ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------------------

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN

ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội

2. PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học

Quốc gia họp tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

vào hồi…giờ 00, ngày…tháng…năm…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

Đặt vấn đề

Gần đây, do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn

cầu, hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày

càng trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc

gia, ảnh hƣởng tới công tác xuất khẩu lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an

ninh lƣơng thực trong khu vực và trên thế giới.Trong điều kiện khí

hậu toàn cầu biến đổi mạnh mẽ, việc tạo ra các giống cây trồng có

năng suất cao, đồng thời chống/chịu đƣợc với các điều kiện bất lợi

của môi trƣờng trở thành một trong những nhiệm vụ then chốt của

khoa học nông nghiệp. Tuy nhiên, cho đến này tất cả những giống

cây trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc sử dụng

trong sản xuất đều đƣợc lai tạo dựa trên các phƣơng pháp chọn giống

truyền thống, hầu nhƣ chƣa có giống cây trồng chịu hạn nào đƣợc tạo

ra b ng phƣơng pháp công nghệ sinh học. Sang thế k I, với sự

phát triển b ng nổ của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, hai định

hƣớng chọn giống chịu hạn đang đƣợc các nhà khoa học đặc biệt

quan tâm là chọn giống phân tử và chọn giống chuyển gen.

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen (với sự tham gia của

hàng trăm gen khác nhau), vì vậy định hƣớng chọn giống phân tử

đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan

trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên những thành tựu

nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, c ng với sự phát triển các

kỹ thuật microaray, proteomic..., các nhà khoa học đã phát hiện và

chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc

tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen điều khiển mặc d

không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của

thực vật nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu

hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp

ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn ở thực vật. Phát

hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu rất mới cho lĩnh vực chọn

giống chuyển gen ở thực vật, đó là ch cần chuyển một hay một vài

gen điều khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cƣờng

tính chống chịu của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu

phân lập, đặc tính hoá các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn

đang trở thành định hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chọn

tạo giống chịu hạn.

Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên

cứu về phân lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn

b ng công nghệ chuyển gen thực vật đã bắt đầu đƣợc một số phòng

thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu hết các chƣơng trình, dự án

nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung và chống

chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nƣớc ngoài hoặc

các gen đã đƣợc công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới.

Cho đến nay, chúng ta vẫn chƣa có một đề tài nghiên cứu cơ bản

hoàn ch nh nào về phân lập gen liên quan đến đáp ứng chống chịu

hạn ở thực vật. Từ đó, chúng tôi đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn

vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số

liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có

khả năng chống chịu điều kiện hạn.

Mục tiêu nghiên cứu

i) Phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã s R 1 /2

liên quan tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam.

ii) Tối ƣu hoá đƣợc quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa Việt Nam.

iii) Tạo ra đƣợc một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố

phiên mã s R 1 /2 có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng

(cây không chuyển gen) trong điều kiện bình thƣờng và có khả năng

chống/chịu (tiếp tục sinh trƣởng, cho thu hạt) khi bị xử l hạn trong

điều kiện phòng thí nghiệm.

Đối tƣợng v nội ung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen

OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan tới tính

chịu hạn của giống lúa Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các gen mã

hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng chuyển gen dƣới sự điều

khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng.

ác n i ung nghiên cứu chính

Nội dung 1: Phân lập gen hai gen OsDREB1A và OsDREB2A

liên quan đến tính chịu hạn từ thƣ viện c N của giống lúa Việt

Nam; và thiết kế các cấu trúc chuyển gen thực vật (binary vector) cho

gen OsDREB1A/OsDREB2A dƣới sự điều khiển của promoter liên

tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9).

Nội dung 2: Tối ƣu hóa quá trình phát sinh callus và tái sinh

cây từ callus của một số giống lúa Việt Nam; và hoàn thiện kỹ thuật

biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên

một số giống lúa Việt Nam có tiềm năng phát sinh callus và khả năng

tái sinh cao.

Nội dung 3: iến nạp các cấu trúc biểu hiện nhân tố phiên

mã vào giống lúa Việt Nam và sàng lọc các dòng cây chuyển gen

(kiểu hình- so sánh với cây đối chứng, kiểu gen- xác định sự tồn tại

ổn định và số lƣợng cấu trúc biến nạp trong cây chuyển gen).

Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện (kiểu hình và kiểu gen) của

các dòng chuyển gen (T3, một cấu trúc biến nạp) trong điều kiện xử

l hạn tại phòng thí nghiệm.

