Título do projeto: “DESENVOLVIMENTO DE UM CURATIVO...
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Título do projeto: “DESENVOLVIMENTO DE UM CURATIVO DERMO-
EPODÉRMICO BIOATIVO ATRAVÉS DA COMPLEXAÇÃO DOS BIOPOLÍMEROS
QUITOSANA, XANTANA E β-GLICANA CONTENDO AGENTE BACTERICIDA”
Palavras-chaves: curativo bioativo, biopolímeros, engenharia de tecidos, quitosana,
xantana, β-glicana
“DEVELOPMENT OF A BIOACTIVE DRESSING FOR DERMO-EPIDERMAL
WOUNDS COMBINING THE BIOPOLYMERS CHITOSAN, XANTHAN AND β-
GLUCAN CONTAINING BACTERICIDE AGENT”
Keyword: bioactive dressing, biopolymers, tissue engineering, chitosan, xanthan, β-
glucana
Proponente: Dra. Márcia Zilioli Bellini
Instituição Sede: Faculdades Adamantinenses Integradas - FAI
1. Identificação da proposta
Sistemas à base de polissacarídeos representam uma alternativa promissora para a
produção de curativos dérmicos bioativos. Membranas obtidas através da complexação dos
polímeros quitosana e xantana, mostraram ótimo desempenho quando aplicadas como
curativos dérmicos, apresentando características físico-químicas e biológicas adequadas
para este fim. No entanto, idealmente, um curativo deve não apenas proteger a lesão, mas
também promover o processo de cicatrização. Diante disto, diferentes compostos têm sido
incorporados aos curativos visando à prevenção e ao controle de infecções bacterianas,
promovendo assim, a aceleração do processo de cura. Uma vez que estudos comprovam a
atividade biológica da β-glicana, destacando-se sua ação anti-inflamatória, antitumoral e
antimutagênica, além de seu efeito protetor contra infecções, neste projeto propõe-se o
desenvolvimento de curativos dérmicos bioativos de quitosana-xantana-β-glicana contendo
o antibiótico bacitracina, empregando estratégias passíveis de escalonamento. Os curativos
produzidos serão caracterizados quanto a aspectos físico-químicos e biológicos. Espera-se
obter, ao final deste projeto, um biocurativo com características adequadas ao tratamento de
lesões de pele.
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2. Qualificação do principal problema a ser abordado
A pele, maior órgão do corpo humano, constitui a primeira barreira de defesa do
organismo, desempenhando importantes funções na homeostasia, como a regulação da
temperatura corporal e a proteção contra a desidratação, além de proporcionar apoio aos
vasos sanguíneos e nervos (Rodrigues et al., 2008; Ratner et al., 2004).
Diversos tipos de lesões podem acometer esse tecido, sendo grande parte de tais
lesões reparadas espontaneamente pela proliferação das células remanescentes da derme e
da epiderme. No entanto, em queimaduras graves (como as de segundo grau profundo e as
de terceiro grau) e úlceras crônicas de várias etiologias, esse processo de regeneração
espontânea é gravemente comprometido, havendo frequentemente a necessidade de
intervenções terapêuticas.
Lesões graves da pele são de difícil tratamento, requerem cuidados especiais, com
longos períodos de internação, podendo ainda, levar o paciente ao óbito. Feridas profundas
na pele acarretam prejuízos ao organismo como um todo, em especial aos mecanismos de
defesa. A perda da integridade da pele normalmente está associada à perda de fluidos,
proteínas e eletrólitos e ao aumento da susceptibilidade do indivíduo a infecções.
O rápido recobrimento da área de pele perdida ou danificada representa uma melhora
do prognóstico do indivíduo sendo que uma solução corrente para esse tipo de trauma
consiste em enxertos de pele humana, autólogos ou não, que hospedam o tecido conjuntivo
e estimulam o desenvolvimento de vasos sanguíneos (Souto et al., 2006). No entanto, esta
solução é limitada pela extensão da área doadora, pela condição clínica dos pacientes e pela
escassez de doadores, além do que os enxertos podem ser rejeitados ou então degradados
precocemente, garantindo apenas uma cobertura temporária da lesão (Souto et al., 2009)
Nos últimos anos a medicina, em conjunto com engenharia de tecidos, tem
apresentado grandes avanços, em especial na área da dermatologia, com o desenvolvimento
de novos materiais destinados a cobertura e tratamento de lesões de pele. Diversos tipos de
curativos são conhecidos, desde os tradicionais como gaze, pomadas e ataduras, até os
curativos bioativos, que liberam substâncias ativas durante a cicatrização da ferida e agem
diretamente nas camadas da pele, acelerando o processo de recuperação do tecido.
