ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------------------------------

ĐOÀN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT

TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP

PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60442901

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình được hoàn thành tại

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Tạ Thị Thảo

TS . Bùi Xuân Thành

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung

Phản biện 2: TS. Đào Duy Tiên

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở

Họp tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.

vào hồi:.......giờ.......phút, ngày.......tháng.......năm 2016.

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin - thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, để có thể phát triển bền vững đòi hỏi hóa học phải phát triển

theo xu hướng là “sạch”. Trong những năm 1990, khái niệm về “Hóa học

xanh” đã được đề xuất, trong đó phát triển phương pháp phổ hồng ngoại được

xem là một trong những phương pháp phân tích thân thiện với môi trường và

đang dần trở thành phương pháp ưu việt trong lĩnh vực phân tích hóa học

xanh. Nhu cầu phát triển trong lĩnh vực hóa học xanh đang tăng lên đáng kể

và trở thành một thách thức lớn cho các nhà hóa học để tạo ra sản phẩm mới,

quy trình và dịch vụ đạt được các yêu cầu mục tiêu xã hội, kinh tế và môi

trường cấp thiết do sự tăng nhận thức về an toàn môi trường, kiểm tra ô

nhiễm môi trường, bền vững sinh thái công nghiệp và công nghệ sản xuất

sạch hơn trên toàn thế giới. Cùng thời gian này xu hướng phát triển công

nghệ phân tích quá trình (PAT-Process Analytical Technology) rất được

khuyến khích bởi các nhà hiệp hội quản lí dược và thực phẩm (FDA-Food

and Drug Administration). PAT được xem là sự kết hợp phân tích với ngành

công nghiệp để ra sản phẩm mới và các công nghệ sản xuất hiệu quả. PAT là

hệ thống thiết kế, phân tích và kiểm soát các quá trình sản xuất, dựa trên các

phép đo kịp thời, quan trọng để đảm bảo chất lượng thuộc tính của nguyên

liệu, đảm bảo chất lượng cao của sản phẩm khi hoàn thành quy trình sản xuất.

PAT bao gồm các quá trình thiết kế dựa trên khoa học xác định các phép đo

chính xác của chất lượng sản phẩm và các biến quá trình quan trọng có ảnh

hưởng đến chất lượng, thiết bị đo lường thích hợp, các công cụ công nghệ

thông tin trong thống kê và các quá trình kiểm soát làm việc với nhau để đảm

bảo sản xuất sản phẩm cuối cùng với chất lượng mong muốn. Một số kỹ

thuật quang phổ được sử dụng để xác định các hoạt chất và tá dược ở khâu

định lượng nguyên liệu trong phần đầu của quá trình sản xuất và theo dõi các

bước pha trộn trong quá trình sản xuất và sau quá trình sản xuất để theo dõi

quá trình. Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật phân tích quang phổ hồng

ngoại kết hợp với phương pháp hồi quy đa biến đã trở thành một kỹ thuật

phân tích có tính ứng dụng cao cho ngành công nghiệp dược phẩm bởi vì đây

là một phương pháp phân tích nhanh, không cần phá hủy mẫu, không sử dụng

các hóa chất và dung môi độc hại.

Đây chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng

nhanh một số hoạt chất thuốc kháng sinh bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại

gần và trung bình”. Luận án này là một phần trong chương trình hợp tác

quốc tế giữa Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phươnag

pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung kết hợp với các phương pháp hồi

quy đa biến để xác định nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần

khẳng định xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần

và áp dụng nhanh trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa

chất và đặc biệt là góp phần phát triển kỹ thuật phân tích xanh.

2

Nội dung nghiên cứu Để xây dựng qui trình xác định các hoạt chất bằng phương pháp phổ

hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê đa biến, nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án gồm:

1. Khảo sát tìm các điều kiện tối ưu của phép đo phổ hồng ngoại vùng gần và trung với các hoạt chất và mẫu tự tạo, mẫu thực tế.

2. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi qui đa biến phù hợp để xác định một hoạt chất khi có mặt các tá dược trong mẫu và nghiên cứu xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm chất bằng một mô hình hồi qui đa biến tuyến tính.

3. Đánh giá các thông số chính của một qui trình phân tích nhanh trên cơ sở xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính từ các mẫu tự tạo có chứa hoạt chất và tá dược thường dùng.

4. Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thị trường hiện nay và so sánh kết quả với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong Dược điển. Điểm mới, những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án Về mặt khoa học - Lần đầu tiên đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh các hoạt chất

nhóm sulfamid và một số chất thuộc nhóm beta lactam (ampicillin, cefixim, cefaclor, ceftriaxone, cefotaxim) bằng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại vùng gần và trung trên cơ sở sử dụng các mô hình hồi quy đa biến PLS và PCR. Quy trình này cho phép phân tích không cần phá hủy mẫu, không sử dụng dung môi độc hại, nhanh và cho kết quả phù hợp trong việc sàn lọc nguyên liệu và phân tích nhanh các sản phẩm thuốc.

- Đã xây dựng được quy trình phân tích đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm thuốc sulfamid và beta lactam. Quy trình này cho phép xác định được bất kỳ một chất nào trong thuốc bằng một mô hình hồi quy đa biến, giúp cho việc xây dựng phần mềm trên thiết bị cầm tay được thuận lợi. Về mặt thực tiễn

- Quy trình phân tích nhanh, không tốn dung môi, không độc hại (tuy nhiên chưa loại trừ được ảnh hưởng của độ ẩm môi trường) phù hợp có thể ứng dụng sàn lọc nguyên liệu và các các sản phẩm thuốc. Mở ra các hướng nghiên cứu mới trên các đối tượng phức tạp hơn như thực phẩm chức năng, các mẫu sinh học và thực phẩm Bố cục của luận án

Luận án gồm năm phần chính là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương 2: thực nghiệm, chương 3: kết quả và thảo luận, kết luận. Trong mỗi phần có các hình ảnh và bảng biểu minh họa tương ứng, phù hợp. Ngoài ra luận án còn gồm đầy đủ các phần: mục lục, danh mục các ký hiệu và chữ cái viết tắt, danh mục bảng, danh mục hình, danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án, tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và các phụ lục liên quan.

3

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về các nhóm thuốc kháng sinh nghiên cứu

1.1.1. Nhóm thuốc kháng sinh Sulfamid

Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid,

có công thức cấu tạo chung là:

HNR2 SO2 NH R1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm Sulfamid

Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì sulfamid mới

có hoạt tính kháng khuẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là

mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn

mạnh hơn, thông thường là các dị vòng 2 – 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc

hidro thì thu được sulfamid là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid).

Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil,

không mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong

dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin). Hầu hết

các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: tính acid thể hiện do có H ở N-

amid linh động (trừ sulfaguanidin) có tính bazơ do có nhóm amin thơm tự do,

nên tan trong dung dịch acid.

1.1.2. Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam

Các kháng sinh mà phân tử có cấu trúc azetidin-2-on (vòng β-lactam)-

một amid vòng 4 cạnh. Gồm các nhóm : penicillin, cephalosporin,

monobactam, cacbapenem. Trong đó 2 nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là

penicillin và cephalosporin.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on( beta-lactam)

Nhóm các penicillin:

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin,

vòng β-lactam.

4

N

SCH

3

CH3

NH

O

COR

COOM

2

3

4

1

56

7

Hình 1.3: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm penicillin

Nhóm các cephalosporin.

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh

gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác

nhau bởi các gốc R

NH

O

COR1

N

S

R3

R2

COOM

12

3

4

5

67

8

Hình 1.4: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm cephalosporin

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các

cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn,

nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau.

