplifier
EaLsi1 et ajouter une
séquence tag Myc tag
28
Immunofluorescence
Les oocytes ont d’abord été injectés de 25 nL/oocyte d’ARNc d’une construction à 2 μg/μL
en utilisant l’injecteur Nanoject II et incubés à 18°C pour 24h dans la solution de Barth.
Après l’incubation, les oocytes ont été transférés dans des cupules contenant de l’O.C.T.,
gelés à l’azote liquide et transférés sur glace sèche. Les oocytes ont été cryo-sectionnés à une
épaisseur de 10 μm à l’aide d’un microtome-cryostat ajusté à -18°C pour obtenir des coupes
immédiatement déposées sur des lames à 37°C pour y être séchées.
Pour l’immunofluorescence, les coupes ont d’abord été fixées sur les lames durant 30 minutes
dans une solution de paraformaldéhyde 4 % à température ambiante (RT). La
perméabilisation des lames a par la suite été faite dans une solution tampon Perm (0,3 %
Triton, 1 % BSA, 98,7 % PBS 1X) durant 15 minutes à RT. Puis, le blocage des protéines a
été fait par l’incubation pendant 30 minutes à température ambiante avec la solution de
blocage (1 mL de sérum de chèvre, 1 mL de BSA 10 %. 1 mL de PBS 10X, 7 mL H2O).
L’incubation avec l’anticorps primaire Myc a alors été réalisé pendant 1h à RT. Les lames
témoins ont été laissées dans le tampon de blocage sans anticorps primaire. L’anticorps
secondaire anti-mouse Alexa 488 a ensuite été ajouté pour une incubation de 60 min à RT à
la noirceur. La visualisation et la photographie des lames ont été réalisées avec un microscope
confocal à 20X, à une longueur d’ondes de 488 nm et une puissance de 0,3 %.
Test de perméabilité à l’eau
La perméabilité à l’eau des transporteurs Lsi1 et leurs mutants a été déterminée en suivant le
protocole décrit par Beitz et al. (2006). Après l’injection de l’ARNc et l’incubation
préalablement décrite, les oocytes ont été incubés dans l’eau milliQ durant 180 sec. Durant
cette période, les cellules ont été photographiées toutes les 6 sec sous un champ lumineux à
l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion totale interne (Nikon TIRF).
L’acquisition des images et leur analyse ont été réalisées avec le logiciel NIS-Element 4.0
afin de mesurer l’aire (A) de chaque oocyte. À partir des valeurs d’aire obtenues, le volume
(V) des oocytes a été calculé V = (4/3) × A × (A/π)1/2. Puis, un rapport V/V0 a été calculé
où V = volume final, V0 = volume initial.
29
Résultats
Activité de transport en influx du Si chez les mutants de OsLsi1 dans les
oocytes de Xenopus
L’activité de transport du Si en influx du transporteur OsLsi1 ayant une mutation à la
première position du filtre (OsLsi1 G88A) ou une mutation à la position du G conservé
(OsLsi1 G89V) a été testée. Une quantité significativement plus faible de Si absorbé a été
observée chez le témoin négatif (oocytes injectés à l’eau) comparativement au témoin positif
OsLsi1 WT (Figure 1). Par ailleurs, la glycine substituée par l’alanine à la première position
du filtre (OsLsi1 G88A) n’a pas affecté significativement le transport du Si comparativement
au témoin positif OsLsi1 sans mutation (OsLsi1 WT). L’aquaporine OsLsi1 est demeurée
fonctionnelle avec une mutation à la position 88. En ce qui a trait au mutant du G conservé
(OsLsi1 G89V), un transport de Si semblable au témoin négatif a été détecté en présence de
cette mutation. Une différence d’absorption en Si d’environ 80 % a été remarquée entre
OsLsi1 sauvage et le mutant G89V. Puisque l'absorption de Si chez le mutant a été égale à
celle observée avec le témoin négatif, une substitution G/V à la position 89 chez OsLsi1
suggère une perte complète d'activité. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les temps
d’incubation dans le Si de 10 minutes ou 30 minutes
.
30
Activité de transport en influx du Si chez les mutants de EaLsi1 dans les
oocytes de Xenopus
L’activité de transport du Si en influx du transporteur EaLsi1 ayant une mutation à la
première position du filtre (EaLsi1 S70G/S70T) ou une mutation à la position du G conservé
(EaLsi1 G71A) a été testée (Figure 2). Une quantité significativement plus faible de Si
absorbé a été observée chez le témoin négatif (oocytes injectés à l’eau) comparativement aux
témoins positifs (OsLsi1 WT et EaLsi1 WT). Contrairement à OsLsi1, une mutation de la
première position du filtre chez EaLsi1 a affecté le transport du Si. De fait, le taux
d’absorption du Si des mutants EaLsi1 S70G et S70T a été semblable au témoin négatif.
L’aquaporine EaLsi1 a perdu sa perméabilité au Si suite à une mutation à la position 70. Pour
ce qui est du mutant du G conservé (EaLsi1 G71A), un taux d’absorption en Si similaire au
témoin négatif a été mesuré. Les mêmes conclusions ont été obtenues pour les temps
d’incubation dans le Si de 10 min ou 30 min.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
H20 OsLsi1 WT OsLsi1 G88A OsLsi1 G89V
Conte
nu e
n S
i (n
mol/
oocy
te)
t = 10 min
t = 30 min
Figure 1 Activité en influx des transporteurs OsLsi1 et de ses mutants mesurée chez les
oocytes de Xenopus laevis. L'absorption en Si a été mesurée dans le temps dans les oocytes
de X. laevis injectés à l'eau (témoin) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1 WT) et de ses mutants
(OsLsi1 G88A et OsLsi1 G89V). Avant le dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou
30 min dans la solution MBS enrichie de Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes
± erreur-type (SE) (n = 4)
31
Figure 2 Activité en influx des transporteurs EaLsi1 et de ses mutants mesurée chez les
oocytes de Xenopus laevis. L'absorption en Si a été mesurée dans le temps dans les oocytes
de X. laevis injectés à l'eau pour le témoin négatif, avec l’ARNc de OsLsi1 WT pour le témoin
positif ou avec l'ARNc du transporteur EaLsi1 WT et ses mutants (EaLsi1 G71A, EaLsi1
S70G, EaLsi1 S70T). Avant le dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou 30 min dans
la solution MBS enrichie de Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes ± erreur-
type (SE) (n = 4)
Immunofluorescence
Les tests de localisation des transporteurs OsLsi1, EaLsi1 et de leurs mutants étiquetés avec
l’épitope Myc en C-terminal ont été réalisés afin d’évaluer leur expression. Les oocytes,
ayant été préalablement injectés avec l’ARNc d’une construction, ont ensuite été cryo-
sectionnés. Les aquaporines Lsi1 ont été détectées grâce aux traitements avec l’anticorps
primaire Myc et l’anticorps secondaire anti-mouse Alexa 488. Les résultats
d’immunofluorescence ont démontré que le transporteur OsLsi1 et ses mutants G88A et
G89V étaient bel et bien présents à la surface des cellules (Figure 3). À l’inverse, le
transporteur EaLsi1 de type sauvage ne semble pas être exprimé spécifiquement à la
membrane mais plutôt uniformément dans la cellule. Pour ce qui est du mutant G71A, il ne
semble pas être exprimé dans les oocytes puisque le résultat est semblable au traitement
témoin.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
H2O OsLsi1 WT EaLsi1 WT EaLsi1
G71A
EaLsi1
S70G
EaLsi1 S70T
Conte
nu e
n S
i (n
mol/
oocy
te) t = 10 min
t = 30 min
32
Figure 3 Localisation des aquaporines et leurs mutants par immunofluorescence. Les oocytes
injectés à l’eau ont été utilisés comme témoin négatif (A). L’aquaporine OsLsi1 de type
sauvage est constatée à la membrane des oocytes (B). Le mutant OsLsi1 G88A est également
largement présent à la membrane (C), de même que le mutant du G conservé OsLsi1 G89V
(D). Pour le EaLsi1 de type sauvage (E), la localisation est plutôt uniforme dans la cellule.