Địa điểm nghiên cứu

Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh

học Phân tử, Viện i truyền Nông nghiệp (Viện hoa học Nông

nghiệp Việt Nam) là địa ch uy tín, dẫn đầu trong cả nƣớc về công tác

phân lập, nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa nhân tố phiên

mã; và Phòng Thí nghiệm tƣơng tác cây trồng-vi sinh vật thuộc

Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển (IR ) tại ontpellier là phòng

thí nghiệm có trang bị hiện đại, có các chuyên gia uy tín trong nghiên

cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa).

Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một

cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng

trên hai gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A

liên quan tính chịu hạn. Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa

OsDREB1A/OsDREB2A dƣới sự điều khiển bởi promoter hoạt động

liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9) đã đƣợc

nghiên cứu biểu hiện và ảnh hƣởng đến cây lúachuyển gen trong cả

điều kiện thông thƣờng và điều kiện bất lợi. Luậnánđã chọn đƣợc 04

dòng lúa Chành trụi chuyển gen (OsDREB1A) kiểu hình bình thƣờng

và có khả năng tăng cƣờng chịu hạn (đã duy trì đến T3).

Ngoài ra, trong nghiên cứu này, lần đầu tiên ở Việt Nam

chúng tôi tiến hành khảo sát chi tiết khả năng phát sinh callus và khả

năng tái sinh cây hoàn ch nh từ callus của nhiều giống lúa Việt Nam

(giống phổ biến, giống chịu hạn, giống địa phƣơng...). ết quả

nghiên cứu đã ch ra một số giống lúa có tiềm năng để tiếp tục tối ƣu

quy trình chuyển gen cho từng giống lúa sau này. Đây là tiền đề cho

các nghiên cứu tiếp theo nh m tạo ra các giống lúa công nghệ sinh

học b ng công nghệ ch nh sửa hệ gen không qua lai tạo có các đặc

điểm nông sinh học vƣợt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống

gốc ban đầu.

Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc

ứng dụng phản ứng PCR định lƣợng trong việc ƣớc tính số lƣợng bản

sao của cấu trúc chuyển gen và xác định các dòng chuyển gen đồng

hợp ngay từ thế hệ T1. Với kết quả từ nghiên cứu này, chúng tôi tin

r ng đây có thể là phƣơng pháp ph hợp cho điều kiện phòng thí

nghiệm còn nhiều hạn chế trong nƣớc khi tiến hành nghiên cứu, sàng

lọc các dòng cây chuyển gen.

Ứng ụng thực tiễn của luận án

ết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng T2

(đồng hợp, một bản sao gen OsDREB1A dƣới sự điều khiển của

promoter cảm ứng Lip9) có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng

không chuyển gen và đặc biệt có khả năng phục hồi và kết hạt sau 3

tuần ngừng tƣới nƣớc. Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng

ứng dụng của OsDREB1A và điều hòa biểu hiện của gen mã hóa

nhân tố phiên mã dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng trong

công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của

luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A do luận

án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan

trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển

gen chịu hạn nh m đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều

kiện thay đổi khí hậu toàn cầu. Các dòng chuyển gen đƣợc duy trì

theo dõi trong nhà lƣới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống

khi điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận cây lúa chuyển gen và vật

liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra).

1. Bố cục của luận án

Luận án gồm 137 trang, bao gồm: Phần mở đầu (06 trang); Tổng

quan tài liệu (32 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (18

trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (36 trang); Kết luận (02

trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên

quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) với 135 tài

liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (12 tài liệu) và tiếng Anh (123 tài

liệu); Phụ lục (14 trang). Luận án có 18 bảng, 24 hình.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ẢNH HƢỞNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN NÔNG NGHIỆP &

THỰC VẬT

Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc d ng để ch trạng thái thiếu nƣớc

do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn

sống, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật.

ôi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở

tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển.

Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ

chống lại sự thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ

khác nhau. Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật đƣợc thực hiện

thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng

loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền

tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu.

1.2. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TR NG ĐIỀU KIỆN HẠN

Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả năng điều hòa

nhanh biểu hiện của các gen chức năng. Quá trình điều hòa biểu hiện

gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các

điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán. Các nghiên cứu

gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bƣớc trong

quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá

trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã,

điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử

RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ quá

trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone).