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng ngà, dạng axit ít tan

trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số

dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng

do đa phần chứa đồng thời nhóm -COOH và -NH2, do có C bất đối tạo góc

quay cực αD, có khả năng thụ UV ứng dụng trong TLC, HPLC (định tính, thử

tinh khiết, tạp liên quan, định lượng) và có hấp thụ hồng ngoại do chứa nhiều

nhóm chức cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác

làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn

hoặc dài, giảm độ hấp thụ).

1.2. Các phương pháp phân tích định tính các hoạt chất kháng sinh

trong thuốc

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

1.3. Các phương pháp phân tích định lượng các hoạt chất kháng sinh

trong thuốc

1.3.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích

Quy trình tốn nhiều thời gian, nếu nguyên liệu hay chế phẩm có lẫn các

tạp chất thì sẽ ảnh hưởng đến kết tủa do có tính chọn lọc không cao. Tuy

nhiên phương pháp này dễ thực hiện ở các phòng thí nghiệm với quy mô nhỏ.

5

1.3.2. Phương pháp trắc quang

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất

quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang và tính phát quang.

Các phương pháp này đơn giản dễ tiến hành thông dụng được ứng dụng

nhiều khi xác định các β-lactam đặc biệt trong dược phẩm tuy nhiên độ chọn

lọc không cao, độ nhạy kém, nồng độ chất phân tích cao.

1.3.3. Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-

lactam nhưng không phổ biến nhiều. Phương pháp có tính chọn lọc cao, giới

hạn phát hiện thấp, độ chính xác cao nhưng khó ứng dụng trong phân tích

đồng thời.

1.3.4. Phương pháp điện di mao quản- capillary electrophoresis (CE)

Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-

lactam trong nhiều mẫu đối tượng khác nhau. Phương pháp có độ thu hồi cao,

giới hạn phát hiện thấp, độ lệch chuẩn thấp nhưng việc chuẩn bị mẫu khá

phức tạp

1.3.5. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có

khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau,có

độ chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để

xác định các hoạt chất kháng sinh trong các sản phẩm dược phẩm. Tuy nhiên

phương pháp được sử dụng trên thiết bị đắt tiền, tốn dung môi, thời gian làm

sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu.

1.4. Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi

quy đa biến phân tích các hoạt chất kháng sinh trong thuốc

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp đo phổ hồng ngoại

1.4.1.1. Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phổ của các phân tử và nhóm phân tử xuất hiện dưới

tác dụng của chùm sáng kích thích có năng lượng phù hợp ( tương tác không

đàn hồi) nằm trong vùng hồng ngoại (IR), làm cho các điện tử hóa trị trong

các liên kết п và σ của các nguyên tử trong phân tử bị kích thích, chuyển lên

mức năng lượng cao E1. Đồng thời, khi đó phân tử , các nhóm phân tử,

nguyên tử quay và dao động. Ba quá trình đó sinh ra phổ hấp thụ hồng ngoại

của chất dưới tác dụng của chùm sáng kích thích

6

1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại

Các chất ở trạng thái rắn, lỏng, khí,khi bị kích thích bằng một chùm

sáng có năng lượng phù hợp( tương tác không đàn hồi) có thể sinh ra phổ

hồng ngoại IR của nó. Do đó, muốn đo phổ IR của một chất ta phải thực hiện

qua các bước:

Chuẩn bị mẫu đo:

Nguồn kích thích phổ

Máy đo phổ

Đánh giá phổ

+ Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại

Có nhiều yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại bao

gồm ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử ( hằng số lực hóa trị, sự thay thế

đồng vị, hiệu ứng electron, yếu tố không gian, liên kết hidro nội phân tử), ảnh

hưởng do tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng của quy trình chuẩn bị mẫu

và ảnh hưởng của môi trường. Tuy nhiên, với trạng thái tồn tại khác nhau của

mẫu thì các yếu tố ảnh hưởng tác động đến các mẫu đo là khác nhau.

Với mẫu rắn việc chuẩn bị mẫu là rất quan trọng. Do mẫu rắn có hiện

tượng tán xạ ánh sáng làm giảm cường độ hấp thụ của mẫu và làm mất đi

những thông tin hóa học. Vì vậy việc làm giảm tán xạ của mẫu đến mức tối

thiểu là cần thiết. Khi chuẩn bị mẫu ta phải đảm bảo các yêu cầu của mẫu đo

có kích thước hạt nhỏ, phân tán đồng đều, bề mặt nhẵn, trong, mỏng. Mặt

khác, đối với phổ truyền qua thông thường được áp dụng bằng định luật Beer,

nhưng với phương pháp phân tích phổ hồng ngoại cho mẫu rắn có sự sai lệch

đáng kể do nồng độ của chất hấp thụ quá cao nằm ngoài khoảng tuyến tính

của định luật. Ngay cả khi ở nồng độ thấp trong khoảng tuyến tính của định

luật thì hiện tượng tán xạ ánh sáng cũng gây nên sự sai khác nên đồ thị thu

được biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu quang cũng hiếm

khi đi qua gốc tọa độ. Một nguyên nhân nữa khiến định luật Beer không thể

áp dụng trong việc định lượng các mẫu rắn bằng phương pháp phổ hồng

ngoại là do phổ hấp thụ của các chất nằm trong các vùng hẹp chứa các đỉnh

đặc trưng nên thường hẹp hơn dải phổ hồng ngoại được lựa chọn khi đo định

lượng do đó có sự sai lệch phi tuyến ánh sáng. Khi hiệu chỉnh bằng hồi quy

đa biến việc hiệu chỉnh tốt nhất cho các biến ở nồng độ cao hay thấp tiến gần

đến giá trị trung bình ta phải phân bố tập số liệu đồng đều. Do đó, khi lập ma

trận nồng độ cần phân bố đồng đều nồng độ từ cao đến thấp. Ngoài ra, còn

yếu tố ảnh hưởng của độ ẩm môi trường do xuất hiện pic của nước ở vùng

sóng 3450cm-1

nên khi chuẩn bị mẫu đo cần giữ mẫu đo và chất nền khô.

7

Đối với mẫu khí và lỏng thì ảnh hưởng do hiện tượng tán xạ ánh sáng

rất ít, mà tín hiệu đo lại bị ảnh hưởng của các liên kết hidro nội phân tử, hiệu

ứng electron, yếu tố không gian, ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử,

ảnh hưởng của độ ẩm do nước tạo liện kết hidro hay tương tác với chất phân

tích làm giảm cường độ ở các đỉnh đặc trưng làm mất thông tin hóa học liên

quan đến chất phân tích.

1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp

với chemometrics

Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một

kỷ nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi

trường- công nghệ hóa học xanh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên

cứu khả mới mẻ trên thế giới. Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu

các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả. Các thiết bị này đều có ưu điểm là

khá gọn nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau

thường không đưa ra được các kết quả có độ chính xác cao. Phần mềm và cơ

sở dữ liệu của chúng lại không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc

bổ sung thêm cơ sở dữ liệu. Do đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp

quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy

đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là một vấn đề vô cùng cần thiết.

Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm

Sulfamid bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được

công bố. Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định

lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương

pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình. Như vậy, để định lượng

nhanh hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp phổ hồng ngoại ta phải kết

hợp với chemometric do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu phổ trong

quá trình chuẩn bị mẫu, ảnh hưởng đáng kể của các tá dược, ảnh hưởng của

độ ẩm môi trường và sự sai lệch của định luật Lambe – Bia. Việc định lượng

cần tiến hành trên các mẫu chuẩn và mẫu tự tạo có tá dược hoặc mẫu chuẩn

đã được xác định hàm lượng bằng HPLC. Kỹ thuật đo được áp dụng là kỹ

thuật đo hấp thụ biến đổi Fourier.

8

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất và thiết bị

2.2. Đối tượng, nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Các hoạt chất:

+ Nhóm β lactam các penicilin: Penicilin, Ampicillin, Amoxicillin

+ Nhóm β lactam các cephalosporin:

Thế hệ 1: Cefadroxil, Cephalexin.