Le mutant du G conservé EaLsi1 G71A (F) ne montre aucun signe d’expression dans la
cellule.
Un test d’influx des transporteurs OsLsi1, EaLsi1 et de leurs mutants étiquetés avec l’épitope
Myc en C-terminal a été réalisé afin de s’assurer que la présence du tag n’affectait pas
l’activité de transport du Si. Les résultats présentés à la Figure 4 indiquent que l’ensemble
des constructions étiquetées ont permis un transport de Si similaire aux gènes non étiquetés
obtenus précédemment.
33
Test de perméabilité à l’eau
Un test pour évaluer le transport de l’eau des aquaporines OsLsi1, EaLsi1 et leurs mutants a
été effectué. Le témoin négatif était représenté par des oocytes injectés à l’eau milliQ, tandis
que le témoin positif correspondait à l’aquaporine humaine AQP7, une aquaporine connue
pour permettre un transport de l’eau (Sohara et al., 2005). Une légère augmentation du
volume des oocytes du traitement OsLsi1 WT comparativement au témoin négatif a été
observée, mais cette augmentation était significativement inférieure au témoin positif AQP7.
La mutation du G conservé (OsLsi1 G89V) chez OsLsi1 a occasionné un arrêt du transport
de l’eau par l’aquaporine, ce qui a produit une augmentation du volume des oocytes
comparable à celle observée chez le témoin négatif. Un transport de l’eau similaire au témoin
négatif a également été observé pour l’aquaporine EaLsi1 WT et son mutant du G conservé
(EaLsi1 G71A).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
H20 OsLsi1
WT Myc
OsLsi1
G88A
Myc
OsLsi1
G89V
Myc
EaLsi1
WT Myc
EaLsi1
G71A
Myc
EaLsi1
S70G
Myc
EaLsi1
S70T
Conte
nu e
n S
i (n
mol/
oocy
te)
t = 10 min
t = 30 min
Figure 4 Activité en influx des transporteurs de silicium (Si) contenant un tag Myc chez les
oocytes de Xenopus laevis. L'absorption en Si a été mesurée dans le temps dans les oocytes
de X. laevis injectés à l'eau (témoin négatif) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1 WT Myc), des
mutants du riz (OsLsi1 G88A Myc et OsLsi1 G89V Myc), de la prêle (EaLsi1 WT Myc) et
de ses mutants (EaLsi1 G71A Myc, EaLsi1 S70G Myc et EaLsi1 S70T Myc). Avant le
dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou 30 min dans la solution MBS enrichie de
Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes ± erreur-type (SE) (n = 4)
34
Figure 5 Test de perméabilité à l’eau chez différentes aquaporines. Pendant l’incubation des
oocytes exprimant les différents transporteurs Lsi1 dans l’eau milliQ, les oocytes ont été
photographiés pour mesurer leur volume. La perméabilité à l’eau a été mesurée dans les
oocytes de Xenopus laevis injectés à l'eau (témoin négatif) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1
WT Myc), le mutant du G conservé du riz (OsLsi1 G89V Myc), de la prêle (EaLsi1 WT
Myc), le mutant du G conservé de la prêle (EaLsi1 G71A Myc) ainsi que l’aquaporine
humaine AQP7 comme témoin positif. Les valeurs présentées sont les moyennes du rapport
du volume final (V0) sur le volume initial (V) de quatre expériences ± erreur-type (SE) (n =
4) dont chaque expérience contenait 5 oocytes par traitement.
Discussion
Les effets bénéfiques du Si chez les plantes ont incité à trouver des moyens pour bénéficier
de ces effets en agriculture. Malgré la découverte des transporteurs de Si, les mécanismes
moléculaires expliquant l’absorption efficace du Si demeurent encore peu compris. L’étude
présente visait à mieux définir les paramètres moléculaires impliqués dans la fonctionnalité
et la perméabilité du Si du transporteur d’influx Lsi1. La signature GSGR du filtre sélectif
constitue aujourd’hui le critère majeur quant à la sélectivité du Si des NIPIII (Coskun et al.,
2019). Les résidus G-S permettent la formation d’une constriction plus large, facilitant ainsi
le passage de l’acide silicique (4.38 Å) (Hove et Bhave, 2011). Pourtant, plusieurs espèces
présentent un filtre de type ASGR, comme Vigna radiata et Phaseolus vulgaris (Trembath-
Reichert et al., 2015). Dans ce projet, nous avons tenté de redéfinir la première position du
filtre ar/R impliquée dans le passage sélectif du Si chez les transporteurs Lsi1.
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
1,16
1,18
H20 OsLsil1 WT OsLsil1
G89V
EaLsil1 WT EaLsil1
G71A
AQP7
V/V
0
35
Une étude par mutagénèse a été effectuée afin de mesurer l’impact des mutations sur la
fonctionnalité des transporteurs de Si. Le transporteur de Si du riz (OsLsi1), composé d’un
filtre ar/R de type GSGR, et le transporteur NIPII de la prêle (EaLsi1), formé d’un filtre
STAR, sont les deux espèces fortement accumulatrices qui ont servi de modèles pour l’étude
de mutagenèse. Le transport du Si des mutants a été mesuré par expression hétérologue chez
des oocytes de Xenopus laevis. Une substitution de l’acide aminé à la première position du
filtre ou une substitution à la position adjacente, appelée « G conservé », ont été les mutations
étudiées. Les résultats obtenus chez OsLsi1 ont présenté une perte de fonctionnalité majeure
du transporteur lors d’une mutation du G conservé (OsLsi1 G89V). À l’inverse, aucun impact
d’une mutation à la première position du filtre sélectif (OsLsi1 G88A) n’a été mesuré. Chez
EaLsi1, les substitutions de la sérine vers la glycine ou la thréonine à la première position du
filtre (EaLsi1 S70G/S70T) ainsi que la mutation du G conservé en alanine ont toutes entrainé
une faible accumulation en Si. Les tests d’immunofluorescence démontrent que les mutations
G88A et G89V chez OsLsi1 n’ont pas affecté l’expression membranaire de la protéine, mais
uniquement le transport du Si. À l’inverse, la mutation G71A chez EaLsi1 a semblé affecter
l’expression du transporteur puisqu’aucune fluorescence n’a été remarquée.