Curativos convencionais atuam apenas como cobertura passiva da ferida, mantendo-a
protegida do ambiente. Entretanto, idealmente um curativo deve não apenas proteger a
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lesão, mas também promover o processo de cicatrização, proporcionando um
microambiente adequado, hidratado e com isolamento térmico, removendo o excesso de
exsudato e promovendo as trocas gasosas (Jayakumar et al., 2011, Wittaya-Areekul e
Prahsarn, 2006). Neste contexto, propostas de terapias alternativas que busquem o
restabelecimento mais rápido e efetivo da pele lesada, em especial utilizando matrizes
poliméricas produzidas em laboratórios utilizando materiais com atividade biológica
comprovada, são de grande relevância.
2.1.Seleção dos biopopolímeros constituintes de um curativo
A seleção do material a ser usado na preparação de um curativo dérmico é um dos
primeiros passos para se atingir uma favorável reconstituição da pele lesada. O uso de
polissacarídeos naturais, isolados ou combinados entre si, como matéria-prima de curativos
dérmicos tem sido uma escolha bastante comum nos últimos anos, uma vez que estes
materiais apresentam numerosas variações em sua estrutura, composição e função, além de
exibirem elevada biocompatibilidade, biodegradabilidade e frequentemente, atividade
fisiológica (Bueno et al., 2015; Burd e Huang, 2008). Vários destes compostos estão
disponíveis na natureza em grandes quantidades, podendo ser obtidos com pureza adequada
a custos relativamente reduzidos, sendo possível em vários casos realizar nos mesmos
modificações químicas que tornam suas propriedades mais apropriadas para aplicações
específicas.
Como exemplo de compostos pertencentes a esse grupo de biopolímeros pode-se citar
a quitina, a quitosana, o alginato, a pectina, a xantana, a celulose e seus derivados
(metilcelulose, carboximetilcelulose) usados separadamente ou combinados (Bellini et al.,
2015a; Bellini et al., 2015b; Fan et al., 2013; Bellini et al., 2012; Murakami et al., 2010;
Yang et al., 2010; Muzzarelli, 2009).
A quitosana (Q) é um polissacarídeo derivado da quitina, formado por dois
monômeros, a D-glicosamina e a N-acetil-D-glicosamina (Meng et al., 2010).
Características como elevada biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades de
absorção e adsorção, aliados à sua capacidade de acelerar a cicatrização e à sua atividade
antimicrobiana (Bueno e Moraes 2011; Campos et al., 2009; Rodrigues et al., 2008; Mi et
al., 2001), possibilitam sua utilização na produção de curativos dérmicos e de suportes para
o crescimento celular, os chamados scaffolds, muito utilizados na engenharia de tecidos
3
(Bellini et al., 2015a).
A natureza policatiônica da quitosana possibilita seu uso na preparação de complexos
polieletrólitos (PECs) com espécies aniônicas (Meng et al., 2010; Rodrigues et al., 2008;
George e Abraham, 2006). Sendo a xantana (X) um poliânion, sua interação com a
quitosana, em condições apropriadas, possibilita a formação de um complexo iônico com
características interessantes para o uso como curativos e scaffolds (Bellini et al., 2012;
Veiga e Moraes, 2012).
Assim como a quitosana, a xantana (X) é um polissacarídeo atóxico, sendo obtido por
fermentação pela bactéria Xanthomonas campestris, podendo apresentar atividade
emulsificante, estabilizante e floculante, formando géis, filmes e membranas (Bejenariu et
al., 2008). Sua complexação com quitosana, através de interações entre os grupos amino da
quitosana e carboxil da xantana, possibilita a obtenção de matrizes que apresentam elevada
absorção de soluções aquosas e com estabilidade comprovada em fluidos biológicos
(Bellini et al., 2012). Tais características são fundamentais na aplicação como curativos
dérmicos bioativos.
As β-glicanas são polissacarídeos constituintes estruturais da parede celular de
leveduras, fungos e alguns cereais (Miura et al., 2003). Uma importante fonte de β-glicana
é a parede celular de Saccharomyces cerevisiae. A β-glicana é constituída por um esqueleto
linear central de unidades de glicose ligadas na posição β(1-3), com cadeias laterais de
glicose unidas em β (1-6), que ocorrem em diferentes intervalos e têm tamanhos variados
(Manners et al., 1973; Di Luzio et al., 1979). De acordo com o número de ramificações β
(1-6), as β-glicanas podem ser solúveis em água ou em soluções básicas. Na parede celular
de S. cerevisiae, a porção solúvel em água apresenta grande número de ramificações unidas
na posição β(1-6), enquanto que a porção insolúvel, o maior componente da parede,
apresenta apenas de 3 a 6% de ramificações (Kwiatkowski e Kwiatkowski, 2012;
Shahinian, 2000).
Diversos efeitos benéficos têm sido relacionados à β-glicana. Dentre eles podem-se
citar sua atividade imunomodulatória, anti-inflamatória, antitumoral e antimutagênica,
sendo este composto considerado hipocolesterolêmico e hipoglicêmico, além de exercer
efeito protetor contra infecções (Magnani et al., 2011; Magnani e Castro-Gómez, 2008;
Luhm et al., 2006; Khalikova et al., 2005).