Thế hệ 2: Cefaclor

Thế hệ 3: Cefixime, Ceftriaxon, Cefotaxime.

+ Nhóm sulfamid:

Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol

+Hoạt chất đi kèm với nhóm sulfamid

Trimethoprim.

- Các đối tượng mẫu thực tế tiến hành nghiên cứu

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Nguyên tắc phân tích định lượng bằng hồng ngoại gần và trung bình

Để xác định hàm lượng các hoạt chất trong thuốc cần phải tiến hành

tuần tự các bước sau:

1. Chuẩn bị các mẫu chuẩn tự tạo dạng rắn để xác định từng hoạt chất: cân

hoạt chất và các tá dược khác nhau với tỉ lệ khối lượng phù hợp, sau đó

nghiền và trộn đều để đồng nhất

2. Tiến hành đo phổ hấp thụ hồng ngoại truyền qua của mẫu chuẩn ở điều

kiện phù hợp trong vùng phổ hồng ngoại gần và trung thu được ma trận tín

hiệu độ hấp thụ quang A theo số sóng .

3. Xây dựng mô hình hồi qui để xác định các hoạt chất trong thuốc dựa trên

mô hình được xây dựng từ ma trận độ hấp thụ quang của 20-30 mẫu chuẩn

dùng để xây dựng mô hình hồi qui đa biến và ma trận nồng độ có chứa chất

phân tích và tá dược. Trên phần mềm matlab, xử lí số liệu theo 4 phương

pháp PCR, CLS, ILS và PLS.

4. Kiểm tra độ chính xác của mô hình thông qua phân tích 10-15 mẫu chuẩn

tự tạo, đánh giá sai số tương đối và các hệ số tương quan để lựa chọn mô

hình phù hợp.

5. Phân tích mẫu thực tế trên cơ sở vecto độ hấp thụ quang và mô hình đa

biến tuyến tính.

9

2.2.2.2. Quy trình phân tích

Hình 2.1: Lược đồ phân tích các hoạt chất trong thuốc bằng phương pháp IR

kết hợp với chemometrics

2.3. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến

Chạy 4 mô hình hồi quy tuyến tính trong phần mềm matlab 2015 là

CLS, ILS, PLS và PCR

2.4. Các phương pháp phân tích đối chứng xác định hàm lượng các hoạt

chất kháng sinh trong thuốc

2.4.1. Phương pháp phân tích đối chứng theo dược điển

1. Trộn hoạt chất và tá dược có

thành phần khối lượng thay đổi.

2. Lấy 2mg mẫu chất rắn + 98mg

KBr →(Hỗn hợp A)

3. Ép viên15mg hỗn hợp A

Nghiền và trộn 10 phút

Nghiền và trộn 10 phút

4. Đo phổ hấp thụ hồng

ngoại truyền qua thu

được ma trận tín hiệu Y

5. Nhập dữ liệu ma trận hàm lượng và ma trận tín

hiệu của các mẫu chuẩn và các mẫu kiểm tra vào

phần mềm matlab xử lí theo 4 phương pháp CLS,

ILS, PLS và PCR

Nếu cho kết

quả tốt

Nếu kết quả không tốt Đạo hàm bậc 1,

đạo hàm bậc 2

ma trận tín hiệu

Chuyển dữ liệu

vào Matlab đến khi

thu được kết quả

tốt

7.Lựa chọn mô hình

với số PC phù hợp

8.Phân tích định

lượng mẫu thực tế

Đo phổ NIR 3600-2800cm-1

6. Đánh giá kết quả hàm lượng tìm được từ mô

hình bằng các hệ số tương quan R, RMSE

10

Các hoạt chất kháng sinh được phân tích theo dược điển bằng phương pháp

HPLC

- Hoạt chất sulfaguanidin, penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalexin,

cefaclor, cefadroxil, cefotaxim, cefixim được xác định theo DĐVN4

- Hoạt chất sulfamethoxazol và trimethoprim được xác định theo dược điển

Mỹ USP 34- NF 29

2.4.2. Phương pháp đối chứng LC/MS

Các hoạt chất cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cefotaxim, cefriaxon

được phân tích đối chứng theo phương pháp LC/MS.

- Cột tách :C18 (2,1 mm ID × 50mm × 1,9 µm)

- Pha động gồm: kênh A là đệm CH3COONH4 12,50 mM, kênh B:

ACN với tỉ lệ thể tích hai kênh A và B là 30/70. Thể tích mẫu bơm là 10µl,

tốc độ pha động là 200 µl/phút.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu phép đo hồng ngoại

3.1.1. Lựa chọn vùng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất

Các hoạt chất nhóm sulfamid và nhóm beta lactam trong công thức cấu

tạo của chúng đều chứa các nhóm chức SO2NH-, NH2, C-H, -OCH3, C=O,

OH, COOH. Vì vậy khi đo phổ hồng ngoại trên vùng phổ từ 4000 – 400 cm-1

ta thấy xuất hiện các đỉnh đặc trưng ở vùng từ 3600 – 2800 cm-1

và vùng từ

1800 – 400 cm-1

. Trên phổ hồng ngoại hấp thụ thu được khi đo các hoạt chất

dải số sóng đo 7500-2800 cm-1

trong vùng 3600-2800cm-1

các hoạt chất đều

có đỉnh pic đặc trưng và rõ ràng của các nhóm chức NH-, NH2, OCH3, OH,

COOH nên chúng tôi lựa chọn vùng phổ này để nghiên cứu.

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược

Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc thay đổi theo từng nhà sản

xuất khác nhau. Vì thế, chúng tôi đã khảo sát phổ hồng ngoại của một số loại

tá dược thường được sử dụng để sản xuất các kháng sinh được lựa chọn

nghiên cứu.

+ Nhóm sulfamid: tinh bột sắn, magie stearate, bột talc, canxi phosphat,

maltodextrin.

+ Nhóm Penicillin: sodium starch glycolate, magiesi stearate.

11

+ Nhóm Cefalosporin: magie stearate, bột talc, natriglycolat starch,

natrilaurysulfat, lactose.

Tiến hành lấy lần lượt 2 mg từng tá dược trộn với 98 mg KBr, nghiền

mịn đồng nhất từng mẫu trong cối mã não trong 10 phút. Lấy khoảng 15 mg

lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được mẫu viên của các

tá dược, sau đó đem đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ

3600-2800 cm- 1

.Quan sát các phổ hấp thụ hồng ngoại ta thấy, các tá dược

khảo sát đều có hấp thụ hồng ngoại trong vùng phổ khảo sát là 3600-2800

cm-1

Do đó không thể xác định riêng rẽ các hoạt chất khi có mặt của các loại

tá dược trên. Ảnh hưởng của các tá dược trong vùng khảo sát sẽ được loại trừ

bằng cách phân tích đồng thời cả tá dược và hoạt chất trong mẫu sử dụng

thuật toán hồi qui đa biến.

3.1.3. Khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu /KBr

Để khảo sát lựa chọn tỉ lệ khối lượng mẫu/ KBr phù hợp chúng tôi tiến

hành khảo sát trên với mẫu thuốc chứa một hoạt chất ( mẫu thuốc viên

Cephalexin – chứa hoạt chất Cephalexin 500mg trong một viên) và mẫu

thuốc chứa hai hoạt chất (mẫu thuốc viên Bisepton - chứa hàm lượng

sulfamethoxazol 400 mg và trimethoprim 80 mg trên một viên). Tiến hành

trộn bột thuốc của mẫu thuốc viên với KBr theo tỷ lệ khối lượng mẫu trên

KBr là x/y với x= 1-10 và y = 100- x. Chúng tôi nhận thấy khi tỷ lệ khối

lượng mẫu/ KBr tăng thì độ hấp thụ quang của các mẫu viên cũng tăng lên.

