TrFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion.
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trFTIR
Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion
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NMR und XRD:
Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch ?
trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio-logischen Bedingungen!
Informationen: - Ladungsverteilung - H-Brücken - Protonierungszustände - Kinetik
Nutzung von trFTIR in der Bioanalytik
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Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen
)(
)(log
2
1
vI
vIE
Differenzspektren
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Hohe Anforderungen, da Hintergrundintensität viel stärker ist, als die Intensitätsänderungen (3-5 Größenordnungen)
• Michelson Interferometer (Multiplexvorteil)
• Gleiche Bedingungen bei jeder Messung!
• Wiederholungsmessungen zur Verbessung des Signal/Rausch Verhältnisses (~ )n
Apparatur
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L M Z D
Michelson Interferometer
Apparatur
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Reaktionsinitiierung
ATP
NO2
ATP
N+
O
O
O
N
O
ATP
hv
+
Zeitauflösung
a) Direkt über ns - Laserblitz nur bei photobiologisch aktiven Proteinen
z.B. Bacteriorhodopsin
b) Photolabile Trigger-Substanzen
z.B. Caged ATP
c) Mischzellen max. µs - Auflösung
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Rapid Scan
• Spektrenaufnahme mit schneller Spiegelbewegung schnelle aufeinanderfolgende Aufnahme vollständiger Interferogramme - It(x)
• ms - Auflösung
• auf alle Reaktionen anwendbar
Step Scan
• Bei fixierter Spiegelposition wird Zeitabhängigkeit des Signals gemessen - Ix(t). Wiederholung der Messung bei jeder Spiegelposition
• ns - Auflösung (Detektionsbegrenzung)
• nur zyklische Reaktionen (z.B. Bacteriorhodopsin), andernfalls besondere Technik notwendig
Zeitauflösung
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Häufige Reaktionswiederholung (oft > 1000x) genau gleiche Bedingungen! Techniken für azyklische Reaktionen:
• Flow cells Austausch der Substanz - hoher Substanzbedarf - kleine Extinktionsänderungen nicht messbar (grosse Zelldimensionen)
• Fokussierung des Laser/IR Strahls Messung von einzelnen Probensegmenten - 4 μm Film zwischen CaF2-Fenstern (Filmdicke ± 10%) - Aufheizung der Probe - Beeinflussung von Segmenten durch Streulicht
Zeitauflösung
Step Scan Technik
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Austausch von Aminosäuren
Eine bestimmte Extinktions-änderung entfällt (neue Aminosäure ist unreaktiv)Problem: invasive Mutation
Isotopenmarkierung
Verschiebung der Wellenzahl der Extinktionsänderung (Isotopeneffekt)
Bandenzuordnung
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• Kommerzielles FTIR Spektrometer mit Globar, Beamsplitter, Spiegel
• Farbstofflaser (Laserblitz ca. 20 ns)
• Individuelle Anfertigung von Messzelle und Signalverstärker
• Kommerzieller stickstoffgekühlter MCT-Detektor (Mercury/Cadmium/Tellur) mit einer Zeitauflösung von ca. 20 ns
• Schnelle Photodiode, die durch Laserreflex aktiviert wird und Aufnahme der Daten auslöst
• 3 mbar Vakuum im Geräteraum, um Vibration des Spiegels durch Geräusche zu minimieren
• Isolationstisch und Temperaturkontrolle
Beispiel für ein Step Scan trFTIR Gerät
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Vorteile der trFTIR
- physiologische Bedingungen- Informationen über H-Atome und Ladungsverteilungen- Instabile Intermediate sind messbar - Kinetische Informationen
Nachteil
Noch keine Standardprozedur zur Vermessung verschiedener Proben verfügbar. Aufwändige, auf das Problem zugeschnittene, technische Modifikationen
Zusammenfassung und Ausblick
Ausblick
- Standardisierung und Validation der Methoden- fs - Zeitauflösung- Theoretische Berechnung kompletter IR-Spektren und Vergleich mit dem Experiment Struktur und Ladungsverteilung im Reaktionsverlauf!
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Anwendung
• Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten
• Untersuchung molekularer Reaktionsmechanismen Verständnis Struktur, Funktion und Interaktion von Proteinen Voraussetzung Entwicklung gezielter wirkender
pharmakologische Substanzen
mit weniger Nebenwirkungen
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Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin
• Aufklärung katalytische Schritte • Mechanismus stimmt mit 10 Jahre später über
Röntgenstrukturanalyse
ermittelter Kristallstruktur überein
Bakteriorhodopsin [2]
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Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin
Protonentransfer im Bakteriorhodopsin mit Hilfe von Wasser [1]
•Retinal über Schiffsche Base Gebunden•Wird durch Licht angeregtIsomerisierung (pk-Änderung)H-Brücke W402 aufgespaltenFreie OH-Gruppe W401 kann negative Ladung des Asp 85 nicht mehr stabilisierenProtonentransfer von Schiffscher Base auf Asp 85Arg 82 bewegt sichProtonierter Wasserkomplex nahe der Oberfläche destabilisiertGibt Proton ab
Wasser aktiv beteiligt
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Wie Proteine Protonen pumpen
•1190 cm-1
DeprotonierungZentrale Protonenbindestelle
•1762 cm-1
Protonierung Asp-85
Differenzspektrum Protonentransfer Bakteriorhodopsin [1]
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Schaltmechanismus von GTPasen
• RAS kontrolliert Wachstumssignal • Mutationen unkontrolliertes Zellwachstum GAP hydrolysiert nicht mehr • Verfolgt RAS-GTP-Hydrolyse
Struktur vom Intermediat (H2PO42- ) [1]
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Schaltmechanismus von GTPasen
GTP-Hydrolyse [1]Differenzspektrum GTP-Hydrolyse [2]
•Ras(*Ras)Gap: Intermediat (1143 cm-1)•Katalyse durch positive geladene Lys, Arg und Mg2+
Mutation Arg zu ungeladenem Gln -> Verlangsamung
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Pharmascreening
• Nahezu alle Moleküle IR-aktiv (keine Fluoreszenzmarkierung)
Kann direkt Einfluss Pharmaka auf Protein bestimmen
z.B. Reaktivierung RAS• Studieren potentieller Pharmaka• Identifizierung aktivierender Pharmaka • Substanzen in natürlicher Umgebung studieren (RAS
über Lipidanker an Membranmodelle binden die auf ATR-Oberfläche aufgetragen sind)
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– Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren
– Herstellung gezielter wirkender Pharmaka mit weniger Nebenwirkungen
– Untersuchung Protein mit unbekannter Raumstruktur
– Charakterisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren
Ausblick
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Literatur
1. Proteinreaktionen: aufgelöst mit trFTIR, Nachrichten aus der Chemie, 5
2. http://www.innovationspreis-ruhr.de/Entwicklungsbeschreibung_17%2002%2006.pdf
3. K. Gerwert, Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1988, 92, 978
4. W. Uhrmann , A. Becker, C. Taran, F. Siebert, Appl. Spectrosc., 1991, 45, 390
5. R. Rammelsberg, B. Hessling, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Appl. Spectrosc., 1997, 51, 558
6. R. Rammelsberg, S. Boulas, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Vib. Spectrosc., 1999, 19, 143