1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN Ã TR NG ĐÁP ỨNG

STRESS HẠN

Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố

phiên mã (TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng

chống chịu stress. Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt

động gen đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định

thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên

cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC,

bZIP hay ZF.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNxG LÚA CHUYỂN

GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lƣợng nƣớc tiêu

thụ trong sản xuất lúa gạo có nghĩa vô c ng to lớn để tăng sản

lƣợng và đảm bảo an ninh lƣơng thực. Một hƣớng nghiên cứu phổ

biến và rất đƣợc quan tâm hiện nay là tăng cƣờng biểu hiện các gen

đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa

chuyển gen. o cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc

sử dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng

lƣới điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo

giống lúa chịu hạn thƣờng mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen

chức năng (mã hóa protein/enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng

chống chịu stress). Tuy nhiên, cho đến nay mới ch có một vài

nghiên cứu chứng minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển

gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng ruộng. Ở Việt Nam, cho

đến nay chƣa có một nghiên cứu hoàn ch nh nào về các gen liên

quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm

gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới tăng cƣờng đáp ứng

chống chịu hạn ở lúa.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Thƣ viện c N sơ cấp của lúa Oryza sativaL.xử lý hạn và mặn

đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông

nghiệp. 47 giống lúa đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Di

truyền.

2.1.2. Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Escherichia coli H5α đƣợc mua từ hãng

Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli XLOR, XL1-Blue MRF và

phage “trợ giúp” đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ);

chủng vi khuẩn E. coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty

Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

LBA4404 khả biến.

2.1.3. Vector và oligonucleotide

Các cặp mồi sử dụng làm mồi và các mẫu oligonucleotide đầu dò

đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003)

và Tran (2004).

- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA.

- Nhân dòng trình tự mã hóaOsDREB1A/OsDREB2Avào vectorpUC19.

- Thiết kế vector biểu hiện OsDREB1A/OsDEB2A.

Hình 2.2 | Giản đồ quy trình thiết kế vector chuyển gen

- Đánh giá khả năng tạo callus và tái sinh chồi từ callus của một số giống

lúaở Việt Nam

- Khảo sát một số quy trình chuyển gen cho lúa indica

- Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsDREB1A/OsDREB2A.

- Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen

- Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở giai đoạn sinh

trƣởng, ra hạt

Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

OSDREB1A/OSDREB2A

3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen OsDREB1A/OsDREB2A

Trình tự mã hóa gen OsDREB1A đã đƣợc phân lập b ng phản

ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB1A-Fw/Rv từ DNA hệ gen giống

Cƣờm Dạng và thƣ viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền.

Trình tự mã hóa s R 2 đã đƣợc phân lập b ng phản ứng PCR

với cặp mồi gen OsDREB2A-Fw/Rv từ khuôn cDNA xử lý hạn của

giống lúa Cƣờm Dạng. Sản phẩm khuếch đại trình tự mã hóa của hai

gen đã đƣợc nhân dòng vào vector pUC19. Vector tái tổ hợp đã đƣợc

biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng H5α, sàng lọc b ng phƣơng

pháp PCR trực tiếp khuẩn các lạc màu trắng(hình 3.5) và tiếp đó

đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger với cặp mồi vector .

Hình 3.5 | Kết quả PCR kiểm tra trực tiếp khuẩn lạc mang

vector pUC19 tái tổ hợp Ghi chú: ên trái- i h ợc biến n p vector tái tổ hợ

i giế g - 5: sản ph h h n l c biến n p sản

ph m ghép n i với o n chèn là sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t DNA

tổng s gi g ú ờm D ng; (ii) giếng 6-9: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i với o n chèn là sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t

cDNA xử lý h n của gi ng lúa M c Tuyề giế g i chứng âm (không có DNA khuôn).

ên ph i- i h ợc biến n p vector tái tổ hợp pUC19/OsDREB2A: giế g i chứng âm (không có DNA khuôn); 12-15: sản ph h h n

l c biến n p sản ph m ghép n i giữa pUC19 và sản ph m khuế h i trình tự mã hóa

OsDREB2A t cDNA của gi g ú ờm D ng.

3.1.2. Thiết kế vector chuyển gen

Trình tự mã hoá OsDREB1A/OsDREB2A trong vector pUC19 và

vector chuyển gen pBIG - Lip9/Ubi đƣợc cắt và xử lý b ng enzyme

giới hạn BamHI, rồi đƣợc ghép nối b ng enzyme T4 ligase theo quy

trình giản lƣợc trong hình 2.2. Vector pBIG-Lip9/Ubi tái tổ hợp đƣợc

biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α, sử dụng phƣơng pháp

PCR trực tiếp khuẩn lạc để sàng lọc các thể tái tổ hợp trong đó trình

tự mã hóa n m cùng chiều với promoter điều khiển trong cấu trúc

chuyển gen (hình 3.10).