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2.2.Incorporação de agentes biologicamente ativos em curativos
Nos últimos anos, uma estratégia que tem ganhado atenção na produção de curativos
dérmicos e sido fundamental na prevenção e terapia de infecções é a incorporação de
agentes bioativos diversos nos biomateriais destinados para este fim. Diferentes estudos
relatam a incorporação de vários tipos de fármacos com aplicações distintas em matrizes
poliméricas a base de quitosana destinadas ao uso no tratamento de lesões da pele. Dentre
muitos, pode-se citar a incorporação de agentes microbianos como a prata (Girata, 2011;
Meng et al., 2010) e a bacitracina (Rodrigues, 2008), de analgésicos e antipiréticos como o
paracetamol (Fernández-Hervás e Fell, 1998), e de agentes anti-inflamatórios como o
diclofenato de sódio (González-Rodrígues et al., 2001).
A inclusão de antibióticos em curativos tem grande relevância para o tratamento de
lesões de pele, de modo a promover o controle dos processos infecciosos no local da lesão
A bacitracina é um antibiótico com intenso efeito sobre bactérias Gram positivas,
possuindo mecanismo de ação inibitório sobre a síntese da parede celular dos
microrganismos (Farzana et al., 2004). Este fármaco tem sido amplamente utilizado pela
indústria farmacêutica como princípio ativo em pomadas, associados ou não a outros
antibióticos (Vaucher e Schapoval, 2003). A elevada solubilidade deste antibiótico em
meios aquosos possibilita sua incorporação em dispositivos à base de quitosana, através do
intumescimento destas matrizes em soluções aquosas contendo o fármaco (Rodrigues,
2008).
Desta forma, a inclusão de medicamentos como antibióticos às membranas de
quitosana/xantana/β-glicana é bastante relevante, pois permitiria não só a recuperação dos
tecidos lesados pela ação dos biopolímeros, mas também o controle do crescimento de
microrganismos indesejáveis.
3. Objetivos e metas a serem alcançados
Este projeto de pesquisa tem com principal objetivo contribuir para os estudos no
ramo de obtenção de materiais com potencial para utilização na regeneração de lesões de
pele.
Como objetivos específicos, neste trabalho propõem-se:
Padronização da metodologia de produção de membranas poliméricas de quitosana,
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xantana e β-glicana, com vistas à obtenção dos materiais em, pelo menos, média
escala;
Avaliação das características físico-químicas e biológicas das membranas
produzidas;
Otimização da formulação polimérica através de um modelo estatístico de superfície
de resposta;
Determinação da eficiência de incorporação, da cinética de liberação e da eficácia
antimicrobiana do fármaco bacitracina incorporado nas membranas que se
mostrarem mais favoráveis ao uso;
Avaliação da recuperação da pele através da realização de testes in vivo.
4. Indicadores de acompanhamento
Dentre as estratégias adotadas para a disseminação e avaliação dos resultados obtidos
neste projeto de pesquisa pode-se citar: publicação de artigos científicos completos em
revistas e periódicos internacionais de grande impacto, contribuindo significativamente
para a divulgação dos resultados alcançados neste estudo; participação em congressos
científicos de destaque, nacionais e internacionais, com o objetivo de apresentar trabalhos
derivados do presente projeto de pesquisa, além de fortalecer o relacionamento com
profissionais da área; apresentação de palestras e realização de cursos em reuniões e
encontros científicos, favorecendo a transmissão do conhecimento adquirido durante o
andamento deste projeto.
5. Metodologia a ser empregada;
A análise das propriedades intrínsecas do curativo bioativo, de sua arquitetura, assim
como das consequências biológicas decorrentes de sua utilização é de extrema importância
para melhor embasar sua aplicabilidade. Diferentes técnicas de caracterização devem ser
avaliadas tanto in vitro quanto in vivo. Os ensaios de caracterização físico-química de
membranas com potencial aplicação em processos de reparo tecidual são: determinação da
espessura; determinação do grau de hidratação ou intumescimento quando da imersão em
água e soluções fisiológicas; avaliação da permeabilidade ao vapor d’água e ao oxigênio;
análise da morfologia da superfície e da secção transversal; determinação da resistência à
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tração e do alongamento na ruptura; estabilidade física e mecânica, dentre outros (Li et al.,
2010; Chesnutt et al., 2009; Wang et al., 2009). Quando os curativos são formulados com
agentes ativos incorporados, faz-se também necessária a determinação da eficiência de
incorporação e do perfil cinético de sua liberação (Mi et al., 2003).
Desta forma, visando alcançar o objetivo deste projeto, propõe-se preparar
membranas poliméricas através da complexação dos polissacarídeos naturais, quitosana,
xantana e β-glicana, com base nos procedimentos descritos por Bellini et al. (2012), mas
com vistas à análise de condições que possibilitem a ampliação da escala produtiva.