Dans un récent article, Kirscht, Kaptan et al. (2016) ont révélé la présence d’un cinquième
acide aminé dans le filtre sélectif ar/R de toutes les aquaporines appartenant spécifiquement
à la famille des Tonoplast Intrinsic Proteins (TIPs). Cette cinquième position n’est cependant
pas conservée au sein des autres familles d’aquaporines. Cela suggère qu’il peut exister de la
variabilité au niveau du filtre ar/R entre les familles et sous-familles d’aquaporines. De ce
fait, il est possible que la première position du filtre des NIPIII se différencie des autres
familles. À la lumière des résultats obtenus, il semble que la première position actuelle du
filtre sélectif est moins impliquée dans la sélectivité du Si que la position adjacente. En effet,
une mutation G/V de la position 89 chez OsLsi1 a grandement affecté la perméabilité au Si
du canal, contrairement à la mutation G/A de la position 88 qui n’a entrainé aucun
changement d’activité de transport. Cela suggère que la position 88 chez OsLsi1 ne participe
pas à la perméabilité du Si. Préalablement à ce projet, des tests similaires ont également été
réalisés chez plusieurs espèces possédant un filtre sélectif ASGR et les résultats ont été
comparables (résultats non publiés). De plus, les résultats obtenus par Mitani et al. (2011)
apportent une confirmation supplémentaire quant à l’effet de la mutation G88A. Tout comme
36
nos résultats, ils révèlent qu’une mutation G/A de la première position du filtre chez OsLsi1
n’a pas affecté le transport du Si. D’après notre étude, la première position n’est pas critique
dans le transport du Si et ne fait donc pas partie intégrante du filtre sélectif des transporteurs
Lsi1. À l’inverse, la position adjacente est un résidu clé impliqué dans la sélectivité du Si
chez les aquaporines Lsi1. Selon des analyses préalables de centaines d’alignement
d’aquaporines NIPIII, il semblerait d’autant plus qu’un changement de la première position
du filtre ar/R à la position adjacente du G conservé rendrait plus uniforme ce filtre chez
l’ensemble des monocotylédones. Ces résultats vont à l’encontre de la signature moléculaire
des NIPIII suggérée par Ma et al. (2006). Nos résultats suggèrent donc une redéfinition du
mécanisme moléculaire d’absorption du Si et de la composition du filtre sélectif ar/R des
transporteurs NIPIII.
Puisque la prêle est une plante ancestrale et que le transporteur EaLsi1 fait plutôt partie de la
sous-famille d’aquaporines NIPII, il est possible que les résidus clés impliqués dans la
perméabilité se différencient des aquaporines NIPIII (Grégoire et al., 2012). Les résultats
contradictoires entre OsLsi1 et EaLsi1 quant à l’effet engendré par la mutation de la première
position du filtre pourraient être expliqués par une variation entre le filtre ar/R des
aquaporines NIPII comparativement aux NIPIII. L’arrêt du transport en Si lors d’une
mutation de la position 70 (EaLsi1 S70G et EaLsi1 S70T) pourrait donc être lié à cette
classification différente. Cette différence évolutive du transporteur de Si chez la prêle
pourrait également justifier l’expression uniforme de ce transporteur dans la cellule (Figure
3) puisqu’il a été démontré que plusieurs NIPs ont une localisation intracellulaire
principalement au niveau du réticulum endoplasmique, qui est retrouvée de façon uniforme
dans la cellule (Wudick et al., 2009). Dans le cas des mutations à la position 70, il est
également plausible qu’une substitution de l’acide aminé sérine ait modifié la configuration
de la protéine puisqu’il s’agit d’un changement chimique plus complexe. L’acide aminé
thréonine, très semblable à la sérine autant au niveau des caractéristiques de la chaine latérale
que de la polarité, a pourtant engendré les mêmes effets sur le transport du Si que la
substitution par la glycine. Le score Grantham indique également une très forte similarité
entre la sérine, la glycine et la thréonine (Grantham, 1974). Les résultats suggèrent donc que
la sérine à la position 70 chez EaLsi1 est critique pour la sélectivité du Si. Cependant, des
études d’expression seraient nécessaires pour appuyer cette hypothèse. Pour ce qui est de la
37
mutation du G conservé chez EaLsi1 ayant occasionné un arrêt du transport du Si, il n’est
pas possible de conclure que cette position est spécifiquement impliquée dans la sélectivité
du Si puisque les tests par immunofluorescence indiquent une absence d’expression. La
mutation G71A entraine possiblement un arrêt de l’expression protéique chez les NIPII.
Ainsi, nos résultats n’ont pas remis en question la signature moléculaire de type STAR du
filtre ar/R chez les transporteurs de Si des plantes ancestrales. Des études supplémentaires
sont nécessaires chez les NIPII de ces plantes primitives.
La faible capacité de l’aquaporine OsLsi1 à transporter l’eau (Figure 5), ainsi que l’arrêt
complet de ce faible transport chez le mutant G89V démontrent que le G conservé est
impliqué dans la perméabilité des molécules. Ce faible flux d’eau permis par l’aquaporine
OsLsi1 WT est cependant loin d’être aussi important que le transport de Si mesuré dans les
tests d’influx. Cela suggère que le passage du Si au travers du transporteur n’est pas
simplement lié au flux de l’eau comme le proposent Exley et Guerriero (2019). En plus des
résultats présentés dans ce mémoire qui montrent l’influence des mutations sur la
perméabilité du transporteur, de nombreuses études prouvent également l’implication du
Lsi1 dans le transport spécifique du Si (Coskun et al., 2019; Ma et al., 2001).
En conclusion, ce travail met en lumière le fait qu’un changement de la première position du
filtre sélectif ar/R soit valable uniquement chez les transporteurs de Si des plantes
supérieures, appartenant aux NIPIII. Ces mêmes conclusions ne peuvent être émises pour les
transporteurs de Si des plantes ancestrales. Ce projet a ainsi mené à une meilleure
compréhension des facteurs moléculaires impliqués dans la perméabilité du Si. Cette avancée
permettra de moduler de manière plus précise le passage de cet élément chez les plantes afin
de générer des cultures ayant une absorption en Si plus efficace. Ces nouvelles connaissances
pourraient éventuellement mener à de nouvelles applications en agriculture, puisque ces
transporteurs ont le potentiel d’être exprimés dans des cultures d’importance qui n’absorbent
pas cet élément et ainsi améliorer la résistance aux divers stress. Cette approche s’inscrirait
bien dans une optique de réduction planétaire d’utilisation de pesticides.
38
Chapitre 3 : Étude de l’accumulation en silicium et de la
résistance à Leptosphaeria maculans chez Brassica napus
génétiquement modifié avec le gène Lsi1
39
Introduction
L’importance du silicium (Si) chez les plantes a depuis plusieurs décennies été rapportée.
Retrouvé en très grandes quantités dans l’environnement, le Si n’est cependant par considéré
comme un élément essentiel pour les plantes. Il se retrouve disponible pour les plantes sous
la forme d’acide silicique (Si(OH)4) et peut être absorbé par les racines à des pH inférieurs à
9 (Ma et al., 2001). Cette molécule se caractérise par une solubilité dans l’eau jusqu’à 2 mM
à 25°C et une polymérisation sous forme de gel à des concentrations supérieures (Takahashi,
1978). Dans la solution du sol, l’acide silicique se retrouve généralement à des concentrations
allant de 0,1 à 0,6 mM (Ma et al., 2001). Après l’absorption du Si dans les racines, la molécule
atteint le xylème et est transportée dans les parties aériennes pour y être déposée sous forme
de silice amorphe ou de gel de silice (SiO2 + nH20). Le Si est un élément peu mobile, ce qui
explique son accumulation principalement dans les tissus âgés de la plante (Ma et Yamaji,
2006).