Tuy nhiên khi độ hấp thụ quang càng cao thì độ lặp lại của phép đo càng

kém. Mặt khác, nếu lượng mẫu đưa vào quá nhỏ thì dễ gây sai số trong quá

trình cân, do đó chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ mẫu/ KBr là 2/98 cho những

nghiên cứu tiếp theo.

3.1.4. Khảo sát khối lượng mẫu đem ép viên và độ lặp lại của quá trình

ép viên

Lượng mẫu ép viên ảnh hưởng đến bề dày viên, do đó có ảnh hưởng

trực tiếp độ hấp thụ quang của hoạt chất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi có

khảo sát lượng mẫu đem ép viên từ 10mg, 15mg, 17mg và 20 mg. Nhận thấy

rằng, lượng mẫu đem ép viên tăng kéo theo độ hấp thụ tăng. Tuy nhiên, khi

cân lượng ép viên là 10mg , thì viên bị rạn, nứt. Với lượng mẫu đem ép viên

lớn (20mg) độ hấp thụ quang quá cao gây sai số. Vì vậy, chúng tôi chọn

lượng mẫu đem ép viên là 15 mg.

12

3.1.5. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm mẫu

Độ ẩm không khí là một trong những yếu tố quan trọng gây ảnh hưởng

trực tiếp đến khả năng hấp thụ hồng ngoại của các chất. Tiến hành khảo sát

ảnh hưởng độ ẩm bằng cách chuẩn bị 2 mẫu tự tạo gồm Cefixim và các tá

dược có thành phần và khối lượng như nhau. Trong đó, 1 mẫu được chuẩn

bị tại nhiệt độ, độ ẩm của phòng (45%, 30 C) và một mẫu sau khi chuẩn bị

với cùng điều kiện với mẫu 1, được sấy chân không( 50 C, 500MPa ).

Sau khi khảo sát độ ẩm trên đối tượng Cefixim thấy rằng độ ẩm làm

tăng giá trị độ hấp thụ quang A. Do đó, có thể kết luận độ ẩm mẫu có ảnh

hưởng đến kết quả đo.

Kết luận: Từ khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép đo đã lựa chọn được:

- Vùng phổ đo mẫu: 3600 -2800 cm-1

- Tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr = 2/98

- Độ dày viên: 15mg

- Tá dược trong thành phần mẫu đo:

+ Nhóm Sulfamid: Tinh bột sắn, maltodextrin và canxiphosphat.

+ Nhóm Penicillin: Sodium starch glycolate, magiesi stearate.

+ Nhóm Cefalosporin: Magie stearate, bột talc, natriglycolat starch,

natrilaurysulfat, lactose.

- Độ ẩm không khí 30- 45%

3.2. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định từng hoạt

chất kháng sinh trong thuốc.

Kết quả khảo sát điều kiện đo ở mục 3.1 cho thấy các hoạt chất nghiên

cứu đều hấp thụ ánh sáng mạnh ở vùng sóng 3600 - 2800cm-1

, các tá dược

đóng góp đáng kể vào giá trị độ hấp thụ quang đo được. Ngoài ra, độ đồng

đều, kích thước hạt, bề mặt nhẵn của viên, độ dày viên ép khác nhau làm cho

tín hiệu đo của một mẫu sau mỗi lần đo là không lặp lại. Vì vậy, để định

lượng nhanh hoạt chất kháng sinh khi có lẫn tá dược phải kết hợp phân tích

phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến. Từ các nguyên tắc của các mô

hình hồi quy đa biến ta nhận thấy rằng mô hình CLS tính toán dựa trên giá trị

độ hấp thụ quang theo số sóng trên toàn dải phổ và trên tập số liệu thô ban

đầu, còn với mô hình ILS thì phù hợp với tập số liệu nhỏ và chỉ sử dụng một

số giá trị độ hấp thụ tại một số số sóng đặc trưng khác. Với hai mô hình PCR

và PLS tính toán trên cơ sở tối ưu hóa cơ sở dữ liệu, loại bỏ nhiễu bằng cách

tìm số PC phù hợp. Sau khi xử lí tập dữ liệu theo các mô hình hồi quy, dựa

trên các hệ số tương quan R2, RMSE để đánh giá và lựa chọn mô hình phù

hợp để phân tích định lượng.

13

3.2.1. Ma trận mẫu chuẩn và ma trận mẫu kiểm tra xác định hoạt chất

cefixim khi có mặt các tá dược

Tiến hành chuẩn bị 30 mẫu chuẩn (gồm 20 mẫu chuẩn làm ma trận

chuẩn và 10 mẫu chuẩn để làm ma trận kiểm tra) chứa hỗn hợp gồm cefixim

cùng với bốn tá dược là magie stearate, bột talc, natriglycolat starch,

natrilaurysulfat theo như quy trình phân tích trong mục 2.2. với hàm lượng

(%) khối lượng thay đổi theo bảng 3.6 và 3.7. Đo phổ hồng ngoại hấp thụ của

các mẫu này trong vùng phổ từ 3600-2800 cm-1

, ghi lại độ hấp thụ quang của

từng mẫu theo số sóng. Lưu lại kết quả dưới dạng ma trận tín hiệu đo có kích

thước (20x417) và (10x417) để xây dựng mô hình hồi qui. Dữ liệu độ hấp thụ

quang được ghi vào đĩa CD – phụ lục 3.

3.2.2. Nghiên cứu xác định cefixim khi có tá dược bằng phương pháp

CLS và ILS

CLS tính toán trên các tập số liệu ban đầu để tìm ra ma trận hệ số K:

Y0nxk =X0nxm Kmxk

Trong đó n số mẫu để xây dựng mô hình hồi quy đa biến (n=20), k số

sóng (k=417), m số cấu tử cần phân tích (m=1);

K là ma trận hệ số, trong đó với hồi qui đa biến K được tính như sau:

K=(X0tX0)

-1X0

tY0 trong đó X0

t là ma trận chuyển vị của ma trận X.

Tương tự ILS tính toán trên tập ma trận tín Y0 hiệu độ hấp thụ quang

A để tìm ra ma trận hệ số K theo công thức

X0nxm =Y0nxk Pkxm

Trong đó n là số mẫu n=20, m là số cấu tử m=1, k là số bước sóng k=417,

P là ma trận hệ số được tính là P=(Y0tY0)

-1Y0

tX0.

Sau khi xử lí số liệu thấy rằng trong phương pháp CLS, do đặc tính số

liệu độ hấp thụ quang là số liệu thô ban đầu nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh

hưởng trực tiếp bởi độ lớn giá trị độ hấp thụ quang A. Các kết quả trên cho

thấy, sự sai khác giữa hàm lượng thực và hàm lượng tính được từ mô hình

không quá lớn với mẫu kiểm tra có thể do thành phần tá dược trong các mẫu

này giống với các mẫu chuẩn và đã có tín hiệu tương ứng với mô hình hồi qui

nên. Tuy nhiên, khi phân tích mẫu thực tế, nếu nhà sản xuất thay đổi thành

phần tá dược thì kết quả sai số sẽ tăng lên.

Với phương pháp ILS, hàm lượng thu được là số âm chứng tỏ dưới giới

hạn phát hiện của phương pháp. Điều này có thể do mô hình chỉ sử dụng một

số giá trị độ hấp thụ tại một số số sóng chọn ngẫu nhiên (mà có thể tại đó

không có tín hiệu đo) nên gây ra nguồn sai số lớn.

14

Do vậy không nên sử dụng hai phương pháp CLS và ILC trong phân

tích định lượng bằng phổ IR.