Propõe-se ainda a realização de diferentes ensaios de caracterização físico-química e
biológica com testes de efetividade in vitro utilizando células animais, buscando melhor
embasar a aplicabilidade do material visando o uso proposto.
5.1. Formulação das membranas
A complexação polimérica será testada em diferentes concentrações poliméricas,
variando-se a razão volumétrica de soluções aquosas de quitosana, de xantana e de β-
glicana. Os complexos poliméricos serão preparados com volume final de mistura de
200 mL contendo 1g ou 0,75g de quitosana.
Os efeitos das diferentes concentrações poliméricas das membranas serão
comparados através de um planejamento experimental fatorial, especificando-se as
proporções poliméricas dos polissacarídeos xantana e β-glicana como níveis de entrada,
conforme mostrado na Tabela 1, de forma a verificar quais condições melhorariam as
características das membranas. A faixa de concentração polimérica a ser testada foi
estabelecida com base em experimentos anteriores de Bellini et al. (2012), que utilizaram a
concentração de 1 g de cada polissacarídeo por unidade de membranas de quitosana-
xantana.
5.2. Preparo das membranas
Para a obtenção das membranas a solução de quitosana será adicionada através de
bomba peristática a uma vazão de 10 mL/min à solução de xantana e/ou de β-glicana, sob
constante agitação de 1000 rpm através de agitador mecânico de alto torque. Nas
formulações que contiverem tanto o polissacarídeo xantana quanto β-glicana, estes serão
previamente misturados sob constante agitação de 1000 rpm por 2 minutos antes da adição
da quitosana. Durante o preparo do complexo polimérico a temperatura será mantida a 25ºC
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em um reator de vidro encamisado com diâmetro interno de 11 cm e externo de 12 cm, de
capacidade total igual a 7,5 L.
Tabela 1. Planejamento experimental fatorial empregado para avaliação de membranas com
diferentes proporções de xantana e β-glicana.
Experimento Xantana β-glicana
Nível Concentração (g/unid) Nível Concentração (g/unid)
1 -1 0,22 -1 0,22
2 1 1,00 -1 0,22
3 -1 0,22 1 1,00
4 1 1,00 1 1,00
5 0 0,75 0 0,75
6 0 0,75 0 0,75
7 0 0,75 0 0,75
8 -1,41 0,00 0 0,75
9 1,41 1,50 0 0,75
10 0 0,75 -1,41 0,00
11 0 0,75 1,41 1,50
5.3. Preparo das membranas
Para a obtenção das membranas a solução de quitosana será adicionada através de
bomba peristática a uma vazão de 10 mL/min à solução de xantana e/ou de β-glicana, sob
constante agitação de 1000 rpm através de agitador mecânico de alto torque. Nas
formulações que contiverem tanto o polissacarídeo xantana quanto β-glicana, estes serão
previamente misturados sob constante agitação de 1000 rpm por 2 minutos antes da adição
da quitosana. Durante o preparo do complexo polimérico a temperatura será mantida a 25ºC
em um reator de vidro encamisado com diâmetro interno de 11 cm e externo de 12 cm, de
capacidade total igual a 7,5 L.
Após a complexação polimérica, a suspensão de coacervados será desaerada em
bomba de vácuo por 2 horas, transferida para uma placa de poliestireno de 15 cm de
diâmetro e seca em estufa com circulação de ar a 37ºC até a formação de uma membrana
seca. Ao término da secagem, para a neutralização do pH das membranas, as mesmas serão
submetidas a sucessivas lavagens com água destilada e deionizada e com tampão Hepes a
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10 mM e novamente secas em estufa de circulação de ar a 37ºC.
Os estudos de ampliação de escala serão realizados utilizando-se um reator de vidro
encamisado de capacidade igual a 7,5 L. Serão testados diferentes volumes finais da
mistura polimérica, variando-se entre 0,2 e 5 L. A solução de quitosana em ácido acético
será misturada, com o auxílio de uma bomba peristáltica, à solução de xantana e/ou de β-
glicana em vazões volumétricas variando de 10 e 300 mL/min, com alimentação em
múltiplos pontos, conforme demonstrado na Figura 1. O efeito da agitação do sistema por
agitador mecânico de alto torque também será avaliado, empregando-se valores entre 500 e
1500 rpm. A mistura resultante será transferida para moldes de poliestireno de tamanhos
variáveis e seca em estufa com circulação de ar, avaliando-se diferentes temperaturas, entre
37 e 70ºC, até a formação de uma membrana seca.
Figura 1. Alimentação dos reatores: (A) em dois pontos; (B) em quatro pontos.
Quando requerido, as membranas serão esterilizadas por exposição a Oxyfume 30
(30% óxido de etileno e 70% CO2) na empresa Acecil Central de Esterilização Comércio e
Indústria Ltda (Campinas, SP) e então caracterizadas físico-química e biologicamente,
conforme descrito a seguir.