Parmi les effets bénéfiques du Si chez les plantes, on remarque principalement une meilleure
résistance à divers stress abiotiques et biotiques (Coskun et al., 2019). On rapporte que le Si
favorise une meilleure tolérance à la toxicité des métaux, aux stress hydriques et salins. De
même, l’élément améliore la résistance des plantes exposées aux basses températures, aux
déséquilibres nutritifs, aux extrêmes de température et aux radiations UV. Toutefois la
majorité des effets observés du Si sont associés à une meilleure défense contre les stress
biotiques. C’est particulièrement au niveau des infections fongiques que le rôle
prophylactique de cet élément se fait remarquer (Fauteux et al., 2005). Les études rapportent
que les champignons biotrophes et hémibiotrophes sont les organismes les plus réprimés par
le Si chez les plantes. Les effets du Si présentent deux particularités bien reconnues
aujourd’hui. Dans un premier temps, seules les plantes ayant la capacité d’accumuler
l’élément peuvent en bénéficier. D’autre part, ses effets bénéfiques sont observés seulement
en conditions de stress.
Bien que le Si soit généralement abondant dans les sols, sa proportion dans les tissus des
plantes terrestres varie entre 0,1 et 10 % du poids sec (Liang et al., 2015). En réalité, les
plantes n’ont pas toutes la capacité d’absorber le Si en grande quantité, ce qui explique
pourquoi elles sont catégorisées selon leur teneur en cet été élément. On retrouve les faibles
40
accumulateurs (< 0,5 %), les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5 %), et les forts
accumulateurs (˃ 1,5 % du poids sec) (Hodson et al., 2005). Cette variabilité d’absorption
est aujourd’hui expliquée par la présence de transporteurs de Si au niveau des cellules
racinaires, appelés Lsi1 et Lsi2 (Ma et al., 2006; Ma et al., 2007). Le transporteur Lsi1 est
une aquaporine membranaire qui permet l’entrée en influx du Si de la solution du sol dans
les cellules racinaires. Sa présence explique en grande partie la forte accumulation de Si
possible chez les plantes. Les Poacées rassemblent plusieurs espèces porteuses du gène Lsi1
et, de ce fait, sont de fortes accumulatrices de Si. À l’inverse, les espèces de la famille des
Brassicaceae comme Arabidopsis thaliana et Brassica napus figurent parmi les faibles
accumulateurs et ne possèdent pas de gène Lsi1.
Des études réalisées chez Arabidopsis thaliana transformé génétiquement avec le gène
d’absorption du Si Lsi1 ont révélé que l’ajout de ce transporteur permettait à la plante de
bénéficier des effets du Si (Vivancos et al., 2015). Ces auteurs ont en effet démontré que la
présence du gène TaLsi1 chez Arabidopsis contribuait à une meilleure résistance au blanc
poudreux. Il semblerait, par conséquent, que les effets du Si sont universels et que la capacité
d’absorption de l’élément dans les tissus est le principal facteur limitant les plantes à en
profiter. Il s’avère donc envisageable de générer des plants plus résistants aux stress grâce à
l’insertion du gène Lsi1.
Dans ce présent projet, nous nous intéressons à mesurer l’effet du Si chez le canola (Brassica
napus L.) transformé avec le gène Lsi1. Étant donné que cette culture est largement répandue
au Canada et qu’elle fait aujourd’hui face à plusieurs difficultés, incluant la présence de
maladies, il paraît primordial de trouver de nouvelles méthodes pour lutter contre les stress
qu’elle subit. Sachant qu’Arabidopsis fait partie de la même famille que le canola, une
transformation avec le gène Lsi1 permettrait potentiellement d’améliorer sa capacité à lutter
contre divers agents pathogènes. Nous posons donc la première hypothèse que le canola
transformé avec Lsi1 accumule des quantités supérieures de Si dans ses parties aériennes
comparativement au canola non transformé. En seconde partie, nous posons l’hypothèse que
les plants de canola transformés avec Lsi1 sont plus tolérants au champignon hémibiotrophe
Leptosphaeria maculans Desm. Cet organisme est l’agent pathogène engendrant les pertes
économiques les plus importantes dans la culture de canola au Canada. L’objectif de cette
41
présente étude est de démontrer que les effets du Si chez les plantes sont universels et qu’ils
dépendent uniquement de la capacité des plantes à absorber l’élément. L’objectif sous-jacent
vise à démontrer que les plants de canola génétiquement modifiés avec le gène Lsi1
bénéficient d’apports supérieurs en Si. Le taux de Si dans les parties aériennes a été mesuré
chez les plants transformés et non transformés préalablement fertilisés au Si ou non afin de
mesurer leur capacité relative à accumuler l’élément. Les plants de canola transformés ont
ensuite été inoculés avec L. maculans en plus de la fertilisation en Si pour évaluer leur
résistance au stress.
Matériels et méthodes
Production des plants de canola transgéniques
L’espèce modèle Brassica napus (canola), une plante faiblement accumulatrice de Si, a été
transformée avec un des deux homologues de Lsi1 à l’étude afin de permettre l’absorption
de Si. Certains plants de canola de la variété Westar ont subi une transgénèse de manière à
introduire le gène VaNIP2-1 (VaLsi1), un transporteur de Si provenant de Vigna angularis,
et d’autres le gène CaNIP2-1 (CaLsi1), un transporteur de Si provenant de Cicer arietinum.
Le vecteur pCAMBIA-1302 a été utilisé pour la transformation. La présence du promoteur
constitutif CaMV 35S dans la construction a permis de réguler l’expression du gène Lsi1. Le
marqueur de sélection bactérien utilisé a été la kanamycine, tandis que le marqueur de
sélection végétal a été l’hygromycine. Agrobacterium tumefaciens GV3101 comportant la
construction 35S::VaNIP2-1 ou 35S ::CaNIP2-1 a été utilisé pour faire la transformation du
canola. Les transformants (T0) ont été régénérés et sélectionnés par une germination sur un
milieu contenant l’hygromycine comme agent de sélection. Les plants résistants à
l’hygromycine ont été transférés dans des pots contenant du terreau et laissés pousser en serre
sous conditions contrôlées. La présence du transgène VaLsi1 ou CaLsi1 a par la suite été
vérifiée par amplification PCR en utilisant les amorces spécifiques à ces gènes (Tableau 4).
Une fois la floraison et la maturation des siliques, les graines T1 de chaque plant ont été
récoltées individuellement.
42
Tableau 4 Amorces utilisées pour détecter le transgène VaNIP2-1 ou CaNIP2-1 chez le
canola transgénique.
Nom de
l’amorce
Direction Séquence Commentaire
VaNIP2-
1-F
F ATGGAAGGTACCAGCCCAAACAC
Pour détecter le gène
VaNIP2;1 dans le canola
transgénique
VaNIP2-
1-R
R TCAAACCAAGCTTCGTTGGTCGG
Pour détecter le gène
VaNIP2;1 dans le canola
transgénique
CaNIP2-
1-F
F ATGGACAGAAGAACACACAGTTT
Pour détecter le gène
CaNIP2;1 dans le canola
transgénique
CaNIP2-
1-R
R TCACACTGAACATTGATTGTCCT
Pour détecter le gène
CaNIP2;1 dans le canola
transgénique
Croissance des plants de canola
Les graines de canola Westar WT, VaLsi1 et CaLsi1 ont d’abord été stérilisées avec 1 %
d’hypochlorite de sodium pendant 5 minutes puis rincées plusieurs fois à l’eau distillée. Les
graines de canola ont ensuite été semées à une profondeur de 1,5-2,0 cm dans la vermiculite
et arrosées à l’eau distillée. La photopériode pour la germination a été de 16h à une
température de 16 °C la nuit et 22°C le jour. Une semaine après le semis, les plantules ont
été transplantées dans des pots individuels de 8 pouces contenant du terreau Promix et
fertilisées avec un engrais 20-20-20. Préalablement à la transplantation, le terreau a été saturé
d’eau Si+/Si- selon les traitements. L’eau Si+ était composée d’eau de pluie, de silicate de
potassium (Kasil®, PQ Corporation) à 1,7 mM et d’hydroxyde de potassium pour corriger le
pH à 6,5. L’eau Si- était composée d’eau de pluie uniquement. Durant toute la croissance des
plants, ils ont été arrosés à l’eau de pluie, fertilisés au 20-20-20 et en Si+/Si- deux fois par
semaine avec un volume égal pour tous les plants. Ce volume variait d’une fertilisation à
l’autre selon l’humidité du terreau (100 mL ou 200 mL). Les conditions de croissance dans
la serre ont été maintenues identiques à celles de la période de germination, c’est-à-dire 16°C
la nuit, 22°C le jour et une photopériode de 16h.