3.2.3. Nghiên cứu xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp

PCR

PCR tính toán theo các bước sau :

Xử lý PCA:

- Tìm ma trận trọng số (PCAloading) và ma trận trị số (PCAscore) từ ma

trận tín hiệu (độ hấp thụ quang)

- Tìm số PC phù hợp của ma trận tín hiệu X

- Tìm phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ giữa ma trận hàm

lượng và ma trận trọng số, ma trận trị số của các PC

- Tính lại các hàm lượng của hoạt chất cefixim trong mẫu chuẩn tự tạo

- Kiểm tra tính chính xác của mô hình hồi qui đa biến.

Căn cứ vào kết quả xử lí số liệu thấy rằng kết quả tốt, lặp lại ở ma trận

ban đầu với số PC bằng 4 và ở ma trận đạo hàm bậc 1 và 2 với các số PC 3

và 4. Các ma trận này đều có thể sử dụng làm mô hình chuẩn với các số PC

tối ưu khác nhau để định lượng nhanh cefixim khi có lẫn tá dược trong các

mẫu thuốc thành phẩm.

3.2.4. Xác định cefixim khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS

Tính toán PLS theo các bước sau :

- Tìm ma trận trị số (score matrices) và ma trận trọng số (loading

matrices), tìm hệ số hồi quy “BETA”

- Tìm số PC theo ma trận X và Y

- Tìm mối tương quan giữa X và Y theo số PC vừa tìm được ta được

“BETA”

- Tính lại hàm lượng cefixim trong các mẫu chuẩn tự tạo

- Kiểm tra tính chính xác của mô hình hồi qui đa biến.

Với các mô hình PLS xây dựng trên tập số liệu lừ ma trận phổ đạo hàm

bậc một và ma trận bậc hai cho ta kết quả khả quan hơn rất nhiều. Ở số

PC=2, có sự phù hợp lớn về hàm lượng tìm được với hàm lượng ban đầu

trong ma trận chuẩn nhưng sai khác rất lớn ở các ma trận kiểm tra. Khi số PC

bằng 3 và 4 kết quả đều tốt ở các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra. Vậy ta có thể

lựa chọn các mô hình đạo hàm bậc 1 và mô hình đạo hàm bậc 2 với số PC

bằng 3 hoặc 4 theo phương pháp PLS làm mô hình chuẩn xác định cefixim

trong thuốc thành phẩm.

15

Như vậy đối với các hợp chất bất kỳ, để xác định bằng phương pháp

phổ IR két hợp với thuật toán PLS, việc xây dựng mô hình chuẩn cần tiến

hành theo các bước sau đây:

- Sử dụng ma trận hàm lượng (của mẫu chuẩn tự tạo) và ma trận tín hiệu

ban đầu tìm số PC và tính lại hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu

chuẩn bắt đầu với số PC sao cho tổng phương sai tích lũy đạt 95%, cho

đến khi các hệ số tương quan và hệ số biến thiến (RMSES) đạt yêu cầu

(R>0,9 và RMSES <5 nếu tính theo % hàm lượng). Nếu tìm được số PC

phù hợp thì dừng lại.

- Nếu tăng số PC mà % phương sai tích lũy đã lớn hơn 99% nhưng vẫn

chưa đạt yêu cầu về R và RMSE thì phải tiến hành đạo hàm bậc 1 và

đạo hàm bậc 2 phổ IR rồi tiếp tục tìm số PC phù hợp.

Kết quả hàm lượng thu được ở cho thấy cả 2 phương pháp PCR và PLS

đều cho kết quả tốt, song với phương pháp PLS có các giá trị RMSES và

RMSET thấp hơn. Mặt khác, với mô hình đạo hàm bậc 2 có thể tách tín hiệu,

loại bỏ nhiễu nhưng làm giảm giá trị A nên làm cho sai số lại tăng lên. Vì

vậy, chúng tôi lựa chọn ma trận đạo hàm bậc 1 với số PC bằng 4 theo phương

pháp PLS để làm mô hình chuẩn xác định hoạt chất cefixim trong thuốc.

3.2.5. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định hoạt chất

kháng sinh sulfaguanidin trong thuốc

Chuẩn bị 35 mẫu tự tạo theo quy trình xử lí mẫu mục 2.2, gồm 25 mẫu

làm ma trận chuẩn và 10 mẫu làm ma trận kiểm tra chứa hoạt chất

sulfaguanidin và tá dược thường sử dụng trong thành phần viên thuốc là

magie stearat, natriglycolat starch. Đo 35 mẫu tự tạo theo quy trình mục 2.2.

Ma trận chuẩn gồm ma trận nồng độ có kích thước (25x1), ma trận tín hiệu

có kích thước (25x417); ma trận kiểm tra gồm ma trận nồng độ có kích thước

(10x1), ma trận tín hiệu có kích thước (10x417) ( đĩa CD – phụ lục 3).

Nhập các dữ liệu ma trận nồng độ và ma trận tín hiệu của ma trận

chuẩn, ma trận kiểm tra vào cửa sổ workspace và chạy câu lệnh theo từng

bước của từng phương pháp PLS và PCR trong cửa sổ comman window. Kết

quả ta thu được các ma trận Ypred, Ytest tính ra được từ mô hình với các số

PC khác nhau. Xử lí kết quả theo các công thức (3.1, 3.2, 3.3) tìm ra các hệ

số tương quan R2, RMSES, RMSET để tìm ra thuật toán hồi quy phù hợp với

số PC lựa chọn tối ưu.

16

Dựa vào bảng kết quả phân tích số liệu ta thấy rằng các giá trị R2 tăng

lên khi thay đổi số PC từ 3 đến 5, khi số PC thay đổi từ 5 đến 7 thì hệ số

tương quan R2 không thay đổi nhiều. Các giá trị RMSE thay đổi không nhiều

và có xu hướng giảm dần khi tăng số PC. So sánh các giá trị hệ số tương

quan của các ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra ta thấy với số PC=5 độ chính

xác lặp lại. Do vậy, ta có thể lựa chọn phương pháp PLS với PC tối ưu bằng 5

để xác định sulfaguanidin trong các mẫu thuốc.

3.3. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định đồng thời các

hoạt chất kháng sinh trong thuốc

Trên thực tế, hầu như các thuốc kháng sinh chỉ chứa một số hoạt chất

và tá dược. Do đó, mô hình hồi qui đa biến như phần 3.2 là hoàn toàn phù

hợp. Tuy nhiên, do tỷ lệ kháng thuốc và kháng chéo giữa một số kháng sinh

đặc biệt nhóm các sulfamid rất cao nên đã có một số loại thuốc ở dạng phối

hợp nhiều kháng sinh như phối hợp sulfamethoxazol với trimethoprim hoặc

amoxiclin với clavunalat để tăng khả năng điều trị bệnh. Mặt khác, qua khảo

sát điều kiện đo ta thấy rằng các hoạt chất kháng sinh đều có chung điều kiện

đo phổ IR và thuốc thành phẩm chứa kháng sinh có cùng chung nhiều thành

phần tá dược như nhau. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn ghép chung một số hoạt

chất vào từng nhóm nhỏ xây dựng ma trận xác định đồng thời các hoạt chất

kháng sinh khi có lẫn các tá dược. Mô hình này nếu áp dụng được sẽ rất tiện

lợi cho việc phát triển phần mềm mở (cập nhật thông tin mẫu chuẩn vào một

mô hình) để xác định một hay nhiều hoạt chất trong thuốc trên các thiết bị IR

đo hiện trường.

3.3.1. Nghiên cứu xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi

có tá dược

3.3.1.1. Chế tạo mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra chứa hoạt chất cefaclor,

cephalexin, cefadroxil và các tá dược

Chuẩn bị 31 mẫu tự tạo (22 mẫu chuẩn và 9 mẫu kiểm tra) chứa đồng

thời ba hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil và tổng ba tá dược: Magie

stearate, bột talc, lactose theo như quy trình phân tích trong mục 2.2. Ta

được ma trận nồng độ chuẩn có kích thước (22x4) và ma trận nồng độ kiểm

tra có kích thước (10x4) (đĩa CD- phụ lục 3).