5.4. Caracterização físico-química dos dispositivos
As membranas de diferentes composições poliméricas serão avaliadas quanto ao
aspecto e morfologia da superfície e da secção transversal, à espessura, à capacidade de
absorção, a estabilidade durante exposição a soluções aquosas diversas, à resistência
mecânica, à eficiência de incorporação e à cinética de liberação do fármaco conforme
descrito a seguir.
(A) (B)
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As membranas serão analisadas quanto ao seu aspecto e morfologia da superfície a
olho nu e o seu aspecto será registrado por fotografia digital. A espessura média dos
suportes será obtida utilizando um micrômetro, realizando-se pelo menos sete medidas ao
longo da membrana e em ângulos de 90º. Os resultados serão expressos como médias.
A capacidade das membranas absorverem água e fluido corpóreo simulado será
determinada após exposição das amostras secas e de massas conhecidas às soluções por
24 h a 37ºC. Ao final desse período, as massas serão novamente avaliadas para possibilitar
o cálculo da quantidade de solução absorvida.
A estabilidade das amostras nestas soluções também será avaliada. Após a
exposição às soluções, as amostras serão lavadas com água destilada para a remoção de
material fracamente aderido e secas à 37ºC até que atinjam massa constante. A variação de
massa após a exposição a cada solução será, então, determinada.
As propriedades mecânicas das membranas serão avaliadas com base no método
ASTM D-882 (1995), calculando-se os valores de tensão e alongamento na ruptura e do
módulo de Young.
5.5. Análise da citotoxicidade in vitro
A citotoxicidade das membranas a culturas celulares será avaliada in vitro, utilizando
células L929, uma linhagem fibroblastóide de ratos estabelecida em cultura contínua e
amplamente utilizada em ensaios de citotoxicidade (Liu et al., 2010; Mortazavi et al.,
2010). As células L929 serão mantidas e propagadas em meio de cultura RPMI-1640
suplementado (assim definido deste ponto em diante) com 0,3g/L de L-glutamina, 2,0g/L
de D-glicose, 2,0g/L de NaHCO3, 10.000 UI/L de penicilina, 0,05g/L de estreptomicina,
5,958g/L de Hepes e 10% (v/v) de soro fetal bovino, em estufa a 37ºC e 5% de CO2.
A citotoxicidade do material será avaliada indiretamente, através do método de
redução do MTT (3-(4,5-dimeteiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium brometo), que se baseia
na análise da atividade mitocondrial das células expostas aos extratos das amostras. Os
extratos serão obtidos incubando-se as amostras em meio de cultivo PRMI-1640
suplementado a uma concentração de 0,05 g de material seco por mililitro de meio por 48
horas a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2, conforme descrito por Bellini et al. (2012).
5.6. Análise dos resultados da etapa de obtenção das membranas
Os resultados numéricos referentes às caracterizações físico-química e biológica das
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diferentes formulações serão analisados empregando-se o teste de comparação de médias
de Tukey com nível de significância de 5%. Todos os resultados serão expressos como a
média das medidas experimentais, calculadas com, no mínimo, três amostras
independentes. Cada valor médio será acompanhado de seu respectivo erro padrão, o que é
indicado para realizar comparações entre médias de diferentes populações.
O planejamento experimental fatorial será elaborado especificando-se os níveis das
variáveis de entrada em dois, os quais serão, a concentração (g/unidade de membrana) dos
polissacarídeos xantana e β-glicana, realizando-se 11 experimentos, sendo 8 experimentos
distintos e 3 no ponto central. As variáveis respostas serão absorção de água e fluido
corpóreo sumulado, perda de massa, tensão e alongamento na ruptura e citotoxicidade.
As análises estatísticas dos resultados serão realizadas utilizando o software Statistica
7®
. As melhores formulações apontadas pelo planejamento experimental, considerando-se
também a integridade e o aspecto das amostras, serão utilizadas nos estudos de ampliação
de escala de produção e, posteriormente, na realização dos ensaios de incorporação do
agente bioativo bacitracina.
5.7. Incorporação e cinética de liberação de bacitracina nas membranas
A incorporação da bacitracina se dará por difusão do fármaco nas membranas. As
membranas serão cortadas em corpos de prova circulares de 2 cm de diâmetro, colocados
em frascos âmbar e, hidratados em solução de bacitracina por 24 h a 37°C. Duas diferentes
concentrações de bacitracina serão avaliadas, sendo elas 1,5 e 3,5 mg de bacitracina/mL de
solvente.
A quantidade de bacitracina incorporada na membrana será determinada através da
diferença entre a quantidade de fármaco inicial e a quantidade de fármaco na solução de
equilíbrio (após a retirada da membrana). As concentrações do fármaco nas soluções serão
avaliadas em espectrofotômetro UV-visível a 253 nm.