43
Six semaines plus tard, une fois le stade de floraison atteint, une vielle feuille ainsi qu’une
jeune feuille de chaque plant ont été récoltées et lyophilisées. Ces deux feuilles ont été
récoltées sur un total de cinq plants différents par traitement. Une extraction d’ADN de
chaque canola transgénique a également été réalisée, suivie d’une amplification PCR des
gènes VaNIP2-1 et CaNIP2-1 avec des amorces spécifiques selon les échantillons afin de
confirmer la présence du transgène.
Détermination de la concentration en Si dans les feuilles
Afin de déterminer la concentration en Si des tissus végétaux récoltés préalablement, les
échantillons de feuilles préalablement lyophilisées ont été broyées séparément en une poudre
fine avec un broyeur à billes. Des pastilles de 13 mm de diamètre x 5 mm d’épaisseur ont par
la suite été faites grâce à une intense compression de la poudre. Puis, les pastilles ont été
dosées en Si avec le X-ray fluorescence (XRF) (Niton XL3t GOLDD XRF Analyzer, Thermo
Fisher Scientific) selon la procédure de Reidinger et al. (2012).
Préparation de l’inoculum de Leptosphaeria maculans, inoculation des plants et mesure de
la sévérité de la maladie
Des nouvelles cultures de L. maculans ont été préparées sur milieu de culture V8-Agar
contenant 200 ml de V8, 15 g d’agar et 0,75 g de CaCO3. Elles ont ensuite été entreposées à
température ambiante pendant 14 jours pour obtenir des cultures sporulantes. Deux semis du
témoin et de chaque transformant (WT, VaLsi1 et CaLsi1) ont été effectués à une semaine
d’intervalle afin d’obtenir deux lots de plants d’âges distincts. Après la germination, la
transplantation et la fertilisation ont été réalisées de la manière décrite précédemment, les
plants âgés de 6 semaines et de 5 semaines ont été inoculés avec L. maculans. L’inoculation
a été réalisée le même jour pour les deux lots afin d’uniformiser les conditions d’inoculation.
Pour l’inoculation, une légère blessure au niveau du limbe a été faite au scalpel sur les deux
plus vieilles feuilles matures de chaque plant (Huang et al., 2006). Une pastille de mycélium
de L. maculans sur gélose V8 Agar a ensuite été placée sur chaque blessure tête vers le bas
et maintenue collée grâce à un tissu collant de type Hypafix®. Deux jours avant l’inoculation,
les conditions de la serre ont été ajustées à 90 % d’humidité relative, 12°C (nuit) et 24 °C
(jour) afin de favoriser le développement du champignon. Ces conditions ont été maintenues
44
jusqu’à 48h après l’inoculation. Une photopériode de 16 heures a été conservée durant
l’ensemble de l’expérimentation. Les mesures de la sévérité ont été réalisées 14 jours après
l’inoculation en mesurant le diamètre des lésions en afin d’estimer l’étendue des dommages.
Analyses statistiques
Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ± erreur-type (SE). Les différences
entre les moyennes ont été analysées en suivant le test de comparaisons multiples de Tukey
basé sur l’analyse de la variance (ANOVA) et ont été considérées significatives à P < 0,05.
Résultats
Caractérisation des plantes transgéniques
La présence de l’insert VaLsi1 ou CaLsi1 a d’abord été analysée pour l’ensemble des plants
de canola utilisés pour les différents tests. Les résultats d’amplification démontrent que la
majorité des plants de canola T1 possèdent l’insertion. Les plants de canola démontrant une
amplification PCR du gène VaLsi1 ou CaLsi1 (Figure 6 et 7) ont été sélectionnés pour les
expérimentations. L’ensemble de plants de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 sont
respectivement issus d’un seul évènement de transformation.
Figure 6 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert VaLsi1 chez les différents
plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non
(Si-) en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert VaLsi1
attendue étant de 867 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément
les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.
45
Figure 7 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert CaLsi1 chez les différents
plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non
(Si-) en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert CaLsi1
attendue étant de 822 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément
les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.
Accumulation de Si chez le canola transformé avec VaLsi1
L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène
Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une
quantité significativement plus élevée de Si s’est accumulée dans les feuilles de plants
transformés avec VaLsi1 sans fertilisation en Si (VaLsi1 Si-) comparativement aux feuilles
de canola témoin sans transformation et sans fertilisation en Si (WT Si-) (Figure 8). Pour ce
qui est des traitements avec fertilisation en Si (Si+), une accumulation en Si près de 40 %
plus importante a été remarquée chez les plants transformés avec VaLsi1 comparativement
aux plants de canola WT. Pour l’ensemble des plants WT ou transformés, une quantité
supérieure en Si a été principalement observée dans les vieilles feuilles. Une diminution
graduelle du niveau de Si a été mesurée entre les vieilles feuilles, les feuilles centrales et les
jeunes feuilles. En plus d’accumuler plus de Si dans ses tissus comparativement au canola
WT Si- et Si+, le canola transformé avec VaLsi1 et fertilisé en Si a accumulé
significativement plus de Si que son équivalent sans fertilisation en Si. Par, ailleurs, les taux
46
de Si dans les feuilles des plants WT Si+ sont comparables aux taux retrouvés dans les
feuilles des plants VaLsi1 Si-.
Accumulation de Si chez le canola transformé avec CaLsi1
L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène
Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une
quantité significativement plus élevée de Si a été obtenue dans les feuilles de canola soumis
à un traitement Si+ (WT et CaLsi1 Si) comparativement aux traitements Si- (WT et CaLsi1)
(Figure 9). Cependant, aucune différence significative d’accumulation en Si n’a été
remarquée entre les plants de canola WT Si+ et CaLsi1 Si+ au niveau des vieilles feuilles.
Une quantité supérieure de Si a néanmoins été mesurée dans les jeunes feuilles de plants de
canola CaLsi1 Si+ en comparaison aux jeunes feuilles de plants de canola WT Si+.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
WT Si- WT Si+ VaLsi1 Si- VaLsi1 Si+
Co
nte
nu
en
Si
(mg/g
MS
)
Vieilles feuilles
Feuilles centrales
Jeunes feuilles
Figure 8 Contenu en silicium (Si) des feuilles de plants de canola Westar WT et de plants
transformés avec le gène VaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7
mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles, les
feuilles centrales et les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type
(SE) de cinq réplicas biologiques indépendants.
47
Figure 9 Contenu en Si dans les feuilles chez les plants de canola Westar WT et les plants
transformés avec le gène CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7
mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles et
les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de six réplicas
biologiques indépendants.
Sévérité de la maladie causée par Leptosphaeria maculans chez les plants
de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 et fertilisés en Si.
Après la croissance, la fertilisation en Si et l’inoculation avec Leptosphaeria maculans, la
sévérité de la maladie a été mesurée chez les plants de canola WT et les plants transformés
avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 afin d’évaluer l’effet protecteur du Si chez les plantes.
