LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE VEGETALI (Prof. Alma Balestrazzi)

TRASFORMAZIONE GENETICA DI SPINACIO (SPINACIA OLERACEA L.)

MEDIATA DA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

CHE COSA SONO LE PIANTE TRANSGENICHE?

Le piante transgeniche sono prodotte con la tecnica del DNA ricombinante

Con questa tecnica è possibile introdurre nuovi geni che consentono alla pianta di migliorare le proprie caratteristiche

http://mv.picse.net/pesticides/cotton/how-was-bt-cotton-produced/

www.slideshare.net

Esempio di OGM vegetale (pianta transgenica) dotato di resistenza a insetti dannosi ottenuto

mediante inserimento del gene Bt

foglie di arachide divorate da larve

dell’insetto dannoso

foglie di arachide che producono un

pesticida naturale in grado di proteggerle

dalle larve

Agrobacterium tumefaciens: un sistema di ingegneria genetica frutto dell’evoluzione

Agrobacterium tumefaciens: un sistema di ingegneria genetica frutto dell’evoluzione

Agrobacterium tumefaciens

INOCULAZIONE

ESEMPIO DI TUMORE (GALLA)

GALLAindotta in vitro

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO

http://www.ortofruttabaldan.it/

http://www.slowfood.it/

http://study.com/academy/lesson/mesophyll-

cells-function-definition-quiz.html http://inhabitat.com/

MESOFILLO FOGLIARE(TESSUTO)

CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE

CLOROPLASTI

IL NOSTRO TARGET

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO

I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

ENZIMA DI RESTRIZIONE TAGLIO

DNA LIGASI SALDATURA

1

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO

I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)

2

PLASMIDERICOMBINANTE

VETTORE (PLASMIDE)

GENE DI INTERESSE

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO

Coltura in vitro di cellule vegetali

rigenerazione

microcallocallo

I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)

trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens

TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO

PLASMIDE RICOMBINANTE GIA’ PREDISPOSTO

ESERCITAZIONE

RISULTATO ???

STEP 1: STERILIZZAZIONE TESSUTO FOGLIARE

• trasferire foglie in contenitore sterile (tipo Magenta)• versare 200 ml di Etanolo al 70%• incubare per 3 min a temperatura ambiente

forte agente sterilizzante,

estremamente fitotossico

• al termine eliminare l’etanolo e versare 200 ml di soluzione contenente teepol (0.04%) e ipoclorito di sodio (10%)

• incubare per 15-20 min a temperatura ambiente

ipoclorito di sodio: efficace

per sterilizzazione di

superficie - teepol: detergente

universale, rimuove particelle

estranee

• al termine eliminare la soluzione ed effettuare 3-4 lavaggi con dH2O sterile per eliminare ogni residuo di agente sterilizzante.

STEP 2: preparazione degli espianti (leaf discs) e co-coltivazione con il ceppo ingegnerizzato di Agrobacterium tumefaciens

• Tutte le operazioni devono essere effettuate con estrema cura per non danneggiare il tessuto fogliare

• Prelevare una foglia sterilizzata con la pinzetta e trasferirla in una piastra Petri

• Con l’aiuto di un bisturi excidere porzioni di tessuto di forma quadrata (1 cm x 1 cm, approssimativamente) (espianti o dischetti fogliari) e

• trasferire gli espianti in una piatra Petri contenente la sospensione di cellule di Agrobacterium tumefaciens (ceppo ingegnerizzato con il gene nptII) e incubare per 10-20 min

• al termine asciugare bene gli espianti su carta bibula sterile per eliminare l’eccesso di sospensione batterica

• trasferire gli espianti su piastre NUTRICI, incubare per 10-20 min

CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI?

• le cellule del tessuto fogliare sono state sottoposte a stress meccanicodurante la preparazione degli espianti e sono state poi esposteall’inoculazione con Agrobacterium tumefaciens

• per favorire la ripresa della proliferazione, gli espianti sono trasferiti supiastre nutrici costituite da terreno mescolato con cellule vegetali insospensione

• le colture cellulari in attiva proliferazione riversano nel mezzo compostiche stimolano la riattivazione del ciclo cellulare

• cellule vegetali in proliferazione inglobate in terreno a formare le piastrenutrici forniscono questo supporto agli espianti di spinacio

CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI?

cellule in sospensione di pioppo (Populus spp.)

TERRENO MS

PIASTRA NUTRICE(recovery)

STEP 3: gli espianti co-coltivati sono trasferiti su terreno selettivo

• gli espianti sono infine trasferiti su piastre Petri contenenti un substratonutritivo (TERRENO MS) costituito da sali (macronutrienti, micronutrienti) evitamine (es, piridossina, tiamina), saccarosio (fonte di carbonio organico)

• il terreno contiene l’antibiotico kanamicina come agente selettivo – questoantibiotico è citotossico e uccide le cellule vegetali che non sono statetrasformate da Agrobacterium tumefaciens

• le cellule che sono state trasformate (frequenza di trasformazione = 1 cellulaogni 106) esprimono il gene nptII che codifica per l’enzima neomicinafosfotransferasi in grado di detossificare la molecola di kanamicina

• gli espianti sono mantenuti a 24-25°C per 4-5 settimane in attesa diverificare la comparsa di calli e/o tessuto da cui sarà possibile rigenerare invitro la pianta geneticamente modificata