Para a determinação da cinética de liberação da bacitracina, os corpos de prova
contendo o fármaco serão imersos em 10 mL de solução tampão PBS (pH 7,4) por até 96
horas a 37ºC. A cada 12 horas as amostras serão centrifugadas a 10.000 rpm por 10
minutos, sendo o fármaco liberado no sobrenadante determinado em espectrofotômetro
UV-visível a 253 nm.
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5.8. Inibição do crescimento de patógenos
A eficácia de inibição in vitro do crescimento de contaminantes comuns em lesões de
pele será analisada. Amostras estéreis de membranas, contendo ou não bacitracina, serão
hidratadas por 1 minuto em água estéril e colocadas na superfície de placas de Petri
contendo meio de cultura TSA previamente inoculadas com 0,1% (v/v) de Pseudomonas
aeruginosa contendo 5,0x108 ufc/mL ou com 0,1% (v/v) de Staphylococcus aureus
apresentando 4,3x108 ufc/mL. Em seguida, as placas serão incubadas a 35ºC em estufa de
cultura por 48 h, e será observada a formação de um halo mais claro na área circundando a
membrana, indicando inibição do crescimento celular. Destaca-se que a bacitracina é
conhecidamente efetiva contra bactérias Gram-positivas como a Staphylococcus aureus,
mas como tem-se outros componentes na formulação das membranas que podem exercer
efeito também sobre micro-organimos Gram-negativos, seu comportamento frente a células
de Pseudomonas aeruginosa será também avaliado.
5.9. Testes de cicatrização in vivo
Visando a comprovação da aplicabilidade do curativo e almejando atingir o objetivo
da Medicina Translacional, que busca transformar descobertas apropriadas em
medicamentos e dispositivos médicos que podem ser utilizados no tratamento de pacientes,
será proposta a realização de testes in vivo utilizando as formulações tidas como mais
promissoras no processo de cicatrização de lesões de pele de acordo com os métodos de
caracterização das amostras descritos anteriormente.
Ratos wistar pesando em torno de 250 g serão anestesiados, por via intraperitoneal,
com 400 μL de solução na concentração de 1:1 (v/v) de quetamina a 10% e xilazina
20mg/mL. Após a anestesia, os animais serão tricotomizados e efetuada a retirada cirúrgica
da derme e epiderme mediante lesões circulares de 1,5 cm de diâmetro na região dorsal de
cada animal. Os animais serão então submetidos ao tratamento conforme descrito na Tabela
2.
Tabela 2. Distribuição dos animais utilizados no experimento
Grupo animais n (lesões) Tratamento
GR01 5 10 Controle
(sem membrana)
GR02 5 10 Membrana sem bacitracina
GR03 5 10 Membrana com bacitracina
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Os ratos serão acompanhados diariamente e o processo de cicatrização será
avaliado. Serão observadas características como: alterações da massa corporal, exsudação
através da ferida, presença de infecção e inflamação, formação de neo-vasos, formação de
tecido de granulação e cicatricial. Essas análises serão realizadas imediatamente após a
queimadura e transcorridos 7, 15, 30, 45 e 60 dias do procedimento experimental.
A avaliação clínico-fotográfica das lesões será realizada por método não invasivo,
pela determinação da porcentagem de cicatrização das ulcerações, observada a partir da
captura e análise de imagens pelo programa Image J® (versão 1.40g para Windows
TM), um
programa de análise de imagem de domínio público desenvolvido por Wayne Rasband do
National Institutes of Health (NIH). É um sucessor do NIH Image, possuindo a vantagem
de ter aplicação multidisciplinar, na pesquisa e na prática clínica.
A captura de imagens será realizada imediatamente após a queimadura experimental
(0d) e nos períodos de 7, 15, 30, 45 e 60 dias após o início do experimento. As imagens
serão capturadas por uma câmera fotográfica digital e analisadas pelo software Image J®
(versão 1.40g para WindowsTM
). No momento da captura da imagem uma régua será
posicionada ao lado de cada animal fotografado o que permitirá a calibração do software e
posterior análise computacional.
6. Principais contribuições científicas, tecnológicas ou de inovação da proposta
Nas últimas décadas, a proposição e análise de tecnologias associadas ao
desenvolvimento de materiais aumentou significativamente, possibilitado a obtenção de
novos produtos tecnológicos para aplicação nas áreas médicas e farmacêuticas. Atualmente,
os biomateriais são utilizados em aplicações complexas, como a engenharia de tecidos, a
terapia celular e a liberação controlada de fármacos e genes (Williams, 2009). O
desenvolvimento e aplicação de um biomaterial envolvem várias áreas do conhecimento,
sendo necessário que haja colaboração entre profissionais de diferentes especialidades,
como a engenharia, a química, a biologia e as ciências clínicas.