3.3.1.2. Xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá

dược theo mô hình PCR

Để có thể lựa chọn mô hình chuẩn theo phương pháp PCR việc đầu tiên

chúng ta phải tìm giá trị PC tối ưu bằng cách nhập các ma trận nồng độ có

17

kích thước (22x1) ứng với thành phần phần trăm của từng chất trong 22 mẫu

chuẩn, nhập ma trận tín hiệu bằng cách đo 22 mẫu chuẩn này trong vùng

sóng 3600- 2800cm-1

, thu tín hiệu dưới dạng excel, chuyển các giá trị A của

mẫu sang hàng ngang tương ứng với từng bước sóng, ta có ma trận tín hiệu

ma trận chuẩn có kích thước (22x417). Chuyển các ma trận nồng độ và ma

trận tín hiệu vào cửa sổ workspace, nhập câu lệnh tìm số PC như mục 2.3

trong cửa sổ comman window, ta thu được kết quả PC bắt đầu khảo sát là 5.

Căn cứ vào các giá trị R2, RMEC, RMEP thu được ta thấy rằng ở số PC=5

vẫn cho kết qủa không chính xác, với PC bằng 6 và 7 thì kết quả có tăng độ

chính xác hơn rõ rệt khi các giá trị R2 ở mức dao động trong khoảng giá trị

(0,84 – 0,94) và RMEP thấp, khi PC bằng 8 và 9 các giá trị không thay đổi

nhiều và cho kết quả tốt với R2 dao động trong khoảng (0,9 – 0,97) trong đó

số PC=8 cho kết quả tốt hơn. Kết quả của các mẫu kiểm tra có sự lặp lại so

với các mẫu chuẩn do vậy ta có thể lựa chọn ma trận chuẩn làm mô hình

chuẩn xác định đồng thời các hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có

lẫn các tá dược bằng phương pháp PCR với số PC tối ưu là 8.

3.3.3. Đánh giá lựa chọn mô hình chuẩn xác định đồng thời cefaclor,

cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS

Dựa vào các giá trị thu được ta thấy rằng với số PC bằng 5 và 6 kết quả

thu được là không tốt khi R2 dao động trong khoảng (0,696 – 0,982), RMEC

và RMEP còn cao, kết quả không lặp lại ở các ma trận chuẩn và ma trận kiểm

tra do đó 2 giá trị PC này không lựa chọn. Với PC bằng 7, 8 và 9 cho kết quả

tương đối đồng đều ở cả 3 hoạt chất và có sự lặp lại ở các ma trận chuẩn, ma

trận kiểm tra trong đó kết quả tốt nhất là số PC=8. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn

ma trận chuẩn làm mô hình chuẩn theo phương pháp PLS với số PC=9 để xác

định 3 hoạt chất kháng sinh cefaclor, cephalexin, cefadroxil trong thuốc.

Căn cứ vào bảng kết quả xử lí số liệu của ma trận chuẩn và ma trận kiểm

tra theo 2 phương pháp PCR và PLS với các số PC khác nhau chúng tôi thấy

rằng hoàn toàn có thể dùng ma trận chuẩn để làm mô hình chuẩn xác định các

hoạt chất kháng sinh trong thuốc ma không cần tách loại khi kết hợp với thuật

toán hồi quy đa biến PLS với số PC=9 và PCR với số PC=8. Trong 2 phương

pháp, phương pháp PLS cho kết quả tốt hơn so với phương pháp PCR khi cho

các giá trị R2 ở các hoạt chất trong các ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra tốt

hơn do vậy với ma trận chuẩn này chúng tôi lựa chọn làm mô hình chuẩn để

định lượng các hoạt chất kháng sinh khi có lẫn tá dược bằng phương pháp phổ

hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến PLS với số PC=9.

18

3.3.4. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

3.3.4.1. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

nhóm penicilin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận hàm lượng của 24 mẫu chuẩn

và 10 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 4

đến 7. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết

quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PCR với số PC = 6 làm mô hình định

lượng đồng thời penicilin, ampicilin và amoxicilin trong thuốc.

3.3.4.2. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

ceftriaxon và cefotaxim trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

Xây dựng mô hình xác định ceftriaxon và cefotaxim bằng ma trận tín

hiệu và ma trận hàm lượng của 24 mẫu chuẩn và kiểm tra độ đúng bằng ma

trận tín hiệu và ma trận hàm lượng của 16 mẫu kiểm tra. Chạy dữ liệu trên

hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 5 đến 8. Kết quả thu

được thấy rằng đều cho kết quả tốt ở hai mô hình PLS và PCR. Vì vậy, có thể

xác định hai hoạt chất này trên cả hai mô hình với số PC = 7

3.3.4.3. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

cefixim và cefadroxil trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận nồng độ của 22 mẫu chuẩn và

10 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 4

đến 7. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết

quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PLS với số PC = 5 làm mô hình định

lượng đồng thời cefixim và cefadroxil trong thuốc.

3.3.4.4. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

penicilin và cephalexin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

Sau khi xử lí số liệu trên ma trận tín hiệu ban đầu kết quả thu được

không tốt, do tiến hành tối ưu hóa ma trận và tiến hành đạo hàm bậc 1 và ma

trận bậc hai. Xử lí số liệu trong matlab2015 theo 2 mô hình PLS và PCR với

các số PC thay đổi từ 2 đến 5. Kết quả thu được ma trận đạo hàm bậc 1 theo

mô hình PLS với số PC =4 là tối ưu cho việc xác định các hoạt chất

cephalexin và penicilin trong thuốc.

19

3.3.4.5. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh

nhóm sulfamid trong thuốc theo mô hình PLS và PCR

Chạy dữ liệu ma trận tín hiệu và ma trận nồng độ của 30 mẫu chuẩn và

15 mẫu kiểm tra trên hai mô hình PLS và PCR với các số PC thay đổi từ 3

đến 5. Kết quả thu được thấy rằng đều cho kết quả tốt, mô hình PCR cho kết

quả tối ưu. Vì vậy, lựa chọn mô hình PCR với số PC = 5 làm mô hình định

lượng đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong thuốc.

3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến kết quả tính toán theo mô hình

Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong nhóm

penicillin để có thể đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm đến sai số của mẫu chi tiết

hơn. Tiến hành lập một ma trận chuẩn gồm 15 mẫu trộn 3 hoạt chất

penicillin, ampicillin, amoxicillin và các tá dược, đưa mẫu đo vào trong máy

điều chỉnh độ ẩm thời gian khoảng một tiếng, điều chỉnh ở các độ ẩm khác

nhau sau đấy lấy mẫu ra đem đo nhanh thu được ma trận tín hiệu (15x 417).

Như vậy, kết quả cho thấy, hơi nước là một yếu tố trực tiếp ảnh hưởng đến

phổ hấp thụ hồng ngoại của chất. Các phân tử nước có hấp thụ hồng ngoại ở

vùng 3450 cm-1

(thuộc cùng khảo sát của hoạt chất nghiên cứu) gây ra sự

chồng chập các peak hấp thụ hồng ngoại, làm tang cường độ hấp thụ. Khi độ

ẩm tăng lên đến giá trị 50% đã gây ra sai số lớn hơn mức cho phép. Vì thế, để

loại trừ ảnh hưởng của nước cần giữ mẫu khô trong phòng giữ độ ẩm ở 30

đến 45%.

3.5. Phân tích mẫu thực tế

3.5.1. Định tính mẫu thực tế

Từ kết quả hình ảnh phổ hấp thu hồng ngoại của mẫu thực tế và bảng

dữ liệu phổ thu được từ các mẫu thực tế, chúng ta nhận thấy có sự giống nhau

giữa các mẫu thực tế so với phổ thư viện tham chiếu (các số liệu đều cho kết

quả gần về 0). Chứng tỏ rằng các mẫu thực tế có chứa hoạt chất cần nghiên

cứu. Do đó, có thể tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng phương pháp

nghiên cứu.