Quatorze jours après l’inoculation, la sévérité de la maladie a été évaluée en mesurant le
diamètre des lésions aux régions inoculées et en calculant par la suite leur aire (mm2). Pour
les plants inoculés après 6 semaines de croissance, la sévérité de la malade n’a pas été
différente entre les traitements Si+ et Si- autant chez le canola WT, que chez les
transformants VaLsi1 et CaLsi1 (Figure 10. A). Ce même constat a été fait chez les plants
âgés de 5 semaines lors de l’inoculation (Figure 10. B). De plus, la taille des lésions chez les
plants de canola WT et les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1 n’a présenté aucune
différence significative selon le traitement Si, et ce, pour les plants âgés de 5 ou de 6
semaines.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
WT Si- WT Si+ CaLsi1 Si- CaLsi1 Si+
Conte
nu e
n S
i (m
g/g
MS
)Vieilles feuilles
Jeunes feuilles
48
Un aperçu des plants et des lésions pour chaque traitement est présenté à la Figure 11. La
santé des plants est demeurée similaire entre ceux venant de canola WT, VaLsi1 ou CaLsi1,
qu’ils aient été fertilisés en Si ou non. Un flétrissement des vieilles feuilles ainsi qu’une
décoloration foliaire ont été remarqués pour l’ensemble des traitements. Pour ce qui est des
lésions causées par le champignon L. maculans, aucune différence visuelle n’a été identifiée.
Dans tous les cas, le centre des lésions a présenté les symptômes typiques d’une infection par
ce champignon, soit des tissus nécrosés de couleur grise envahis de pycnides ainsi qu’un halo
jaune illustrant une chlorose des tissus environnants. Aucun symptôme de la maladie n’a été
remarqué dans les tissus n’ayant pas subi d’inoculation.
0
50
100
150
200
250
300
350
WT VaLsi1 CaLsi1
Air
e de
la l
ésio
n (
mm
2)
ASi-
Si+
0
50
100
150
200
250
300
350
WT VaLsi1 CaLsi1
Air
e de
la l
ésio
n (
mm
2)
BSi-
Si+
Figure 10 Aire des lésions causées par Leptosphaeria maculans sur les feuilles de plants de
canola Westar WT, de plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 fertilisés (Si+) ou
non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). L’aire (mm2) des lésions a été mesurée sur les
feuilles centrales. Les plants étaient âgés de 6 semaines (A) ou 5 semaines (B) lors de
l’inoculation. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de quatre réplicas
biologiques indépendants.
49
Si -
A B
C D
E F
Si +
Figure 11 Lésions causées par Leptosphaeria maculans chez des plants de canola non
transgéniques (WT), transformés avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou avec le
gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) traités ou non avec le silicium (Si). Lésions sur plants
WT Si- (A), WT Si+ (B), VaLsi1 Si- (C), VaLsi1 Si+ (D), CaLsi1 Si- (E) et sur CaLsi1 Si+
(F). L’inoculation a été effectuée sur les vieilles feuilles et la taille des lésions a été mesurée
au point d’inoculation. Les plants représentés étaient âgés de 5 semaines lors de
l’inoculation.
50
Le contenu en Si des plants de canola WT, VaLsi1 et CaLsi1 inoculés avec L. maculans a été
mesuré chez les feuilles centrales. Les taux de Si des plants sans fertilisation au Si ont été
similaires entre les WT, les VaLsi1 et les CaLsi1. À l’inverse, une différence significative a
été remarquée en comparant les niveaux de Si des traitements Si- avec leur équivalent Si+.
De plus, une quantité supérieure de Si a été mesurée chez les plants des transformants VaLsi1
Si+ et CaLsi1 Si+ comparativement aux plants de canola WT Si+. Par ailleurs,
l’accumulation en Si entre les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1, ont été
comparables.
Discussion
Après la transformation du cultivar de canola Westar avec le gène Lsi1 de Vigna angularis
(VaLsi1) ou de Cicer aretinum (CaLsi1), l’accumulation de Si dans les parties aériennes a
été mesurée chez les plants fertilisés ou non en Si (Si+/Si-). Les résultats obtenus ont révélé
que les plants de canola transformés avec le gène VaLsi1 et fertilisé au Si accumulaient près
de 40 % plus de cet élément dans les vieilles feuilles que les plants WT Si+. L’insertion du
gène VaLsi1 chez le canola a donc permis une amélioration de l’absorption de Si dans les
0
0,05
0,1
0,15
0,2
WT VaLsi1 CaLsi1
Conte
nu e
n S
i (m
g/g
MS
) Si-
Si+
Figure 12 Contenu en Si dans les feuilles centrales des plants inoculés avec Leptosphaeria
maculans chez le canola transgénique et non transgénique. Mesures chez les plants de canola
Westar non transgéniques (WT), transformés avec Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou
transformés avec Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) et fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une
solution de Si (1,7 mM). Les feuilles mesurées provenaient des plants âgés de 5 semaines lors
de l’inoculation. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de quatre réplicas
biologiques indépendants.
51
parties aériennes. Toutefois, les taux d’accumulation du transformant VaLsi1 Si+ n’étaient
pas très élevés, ce qui a maintenu les plants à des niveaux correspondant aux faibles
accumulateurs, soit inférieurs à 0,5 % du poids sec (Hodson et al., 2005). Il semblerait, par
conséquent, que la transformation du canola avec le gène VaLsi1 n’a pas permis d’augmenter
l’accumulation du Si à des niveaux suffisamment importants pour produire de forts
accumulateurs. Une meilleure caractérisation des transformants au niveau du nombre de
copies du transgène et de leur expression permettrait une meilleure compréhension du
phénomène. Pour ce qui est du canola transformé avec le gène Lsi1 de C. arietinum, le taux
de Si obtenu dans les vieilles feuilles n’a pas été significativement différent entre les plants
CaLsi1 et les plants WT, nonobstant leur fertilisation en Si. Une légère augmentation du taux
de Si dans les jeunes feuilles des plants CaLsi1 Si+ comparativement aux plants WT Si+ a
néanmoins été obtenue, bien que cet écart n’ait pas été pas suffisamment important pour
obtenir le titre d’accumulateur intermédiaire. Le Si mesuré dans les tissus des plants Si-
s’explique principalement par la présence continuelle de traces de cet élément dans
l’environnement. En effet, des quantités de Si peuvent même se retrouver dans l’eau distillée
ou déminéralisée (Epstein, 1994).
Pour ce qui est du niveau d’activité des transporteurs VaLsi1 et CaLsi1, des tests d’influx du
Si de ces deux aquaporines, réalisés préalablement à ce projet, indiquent que leur activité de
transport est similaire (données non publiées). Il ne semblerait donc pas qu’une activité de
transport différente soit à l’origine des taux d’accumulation variables mesurés dans les tissus
des deux transformants. De plus, une confirmation par PCR de la présence du transgène a été
réalisée dans chacun des plants transformés afin de démontrer que les plants étudiés étaient
bien porteurs de l’insertion. L’absence de l’insertion ne peut donc pas être en cause dans la
variabilité d’accumulation en Si mesuré dans les tissus de chacun des transformants.
Initialement, les effets bénéfiques du Si ont été décrits uniquement chez les espèces
naturellement accumulatrices. Les bienfaits du Si ont, entre autres, été rapportés chez le riz
(Rodrigues et al., 2003), le concombre (Chérif et al., 1992) et le blé (Bélanger et al., 2003).