Hình 3.10 | Điện i sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% i- Sản ph m PCR t các khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB1A. Giếng M: Thang chu n

DNA 1kb; giếng 1, 2: khu n l c 1 và 2; giế g 3 i chứng âm

B- Sản ph m PCR t các khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB2A. Giếng M: Thang chu n DNA 1kb; giế g i chứng âm; giếng 2-5: khu n l c 1-4

3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN G N VÀ GIỐNG

LÚ Ở VIỆT N

3.2.1. Khả hình th nh callus của tập đo n giống lúa Việt Nam

Sử dụng 03 loại môi trƣờng MS (nồng độ 2,4D từ 1,5 mg/l đến

2,5 mg/l) để khảo sát khả năng tạo callus của 47 giống lúa ở Việt

Nam chúng tôi nhận thấy có 26 giống có khả năng tạo callus tốt.

Trong đó, có 05 giống bao gồm giống 20, 26, 34, 44 và 47 có tiềm

năng tạo callus cao nhất. Cụ thể là với giống 20 môi trƣờng có bổ

sung 1,5mg/l 2,4 (môi trƣờng S1) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất

(78,49%) còn môi trƣờng có bổ sung 2mg/l 2,4 ( môi trƣờng S2)

là thích hợp nhất cho sự hình thành callus của giống lúa 26, 34, 44 và

47 (tƣơng ứng 84,94, 76,53%, 79,61% và 90,06%).

3.2.2. Khả năng tái sinh của tập đo n giống lúa Việt Nam

26 giống lúa có khả năng tạo callus tốt trong mục 3.2.1 đã đƣợc

nghiên cứu đánh giá khả năng tái sinh chồi từ callus trên 04 loại môi

trƣờng trên nền MS có bổ sung BAP và kinetin. Kết quả khảo sát cho

thấy, có 05 giống bao gồm YUNLU103-1 , giống LUYIN46, LP-

5M, IR80416-B-152-4 và Chành trụi có khả năng tạo callus tốt nhất

đƣợc lựa chọn tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen

và hoàn thiện quy trình chuyển gen.

3.2.3. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen của giống lúa Việt Nam

Bảng 3.5 | hả năng tiếp nhận gen của 5 giống lúa Việt Nam

Qui trình Ch nh trụi

YUNLU10

3-1B LUYIN46 LP-5M

IR80416-B-

152-4

Phòng

Bệnh học

phân tử

Chọn lọc 1 50 ± 2,04 20,33± 1,67 15,53± 1,78 19,39± 1,57 21,53± 1,98

Chọn lọc 2 38 ± 1,53 5,26± 1,01 2,34± 0,67 4,33± 0,51 6,21± 0,62

Tái sinh 27,67± 1,62 0 0 0 0

PCR 17,33± 1,12

Rahman

(2011)

Chọn lọc 1 55,05± 1,94 20,13± 1,94 10,53± 1,94 17,32± 1,94 11,06± 1,94

Chọn lọc 2 15,12± 1,94 7,05± 1,94 1,12± 1,94 3,54± 1,94 4,57± 1,94

Tái sinh 0 0 0 0

PCR

Hiei

(2008)

Chọn lọc 1 40 20,33 15,53 19,39 9,34

Chọn lọc 2 15,24 5,19 4,31 8,03 3,47

Tái sinh 0 0 0 0 0

PCR 0

05 giống có khả năng tạo callus và tái sinh tạo chồi tốt nhất đƣợc

nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens với 03 quy trình khác nhau (Bảng 3.5) bao gồm: 01 quy

trình đã phát triển bởi chính tác giả và 01 quy trình cho lúa japonica

(Hiei, 2008) và 01 quy trình cho lúa india (Rahman, 2011). ết quả

nghiên cứu cho thấy ch có giống Chành Trụi có khả năng tiếp nhận

gen lạ thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng quy trình đã đƣợc

phát triển bởi chính nghiên cứu sinh (Hình 3.15).

Hình 3.15 | Quy trình chuyển gen Ch nh trụi nền môi trƣờng MS Q y ì h ợc thiết lập cho gi ng Chành trụi t i hó về thời gian t g b ớc, nồ g

các chất bổ sung, nhiệ . Chú ý nồ g vi khu . ef ie ã i 600 = 0,03,

sử dụng vi khu n ở nồ g o hơ ,5 h t s nghiên cứ ớ ó ó h gây giảm hiệu quả củ i ờng chọn lọ b ớc ra rễ (7) có th sử dụ g i ờng MS giảm m t nửa

nồ g (MS/2) giúp rễ xuất hiện sớm (rễ mảnh và phân chia nhiề hơ , y hiê ở b ớc tiếp

theo (8) cầ hú ý hi ây v o ù hè hó i o m và nhiệ ). Cây sau khi h ới 03 tuần sẽ ợc thu mẫu lá, tách DNA tổng s sàng lọc bằ g x ịnh

ây d ơ g í h MS: i ờng Murashige and Skoog.