Neste contexto, uma vez que a busca contínua por biomateriais alternativos para a
composição de dispositivos médicos se faz necessária e com base nos resultados obtidos em
pesquisas anteriores que apontam que membranas de quitosana complexada com xantana
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são bastante promissoras para a aplicação como curativos dérmicos (Bellini et al., 2015a,b;
Bellini et al., 2012) e que dados da literatura consultada apontam para a eficaz ação
biológica da β-glicana como agente anti-inflamatório, antitumoral e antimutagênico, além
de exercer efeito protetor contra infecções, espera-se, ao final deste projeto, o
desenvolvimento de um curativo bioativo à base de quitosana, xantana e β-glicana com
características físico-químicas e biológicas relevantes para o tratamento de lesões dermo-
epidérmicas, contribuindo, assim, para setor de desenvolvimento de materiais para este tipo
de aplicação.
Destaca-se ainda que não foram localizados na literatura trabalhos referentes à
incorporação da β-glicana em dispositivos médicos destinados ao tratamento de pele, o que
evidencia caráter de ineditismo a esta proposta.
Os resultados deste projeto serão publicados em revistas e periódicos de grande
impacto da área, com ótimo potencial de contribuição para a literatura e para a comunidade
científica que atua no segmento de pesquisa e desenvolvimento neste campo. Além disto,
este projeto contribuirá com a formação de recursos humanos voltados para a área de
Bioengenharia e de Biomateriais e para o desenvolvimento de novos produtos a partir do
uso de biomoléculas.
7. Orçamento detalhado
A implantação deste projeto de pesquisa depende, dentre vários quesitos, de recursos
financeiros, sejam eles de capital (equipamentos), de custeio (materiais de consumo,
passagens e diárias) e de bolsas. Desta forma, faz-se necessário a solicitação de auxílio
financeiro junto a esta agência de fomento, visando fundamentalmente prover material de
consumo para sua realização, custeio de passagens e diárias, além de melhor equipar o
laboratório no qual será desenvolvido o trabalho, conforme indicado na Tabela 3.
Destaca-se que a instituição de ensino a qual este projeto pretende ser implantado,
conta com a maior parte dos equipamentos necessários, os quais poderão ser utilizados e
que, junto com as instituições parceiras, viabilizam o desenvolvimento do projeto de
pesquisa.
14
Tabela 3. Itens solicitados para a realização do projeto.
Material Detalhamento Valor previsto
Estufa Estufa de secagem com circulação e renovação de
ar Tecnal TE-394/2 R$ 8.000,00
Material de
consumo
Reagentes, vidraria e material descartável, como:
quitosana, xantana, β-glicana, ácido acético, filtros
para esterilização de soluções, embalagens para
esterilização, tubos de centrífuga, tubos de ensaio
estéreis e frascos com tampa, cartuchos contendo
resinas para purificação de água de sistema da
Millipore.
R$ 10.000,00
Despesas de
transporte
Despesas com deslocamento nos trechos
Adamantina-Assis R$ 2.000,00
Congressos
Participação em 2 (dois) Congressos para
apresentação de trabalhos 2 x R$ 350,00
Viagens 2 x R$ 1.100,00
Diárias com pernoite 2 x 5 x R$ 195,00
Total R$ 24.850,00
8. Cronograma de execução
Tendo em vista os objetivos mencionados e considerando-se os aspectos enfocados
na revisão da literatura efetuada, tem-se por meta desenvolver o plano de estudos em etapas
sequenciais ou paralelas, conforme indicado na Figura 2 e na Tabela 3, destacando-se que a
previsão de duração do projeto é de 36 meses.
15
Figura 2. Plano de desenvolvimento de trabalho
Aumento da escala de produção das membranas de quitosana-xantana- β-glicana
Análise do efeito de diferentes vazões, temperaturas e nível de agitação
Caracterização Físico-Química e Biológica dos materiais
Testes de incorporação, de liberação e de ação do fármaco
com as melhores formulações
Análise estatística do
planejamento fatorial
Obtenção do curativo bioativo
Produção das membranas de quitosana-xantana- β-glicana
Análise de diferentes proporções poliméricas
Caracterização Físico-Química e Biológica dos materiais
Ensaios in vivo
16
Tabela 3. Cronograma de desenvolvimento das atividades
Atividades 2º Semestre
2016
1º Semestre
2017
2º Semestre
2017
1º Semestre
2018
2º Semestre
2018
1º Semestre
2019
Revisão da literatura
pertinente X X X X X X
Produção das membranas
(estudo de diferentes
formulações e ampliação de
escala)
X X X
Caracterização físico-química X X
Caracterização biológica X X
Análise estatística X X
Testes de incorporação,
liberação e ação do fármaco
na membrana
X X
Testes in vivo de cicatrização X X
Redação de relatórios
técnicos X X
X
Redação e submissão de
artigos científicos X X X X
Apresentação de trabalhos em
congressos X
X
9. Identificação de todos os participantes do projeto;
O desenvolvimento deste projeto de pesquisa terá a participação efetiva do
pesquisador proponente deste financiamento e de um aluno regularmente matriculado no
curso de Medicina, Enfermagem ou Farmácia, além da participação de profissionais da
instituição de ensino que darão apoio técnico e acadêmico.