En outre, la découverte des transporteurs Lsi1 et Lsi2 en plus du développement des
biotechnologies permettent aujourd’hui l’étude des effets du Si chez l’ensemble des plantes.
Les travaux de Vivancos et al. (2015) ont démontré qu’une transformation d’Arabidopsis
52
avec le gène Lsi1 du blé (TaLsi1) permettait une meilleure tolérance au blanc poudreux chez
les plants fertilisés avec le Si. Il s’agit d’une des études pionnières révélant les bénéfices du
Si chez des plantes originellement non accumulatrices. Considérant la légère augmentation
de Si accumulé chez les transformants de canola VaLsi1 et CaLsi1, nous avons tenté
d’évaluer la résistance des transformants à un stress biotique.
Aucune augmentation de la tolérance à Leptosphaeria maculans, agent responsable de la
jambe noire, n’a cependant été mesurée chez les deux transformants fertilisés en Si. Plusieurs
raisons peuvent expliquer ces résultats. D’abord, les taux de Si accumulés chez les
transformants n’ont pas été suffisamment élevés pour que les plantes puissent en bénéficier.
Effectivement, il est reconnu que l’importance des effets du Si est directement liée au taux
d’accumulation dans la plante (Coskun et al., 2019). Ainsi, plus la plante accumule de Si
dans ses tissus, plus elle en bénéficie. Tel que mentionné précédemment, les niveaux de Si
mesurés chez les plants VaLsi1 Si+ et CaLsi1 Si+ ont été uniquement à la hauteur des faibles
accumulateurs. Or, les bénéfices du Si ont été rapportés uniquement chez les accumulateurs
intermédiaires et les forts accumulateurs (Bélanger et al., 2003; Chérif et al., 1992; Rodrigues
et al., 2003).
La faible augmentation de Si accumulée dans les tissus des transformants peut principalement
s’expliquer par l’absence du transporteur Lsi2. Ce transporteur est responsables du passage
du Si en efflux, faisant sortir l’élément des cellules racinaires vers l’apoplasme et permettant
de charger le xylème (Ma et al., 2007). Il est aujourd’hui reconnu que la présence conjointe
des deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 permet une accumulation supérieure de Si dans les parties
aériennes (Ma et Yamaji, 2008). En effet, la localisation polaire entre le Lsi1 et le Lsi2
démontre bien que ces deux transporteurs agissent de manière complémentaire afin de
permettre l’entrée efficace de l’acide silicique dans le xylème. Malgré que l’espèce
Arabidopsis thaliana soit naturellement pourvu d’un gène Lsi2, aucune étude n’a rapporté la
présence de ce deuxième transporteur chez Brassica napus (Deshmukh et al., 2013). Cette
différence moléculaire expliquerait en grande partie la différence entre les résultats obtenus
dans la présente expérience chez le canola comparativement à ceux rapportés par Vivancos
et al. (2015) à la suite d’une transformation d’Arabidopsis avec TaLsi1. Dans cette
expérimentation, la présence unique du transgène Lsi1 en l’absence du gène Lsi2 chez les
53
transformants priverait les plants d’une forte accumulation de Si. Une double transformation
avec les deux transporteurs permettrait possiblement une accumulation suffisante de Si pour
être bénéfique.
La maladie de la jambe noire (blackleg), causée par le champignon hémibiotrophe
Leptosphaeria maculans, est une contrainte importante de la culture de canola. Grâce à la
très faible taille de ses spores sexuées et asexuées, ce champignon a la capacité de pénétrer
via les stomates ou les blessures et ainsi d’initier une infection sur n’importe quelle partie de
la plante. En outre, l’étude de McGee et Petrie (1979) révèle que le canola est plus sensible
à une infection par L. maculans au stade six feuilles qu’aux stades ultérieurs. Dans la plupart
des infections sévères, la maladie est issue d’un inoculum primaire sur les graines ou
provenant des résidus de culture au sol (West et al., 2001). Le champignon à l’étude se
développe donc principalement au stade primaire de la plantule. C’est entre autres pour cette
raison que la méthode d’inoculation du canola par L. maculans la plus répandue proposée par
Chen et al. (2006) est une méthode adaptée pour évaluer la résistance au champignon sur de
jeunes plantules. Or, dans le cas de la présente expérimentation, il a été nécessaire de
développer une méthode d’inoculation sur des plants plus âgés afin de permettre aux plantes
d’accumuler des quantités suffisantes de Si. En effet, une accumulation élevée en Si a
généralement lieu durant les stades supérieurs de croissances des plantes (Ma et al., 2006).
Bien que les mécanismes d’action du Si soient encore peu compris, l’ensemble des études
indiquent qu’il contribue à ralentir la propagation des champignons lorsque l’élément est déjà
présent dans la plante. La première hypothèse indique que la double couche cuticule-SiO2
déposée dans les tissus âgés des parties aériennes ralentirait le processus d’infection par les
agents pathogènes (Ma et Yamaji, 2006). La seconde hypothèse énonce que le Si aurait un
rôle de « primer », c’est-à-dire qu’il ferait office d’activateur du système de défense,
permettant ainsi une réponse plus rapide et efficace aux divers stress (Fawe et al., 1998; Fawe
et al., 2001). Puisque le site de déposition du Si a lieu au même endroit que la cible de
nombreux effecteurs, il est maintenant suggéré que le Si interfèrerait avec les effecteurs
libérés par les agents pathogènes et les empêcherait d’atteindre leur cible (Rasoolizadeh et
al., 2018). Ces différentes hypothèses concernant le mécanisme d’action du Si indiquent
toutes qu’une accumulation tardive de Si après une infection précoce ne permettrait pas à la
54
plante d’être mieux protégée. Considérant la manière dont le Si agit dans les plantes et le
faible développement du champignon L. maculans aux stades plus âgés des plants,
l’utilisation de cet agent pathogène n’est peut-être pas adaptée pour montrer les effets
protecteurs du Si. Par ailleurs, l’insertion de Lsi2 dans les plants permettrait possiblement
une accumulation de Si beaucoup plus élevée et rapide, et éliminerait la contrainte d’attente
pour l’inoculation.
En conclusion, les résultats obtenus n’ont pas permis de tester adéquatement les effets du Si
chez le canola transformé en raison des accumulations trop faibles observées. Pour mieux
évaluer la capacité du Si à protéger le canola contre les infections fongiques, une double
transformation avec les transporteurs Lsi1 et Lsi2 serait nécessaire pour permettre une
accumulation élevée en Si dans les parties aériennes. Les conclusions apportées par cette
étude soulèvent un doute quant à l’existence d’un Lsi2 chez Brassica napus et confirment
l’importance de la présence commune des deux transporteurs pour une accumulation en Si
optimale.