3.3. TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN

Các cấu trúc p IG-Lip9:OsDREB1A, pBIG-Ubi:OsDREB1A,

pBIG-Lip9:OsDREB2A và pBIG-Ubi: s R 2 , các vector trống p IG-

Lip9 và pBIG-Ubi đã đƣợc biến nạp vào giống lúa Chành trụi theo quy trình

giản lƣợc trong hình 3, kết quả từ 600 callus ban đầu đã thu đƣợc 99 chồi tái

sinh. ết quả theo dõi cây chuyển gen và sử dụng phƣơng pháp PCR, qRT-

PCR với cả mồi đặc hiệu gen và mồi vector đã xác định đƣợc 44 dòng

chuyển gen một bản copy và trong đó ch có 10 dòng cho hạt ( ảng 3.7).

Bảng 3.1 | Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0

Cấu trúc gen chuyển Tái

sinh

PCR ƣơng

tính Số bản copy qRT-PCR

1 bản copy > 1 bản copy

Lip9: OsDREB2A 15 12 5 7

Ubi: OsDREB2A 12 10 6 4

Lip9: OsDREB1A 23 19 13 6

Ubi: OsDREB1A 20 15 11 4

pBIG-Lip9 16 10 5 5

pBIG-Ubi 13 9 4 5

Tổng 99 75 44 31

Tiếp tục đánh giá cây chuyển gen T1 b ng kỹ thuật qRT-PCR, nảy mầm

trên Hygromycin đã lựa chọn đƣợc 9 dòng chuyển gen đồng hợp một bản

copy để tiếp tục theo dõi đánh giá khả năng chịu hạn trong các thế hệ tiếp

theo. Tuy nhiên trong số đó có 03 dòng là L4, U2 và U3 không cho hạt T2 nên

ch còn 06 dòng đƣợc tiếp tục nghiên cứu trong các thí nghiệm đánh giá kiểu

hình kế tiếp ( ảng 3.10).

Bảng 3.2 | Kết quả sinh trƣởng các òng chuyển gen đồng hợp

Cấu trúc gen Số cây Sinh trƣởng

bình thƣờng Trổ bông Kết hạt

Thu hạt

T2

Lip9:

OsDREB1A

L1 2 2 1 1 1

L2 2 2 2 1 1

L3 2 2 2 2 2

L4 1 0

L5 2 1 1 1 1

Ubi:

OsDREB1A

U1 3 2 2 2 2

U2 1 0

U3 2 1 1 0

U4 2 2 2 2 2

Tổng 17 12 11 9 9

3.4. ĐÁNH GIÁ IỂU HÌNH C Y CHUYỂN GEN

Các cây chuyển gen T2 đƣợc nghiên cứu đánh giá kiểu hình so

sánh với cây đối chứng trong cả điều kiện hạn và điều kiện hạn. Kết

quả so sánh đánh giá trong điều kiện bình thƣờng có 04 dòng chuyển

gen một bản copy có kiểu hình tƣơng đồng với cây đối chứng không

chuyển gen (Bảng 3.11).

Bảng 3.3 | Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây chuyển gen và cây

đối chứng

Cây

Chỉ tiêu sinh trƣởng

Số nhánh/

khóm

Chiều cao

cây (cm)

Lƣợng hạt

chắc trên

bông

Thời gian sinh

trƣởng (ngày)

Cây đối chứng 5,02 ± 1,21 110,65 ± 3,51 110 ± 3,5 110 ± 3

L1 4,51 ± 1,09 90,12 ± 1,56 100 ± 1,2 105 ± 5

L2 4,49 ± 0,82 115,68 ± 2,02 100 ± 3,5 116 ± 4

L3 5,12 ± 0,89 105,79 ± 2,50 115 ± 2,5 107 ± 5

L5 5,09± 0,95 108,54 ± 1,59 116 ± 1,8 106 ± 4

U1 4,99 ± 0,32 105,12 ± 2,01 107± 3,5 106 ± 5

U4 5,16 ± 0,98 112,46 ±1,58 109± 2,5 108 ± 3

Khả năng giữ nƣớc là một trong những ch tiêu quan trọng để

đánh giá tính chịu hạn ở thực vật và khả năng này phụ thuộc vào các

đặc tính nhƣ: sự cuộn lá, đóng mở khí khổng, tham gia cơ chế giảm

áp suất trƣơng của lá, giảm lƣợng nƣớc bị mất của cây và hoạt hoá sự

biểu hiện hàng loạt các gen liên quan đến tính chịu hạn. Trong thí

nghiệm của chúng tôi, mặc d các gen điều khiển chịu hạn đã đƣợc

xác định sự tồn tại và có thể đã biểu hiện tốt trong các cây chuyển

gen. Tuy nhiên, nghiên cứu khả năng giữ nƣớc cho kết quả có sự

khác biệt rất ít giữa cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển

gen (Bảng 3.12).