3.5.2. Định lượng các kháng sinh trong mẫu thuốc

3.5.2.1. Định lượng các kháng sinh nhóm sulfamid

20

Bảng 3.1: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế

(đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu Phương pháp hồng

ngoại (mg/viên)

Phương pháp đối chứng

(mg/viên)

Hàm lượng trên

bao bì (mg/viên)

S1 464,5± 0,6 483,5±0,4 500

S2 483,6±1,8 486,1±0,3 500

S3 456,4±1,2 494,4±0,3 500

S4 481,1±2,5 490,8±0,2 500

Bảng 3.2: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế

(đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu

Hàm lượng SFM (mg/viên) Hàm lượng TMP (mg/viên)

PP hồng

ngoại

PP đối

chứng

HL trên

bao bì

PP hồng

ngoại

PP đối

chứng

HL trên

bao bì

ST1 369,5±1,8 391,2±0,2 400 69,0±1,8 77,5±0,3 80

ST2 382,7±1,2 395,2±0,9 400 71.9±1,2 81,6±0,4 80

ST3 392,7±1,0 394,4±0,2 400 76,0±1,0 77,5±0,2 80

ST4 390,1±0,7 389,2±0,6 400 76,8±0,7 80,6±0,4 80

3.5.2.2. Định lượng các kháng sinh nhóm penicillin

Bảng 3.3: Hàm lượng (mg/viên) của PN,AM,AX trong các mẫu thực tế

(đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu Phương pháp hồng

ngoại (mg/viên)

Phương pháp đối chứng

(mg/viên)

Hàm lượng trên bao

bì (mg/viên)

PN 605,2±1,1 598, 1±0,6 625

AM 464,2±2,0 493,0±0,7 500

AX 547,1±0,9 496,5±0,8 500

Bảng 3.4: Hàm lượng (mg/viên) của nhóm Cefalosporin trong các mẫu

thực tế (đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu

Phương pháp

hồng ngoại

(mg/viên)

Phương pháp đối chứng

(mg/viên) Hàm

lượng trên

bao bì

(mg/viên)

Phương pháp đối

chứng theo dược

điển VN4

Phương

pháp đối

chứng LC-

MS

Cephalexin

MKP 530,7±3,20 - 545,9±0,4 500

Cephalexin 540,2±1,1 528,50±0,9 - 500

Mekocefaclor 243,1 ± 7,9 - 283,8±0,3 250

Cadidroxyl 513,9 ± 1,7 - 512,7±0,3 500

Cefixim 214,8±4,6 205,60±0,8 - 200

Cefadroxil 467,2±1,3 507,00±1,2 - 500

Cefaclor 224,6±5,6 249, 25±1,0 - 250

21

3.5.2.3. Định lượng các kháng sinh nhóm Cefalosporin

Bảng 3.5: Hàm lượng (g/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cefalosporin

trong các mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu Phương pháp

hồng ngoại (g/lọ)

Phương pháp đối chứng (g/lọ)

Hàm lượng

trên bao bì

(g/lọ)

Phương pháp đối

chứng theo dược

điển VN4(g/lọ)

Phương

pháp đối

chứng LC-

MS(g/lọ)

Ceftriaxone

UNION 1,033±0,023 - 1,003±0,065 1,000

Cefotaxime

Myclox 1,021±0,014 1,007±0,056 - 1,000

Cefotaxime

BHARAT 1,058±0,025 - 1,068±0,079 1,000

Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy hàm lượng các hoạt chất

thu được theo phương hồi quy đa biến với phương pháp phân tích tiêu chuẩn

trong dược điển sai khác không đáng kể. Độ chệch tương đối hàm lượng

Cephalexin giữa phương pháp hồng ngoại và phương pháp đối chứng là

2,2%- 2,7% , Cefaclor là:9,88%-11,36%, Cefadroxil là : 0,24%-7,8% ,

Cefixim là: 4,48%, Cetriaxone là: 0,3%, Cefotaxim là : 1%-2%. Từ sự chênh

lệch giữa các phương pháp phân tích, cho ta thấy rằng phương pháp phổ hồng

ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến tỏ ra khá ưu

việt khi áp dụng vào phân tích một số hoạt chất nhóm Cefalosporin. Do đó

hoàn toàn có thể áp dụng phổ biến để phân tích nhanh hàm lượng các mẫu

thuốc ngoài thị trường.

Để dễ so sánh, kết quả phân tích được bằng phương pháp IR sử dụng

thuật toán PCR và PLS so với phương pháp đối chứng của tất cả 16 mẫu

thuốc được biểu diễn thông qua so sánh tương quan hàm lượng bằng cách

tính hệ số tương quan (hình 3.54). Hệ số tương quan đạt được tính qua R2=

0,9891 chứng tỏ kết quả phân tích là tương đương nhau.

22

Hình 3.1: Tương quan giữa hàm lượng hoạt chất được xác định bằng hồi quy

đa biến và hàm lượng hoạt chất được xác định theo dược điển (n=16)

Bảng 3.6: Hàm lượng (mg/viên) của nhóm Cefalosporin trong các mẫu

thực tế (đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu

Phương pháp

hồng ngoại

(mg/viên)

Phương pháp đối chứng (mg/viên)

Hàm lượng

trên bao bì

(mg/viên)

Phương pháp đối

chứng theo dược

điển VN4

Phương

pháp đối

chứng LC-

MS

Cephalexin MKP 530,715±3,2 - 545,88±0,4 500

Cephalexin 540,22±1,08 528,5±0,89 - 500

Mekocefaclor 243,04 ± 7,87 - 283,81±0,3 250

Cadidroxyl 513,94 ± 1,65 - 512,67±0,3 500

Cefixim 214,82±4,56 205,6±0,78 - 200

Cefadroxil 467,2±1,32 507±1,23 - 500

Cefaclor 224,61±5,6 249, 25±0,97 - 250

Bảng 3.7: Hàm lượng (g/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cefalosporin trong các

mẫu thực tế (đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu Phương pháp

hồng ngoại (g/lọ)

Phương pháp đối chứng (g/lọ)

Hàm lượng

trên bao bì

(g/lọ)

Phương pháp đối

chứng theo dược

điển VN4(g/lọ)

Phương

pháp đối

chứng LC-

MS(g/lọ)

Ceftriaxone

UNION 1,033±2,3 - 1,003±0,65 1,000

Cefotaxime

Myclox 1,021±1,4 1,007±0,56 - 1,000

Cefotaxime

BHARAT 1,058±2,5 - 1,068±0,79 1,000

R² = 0.9891

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300 400 500 600 700

Hàm

lượ

ng

ho

ạt c

hất

tín

h t

he

o m

ô

hìn

h

Hàm lượng hoạt chất xác định theo HPLC

23

KẾT LUẬN

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công kỹ

thuật đo phổ IR vùng gần và trung để định lượng các hoạt chất kháng sinh

nhóm sulfamid và nhóm beta lactam trong thuốc viên nén và thuốc tiêm nhờ

xử lý số liệu bằng phương pháp hồi quy đa biến. Các kết quả chính luận án

đạt được như sau:

1. Đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp của phép đo phổ hồng

ngoại truyền qua nhằm định lượng các hoạt chất kháng sinh trong viên thuốc.

Mẫu được đo trục tiếp dạng rắn với vùng phổ IR tối ưu để xác định các hoạt

chất kháng sinh nhóm sulfamid và nhóm beta- lactam từ 3600 cm-1

- 2800

cm-1

; tỉ lệ khối lượng khi trộn mẫu với KBr là 2:98; khối lượng cân đem ép

viên là 15mg. Độ ẩm của mẫu đo và môi trường đo có ảnh hưởng đáng kể

đến kết quả và cần khống chế độ ẩm dưới 45%.