É importe destacar que a proponente tem experiência acumulada na área de
desenvolvimento de biomateriais poliméricos destinados a aplicação na regeneração de
lesões de pele, indicando que as chances de sucesso no desenvolvimento da presente
proposta são bastante elevadas.
Abaixo estão relacionados os nomes e a titulação dos pesquisadores que efetivamente
participarão do projeto. Destaca-se que o aluno que irá receber a bolsa de IC será indicado
após a confirmação da aprovação da proposta, mediante um processo seletivo interno.
17
Márcia Zilioli Bellini (proponente)
Graduação: Ciências Biológicas – Faculdade de Ciências e Letras de Assis -
UNESP;
Pós-Graduação: Mestrado em Ciências de Alimentos – Faculdade de
Engenharia de Alimentos - UNICAMP;
Doutorado em Engenharia Química – Área de
Desenvolvimento de Bioprocessos e Biomaterias – Faculdade de Engenharia
Química - UNICAMP;
Pós-Doutorado em Engenharia Química - Universidade de
Coimbra, Portugal.
Liliana Martos Nicoletti (colaborador)
Graduação: Biomedicina - Organização Educacional Barão de Mauá;
Pós-Grtaduação: Mestrado em Biologia Celular e Molecular - Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP.
Doutorado em Clínica Médica - Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto - USP.
Valter Dias da Silva (colaborador)
Graduação: Farmácia – Faculdades Adamantinenses Integradas – FAI;
Pós Graduação: Mestrado em Ciência Animal – Área: Fisiopatologia Animal
– Universidade do Oeste Paulista - UNOEST
10. Indicação de colaborações ou parcerias já estabelecidas com outros centros
de pesquisa na área;
Destaca-se que o desenvolvimento deste projeto contará com o apoio do Prof. Dr.
Pedro Oliva Neto, do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências e
Letras de Assis - UNESP, que trabalha com o desenvolvimento de tecnologias para a
produção em escala piloto de biopolímeros, dentre eles a goma xantana e a β-glicana. O
Prof. Pedro Oliva fornecerá a xantana e a β-glicana a serem utilizadas neste estudo, bem
como disponibilizará o uso das instalações do Laboratório de Biotecnologia Industrial, o
qual coordena, quando necessário.
18
11. Disponibilidade efetiva de infraestrutura e de apoio técnico para o
desenvolvimento do projeto;
A instituição de ensino Faculdades Adamantinenses Integradas – FAI, a qual este
projeto pretende ser implantado, conta com uma infraestrutura de laboratórios e
equipamentos, os quais poderão ser utilizados e que viabilizam o desenvolvimento do
projeto de pesquisa.
Dentre os laboratórios da instituição de ensino e que estarão disponíveis para o
desenvolvimento deste projeto de pesquisa podemos citar: Laboratórios de Microbiologia;
Laboratórios de Bioquímica; Laboratórios de Química; Laboratórios de Microscopia;
Laboratórios de Histopatologia; Laboratórios de Análise.
Os equipamentos necessários para o andamento da pesquisa e que estarão
disponíveis são: Balança Analítica; Bomba peristáltica; Agitador mecânico de alto torque;
Bomba de vácuo; Medidor de pH; Lupas; Microscópios Ópticos; Materiais cirúrgicos.
Destaca-se ainda que a FAI dispõe de Biotério e que todos os protocolos dos
experimentos envolvendo animais deverão ser analisados e aprovados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais das Faculdades Adamantinenses Integradas, Adamantina, SP,
local onde serão manipulados os animais e realizados os ensaios de cicatrização in vivo.
12. Plano das atividades a serem desenvolvidas pelo bolsista.
Uns dos principais mecanismos institucionais para a inserção do aluno de
graduação em projetos de pesquisa é a iniciação científica. A participação precoce do aluno
em atividades de pesquisa torna-se um instrumento valioso para aprimorar qualidades
desejadas em um profissional de nível superior, bem como para estimular e iniciar a
formação daqueles mais vocacionados para a pesquisa.
Com o intuito de atingir estes objetivos este projeto de pesquisa pleiteia uma
bolsa de estudos de iniciação científica, IC. As atividades específicas a serem
desenvolvidas pelo bolsista serão as seguintes:
Aplicação da metodologia prevista pelo orientador para o desenvolvimento
do curativo;
Elaboração dos testes de caracterização e de aplicação do biomaterial
desenvolvido;
19
Realizar a interface entre os membros da equipe de pesquisa através de
participação em reuniões, seminários e discussões gerais sobre o projeto;
Atualização do status do projeto e apresentação dos resultados obtidos
através de relatórios periódicos.
No decorrer do desenvolvimento deste projeto de pesquisa o bolsista será treinado
através do contato direto com o orientador e também com os pesquisadores colaboradores
do projeto. Espera-se ainda que o aluno desenvolva suas atividades de forma ética, com
criatividade e inovação, buscando sempre a constante ampliação do conhecimento.
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