Bảng 3.4 | Khả năng giữ nƣớc của các òng lúa chuyển gen

Độ hụt khối lƣợng tƣơng đối (%) Tỷ lệ sống sót

(%) Sau 1 giờ Sau 4 giờ Sau 7giờ

Cây đối chứng 10,00 ± 0,25 14,55 ± 0,45 30,55 ± 0,36 30,55 ± 0,36

L3 9,67 ± 0,36 14,01 ± 0,56 27,08 ± 0,52 80,08 ± 0,52

L5 8,67 ± 0,32 13,98 ± 0,49 26,57 ± 0,78 90,57 ± 0,78

U1 9,67 ± 0,23 14,01 ± 0, 32 28,45 ± 0,62 78,45 ± 0,62

U4 8,99 ± 0,36 13,95 ± 0,28 27,45 ± 0,54 83,45 ± 0,54

Hình 3.20 | Khả năng giữ nƣớc của các òng lúa chuyển gen

Ngƣợc lại về thí nghiệm đánh giá khả năng phục hồi cho thấy có

sự khác biệt lớn giữa cây chuyển gen và cây đối chứng. Các cây sau

thí nghiệm đánh giá khả năng giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại trong điều

kiện bình thƣờng, khả năng phục hồi đƣợc ghi nhận ở ngày thứ 1.

Kết quả cho thấy các cây đối chứng phát triển rất yếu xuất hiện các lá

vàng và xoăn; các cây chuyển gen phát triển khỏe mạnh bình thƣờng

các lá xanh khỏe mạnh. Tỷ lệ sống sót giữa cây đối chứng và các

dòng chuyển gen có sự khác biệt rất lớn trong khi cây đối chứng ch

sống sót có 30,55% còn các dòng chuyển gen có tỷ lệ sống sót rất cao

từ 78,45 – 90,57%. Kết quả này cho thấy các cây chuyển gen

OsDREB1A có khả năng phục hồi rất tốt sau quá trình mất nƣớc

(Hình 3.20).

Bảng 3.5 | Khả năng phục hồi v kết hạt của các òng lúa chuyển gen

sau xử lý hạn

Đối chứng L3 L5 U1 U4

Xử

lý

hạn

3

tuần

Số cây sống 0/30 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%)

Sinh trƣởng - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%)

Kết hạt - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%)

Thu hạt - 5/7 (71,43%) 6/9 (66,67%) 4/6 66,67%) 5/7 (71,43%)

Xử

lý

hạn

6

tuần

Số cây sống 0/30 0/30 4/30 (13,33%) 0/30 0/30

Sinh trƣởng - - 4/30 (13,33%) - -

Kết hạt - - 4/30 (13,33%) - -

Thu hạt - - 2/30 (6,67%) - -

Các dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T2 sinh trƣởng gần

tƣơng đƣơng với cây đối chứng đƣợc chúng tôi tiến hành kiểm tra

khả năng chịu hạn và khả năng ra bông tạo hạt sau khi xử l hạn. ết

quả kiểm nghiệm cho thấy cây đối chứng gần nhƣ không có khả năng

phục hồi sau 3 tuần ngừng tƣới, tỷ lệ chồi sinh lá mới rất thấp và

không có khả năng tạo hạt; các dòng chuyển gen có khả năng phục

hồi từ 20 – 30% trong đó có dòng L5 có khả năng phục hồi cao nhất

(30%), các dòng chuyển gen dƣới sự điều khiển promoter Lip9 có

phục hồi cao hơn các dòng chuyển gen dƣới sự điều khiển promoter

Ubiquitin (Ngƣợc lại về thí nghiệm đánh giá khả năng phục hồi cho

thấy có sự khác biệt lớn giữa cây chuyển gen và cây đối chứng. Các

cây sau thí nghiệm đánh giá khả năng giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại

trong điều kiện bình thƣờng, khả năng phục hồi đƣợc ghi nhận ở

ngày thứ 1. ết quả cho thấy các cây đối chứng phát triển rất yếu

xuất hiện các lá vàng và xoăn; các cây chuyển gen phát triển khỏe

mạnh bình thƣờng các lá xanh khỏe mạnh. Tỷ lệ sống sót giữa cây

đối chứng và các dòng chuyển gen có sự khác biệt rất lớn trong khi

cây đối chứng ch sống sót có 30,55% còn các dòng chuyển gen có tỷ

lệ sống sót rất cao từ 78,45 – 90,57%. ết quả này cho thấy các cây

chuyển gen OsDREB1A có khả năng phục hồi rất tốt sau quá trình

mất nƣớc (Hình 3.20).