2. Các thành phần tá dược phổ biến thường đi kèm với hoạt chất

trong các loại thuốc viên có ảnh hưởng rất lớn đến tín hiệu phổ hấp thụ hồng

ngoại trong khoảng 3600 cm-1

- 2800 cm-1

nên không thể sử dụng kỹ thuật

định lượng theo phương pháp đường chuẩn biểu diễn độ hấp thụ quang tại

đỉnh pic hoặc diện tích pic theo hàm lượng mà phải sử dụng các mô hình hồi

quy đa biến tuyến tính cho số liệu trên toàn dải phổ (417 số sóng trong

khoảng phổ đo).

3. Trong số các mô hình hồi qui đa biến tuyến tính CLS, ILS, PCR,

PLS thì hai mô hình xử lý tín hiệu thông qua ma trận số liệu ban đầu là CLS

và ILS đều cho sai số rất lớn (hàng nghìn %). Nguyên nhân có thể do giá trị

độ hấp thụ quang không lặp lại giữa các lần đo và tín hiệu bị ảnh hưởng bởi

rất nhiều thành phần chất không có trong mẫu chuẩn tự tạo.

4. Hai phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính PCR và PLS sử dụng

ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang chuyển đổi theo thuật toán giảm số biến và

loại bỏ nhiễu cho kết quả phân tích rất tốt. Mô hình hồi qui được xây dựng

dựa trên ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang và ma trận hàm lượng hoạt chất

trong 20-30 mẫu chuẩn tự tạo, sau đó được đánh giá độ chính xác bằng ma

trận 10-15 mẫu kiểm tra. Khi xác định cefixim, số PC tối ưu cho mô hình

PLS với PC bằng 4 với ma trận đạo hàm bậc 1. Hai mô hình này đã được áp

dụng để phân tích cefixim trong mẫu chuẩn kiểm tra (tự tạo) với hệ số tương

quan R>0,95. Khi xác định sulfaguanidin trong mẫu chuẩn kiểm tra (tự tạo)

với số PC tối ưu là 5 theo phương pháp PLS, thì hệ số tương quan hàm lượng

tìm được với hàm lượng biết trước là R> 0,95 với ma trận ban đầu không cần

đạo hàm.

24

5. Hai thuật toán hồi qui đa biến PCR và PLS cũng đã được sử dụng

thành công để xác định đồng thời một số các kháng sinh trong cùng nhóm

chất, gồm: sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim; cephalexin,

cefaclor và cefadroxil; penicilin, ampicilin và amoxicilin; cefotaxim và

ceftriaxon; cefixim và cefadroxil; với hệ số tương quan R biểu thị hàm lượng

tìm được và hàm lượng biết trước trong mẫu chuẩn kiểm tra đạt từ 0,83 đến

0,99. Các mô hình được bắt đầu với số PC từ 3 (thông thường chọn từ PC nào

mà tổng % phương sai tích lũy đạt 95% trở lên) cho đến 9 sao cho hệ số

tương quan R >0,95. Nếu chưa đạt sẽ tiến hành với ma trận tín hiệu đạo hàm

bậc 1 và bậc hai. Các đều cho kết quả rất phù hơp với hàm lượng biết trước

trong mẫu kiểm tra mà không cần đạo hàm phổ. Riêng phép xác định đồng

thời penicilin và cephalexin cần tiến hành trên phổ đạo hàm bậc 1 với số

PC=5 mới cho kết quả phù hợp.

6. Đã xây dựng được qui trình định tính và định lượng nhanh các

hoạt chất kháng sinh trong thuốc viên nén và thuốc bột pha tiêm bằng phương

pháp IR trên cơ sở mô hình xác định đồng thời. Mẫu rắn chỉ cần nghiền nhỏ,

trộn với KBr và đo phổ IR mà không cần xử lý mẫu. Dữ liệu phổ IR toàn

phần trong vùng phổ khảo sát được chuyển vào phần mềm Matlab R2015 với

các câu lệnh tự lập. Kết quả áp dụng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính PCR

và PLS cho thấy độ lệch kết quả tìm được bằng phương pháp nghiên cứu với

phương pháp đối chứng theo dược điển Việt Nam hoặc phương pháp tham

chiếu LC-MS chỉ khoảng 0,2%-11,8% tùy mẫu. Nghiên cứu này cho thấy có

thể xây dựng một mô hình hồi qui chứa đồng thời các chất nhưng xác định

được một hoạt chất trong thuốc.

Hướng phát triển tiếp của đề tài:

Các kết quả nghiên cứu ban đầu bằng cách ghép số liệu ma trận hàm

lượng của 12 chất đã làm ở trên vào một ma trận hàm lượng (trong đó mẫu

chuẩn nào không có chất phân tích thì hàm lượng nhập vào bằng 0) với ma

trận số liệu độ hấp thụ quang tương ứng đã cho thấy có sự phù hợp rất tốt giữa

kết quả phân tích với hàm lượng biết trước trong các mẫu kiểm tra. Điều này

mở ra hướng phát triển tiếp theo của đề tài về việc xây dựng ngân hàng mẫu

chuẩn theo cách cập nhật thông tin phổ từng mẫu để xác định các chất khác

nhau trong mẫu và rất thuận lợi để có thể phát triển thiết bị đo hiện trường.

Thành công của nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển một phương

pháp phân tích đơn giản, nhanh, xử lí mẫu đơn giản không sử dụng dung môi

độc hại và hướng tới tự chế tạo được thiết bị phân tích ngay tại hiện trường.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Tạ Thị Thảo, Đoàn Thị Huyền, Bùi Xuân Thành (4/2016). Ứng dụng

phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để phân tích đồng thời các

chất trong cùng hỗn hợp, Kỷ yếu hội thảo khoa học trường Đại học

Sư phạm Hà Nội, tr.364-376

2. Đoàn Thị Huyền, Tạ Thị Thảo, Bùi Xuân Thành, Vũ Thị Huệ. Nghiên

cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần định lượng

nhanh hoạt chất Sulfaguanidin trong thuốc viên nén. Tạp chí phân tích

Hóa, Lý và Sinh học, 21(1/2016), tr.153-162.

3. Tạ Thị Thảo, Bùi Xuân Thành, Vũ Thị Huệ, Đoàn Thị Huyền. Định

lượng đồng thời Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim

trong thuốc viên nén sử dụng mô hình hồi quy cấu tử chính (PCR) từ

dữ liệu phổ hồng ngoại gần. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học,

21(2/2016), tr.127-134

4. Đoàn Thị Huyền, Nguyễn Thu Thảo, Bùi Xuân Thành, Tạ Thị Thảo.

Định lượng đồng thời cefotaxime và Ceftriaxone trong thuốc bột pha

tiêm bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần kết hợp với mô

hình bình phương tối thiểu từng phần(PLS), Tạp chí khoa học, Đại

học ĐH Quốc Gia Hà Nội, Vol. 32, No. tr.167-174.

5. Đoàn Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Bùi Xuân Thành, Tạ Thị

Thảo. Nghiên cứu định lượng nhanh cefadroxil, cephalexin, cefaclor

trong thuốc viên nén bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần

đối chứng bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC MS, Tạp chí

Hóa, lý và Sinh học, 21(3/2016), tr.94-101

6. XUAN-THANH BUI,

THI HUYEN DOAN,ANH-TUYET THI

NGUYEN,THI-THAO TA,DOUGLAS N. RUTLEDGE,SI-HUNG

LE. “FTIR combined with chemometric for fast simultaneous

determination of Penicillin and Cefalexin in medicine”. Indian

Chemical Society (đã xác nhận đăng).