55
Conclusions générales
L’accumulation du Si chez les plantes et les effets qu’il peut engendrer, en particulier contre
divers stress biotiques et abiotiques, font en sorte qu’il est aujourd’hui qualifié d’élément
bénéfique pour la croissance des végétaux (Ma et Yamaji, 2008). L’absence de réponses
expliquant les variations d’absorption chez les plantes a longtemps limité le potentiel
d’utilisation du Si en agriculture. La découverte des gènes Lsi1 et Lsi2, responsables de
l’absorption et du transport du Si chez les plantes, fait naître la possibilité d’améliorer la
capacité d’accumulation de cet élément chez les espèces faiblement accumulatrices (Ma et
al., 2006; Ma et al., 2007). Le transporteur Lsi1, permettant l’entrée du Si en influx dans les
cellules racinaires, est une aquaporine de la famille de Nodulin-26-like intrinsic protein-III
(NIPIII) dont les propriétés de son filtre sélectif ont fait l’objet de la première partie de cette
étude (Ma et al., 2006). Les résidus G-S-G-R du filtre ar/R, de positions précises dans la
séquence protéique, sont actuellement reconnus comme étant le critère moléculaire pour la
sélectivité du Si (Coskun et al., 2019). Or, la présence d’un filtre de type A-S-G-R chez
certaines espèces accumulatrices en plus de la glycine fortement conservée à la position
adjacente à celle de la première position du filtre ont mené à remettre en question les
composantes clés du filtre ar/R des Lsi1. D’après les résultats obtenus dans cette étude,
l’hypothèse énonçant que le filtre sélectif n’est pas basé sur le modèle actuel des résidus G-
S-G-R s’est avérée confirmée. En effet, l’étude du transport en Si chez OsLsi1 révèle qu’une
mutation à la première position du filtre n’entraine aucun changement d’activité. Les résultats
démontrent également qu’une mutation à la position du G conservé engendre un arrêt complet
du transport en Si chez OsLsi1. Ainsi, la position du G conservé est un résidu clé impliqué
dans la sélectivité du Si chez les aquaporines Lsi1, contrairement à la position de la première
glycine du G-S-G-R actuel. Bien que l’effet de la mutation G88A chez OsLsi1 entraînant
aucun changement de fonctionnalité ait déjà été démontré par l’équipe de Mitani et al. (2011),
les résultats obtenus dans ce projet démontrent pour la première fois que la première position
du filtre sélectif initialement établie est erronée. Cette redéfinition des résidus clés impliqués
dans la sélectivité du Si chez les aquaporines Lsi1 permet une meilleure compréhension des
déterminants moléculaires liés à l’absorption en Si.
La première position révisée du filtre sélectif des aquaporines Lsi1 apporte non seulement
des connaissances supplémentaires sur le rôle de certains résidus dans le contrôle du passage
56
des molécules, mais remet également en question la standardisation des positions des acides
aminés du filtre ar/R chez les aquaporines en général. En effet, il semblerait exister une
certaine variabilité positionnelle des filtres ar/R entre les familles d’aquaporines (Kirscht et
al., 2016). Des études supplémentaires sont nécessaires pour mesurer cette variabilité et
identifier les acides aminés réellement impliqués dans la sélectivité chez chacune des
familles. D’autre part, les preuves apportées quant au rôle du G conservé dans la sélectivité
du Si participent à améliorer les connaissances sur l’absorption de cet élément chez les
plantes. Grâce aux conclusions apportées par ces travaux, il sera éventuellement possible
d’améliorer de manière plus optimale l’absorption en Si chez les plantes faiblement
accumulatrices. L’accumulation élevée en Si chez les plantes d’intérêt agricole constitue un
moyen de défense supplémentaire dans la lutte contre les divers stress environnementaux. Ce
projet s’inscrit donc directement dans le cadre d’une gestion phytosanitaire des cultures plus
respectueuse de l’environnement.
Les résultats de Montpetit et al. (2012) et Vivancos et al. (2015) démontrant qu’une
transformation d’Arabidopsis avec le gène Lsi1 du blé (TaLsi1) permettait aux plantes
d’accumuler des quantités supérieures de Si et de mieux tolérer la maladie du blanc poudreux
sont les premières démonstrations que les plantes génétiquement modifiées avec le gène Lsi1
bénéficient d’apports supérieurs en Si. Grâce à ces travaux, on sait aujourd'hui que les effets
du Si ne sont pas limités aux plantes naturellement accumulatrices de Si, mais, à l’inverse,
ils semblent être universels. Il est donc reconnu que la capacité des plantes à accumuler
l’élément est l’unique facteur limitant pour bénéficier des effets positifs du Si. La deuxième
partie de ce projet s’est intéressée à évaluer l’intérêt d’une transformation de Brassica napus,
une espèce faiblement accumulatrice de Si, avec un transporteur Lsi1. Deux transformants
ont été étudiés; un transformant de canola avec le gène VaLsi1 de Vigna angularis ainsi qu’un
transformant avec le gène CaLsi1 de Cicer aretinum. Les résultats démontrent une
accumulation supérieure en Si uniquement chez le canola transformé avec le gène VaLsi1.
Malgré cette augmentation, les niveaux d’absorption en Si sont demeurés faibles et ont
maintenu les plants de canola au titre de faibles accumulateurs (Hodson et al., 2005). De plus,
les transformants n’ont pas démontré être plus tolérants à l’agent pathogène Leptosphaeria
maculans. Les faibles taux d’accumulation en Si dans les tissus seraient directement en cause
dans cette absence d'augmentation de la résistance au champignon. En effet, plus les plantes
57
accumulent des quantités élevées de Si dans leurs tissus, plus elles peuvent bénéficier des
effets protecteurs de cet élément (Coskun et al., 2019). Un taux d’accumulation inférieur à
0,1 % mesuré chez les transformants n’est pas suffisamment élevé pour que le Si puisse jouer
son rôle dans la résistance. Selon le mécanisme de transport du Si présenté par Ma et al.
(2008), l’action conjointe des transporteurs Lsi1 et Lsi2 est nécessaire pour permettre une
accumulation optimale de Si dans les parties aériennes. Or, la présence du transporteur Lsi2
n’a jamais été rapportée chez le canola, contrairement à l’absence du gène Lsi1 qui a été
démontrée chez l’ensemble des Brassicacées (Sonah et al., 2017). Les résultats obtenus par
la transformation du canola semblent indiquer que cette espèce ne possède pas de Lsi2,
puisque la simple transformation avec le transporteur Lsi1 n’a pas entrainé une importante
accumulation en Si. À la lumière de ces résultats, des expérimentations futures sur de doubles
transformants avec les deux gènes responsables du transport en Si devraient être réalisées.
Une double transformation avec les gènes Lsi1 et Lsi2 permettrait de mieux reproduire le
système de transport du Si chez les plantes fortement accumulatrices où le premier
transporteur facilite l’entrée de l’acide silicique de la solution du sol vers les cellules
racinaires, tandis que le deuxième transporteur agit de manière à exporter le Si de la cellule
pour atteindre le xylème (Ma et Yamaji, 2015). La présence des deux transporteurs de Si
chez le canola donnerait possiblement lieu à une déposition supérieure en Si et, par le fait
même, l’exploitation de ses propriétés bénéfiques. Le développement de cultivars de canola
plus résistants à divers stress répond à la demande croissante d’alternatives pour une gestion
plus raisonnée des cultures. La facilité à modifier génétiquement l’espèce de Brassica napus
rend plus aisée l’amélioration génétique et la création de cultivars plus performants, ce qui
donne une perspective positive sur une éventuelle double transformation du canola.
Les conclusions amenées par ce projet soulèvent l’importance du transporteur secondaire
Lsi2 pour le transport optimal du Si chez les plantes. Il semble que l’amélioration de
l’absorption en Si chez une espèce faiblement accumulatrice est uniquement possible s’il y a
présence conjointe des deux gènes Lsi1 et Lsi2. Les résultats obtenus par cette étude
confirment donc cette condition essentielle à considérer en vue d’une amélioration génétique
visant un transport accru en Si. Il est ainsi recommandé que les futurs travaux ayant pour
objectif d’augmenter la résistance aux agents pathogènes via l’accumulation de Si déploient
des efforts supplémentaires pour effectuer une double transformation efficace. Ce mémoire
58
pourrait donc contribuer au développement d’une meilleure approche génétique dans la lutte
contre les stress environnementaux par l’intermédiaire du Si.
59
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