ảng 3.5).

Sau khi đánh giá khả năng chịu hạn các dòng tiếp tục đƣợc trồng

ở điều kiện bình thƣờng trong nhà lƣới, kết quả cho thấy các dòng

chuyển gen có khả năng phục hồi tốt, sinh trƣởng gần nhƣ bình

thƣờng hiện tƣợng lá bị vàng và bị cháy rất ít, các dòng ra hoa kết

quả bình thƣờng. Tỷ lệ hạt chắc ch đạt từ 66,67% đến 71,43%, điều

này cho thấy hạn có khả năng ảnh hƣởng khá lớn đến năng suất của

cây trồng.

-

Hình 3.21 | Khả năng phục hồi, tạo hạt của các òng T2 chuyển gen khi

xử lý hạn 3 tuần

Ghi chú: 1: Cây đối chứng; 1: Dòng L3; 3: Dòng L5; 4: Dòng U1; 5: Dòng U4

Các cây thế hệ T3 của các dòng chuyển gen U1, U4, L3 và L5

đƣợc gieo trong điều kiện nhà lƣới, tiến hành xử lý hạn ở giai đoạn 3

lá mạ để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen quan tâm trong hai

điều kiện xử lý hạn 48h và không xử lý hạn. Kết quả nghiên cứu biểu

hiện OsDREB1A trong cây không chuyển gen, cây chuyển gen trong

điều kiện thƣờng và điều kiện hạn b ng kỹ thuật RT-PCR sử dụng

hai cặp mồi OsDREB1A-RT-Fw/Rv và mồi Actin-Fw/Rv (sử dụng để

nội chuẩn mức độ biểu hiện của OsDREB1A trong tất cả các điều

kiện) đƣợc biểu đồ hóa trong Hình 3.. Kết quả đánh giá cho thấy

OsDREB1A biểu hiện thấp ở cả cây Chành trụi không chuyển gen và

dòng chuyển gen L3 và L5 trong điều kiện không xử lý hạn và ngƣợc

lại với các cây thuộc dòng U1 và U4 gen có mức độ biểu hiện cao

hơn đáng kể (LogFC2 >2). Điều này chứng tỏ với nền cây Chành

Trụi OsDREB1A không có mức biểu hiện cao mặc d đây là giống

lúa nƣơng và dƣới sự điều khiển của promoter Lip9 gen này cũng có

1 2 3 4 5

mức biểu hiện tƣơng đƣơng cây không chuyển gen trong điều kiện

bình thƣờng. Ngƣợc lại, dƣới sự điều khiển của promoter liên tục gen

này có mức độ biểu hiện mạnh (Hình 3.22).

Hình 3.22 | Nghiên cứu mức độ biểu hiện OsDREB1A trong cây chuyển

gen T3

KẾT LUẬN

1. Luận án đã phân lập đƣợc trình tự mã hóa OsDREB1A từ DNA tổng

số giống Cƣờm dạng và cDNA của giống Mộc Tuyền và trình tự mã

hóa OsDREB2A từ cDNA giống Cƣờm dạng. Đã nhân dòng thành

công hai trình tự mã hóa riêng rẽ vào vector pUC19. Kết quả giải trình

tự sau đó cho thấy hai trình tự mã hóa nhân tố phiên mã của hai giống

lúa Việt Nam có trình tự và kích thƣớc (720 bp và 825 bp) tƣơng đồng

với hai gen tƣơng ứng trong ngân hàng gen thế giới là OsDREB1A

(AF300970) và OsDREB2A (AM495895) của giống Nipponbare. Hai

trình tự này sau đó đã đƣợc đƣa thành công một cách riêng rẽ vào hai

hệ vector pBIG/Ubi (promoter Ubiquitine - nguốc gốc từ ngô, là

promoter biểu hiện liên tục) và pBIG/Lip (promoter Lip9 - nguồn gốc

từ lúa, là promoter cảm ứng hạn) để tạo 04 vector biểu hiện (binary

vector): Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A và

Lip9:OsDREB2A làm vật liệu phục vụ công tác tạo giống cây trồng

chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen.

2. Luận án đã thành công bƣớc đầu trong việc đánh giá khả năng phát sinh

callus (trên 04 nền môi trƣờng MS có bổ sung 2,4D nồng độ từ 1,5 – 2,5

mg/l) của 47 giống lúa nƣơng Việt Nam và khả năng tái sinh chồi từ

callus (trên 04 nền môi trƣờng MS bổ sung BAP và kinetine có nồng độ

khác nhau từ 0,5 – 2 mg/l) của 26 giống lúa nƣơng Việt Nam có khả năng

tạo callus trên 50%. Kết quả cụ thể cho thấy, tập đoàn 47 giống lúa nƣơng

đã khảo sát có khả năng tạo calus không cao, ch có 05 giống lúa có khả

năng tạo callus trên 75% (giống LP-5 trên môi trƣờng MS + 1,5 mg/l

2,4D, giống IR80416-B-152-4, YUNLU103-1B và Nếp hau Để Dỏn

trên môi trƣờng S + 2 mg/l 2,4 , đặc biệt có giống Chành Trụi có khả

năng tạo callus lớn hơn 80% trên cả 3 môi trƣờng MS bổ sung 2,4D). Khả

năng tái sinh chồi từ callus của các giống lúa nƣơng đã khảo sát trong luận

án không cao, khó phát triển quy trình chuyển gen cho các giống lúa. Ch

có 05/26 giống lúa (LUYIN46, IR80416-B-152-4, LHY-4, YUNLU103-

1B và Chành Trụi) có khả năng tái sinh chồi từ callus đạt trên 70% trên

môi trƣờng tái sinh TS2 (MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l kinetine). Luận án

đã thành công trong việc thiết lập quy trình chuyển gen cho giống lúa

Chành Trụi là giống lúa nƣơng địa phƣơng của Việt Nam và đây là kết

quả chuyển gen thành công đầu tiên cho một giống lúa bản địa của Việt

Nam đã đƣợc công bố.

3. Luận án đã thành công trong việc biến nạp 04 vector biểu hiện

Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A và

Lip9:OsDREB2A vào giống lúa Chành Trụi. Tỷ lệ chuyển gen trên

giống Chành Trụi dao động từ 9% đến 15%, trung bình là 10%. Luận

án cũng đã lần đầu tiên áp dụng thành công kỹ thuật PCR định lƣợng

(qRT-PCR) ở Việt Nam để thay thế cho: kỹ thuật lai Southern Blotting

trong việc ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển gen ở các cây

chuyển gen thế hệ T0, T1; t lệ nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin

để xác định cây chuyển gen T1 đồng hợp.

4. Luận án đã thành công trong việc sàng lọc đƣợc 04 dòng Chành Trụi

(Lip9:OsDREB1A) một bản sao, đồng hợp ở thế hệ T2 có kiểu hình (chiều

cao cây, số nhánh, thời gian sinh trƣởng…) tƣơng đồng với cây đối chứng

không chuyển gen trong điều kiện thông thƣờng và 100% có khả năng

phục hồi, kết hạt (tỷ lệ hạt chắc đạt 40-60%) sau 03 tuần ngừng cung cấp

nƣớc. Luận án cũng đã thành công trong việc sử dụng PCR định lƣợng và

bán định lƣợng cho gen chuyển (OsDREB1A) và gen ch thị khả năng

chịu hạn Dehydration-Induced Protein (DIP)/Salt-induced protein (SALT)

trong các cây chuyển gen T2. Kết quả cho thấy cả gen chuyển và gen ch

thị đều ch đƣợc tăng cƣờng biểu hiện trong điều kiện gây hạn nhân tạo so

với cây đối chứng (Fold change-FC: 2,5-3,3).

KIẾN NGHỊ

Dựa trên các kết luận rút ra từ kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tôi

đƣa ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:

- Tiếp tục nghiên cứu khả năng duy trì tính ổn định ở các thế hệ

T3, T4… của 04 dòng chuyển gen Chành Trụi đã tạo ra trong nghiên

cứu trong các thế hệ tiếp theo (tính bền vững di truyền, khả năng duy

trì tính chống chịu, năng suất…).

- Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsDREB2A vào các đối

tƣợng cây trồng khác với các promoter điều khiển hoạt động cảm ứng

điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Cao Lệ Quyên, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội (2011), “Nghiên

cứu khả năng tạo callus và tái sinh cây từ một số giống lúa nƣơng

Việt Nam nhập nội phục vụ cho công tác chuyển gen”, hí

Si h họ , 33(1), tr. 80-85.

2. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội

(2012), “Thiết kế vector chuyển gen điều khiển OsDREB1A có

tiềm năng tăng cƣờng khả năng chịu điều kiện bất lợi”, hí

g ghệ Si h họ , 10(2), tr. 271-279.

3. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Đinh Đoàn Long, Phạm uân

Hội (2016), “Nghiên cứu chuyển gen nhân tố phiên mã

MtOsDREB1A liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt

Nam”. hí N g ghiệ v h i N g h , 8, tr. 13-

19.